CN107759700A

CN107759700A - 靶向cd19抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107759700A
Application number: CN201710969332.4A
Authority: CN
Inventors: 黄昕华; 于丽丽; 生德伟; 李德柱; 徐峰波
Original assignee: Yinfeng Biological Group Ltd
Current assignee: Yinfeng Biological Group Ltd
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-03-06

Abstract

本发明公开了一种靶向CD19抗原的转基因T细胞，为染色体中整合有SEQ ID NO:8所示的编码靶向CD19抗原受体的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞；或：为染色体中整合有SEQ ID NO:2所示的编码靶向PSA‑NCAM受体的基因、SEQ ID NO:8所示的编码靶向CD19抗原受体的基因的原始细胞；所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。所述靶向CD19抗原的转基因T细胞在制备治疗恶性B细胞淋巴瘤的药物中的应用。本发明在carT构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除carT细胞，并且沉默或敲除了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

Description

靶向CD19抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及靶向CD19抗原的转基因T细胞及其制备方法与应用。

背景技术

中国白血病2003～2007年发病率是5人每10万人，近年来因工业化导致和环境变化，发病率逐渐上升到8～10人每10万人。保守估计每年新增4万患者。CLL是西方国家最常见的白血病类型，可占全部白血病例的1/3。亚洲国家发生率较低，我国CLL约占白血病总数的3％以下。90％以上的CLL发病年龄在50岁以上，男性发病率高于女性，男∶女＝2∶1。非霍奇金淋巴瘤(NHL)中国每10万人发病3～6人，美国每年发病5万人。

成人急性B淋巴白血病占白血病20～30％。传统化疗可以治愈20％的急性B淋巴白血病的成年患者，80％成年患者几次化疗后耐药或复发；传统化疗可以治愈80％的急性B淋巴白血病的儿童患者，20％儿童患者几次化疗后耐药或复发。复发患者需要经典的骨髓移植或脐带血移植，受限于骨髓或脐带血配型。

欧美现有靶向CD19抗原的carT可以用于成人或儿童的顽固或复发的急性B淋巴白血病(B-ALL)，6个月内的完全有效率80～90％；针对慢性淋巴白血病，疗效在50％(25％CR，25％PR)；也可以针对非霍奇金淋巴瘤(NHL)，疗效(CR+PR)在50～70％之间。

2011年以后的靶向CD19的car T技术，针对B-ALL，CLL，NHL肿瘤，在淋巴清除术化疗(lymphodepleting chemotherapy)后，实施过继性T细胞免疫治疗，能取得上述高比例的响应率。临床试验的数据表明，car T细胞输入患者后，在体内的有限增殖是获取完全响应(complete response)的关键；carT细胞在患者体内少量而长期存在，是防止疾病复发的关键。临床治疗时，输入的CD19 carT细胞数量和体内扩增，和生长因子释放风暴(CRS)和神经毒性密切相关；和临床疗效也密切相关。其中，神经毒性的控制多数患者是可逆的，少数患者因为脑水肿而死亡，其确切原因至今没有判断清晰，众多数据和分析认为，和患者肿瘤负荷，患者个人体质，输入carT细胞数量多少，临床用药(lymphodepletingchemotherapy)，细胞培养细节，car分子的CD28共刺激因子等都有关联。

临床前的数据表明，CD8+和CD4+的中央记忆细胞(central memory)T细胞或者更早期的幼稚(naive)T细胞是取得良好临床疗效的关键。CD4+T细胞和CD8+细胞在外来入侵的病毒和真菌，体内肿瘤的防止和治疗，有协同增强效应。所以，本发明实施的方法是CD4+T细胞和CD8+T细胞纯化后分别培养，然后混合回输患者。患者在输入细胞之前，临床医师根据个体，需要用环磷酰胺或氟达拉滨注射患者，清除机体免疫抑制的因素。

car T技术的基本原理嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。

第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(single chain fragment variable，scFv)和免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs，ITAM，通常为CD3-ζ和FcεRIγ)组成。早期的实验证明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暂的T细胞增值和较低的细胞因子分泌，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。

依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号；第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信号序列(costimulatory molecule，CM)，旨在提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放。现有的国内外第2代carT细胞培养技术，大致遵循类似的技术路线，即在分离患者外周血单个核细胞后，起始培养1～2天后，转染逆转录病毒(retroviral)，或慢病毒(lentiviral)，或转座子(transponson)为载体的基因表达嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，car)分子，加共刺激因素(IL2等生长因子，辅助以CD3CD28抗体，或者抗原表达的细胞株等)培养7～30天后，回输患者。

欧美临床试验的数据表明，现有的CD19chimeric antigen receptor T(car T)技术，治疗B-ALL的6个月内完全治愈率(complete response，CR)达90％以上。但是据多中心多公司技术的临床试验报告，有5个难点，多数没有解决：

1、患者在治疗过程中需要密切监护，有严重CRS，主导原因之一是数十倍于正常水平的血清IL6。欧美临床对此有比较好的处理方案，主要是IL6R单抗或大剂量类固醇激素。

2、40～55％的患者有3～4级的神经毒性的反应，需要临床控制。各个公司都有治疗过程中患者出现脑水肿而死亡，Juno公司的JCAR015(CD28共刺激域)因连续数个患者死亡而项目终止。

3、治疗成功后，患者体内长期缺乏B淋巴细胞，因而必须每2～3周注射一次免疫球蛋白以保持基本免疫需求。

4、治疗12个月后，有40％的人复发，主要是2个原因，a.carT细胞不能持久而衰竭丢失，b.carT细胞的scFv有免疫原性而被患者免疫排斥后丢失。

5、患者体内依旧长期存在肿瘤种子细胞，在carT细胞丢失后重新生长，临床表现为疾病复发。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种靶向CD19抗原的转基因T细胞，及其制备方法。本发明在carT构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除carT细胞，并且敲除了PD1、CTLA4基因，解除了其对carT细胞的抑制，增强了carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种靶向PSA-NCAM(神经细胞表面抗原)的受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其结构为：scFv-PSA-NCAM-CD8a-PD1。

一种编码上述靶向PSA-NCAM受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；其结构为：scFv-PSA-NCAM-CD8a-PD1。

一种重组慢病毒表达载体Ⅰ，其包含有上述编码靶向PSA-NCAM受体的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA。该重组表达载体的病毒包被系统，为常规方法(第2代或第3代慢病毒包被系统)；本发明所使用的慢病毒表达载体(lentiviralexpression vector)SIN-3LTR的载体，母本来自1998年发表的载体(Dull T et al(1998)Athird-generation lentivirus vector with a conditional packagingsystem.JVirol.1998Nov；72(11):8463-71.)。

所述靶向PD1基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.3所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.4所示。

所述靶向CTLA4基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.5所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.6所示。

一种靶向CD19抗原的受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其结构为：anti-CD19 FMC63 scFv-CD27-41BB-CD3zeta。

一种编码上述靶向CD19抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；其结构为：anti-CD19 FMC63 scFv-CD27-41BB-CD3zeta。

一种重组慢病毒表达载体Ⅱ，其包含有上述编码上述靶向CD19抗原受体的基因。该重组表达载体的构建方法，为常规方法。

一种靶向CD19抗原的转基因T细胞，为包含有上述重组慢病毒表达载体Ⅰ、重组慢病毒表达载体Ⅱ的原始细胞，或染色体中整合有上述编码靶向PSA-NCAM受体的基因、编码靶向CD19抗原受体的基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。其制备方法为：使用两轮慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，第一轮感染重组慢病毒表达载体Ⅰ，第二轮感染重组慢病毒表达载体Ⅱ；两轮感染后，即得靶向CD19抗原的转基因T细胞(PD1基因、CTLA4基因沉默)；感染方法为常规方法。

一种靶向CD19抗原的转基因T细胞，为包含有上述重组慢病毒表达载体Ⅱ的、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或染色体中整合有上述编码靶向CD19抗原受体的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。其制备方法包括以下步骤：

(1)重组慢病毒表达载体Ⅱ慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，得重组T细胞；感染方法为常规方法；

(2)gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞(400V，0.5ms)，即得靶向CD19抗原的转基因T细胞，其PD1基因、CTLA4基因被敲除，染色体中整合有编码靶向CD19抗原受体的基因。所述gRNA为靶向PD1基因的gRNA或靶向CTLA4基因的gRNA，所述HDR为PD1基因的HDR或CTLA4基因的HDR。

所述CRISPR-cas9mRNA，是通过体外转录spCas9-2.0得到。SpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(简称spCas9-2.0)为现有技术中已有的序列，为张峰(ZhangFeng)所发布，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示(序列所示为对应的DNA序列)；克隆出spCas9-2.0的cas9蛋白的mRNA，克隆到pUC19质粒中，经过in vitro转录和5’加帽反应，形成成熟的mRNA，供细胞转染，适合E.coli表达。

所述靶向PD1基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(序列所示为相对应的DNA序列)。

所述靶向CTLA4基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示(序列所示为相对应的DNA序列)。

所述PD1基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

所述CTLA4基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

所述靶向CD19抗原的转基因T细胞在制备治疗恶性B细胞淋巴瘤的药物中的应用。

本发明的技术方案，针对背景技术中的问题2，本发明提出靶向AQP4或GABA基因表达的蛋白。AQP4基因表达的蛋白表达于肾小管细胞和中枢神经系统的星细胞。GABAreceptor是中枢神经系统特异性表达的细胞表面受体。在识别AQP4或GABA蛋白的scFv序列后偶联抑制性受体的序列，就构成保护性的car。针对背景技术中的问题3，本发明提出用EGFR单抗Cetuximab和CD20单抗Rituximab消除carT细胞。针对背景技术中的问题4，本发明提出用人源化单抗制作的scFv降低免疫原性。改进细胞培养方案增强car T细胞的中央记忆细胞(central memory T)的比例。针对背景技术中的问题5，本发明提出用基因编辑或者RNAi的方法，敲除或沉默PD1、CTLA4基因，解除对carT细胞的抑制，增强carT细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。

附图说明

图1：慢病毒表达载体Ⅰ的构建简图。

图2：anti-PSA-NCAM scFv-CD8a-PD1的构建示意图。

图3：各种构建的CD19 carT和anti-CD3/anti-CD28磁珠培养的短期增殖曲线。

图4：各种构建的CD19 carT和K562-CD19靶细胞共培养的短期增殖曲线。

图5：Cetuximab诱导CD19 carT细胞毒性(cytotoxicity)图。

图6：脐血T细胞经过PSA-NCAM和CD19两轮car病毒感染后培养的增殖曲线。

图7：CD19carT、PSA-NCAM/CD19双靶向carT对靶细胞SH-SY5Y-CD19的杀伤效果示意图。

图8：脐带血T细胞经过CD19 car慢病毒转染后，与SH-SY5Y、SH-SY5Y-CD19共培养的增殖曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 构建慢病毒表达载体

(1)构建scFv-PSA-NCAM-CD8a-PD1：结构简图如图1所示，car分子设计如图2所示。构建的scFv-PSA-NCAM-CD8a-PD1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(2)构建anti-CD19 FMC63 scFv-CD27-41BB-CD3zeta：构建方法为常规方法，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

(3)构建慢病毒表达载体Ⅰ、Ⅱ：用RPMI1640+10％ FBS培养293T细胞。待细胞90％密度后，用lipo2000混合转染质粒，转染293T细胞。转染方法按照Invitrogen厂商的标准操作，质粒有：表达质粒，pMDLg/pRRE,pRSV-Rev，pMD2.G，混合质粒的摩尔比例为2∶1∶1∶0.5。24-48小时后收获慢病毒上清。然后加Clontech的Lenti-X concentrator，混合后1500g，4C离心45min，去除上清，获取慢病毒沉淀。

实施例2 转染T细胞

健康人或肿瘤患者的外周血抽取50-100ml，或者用Cobra Spectra血细胞分离机获取单个核细胞，经过Ficoll分离后，用CD4+或CD8+磁珠分选(磁珠购自Stem CellTechnologies公司)。

慢病毒感染人CD4+T或CD8+T细胞：制备和浓缩后的慢病毒感染参考TakaraRetronectin说明书，简单描述如下：

制备Retronectin浓度20～100μg/ml，铺板使用密度是4～20μg/cm²，室温2小时后，吸去上清备用；用慢病毒加到上述板125～250μl/cm²，37C温浴4～6小时；待感染T细胞以密度0.5～2.5×10⁴cells/cm²铺板。T细胞感染24小时后换液。

本发明使用2轮慢病毒感染：第1轮感染抑制性carT，第2轮感染CD19 carT。

在两轮感染后，达到以anti-CTLA4 anti-PD1 shRNA克服免疫检查点受体的抑制；识别抗原PSA-NCAM的抑制性car分子，可以识别神经细胞而抑制CD19 carT在中枢神经系统活跃；anti-CD19 FMC63 carT进行杀伤B淋巴肿瘤细胞。

T细胞培养1天后(培养基配方：Lonza X vivo15，成人血清10％，IL2300-500IU/ml，

penicillin(100units/ml)and streptomycin(100μg/ml)，用抗CD3CD28的磁珠(与car T细胞3∶1混合)，刺激CD19 carT细胞生长。

实施例3 敲除PD1基因、CTLA4基因

分别进行敲除PD1基因、CTLA4基因的实验，具体方式如下：gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞(只用慢病毒表达载体Ⅱ转染的T细胞)(400V，0.5ms)。

电转后，培养细胞3天(所用培养基为：Lonza X vivo15，添加成人血清10％，IL2300～500IU/ml)，提取基因组DNA，进行PCR扩增，扩增产物用Agarose胶纯化，进行TA克隆，纯化单个克隆后，挑100个克隆测序获取Indel突变信息，根据突变和非突变的量比，基因编辑效率PD1：17％，CTLA4：18.3％。

所述CRISPR-cas9mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

敲除PD1基因时，靶向PD1基因的gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；PD1基因的HDR核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

敲除CTLA4基因时，靶向CTLA4基因的gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；CTLA4基因的HDR核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

扩增基因敲除位置附近所用引物为：

靶向PD1的exon2附近区域的引物：

Forward：TTCCTCACCTCTCTCCATCTC；

Reverse：CTCTCTTTGATCTGCGCCTT；如SEQ ID NO：14、15所示。

靶向CTLA4的exon2附近区域的引物：

Forward：TGAGTTCACTGAGTTCCCTTTG；

Reverse：GAAATGGCTTTGCTCACCAATTA；如SEQ ID NO：16、17所示。

实施例4carT细胞的性能鉴定，实验数据系列

表1慢病毒滴度数据(qPCR检测)

获得某个实验批次的慢病毒数据(如表1所示)，实验步骤如下：

1.感染前6h在24孔细胞培养板中以2.5×10⁵个细胞/孔均匀接种HEK293细胞。

2.将慢病毒进行梯度稀释，共做3个梯度，即每孔(500μl无双抗、无血清的DMEM培养基)中含10μl、1μl、0.1μl病毒，震荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中，加病毒之前将培养板中的培养基吸净。

3.感染18-20h后，将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基。

4.感染64-68h后收集细胞并进行基因组DNA的提取。

5.提取基因组DNA(按照AxyGEN的基因组DNA提取试剂盒说明书)。

6.以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品，慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数。

7.以Actin质粒梯度稀释为标准品，Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数。

图3：各种构建的CD19 carT(这里的CD19 carT，是指经过含anti-CD19 FMC63scFv-CD27-41BB-CD3zeta的慢病毒表达载体转染得到的，未敲除PD1基因、CTLA4基因)和anti-CD3/anti-CD28磁珠培养的短期增殖曲线。完全培养基为Lonza X vivo15，成人血清10％，IL2 300-500IU/ml。各个组别为：空载GFPcarT对照；CD19car T(no 4-1BB共刺激序列)；CD19 car T(含4-1BB共刺激序列)。

图4：各种构建的CD19 carT和K562-CD19靶细胞共培养的短期增殖曲线。完全培养基为Lonza X vivo15，成人血清10％，IL2300-500IU/ml。各个组别为：GFP载体对照；CD19car T(car受体无4-1BB共刺激序列)；CD19 car T(car受体含4-1BB共刺激序列)。

图5：Cetuximab诱导CD19 carT细胞毒性(cytotoxicity)图。完全培养基为LonzaX vivo15，非热灭活的成人血清10％，IL2 300-500IU/ml。体外培养皿中，在培养基中添加1000ng/mlCetuximab后，CD19 carT细胞短时间内进入程序死亡，活性细胞数量下降。各个组别为：载体GFP阴性对照；CD19 carT(carT无4-1BB)；CD19 carT(carT含4-1BB)。

图6：脐血T细胞经过PSA-NCAM和CD19两轮car病毒感染，在单独培养生长时，能有效增殖；但在SH-SY5Y细胞存在时，生长缓慢。

图7：CD19 carT能有效杀伤靶细胞SH-SY5Y-CD19(细胞株SH-SY5Y表达CD19抗原)，PSA-NCAM/CD19双靶向carT不能杀伤靶细胞SH-SY5Y-CD19。

图8：脐带血T细胞经过CD19 car慢病毒转染，能识别杀伤SH-SY5Y-CD19，不能杀伤母本SH-SY5Y细胞，表现了专一性靶向CD19抗原。

序列表

<110> 银丰生物工程集团有限公司

<120> 靶向CD19抗原的转基因T 细胞及其制备方法与应用

<141> 2017-10-18

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser

130 135 140

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly

165 170 175

Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

180 185 190

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

195 200 205

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

210 215 220

Arg Gly Gly Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg

245 250 255

Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser

260 265 270

Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu

275 280 285

Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val

290 295 300

Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala

305 310 315 320

Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys

325 330 335

Ser Trp Pro Leu

340

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gacgttgtga tgacccaaac cccgcttagt ttgcctgtga gtttgggaga ccaagcgagt 60

atcagttgcc ggtcaagcca atctctggtt catagcaacg gaaacactta tttgtactgg 120

tacctgcaga aaccagggca gagcccaaaa cctctgattt accgcgtctc caatagattt 180

agtggggtac ctgaccggtt ttcaggtagt gggtcaggga ctgacttcac gcttaaaatc 240

agccgagtgg aggccgaaga tctgggggtt tacttttgtt tccaagggac acatgttcct 300

tatacattcg ggggcgggac tagacttgag attaaaggcg gtggtggttc agggggagga 360

ggttcaggcg gcgggggttc ccagatacaa cttcagcagt ctggaccaga actcgtgagg 420

cccggggctt ccgtgaaaat atcttgtaaa gcctcaggat acacatttac agattattac 480

attcactggg tgaagcagag gccaggggag ggcctggagt ggatcggatg gatatacccc 540

ggttcaggga acactaagta taacgaaaag ttcaaaggga aagcgacgct caccgtagat 600

acatccagtt ccacagcgta catgcaactg tcatcactta cgtctgaaga ttcagcagtg 660

tatttctgtg ccagaggagg gaaattcgca atggactact gggggcaggg tacaagtgta 720

accgtgtcta gtagtcgggc ggcaagagga accataggag cacgaaggac gggtcagccc 780

ctgaaggagg acccctccgc agttcccgtg ttttccgttg attacggtga attggacttt 840

cagtggcggg aaaagacccc ggagcctcct gttccgtgcg taccagaaca aacagaatac 900

gcgacaattg tgttcccgag cgggatgggc actagctctc cagcaagacg agggagtgcc 960

gatggccccc gctctgcgca gccgctgcgg cccgaggacg gtcattgttc ttggcctctc 1020

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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<210> 4

<211> 50

<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 7

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

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Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

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Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro

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Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn

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Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp

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Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr

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Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

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Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His

195 200 205

Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp

225 230 235 240

Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr

260 265 270

His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His

275 280 285

Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser

290 295 300

Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Gly Ser Ser Asp Phe Ile Arg

305 310 315 320

Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly

325 330 335

Ala Leu Phe Leu His Gln Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

340 345 350

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

355 360 365

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

370 375 380

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

385 390 395 400

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

405 410 415

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

420 425 430

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

435 440 445

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

450 455 460

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

465 470 475 480

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

485 490 495

Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

500 505 510

Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu

515 520 525

Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys

530 535 540

Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile

545 550 555 560

Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly

565 570 575

Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His

580 585 590

Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys

595 600 605

Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr

610 615 620

Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys

625 630 635 640

Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser

645 650 655

Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile

660 665 670

Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys

675 680 685

Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly

690 695 700

Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser

705 710 715 720

Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg

725 730 735

Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu

740 745 750

Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His

755 760 765

Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly

770 775 780

Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys

785 790 795 800

Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val

805 810 815

Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn

820 825 830

Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn

835 840 845

Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu

850 855 860

Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg

865 870 875 880

His Ile Val

<210> 8

<211> 2655

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atgctgttgc tcgtgacgtc cctgcttctt tgcgaacttc ctcacccagc cttccttttg 60

atccccgaag aagttaagct tcaagagtcc ggcccagggt tggttgcccc cagccaatca 120

ttgtctgtga catgcacggt ctcaggagtt tccttgccag actatggtgt ctcatggata 180

cgacaacccc cacgcaaagg cctggaatgg ctcggtgtta tctgggggag tgagactact 240

tactacaact ctgccttgaa atcccgcttg actattatca aagataattc taaatcacag 300

gttttcctta agatgaacag tttgcagacc gatgacaccg ccatatatta ctgtgcaaag 360

cattattact acgggggttc atatgctatg gactactggg gacagggtac cagcgtgact 420

gtttctagcg gaggtggagg aagcggcggt gggggtagtg ggggaggtgg gagtgatatt 480

caaatgaccc agaccacatc atcactgagt gcgtccctcg gtgaccgggt taccatcagc 540

tgccgggcat ctcaggacat tagcaaatac ctgaactggt atcaacaaaa gcccgacgga 600

actgtaaaac tcctgattta tcataccagt aggttgcatt ctggcgtgcc ttcacggttt 660

agtgggtcag gctcagggac cgattatagt ctgacaatta gtaacttgga acaggaggac 720

atagcaacct acttttgtca acaagggaat accttgccat atacattcgg cggtgggaca 780

aagcttgaaa tcactggtgg cggtggctcc cctacccacc tcccctacgt ttcagagatg 840

ctggaggcga gaactgcagg tcatatgcag acacttgcag attttcgaca acttcctgcg 900

cggactttgt ccacacactg gcccccacaa cgctctctcg ggtccagtga ctttattcga 960

atactggtca tattttcagg aatgtttctg gtatttacct tggctggagc attgtttctc 1020

catcaatccg tcgttaaaag gggccgcaaa aaattgctct acatattcaa gcaacctttt 1080

atgcgccctg tccagacgac acaagaggaa gacgggtgca gctgcagatt tcccgaagaa 1140

gaggaggggg gttgcgagct ccgagtaaag ttctcaagaa gcgcagatgc tccggcttat 1200

caacaaggtc aaaaccagtt gtacaacgaa ttgaaccttg ggaggcggga ggaatatgat 1260

gttctcgata agcggcgcgg gagagaccca gaaatggggg gaaagccgcg gcgcaagaac 1320

ccacaggaag gcttgtacaa tgaattgcag aaagataaaa tggccgaggc atattccgaa 1380

attgggatga agggtgagcg gcgcaggggg aagggacacg atggattgta tcaagggctc 1440

agcaccgcta caaaagacac ctacgacgcc ctgcatatgc aagcacttcc tcctagagag 1500

ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga accccggccc catggcctgt 1560

ggggccgaca gctatgagat ggaggaagac ggcgtccgca agtgtaagaa gtgcgaaggg 1620

ccttgccgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 1680

aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 1740

ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 1800

ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 1860

gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 1920

caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 1980

tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 2040

gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 2100

agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 2160

cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 2220

ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 2280

aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 2340

acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 2400

gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 2460

gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 2520

ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 2580

ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gcgaaggcgc 2640

cacatcgttt gataa 2655

<210> 9

<211> 4869

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atggcaccca agaaaaagcg taaggtgggg atccacggcg ttccagcggc tgataaaaaa 60

tattctatcg gtctggacat tggaacaaat tctgtcggtt gggcagtaat tacggatgaa 120

tataaagttc ctagcaaaaa gtttaaggta ttaggcaaca ccgatcgtca ctcaatcaag 180

aaaaacctga ttggcgcgtt actgttcgac agtggtgaaa ctgcagaggc cacccgcctt 240

aagcgtactg ctcgccgccg ctatactcgt cgtaagaatc gcatttgcta tcttcaggag 300

atcttctcta acgaaatggc gaaggttgac gattcttttt tccaccgctt agaagaatct 360

ttcctggtcg aggaggacaa gaagcatgaa cgccatccga tcttcggcaa cattgtcgat 420

gaagtcgcat atcacgaaaa gtatccaacc atctaccact tgcgtaagaa actggtcgac 480

tcaactgata aagccgactt gcgccttatc taccttgctc ttgcccatat gattaaattt 540

cgtggtcact ttttaattga aggagacctt aacccggaca attctgacgt tgacaagttg 600

ttcatccagc ttgtgcagac ctataaccaa ttattcgagg aaaacccgat caacgcttcc 660

ggagtggacg cgaaggctat tctttccgct cgtcttagta aatctcgccg cctggagaac 720

ctgattgcac aattgcctgg tgagaagaag aatggccttt tcggcaactt gattgcgtta 780

agcttaggcc tgacaccaaa ttttaagtcc aatttcgatt tggcagaaga cgctaagctg 840

caattaagca aagatactta tgacgatgat ttagataatt tgctggctca gattggcgac 900

cagtacgcgg accttttcct tgcggcgaag aatcttagtg acgctatcct gctttctgat 960

atcctgcgcg ttaatactga gatcacgaag gcgccgctta gtgcaagtat gattaagcgc 1020

tacgacgagc atcatcagga ccttacatta cttaaagcat tggttcgcca acaattaccg 1080

gaaaaataca aagagatctt tttcgatcag tcgaagaacg gttacgcagg atacatcgat 1140

ggcggggcat cccaagagga gttttataaa ttcatcaagc ctattttaga gaaaatggac 1200

ggtactgagg agctgctggt aaaactgaat cgtgaagact tacttcgcaa gcaacgcaca 1260

tttgacaatg gatcgatccc ccaccagatt cacttgggcg aattgcacgc gatccttcgt 1320

cgtcaggagg acttctaccc cttcttaaaa gacaaccgtg agaagattga gaaaattttg 1380

accttccgca ttccctacta tgtcggacct ctggcacgcg gaaactctcg ctttgcttgg 1440

atgacccgca aatcagagga gacgattacc ccatggaact ttgaggaggt tgtcgacaag 1500

ggagcctccg cgcaaagctt tattgagcgt atgactaact tcgataaaaa tcttcccaac 1560

gaaaaggtgt tgcccaagca ttcccttctg tatgaatact tcaccgttta taacgaatta 1620

acgaaggtaa agtacgtaac agaggggatg cgcaaacccg ccttccttag cggtgaacag 1680

aagaaagcca ttgttgacct gttattcaag actaaccgta aagtaacggt aaagcaactt 1740

aaagaggact atttcaagaa aattgagtgc tttgacagcg tggagatttc gggtgtggag 1800

gaccgcttca acgcttcgct tggtacgtat cacgatttgt tgaagattat taaagacaaa 1860

gatttcttag ataatgagga aaatgaggac attttagagg acatcgtctt gacactgacg 1920

ctgttcgagg accgcgagat gatcgaagaa cgtcttaaga cttatgctca cttgtttgat 1980

gataaagtca tgaaacagtt gaagcgtcgc cgctatacgg gctggggtcg cctttcccgt 2040

aaattaatta acgggattcg tgataaacag tctggcaaga caattctgga ttttttgaag 2100

tcggacgggt tcgcgaatcg taattttatg caactgatcc acgacgactc tctgactttc 2160

aaggaagata ttcagaaagc tcaggtgtcg ggccaaggtg acagtttgca cgaacatatt 2220

gctaaccttg ccggttctcc tgctatcaaa aaaggtatcc ttcagacagt caaggtcgtc 2280

gacgaattag taaaggtaat ggggcgccat aaacctgaga acatcgtcat cgagatggca 2340

cgtgagaatc aaaccacaca gaaggggcaa aagaactccc gtgaacgtat gaagcgtatt 2400

gaagagggga ttaaagagtt gggctcccag attcttaaag agcacccggt cgagaatacc 2460

caactgcaaa acgaaaaatt atacctttat tatttgcaga atggacgcga tatgtatgtg 2520

gatcaagagt tagatattaa tcgtctgtca gactacgacg tcgaccacat cgttccgcaa 2580

tcattcttaa aggatgactc tatcgataac aaggtcttga ctcgttctga taagaatcgc 2640

ggaaagtccg acaacgttcc atcagaggag gtcgtcaaga aaatgaagaa ttattggcgt 2700

cagcttttga atgccaaact gattacacaa cgcaaatttg acaaccttac aaaggcggaa 2760

cgtggtggac tttccgaatt ggataaggcg ggctttatta agcgccaact ggttgaaacc 2820

cgccagatca ccaaacatgt ggcccaaatt ttggactccc gtatgaatac caagtacgat 2880

gagaatgata agcttattcg tgaggttaag gtcattactc ttaaatcaaa gttggtcagt 2940

gattttcgca aggactttca gttctacaaa gtccgcgaga tcaataacta ccatcatgcg 3000

cacgacgctt atttaaacgc cgtagtagga acggccctga ttaaaaaata cccaaaactt 3060

gagagcgagt ttgtgtatgg ggactataag gtttacgacg ttcgtaaaat gatcgccaaa 3120

tctgagcaag aaatcggcaa agcaactgcc aaatatttct tttacagtaa catcatgaat 3180

tttttcaaga cagaaatcac attggccaat ggggagattc gtaaacgtcc tttaattgag 3240

accaacggcg agactggcga gattgtatgg gataagggac gtgactttgc gacagtgcgc 3300

aaagtcttat ccatgccaca ggtgaacatc gtgaagaaaa ccgaggtgca aactggtggc 3360

ttctctaagg aatcaatcct gccaaagcgt aatagtgata aacttattgc tcgcaaaaag 3420

gactgggacc cgaaaaagta cggtggattc gactcaccta cagtcgcata ctcggttctt 3480

gtcgtcgcaa aagtcgagaa agggaaatca aaaaagttaa agtcggttaa ggagcttctt 3540

gggatcacaa tcatggagcg ctcaagtttt gagaagaatc ctattgattt tttggaagca 3600

aaagggtata aagaggtaaa aaaggactta atcattaaat tgcccaaata cagtcttttt 3660

gaacttgaaa acgggcgtaa gcgtatgctt gcgagcgcgg gcgagctgca aaagggtaat 3720

gaattagcac tgccatcgaa atacgtcaac ttcttatacc tggcctcaca ttacgagaaa 3780

cttaaaggat ccccggagga taacgaacaa aagcaactgt ttgtagagca gcataagcac 3840

tatctggatg aaattatcga acaaatcagc gagttcagca aacgtgtgat cttggcggac 3900

gctaaccttg acaaggtact gagtgcctat aacaaacatc gtgacaagcc cattcgtgaa 3960

caggccgaaa acattatcca ccttttcact ctgacgaact tgggagcgcc ggccgcattt 4020

aagtactttg acactacgat cgatcgcaag cgctatacat ccactaagga ggtattggac 4080

gcgaccctta tccatcaaag cattacggga ctttacgaga cacgtatcga cctttcacaa 4140

ttaggaggag ataaacgtcc agccgcgacc aaaaaagcag gccaggccaa gaagaaaaag 4200

gaatttgggt ctggagaggg acgtggctcc ttgcttacgt gcggtgatgt cgaggaaaac 4260

ccgggaccta tgaccgaata caagcccacc gtacgcttag ccacccgcga cgacgttcca 4320

cgcgcagtgc gcacgttagc tgcagcattc gcagactatc ccgcaactcg tcacactgtt 4380

gaccccgatc gccatattga gcgtgtaacc gaacttcagg agttattttt gacgcgtgta 4440

ggtttagata ttggaaaggt gtgggtagca gatgatggcg cggcggtggc agtgtggacc 4500

acaccggagt cagtggaggc aggtgccgtg tttgcagaga tcgggcctcg tatggccgaa 4560

ttatccggct cgcgtttagc tgcccaacag caaatggaag gacttttagc cccacaccgt 4620

cctaaggaac cagcctggtt tttagcgact gtgggtgtct cccccgatca ccaaggaaag 4680

gggctgggaa gcgccgttgt tttacccggt gtagaagcgg cagagcgtgc aggagtacct 4740

gcgtttctgg aaacgtcagc tcctcgtaat ttacccttct atgagcgcct tggctttaca 4800

gttacagcag acgtcgaggt tcccgaaggc cctcgcacat ggtgtatgac ccgtaagccc 4860

ggagcttga 4869

<210> 10

<211> 98

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gcggagagct tcgtgctaaa cgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgct 98

<210> 11

<211> 98

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggtgcggcaa cctacatgat ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgct 98

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga gcttcgtgtg ataatggtac 60

cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgctt 100

<210> 13

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct acatgtgata aaatgagttg 60

accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagt 99

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ttcctcacct ctctccatct c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ctctctttga tctgcgcctt 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tgagttcact gagttccctt tg 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gaaatggctt tgctcaccaa tta 23

Claims

1.一种靶向CD19抗原的受体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.一种编码权利要求1所述的靶向CD19抗原受体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.一种重组慢病毒表达载体Ⅱ，其特征在于：其包含有权利要求2所述的编码靶向CD19抗原受体的基因。

4.一种靶向CD19抗原的转基因T细胞，其特征在于：为包含有权利要求3所述的重组慢病毒表达载体Ⅱ的、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，或染色体中整合有权利要求2所述的编码靶向CD19抗原受体的基因、且敲除了PD1基因或/和CTLA4基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。

5.权利要求4所述的靶向CD19抗原的转基因T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)重组慢病毒表达载体Ⅱ慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，得重组T细胞；

(2)gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞，即得靶向CD19抗原的转基因T细胞；所述gRNA为靶向PD1基因的gRNA或靶向CTLA4基因的gRNA，所述HDR为PD1基因的HDR或CTLA4基因的HDR。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述CRISPR-cas9mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

所述靶向PD1基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

所述靶向CTLA4基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

所述PD1基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述CTLA4基因的HDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

7.一种靶向CD19抗原的转基因T细胞，其特征在于：为包含有重组慢病毒表达载体Ⅰ、权利要求3所述的重组慢病毒表达载体Ⅱ的原始细胞，或染色体中整合有编码靶向PSA-NCAM受体的基因、权利要求2所述的编码靶向CD19抗原受体的基因的原始细胞，所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞；

所述编码靶向PSA-NCAM受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述重组慢病毒表达载体Ⅰ，其包含有编码靶向PSA-NCAM受体的基因，以及靶向PD1基因的shRNA或/和靶向CTLA4基因的shRNA。

8.根据权利要求7所述的靶向CD19抗原的转基因T细胞，其特征在于：所述靶向PD1基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.3所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.4所示；

所述靶向CTLA4基因的shRNA，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如序列表SEQNO.5所示，反义链的核苷酸序列如序列表SEQ NO.6所示。

9.权利要求7或8所述的靶向CD19抗原的转基因T细胞的制备方法，其特征在于：使用两轮慢病毒感染CD4+T细胞或CD8+T细胞，第一轮感染重组慢病毒表达载体Ⅰ，第二轮感染重组慢病毒表达载体Ⅱ；两轮感染后，即得靶向CD19抗原的转基因T细胞。

10.权利要求4或7所述的靶向CD19抗原的转基因T细胞在制备治疗恶性B细胞淋巴瘤的药物中的应用。