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ES2612935T3 - Anticuerpos, dominios variables y cadenas adaptados para su uso en seres humanos - Google Patents

Anticuerpos, dominios variables y cadenas adaptados para su uso en seres humanos Download PDF

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ES2612935T3
ES2612935T3 ES12772122.3T ES12772122T ES2612935T3 ES 2612935 T3 ES2612935 T3 ES 2612935T3 ES 12772122 T ES12772122 T ES 12772122T ES 2612935 T3 ES2612935 T3 ES 2612935T3
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ES
Spain
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human
gene
segments
heavy chain
vertebrate
Prior art date
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ES12772122.3T
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English (en)
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Allan Bradley
Glenn Friedrich
E-Chiang Lee
Mark STRIVENS
Nicholas ENGLAND
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Kymab Ltd
Original Assignee
Kymab Ltd
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Publication date
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Abstract

Un método para producir una cadena pesada, un dominio VH o un anticuerpo específicos para un antígeno diana, en donde la cadena pesada, el dominio VH o el anticuerpo comprenden una HCDR3 de al menos 20 aminoácidos de longitud, comprendiendo el método proporcionar un vertebrado no humano, opcionalmente un ratón o una rata, que tiene un genoma que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segmento de un gen humano no reordenado JH6*02, uno o más segmentos del gen VH y uno o más segmentos del gen D aguas arriba de una región constante; en donde los segmentos de genes en el locus de la cadena pesada están conectados operablemente a la región constante de la misma de manera que el vertebrado es capaz de producir una cadena pesada de anticuerpo producida mediante recombinación de JH6*02 humano con un segmento de D humano y un segmento de VH humano, en donde el segmento del gen JH6*02 comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: ATTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAG, y en donde el vertebrado ha sido inmunizado con el antígeno diana y produce una cadena pesada de anticuerpo específica para el antígeno diana en donde el dominio variable de la cadena pesada es el producto de la recombinación entre un VH, D y JH6*02 humanos y en donde la longitud de la HCDR3 es de al menos 20 aminoácidos, y aislar del vertebrado no humano la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo específicos para el antígeno diana o una célula productora de la cadena pesada, el dominio VH o el anticuerpo, en donde la cadena pesada, el dominio VH o el anticuerpo comprenden una HCDR3 que deriva de la recombinación de JH6*02 humano con un segmento del gen VH humano y un segmento del gen D humano, opcionalmente en donde la región constante del locus es una región constante del vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata), y la región constante no humana de la cadena pesada aislada o el anticuerpo es remplazada por una región constante humana.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos, dominios variables y cadenas adaptados para su uso en seres humanos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la provision de anticuerpos terapeuticos y profilacticos que se adaptan espedficamente para el uso en seres humanos.
En la presente memoria se describen bibliotecas, vertebrados y celulas, tales como ratones o ratas transgenicos o celulas de raton o rata transgenicos. La invencion se refiere a metodos de utilizacion de los vertebrados para el aislamiento de una cadena pesada, un dominio VH o anticuerpos. Tambien se describen anticuerpos, cadenas pesadas, polipeptidos, secuencias de nucleotidos, composiciones farmaceuticas. La invencion tambien proporciona las utilizaciones.
Antecedentes
El estado de la tecnica proporciona vertebrados no humanos (p. ej., ratones y ratas) y celulas que comprenden loci de inmunoglobulina transgenica, comprendiendo tales loci segmentos variables (V), de diversidad (D) y/o de union (J) humanos y opcionalmente regiones constantes humanas. Alternativamente, se proporcionan en los loci transgenicos las regiones constantes endogenas del anfitrion vertebrado (p. ej., regiones constantes de raton o rata). Los metodos de construccion de tales vertebrados transgenicos y el uso de estos para generar anticuerpos y acidos nucleicos de los mismos despues de la inmunizacion con antfgeno son conocidos en la tecnica, p. ej., veanse los documentos US7501552 (Medarex), US5939598 (Abgenix), US6130364 (Abgenix), WO02/066630 (Regeneron), WO2011004192 (Genome Research Limited), WO2009076464, WO2009143472 y WO2010039900 (Ablexis). Tales loci transgenicos en la tecnica incluyen cantidades variables del repertorio V(D)J humano. Los loci de inmunoglobulinas transgenicas existentes se basan en una unica fuente de ADN humano. La diversidad potencial de las regiones variables de los anticuerpos humanos en los vertebrados no humanos que portan tales loci transgenicos es, pues, limitada.
Los autores de la presente invencion consideraron que sena deseable adaptar los genomas de estos vertebrados transgenicos no humanos (y por tanto anticuerpos y cadenas de anticuerpos producto de estos) para hacer frente a la variabilidad - y homogeneidad - en el uso de genes de anticuerpos naturales de los seres humanos. Los autores de la presente invencion quisieron realizar esto con el fin de abordar mejor el uso en seres humanos de farmacos terapeuticos y profilacticos basados en anticuerpos.
Sena deseable tambien proporcionar un repertorio y una diversidad novedosos potencialmente ampliados de regiones variables humanas en loci de inmunoglobulinas transgenicas y vertebrados no humanos que alberguen los mismos, asf como en anticuerpos producidos despues de la inmunizacion de estos animales.
Compendio de la invencion
La invencion es como se expone en las reivindicaciones.
La presente invencion se ha desarrollado a partir de un extenso analisis bioinformatico de las distribuciones de los segmentos genicos de anticuerpos naturales a traves de una minada de diferentes poblaciones humanas y a traves de mas de dos mil muestras de individuos humanos. Los autores de la presente invencion han llevado a cabo esta tarea enorme para comprender mas a fondo y disenar sistemas de vertebrados no humanos y los anticuerpos resultantes para abordar mejor la terapeutica medica en seres humanos en su conjunto, asf como para permitir el diseno racional para abordar poblaciones etnicas espedficas de seres humanos. Utilizando semejante diseno racional, los autores de la presente invencion han construido vertebrados transgenicos no humanos y anticuerpos aislados, cadenas de anticuerpos y celulas que expresan estos de una manera que proporciona productos que utilizan segmentos de genes que se han incluido a proposito basandose en el analisis bioinformatico de los seres humanos. Los ejemplos ilustran experimentos elaborados en los que los autores de la presente invencion aislaron muchas celulas y anticuerpos con este fin.
La descripcion se refiere a repertorios de genes de inmunoglobulina superhumanos sinteticamente ampliados y etnicamente diversos. La descripcion proporciona por lo tanto diversidades de inmunoglobulinas sinteticas novedosas y potencialmente ampliadas, proporcionando asf una reserva de diversidad a partir de la cual se pueden seleccionar compuestos terapeuticos principales de anticuerpos humanos. Esta reserva ampliada es util cuando se trata de encontrar anticuerpos con caractensticas deseables, tales como una afinidad relativamente alta para un antfgeno diana sin la necesidad de una maduracion adicional de la afinidad (p. ej., utilizando tecnicas laboriosas in vitro tales como la presentacion en fagos o ribosomas), o mejores caractensticas bioffsicas, o para dirigirse a dianas y nuevos epftopos que han sido diffciles de tratar con anticuerpos no alcanzados por los sitios de union de anticuerpos anteriores.
La descripcion tambien proporciona una diversidad que es potencialmente sesgada hacia el uso de genes variables
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comunes para los miembros de una poblacion humana espedfica, que es util para la generacion de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades o afecciones dentro de tal poblacion. Esta capacidad de sesgo del repertorio de anticuerpos permite adaptar agentes terapeuticos de anticuerpos con el objetivo de tratar y/o prevenir de manera mas eficaz las enfermedades o afecciones medicas en las poblaciones humanas espedficas.
Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de la posibilidad de proporcionar segmentos de genes de inmunoglobulina de fuentes dispares en loci transgenicos, con el fin de proporcionar diversidades de anticuerpos novedosas y potencialmente ampliadas a partir de las cuales se pudieran generar anticuerpos terapeuticos (y reactivos herramienta de anticuerpos. Esto abre el potencial de las tecnologfas de humano-raton/rata transgenicos a la posibilidad de interrogar espacios de secuencias de anticuerpos diferentes y posiblemente mas grandes de lo que ha sido posible hasta ahora.
En el diseno racional de loci de anticuerpos transgenicos, asf como anticuerpos y cadenas de anticuerpos, los autores de la presente invencion tambien se dieron cuenta de que a menudo es deseable una dimension de HCDR3 relativamente larga (al menos 20 aminoacidos) para abordar los epftopos. Por ejemplo, se han aislado anticuerpos de origen natural de seres humanos infectados con patogenos de enfermedades infecciosas, teniendo tales anticuerpos una dimension de HCDR3 larga. En este sentido se han encontrado anticuerpos neutralizadores. Sena deseable una dimension de HCDR3 larga para hacer frente a otros antfgenos (p. ej., hendiduras de receptores o sitios activos de enzimas), no solo limitada a agentes patogenos de enfermedades infecciosas, y por lo tanto los autores de la presente invencion se dieron cuenta de la conveniencia general de la posibilidad de modificar loci transgenicos para poder producir anticuerpos y cadenas pesadas con HCDR3 largas. Los autores de la presente invencion, a traves de la ejecucion laboriosa de la bioinformatica en mas de 2000 muestras de ADN humano a traves del proyecto 1.000 Genomas junto con opciones de secuencias racionales, identificaron que es deseable la inclusion de la variante del segmento del gen humano espedfico JH6*02 para la produccion de anticuerpos y cadenas con HCDR3 largas.
El diseno racional adicional y la bioinformatica han llevado a los autores de la presente invencion a darse cuenta de que las variantes de regiones constantes humanas espedficas se conservan a traves de muchas poblaciones humanas diversas. Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que esto abre la posibilidad de hacer una eleccion para humanizar anticuerpos, cadenas y dominios variables mediante la utilizacion de tales regiones constantes espedficas en los productos, en lugar de elegir arbitrariamente la region constante humana (o una version sintetica de una region constante humana). Este aspecto de la descripcion tambien permite adaptar los farmacos basados en anticuerpos a las poblaciones humanas etnicas espedficas, compatibilizando de ese modo el farmaco con el paciente mas estrechamente (y por lo tanto ajustandolo a la enfermedad) de lo que hasta ahora se habfa logrado. Puede ser un problema en el estado de la tecnica que los anticuerpos sean humanizados con la eleccion arbitraria de una region constante humana (presumiblemente derivada de una poblacion etnica (a menudo desconocida) o de origen no natural) que no funciona tan bien en pacientes de una poblacion etnica humana diferente. Esto es importante, ya que la region constante tiene el papel principal en el suministro de las funciones efectoras de los anticuerpos, p. ej., para el reciclaje del anticuerpo, para el reclutamiento celular y del complemento y para la destruccion celular.
En la presente invencion se describe:
Primera configuracion
Un vertebrado no humano o una celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula productora de anticuerpos) que comprende un genoma que tiene un repertorio de genes VH y/o D y/o J humanos de la cadena pesada de inmunoglobulina superhumana.
Un vertebrado no humano o una celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o celula productora de anticuerpos) que comprende un genoma que tiene un repertorio de genes VL humanos de la cadena ligera de inmunoglobulina superhumana; opcionalmente en donde el vertebrado o la celula estan de acuerdo con la primera configuracion.
Un vertebrado no humano o celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o celula productora de anticuerpos) cuyo genoma comprende un locus de inmunoglobulina transgenica (p. ej., un locus de cadena pesada o un locus de cadena ligera), comprendiendo dicho locus segmentos de genes de inmunoglobulina de acuerdo con el primer y segundo segmentos de genes de inmunoglobulina humana (opcionalmente segmentos V) como se menciona a continuacion conectados operablemente aguas arriba de una region constante de inmunoglobulina; opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de inmunoglobulina transgenica;
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen V; y/u
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de segmentos funcionales del gen D;
y/u opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de
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los segmentos funcionales del gen J.
Un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula productora de anticuerpos) cuyo genoma comprende un locus de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos de genes de inmunoglobulina humana conectados operablemente aguas arriba de una region constante de vertebrado no humano para la produccion de un repertorio de anticuerpos quimericos, o cadenas ligeras o pesadas quimericas, que tienen una region constante de vertebrado no humano y una region variable humana; en donde el locus transgenico comprende uno o mas segmentos del gen V de la inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen J humano y opcionalmente uno o mas segmentos del gen D humano, siendo el primero (opcionalmente un segmento V) de dichos segmentos de genes y el segundo (opcionalmente un segmento V) de dichos segmentos de genes diferentes y derivados de los genomas de un primer y un segundo individuos humanos respectivamente, en donde los individuos son diferentes; y opcionalmente no estan relacionados;
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen V; y/u
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen D; y/u
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen J.
Un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o una rata) o celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula productora de anticuerpos) cuyo genoma comprende un primer y un segundo loci de inmunoglobulina transgenica, comprendiendo cada locus una pluralidad de segmentos de genes de inmunoglobulina humana conectados operablemente aguas arriba de una region constante de vertebrado no humano para la produccion de un repertorio de anticuerpos quimericos, o cadenas ligeras o pesadas quimericas, que tienen una region constante de vertebrado no humano y una region variable humana;
en donde (i) el primer locus transgenico comprende uno o mas segmentos del gen V de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen J humano y opcionalmente uno o mas segmentos del gen D humano, (ii) el segundo locus transgenico comprende uno o mas segmentos del gen V de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen J humano y, opcionalmente, uno o mas segmentos del gen D humano; y (iii) en donde un primer segmento genico (opcionalmente V) de dicho primer locus y un segundo segmento genico (opcionalmente V) de dicho segundo locus son diferentes y derivan de los genomas de un primer y un segundo individuos humanos, respectivamente, en donde los individuos son diferentes; y opcionalmente no estan relacionados;
opcionalmente en donde el primer y segundo loci estan en diferentes cromosomas (opcionalmente cromosomas con el mismo numero de cromosoma) en dicho genoma;
opcionalmente en donde cada locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen V; y/u
opcionalmente en donde cada locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen D; y/u
opcionalmente en donde cada locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos funcionales del gen J.
Un metodo de construccion de una celula (p. ej. una celula ES) de acuerdo con la descripcion, comprendiendo el metodo
(a) la identificacion de los segmentos funcionales de los genes V y J (y opcionalmente D) de la secuencia del genoma de un (o de dicho) primer individuo humano;
(b) la identificacion de uno o mas segmentos funcionales de los genes V y/o D y/o J de la secuencia del genoma de un (o de dicho) segundo individuo humano, en donde estos segmentos de genes adicionales no se encuentran en la secuencia del genoma del primer individuo;
(c) y la construccion de un locus de inmunoglobulina transgenica en la celula, en donde los segmentos de genes de
(a) y (b) se proporcionan en el locus conectado operablemente aguas arriba de una region constante.
En una realizacion, el segmento o los segmentos de genes de la etapa (b) se identifico o se identificaron a partir de una base de datos de genes de inmunoglobulina seleccionada entre las bases de datos 1000 Genomes (1000 Genomas), Ensembl, GenBank e IMGT.
A lo largo de este texto, GenBank es una referencia a un numero de lanzamiento de GenBank 185.0 o 191.0; la base de datos 1000 Genomas es la Fase 1, publicacion v3 de 16 de marzo de 2012; la base de datos Ensembl es el
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conjunto GRCh37.p8 (10/04/2012); la base de datos IMGT esta disponible en
www.imgt.org.
En una realizacion, el primer y segundo individuos humanos son miembros de la primera y segunda poblaciones etnicas, respectivamente, en donde las poblaciones son diferentes, opcionalmente en donde el segmento del gen de inmunoglobulina humana derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo es de baja frecuencia (opcionalmente raro) dentro de la segunda poblacion etnica.
Esta configuracion de la descripcion tambien proporciona un metodo para preparar un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo
(a) la construccion de una celula ES (p. ej., una celula ES de una cepa de raton C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv) llevando a cabo el metodo anterior;
(b) la inyeccion de la celula ES en un blastocisto del vertebrado no humano donante (p. ej., un blastocisto de una cepa de raton C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv);
(c) la implantacion del blastocisto en una madre de acogida vertebrada no humana (p. ej., un raton de la cepa C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv); y
(d) la obtencion de una cna de dicha madre, en donde el genoma de la cna comprende un locus de inmunoglobulina transgenica.
En una realizacion, la invencion proporciona un metodo de aislamiento de un anticuerpo que se une a un antfgeno predeterminado (p. ej., un antfgeno de patogeno bacteriano o viral), comprendiendo el metodo la inmunizacion de un vertebrado no humano de acuerdo con la descripcion.
Segunda configuracion
Una biblioteca de celulas transgenicas productoras de anticuerpos cuyos genomas codifican colectivamente un repertorio de anticuerpos, en donde
(a) una primera celula transgenica expresa un primer anticuerpo que tiene una cadena codificada por un primer gen de inmunoglobulina, comprendiendo el gen una primera secuencia de nucleotidos del dominio variable producida tras la recombinacion de un primer segmento del gen de la inmunoglobulina humana no reordenado;
(b) una segunda celula transgenica expresa un segundo anticuerpo que tiene una cadena codificada por un segundo gen de inmunoglobulina, comprendiendo el segundo gen una segunda secuencia de nucleotidos del dominio variable producida tras la recombinacion de un segundo segmento del gen de la inmunoglobulina humana no reordenado, no siendo identicos el primer y el segundo anticuerpos;
(c) el primer y segundo segmentos de genes son diferentes y derivan de las secuencias del genoma del primer y segundo individuos humanos respectivamente, en donde los individuos son diferentes; y opcionalmente no estan relacionados;
(d) en donde las celulas son celulas de vertebrados no humanos (p. ej., raton o rata).
En una realizacion, el primer y segundo individuos humanos son miembros de la primera y segunda poblaciones etnicas respectivamente, en donde las poblaciones son diferentes; opcionalmente en donde las poblaciones etnicas se seleccionan entre las identificadas en la base de datos de 1000 Genomas.
En otra realizacion, el segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana es una variante polimorfica del primer segmento del gen de inmunoglobulina humana; opcionalmente en donde el segundo segmento del gen se selecciona del grupo que consiste en un segmento del gen de cualquiera de las Tablas 1 a 7 y 9 a 14 de mas abajo (p. ej., seleccionado de la Tabla 13 o la Tabla 14), p. ej., el segundo segmento del gen es una variante polimorfica de VH1-69.
Tercera configuracion Un anticuerpo aislado que tiene
(a) una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleotidos producida tras la recombinacion en una celula de vertebrado no humano transgenico de un segmento del gen V de inmunoglobulina humana no reordenado con un segmento de D humano y de J humano, opcionalmente con maduracion de afinidad en dicha celula, en donde uno de los segmentos de genes deriva del genoma de un individuo de una primera poblacion etnica humana; y los otros dos segmentos de genes derivan del genoma de un individuo de una segunda poblacion etnica humana diferente, y en donde el anticuerpo comprende las regiones constantes de la cadena pesada de dicho vertebrado no humano (p. ej., regiones constantes de la cadena pesada de roedor, raton o rata); y/o
(b) una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleotidos producida tras la recombinacion en una celula de
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vertebrado no humano transgenico de un segmento del gen V de inmunoglobulina humana no reordenado con un segmento J humano, opcionalmente con maduracion de afinidad en dicha celula, en donde uno de los segmentos de genes deriva del genoma de un individuo de una primera poblacion etnica humana (opcionalmente la misma que la primera poblacion de (a)); y el otro segmento del gen deriva del genoma de un individuo a partir de una segunda poblacion etnica humana, diferente (opcionalmente la misma que la segunda poblacion de (a)), y en donde el anticuerpo comprende regiones constantes de la cadena ligera de dicho vertebrado no humano (p. ej., regiones constantes de la cadena ligera de roedor, raton o rata);
(c) Opcionalmente en donde cada dominio variable del anticuerpo es un dominio variable humano.
(d) Opcionalmente en donde las regiones constantes de la cadena pesada son regiones constantes de tipo gamma.
La descripcion tambien proporciona una secuencia de nucleotidos aislada que codifica el anticuerpo, opcionalmente en donde la secuencia se proporciona en un vector de expresion del anticuerpo, opcionalmente en una celula anfitriona.
La invencion tambien proporciona un metodo de produccion de un anticuerpo humano, comprendiendo el metodo la sustitucion de las regiones constantes de vertebrados no humanos del anticuerpo de la tercera configuracion por regiones constantes de anticuerpos humanos.
La descripcion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la tercera configuracion, o un anticuerpo producido de acuerdo con el metodo anterior y un diluyente, excipiente o portador; opcionalmente en donde la composicion se proporciona en un recipiente conectado a una aguja o una jeringa IV o en una bolsa IV.
La descripcion tambien proporciona una celula productora de anticuerpos que expresa el segundo anticuerpo citado en una cualquiera de las configuraciones.
En una configuracion alternativa, la descripcion contempla la combinacion de secuencias de nucleotidos del primer y segundo segmentos de genes de inmunoglobulina (p. ej., dos o mas variantes polimorficas de un segmento del gen VH o VL de la lmea germinal humana en particular) para proporcionar un segmento del gen sintetico. Semejante segmento del gen sintetico se utiliza, en una realizacion, para construir un locus de inmunoglobulina transgenica, en donde el segmento del gen sintetico se proporciona combinado con una o mas regiones variables y J humanas (y opcionalmente una o mas regiones D humanas) conectadas operablemente aguas arriba de una region constante. Cuando se proporciona en el genoma de un vertebrado o celula no humanos (p. ej., una celula de raton o rata, p. ej., una celula ES), la descripcion proporciona una diversidad de segmentos del gen superhumano. Las secuencias que se van a combinar se pueden seleccionar entre segmentos de genes que se ha observado que se utilizan comunmente en los anticuerpos humanos originados contra un antfgeno particular (p. ej., un antfgeno de la gripe, tal como la hemaglutinina). Mediante la combinacion de las secuencias, el segmento del gen sintetico se puede recombinar in vivo para producir un anticuerpo que se adapte bien al tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad o afeccion (p. ej., influenza) mediada por dicho antfgeno.
Cuarta configuracion
Un vertebrado no humano (opcionalmente, un raton o una rata) o una celula de vertebrado cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende el segmento del gen humano JH6*02, uno o mas segmentos del gen Vh y uno o mas segmentos del gen D aguas arriba de una region constante; en donde los segmentos de genes en el locus de la cadena pesada estan unidos operablemente a la region constante de la misma de manera que el raton es capaz de producir una cadena pesada de anticuerpo producida por la recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D y un segmento de VH.
Una celula de vertebrado no humano (opcionalmente una celula de raton o una celula de rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segmento del gen JH6*02 humano, uno o mas segmentos del gen VH y uno o mas segmentos del gen D aguas arriba de una region constante; en donde los segmentos de genes en el locus de la cadena pesada estan unidos operablemente a la region constante de la misma para producir (p. ej., en una celula de la progenie posterior) una cadena pesada de anticuerpo producida por recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D y un segmento de VH.
Una cadena pesada (p. ej., compuesta por un anticuerpo) aislada de un vertebrado de la invencion en donde la cadena pesada comprende una HCDR3 de al menos 20 aminoacidos.
Un metodo para producir una cadena pesada, un dominio VH o un anticuerpo espedfico para un antfgeno diana, comprendiendo el metodo la inmunizacion de un vertebrado no humano de acuerdo con la descripcion con el antfgeno y el aislamiento de la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo espedfico para un antfgeno diana o una celula que produce la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo, en donde la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo comprenden una HCDR3 que deriva de la recombinacion de JH6*02 humano con un segmento del gen VH y un segmento del gen D.
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Una cadena pesada, un dominio VH, o un anticuerpo producidos por el metodo.
Una celula B o hibridoma que expresan un dominio VH de la cadena pesada que es identico al dominio VH de la cadena pesada.
Un acido nucleico que codifica el dominio VH de la cadena pesada descrito en la presente memoria, o que codifica la cadena pesada.
Un vector (p. ej., un vector de celulas CHO o de celulas HEK293) que comprende el acido nucleico; opcionalmente en donde el vector esta en una celula anfitriona (p. ej., una celula CHO o una celula HEK293).
Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, la cadena pesada o el dominio VH (p. ej., incluidos en un anticuerpo), junto con un excipiente, diluyente o medicamento farmaceuticamente aceptable (p. ej., un dominio variable espedfico del antigeno adicional, una cadena pesada o un anticuerpo).
El anticuerpo, la cadena pesada o el dominio VH (p. ej., compuesto por un anticuerpo) anteriores para su uso en medicina.
El uso de un anticuerpo, cadena pesada o dominio VH (p. ej., compuesto por un anticuerpo) anteriores en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de una afeccion medica en un ser humano.
Quinta Configuracion
Un metodo de produccion de una cadena pesada de anticuerpo, comprendiendo el metodo
(a) proporcionar un dominio variable de cadena pesada espedfico del antigeno; y
(b) combinar el dominio variable con una region constante de la cadena pesada humana para producir una cadena pesada de anticuerpo que comprende (en direccion N a C terminal) del dominio variable y la region constante;
en donde la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a.
Un anticuerpo que comprende una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno y una region constante que es una region constante IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a. Opcionalmente, el dominio variable comprende mutaciones somaticas de AID en el patron de raton.
Un polipeptido que comprende (en direccion N a C terminal) una secuencia lfder, un dominio variable humano que es espedfico para un antigeno y una region constante humana que es una region constante IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, lGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a en donde (i) la secuencia lfder no es la secuencia lfder del dominio variable humano nativo; y/o (ii) el dominio variable comprende mutaciones somaticas en el patron de AID del raton y/o mutaciones en las regiones de union del patron de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de raton.
Un secuencia de nucleotidos que codifica (en direccion 5' a 3') una secuencia lfder y una cadena pesada de anticuerpo humano, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante que es una region constante IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a; y siendo la secuencia lfder operable para la expresion de la cadena pesada y en donde la secuencia lfder no es la secuencia lfder del dominio variable humano nativo.
Una secuencia de nucleotidos que codifica (en direccion 5' a 3') un promotor y una cadena pesada de anticuerpo humano, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante que es una region constante IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a; y siendo el promotor operable para la expresion de la cadena pesada y en donde el promotor no es el promotor humano nativo.
Un vector (p. ej., un vector de celula CHO o de celula HEK293) que comprende una secuencia de nucleotidos de la region constante IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a que esta en 3' de un sitio de clonacion para la insercion de una secuencia de nucleotidos de dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo humano, de manera que tras la insercion de semejante secuencia de dominio variable el vector comprende (en direccion 5' a 3') un promotor, una secuencia lfder, la secuencia del dominio variable y la secuencia de la region constante de modo que el vector es capaz de expresar una cadena pesada de anticuerpo humano cuando esta presente en una celula anfitriona.
Sexta Configuracion
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 3 segmentos de genes de la region variable humana del
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mismo tipo (p. ej., al menos 3 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 3 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 3 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 3 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 3 segmentos de genes JK1 humanos), en donde al menos dos de los segmentos de genes humanos son variantes que no son identicas entre st
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 3 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos) en cis en el mismo locus de Ig.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen humano del mismo tipo, en donde el tercer segmento del gen esta en cis con uno de dichos 2 segmentos de genes diferentes.
Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio de segmentos de genes de la region variable humana, en donde la pluralidad comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos), el primero de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primera vertebrado no comprende el segundo segmento del gen.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogena diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos), en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 3 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 3 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 3 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 3 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 3 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 3 segmentos de genes Jk1 humanos), en donde al menos dos de los segmentos de genes humanos son variantes que no son identicas entre sf.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6- 1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos) en cis en el mismo locus de Ig.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen humano del mismo tipo, en donde el tercer segmento del gen esta en cis con uno de dichos 2 segmentos de genes diferentes.
Un metodo para proporcionar un repertorio de segmentos de genes de la region variable de inmunoglobulina humana mejorado, comprendiendo el metodo proporcionar una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., un raton o rata) que comprende un repertorio de segmentos de genes de la region variable humana, en donde el metodo comprende proporcionar al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos), en donde el primero de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no
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comprende el segundo segmento del gen.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos), en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos de genes VH6-1 humanos, al menos 2 segmentos de genes JH6 humanos, al menos 2 segmentos de genes Vk1-39 humanos, al menos 2 segmentos de genes D2-2 humanos o al menos 2 segmentos de genes Jk1 humanos), en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones; opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende un primer y un segundo segmentos de genes del locus de Ig humana del mismo tipo (p. ej., el primer y el segundo segmentos de genes JH6 humanos; o el primer y el segundo segmentos de genes IgG2; o el primer y el segundo segmentos de genes JA7 humanos), en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado entre uno cualquiera de las Tablas 1 y 9 a 14 (p. ej., seleccionados de la Tabla 13 o la Tabla 14) (p. ej., IGHJ6-a) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente.
Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un primer y un segundo segmentos de genes del locus de Ig humana del mismo tipo (p. ej., el primer y segundo segmentos de genes JH6 humanos; o el primer y segundo segmentos de genes IgG2; o el primer y segundo segmentos de genes JA7 humanos), en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado de una cualquiera de los Tablas 1 y 9 a 14 (p. ej., seleccionado de la Tabla 13 o la Tabla 14) (p. ej., IGHJ6-a) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente, en donde el primer segmento del gen se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo segmento del gen se proporcionan en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende un primer y un segundo segmentos de genes del locus de Ig humana del mismo tipo (p. ej., un primer y un segundo segmentos de genes JH6 humano, o un primer y un segundo segmentos de genes IgG2, o un primer y un segundo segmentos de genes JA7 humanos), en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado de una cualquiera de las Tablas 1 y 9 a 14 (p. ej., seleccionado de la Tabla 13 o la Tabla 14) (p. ej., IGHJ6-a) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente.
En un aspecto de esta configuracion, la descripcion se refiere a variantes del segmento del gen D humano como se describe mas adelante.
En un aspecto de esta configuracion, la descripcion se refiere a variantes del segmento del gen V humano como se describe mas adelante.
En un aspecto de esta configuracion, la descripcion se refiere a variantes del segmento del gen J humano como se describe mas adelante.
Breve descripcion de las figuras
Figuras 1 a 3: Representacion esquematica que ilustra un protocolo para la produccion de vectores BAC modificados geneticamente por recombinacion para anadir segmentos de genes V en un genoma de raton;
Figura 4: Representacion esquematica que ilustra un protocolo para la adicion de segmentos de genes V a un genoma de raton utilizando intercambio de casete mediado por recombinasa secuencial (sRMCE); y
Figura 5 (en 4 partes): Alineamiento de 13 variantes de IGHV1-69 que muestran la region codificante variable (V) solamente. Los nucleotidos que difieren de la variante *01 de VH1-69 se indican en la posicion apropiada mientras que los nucleotidos identicos estan marcados con un guion. Cuando los cambios de nucleotidos dan como resultado diferencias de aminoacidos, el aminoacido codificado se muestra por encima del triplete correspondiente. Las regiones recuadradas corresponden a las CDR1, CDR2 y CDR3 como se indica.
La Figura 6 es una representacion esquematica que ilustra la diversidad del segmento del gen y el efecto de incluir
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variantes de variantes en cis de acuerdo con la descripcion: -
(a) Situacion en una persona normal: La recombinacion en el mismo cromosoma limita las combinaciones de variantes, por ejemplo, el gen del anticuerpo V4-4 solo se puede recombinar dentro de la variante 1 para formar, por ejemplo, V4-4-D-J6 o V4-4-D-J2A. Del mismo modo la variante V4-4A no puede ser recombinada con ninguno de J6 o J2a de la variante 1 y solo se pueden unir con genes J de la variante 2 para formar V4-4A-D-J6A y V4-4A-D-J2. Complejidad de V4-4-J2/J6 = 4.
(b) Situacion en un raton transgenico: Solo se proporciona una variante por lo que el genoma es limitado. Complejidad de V4-4-J6/J2 = 2.
(c) Raton de la descripcion anterior: Las variantes se anaden en cis y por lo tanto se pueden recombinar en cada combinacion, ampliando el repertorio. Por ejemplo V4-4 se puede combinar con J6A, J6, J2A o J2 y de manera similar V4-4A se puede recombinar con estos mismos genes J. La complejidad de V4-4-J6/J2 = 8, que en este ejemplo simple es el doble que la de una persona y 4X la de un raton con una sola variante.
Figura 7: Alineamiento de variantes JH602 humanas. Los nucleotidos que difieren de JH6*01 se indican en la posicion apropiada mientras que los nucleotidos identicos estan marcados con un guion. Cuando los cambios de nucleotidos dan como resultado diferencias de aminoacidos, el aminoacido codificado se muestra arriba. Los numeros de acceso (p. ej., J00256) se muestran a la izquierda del nombre de la variante IMGT.
Figura 8: Alineamiento de las secuencias JH de diversas especies.
Figura 9: Tabla de codones
Figura 10: Extracto de la base de datos de BAC
Breve descripcion de las tablas
Tabla 1: Variantes polimorficas de V de IgH humana Tabla 2: Variantes polimorficas de D de IgH humana Tabla 3: Variantes polimorficas de J de IgH humana Tabla 4: Variantes polimorficas de Vk de Ig humana Tabla 5: Variantes polimorficas de VA de Ig humana Tabla 6: Variantes polimorficas de Jk IgH humana Tabla 7: Variantes polimorficas de JA de IgH humana Tabla 8: Poblaciones humanas del Proyecto 1000 Genomas
Tabla 9: Uso de genes de inmunoglobulina en las respuestas de anticuerpos humanos a patogenos de enfermedades Infecciosas
Tabla 10A: Apariciones de variantes de JH5 de IgH humana
Tabla 10B: Variantes de JH5 de IgH humana No Sinonimas
Tabla 11A: Apariciones de variantes de JH6 de IgH humana
Tabla 11 B: Variantes de JH6 de IgH humana No Sinonimas
Tabla 12A: Apariciones de variantes de JH2 de IgH humana
Tabla 12B: Variantes de JH2 de IgH humana No Sinonimas
Tabla 13: Analisis de frecuencia de variantes y distribucion de poblacion humana
Tabla 14: Distribuciones de variantes humanas frecuentes
Tabla 15: Uso de segmentos de genes humanos: Repertorios de cadena pesada de vertebrados no humanos no sometidos a tratamiento previo
Tabla 16: Uso de segmentos de genes humanos: Repertorios de cadena pesada vertebrados no humanos inmunizados
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Tabla 17: Uso de segmentos de genes humanos: Repertorios de cadena pesada de hibridomas espedficos del antigeno
Tabla 18: Tabla de correlacion de secuencias
Tabla 19: Resumen de la funcion correlacionada con el subtipo de la region constante gamma humana Tabla 20: Segmentos de genes que prevalecen en pocas poblaciones humanas Tabla 21: Informacion genomica y de secuencia Descripcion detallada de la invencion
Una fuente adecuada de JH6*02 y otras secuencias de ADN humano para su uso en la invencion sera facilmente evidente para el experto. Por ejemplo, es posible recoger una muestra de ADN de un donante humano con su consentimiento (p. ej., una muestra de raspado bucal como en el Ejemplo de la presente memoria) a partir de la cual se pueden obtener secuencias de ADN adecuadas para su uso en la construccion de un locus de la invencion. Otras fuentes de ADN humano estan disponibles comercialmente, como sera conocido por la persona experta. Alternativamente, la persona experta es capaz de construir la secuencia de un segmento del gen remitiendose a una o mas bases de datos de secuencias de segmentos de genes de Ig humana descritas en la presente memoria.
Una fuente ilustrativa para segmentos de genes V, D y J humanos de acuerdo con la invencion son los Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC RPCl-11) obtenidos de Roswell Park Cancer Institute (RPCl)/Invitrogen. Vease
http://bacpac.chori.org/hmale11.htm, que describe los BAC de la siguiente manera: -
Biblioteca de BAC de varon humano RPCl-11
La biblioteca de BAC de varon humano RPCl-11 (Osoegawa et al., 2001) se construyo utilizando tecnicas de clonacion mejoradas (Osoegawa et al., 1998) desarrolladas por Kazutoyo Osoegawa. La biblioteca fue generada por Kazutoyo Osoegawa. La construccion fue financiada por una subvencion del Instituto Nacional de Investigacion del Genoma Humano (NHGRI, NIH) (Num. 1R01RG01165-03). Esta biblioteca se genero de acuerdo con el nuevo NHGRI/DOE " Guidance on Human Subjects in Large-Scale DNA Sequencing...
"Se obtuvo sangre masculina a traves de un protocolo de seleccion doble ciego. El ADN de la sangre masculina fue aislado de un donante elegido al azar (de un total de 10 donantes masculinos)".
Osoegawa K, Mammoser AG, Wu C, Frengen E, Zeng C, Catanese JJ, de Jong PJ; Genome Res. Mar 2001; 11(3): 483-96; "A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome";
Osoegawa, K., Woon, P.Y., Zhao, B., Frengen, E., Tateno, M., Catanese, J.J, y de Jong, P.J. (1998); "An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries"; Genomics 52, 1-8.
Repertorios de genes de inmunoglobulina superhumana
La descripcion se refiere a repertorios de genes de inmunoglobulina superhumanos sinteticamente ampliados y etnicamente diversos. Los repertorios de inmunoglobulina humana estan mas alla de los que se encuentran en la naturaleza (es decir, "Superhumanos"), por ejemplo, son mas diversos que un repertorio humano natural o comprenden combinaciones de segmentos de genes de inmunoglobulina humana de diferentes fuentes de una manera que no es natural. Por lo tanto, los repertorios descritos en la presente memoria son repertorios de inmunoglobulina "superhumanos", y la descripcion se refiere a la aplicacion de estos en celulas transgenicas y vertebrados no humanos por su utilidad en la produccion de anticuerpos quimericos (con la posibilidad de convertir estos en anticuerpos aislados totalmente humanos, utilizando la tecnologfa del ADN recombinante). La presente descripcion proporciona de este modo diversidades de inmunoglobulina sinteticas novedosas y potencialmente ampliadas, lo que proporciona una reserva de diversidad a partir de la cual se pueden seleccionar anticuerpos terapeuticos (agentes terapeuticos de anticuerpos y reactivos de herramientas de anticuerpos). Esto abre el potencial de las tecnologfas de humano-raton/rata transgenicos a la posibilidad de interrogacion de espacios de secuencias de anticuerpos diferentes y posiblemente mas grandes de lo que hasta ahora habfa sido posible. Con este fin, en una realizacion, la descripcion proporciona un SUPERHUMAN MOUSE™ (tambien conocido como SUPRA-MOUSE™) y una SUPERHUMAN RAT™ (tambien conocida como SUPRA-RAT™).
En el desarrollo de esta forma de pensar, los autores de la presente invencion se han dado cuenta de la posibilidad de explotar los enormes recursos geneticos ya disponibles para el experto gracias a esfuerzos como el HapMap Project, Proyecto 1000 Genomas y otras diversas bases de datos de genes de inmunoglobulina (vease mas abajo para mas detalles). Por lo tanto, en algunas realizaciones, los autores de la presente invencion se dieron cuenta de la aplicacion de estos avances en la secuenciacion del genoma de la presente descripcion para generar repertorios de genes de inmunoglobulinas artificiales producidas sinteticamente y etnicamente diversas. En un aspecto, los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que tales repertorios eran utiles para la produccion de anticuerpos que tienen una afinidad y/o unas caractensticas bioffsicas mejoradas y/o en donde el intervalo de especificidades de epftopo producidas por medio de semejante repertorio es novedoso, proporciona anticuerpos
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para epriopos que han sido hasta ahora intratables por los loci de inmunoglobulina transgenica anteriores o diriciles de abordar.
La presente descripcion proporciona bibliotecas, vertebrados y celulas, tales como ratones o ratas transgenicos o celulas transgenicas de raton o rata. Ademas, la invencion se refiere a metodos de uso de los vertebrados para aislar anticuerpos o secuencias de nucleotidos que codifican anticuerpos. Tambien se describen anticuerpos, secuencias de nucleotidos y composiciones farmaceuticas. La presente invencion tambien proporciona los usos.
Analisis de variacion
Los autores de la presente invencion han reconocido los metodos y disenos de loci de anticuerpos que aprovechan la potencia del analisis de variacion genetica. El genoma humano de referencia proporciona una base para el trabajo experimental y el analisis genetico de muestras humanas. El ser humano de referencia es una compilacion de los genomas de un pequeno numero de individuos y para cualquier segmento del genoma se encuentra disponible un genoma de referencia unico de alta calidad para uno de los dos cromosomas. Debido a que el genoma de referencia se ensambla a partir de una serie de clones de insercion muy grande, se conoce la identidad de estos clones. De acuerdo con ello, el trabajo experimental con el ADN genomico humano se lleva a cabo normalmente en los clones de los que procede la secuencia de referencia.
Los seres humanos individuales difieren en su secuencia y, recientemente, se han secuenciado los genomas de varios individuos, por ejemplo, James Watson y Craig Venter. La comparacion de la secuencia del genoma de estos individuos ha revelado diferencias entre sus secuencias y el genoma de referencia en las partes tanto codificantes como no codificantes del genoma, aproximadamente 1 de cada 1000 bases son diferentes. Algunas variantes seran significativas y contribuiran a las diferencias entre individuos. En casos extremos estos daran lugar a una enfermedad genetica. La variacion puede estar implicada en diferentes respuestas a los farmacos administrados a pacientes humanos, por ejemplo, produciendo una indeseable reduccion de la respuesta del paciente al tratamiento.
El Proyecto 1000 Genomas tiene el objetivo de identificar las variaciones mas frecuentes en el genoma humano. Este proyecto de dominio publico implico la secuenciacion de los genomas de mas de 1000 personas de diversos grupos etnicos, la comparacion de estas secuencias con la referencia y el montaje de un catalogo de variantes. Esto ha permitido a la anotacion de variantes en las regiones codificantes, pero debido a que esta secuencia no derivaba de grandes clones de ADN, el analisis de la secuencia de los individuos diploides no puede discriminar la distribucion de la variacion entre los cromosomas heredados de la madre y del padre. Cuando se identifica mas de una variante en un gen que codifica una protema, no es posible esclarecer la distribucion del patron de las variantes en cada version de la protema. Por ejemplo, si se detectan dos variantes en diferentes posiciones de la misma protema en un individuo, esto podria ser el resultado de una copia con dos variantes y ninguna en la otra o cada copia podria tener solo una variante. Para esclarecer la secuencia de las protemas reales, el 1000-Genome Project ha secuenciado trios de madre-padre-hijo. Esto permite "escalonar" las variantes de secuencia, en otras palabras, identificar los bloques de secuencia que se heredan de uno u otro de los padres y desentranar las variantes.
Para comprender mejor la variacion dentro del conjunto de los 1000 Genomas se ha desarrollado una herramienta que puede identificar las variantes significativas (definidas como cambios de aminoacidos no sinonimos) de una region de ADN a partir de los datos en fase en el conjunto de datos de los 1000 Genomas. Esta herramienta se encuentra disponible en la red
http://www.1000genomes.org/variation-pattern-finder. Esta herramienta permite a un investigador descargar la variacion no sinonima delimitada entre las coordenadas espedficas. Los archivos descargados se configuran como genotipos individuales, pero los datos estan escalonados por lo que se pueden extraer la informacion del haplotipo y las frecuencias de haplotipos espedficos en diferentes poblaciones.
El analisis de los autores de la presente invencion de los datos de los 1000 Genomas para los segmentos codificantes humanos individuales de los genes C, V D y J de las cadenas pesada y ligera revela que existe una variacion significativa en estos segmentos. Los individuos por lo general tendran dos alelos de cadena pesada diferentes y tambien diferentes alelos de cadena ligera, en los loci tanto kappa como lambda. El repertorio de anticuerpos que puede ser generado a partir de cada alelo sera diferente. Esta variacion contribuira a una respuesta inmunitaria mejor o diferente para ciertos anrigenos.
Los ratones humanizados que se han generado hasta ahora con loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina contienen un solo tipo de locus de inmunoglobulina. Incluso si estos ratones contienen un locus de cadena pesada humana completa, la variacion sera menor que la contenida en un ser humano ripico, porque solo se encuentra disponible un conjunto de genes C, V, D y J, mientras que un ser humano ripico tendria dos conjuntos.
Los autores de la presente invencion han ideado formas de mejorar esta limitacion en la construccion de los vertebrados y las celulas no humanos transgenicos para la produccion de anticuerpos humano y regiones variables in vivo.
Se pueden generar ratones con dos loci diferentes, cada uno disenado para tener un repertorio diferente de segmentos de V, D y J. Esto podria ser en un solo raton, o en dos o mas cepas de raton separadas y seria analogo a o estaria mas alla del repertorio que se encuentra en un ser humano normal. La modificacion de semejante raton iria mas alla del repertorio descrito en los ratones humanizados hasta la fecha, que solo tienen un juego de alelos.
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Sin embargo, los autores de la presente invencion tambien se dieron cuenta de que esto tambien tiene limitaciones, porque los diferentes loci normalmente no interaction para mezclar las variantes de V, D y J entre loci. Esta misma limitacion tambien es inherente a un ser humano, por lo que este sistema no utiliza la ventaja de la recombinacion de variantes en todas las combinaciones.
Para ir mas alla del repertorio normal en los seres humanos y aprovechar las combinaciones de variantes de C, V, D y J los autores de la presente invencion decidieron, en una realizacion, proporcionar estos en el mismo cromosoma en cis. Vease la Figura 6. Estos loci se caracterizanan por tener mas que el numero normal de genes J, Do V. Por ejemplo, n = 6 para los genes J, pero incluyendo una variante J6 y una variante J2 aumentana esto a n = 8. Esto se podna combinar con variantes adicionales de los genes D y V, por ejemplo. Mediante el analisis detallado de la base de datos de los 1000 Genomas, los autores de la presente invencion han ideado una coleccion de segmentos de genes de variante humanas polimorficos candidatos, por ejemplo, segmentos de genes JH (p. ej., veanse los ejemplos), que puede ser incorporada al diseno de loci de cadena pesada y ligera transgenicas en ratones para expresar repertorios sinteticos cada vez mas diversos y nuevos, de regiones variables humanas. Por otra parte, mediante la utilizacion de segmentos de genes de variantes humanas de origen natural, segun las realizaciones de la invencion, esto esta dirigido a la compatibilidad con pacientes humanos puesto que el analisis de los autores de la presente invencion ha sacado variantes candidato que son naturalmente conservadas y, a veces muy frecuentes entre las poblaciones etnicas humanas. Ademas esto permite a uno adaptar las configuraciones de la descripcion para proporcionar medicamentos basados en anticuerpos que abordan mejor las poblaciones etnicas humanas espedficas.
En un ejemplo de acuerdo con cualquier configuracion de la descripcion, se proporcionan loci (y las celulas y los vertebrados que los comprenden) en los que se utilizan segmentos de genes de diferentes poblaciones humanas. Esto es deseable para aumentar la diversidad de genes de anticuerpos para abordar mejor pacientes humanos mas diversos. En un ejemplo, los segmentos de genes son de una primera y una segunda poblaciones humanas diferentes, respectivamente, y por lo tanto el segundo segmento del gen se encuentra en la segunda poblacion humana, pero no asf (o rara vez) en la primera poblacion humana. Rara vez significa, por ejemplo, que el segmento del gen se encuentra en 5, 4, 3, 2, o 1 o cero de los individuos de la primera poblacion en la base de datos de los 1000 Genomas. Por ejemplo, el primer segmento del gen se puede mostrar como presente en una primera poblacion por referencia a la Tabla 13 o 14 en la presente memoria, el segundo segmento del gen se puede mostrar como presente en la segunda poblacion por referencia a la Tabla 13 y no en la primera poblacion. Opcionalmente, el primer segmento del gen tambien se puede mostrar como presente en la segunda poblacion por referencia a la Tabla 13 o 14.
En cualquier configuracion o aspecto de la invencion, donde se utiliza un segmento del gen V, esto se puede utilizar opcionalmente con la secuencia lfder nativa. Por ejemplo, el uso de ADN genomico (p. ej., de BAC como en los ejemplos) significara que el lfder nativo sera utilizado para cada segmento del gen V incorporado al locus y los genomas de la descripcion. En una alternativa, el experto puede desear hacer inerte una secuencia lfder no nativa junto con uno o mas de los segmentos del gen V. De manera similar, en cualquier configuracion o aspecto de la invencion, donde se utiliza un segmento del gen V, esto se puede utilizar opcionalmente con la secuencia UTR 5' nativa. Por ejemplo, el uso de ADN genomico (p. ej., de BAC como en los ejemplos) significara que la secuencia UTR 5' nativa se utilizara para cada segmento del gen V incorporado al locus y los genomas de la descripcion. En una alternativa, el experto puede desear excluir la secuencia UTR 5' nativa.
Se describen en la presente memoria, en una primera configuracion
(a) Repertorios de genes de cadena pesada superhumanos
Un vertebrado o celula de vertebrado no humano (opcionalmente una celula ES o un celula productora de anticuerpos) que comprenden un genoma que tiene un repertorio de genes VH y/o D y/o J humanos de una cadena pesada de inmunoglobulina superhumana.
En un aspecto, la celula de la descripcion es una celula madre embrionaria. Por ejemplo, la celula ES deriva de la cepa C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv de raton. En un aspecto, el vertebrado no humano es un roedor, adecuadamente un raton, y las celulas de la descripcion, son celulas de roedores o celulas ES, adecuadamente celulas ES de raton. Las celulas ES de la presente descripcion se pueden utilizar para generar animales utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica, que comprenden la inyeccion de la celula ES en un blastocisto seguido de la implantacion de los blastocistos quimericos en hembras para producir descendencia que puede ser criada y seleccionada para determinar los homocigotos recombinantes que tienen la insercion requerida. En un aspecto, la descripcion se refiere a un animal transgenico que comprende tejido derivado de celulas ES y tejido derivado de embrion del anfitrion. En un aspecto, la descripcion se refiere a los animales de la siguiente generacion geneticamente alterados, que incluyen animales que tienen recombinantes homocigotos para las regiones VDJ y/o VJ.
El repertorio de segmentos de genes de inmunoglobulina humana natural consiste en (vease, p. ej., www.imgt.orq): - VH: total 125; funcionales 41
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DH: total 27; funcionales 23 JH: total 8; funcionals 6 Vk: total 77; funcionales 38 Jk: total 5; funcionales 5 V lambda: total 75; funcionales 31 J lambda: total 7; funcionales 5
En una realizacion, el genoma de vertebrado o celula comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos del gen VH de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen D humano y uno o mas segmentos del gen J humano, en donde la pluralidad de segmentos del gen VH consiste en mas que el repertorio humano natural de segmentos del gen VH funcionales; opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de cadena pesada transgenica.
En una realizacion del vertebrado o celula, el repertorio del gen VH consiste en una pluralidad de segmentos del gen VH derivados de la secuencia del genoma de un primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen VH diferentes derivados de la secuencia del genoma de un segundo individuo humano diferente. Opcionalmente, los segmentos de D y J derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano. Opcionalmente, los segmentos del gen Vh de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen VH enumerados en la Tabla 1, 13 o 14. De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen D.
Opcionalmente, los individuos no estan relacionados. Los individuos "no estan relacionados" en el contexto de cualquier configuracion o aspecto de la descripcion, por ejemplo, si uno de los individuos no aparece en un arbol familiar del otro individuo de la misma generacion o de una, dos, tres o cuatro generaciones anteriores. Por otra parte, no estan relacionados, por ejemplo, si no comparten un ancestro comun en la generacion actual o en una, dos, tres o cuatro generaciones anteriores.
En una realizacion del vertebrado o celula, el locus transgenico comprende mas de 41 especies de segmentos del gen VH humano funcionales, y por lo tanto mas que el repertorio funcional humano natural. Opcionalmente, el locus comprende al menos 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 especies de segmentos del gen VH humano funcionales (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio de VH funcional completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen VH derivados de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen VH derivados de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano). De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen VH que es util para generar un nuevo gen y una diversidad de anticuerpos para su uso en terapia y en la seleccion de anticuerpos herramienta.
En una realizacion del vertebrado o celula, el locus transgenico comprende un primer segmento del gen VH derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen VH derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen VH es una variante polimorfica del primer segmento del gen VH. Por ejemplo, los segmentos del gen VH son variantes polimorficas de VH1-69 como se ilustra en los ejemplos siguientes. Opcionalmente, el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen VH (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano). De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen VH.
En una realizacion del vertebrado o celula, el genoma (alternativamente o adicionalmente a la diversidad de VH superhumano) comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos del gen VH de inmunoglobulina humana, una pluralidad de segmentos del gen D humano y uno o mas segmentos del gen J humano, en donde la pluralidad de segmentos del gen D consiste en mas que el repertorio humano natural de segmentos del gen D funcionales. Opcionalmente, el genoma es homocigoto para dicho locus de cadena pesada transgenica.
En una realizacion del vertebrado o celula, el repertorio del gen D consiste en una pluralidad de segmentos del gen D derivados de la secuencia del genoma de un (o de dicho) primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen D diferentes derivados de la secuencia del genoma de un segundo (o de dicho), individuo humano diferente. Opcionalmente, los individuos no estan relacionados. Opcionalmente, los segmentos de J derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano. Opcionalmente, los segmentos del gen D de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen D enumerados en la Tabla 2, 13 o 14. De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen D.
En una realizacion del vertebrado o celula, el locus transgenico comprende mas de 23 especies de segmentos del gen D humano funcionales; opcionalmente en donde el locus comprende al menos 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 especies del segmento del gen D humano funcionales (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio D funcional
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completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen D derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen D derivado de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano). De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen D.
En una realizacion del vertebrado o celula, el locus transgenico comprende un primer segmento del gen D derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen D derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen D es una variante polimorfica del primer segmento del gen D. Opcionalmente, el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen D (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano). De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen D.
En una realizacion del vertebrado o celula (alternativamente o adicionalmente a la diversidad de VH y/o JH superhumanos), el genoma comprende un (o dicho) locus de la cadena pesada de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos del gen VH de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen D humano y una pluralidad de segmentos del gen JH humano, en donde la pluralidad de segmentos del gen J consiste en mas que el repertorio humano natural de segmentos del gen J funcionales; opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de cadena pesada transgenica.
En una realizacion del vertebrado o celula, el repertorio del gen JH consiste en una pluralidad de segmentos del gen J derivado de la secuencia del genoma de un (o de dicho) primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen J diferentes derivados de la secuencia del genoma de un segundo (o de dicho), individuo humano diferente. Opcionalmente, los individuos no estan relacionados. Opcionalmente los segmentos de D derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano. Opcionalmente, los segmentos del gen J de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen J enumerados en la Tabla 3, 13 o 14. De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen JH.
En una realizacion del vertebrado o celula, el locus transgenico comprende mas de 6 segmentos del segmento del gen JH humano funcionales. Opcionalmente, el locus comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16 segmentos del gen JH humano funcionales (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio de JH funcional completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen JH derivados de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen JH derivados de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano). De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen JH.
En una realizacion del vertebrado o celula, el locus transgenico comprende un primer segmento del gen JH derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen JH derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen JH es una variante polimorfica del primer segmento del gen JH. Opcionalmente, el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen JH (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano). De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen JH.
(b) Repertorios de genes de cadena ligera superhumana
La primera configuracion de la descripcion tambien proporciona: -
Un vertebrado o celula de vertebrado no humano (opcionalmente una celula ES o celula productora de anticuerpos) que comprende un genoma que tiene un repertorio del gen VL humano de cadena ligera de inmunoglobulina superhumana. Opcionalmente, el vertebrado o celula comprenden un transgen de cadena pesada de acuerdo con el aspecto (a) de la primera configuracion. Por lo tanto, la diversidad superhumana se proporciona en los segmentos de genes de inmunoglobulina de cadena tanto pesada como ligera en la celula y en el vertebrado. Por ejemplo, el genoma de la celula o del vertebrado es homocigoto para los transgenes de cadena pesada y ligera y la expresion de anticuerpos endogenos esta inactivada. Semejante vertebrado es util para la inmunizacion con un antfgeno predeterminado para producir uno o mas anticuerpos seleccionados que se unen al antfgeno y que tienen regiones variables humanas resultantes de la recombinacion dentro del repertorio de segmentos de genes superhumanos. Esto proporciona potencialmente un nuevo anticuerpo y un espacio de secuencia del gen desde el cual seleccionar anticuerpos terapeuticos, profilacticos y herramienta.
En una realizacion del aspecto (b) de la primera configuracion, el genoma del vertebrado o la celula comprende
(i) un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos del
gen Vk de inmunoglobulina humana y uno o mas segmentos del gen J humano, en donde la pluralidad de
segmentos del gen Vk consiste en mas que el repertorio humano natural de segmentos del gen Vk funcionales;
opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de la cadena ligera kappa transgenica; y/o
(ii) un locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos
del gen VA inmunoglobulina humana y uno o mas segmentos del gen J humano, en donde la pluralidad de
segmentos del gen VA consiste en mas que el repertorio humano natural de segmentos del gen VA funcionales;
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opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de la cadena ligera lambda transgenica.
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen VL.
En una realizacion del vertebrado o celula,
(i) el repertorio del gen Vk consiste en una pluralidad de segmentos del gen Vk derivados de la secuencia del genoma de un primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen Vk derivados de la secuencia del genoma de un segundo individuo humano, diferente; opcionalmente en donde los individuos no estan relacionados; opcionalmente en donde los segmentos de J derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano; y, opcionalmente, en donde los segmentos del gen Vk de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen Vk enumerados en la Tabla 4, 13 o 14; y
(ii) el repertorio del gen VA consiste en una pluralidad de segmentos del gen VA derivados de la secuencia del genoma de un primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen VA derivados de la secuencia del genoma de un segundo individuo humano diferente; opcionalmente en donde los individuos no estan relacionados; opcionalmente en donde los segmentos de J derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano; y, opcionalmente, en donde los segmentos del gen VA de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen VA enumerados en la Tabla 5, 13 o 14.
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen VL.
En una realizacion del vertebrado o celula,
- el locus transgenico ligero kappa comprende mas de 38 especies de segmentos del gen Vk humano funcionales; opcionalmente en donde el locus comprende al menos 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 o 48 especies del segmento del gen Vk humano funcionales (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio de Vk funcional completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen Vk derivados de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen Vk derivados de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano); y
- el locus transgenico ligera lambda comprende mas de 31 especies de segmentos del gen VA humano funcionales; opcionalmente en donde el locus comprende al menos 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o 41 especies de segmentos del gen VA humano funcionales (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio de VA funcional completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen VA derivados de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen VA derivados de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano).
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen VL.
En una realizacion del vertebrado o celula,
- el locus transgenico ligero kappa comprende un primer segmento del gen Vk derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen Vk derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen Vk es una variante polimorfica del primer segmento del gen Vk; opcionalmente en donde el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen Vk (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano); y
- el locus transgenico ligero lambda comprende un primer segmento del gen VA derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen VA derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen VA es una variante polimorfica del primer segmento del gen VA; opcionalmente en donde el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen VA (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano).
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen VL.
En una realizacion del vertebrado o celula, el genoma comprende un (o dicho) locus de cadena ligera de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos del gen VL de inmunoglobulina humana y una pluralidad de segmentos del gen JL humano, en donde la pluralidad de segmentos del gen J consiste en mas que el repertorio humano natural de segmentos del gen J funcionales; opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de cadena pesada transgenico.
En una realizacion del vertebrado o celula,
(i) el repertorio del gen Jk consiste en una pluralidad de segmentos del gen Jk derivado de la secuencia del genoma de un (o de dicho) primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen Jk derivados de la secuencia del genoma de un (o de dicho) segundo individuo humano diferente; opcionalmente en donde los
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individuos no estan relacionados; opcionalmente en donde los segmentos de Vk derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano; opcionalmente en donde los segmentos del gen Jk de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen Jk enumerados en la Tabla 6, 13 o 14; y
(ii) el repertorio del gen Jk consiste en una pluralidad de segmentos del gen JA derivados de la secuencia del genoma de un (o de dicho) primer individuo humano, con un suplemento de uno o mas segmentos del gen JA derivados de la secuencia del genoma de un (o de dicho) segundo individuo humano diferente; opcionalmente en donde los individuos no estan relacionados; opcionalmente en donde los segmentos de VA derivan de la secuencia del genoma del primer individuo humano; opcionalmente en donde los segmentos del gen JA de la secuencia del genoma del segundo individuo se seleccionan entre los segmentos del gen JA enumerados en la Tabla 7, 13 o 14.
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen JL.
En una realizacion del vertebrado o celula,
(i) el locus de cadena ligera transgenico comprende mas de 5 especies de segmentos del gen Jk humano funcionales; opcionalmente en donde el locus comprende al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 especies de segmentos del gen Jk funcionales completos (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio Jk funcional completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen Jk derivados de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen Jk derivados de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano); y/o
(i) el locus de cadena ligera transgenico comprende mas de 5 especies de segmentos del gen JA humano funcionales; opcionalmente en donde el locus comprende al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 especies de segmentos del gen JA humano funcionales (p. ej., en donde el locus comprende el repertorio de JA funcional completo de dicho primer individuo con un suplemento de uno o mas segmentos del gen JA derivados de la secuencia del genoma del segundo individuo humano y, opcionalmente, con uno o mas segmentos del gen JA derivados de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano).
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen JL.
En una realizacion del vertebrado o celula,
(i) el locus transgenico ligero kappa comprende un primer segmento del gen Jk derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen Jk derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen Jk es una variante polimorfica del primer segmento del gen Jk; opcionalmente en donde el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen Jk (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano); y
(ii) el locus transgenico ligero lambda comprende un primer segmento del gen JA derivado de la secuencia del genoma del primer individuo y un segundo segmento del gen JA derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo, en donde el segundo segmento del gen Jk es una variante polimorfica del primer segmento del gen JA; opcionalmente en donde el locus comprende una variante polimorfica adicional del primer segmento del gen JA (p. ej., una variante derivada de la secuencia del genoma de un tercer individuo humano).
De esta manera, el locus proporciona un repertorio superhumano de segmentos del gen JL.
A continuacion se describen aspectos adicionales de la primera configuracion.
Se describe en la presente memoria, una segunda configuracion
Una biblioteca de celulas transgenicas productoras de anticuerpos cuyos genomas codifican colectivamente un repertorio de anticuerpos, en donde
(a) una primera celula transgenica expresa un primer anticuerpo que tiene una cadena (p. ej., una cadena pesada) codificada por un primer gen de inmunoglobulina, comprendiendo el gen una primera secuencia de nucleotidos del dominio variable producida tras la recombinacion de un primer segmento del gen de la inmunoglobulina humana no reordenado (p. ej., un VH);
(b) una segunda celula transgenica expresa un segundo anticuerpo que tiene una cadena (p. ej., una cadena pesada) codificada por un segundo gen de inmunoglobulina, comprendiendo el segundo gen una segunda secuencia de nucleotidos del dominio variable producida tras la recombinacion de un segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana no reordenado (por ejemplo, un VH), no siendo identicos el primer y segundo anticuerpos;
(c) el primer y segundo segmentos de genes son diferentes y derivados de las secuencias del genoma del primer y segundo individuos humanos respectivamente, en donde los individuos son diferentes; y opcionalmente no relacionados;
(d) en donde las celulas son celulas de vertebrados no humanos (p. ej., raton o rata) (p. ej., celulas B o hibridomas).
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En una realizacion, la biblioteca se proporciona en vitro. En otra realizacion, la biblioteca se proporciona in vivo por uno o una pluralidad de vertebrados no humanos transgenicos. Por ejemplo, el vertebrado o cada uno de los vertebrados estan de acuerdo con cualquier aspecto de la primera configuracion de la descripcion.
En una realizacion, la biblioteca codifica un repertorio de anticuerpos de 10 a 109 anticuerpos, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 108; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 107; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 106; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 105; o 10, 20, 30, 40, 50 100 o 1000 a 104 anticuerpos. En un ejemplo, la biblioteca codifica un repertorio de anticuerpos de al menos 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o 1010 anticuerpos.
La primera secuencia de nucleotidos del dominio variable se produce despues de la recombinacion del primer
segmento del gen de inmunoglobulina humana no reordenado con uno o mas segmentos de genes de
inmunoglobulina (por ejemplo, segmentos de genes de inmunoglobulina humana). Por ejemplo, cuando el primer segmento del gen es un VH, la primera secuencia de nucleotidos del dominio variable (un dominio VH) se produce despues de la recombinacion de VH con un D y segmentos JH humanos in vivo, opcionalmente con hipermutacion somatica, en la primera celula transgenica o en un ancestro de la misma. Por ejemplo, cuando el primer segmento del gen es VL, la primera secuencia de nucleotidos de dominio variable (un dominio VL) se produce despues de la recombinacion de VL con un segmento de JL humano in vivo, opcionalmente con hipermutacion somatica, en la primera celula transgenica o un ancestro de la misma.
La segunda secuencia de nucleotidos del dominio variable se produce despues de la recombinacion del segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana no reordenado con uno o mas segmentos de genes de
inmunoglobulina (por ejemplo, segmentos de genes de inmunoglobulina humana). Por ejemplo, cuando el segundo
segmento del gen es Vh, la segunda secuencia de nucleotidos del dominio variable (un dominio VH) se produce despues de la recombinacion de VH con un D y segmentos de JH humanos in vivo, opcionalmente con hipermutacion somatica, en la segunda celula transgenica o en un ancestro de la misma. Por ejemplo, cuando el segundo segmento del gen es VL, la segunda secuencia de nucleotidos del dominio variable (un dominio VL) se produce despues de la recombinacion de VL con un segmento de JL humano in vivo, opcionalmente con hipermutacion somatica, en la segunda celula transgenica o un antecesor de la misma.
El primer y segundo segmentos de genes derivan respectivamente de secuencias del genoma del primer y segundo individuos humanos. En un ejemplo, semejante segmento de gen aislado o clonado a partir de una celula de la muestra tomada de dicho individuo utilizando tecnicas de biologfa molecular convencionales como las conocidas por los expertos. La secuencia del segmento del gen se puede mutar (p. ej., por la introduccion de hasta 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 cambios de nucleotidos) antes de su uso en la presente descripcion. En otro ejemplo, un segmento del gen se obtiene mediante la identificacion de un segmento del gen de inmunoglobulina humana candidato en una base de datos (vease la grna mas abajo) y una secuencia de nucleotidos que codifica un segmento del gen para su uso en la presente descripcion se realiza mediante la referencia (p. ej., para que sean identicas o un mutante con hasta 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 cambios de nucleotidos con respecto a la secuencia de referencia) a la secuencia de la base de datos. El experto sera consciente de los metodos para obtener secuencias de nucleotidos por medio de la referencia a bases de datos o mediante la obtencion de muestras celulares.
En una realizacion del vertebrado, celula o biblioteca de cualquier configuracion de la descripcion, el primer y segundo individuos humanos son miembros de la primera y segunda poblaciones etnicas, respectivamente, en donde las poblaciones son diferentes. Esto, por lo tanto, proporciona la diversidad de genes superhumanos en loci, celulas y vertebrados transgenicos de conformidad con la descripcion.
Poblaciones humanas
Opcionalmente, las poblaciones etnicas se seleccionan entre las identificadas en el Proyecto 1000 Genomas de la base de datos. A este respecto, vease la Tabla 8, que ofrece detalles de las poblaciones etnicas en las que se basa la base de datos de 1000 Genomas.
N A Rosenberg et al. (Science 20 de diciembre 2002: Vol. 298 num. 56022342-2343) estudiaron la estructura genetica de las poblaciones humanas de diferente ascendencia geografica. En total, se tomaron muestras de 52 poblaciones, siendo estas poblaciones con:
Ascendencia africana
(Pigmeos Mbuti, pigmeos Biaka, pueblos San, y los hablantes de lenguas Nfger-Kordofanas (Bantu, Yoruba o poblaciones Mandenka),
Ascendencia euroasiatica
(Ascendencia europea (Orcadiana, Adygei, Euskera, Francesa, Rusa, Italiana, Sarda, Toscana), ascendencia del Medio Oriente (Mozabita, Beduina, Drusa, Palestina),
Ascendencia de Asia central/sur (Balochi, Brahul, Makrani, Sindhi, Pathan, Burusho, Hazara, Uygur, Kalash)), Ascendencia de Asia Oriental
(Han, Dal, Daur, Hezhen, Lahu, Miao, Oroqen, She, Tujia, Tu, Xibo, Yi, Mongola, Naxi, Camboyana, Japonesa, Yakutia), ascendencia Oceanica (Melanesia, Papua); o
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Ascendencia Americana
(Karitiana, Suri, Colombiana, Maya, Pima).
El Proyecto Internacional HapMap, Nature, 18 Dic 2003; 426 (6968): 789-96, describe el objetivo del Proyecto HapMap: determinar los patrones comunes de la variacion de la secuencia de ADN en el genoma humano mediante la determinacion de los genotipos de un millon o mas de variantes de secuencias, sus frecuencias y el grado de asociacion entre ellos en muestras de ADN de poblaciones con ascendencia de partes de Africa, Asia y Europa. Las poblaciones humanas pertinentes de diferente ascendencia geografica incluyen poblaciones Yoruba, Japonesa, China, del Norte de Europa y de Europa Ocidental. Mas espedficamente:-
La poblacion de Utah con ascendencia del Norte de Europa o Europa Occidental (muestras recogidas en 1980 por el
Centre d'Etude du polymorphisms Humain (CEPH));
poblacion con ascendencia de los pueblos Yoruba de Ibadan, Nigeria;
poblacion con ascendencia Japonesa; y
poblacion con ascendencia de los Chinos Han de China.
Los autores, citando publicaciones anteriores, sugieren que la geograffa ancestral es una base razonable para el muestreo de las poblaciones humanas.
Una muestra adecuada de las poblaciones humanas a partir de las cuales se seleccionan las poblaciones utilizadas en la presente descripcion es la siguiente: -
(a) Ascendencia europea
(b) ascendencia del Norte de Europa; ascendencia de Europea occidental; ascendencia Toscana; ascendencia Britanica, ascendencia Finlandesa o ascendencia Iberica.
(c) Mas espedficamente, la poblacion de residentes de Utah con ascendencia del Norte de Europa y/o Europa Occidental; poblacion Toscana en Italia; poblacion Britanica en Inglaterra y/o Escocia; poblacion Finlandesa en Finlandia; o poblacion Iberica en Espana.
(a) Ascendencia de Asia Oriental
(b) Ascendencia japonesa; ascendencia China o ascendencia Vietnamita.
(c) Mas espedficamente, poblacion Japonesa en Tokio, Japon; poblacion China Han en Beijing, China; poblacion Dai china en Xishuangbanna; poblacion Kinh en Ho Chi Minh, Vietnam; o poblacion China en Denver, Colorado, EE.UU.
(a) Ascendencia de Africa Occidental
(b) Ascendencia Yoruba; ascendencia Luhya; ascendencia de Gambia; o ascendencia Malawi.
(c) Mas espedficamente, poblacion Yoruba en Ibadan, Nigeria; poblacion Luhya en Webuye, Kenia; poblacion de Gambia en la Division Occidental, Gambia; o la poblacion Malawi en Blantyre, Malawi.
(a) Poblacion de las Americas
(b) Ascendencia Nativa Americana; ascendencia Afrocaribena; ascendencia Mejicana; ascendencia Puertorriquena; ascendencia Colombiana; o ascendencia Peruana.
(c) Mas espedficamente, poblacion de ascendencia Africana en el suroeste de los Estados Unidos; poblacion de Afroamericanos en Jackson, MS; poblacion de Afrocaribenos en Barbados; poblacion de ascendencia Mejicana en Los Angeles, CA; poblacion Puertorriquena en Puerto Rico; poblacion de Colombianos en Medellin, Colombia; o poblacion Peruana en Lima, Peru.
(a) Ascendencia del Sur de Asia
(b) Ascendencia Ahom; ascendencia Kayadtha; ascendencia Reddy; Maratha; o ascendencia Punjabi.
(c) Mas espedficamente, poblacion Ahom en el estado de Assam, India; poblacion Kayadtha en Calcuta, India; poblacion Reddy en Hyderabad, India; poblacion Maratha en Bombay, India; o poblacion Punjabi en Lahore, Pakistan.
En cualquier configuracion de la descripcion, en una realizacion, cada poblacion humana se selecciona entre una poblacion marcada como "(a)" mas arriba.
En cualquier configuracion de la descripcion, en otra realizacion, cada poblacion humana se selecciona entre una poblacion marcada como "(b)" mas arriba.
En cualquier configuracion de la descripcion, en otra realizacion, cada poblacion humana se selecciona entre una poblacion marcada como "(c)" mas arriba.
En una realizacion de la biblioteca del vertebrado, la celula o la biblioteca de la descripcion, la primera y segunda poblaciones etnicas se seleccionan del grupo que consiste en una poblacion etnica con ascendencia europea, una poblacion etnica con ascendencia de Asia Oriental, una poblacion etnica con ascendencia de Africa Occidental, una poblacion etnica con ascendencia de las Americas y una poblacion etnica con ascendencia del Sur de Asia.
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En una realizacion de la biblioteca del vertebrado, la celula o la biblioteca de la descripcion, la primera y segunda poblaciones etnicas se seleccionan del grupo que consiste en una poblacion etnica con ascendencia de Europa del Norte; o una poblacion etnica con ascendencia Europea occidental; o una poblacion etnica con ascendencia Toscana; o una poblacion etnica con ascendencia Britanica; o una poblacion etnica con ascendencia Islandesa; o una poblacion etnica con ascendencia Finlandesa; o una poblacion etnica con ascendencia Iberica; o una poblacion etnica con ascendencia Japonesa; o una poblacion etnica con ascendencia China; o una poblacion etnica con ascendencia Vietnamita; o una poblacion etnica con ascendencia Yoruba; o una poblacion etnica con ascendencia Luhya; o una poblacion etnica con ascendencia de Gambia; o una poblacion etnica con ascendencia Malawi; o una poblacion etnica con ascendencia Nativa Americana; o una poblacion etnica con ascendencia Afrocaribena; o una poblacion etnica con ascendencia Mejicana; o una poblacion etnica con ascendencia Puertorriquena; o una poblacion etnica con ascendencia Colombiana; o una poblacion etnica con ascendencia Peruana; o una poblacion etnica con ascendencia Ahom; o una poblacion etnica con ascendencia Kayadtha; o una poblacion etnica con ascendencia Reddy; o una poblacion etnica con ascendencia Maratha; o una poblacion etnica con ascendencia Punjabi.
En una realizacion de cualquier configuracion del vertebrado, la celula o la biblioteca de la descripcion, el segmento del gen de inmunoglobulina humana derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo es de baja frecuencia (opcionalmente raro) dentro de la segunda poblacion etnica. Opcionalmente el segmento del gen de inmunoglobulina humana tiene una Menor Frecuencia de Alelos (MAF) (frecuencia acumulativa) de entre 0,5% - 5%, opcionalmente menor de 0,5%, en la segunda poblacion humana, p. ej., como en la base de datos de los 1000 Genomas.
En una realizacion de cualquier configuracion del vertebrado, la celula o la biblioteca de la descripcion, la primera secuencia de nucleotidos de la region variable se produce mediante la recombinacion del primer segmento del gen de inmunoglobulina humana con un primer segmento del gen J y, opcionalmente, un primer segmento del gen D, en donde el primer segmento del gen de inmunoglobulina humana es un segmento del gen V y los segmentos de V, D y J derivan de la primera poblacion humana, opcionalmente del genoma de un individuo de la primera poblacion humana.
En una realizacion de la biblioteca del vertebrado, la celula o la biblioteca de la descripcion, la segunda secuencia de nucleotidos de la region variable se produce por recombinacion del segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana con un segundo segmento del gen J y opcionalmente un segundo segmento del gen D, en donde el segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana es un segmento del gen V derivado de la segunda poblacion y los segmentos de D y/o J derivan de la primera poblacion humana, siendo opcionalmente los segmentos de los genes D y J del genoma de un individuo de la primera poblacion humana.
En una realizacion de la biblioteca del vertebrado, celula o biblioteca de la descripcion, todos los segmentos D y J que se han recombinado con el primer y segundo segmentos de genes V son segmentos D y J derivados de la primera poblacion humana, siendo opcionalmente la segmentos del gen D y J del genoma de un individuo de la primera poblacion humana.
En una realizacion de la biblioteca, el segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana es una variante polimorfica del primer segmento del gen de inmunoglobulina humana; opcionalmente en donde el segundo segmento del gen se selecciona del grupo que consiste en un segmento del gen de cualquiera de las Tablas 1 a 7 y 9 a 14 (p. ej., seleccionado de la Tabla 13 o 14).
En una realizacion de la biblioteca, el primer y segundo segmentos de genes de inmunoglobulina humana son ambos (i) segmentos de genes VH; (ii) segmentos de D; (iii) segmentos de J (opcionalmente ambos segmentos Jh, ambos segmentos Jk o ambos segmentos J*); (iv) las regiones constantes (opcionalmente ambas regiones constantes gamma, opcionalmente ambas regiones constantes C gamma-1); (v) regiones CH1; (vi) regiones CH2; o (vii) regiones CH3.
La biblioteca, por ejemplo, no esta sometida a tratamiento previo y opcionalmente tiene un tamano de biblioteca de 10 o 102 a 109 celulas. Por ejemplo, de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 108; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 107; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 106; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 105; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 104 celulas.
La biblioteca se ha seleccionado, por ejemplo, contra un antfgeno predeterminado y, opcionalmente, tiene un tamano de biblioteca de 10 o 102 a 109 celulas. Por ejemplo, de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 108, o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 107; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 106; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 105; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 104 celulas.
En una realizacion de la biblioteca de la descripcion, dichas primera y segunda celulas son progenie de las celulas del primer y segundo vertebrados no humanos antecesores respectivamente, en donde la primera celula antecesora comprende un genoma que comprende dicho primer segmento del gen de inmunoglobulina humana; y la segunda celula antecesora comprende un genoma que comprende dicho segundo segmento del gen de inmunoglobulina humana.
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La descripcion proporciona adicionalmente una biblioteca de celulas transgenicas productoras de anticuerpos cuyos genomas codifican en conjunto un repertorio de anticuerpos, en donde la biblioteca comprende la primera y segunda celulas antecesoras descritas anteriormente.
La descripcion proporciona adicionalmente una biblioteca de celulas de hibridoma producido por fusion de la biblioteca de la descripcion (p. ej., una biblioteca de celulas B) con celulas companeras de fusion y, opcionalmente, tiene un tamano de biblioteca de 10 o 102 a 109 celulas. Por ejemplo, de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1o0o a 108; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 107; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 106; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 105; o 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 1000 a 104 celulas. La produccion de hibridomas es bien conocida por los expertos. Los ejemplos de los companeros de fusion son SP2/0-g14 (que puede obtenerse de ECACC), P3XS3-Ag8.S53 (que puede obtenerse de LGC Standards; CRL-1580), celulas NS1 y NS0. La fusion con PEG o electrofusion se puede llevar a cabo, como es convencional.
La descripcion proporciona, en una tercera configuracion:-
Un anticuerpo aislado que tiene
(a) una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleotidos producida tras la recombinacion en una celula de vertebrado no humano transgenico de un segmento del gen V de inmunoglobulina humana no reordenado con un D humano y un segmento de J humano, opcionalmente con maduracion de afinidad en dicha celula, en donde uno de los segmentos de genes (p. ej., VH) deriva del genoma de un individuo de una primera poblacion etnica humana; y los otros dos segmentos de genes (p. ej., D y JH) derivan del genoma de un individuo de una segunda (p. ej., una segunda y una tercera, respectivamente), poblacion etnica humana,
diferente,
y en donde el anticuerpo comprende regiones constantes de cadena pesada (p. ej., C gamma) de dicho vertebrado no humano (p. ej., regiones constantes de cadena pesada de roedor, raton o rata); y/o
(b) una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleotidos producida tras la recombinacion en una celula de vertebrado no humano transgenico de un segmento del gen V de inmunoglobulina humana no reordenado con un segmento de J humano, opcionalmente con maduracion de afinidad en dicha celula, en donde uno de los segmentos de genes (p. ej., VL) deriva del genoma de un individuo de una primera poblacion etnica humana (opcionalmente la misma que la primera poblacion de (a)); y el otro segmento del gen (p. ej., JL) deriva del genoma de un individuo de una segunda poblacion etnica humana, diferente (opcionalmente la misma que la segunda poblacion de (a)), y en donde el anticuerpo comprende regiones constantes de cadena ligera de dicho vertebrado no humano (p. ej., regiones constantes de cadena pesada de roedores, raton o rata);
(c) Opcionalmente en donde cada dominio variable del anticuerpo es un dominio variable humano.
(d) Opcionalmente en donde las regiones constantes de cadena pesada son las regiones constantes de tipo mu o gamma.
La descripcion tambien proporciona una secuencia de nucleotidos aislada que codifica el anticuerpo de la tercera configuracion, opcionalmente en donde la secuencia se proporciona en un vector de expresion de anticuerpo, opcionalmente en una celula anfitriona. Los vectores adecuados son vectores de expresion de mairnferos (p. ej., vectores de celulas CHO o vectores de celulas HEK293), vectores de levaduras (p. ej., un vector para la expresion en Picchia pastoris, o un vector de expresion bacteriano, por ejemplo, un vector para la expresion en E. coli.
La invencion tambien proporciona un metodo de produccion de un anticuerpo humano, comprendiendo el metodo la sustitucion de las regiones constantes de vertebrado no humano del anticuerpo de la tercera configuracion por regiones constantes de anticuerpos humanos (p. ej., una variante C descrita en la Tabla 13 o 18). El experto sera consciente de las tecnicas convencionales de la biologfa molecular para llevar a cabo esto. Por ejemplo, veanse Harlow, E. y Lane, D. 1998, 5a edicion, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, Nueva York; y Pasqualini y Arap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257-259 para la inmunizacion convencional. La union de las regiones variables de un anticuerpo a una region constante humana se puede efectuar mediante mecanismos facilmente disponibles en la tecnica, tales como el uso de la tecnologfa de ADN y ARN recombinante convencional, como sera evidente para los expertos. Vease, por ejemplo Sambrook, J y Russell, D. (2001, edicion 3'd) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, Nueva York).
En una realizacion, el metodo comprende elaborar, adicionalmente, un mutante o derivado del anticuerpo.
La descripcion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la tercera configuracion, o un anticuerpo humano producido de acuerdo con la invencion y un diluyente, excipiente o portador; opcionalmente en donde la composicion se proporciona en un recipiente conectado a una aguja o una jeringa IV o en una bolsa IV.
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La descripcion tambien proporciona una celula productora de anticuerpos (p. ej., una celula de mairnfero, p. ej., CHO o HEK293, una celula de levadura, p. ej., P pastoris; una celula bacteriana, p. ej., E. coli; una celula B; o un hibridoma) que expresa el segundo anticuerpo de la tercera configuracion o el anticuerpo aislado producido de acuerdo con la invencion.
La primera configuracion de la descripcion tambien proporciona:-
Un vertebrado o celula de vertebrado no humano (opcionalmente una celula ES o celula productora de anticuerpos) cuyo genoma comprende un locus de inmunoglobulina transgenica (p. ej., un locus de cadena pesada o un locus de cadena ligera), comprendiendo dicho locus segmentos de genes de inmunoglobulina de acuerdo con el primer y segundo segmentos de genes de inmunoglobulina humana (opcionalmente segmentos V) descritos anteriormente en relacion con la tercera configuracion. Los segmentos de genes estan conectados operablemente aguas arriba de una region constante de inmunoglobulina; opcionalmente en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de inmunoglobulina transgenica.
Opcionalmente, el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos del gen V funcionales; y/u
Opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos del gen D funcionales; y/u
Opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos del gen J funcionales.
De esta manera, se proporciona un repertorio de genes de inmunoglobulina superhumana en un vertebrado o celula de vertebrado no humano transgenico de acuerdo con la descripcion.
La primera configuracion tambien ofrece:-
Un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o rata) o celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula productora de anticuerpos) cuyo genoma comprende un locus de inmunoglobulina transgenica que comprende una pluralidad de segmentos de genes de inmunoglobulina humana conectados operablemente aguas arriba de una region constante de vertebrado no humano para la produccion de un repertorio de anticuerpos quimericos, o cadenas pesadas o ligeras quimericas, que tienen una region constante de vertebrado no humano y una region variable humana; en donde el locus transgenico comprende uno o mas segmentos del gen V de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen J humanos y opcionalmente uno o mas segmentos del gen D humanos, siendo el primero (opcionalmente un segmento V) de dichos segmentos de genes y el segundo (opcionalmente un V segmento) de dichos segmentos de genes diferentes y derivados de los genomas del primer y segundo individuos humanos respectivamente, en donde los individuos son diferentes; y opcionalmente no estan relacionados;
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de segmentos del gen V funcionales; y/u
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de segmentos del gen D funcionales; y/u
opcionalmente en donde el locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de segmentos del gen J funcionales.
De esta manera, se proporciona un repertorio de genes de inmunoglobulina superhumana en un vertebrado o celula de vertebrado no humano transgenico de acuerdo con la descripcion.
La primera configuracion tambien ofrece:-
Un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o una rata) o una celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o celula productora de anticuerpos) cuyo genoma comprende un primer y un segundo loci de inmunoglobulina transgenica, comprendiendo cada locus una pluralidad de segmentos de genes de inmunoglobulina humana conectados operablemente aguas arriba de una region constante de vertebrado no humano para la produccion de un repertorio de anticuerpos quimericos, o cadenas pesadas y ligeras quimericas, que tiene una region constante de vertebrado no humano y una region variable humana;
en donde (i) el primer locus transgenico comprende uno o mas segmentos del gen V de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen J humano y opcionalmente uno o mas segmentos del gen D humano, (ii) el segundo locus transgenico comprende uno o mas segmentos del gen V de inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos del gen J humano y, opcionalmente, uno o mas segmentos del gen D humano; y (iii) en donde un primer segmento del gen (opcionalmente V) de dicho primer locus y un segundo segmento del gen (opcionalmente V) de dicho segundo locus del gen son diferentes y derivan de los genomas de un primer y un segundo individuos humanos, respectivamente, en donde el individuos son diferentes; y opcionalmente no estan relacionados;
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opcionalmente en donde el primer y el segundo loci estan en diferentes cromosomas (opcionalmente cromosomas con el mismo numero de cromosomas) en dicho genoma;
opcionalmente en donde cada locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de los segmentos del gen V funcionales; y/u
opcionalmente en donde cada locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de segmentos del gen D funcionales; y/u
opcionalmente en donde cada locus de inmunoglobulina comprende mas que el complemento humano natural de segmentos del gen J funcionales.
De esta manera, se proporciona un repertorio de genes de inmunoglobulina superhumana en un vertebrado o una celula de vertebrado no humano transgenico de acuerdo con la descripcion.
En estas realizaciones de la primera configuracion, los segmentos de genes de inmunoglobulina son opcionalmente como se ha descrito para la tercera configuracion.
En estas realizaciones de la primera configuracion, el genoma comprende opcionalmente un tercer segmento de gen de inmunoglobulina (opcionalmente un segmento V), derivando el tercer segmento del gen de un individuo humano que es diferente del individuo del que deriva el primer (y opcionalmente tambien el segundo) segmento del gen; opcionalmente en donde el primer, segundo y tercer segmentos de genes son variantes polimorficas de un segmento de los genes de inmunoglobulina humana (p. ej., VH1-69 - veanse los ejemplos para una descripcion adicional).
En estas realizaciones de la primera configuracion, el genoma o celula de vertebrado es opcionalmente homocigoto para el primer, segundo y opcionalmente tercer segmento del gen, en donde una copia del primer, segundo y opcionalmente tercer segmentos de genes se proporcionan juntas en el mismo cromosoma conectado operablemente aguas arriba de una region constante de vertebrado no humano comun.
Por ejemplo, cada primer, segundo y opcionalmente tercer segmento del gen es un segmento del gen V.
En un ejemplo, la biblioteca de la descripcion es proporcionada por una coleccion de vertebrados no humanos (opcionalmente una coleccion de roedores, ratones o ratas); opcionalmente, en donde un primer miembro de dicha coleccion produce dicho primer anticuerpo pero no dicho segundo anticuerpo, y un segundo miembro de la coleccion produce dicho segundo anticuerpo (pero opcionalmente no dicho primer anticuerpo). Por lo tanto, se contempla la preparacion de vertebrados no humanos en los que se han utilizado genomas humanos diferentes como una fuente para la construccion de los loci transgenicos en los vertebrados. Por ejemplo, un primer vertebrado comprende un locus de cadena pesada transgenica que tiene segmentos de genes solo de una primera (y, opcionalmente, una segunda) poblacion humana o individuo; un segundo vertebrado comprende un locus de la cadena pesada transgenica que tiene segmentos de genes solo de una tercera (y opcionalmente una cuarta) poblacion humana o individuo; y, opcionalmente, se pueden construir un tercer y mas vertebrados de manera similar basandose en los genomas de poblaciones humanas unicas o solapantes. Sin embargo, cuando se proporciona en forma de una poblacion mixta de vertebrados transgenicos, la poblacion mixta proporciona una reserva colectiva de genes de inmunoglobulina humana que es mayor que la encontrada en un repertorio humano natural. Esto es util para ampliar el espacio de secuencia del anticuerpo y el gen mas alla de las posibles con los ratones y ratas transgenicos anteriores portadores de loci de inmunoglobulina humana. Como se explico anteriormente, estos se han basado en un unico genoma humano.
En una realizacion, la coleccion de vertebrados no humanos lleva genes de inmunoglobulina humana confinados a poblaciones humanas que estan juntas agrupadas bajo el mismo genero de poblacion "(a)" mencionado anteriormente. Esto proporciona un repertorio de genes que esta sesgado hacia la produccion de regiones variables de anticuerpos humanos prevalentes en el genero de la poblacion (a) y por lo tanto es util para generar agentes terapeuticos/profilacticos de anticuerpos para los miembros de dicha poblacion. Alternativamente, cuando se proporcionan segmentos de genes de diferentes poblaciones humanas en un solo transgen de acuerdo con la descripcion (no necesariamente en una coleccion de vertebrados), las diferentes poblaciones humanas se agrupan juntas, por ejemplo, bajo el mismo genero de la poblacion "(a)" mencionado anteriormente.
La descripcion tambien proporciona un repertorio de anticuerpos expresados a partir de una biblioteca de celulas de acuerdo con la descripcion.
En el vertebrado o celula no humanos de cualquier configuracion de la descripcion, la region constante del locus transgenico es, en un ejemplo, una region constante endogena de dicho vertebrado (p. ej., region constante de raton o rata endogena, p. ej., de la misma cepa de raton o rata que el vertebrado no humano en sf).
La descripcion tambien proporciona un metodo de construccion de una celula (p. ej., una celula ES) de acuerdo con la invencion, comprendiendo el metodo
(a) la identificacion de segmentos de genes V y J funcionales (y opcionalmente D) de la secuencia del genoma de un
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(o de dicho) primer individuo humano;
(b) la identificacion de uno o mas segmentos de genes V y/o D y/o J funcionales de la secuencia del genoma de un (o de dicho) segundo individuo humano, en donde estos segmentos de genes adicionales no se encuentran en la secuencia del genoma del primer individuo;
(c) y la construccion de un locus de inmunoglobulina transgenica en la celula, en donde los segmentos de genes de
(a) y (b) se proporcionan en el locus conectado operablemente aguas arriba de una region constante.
Opcionalmente, la celula comprende un locus de cadena pesada construido de acuerdo con las etapas (a) a (c) y/o un locus de cadena ligera (loci kappa y/o lambda) construido de acuerdo con las etapas (a) a (c).
Opcionalmente, la celula es homocigota para el locus o para cada locus transgenico; opcionalmente en donde la expresion del anticuerpo a partir de loci endogenos para dicha celula ha sido inactivada. Esto es util para confinar el repertorio de genes de anticuerpos funcionales, y por lo tanto la produccion de anticuerpos, a los anticuerpos que llevan regiones variables humanas.
Opcionalmente, el segmento o los segmentos de genes en la etapa (b) se identifican a partir de una base de datos de genes de inmunoglobulina seleccionada entre las bases de datos de los 1000 Genomas, Ensembl, GenBank e IMGT.
Opcionalmente, el primer y segundo individuos humanos son miembros de la primera y segunda poblaciones etnicas, respectivamente, en donde las poblaciones son diferentes, opcionalmente en donde el segmento del gen de inmunoglobulina humana derivado de la secuencia del genoma del segundo individuo es de baja frecuencia (opcionalmente raro) en la segunda poblacion etnica.
La descripcion tambien proporciona un metodo de preparacion de un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo
(a) la construccion de una celula ES (p. ej., una celula ES de una cepa C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv de raton) llevando a cabo el metodo anterior;
(b) la inyeccion de la celula ES en un blastocisto del vertebrado no humano donante (p. ej., un blastocisto de una cepa C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv de raton);
(c) la implantacion del blastocisto en un vertebrado no humano madre de acogida (p. ej., un raton de la cepa C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv); y
(d) la obtencion de una cna a partir de dicha madre, en donde el genoma de la cna comprende un locus de inmunoglobulina transgenica.
La descripcion proporciona un vertebrado no humano transgenico (p. ej., un raton o rata) preparado por el metodo o una progenie del mismo. La descripcion tambien proporciona una poblacion de tales vertebrados no humanos.
La microinyeccion de celulas ES en blastocistos y la generacion de ratones transgenicos posterior son practicas convencionales en el estado de la tecnica, y el experto en la materia es consciente de los mecanismos utiles para efectuar esto. Las cepas C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv de raton y las celulas ES son facilmente accesibles al publico.
La invencion tambien proporciona un metodo de aislamiento de un anticuerpo que se une a un antfgeno predeterminado (p. ej., un antfgeno de patogeno bacteriano o viral), comprendiendo el metodo
(a) proporcionar un vertebrado (opcionalmente, un raton o rata), de acuerdo con la reivindicacion 1;
(b) inmunizar (p. ej., utilizando un metodo de sensibilizacion-refuerzo convencional) dicho vertebrado con dicho antfgeno (opcionalmente en donde el antfgeno es un antfgeno de un patogeno de enfermedad infecciosa);
(c) eliminar los linfocitos B del vertebrado y seleccionar uno o mas linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen al antfgeno;
(d) opcionalmente inmortalizar dichos linfocitos B seleccionados o la progenie de los mismos, opcionalmente mediante la produccion de hibridomas de los mismos; y
(e) aislar un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de tipo IgG) expresado por los linfocitos B; y
(f) producir, opcionalmente, un derivado o una variante del anticuerpo.
Este metodo comprende ademas opcionalmente despues de la etapa (e) la etapa de aislar dichos linfocitos B el acido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une dicho antfgeno; intercambiar opcionalmente la secuencia de nucleotidos de la region constante de la cadena pesada del anticuerpo por una secuencia de nucleotidos que
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codifica una region constante de cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente someter a maduracion de la afinidad la region variable de dicho anticuerpo; y, opcionalmente, insertar dicho acido nucleico en un vector de expresion y, opcionalmente, un anfitrion.
Analisis bioinformatico y seleccion de segmentos de genes de inmunoglobulina Vease tambien la discusion sobre el analisis de variaciones anterior.
El experto sabra de fuentes de secuencias de genes de anticuerpos humanos, tales como IMGT (
www.imgt.org), GenBank (
www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Las herramientas bioinformaticas para la manipulacion de bases de datos tambien estan facilmente disponibles y son conocidas para los expertos, p. ej., las asequibles al publico del Proyecto 1000 Genomas/EBI (
www.1000genomes.org)
Como fuente de secuencias de segmentos de genes de anticuerpos, el experto tambien sera consciente de las siguientes bases de datos y de los recursos disponibles (incluyendo las actualizaciones de los mismos): -
1.1. La base de datos de Kabat (G. Johnson y T. T. Wu, 2002;
http://www.kabatdatabase.com). Creada por E. A. Kabat y T. T. Wu en 1966, la base de datos de Kabat publica secuencias alineadas de anticuerpos, receptores de celulas T, moleculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, y otras protemas de interes inmunologico. La interfaz de busqueda es proporcionada por la herramienta Seqhuntll, y el intervalo de utilidades esta disponible para el alineamiento de secuencias, la clasificacion de subgrupos de secuencias, y la generacion de graficos de variabilidad. Veanse tambien Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., y Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Publicacion NIH Num. 91- 3242, Bethesda, MD, en particular con referencia a segmentos de genes humanos para su uso en la presente invencion.
1.2. KabatMan (A. C. R. Martin, 2002;
http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html). Se trata de una interfaz de la red para realizar consultas simples a la base de datos de secuencias de Kabat.
1.3. IMGT, International ImMunoGeneTics Information System®; M.-P. Lefranc, 2002;
http://imgt.cines.fr). IMGT es un sistema integrado de informacion que se especializa en anticuerpos, receptores de celulas T, y moleculas MHC de todas las especies de vertebrados. Proporciona un portal comun de datos normalizados que incluye secuencias de nucleotidos y protemas, cebadores de oligonucleotidos, mapas de genes, polimorfismos geneticos, especificidades, y estructuras bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D). IMGT incluye tres bases de datos de secuencias (IMGT/LIGM-DB, IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMERDB), una base de datos del genoma (IMGT/GENE-DB), una base de datos de estructura 3D (IMGT/3Dstructure-DB), y un intervalo de recursos en la red ("pagina IMGT Marie-Paule") y herramientas interactivas.
1.4. V-BASE (I. M. Tomlinson, 2002;
http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase). V-BASE es un directorio completo de todas las secuencias de regiones variables de la lmea germinal de anticuerpos humanos compiladas a partir de mas de mil secuencias publicadas. Incluye una version del soporte logico de alineamiento DNAPLOT (desarrollado por Hans-Helmar Althaus y Werner Muller) que permite la asignacion de genes V de anticuerpos reordenados a sus segmentos de genes de la lmea germinal mas cercanos.
1.5. Antibodies-Structure and Sequence (A. C. R. Martin, 2002;
http://www.bioinf.org.uk/abs). Esta pagina resume informacion util sobre la estructura y la secuencia de los anticuerpos. Proporciona una interfaz de consulta de los datos de secuencias de anticuerpos de Kabat, informacion general sobre los anticuerpos, estructuras cristalinas, y enlaces a otras informaciones relacionadas con anticuerpos. Tambien distribuye un resumen automatizado de todas las estructuras de anticuerpos depositadas en el Protein Databank (PDB). Tiene un interes particular una descripcion exhaustiva y una comparacion de los diversos esquemas de numeracion para las regiones variables de anticuerpos.
1.6. AAAAA-AHo's Amazing Atlas of Antibody Anatomy (A. Honegger, 2001;
http://www.unizh.ch/~antibody). Este recurso incluye herramientas para el analisis estructural, el modelado y la modificacion. Adopta un esquema unificador para el alineamiento estructural global del anticuerpo y las secuencias de receptores de celulas T, e incluye las macros de Excel para el analisis de anticuerpos y la representacion grafica.
1.7. WARM-Web Antibody Modeling (N. Whitelegg y A. R. Rees, 2001;
http://antibody.bath.ac.uk). Organizado por el Centro para el Analisis y Diseno de Protemas de la Universidad de Bath, Reino Unido. Basado en el paquete de AbM (anteriormente comercializado por Oxford Molecular) para construir los modelos 3D de secuencias de Fv de anticuerpos utilizando una combinacion de metodos teoricos establecidos, este sitio tambien incluye la ultima informacion estructural de anticuerpos.
1.8. Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M. R. Clark, 2001;

http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html). Estas paginas proporcionan materiales educativos sobre la estructura y funcion de las inmunoglobulinas, y se ilustran mediante muchas imagenes en color, modelos y animaciones. Se encuentra disponible informacion adicional sobre la humanizacion de anticuerpos y el Mike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Project, cuyo objetivo es correlacionar la eficacia clmica y la respuesta anti- inmunoglobulina con secuencias de la region variable de anticuerpos terapeuticos.
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1.9. The Antibody Resource Page (The Antibody Resource Page, 2000;
http://www.antibodyresource.com). Este sitio se describe a sf mismo como la "gma completa para la investigacion y los proveedores de anticuerpos". Se proporcionan enlaces a herramientas de secuenciacion de aminoacidos, herramientas de secuenciacion de nucleotidos de anticuerpos, y bases de datos de cultivos de hibridomas/celulas.
1.9. Humanization bYDesign (J. Saldanha, 2000;
http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s). Este recurso ofrece una vision general sobre la tecnologfa de humanizacion de anticuerpos. La caractenstica mas util es una base de datos consultable (por secuencia y texto) de mas de 40 anticuerpos humanizados publicados incluyendo la informacion sobre cuestiones de diseno, la eleccion del marco, las retromutaciones del marco, y la afinidad de union de los constructos humanizados. Vease tambien Antibody Engineering Methods and Protocols, Ed. Benny K C Lo, Methods in Molecular Biology™, Human Press. Tambien en
http://www.blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and- protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdf
Como fuente de datos de la variacion de la secuencia genomica, el experto tambien sera consciente de las siguientes bases de datos y recursos disponibles (incluyendo las actualizaciones de los mismos): -
1. HapMap (The International HaMap Consortium 2003;
http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en). El HapMap Project es un proyecto internacional que tiene como objetivo comparar las secuencias geneticas de diferentes individuos para identificar regiones cromosomicas que contienen variantes geneticas compartidas. El sitio www HapMap proporciona herramientas para identificar regiones cromosomicas y las variantes de las mismas, con opciones para profundizar en los datos de frecuencia a nivel de poblacion.
2. 1000 Genomas (The 1000 Genomes Project Consortium 2010;
http://www.1000genomes.org/). Este recurso proporciona la secuencia genomica completa para 2500 individuos no identificados a partir de uno de los 25 grupos de poblacion distintos, con el objetivo de identificar las variantes genomicas de > 1%. El sitio proporciona la capacidad de interrogar los datos utilizando las herramientas en lmea (p. ej., 'Buscador del Patron de Variacion') y descargar los datos de las variantes de grupos de la poblacion.
3. Base de datos SNP japonesa (H.Haga et al 2002;.
http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.html). Basada en un estudio que identifica 190.562 variantes geneticas humanas, este sitio cataloga las variantes genomicas con caractensticas utiles para la busqueda y el resumen de los datos.
Es posible identificar variantes en los genes de inmunoglobulina clasificados como variantes de baja frecuencia o raras que se segregan con poblaciones etnicas humanas espedficas. Para los fines de este analisis, un segmento del gen de inmunoglobulina de baja frecuencia se clasifica como aquel con "Frecuencia del Alelo Menos Comun" (MAF) (frecuencia acumulativa) de entre 0,5% - 5%, las variantes raras son aquellas clasificadas por tener un MAF de menos de 0,5% en una poblacion humana particular.
Se preve el siguiente protocolo bioinformatico para identificar segmentos de genes de inmunoglobulina humana para su uso en la presente descripcion:
(a) Identificar una o mas regiones genomicas que contienen segmentos de genes de interes ('regiones genomicas diana') y calcular las coordenadas genomicas, utilizando coordenadas que corresponden a la construccion de ensamblaje de secuencias utilizada ya sea por el Proyecto 1000 Genomas o por el proyecto HapMap Internacional (u otra base de datos de genes humanos seleccionada de eleccion).
(b) Identificar las variantes genomicas mapeadas para las regiones genomicas identificadas anteriormente en (a). Recuperar frecuencias de variantes de las variantes para cada superpoblacion y preferiblemente subpoblacion donde tales datos estan disponibles. Las herramientas facilmente disponibles en el sitio WWW HapMap y las herramientas para el Proyecto de los 1000 Genomas son utiles para esta etapa.
(c) Filtrar la lista de variantes genomicas de las regiones genomicas diana para que contengan solo las variantes clasificadas como polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) "No sinonimos" o 'las 'inserciones o deleciones" (indel) genomicas. Filtrar aun mas para incluir aquellos que estan presentes solo en secuencias exonicas.
(d) Correlacionar los datos de frecuencia de poblacion para cada una de las variantes identificadas para cada una de las superpoblaciones (p. ej., 'Ascendencia europea', 'Ascendencia de Asia Oriental', 'Ascendencia de Africa Occidental', 'America', y 'Ascendencia del Sur de Asia') para identificar las variantes que se segregan con menos de dos superpoblaciones. Adicionalmente correlacionar todas las variantes identificadas con cada una de las subpoblaciones (p. ej., la superpoblacion 'Ascendencia europea' se podna subdividir en grupos tales como 'CEU - residentes de Utah con ascendencia del Norte de Europa o Europa Occidental', 'TSI Toscanos en Italia' y 'Britanicos de Inglaterra y Escocia') y producir una segunda puntuacion para la rareza de las variantes dentro de la superpoblacion.
(e) Recoger uno o mas segmentos de genes que muestran la segregacion para subpoblaciones espedficas para la construccion de loci sinteticos de acuerdo con la descripcion.
En una realizacion a lo largo del presente texto, "lmea germinal" se refiere a la secuencia del segmento del gen de la
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lmea germinal canonica.
Mediante el analisis detallado de la base de datos de los 1000 Genomas, los autores de la presente invencion han ideado una coleccion de variantes de segmentos de genes de anticuerpos polimorficos candidatos, p. ej., segmentos del gen JH de la variante humana (p. ej., vease el Ejemplo 4), que puede ser incorporada en el diseno de loci de cadena pesada transgenicos en ratones para expresar repertorios sinteticos, novedosos, cada vez mas diversos de regiones variables humanas. Con este fin, la invencion proporciona las siguientes realizaciones.
La presente invencion proporciona -
Seleccion de la variante JH6*02 humana
Loci de IgH transgenicos, vertebrados no humanos, celulas y anticuerpos basados en JH6*02 humana
Como se ha explicado anteriormente, en el diseno de loci de cadena pesada de Ig transgenicos, los autores de la presente invencion han considerado la gran cantidad de datos disponibles en el proyecto 1000 Genomas (vease
www.1000genomes.org) que analiza las distribuciones de genes entre muchas poblaciones humanas, y en particular los datos sobre segmentos de genes de Ig. Los autores de la presente invencion tambien estaban al tanto de los segmentos de genes humanos descritos en la base de datos IMGT (vease
www.imgt.org) y en Ensembl (vease
www.ensembl.org). Los autores de la presente invencion necesitaron tomar decisiones acerca de que segmentos de genes humanos incluir, entre el gran numero de segmentos de genes humanos que se presentan en estas bases de datos y las otras fuentes de informacion de segmentos de genes de Ig humana conocidos en la tecnica, incluyendo las otras bases de datos descritas en la presente memoria. Al elegir segmentos del gen JH humano, los autores de la presente invencion fueron conscientes de que JH6 humano codifica una secuencia de aminoacidos relativamente larga, y por lo tanto los autores de la presente invencion pensaron que sena deseable incluir este para aumentar las posibilidades de producir cadenas de IgH con regiones HCDR3 relativamente largas. Se ha demostrado que los anticuerpos con HCDR3 largas (al menos 20 aminoacidos de acuerdo con la nomenclatura IMGT) neutralizan una variedad de patogenos de manera eficaz incluyendo el VIH, el virus de la influenza, la malaria y los tripanosomas africanos. Tambien se hace referencia a los anticuerpos solo de cadena pesada de Camelidos (p. ej., Ilama o camello) de origen natural que llevan HCDR3 largas para llegar a epttopos relativamente inaccesibles (vease, p. ej., el documento EP0937140). Las HCDR3 largas pueden formar subdominios estables unicos con estructura de bucle ampliado que sobresale por encima de la superficie de los anticuerpos para conferir una especificidad fina. En algunos casos, la propia HCDR3 larga es suficiente para la union y neutralizacion del epttopo (Liu, L et al; Journal of Virology. 2011. 85:8467-8476). La estructura unica de la HCDR3 larga le permite unirse a epttopos afines dentro de la estructura inaccesible o la glicosilacion intensa sobre una superficie del patogeno. En la sangre periferica humana, existen en torno a 3,5% de los anticuerpos B no sometidos a tratamiento previo o 1,9% de los anticuerpos IgG B de memoria que contienen las HCDR3 con longitudes de mas de 24 aminoacidos (PLoS One. 2012; 7(5): e36750. Epub 9 de mayo de 2012; "Human peripheral blood antibodies with long HCDR3s are established primarily at original recombination using a limited subset of germline genes"; Briney BS et al) (Fig. 1). El analisis de uso indica que estos anticuerpos tienen preferencia por el uso de JH6 humano con D2-2, D3-3 o D2-15 humanos (Brinley, Bs et al., Figuras 2-5). Vease tambien PLos One. 30 de marzo de 2011; 6(3): e16857; Comparison of antibody repertoires produced by HIV-1 infection, other chronic and acute infections, and systemic autoimmune disease"; Breden F et al. Alrededor de 20% de todas las HCDR3 de los anticuerpos utilizan JH6. Sin embargo, en aquellos anticuerpos con HCDR3 de mas de 24 aminoacidos, 70% utilizan JH6 (Brinley, BS et al., Fig.2).
Existe la necesidad en la tecnica de vertebrados y celulas no humanos modificados geneticamente que puedan elaborar anticuerpos y cadenas pesadas que tienen HCDR3 humanas largas, asf como anticuerpos, cadenas y dominios VH que se pueden seleccionar entre tales vertebrados y celulas en donde estos pueden dirigirse a epftopos diana con un mejor acceso por las HCDR3 largas.
Los autores de la presente invencion, por lo tanto, eligieron esta configuracion de la invencion para incluir un segmento del gen JH6 humano como un segmento del gen humano obligatorio en su diseno del locus de IgH. Se conocen varias variantes de JH6 humanas de origen natural diferentes (p. ej., JH6*01 a *04, asf como otras; nomenclatura IMGT). Los autores de la presente invencion consideraron esto cuando decidieron que variante de JH6 humana debfa ser incluida en el diseno del locus de IgH transgenica. Un alineamiento de algunas variantes de JH6 humano se muestra en la Figura 7 (de
www.imgt.org; los guiones indican nucleotidos identicos; los cambios de nucleotidos en comparacion con la variante *01 se muestran por medio de nucleotidos subrayados y los correspondientes cambios de aminoacidos se muestran por medio de los aminoacidos subrayados; los numeros de acceso GenBank (publicacion 185.0) se muestran como prefijo de J, X, M o A). Los autores de la presente invencion utilizaron la secuenciacion de muestras de ADN genomico humano, la inspeccion de las bases de datos de ADN de IgH publicas, asf como decisiones informadas sobre la base de secuencias variantes como medios para llegar a una eleccion racional de que variante JH6 se va a utilizar.
La base de datos de 1000 Genomas utiliza JH6*03 humano como secuencia de referencia, que sena una posible eleccion para el experto en la tecnica que desee construir un locus de IgH transgenica. Los autores de la presente invencion se dieron cuenta (p. ej., Figura 7 de la presente memoria) de que la posicion 6 en JH6*03 es una tirosina (Y) codificada por un codon TAC, mientras que algunas otras variantes humanas de origen natural tienen una glicina
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(G) codificada por un codon GGT (estando la glicina presente como un motivo YYG, formando parte de un motivo YYGXDX mas grande). Para entender la importancia potencial de esto, los autores de la presente invencion llevaron a cabo analisis de secuencias de JH de otras especies de vertebrados. Los autores de la presente invencion observaron sorprendentemente que los motivos YYG e YYGXDX se conservan a traves de muchas especies de vertebrados (veanse las Figuras 7 y 8). Esto sugirio a los autores de la presente invencion, por lo tanto, que la conservacion de este motivo podna ser deseable, lo que podna guiar la eleccion de la variante jH6 para su uso en la presente invencion.
Otra sugerencia surgio cuando los autores de la presente invencion consideraron el codon TAC frente al codon GGT que codifican Y o G respectivamente. Los autores de la presente invencion consideraron el impacto de estas secuencias de nucleotidos sobre la accion de la citidina desaminasa inducida por activacion (AID). Los autores de la presente invencion conodan la creencia de que la citidina desaminasa inducida por activacion (AID) iniciaba la hipermutacion somatica de Ig (SHM) en un mecanismo de varias etapas y abordaron esta actividad cuando disenaron racionalmente el locus. La AID cataliza la desaminacion de C a U en el ADN, generando mutaciones en las bases C. Las citidinas situadas dentro de motivos de punto caliente estan preferentemente desaminadas. Ciertos motivos son puntos calientes para la actividad de AID (DGYW, WRC, WRCY, WRCH, RGYW, AGY, TAC, WGCW, en donde W = A o T, Y = C o T, D = A, G o T, H = A o C o T, y R = A o G). La presencia de un codon TAC que codifica Y en la posicion 6 de JH6*03 crea puntos calientes de mutacion AID (siendo la citidina el sustrato de AID), siendo estos puntos calientes los motivos subrayados en la frase anterior. Los autores de la presente invencion consideraron el impacto de esto y, al hacerlo, consideraron posibles mutantes creados por la actividad de AID en la citidina. Se hace referencia a la Figura 9. Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que una mutacion en la tercera base del codon TAC proporcionana 3 resultados posibles: Y, parada o parada. Por lo tanto, de los tres posibles codones de parada en el codigo genetico (siendo el otro codificado por TGA - vease la Figura 9), dos de ellos senan proporcionados por la mutacion de la citidina en el codon TAC que codifica la posicion 6 en JH6*03. Los autores de la presente invencion, por lo tanto, consideraron que esto podna aumentar las posibilidades de produccion de regiones variables de IgH no productivas en loci transgenicos basados en JH6*03. Ademas, los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que la provision de un codon GGT en su lugar (como para otras variantes de JH6 humanas) pareda preferible ya que la mutacion de la tercera base nunca producina un codon de parada (vease la Figura 9), y ademas mantendna la codificacion, y por lo tanto la conservacion, de la glicina en la posicion 6, que los autores de la presente invencion tambien observaron que estaba en los motivos YYG y YYGXDX conservados entre las especies.
Despues de haber decidido en contra del uso de JH6*03, los autores de la presente invencion necesitaron realizar una eleccion de otras posibles variantes humanas. El motivo MDV esta en el extremo C terminal de HCDR3 basado en JH6 humano, el marco adyacente 4 (FW4) que empieza en el motivo WGQ (con referencia a la secuencia mostrada codificada por JH6*01; Figura 7). En la toma de sus decisiones de diseno del locus, los autores de la presente invencion deseaban maximizar la conservacion de esta union HCDR3/FW4 en las cadenas de la IgH producto y los anticuerpos que incluyen estas. Los autores de la presente invencion crefan que esto era deseable para la funcionalidad y la conformacion del dominio variable de la cadena pesada. Los autores de la presente invencion pensaron que esto podna deseable en algunos casos para minimizar la inmunogenicidad (adecuado para el uso farmaceutico en seres humanos). De acuerdo con estas consideraciones, los autores de la presente invencion quenan hacer una eleccion que minimizara la mutacion alrededor de la union HCDR3/FW4 como resultado de SHM in vivo para conservar la configuracion de la union. Vease Rogozin y Dfaz; "Cutting Edge: DGYW/WRCH is a Better Predictor of Mutability at G:C Bases in Hypermutation Than the Widely Accepted RGYW/WRCY Motif and Probably Reflects a Two_Step Activation-Induced Cytidine Deaminase-Triggered Process"; Journal of Immunology; 15 de marzo de 2004 vol. 172 num. 63382-3384. Un ejemplo de un motivo DGYW es GGCA. Los autores de la presente invencion tuvieron esto en cuenta a la hora de analizar las secuencias de las variantes.
Con estas consideraciones en mente, los autores de la presente invencion decidieron espedficamente utilizar JH6*02 humano como JH6 humano obligatorio para su diseno de locus de IgH. JH6*01 fue rechazado como segmento del gen JH6 obligatorio puesto que la secuencia de nucleotidos GGG CAA (que codifica G y Q) contiene un motivo GGCA que es un punto caliente de reconocimiento de la AID. Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que JH6*04 tambien contema semejante motivo debido a la presencia de la secuencia GGC AAA que codifica G y K (posiciones 11 y 12 respectivamente). Los autores de la presente invencion tambien se dieron cuenta de que la variante *02 tiene una C en lugar de una G que esta en la variante *01, siendo deseablemente C un cambio sinonimo (es decir, sin cambiar la secuencia de aminoacidos codificada alrededor de la union CDR3/FW4) y esto no proporciona un motivo de punto caliente de AID GGCA. Los autores de la presente invencion, por lo tanto, decidieron que el JH6 obligatorio debe tener esta base C y esto tambien apuntaba a la utilizacion de la variante humana JH6*02.
En un ejemplo de cualquier configuracion de la invencion en la presente memoria, la unica especie JH6 incluida en el locus o genoma es JH6*02 humano.
Los autores de la presente invencion obtuvieron 9 muestras de ADN anonimos de raspado bucal de 9 adultos humanos que dieron su consentimiento. La secuenciacion se realizo en el ADN del locus de IgH para confirmar el uso de la variante de JH6 natural. Se encontro que el genoma de los 9 seres humanos contema un segmento del gen de la variante JH6*02. En 7 de los 9 seres humanos, el genoma era homocigoto para JH6*02 (es decir, cada
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cromosoma 14 tema JH6*02 como su segmento del gen JH6 en el locus de IgH). Los autores de la presente invencion tambien inspeccionaron la informacion de secuencias disponible publicamente en los genomas de los cientfficos conocidos Craig Venter y Jim Watson. Ambos genomas contienen tambien JH6*02. Esto indico a los autores de la presente invencion que esta variante es comun en los seres humanos.
Por lo tanto, los autores de la presente invencion realizaron una seleccion de JH6*02 humano basandose en
(i) Que contenga los motivos YYG e YYGXDX que se conservan a traves de varias especies de vertebrados;
(ii) Que proporcione uno codon TAC menos (punto caliente para AID que pone en riesgo los codones de parada) y una opcion en lugar de un codon que conserve los motivos YYG e YYGXDX;
(iii) La evitacion de un punto caliente para AID GGCA en la region de la union HCDR3/FW4; y
(iv) La aparicion comun (y por lo tanto la conservacion y la aceptabilidad) en los seres humanos de la variante JH6*02.
Este razonamiento fue sometido a ensayo por los autores de la presente invencion en ejemplos de laboratorio, con el fin de observar si JH6*02 humano podna participar de manera deseable en la recombinacion de segmentos de genes de anticuerpo y la produccion de cadenas pesadas en un entorno foraneo (vertebrado no humano), y, adicionalmente, evaluar si las HCDR3 largas basadas en JH6*02 humano se podnan producir in vivo (en entornos carentes de tratamiento previo e inmunizados) en tales sistemas no humanos. Se observo que en algunos entornos no humanos, tales como un raton, los motivos YYG e YYGXDX no se han conservado, y por lo tanto los autores de la presente invencion decidieron que era importante someter a ensayo si JH6*02 (que tiene los motivos YYG e YYGXDX) podna funcionar o no adecuadamente en un entorno foraneo para participar en la recombinacion de VDJ y la seleccion frente al antigeno.
Por lo tanto, como se explica adicionalmente en los ejemplos, los autores de la presente invencion construyeron loci de IgH que conteman jH6*02 transgenico en celulas ES, vertebrados no humanos transgenicos generados a partir de las celulas ES (tanto carentes de tratamiento previo como inmunizados con un intervalo de diferentes tipos de antfgeno diana), anticuerpos aislados y secuencias de cadena pesada basadas en JH6*02, asf como celulas B que expresan estas e hibridomas preparados que expresan anticuerpos espedficos de antfgeno que se basan en la variante JH6*02 seleccionada. Los autores de la presente invencion encontraron que la variante JH6*02 fue ampliamente utilizada y podna contribuir a la produccion de HCDR3 de al menos 20 aminoacidos en muchas cadenas pesadas diferentes (incluyendo cadenas pesadas espedficas de antigeno). La variante elegida se utilizo preferiblemente sobre otros segmentos de genes JH en todos los entornos (no sometido a tratamiento previo, inmunizado y espedfico de antfgeno) para la produccion de HCDR3 de al menos 20 aminoacidos.
Por lo tanto, la presente descripcion proporciona un locus de IgH que incluye JH6*02 humano (nomenclatura IMGT) como un segmento del gen JH obligatorio. En una realizacion, el locus comprende segmentos de genes de la region constante de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) aguas abajo (es decir, 3' con respecto a) de JH6*02 humano; y uno o mas segmentos del gen VH (p. ej., una pluralidad de segmentos del gen VH humano) y uno o mas segmentos del gen D (p. ej., una pluralidad de segmentos del gen D humano) aguas arriba (es decir, 5' con respecto a) de JH6*02 humano. Por ejemplo, el locus esta compuesto por un vector (p. ej., un vector de ADN, p. ej., un cromosoma artificial de levadura (YAC), BAC o PAC). Semejante vector (p. ej., YAC) puede ser introducido en una celula de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) usando tecnicas convencionales (p. ej., inyeccion pronuclear) de modo que el locus se integre en el genoma de la celula para la expresion de las cadenas de IgH que comprenden al menos una cadena cuyo dominio variable es un producto de la recombinacion de JH6*02 humano con un VH y un segmento del gen D.
En otro ejemplo, el locus (p. ej., con una region constante completamente humana, de rata o de raton, o una region constante quimerica de ser humano/raton) se puede proporcionar en el genoma de una celula de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata). Por ejemplo, la celula es una celula ES o una celula productora de anticuerpos (p. ej., una celula B aislada, una celula iPS o un hibridoma).
En otro ejemplo, la descripcion proporciona un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata) que comprende un locus de IgH de la invencion que comprende un segmento del gen JH6*02 humano, en donde el locus puede expresar una cadena de IgH cuyo dominio variable es un producto de la recombinacion de JH6*02 humano con un VH y un segmento del gen D. Como se muestra en los ejemplos, los autores de la presente invencion han producido con exito tales ratones que producen tales cadenas de IgH con dominios VH basados en JH6*02 humano. Los autores de la presente invencion aislaron y secuenciaron las cadenas de IgH de los ratones antes (no sometidos a tratamiento previo) y despues (inmunizados) de la exposicion a una gama de antfgenos diana y confirmaron por comparacion con las secuencias de segmentos de genes IgH de IMGT que se produdan cadenas aisladas (y los anticuerpos que contienen las mismas) basadas en JH6*02. Tales cadenas se encontraron en ratones no sometidos a tratamiento previo, asf como en los anticuerpos espedficos de antfgeno de ratones inmunizados. Se aislaron celulas B de ratones inmunizados, en donde las celulas B expresan anticuerpos basados en JH6*02 y se generaron hibridomas a partir de las celulas B, expresando los hibridomas anticuerpos espedficos de antfgenos basados en JH6*02. Los autores de la presente invencion, por lo tanto, proporcionaron el locus, el vertebrado, la celula y el
hibridoma de la descripcion basandose en el uso de JH6*02 humano y mostraron que los anticuerpos basados en JH6*02 y las celulas B que expresan estos se pueden producir y aislar con exito despues de la inmunizacion de los vertebrados, siendo los correspondientes hibridomas una buena fuente de anticuerpos cuyos VH dominios se basan en JH6*02, p. ej., para la administracion a un paciente, por ejemplo, para la medicina humana. Ademas, se encontro 5 que era posible producir y aislar anticuerpos espedficos de antigeno cuyos dominios VH se basan en JH6*02 y que ternan HCDR3 relativamente largas (p. ej., 20 aminoacidos).
Por lo tanto, la presente descripcion proporciona realizaciones como en las siguientes clausulas: -
1. Un vertebrado no humano (opcionalmente, un raton o una rata) o una celula de vertebrado cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos del gen JH6*02 humano, 10 uno o mas segmentos de genes VH y uno o mas segmentos de genes D aguas arriba de una region constante; en donde los segmentos de genes en el locus de la cadena pesada estan unidos operablemente a la region constante de manera que el raton es capaz de producir una cadena pesada de anticuerpo producida por la recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D y un segmento de VH.
En otro ejemplo, la descripcion proporciona
15 Un vertebrado no humano (opcionalmente, un raton o una rata) o una celula de vertebrado cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende uno, mas o todos los segmentos de genes de IGHV humano seleccionados entre V3-21, V3-13, V3-7, V6-1, V1-8, V1-2, V7-4-1, V1-3, V1-18, V4-4, V3-9, V3-23, V3-11 y V3-20 (p. ej., uno, mas o todos de V3-21*03, V3-13*01, V3-7*01, V6-1*01, V1-8*01, V1-2*02, V7-4-1*01, V1-3*01, V1-18*01, V4-4*01, V3-9*01 y V3-23*04). Se encontro que estos segmentos de los repertorios no sometidos a 20 tratamiento previo eran productivos para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud. En una realizacion, el locus comprende un JH6 humano, por ejemplo, JH6*02.
La invencion tambien proporciona una HCDR3, un dominio VH, una cadena pesada de anticuerpo o un anticuerpo que tiene un tamano de HCDR3 de al menos 20 aminoacidos. Opcionalmente, la HCDR3 o el dominio VH (o dominio Vh de la cadena pesada o anticuerpo) comprende hipermutaciones somaticas de patron AID de raton y/o 25 mutaciones de patron dTd de raton. Esto se puede proporcionar, por ejemplo, cuando se produce el dominio VH en un raton que comprende AID de raton y/o TdT de raton (p. ej., AID o TdT endogeno). Veanse tambien Annu. Rev. Biochem. 2007. 76: 1-22; Javier M. Di Noia y Michael S. Neuberger, "Molecular Mechanisms of Antibody Somatic Hpermutation" (en particular, la Figura 1 y la discusion asociada en los puntos calientes AID en raton); y Curr Opin Immunol. 1995 Abr; 7 (2): 248-54, "Somatic hypermutation", Neuberger MS y Milstein C (en particular, la discusion 30 sobre puntos calientes en raton).
Se encontro que estos segmentos en repertorios no sometidos a tratamiento previo eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
En un ejemplo, el vertebrado no se ha sometido a tratamiento previo. En otra realizacion en cambio el vertebrado se inmuniza con un antfgeno diana.
35 En un ejemplo, el vertebrado o celula mencionados a continuacion son capaces de producir de ese modo una cadena pesada de anticuerpo tras la inmunizacion con un antfgeno diana. En un ejemplo, el vertebrado es un vertebrado inmunizado que produce cadenas pesadas de anticuerpos espedficos para un antfgeno diana y en donde los dominios variables de las cadenas pesadas son el producto de la recombinacion entre VH, D y JH6*02. Por ejemplo, D se selecciona entre D3-3, D2-15, D3-9; D4-17; D3-10; D2-2; D5-24; D6-19; D3-22; D6-13; D5-12; D1- 40 26; D1-20; D5-18; D3-16; D2-21; D1-14; D7-27; D1-1; D6-25; D2-14 y D4-23 humanos (p. ej., seleccionados entre
D3-9*01; D4-17*01; D3-10*01; D2-2*02; D5-24*01; D6-19*01; D3-22*01; D6-13*01; D5-12*01; D1-26*01; D1-20*01; D5-18*01; D3-16*02; D2-21*02; D1-14*01; D7-27*02; D1-1*01; D6-25*01; D2-15*01; y D4-23*01). Por ejemplo, D es D3-9 o D3-10 humano. En un ejemplo, la longitud de HCDR3 es de al menos 20 aminoacidos (p. ej., 20, 21, 23 o 24).
45 En un ejemplo del vertebrado o celula, el genoma comprende segmentos del gen JH humano adicionales (p. ej., segmentos del gen JH2, 3, 4 y 5).
En un ejemplo del vertebrado o celula, el genoma comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende uno o mas segmentos del gen V humano y uno o mas segmentos del gen J humano aguas arriba de una region constante (p. ej., una region constante kappa o lambda humana o de raton).
50 Para el reordenamiento y la expresion de cadenas pesadas, el locus comprende elementos de control, tales como un E|j y S|j entre el segmento o los segmentos del gen J y la region constante como es conocido por los expertos. En un ejemplo, se incluye un Ej y Sj de raton en el locus de la cadena pesada entre JH6*02 y la region constante (es decir, en el orden 5' a 3' el locus comprende JH6*02, Ej y Sj y la region constante). En un ejemplo, el Ej y Sj son Ej y Sj de un genoma derivado de 129 de raton (p. ej., un genoma derivado de 129Sv, p. ej., 129Sv/EV (tal como 55 129S7Sv/Ev (por ejemplo de celulas AB2.1 o aB2.2 obtenibles de Baylor College of Medicine, Texas, USA) o 129S6Sv/Ev))); en otro ejemplo, el Ej y Sj son Ej y Sj de un genoma derivado de C57BL/6 de raton. A este respecto, el locus se puede construir en el locus de IgH del genoma de una celula seleccionada entre las celulas
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AB2.1, AB2.2, VGF1, CJ7 y FH14. Se establecieron las celulas VGF1 y se describen en Auerbach W, Dunmore JH, Fairchild-Huntress V, et al; Establishment and chimera analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-derived mouse embryonic stem cell lines. Biotechniques 2000; 29:1024-8, 30, 32.
Adicionalmente o alternativamente, la region constante (o al menos una C|j o C|j y las regiones constantes gamma de las mismas) es una region constante (o Cj o Cj y regiones constantes gamma de las mismas) de un genoma descrito en el parrafo inmediatamente anterior.
Una fuente adecuada de JH6*02 y otras secuencias de ADN humano sera facilmente evidente para el experto. Por ejemplo, es posible recoger una muestra de ADN de un donante humano que ha dado su consentimiento (p. ej., un raspado bucal como en el ejemplo de la presente memoria) del que se pueden obtener secuencias de ADN adecuadas para su uso en la construccion de un locus de la invencion. Otras fuentes de ADN humano estan disponibles comercialmente, como sera conocido por los expertos. Alternativamente, los expertos son capaces de construir la secuencia del segmento del gen por referencia a una o mas bases de datos de secuencias de segmentos de genes de Ig humana descritos en la presente memoria.
2. El vertebrado de la clausula 1, en donde el vertebrado se ha inmunizado con un antfgeno diana y en donde el dominio variable de la cadena pesada es el producto de la recombinacion entre VH, D y JH6*02 y en donde la longitud de HCDR3 es de al menos 20 aminoacidos (p. ej., 20, 21, 23 o 24).
Opcionalmente, el vertebrado inmunizado produce una cadena pesada de anticuerpo espedfica para un antfgeno diana y en donde el dominio variable de la cadena pesada es el producto de la recombinacion entre VH, D y JH6*02 y en donde la longitud de HCDR3 es de al menos 20 aminoacidos (por ejemplo, 20, 21,23 o 24).
3. Una celula de vertebrado no humano (opcionalmente una celula de raton o una celula de rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segmento del gen JH6*02 humano, uno o mas segmentos del gen VH y uno o mas segmentos del gen D aguas arriba de una region constante; en donde los segmentos de los genes en el locus de la cadena pesada estan unidos operablemente a la region constante de la misma para la produccion (p. ej., en una celula de la progenie posterior) de una cadena pesada de anticuerpo producida por la recombinacion de jH6*02 humano con un segmento de D y un segmento de VH.
4. La celula de la clausula 3, que es una celula ES susceptible de diferenciacion en una celula productora de anticuerpo de la progenie que expresa dicha cadena pesada.
5. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el locus de la cadena pesada comprende una secuencia senal de recombinacion de JH6*02 humano (RSS) conectada operablemente en 5' al segmento del gen JH6*02.
Por ejemplo, la secuencia de RSS-JH6*02 nativa puede ser utilizada para mantener ventajosamente el emparejamiento natural entre RSS y este segmento del gen JH. A este respecto, se utiliza la siguiente secuencia: -
Sgtttttggggtgaggatggacattctgccattgtgattactactactactacggtatggacgtctggggccaagggacca cggtcaccg tctcctcag (SEQ ID NO: 238)
Las RSS tienen una arquitectura comun: nonamero (p. ej., primera secuencia subrayada anterior) seguido de un espaciador de 22 pb y luego un heptamero (p. ej., segunda secuencia subrayada anterior). Los espaciadores son de 23 pb +/-1 normalmente, mientras que el heptamero y el nonamero estan mas conservados.
6. El vertebrado o celula de la clausula 5, en donde la RSS es el SEQ ID NO: 238 o una secuencia que tiene un nonamero identico y la secuencia del heptamero que flanquea una secuencia que es identica en al menos 70% a la secuencia del polfmero de 22 unidades del SEQ ID NO: 238.
7. El vertebrado o celula de la clausula 6, en donde la RSS y el JH6*02 se proporcionan en forma del SEQ ID NO: 237.
8. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el JH6*02 es el unico segmento del gen de tipo JH6 en el genoma.
9. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el JH6*02 es el segmento del gen JH mas proximo a la region constante en el locus.
10. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9; D4-17; D3-10; D2-2; D5-24; D6-19; D3-22; D6-13; D5-12; D1-26; D1-20; D5-18; D3-16; D2-21; D1-14; D7-27; D1-1; D6-25; D2-14; y D4-23.
Por ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9*01; D4-17*01; D3-10*01; D2-2*02; D5-24*01; D6-19*01; D3-22*01; D6-13*01; D5-12*01; D1-26*01; D1-20*01; D5-18*01; D3-16*02; D2-21*02; D1-14*01; D7-27*02; D1-1*01; D6-25*01; D2-15*01; y D4-23*01.
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11. El vertebrado o celula de la clausula 10, en donde el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9, D3-10, D6-19, D4-17, D6-13, D3-22, D2-2, D2 -25 y D3-3.
Se encontro que estos segmentos de D eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
En un ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9, D3-10, D6-19, D4-17, D6-13 y D3-22 (p. ej., uno, mas o todos de D3-9*01, D3-10*01, D6-19*01, D4- 17*01, D6-13*01 y D3-22*01. Se encontro que estos segmentos de D de los repertorios no sometidos a tratamiento previo eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
En un ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-10, D6-19 y D1-26 (p. ej., uno, mas o todos de D3-10*01, D6-19*01 y D1-26*01). Se encontro que estos segmentos de D de los repertorios inmunizados eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
En un ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9 y D3-10 (p. ej., uno, mas o todos de D3-9*01 y D3-10*01. Se encontro que estos segmentos de D de los repertorios espedficos de antfgeno eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
12. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el locus comprende una pluralidad de segmentos del gen D humano y el JH6*02 esta en una configuracion de lmea germinal humana con respecto al segmento del gen D humano mas 3' (o todos los segmentos de D humanos comprendidos por el locus).
En un ejemplo, el segmento del gen D mas 3' es D7-27. En un ejemplo, el locus comprende todos los segmentos del gen D humano de D1-1 a D7-27 que esta presente en un locus de IgH humana de la lmea germinal (p. ej., como se muestra en la base de datos IMGT).
Alternativamente o adicionalmente, el JH6*02 esta en una configuracion de lmea germinal humana con respecto a uno, mas o todos los E|j S|j y la region constante (p. ej., C|j)
13. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen IGHV seleccionados entre V3-21, V3-13, V3-7, V6-1, V1-8, V1-2, V7-4-1, V1-3, V1-18, V4-4, V3- 9, V3-23, V3-11 y V3-20.
En un ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen IGHV humano V3-21, V3-13, V3-7, V6- 1, V1-8, V1-2, V7-4-1, V1-3, V1-18, V4-4, V3-9, V3-23 (por ejemplo, uno, mas o todos de V3-21*03, V3-13*01, V3- 7*01, V6-1*01, V1-8*01, V1-2*02, V7-4-1*01, V1-3*01, V1-18*01, V4- 4*01, V3-9*01 y V3-23*04). Se encontro que estos segmentos de repertorios no sometidos a tratamiento previo eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
En un ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen IGHV humano V3-7, V3-11 y V4-4 (p. ej., uno, mas o todos de V3-7*01, V3-11*01 y V4-4*02). Se encontro que estos segmentos de repertorios inmunizados eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
En un ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gene IGHV humano V4-4, V1-8, V3- 9, V3- 11 y V3-20 (por ejemplo, uno, mas o todos de V4-4*02, V1-8*01, V3-9*01, V3-11*01 y V3-20 (p. ej., *d01). Se encontro que estos segmentos de repertorios espedficos de antfgeno eran productivos en la recombinacion con JH6*02 humano para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud.
14. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el locus comprende uno, mas o todos de D3-9*01, D3-10*01, D6-19*01, D6-13*01, D1-26*01, IGHV1-8*01, IGHV4-61*01, IGHV6- 1*01, IGHV4-4*02, IGHV1-3*01, IGHV3-66*03, IGHV3-7*01 y IGHV3-9*01 humanos.
Estos son segmentos de genes que muy a menudo se combinan con JH6*02 para producir cadenas pesadas productivas y anticuerpos.
Por ejemplo, el locus comprende uno, mas o todos de IGHV1-8*01, D3-9*01 y D3-10*01 humanos. Estos segmentos de genes fueron productivos con JH6*02 para producir HCDR3 de al menos 20 aminoacidos en mas de 10 anticuerpos.
15. Una celula productora de anticuerpos (p. ej., una celula B) que es una progenie de la celula de una cualquiera de las clausulas 3 a 14, en donde la celula productora de anticuerpos comprende un locus de cadena pesada que comprende una region variable reordenada producida por recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D y un segmento de VH (p. ej., JH6*02 con VH3-11 humano (p. ej., VH3-11*01) y D3-9; VH3-20 (p. ej., VH3-20*01) y D3-10; VH4-4 (p. ej., VH4-4*02) y D3-10; VH3-9 (p. ej., VH3-9*01) y D3-10, o VH1-8 (p. ej., VH1-8*01) y D310).
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Semejante region variable sena el producto de la hipermutacion somatica in vivo en un vertebrado no humano o celula de la invencion.
16. La celula de la clausula 15, que es una celula B o hibridoma que expresa un anticuerpo espedfico del antfgeno diana que comprende una cadena pesada que comprende una region variable reordenada producida por recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D y un segmento de VH (p. ej., JH6*02 con VH3-11 humano (p. ej., VH3-11*01) y D3-9; VH3-20 (p. ej., VH3-20*01) y D3-10; VH4-4 (p. ej., VH4-4*02) y D3-10; VH3-9 (p. ej., VH3- 9*01) y D3-10, o VH1-8 (p. ej., VH1-8*01) y D310).
Semejante region variable sena el producto de una hipermutacion somatica in vivo en un vertebrado no humano o celula de la invencion.
17. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde la cadena pesada del anticuerpo se une espedficamente a un antigeno diana.
18. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde la cadena pesada del anticuerpo tiene una longitud de HCDR3 de al menos 20 aminoacidos.
Opcionalmente, la longitud de HCDR3 es de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoacidos. Ademas, en un ejemplo, la longitud es de no mas de 35, 34, 33, 32 o 31 aminoacidos. Por ejemplo, la longitud HCDR3 es de 20, 21, 22, 23 o 24 aminoacidos.
19. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde la cadena pesada del anticuerpo es un producto de la recombinacion de JH6*02 con un segmento del gen VH humano expuesto en la clausula 13 o 14 y/o un segmento del gen D expuesto en la clausula 10, 11 o 14.
20. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde todos los segmentos de genes de la region variable de la cadena pesada del vertebrado no humano endogena se han inactivado en el genoma (p. ej., mediante delecion o inversion del segmento del gen).
21. El vertebrado o celula de cualquier clausula anterior, en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de la cadena pesada.
22. Una cadena pesada (p. ej., comprendida por un anticuerpo) aislada de un vertebrado de una cualquiera de las clausulas 1, 2, 5 a 14 y 17 a 21 en donde la cadena pesada comprende una HCDR3 de al menos 20 aminoacidos.
23. La cadena pesada de la clausula 22, en donde la HCDR3 es el producto de la recombinacion de JH6*02 humano con un segmento del gen VH humano expuesto en la clausula 13 o 14 y/o un segmento del gen D expuesto en la clausula 10, 11 o 14.
En un ejemplo, la cadena pesada es quimerica, donde la region C no es humana. En un ejemplo, la cadena pesada es humana, donde la region C es humana.
24. Una cadena pesada (p. ej., comprendida por un anticuerpo) cuyo dominio variable de VH es identico al dominio variable de VH de la cadena pesada de la clausula 22 o 23, y que comprende una region constante humana o una region constante quimerica humano-raton (p. ej., CH1 es humano y los demas dominios constantes son de raton).
25. La cadena pesada de la clausula 22, 23 o 24, cuyo dominio variable de VH es espedfico para un antfgeno diana.
26. Un metodo para producir una cadena pesada, un dominio de VH o un anticuerpo espedfico para un antfgeno diana, comprendiendo el metodo la inmunizacion de un vertebrado no humano de acuerdo con una cualquiera de las clausulas 1, 2, 5 a 14 y 17 a 21 con el antfgeno y el aislamiento de la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo espedfico para un antfgeno diana o una celula productora de la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo, en donde la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo comprenden una HCDR3 que deriva de la recombinacion de JH6*02 humano con un segmento del gen VH y un segmento del gen D.
27. Un metodo para producir una cadena pesada humana o un anticuerpo que comprende llevar a cabo el metodo de la clausula 26, en donde la region constante del locus es una region constante de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata), y a continuacion sustituir la region constante no humana de la cadena pesada aislada o el anticuerpo por una region constante humana (p. ej., por modificacion del acido nucleico que codifica el anticuerpo).
28. Una cadena pesada, un dominio VH o un anticuerpo producido por el metodo de la clausula 26 o 27. Opcionalmente, la longitud de HCDR3 es de al menos 20 aminoacidos como se describe en la presente memoria.
29. Una celula B o hibridoma que expresan un dominio VH de la cadena pesada que es identico al dominio VH de la cadena pesada de la clausula 22, 23 o 28.
30. Un acido nucleico que codifica el dominio VH de la cadena pesada de la clausula 22, 23 o 28, o que codifica la
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cadena pesada de la clausula 22, 23, 24, 25 o 28.
31. Un vector (p. ej., un vector de celula CHO o de celula HEK293) que comprende el acido nucleico de la clausula 30; opcionalmente en donde el vector esta en una celula anfitriona (p. ej., una celula CHO o una celula HEK293).
32. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo, la cadena pesada o el dominio VH (p. ej., comprendido por un anticuerpo) de una cualquiera de las clausulas 22 a 25 y 28, junto con un excipiente, diluyente farmaceuticamente aceptable o un medicamento (p. ej., un dominio variable espedfico del antigeno, una cadena pesada o un anticuerpo).
33. El anticuerpo, la cadena pesada o el dominio VH (p. ej., comprendido por un anticuerpo) de una cualquiera de las clausulas 22 a 25 y 28 para su uso en medicina (p. ej., en medicina humana).
Por ejemplo, el locus comprende los siguientes segmentos del gen VH humano
IGHV6-1
IGHV3-7
IGHV1-8
IGHV3-9
IGHV3-11
IGHV3-13
IGHV1-18
IGHV3-30
IGHV4-31
IGHV4-39
IGHV4-59
Opcionalmente tambien (i) y/o (ii)
(i)
IGHV1-2 IGHV2-5 e IGHV3-21
(ii)
IGHV1-2
IGHV2-5
IGHV3-21
IGHV1-24
Por ejemplo, el locus comprende las siguientes variantes del segmento del gen VH humano
IGHV6-1*01
IGHV3-7*01
IGHV1-8*01
IGHV3-9*01
IGHV3-11*01
IGHV3-13*01
IGHV1-18*01
IGHV3-30*18
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IGHV4-31*03 IGHV4-39*01 e IGHV4-59*01;
Opcionalmente tambien (iii) o (iv)
(ii)
IGHV1-2*04 IGHV2-5*10 e IGHV3-21*03
(iv)
IGHV1-2*02 IGHV2-5*01 IGHV3-21*01 e IGHV1-24*01
Por ejemplo, el locus comprende las siguientes variantes del segmento del gen JH humano
IGHJ2*01
IGHJ3*02
IGHJ4*02
IGHJ5*02 y
GHJ6*02
Por ejemplo, el locus comprende los siguientes segmentos del gen D humano
IGHD1-1
IGHD2-2
IGHD3-9
IGHD3-10
IGHD5-12
IGHD6-13
IGHD1-14
IGHD2-15
IGHD3-16
IGHD4-17
IGHD6-19
IGHD2-21
IGHD5-24
IGHD1-26 e
IGHD7-27
y opcionalmente tambien (v) o (vi)
(v)
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IGHD3-3
(vi)
IGHD3-3
IGHD4-4
IGHD5-5
IGHD6-6
IGHD1-7
IGHD2-8 y
IGHD2-8
La presente descripcion proporciona en una quinta configuracion-
Regiones constantes adaptadas para uso humano y humanizacion de anticuerpos
Otro diseno racional y la bioinformatica han llevado a los autores de la presente invencion a darse cuenta de que las variantes de la region constante humana espedficas se conservan a traves de muchas poblaciones humanas diferentes. Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que esto abre la posibilidad de realizar una eleccion para humanizar anticuerpos, cadenas y dominios variables mediante el uso de tales regiones constantes espedficas en los productos, en lugar de elegir arbitrariamente la region constante humana (o una version sintetica de una region constante humana). Este aspecto de la descripcion tambien permite adaptar los farmacos basados en anticuerpos a poblaciones etnicas humanas espedficas, ajustando de ese modo mas estrechamente el farmaco al paciente (y por lo tanto el entorno de la enfermedad) de lo que se habfa hecho hasta ahora. Puede ser un problema en el estado de la tecnica que los anticuerpos sean humanizados con una eleccion arbitraria de la region constante humana (presumiblemente derivada de una poblacion etnica (a menudo desconocida) o de origen no natural) que no funciona tan bien en pacientes de una poblacion etnica humana diferente. Esto es importante, ya que la region constante tiene un papel principal en el suministro de funciones efectoras de anticuerpos, p. ej., para el reciclaje de anticuerpos, el reclutamiento celular y del complemento y para la muerte celular.
Como se ha discutido adicionalmente en el documento WO2011066501, los subtipos de IgG humana IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 muestran una capacidad diferencial para el reclutamiento de funciones inmunitarias tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, p. ej., IgG1 e IgG3), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP, p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, p. ej., IgG1, IgG3). La implicacion espedfica del subtipo de tales funciones inmunitarias se basa en la selectividad para los receptores de Fc sobre las distintas celulas inmunitarias y la capacidad para unirse a C1q y activar el ensamblaje de un complejo de ataque a membrana (MAC). Entre los diferentes tipos, la afinidad relativa para los receptores de FcY (p. ej., FcyRI, FcYRIIa/b/c, FcYRIIIa/b) es alta para IgG1 y IgG3, sin embargo, hay una afinidad minima para IgG2 (restringida al polimorfismo FcyRIIA 131H), e IgG4 solamente tiene afinidad medible para FcyRI. Utilizando analisis comparativos de secuencias y estructuras co-cristalinas, se han mapeado los residuos de contacto claves para la union al receptor con respecto a los residuos de aminoacidos que abarcan la bisagra inferior y la region CH2. Utilizando tecnicas de modificacion de protemas convencionales, se ha logrado cierto exito en la mejora o reduccion de la afinidad de una preparacion de anticuerpos para los receptores de Fc y el componente C1q del complemento.
Entre los isotipos, IgG2 es menos capaz de unirse a la familia de receptores de Fc. Utilizando IgG2 como punto de partida, se han hecho esfuerzos para encontrar un mutante con menos funciones efectoras pero que conserve la union a FcRn, la estabilidad prolongada y la baja inmunogenicidad. La mejora de los mutantes de esta naturaleza puede proporcionar agentes terapeuticos de anticuerpos mejorados con una seguridad mantenida. Los anticuerpos terapeuticos IgG1 humanos que se unen a las dianas de la superficie celular son capaces de atraer celulas efectoras que pueden mediar la lisis celular de la celula diana por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Estos mecanismos se producen mediante la interaccion de la region CH2 del dominio Fc del anticuerpo con los receptores de FcyR sobre las celulas efectoras inmunitarias o con C1q, el primer componente de la cascada del complemento. La Tabla 19 muestra las actividades de los diferentes subtipos gamma humanos. El experto puede elegir en consecuencia promover o mitigar la actividad dependiendo del entorno de la enfermedad en los seres humanos de interes. Por ejemplo, el uso de una region constante gamma-1 humana es deseable cuando se desea aislar cadenas pesadas totalmente humanas y anticuerpos que tienen una actividad de activacion del complemento relativamente alta por la via clasica y el reconocimiento de FcyRI en pacientes humanos. Vease tambien Mol Immunol. 2003 Dic; 40(9): 585-93; "Differential binding to human Fcgamma Rlla and Fcgamma Rllb receptors by human IgG wild type and mutant antibodies"; Armour KL et al.
Las regiones constantes de IgG2 se adaptan bien a la produccion de anticuerpos y cadenas pesadas de acuerdo con la invencion para la union a citoquinas o dianas solubles en los seres humanos, ya que la IgG2 es
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esencialmente silenciosa para FcyRI,III, activa para FcYRIla y tiene poca actividad del Complemento.
Las regiones constantes de IgG1 tienen gran utilidad para la terapeutica humana, ya que los anticuerpos y las cadenas pesadas de IgG1 son activas para FcyRIJIJN y tienen actividad del complemento. Esto se puede mejorar mediante el uso de una region constante gamma-1 humana que haya sido activada mediante modificacion como se conoce en la tecnica.
Por lo tanto, el trabajo de los autores de la presente invencion ha identificado un conjunto de regiones constantes humanas de diferentes isotipos a partir del cual se puede realizar una eleccion informada cuando se humanizan cadenas de anticuerpos quimericos (o se conjugan los dominios V, tales como dAb o VHH de camelidos, con regiones constantes). La coleccion fue identificada sobre la base del analisis bioinformatico de la base de datos de 1000 Genomas, seleccionando los autores de la presente invencion variantes de la region constante que se producen con frecuencia a traves de las diversas poblaciones etnicas humanas, asf como las que aparecen con una frecuencia relativamente alta dentro de las poblaciones individuales (evaluadas por el numero de individuos cuyos genomas comprenden la variante). Por clasificacion a traves de las innumerables secuencias posibles sobre esta base, los autores de la presente invencion han proporcionado una coleccion de variantes de regiones constantes humanas que se producen de forma natural y que se pueden utilizar cuando se disenan de una manera racional anticuerpos, cadenas pesadas y otros formatos basados en anticuerpos que llevan una region constante humana. En particular, esto es util cuando se humanizan cadenas pesadas quimericas para producir cadenas totalmente humanas en las que las regiones tanto variables como constantes son humanas. Esto es util para la compatibilidad con los pacientes humanos que reciben farmacos basados en anticuerpos.
Con este fin, la descripcion proporciona los siguientes aspectos: -
1. Un metodo de produccion de una cadena pesada de anticuerpo, comprendiendo el metodo
(a) proporcionar un dominio variable de cadena pesada espedfico del antfgeno (p. ej., VH (tal como un VH humano o dAb) o VHH o un dominio variable de cadena pesada humanizado); y
(b) combinar el dominio variable con una region constante de la cadena pesada humana para producir una cadena pesada de anticuerpo que comprende (en direccion N a C terminal) el dominio variable y la region constante;
en donde
la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHAref, IGHAIa, IGHA2a, IGHA2b, IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref, IGHG4a, IGHDref, IGHEref, IGHMref, IGHMa o IGHMb
La etapa (b) se puede llevar a cabo, p. ej., utilizando tecnologfa de ADN recombinante empleando las secuencias de nucleotidos correspondientes.
Para la region constante de acuerdo con cualquier aspecto de esta configuracion, se puede utilizar ADN genomico o equivalente (es decir, que tiene intrones y exones y opcionalmente tambien secuencias UTR 5', p. ej., con una secuencia lfder nativa o no nativa) para la regio constante. Por ejemplo, cualquiera de las secuencias de "GENOMIC" descrita como SEC ID NO: 365 en adelante en la presente memoria. Alternativamente, se puede utilizar una secuencia sin intrones, por ejemplo cualquiera de las secuencias "CDS" descritas como SEQ ID NO: 365 en adelante en la presente memoria (p. ej., una secuencia lfder nativa o no nativa).
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHAref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHAIa.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHA2a.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHA2b.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la invencion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante IGHGIref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG2ref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG2a.
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Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG3ref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG3a.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG3b.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG4ref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHG4a.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHDref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHEref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHMref.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHMa.
Opcionalmente para cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, la region constante de la cadena pesada humana es una region constante de IGHMb.
Opcionalmente, se produce un derivado (p. ej., un mutante o producto conjugado) de la cadena pesada o un anticuerpo que contiene la cadena pesada. Por ejemplo, se puede conjugar una carga util toxica (p. ej., para aplicaciones en oncologfa). Por ejemplo, se pueden introducir una o mas mutaciones, como se conoce en la tecnica, para inactivar o mejorar la funcion efectora de Fc.
2. El metodo del aspecto 1, en donde el dominio variable es un dominio variable humano.
Un dominio variable humano es, por ejemplo, el producto de la recombinacion en un vertebrado no humano transgenico de segmentos de los genes VH, D y JH humanos. Alternativamente, el dominio variable se identifica usando la tecnologfa de presentacion in vitro de una biblioteca de VH humano, p. ej., empleando la presentacion en fagos, la presentacion en ribosomas o la presentacion en levadura, como se conoce en la tecnica.
En otra realizacion, el dominio variable es un dominio variable humanizado, p. ej., que comprende marcos humanos con CDR no humanas (p. ej., de raton o rata)). La tecnologfa de humanizacion es convencional en la tecnica, y sera facilmente conocida para los expertos.
3. El metodo de cualquier aspecto precedente, en donde el dominio variable ha sido previamente seleccionado entre un vertebrado no humano que ha sido inmunizado con el antfgeno.
Por ejemplo, el genoma del vertebrado (tal como un raton o una rata) comprende un locus de cadena pesada quimerica que comprende una region variable humana (segmentos de genes V, D y JH humanos) conectada operablemente aguas arriba de una region constante de vertebrado no humano de manera que el locus es capaz de reorganizarse para la expresion de las cadenas pesadas que comprenden los dominios variables humanos y las regiones constantes de vertebrados no humanos.
En realizaciones alternativas, el dominio variable se selecciona mediante tecnologfa in vitro, tal como la presentacion en fagos, la presentacion en ribosomas o la presentacion en levadura. En este caso el dominio variable se puede presentar con o sin una region constante, siempre que se combine despues con una region constante humana de acuerdo con la descripcion.
4. El metodo de cualquier aspecto anterior, que comprende proporcionar un vector de expresion (p. ej., un vector de expresion de mairnfero, tal como un vector de CHO o HEK293) que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la region constante; insertar una secuencia de nucleotidos que codifica el dominio variable en el vector 5' de la secuencia de la region constante; insertar el vector en una celula anfitriona y expresar la cadena pesada por medio de la celula anfitriona; comprendiendo el metodo ademas el aislamiento de una cadena pesada (p. ej., como parte de un anticuerpo) que comprende el dominio variable y la region constante humana.
El vector comprende los elementos reguladores suficientes para efectuar la expresion de la cadena pesada cuando el vector es albergado por una celula anfitriona, p. ej., una celula CHO o HEK293.
5. El metodo de cualquier aspecto precedente, que comprende adicionalmente la obtencion de una secuencia de nucleotidos que codifica la cadena pesada.
6. Un anticuerpo que comprende una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno y una region constante que es una region constante de IGHAref,
5 IGHAIa, IGHA2a, IGHA2b, IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref, IGHG4a, IGHDref, IGHEref, IGHMref, IGHMa o IGHMb.
7. Un polipeptido que comprende (en direccion N a C terminal) una secuencia lfder, un dominio variable humano que es espedfico para un antigeno y una region constante humana que es una region constante de IGHAref, IGHAIa, IGHA2a, IGHA2b, IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref, IGHG4a, IGHDref,
10 IGHEref, IGHMref, IGHMa o IGHMb; en donde (i) la secuencia lfder no es la secuencia lfder del dominio variable humano nativo (p. ej., la secuencia lfder es otra secuencia lfder humana o una secuencia lfder no humana); y/o (ii) el dominio variable comprende mutaciones somaticas de patron AID de raton o mutaciones en regiones de union del patron de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de raton.
8. Una secuencia de nucleotidos que codifica (en direccion 5' a 3') una secuencia lfder y una cadena pesada de 15 anticuerpo humano, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno y una
region constante que es una region constante de IGHAref, IGHAIa, IGHA2a, IGHA2b, IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref, IGHG4a, IGHDref, IGHEref, IGHMref, IGHMa o IGHMb; y siendo la secuencia lfder operable para la expresion (p. ej., en una celula CHO o HEK293 de marnffero) de la cadena pesada y en donde la secuencia lfder no es la secuencia lfder del dominio variable humano nativo (p. ej., la 20 secuencia lfder es otra secuencia lfder humana o una secuencia lfder no humana).
En un ejemplo, la secuencia lfder es
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAG C Que se traduce en
MGWSCIILFLVATATGVHS
25 9. Una secuencia de nucleotidos que codifica (en direccion 5' a 3') un promotor y una cadena pesada de anticuerpo
humano, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno y una region constante que es una region constante de IGHAref, IGHAIa, IGHA2a, IGHA2b, IGHGIref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref, IGHG4a, IGHDref, IGHEref, IGHMref, IGHMa o IGHMb; y siendo el promotor operable para la expresion (p. ej., en una celula CHO o HEK293 de mairnfero) de la cadena pesada y en 30 donde el promotor no es el promotor humano nativo.
En una realizacion, la secuencia del promotor es un promotor de IGK 3-15 humano.
10. El anticuerpo, secuencia del polipeptido o de nucleotidos, de uno cualquiera de los aspectos 6 a 9, en donde el dominio variable comprende mutaciones somaticas de patron AID de raton y/o mutaciones en la region de union del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de raton.
35 Por ejemplo, una manera de proporcionar, en cualquier aspecto de esta configuracion de la descripcion, mutaciones somaticas del patron AID de raton y/o mutaciones en la region de union del patron de raton de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de raton consiste en seleccionar un dominio variable de un vertebrado o celula no humanos. Por ejemplo, un vertebrado o celula como los descritos en la presente memoria.
11. Un vector (p. ej., un vector de celula CHO o de celula HEK293) que comprende el acido nucleico de los aspectos
40 8, 9 o 10; opcionalmente en donde el vector esta en una celula anfitriona (p. ej., una celula CHO o una celula
HEK293).
12. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o polipeptido de uno cualquiera de los aspectos 6, 7 y 10, junto con un excipiente, diluyente farmaceuticamente aceptable, o un medicamento (p. ej., un dominio variable, cadena de anticuerpo o anticuerpo espedficos del antfgeno adicionales).
45 13. El anticuerpo o polipeptido de uno cualquiera de los aspectos 6, 7 y 10 para su uso en el tratamiento y/o la
prevencion de una afeccion medica en un paciente humano.
14. El uso del anticuerpo o polipeptido de uno cualquiera de los aspectos 6, 7 y 10 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de una afeccion medica en un paciente humano.
15. El anticuerpo, polipeptido o uso del aspecto 13 o 14, en donde el humano es un miembro de una poblacion 50 humana seleccionado entre numerosas poblaciones 1-14, en donde las poblaciones se numeran como sigue (siendo
las etiquetas de poblacion conforme a la nomenclatura del Proyecto 1000 Genomas)
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35
2= CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI.
16. El anticuerpo, polipeptido o uso del aspecto 15, en donde la region constante es una
(i) region constante de IGHA1a y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-14;
(ii) region constante de IGHA2a y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-14;
(iii) region constante de IGHA2b y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-14;
(iv) region constante de IGHG2a y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-9 y 1113;
(v) region constante de IGHG3a y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-14;
(vi) region constante de IGHG3b y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-8 y 1113;
(vii) region constante de IGHG4a y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-9 y 1113;
(viii) region constante de IGHMa y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-14; o
(ix) region constante de IGHMb y la poblacion humana se selecciona entre cualquier numero de poblacion 1-14;
En donde las poblaciones se numeran como sigue (siendo las etiquetas de poblacion conforme a la nomenclatura del Proyecto 1000 Genomas)
1= ASW;
2= CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI.
17. Un vector (p. ej., un vector de celula CHO o celula HEK293) que comprende una secuencia de nucleotidos de la region constante de IGHG1ref, IGHG2ref, IGHG2a, IGHG3ref, IGHG3a, IGHG3b, IGHG4ref o IGHG4a que esta en 3' con respecto a un sitio de clonacion para la insercion de una secuencia de nucleotidos del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo humano, de manera que tras la insercion de semejante secuencia de dominio variable el vector comprende (en direccion 5' a 3') un promotor, una secuencia lfder, la secuencia del dominio variable y la secuencia de la region constante de modo que el vector es capaz de expresar una cadena pesada de anticuerpo humano cuando esta presente en una celula anfitriona.
La presente descripcion proporciona en una sexta configuracion-
Multiples variantes en el mismo genoma en Cis o Trans
El analisis de los autores de la presente invencion ha revelado agrupaciones de variantes de segmentos de genes de anticuerpos humanos de origen natural tal como se establece en la Tabla 13 y la Tabla 14. Esto puso de manifiesto la posibilidad de producir genomas transgenicos en vertebrados y celulas no humanos en donde los genomas contienen mas que el complemento humano natural de segmentos de genes humanos espedficos. En un ejemplo, esto se puede conseguir proporcionando mas que el complemento humano natural de un tipo de segmento de gen espedfico en uno o ambos de los respectivos loci de Ig (p. ej., uno o los dos cromosomas que albergan IgH en un genoma de raton o un genoma de la celula de raton).
Con este fin, esta configuracion de la descripcion proporciona lo siguiente (tal como se establece en los parrafos numerados): -
1. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 3 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 3 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 3 segmentos del gen JH6 humano, al menos 3 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 3 segmentos del gene D2-2 humano o al menos 3 segmentos del gen Jk1 humano), en donde al menos dos de los segmentos de genes humanos son variantes que no son identicas entre sf.
Por ejemplo, el genoma comprende una region variable que comprende segmentos de los genes V, D y J (para la region variable de un locus de cadena pesada) o segmentos de genes V y J (para la region variable de un locus de cadena ligera) aguas arriba de una region constante para la expresion de las cadenas pesada o ligera, respectivamente.
En una alternativa, el experto puede elegir proporcionar mas que el complemento humano de tipo salvaje de un tipo de segmento del gen espedfico, proporcionando varias copias de un tipo de variante del segmento del gen humano. Por lo tanto, se proporciona
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 3 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 3 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 3 segmentos del gen JH6 humano, al menos 3 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 3 segmentos del genes D2-2 humano o al menos 3 segmentos del gen Jk1 humano), en donde los segmentos de genes humanos son variantes identicas.
Por ejemplo, el genoma comprende una region variable que comprende segmentos de los genes V, D y J (para la region variable de un locus de cadena pesada) o segmentos de los genes V y J (para la region variable de un locus de cadena ligera) aguas arriba de una constante region para la expresion de cadenas pesada o ligera, respectivamente.
2. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 3 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano) en cis en el mismo locus de Ig.
En una alternativa, el experto puede elegir proporcionar mas que el complemento humano de tipo salvaje de un tipo de segmento de gen espedfico, proporcionando varias copias de un tipo de variante del segmento del gen humano. Por lo tanto, se proporciona
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una
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celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos del mismo tipo de variante (p. ej., al menos 2 segmentos del gen JH6*02 humano) en cis en el mismo locus de Ig.
3. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes diferentes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen humanos VH6-1, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gene Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen humanos D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen humano del mismo tipo, en donde el tercer segmento del gen esta en cis con uno de dichos 2 segmentos de genes diferentes.
En una alternativa, el experto puede elegir proporcionar mas que el complemento humano de tipo salvaje de un tipo de segmento del gen espedfico, proporcionando varias copias de un tipo de variante del segmento del gen humano. Por lo tanto, se proporciona
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana diferentes del mismo tipo de variante (p. ej., al menos 2 segmentos del gen JH6*02 humano) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen humano del mismo tipo variante, en donde el tercer segmento del gen esta cis con uno de dichos 2 segmentos de genes diferentes.
4. Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio de segmentos de genes de la region variable humana, en donde la pluralidad comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del genes Jk1 humano), el primero de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen.
5. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano), en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
6. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 3 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 3 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 3 segmentos del gen JH6 humano, al menos 3 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 3 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 3 segmentos del gen Jk1 humano), en donde al menos dos de los segmentos de genes humanos son variantes que no son identicas entre sf.
7. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano) en cis en el mismo locus de Ig.
8. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humanos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano) k en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen humano del mismo tipo, en donde el tercer segmento del gen es k con uno de dichos 2 segmentos de genes diferentes.
9. Un metodo para proporcionar un repertorio mejorado de segmentos de genes de la region variable de inmunoglobulina humana, comprendiendo el metodo proporcionar una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., un raton o rata) que comprende un repertorio de segmentos de genes de la region variable humana, en donde el metodo comprende proporcionar al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano), en donde el primero de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos de genes diferentes se proporciona en el
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genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen.
10. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano), en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
11. El vertebrado, celula o metodo de cualquier parrafo anterior, en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
12. El vertebrado, celula o metodo de cualquier parrafo anterior, en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente
relacionados en al menos 3 generaciones.
13. El vertebrado, celula o metodo de cualquier parrafo anterior, en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes; opcionalmente en donde los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
14. El vertebrado, celula o metodo del apartado 13, en donde los individuos no estan relacionados geneticamente.
15. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de genes de la region variable humana del mismo tipo (p. ej., al menos 2 segmentos del gen VH6-1 humano, al menos 2 segmentos del gen JH6 humano, al menos 2 segmentos del gen Vk1-39 humano, al menos 2 segmentos del gen D2-2 humano o al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano), en donde los segmentos de genes derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones; opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
16. El metodo del parrafo 15, en donde los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
17. El metodo del parrafo 15, en donde los individuos no estan relacionados geneticamente.
18. El vertebrado, celula o metodo del parrafo anterior, en donde al menos uno de los diferentes segmentos es un mutante sintetico de un segmento del gen de la lmea germinal humana.
19. El vertebrado, celula o metodo de cualquier parrafo anterior, en donde cada uno de dichos segmentos de genes se produce en 10 o mas poblaciones humanas diferentes.
20. El vertebrado, celula o metodo del parrafo anterior, en donde cada uno de dichos segmentos de genes tiene una frecuencia en seres humanos de 5% o mayor (p. ej., 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95% o mayor).
A este respecto, el experto puede ser orientado por la informacion proporcionada en la Tabla 14.
La frecuencia puede ser, por ejemplo, frecuencia acumulativa en la base de datos de 1000 Genomas.
21. El vertebrado, celula o metodo del parrafo 20, en donde cada uno de dichos segmentos de genes se produce en 10 o mas poblaciones humanas diferentes.
22. El vertebrado, celula o metodo de cualquier parrafo anterior, en donde cada uno de dichos segmentos de genes se produce en la base de datos de 1000 Genomas en mas de 50 individuos.
23. El vertebrado, celula o metodo del parrafo anterior, en donde cada uno de dichos segmentos de genes (i) tiene una frecuencia en seres humanos de 5% o mayor (p. ej., 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95% o mayor); y (ii) se produce en 10 o mas poblaciones humanas diferentes.
A este respecto, el experto puede ser orientado por la informacion proporcionada en la Tabla 14.
La frecuencia puede ser, por ejemplo, frecuencia acumulativa en la base de datos de 1000 Genomas.
24. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende un primer y un segundo segmentos de genes del locus de Ig humana del mismo tipo (p. ej., el primer y segundo segmentos del gen JH6 humano; o el primer y segundo segmentos del gen de IgG2 humano; o el primer y segundo segmentos del gen JA7 humano), en donde el primer
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segmento del gen es un segmento del gen seleccionado de la Tabla 14 (p. ej., IGHJ6-a) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente (p. ej., IGHJ6 ref; SEQ ID NO: 244).
La Tabla 14 enumera variantes humanas normalmente de origen natural. Se puede observar que estas existen en muchas poblaciones humanas y por lo tanto tienen positivamente una amplia aplicabilidad para farmacos basados en anticuerpos humanos.
Por ejemplo, los segmentos de genes se proporcionan en forma de inserciones espedficas en un locus de Ig de un vertebrado no humano endogeno. Alternativamente, se puede llevar a cabo la integracion aleatoria (p. ej., usando YAC) como se conoce en la tecnica.
Por ejemplo, el genoma comprende una region variable que comprende segmentos de los genes V, D y J (para la region variable de un locus de cadena pesada) o segmentos de los genes V y J (para la region variable de un locus de cadena ligera) aguas arriba de una region constante para la expresion de las cadenas pesada o ligera, respectivamente.
En otra realizacion, la descripcion permite al experto en la tecnica seleccionar dos o mas variantes de segmentos de genes humanos de origen natural diferentes para la combinacion en el genoma de un vertebrado no humano o celula. No es necesario incluir una secuencia de referencia. Puede ser deseable utilizar uno o mas segmentos de genes raros para aumentar la diversidad del repertorio. Adicional o alternativamente, puede ser deseable incluir una mezcla de variantes frecuentes y raras del mismo tipo para proporcionar diversidad al repertorio. Las variantes pueden ser elegidas adicionalmente o alternativamente para adaptar la inclusion del segmento del gen a una o mas poblaciones humanas espedficas como se indica por la informacion proporcionada en la Tabla 13 o en la Tabla 14.
Por lo tanto, la descripcion proporciona
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende un primer y un segundo segmentos de genes del locus de Ig humanos del mismo tipo (p. ej., primer y segundo segmentos del gen JH6 humano; o primer y segundo segmentos del gen IgG2, o primero y segundo segmentos del gen JA7 humano), en donde los segmentos de genes son segmentos de genes seleccionados de la Tabla 13 o la Tabla 14; y, opcionalmente, en donde uno o mas de los segmentos de genes aparecen en la Tabla 14 (p. ej., IGHJ6-a) o son una secuencia de referencia (p. ej., IGHJ6 ref; SEQ ID NO: 244).
25. El vertebrado o celula del parrafo 24, en donde el genoma comprende un tercer segmento del gen humano de dicho tipo, siendo el tercer segmento del gen diferente del primer y segundo segmentos de genes.
26. El vertebrado o celula del parrafo 24 o 25, en donde el primer y segundo segmentos de genes estan en cis en el mismo cromosoma; y, opcionalmente, el tercer segmento del gen tambien esta en cis en dicho cromosoma.
27. El vertebrado o celula del parrafo 26, en donde los segmentos de genes son inserciones dirigidas a un locus de Ig no humano endogeno.
Por ejemplo, los segmentos de genes son segmentos de genes de cadena pesada y el locus no humano es un locus de IgH. Por ejemplo, los segmentos de genes son segmentos de genes de cadena ligera (kappa o lambda) y el locus no humano es un locus de IgL.
28. El vertebrado o celula del parrafo 24 o 25, en donde el primer y segundo segmentos de genes estan en trans en diferentes cromosomas.
Por lo tanto, los cromosomas son del mismo tipo (p. ej., tanto cromosoma 6 de raton como cromosoma 4 de rata).
29. El vertebrado o celula de uno cualquiera de los parrafos 24 a 28, en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado entre uno cualquiera de las Tablas 1 a 7 y 9 a 14 (p. ej., seleccionado de la Tabla 13 o 14) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente.
30. Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un primer y un segundo segmentos de genes del locus de Ig humana del mismo tipo (p. ej., primero y segundo segmentos del gen JH6 humano, o primer y segundo segmentos del gen IgG2, o primer y segundo segmentos del gen JA7 humano), en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado de uno cualquiera de las Tablas 1 a 7 y 9 a 14 (p. ej., la Tabla 13 o 14) (p. ej., IGHJ6-a) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente (p. ej., SEQ ID NO: 7), en donde el primer segmento del gen se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo segmento del gen se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion.
31. La poblacion del parrafo 30, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen.
32. La poblacion del parrafo 30 o 31, en donde la poblacion comprende un tercer segmento del gen humano de
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dicho tipo, siendo el tercer segmento del gen diferente del primer y segundo segmentos de genes y opcionalmente en donde el primer y tercer segmentos de genes estan presentes en el genoma del primer vertebrado.
33. La poblacion del parrafo 30, 31 o 32, en donde los segmentos de genes son inserciones dirigidas a un locus de Ig no humana endogeno en el respectivo genoma.
Por ejemplo, los segmentos de genes son segmentos de genes de cadena pesada y el locus no humano es un locus de IgH. Por ejemplo, los segmentos de genes son segmentos de genes de cadena ligera (kappa o lambda) y el locus no humano es un locus de IgL.
34. La poblacion de uno cualquiera de los parrafos 30 a 33, en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado entre uno cualquiera de las Tablas 1 a 7 y 9 a 14 (p. ej., la Tabla 13 o 14) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente.
35. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende un primer y un segundo segmentos de genes de un locus de Ig humana del mismo tipo (p. ej., primero y segundo segmentos del gen JH6 humano; o primer y segundo segmentos del gen IgG2, o primer y segundo segmentos del gen JA7 humano), en donde el primer segmento del gen es un segmento del gen seleccionado entre uno cualquiera de las Tablas 1 a 7 y 9 a 14 (p. ej., Tabla 13 o 14) (p. ej., IGHJ6-a) y el segundo segmento del gen es la secuencia de referencia correspondiente (p. ej., SEQ ID NO: 7).
36. Un metodo para proporcionar un repertorio mejorado de segmentos de genes de inmunoglobulina humana, comprendiendo el metodo proporcionar una poblacion de acuerdo con uno cualquiera de los parrafos 30 a 33.
Variantes que prevalecen en pocas poblaciones
En otro aspecto, se debe observar que ciertas variantes de segmentos de genes humanos pueden aparecer con relativa frecuencia en una o un pequeno numero de poblaciones, pero no se encuentran prevalentemente a traves de muchas poblaciones humanas diferentes. Se piensa que los repertorios de segmentos de genes espedficos de la lmea germinal han evolucionado en poblaciones etnicas humanas individuales debido a la exposicion iterativa a antfgenos (p. ej., antfgenos de patogenos de enfermedades) a los que la poblacion se expone a menudo. La exposicion repetida y la mutacion pueden haber dado lugar a la evolucion de variantes de segmentos de genes que pueden proporcionar una respuesta eficaz al antfgeno (patogeno) en la poblacion, y esto puede explicar la conservacion de los segmentos de genes en las poblaciones (al contrario que otras poblaciones etnicas humanas que pueden no haber encontrado con frecuencia el antfgeno). Con esto en mente, los autores de la presente invencion identificaron variantes de segmentos de genes a partir de su analisis que son relativamente prevalentes en un pequeno numero de poblaciones humanas, y no en muchas poblaciones. Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que la inclusion de uno o mas de tales segmentos de genes en las configuraciones de la descripcion (p. ej., loci de Ig transgenicos, vertebrados y celulas) sena util para la produccion de anticuerpos, cadenas de Ig y dominios variables que pueden dirigirse a antfgenos (p. ej., antfgenos causantes de enfermedades o patogenos) a los que el pequeno numero de poblaciones humanas pueden quedar expuestas. Tales productos senan utiles para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades o afecciones medicas en los miembros de semejante poblacion. Este aspecto tambien podna ser util para abordar patogenos de enfermedades infecciosas que pueden haber sido comunes en el pequeno numero de poblaciones, pero que en el futuro o de manera relativamente reciente en la evolucion, se han convertido en patogenos causante de enfermedades mas prevalentes en otras poblaciones humanas (es decir, aquellos que no figuran en la Tabla 13 frente a la variante o las variantes de segmentos de genes en cuestion). Con este fin, a partir de la base de datos de 1000 Genomas los autores de la presente invencion han identificado las variantes de segmentos de genes enumeradas en la Tabla 20.
Por lo tanto, de acuerdo con cualquier configuracion o aspecto descrito en la presente memoria, uno, mas o todos los segmentos de genes utilizados en la presente descripcion pueden ser un segmento de gen enumerado en la Tabla 20A, 20B, 20C o 20D.
Multiples variantes de segmentos del gen JH
Una aplicacion espedfica de esta configuracion es la provision de multiples segmentos del gen JH humano como sigue.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B-) que tienen un genoma que comprende al menos 3 segmentos del gen JH humano del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), en donde al menos dos de los segmentos del gen JH humano son variantes que no son identicas entre sf.
En un ejemplo, cualquier celula de la descripcion es una celula aislada. Una celula "aislada" es aquella que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de produccion (p. ej., naturalmente o recombinante). Preferiblemente, la celula aislada esta libre de asociacion con todos los demas componentes de su entorno de produccion, p. ej., de modo que la celula puede producir un anticuerpo para un patron aprobado o
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susceptible de ser aprobado por la FDA. Los componentes contaminantes de su entorno de produccion, tales como los que resultan de las celulas transfectadas recombinantes, son materiales que tipicamente interferinan en los usos en investigacion, diagnostico o terapeuticos para el anticuerpo resultante, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, se purificara el polipeptido: (1) hasta mas de 95% en peso de anticuerpo segun se determina mediante, por ejemplo, el metodo de Lowry, y en algunas realizaciones, a mas de 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tincion con plata. Ordinariamente, sin embargo, una celula aislada se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B-) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH no endogeno diferentes (p. ej., segmentos de genes humanos) del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6) en cis en el mismo locus de Ig (p. ej., IgH, p. ej., IgH endogena, p. ej., de raton o rata IgH). En un ejemplo, el genoma comprende un repertorio de VH, D y JH humanos que comprende dichos segmentos del gen JH diferentes. Opcionalmente, los segmentos del gene JH no endogeno no son de raton ni rata, p. ej., segmentos del gen JH humano. En un ejemplo uno o mas o todos los segmentos de genes no endogenos son sinteticos.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B-) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH humano diferentes del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6) en trans en el mismo locus de Ig (p. ej., IgH, p. ej., IgH endogena, p. ej., de raton o rata IgH); y opcionalmente un tercer segmento del gen JH del mismo tipo, en donde el tercer JH esta en cis con uno de dichos 2 segmentos del gen JH diferentes.
Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio de segmentos del gen JH humano, en donde la pluralidad comprende al menos 2 segmentos del gen JH humano diferentes del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), el primero de dichos segmentos del gen JH diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos del gen JH diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen JH.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH no endogeno (p. ej., humano) diferentes del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), en donde los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones (p. ej., 3, 4, 5 o 6 generaciones). Opcionalmente, los segmentos del gen JH no endogenos son segmentos del gen JH humano. En un ejemplo uno o mas o todos los segmentos de genes no endogenos son sinteticos.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 3 segmentos del gen JH humano del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), en donde al menos dos de los segmentos del gen JH humano son variantes que no son identicas entre sf.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH (p. ej., humano) no endogenos diferentes del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6) en cis en el mismo locus de Ig (p. ej., IgH, p. ej., IgH endogena, p. ej., IgH de raton o rata)). Opcionalmente, los segmentos del gen JH no endogenos no son de raton ni rata, p. ej., segmentos del gen JH humano. En un ejemplo uno o mas o todos los segmentos de genes no endogenos son sinteticos.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH humano diferentes del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6) en trans en el mismo locus de Ig (p. ej., IgH, p. ej., IgH endogena, p. ej., IgH de raton o rata IgH); y opcionalmente un tercer segmento del gen JH humano del mismo tipo, en donde el tercer JH esta en cis con uno de dichos 2 segmentos del gen JH diferentes.
Un metodo para proporcionar un mejor repertorio de segmentos del gen JH de inmunoglobulina humana, comprendiendo el metodo proporcionar una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., un raton o rata) que comprende un repertorio de segmentos del gen JH humano, en donde el metodo comprende proporcionar al menos 2 segmentos del gen JH humano diferentes del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), en donde el primero de dichos segmentos del gen JH se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos del gen JH diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen JH.
Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un
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raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH (p. ej., humano) diferentes no endogenos del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), en donde los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones (p. ej., 3, 4, 5, o 6 generaciones). Opcionalmente, los segmentos del gen JH no endogenos son segmentos del gen JH humano. En un ejemplo uno o mas o todos los segmentos de genes no endogenos son sinteticos.
En un ejemplo del vertebrado o celula o el metodo de la descripcion, al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
En un ejemplo del vertebrado o celula o el metodo de la descripcion, los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones (p. ej., 3, 4, 5, o 6 generaciones).
En un ejemplo del vertebrado o celula o el metodo de la descripcion, los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes; opcionalmente en donde los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
En un ejemplo del vertebrado o celula o el metodo de la descripcion, los individuos no estan relacionados geneticamente (p. ej., 3, 4, 5, o 6 generaciones anteriores).
En un ejemplo del vertebrado o celula o el metodo de la descripcion, al menos uno de los diferentes segmentos de JH es un mutante sintetico de un segmento del gen JH de la lmea germinal humana.
La descripcion tambien proporciona un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JH humano del mismo tipo (JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6), en donde los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones (p. ej., 3, 4, 5, o 6 generaciones); opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en el mismo locus de IgH en dicho genoma.
En un ejemplo del vertebrado o celula o el metodo de esta realizacion de la descripcion, el genoma comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen JH humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos del gen JH humanos, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen JH suplementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
En un ejemplo de la poblacion de la descripcion, la poblacion comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen JH humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos del gen JH humano, en donde dichos repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen JH suplementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula no humana (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen JH humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos del gen JH humano, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen JH suplementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
Una poblacion de los vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen JH humano con un suplemento de segmentos de uno, dos o mas segmentos del gen JH humano, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen JH suplementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
En un ejemplo del vertebrado o de la poblacion, al menos uno de dichos segmentos del gen JH tiene los SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. Por ejemplo, al menos uno de dichos segmentos del gen JH tiene el SEQ ID NO: 1 y al menos uno, dos o mas de dichos segmentos del gen JH suplementarios es una variante de acuerdo con cualquier ejemplo anterior. Por ejemplo, al menos uno de dichos segmentos del gen JH tiene el SEQ ID NO: 2 y al menos uno, dos o mas de dichos segmentos del gen JH suplementarios es una variante de acuerdo con uno cualquiera de los ejemplos anteriores. Por ejemplo, al menos uno de dichos segmentos del gen JH tiene el SEQ ID NO: 2 y al menos uno, dos o mas de dichos segmentos del gen JH suplementarios es una variante de acuerdo con uno cualquiera de los ejemplos anteriores.
En una realizacion, el vertebrado no humano o celula de vertebrado celula de la descripcion comprenden un genoma que comprende repertorios de los genes VH, D y JH que comprenden segmentos de genes humanos, comprendiendo el repertorio del gen JH (p. ej., un repertorio del segmento del JH gen humano)
una pluralidad de segmentos del gen JH1 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JH1 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JH2 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JH2 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
5 una pluralidad de segmentos del gen JH3 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JH3 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JH4 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JH4 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JH5 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JH5 diferentes en cis en 10 el mismo locus de Ig en dicho genoma; y/o
una pluralidad de segmentos del gen JH6 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JH6 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
opcionalmente en donde los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes.
15 Opcionalmente dichos al menos 2 segmentos del gen JH diferentes son segmentos de genes humanos o segmentos de genes sinteticos derivados de segmentos de genes humanos.
Opcionalmente, el locus de Ig es un locus de IgH, p. ej., un locus endogeno, p. ej., un locus de IgH de raton o rata.
En una realizacion, el vertebrado no humano o celula de vertebrado de la descripcion comprenden un genoma que comprende repertorios de los genes VH, D y JH que comprenden segmentos de genes humanos, comprendiendo el 20 repertorio del gen JH (p. ej., un repertorio de segmentos del gen JH humano)
una pluralidad de segmentos del gen JH1 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen JH1 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen JH2 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen JH2 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen JH3 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen JH3 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen JH4 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen JH4 diferentes;
25 una pluralidad de segmentos del gen JH5 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen JH5 diferentes; y/o
una pluralidad de segmentos del gen JH6 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen JH6 diferentes;
opcionalmente en donde los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de dos o tres individuos humanos diferentes;
opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el 30 mismo locus de Ig en dicho genoma.
Opcionalmente dichos al menos 3 segmentos del gen JH diferentes son segmentos de genes humanos o segmentos de genes sinteticos derivados de segmentos de genes humanos.
Opcionalmente, el locus de Ig es un locus de IgH, p. ej., un locus endogeno, p. ej., un locus de IgH de raton o rata.
Opcionalmente en el vertebrado o celula los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
35 Opcionalmente en el vertebrado o celula los individuos no estan geneticamente relacionados (p. ej., 3, 4, 5 o 6 generaciones anteriores).
Opcionalmente en el vertebrado o celula al menos uno de los segmentos de JH diferentes es un mutante sintetico de un segmento del gen JH de la lmea germinal humana.
En una realizacion de un vertebrado no humano o celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula 40 B) de acuerdo con la descripcion, el genoma del vertebrado o celula comprende repertorios de genes VH, D y JH humanos, comprendiendo el repertorio del gen JH (p. ej., un repertorio del gen JH humano)
una pluralidad de segmentos del gen JH1 proporcionada por al menos 2 diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
45 una pluralidad de segmentos del gen JH2 proporcionada por al menos 2 diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma; una pluralidad de segmentos del gen JH3 proporcionada por al menos 2 diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma; una pluralidad de segmentos del gen JH4 proporcionada por al menos 2 50 diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JH5 proporcionada por al menos 2 diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma; y/o una pluralidad de segmentos del gen JH6 proporcionada por al menos 2 diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
55 en donde los segmentos del gen JH derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones (p. ej., 3, 4, 5 o 6 generaciones).
segmentos
del gen JH1 humanos
segmentos
del gen CM X —> humanos
segmentos
del gen JH3 humanos
segmentos
del gen JH4 humanos
segmentos
del gen JH5 humanos
segmentos
del gen JH6 humanos
Opcionalmente dichos al menos 2 segmentos del gen JH diferentes son segmentos de genes humanos o
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segmentos de genes sinteticos derivados de segmentos de genes humanos.
Opcionalmente, el locus de Ig es un locus de IgH, p. ej., un locus endogeno, p. ej., un locus de IgH de raton o rata. Opcionalmente en el vertebrado o celula, los individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
JH5
Una realizacion proporciona un vertebrado, celula o poblacion de la descripcion cuyo genoma comprende una pluralidad de segmentos del gen JH5, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una mutacion de nucleotido en una o mas posiciones
correspondientes a las posiciones
106.330.024
106.330.027
106.330.032
106.330.041
106.330.44
106.330.45
106.330.62
106.330.63
106.330.65
106.330.66
106.330.67
106.330.68 y 106.330.071
en el cromosoma humano 14.
En el vertebrado, celula o poblacion opcionalmente la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.067 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.330.071 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); (ii) la posicion 106.330.066 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); y/o (iii) la posicion 106.330.068 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una timina).
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.071 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.330.063 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina); y/o (ii) la posicion 106.330.067 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.045 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.044 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.330.66 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); y/o (ii) la posicion 106.330.068 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una timina).
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Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.066 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.330.67 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); y/o (ii) la posicion 106.330.068 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una timina).
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.068 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.330.067 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); y/o (ii) la posicion 106.330.066 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.027 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.024 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.032 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.041 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una adenina o timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.063 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del sEq ID NO: 1.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.071 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, la pluralidad comprende una variante del gen JH5 humano del SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.330.062 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, el genoma comprende el SEQ ID NO: 1; opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig que una, dos o mas de las variantes.
JH6
Una realizacion proporciona un vertebrado, celula o poblacion de la descripcion cuyo genoma comprende una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano del SEQ ID NO: 2, en donde la variante comprende una mutacion de nucleotido en una o mas posiciones correspondiente a las posiciones
106.329.411
106.329.413
106.329.414 106.329.417 106.329.419 106.329.426
106.329.434 106.329.435, y 106.329.468
en el cromosoma humano 14.
Opcionalmente, el genoma del vertebrado, celula o poblacion comprende una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano del SEQ ID NO: 2, en donde la variante comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.329.435 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de SEQ ID NO: 2.
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Opcionalmente, la variante comprende, ademas, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion l06.329.468 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); (ii) la posicion 106.329.419 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina); (iii) la posicion
106.329.434 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una citosina) y/o la posicion
106.329.414 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); (iv) la posicion 106.329.426 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina); (v) la posicion 106.329.413 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina); (vi) la posicion 106.329.417 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una timina); (vii) la posicion 106.329.411 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una timina); (viii) la posicion
106.329.451 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina); (ix) la posicion
106.329.452 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una citosina); y/o (x) la posicion 106.329.453 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una citosina).
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, mutaciones en las posiciones correspondientes a la posicion 106.329.451 en el cromosoma humano 14, siendo la mutacion adicional una adenina; la posicion 106.329.452 en el cromosoma humano 14, siendo la mutacion adicional una citosina; y la posicion 106.329.453 en el cromosoma humano 14, siendo la mutacion adicional una citosina.
El vertebrado, celula o poblacion comprenden opcionalmente una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano del SEQ ID NO: 2, en donde la variante comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.329.468 en el cromosoma humano 14; y opcionalmente ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 2.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a la posicion
106.329.435 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano del SEQ ID NO: 2, en donde la variante comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.329.417 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 2.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a la posicion
106.329.435 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano del SEQ ID NO: 2, en donde la variante comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.329.434 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 2.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.329.414 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina); y/o (ii) la posicion 106.329.435 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano del SEQ ID NO: 2, en donde la variante comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.329.411 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 2.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a la posicion
106.329.435 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una guanina).
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH6, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH6 humano que es una secuencia antisentido de una variante descrita anteriormente.
Opcionalmente, el genoma comprende el SEQ ID NO: 2; opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig que una, dos o mas de las variantes de JH6.
JH2
Una realizacion proporciona un vertebrado, celula o poblacion de la descripcion cuyo genoma comprende una
pluralidad de segmentos del gen JH2, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH2 humano del SEQ
ID NO: 3, en donde la variante comprende una mutacion de nucleotido en una o mas posiciones correspondiente a
las posiciones
106.331.455
106.331.453, y
106.331.409
en el cromosoma humano 14.
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Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden dicha pluralidad de segmentos del gen JH2, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH2 humano del SEQ ID NO: 3, en donde la variante comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.331.455 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 3.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a (i) la posicion 106.331.453 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina); y/o
(ii) la posicion 106.331.409 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina);
(iii) la posicion 106.329.434 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina).
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH2, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH2 humano del SEQ ID NO: 3, en donde la variante comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.331.453 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 3.
Opcionalmente, la variante comprende, adicionalmente, una mutacion en una posicion correspondiente a la posicion 106.331.409 en el cromosoma humano 14 (siendo opcionalmente la mutacion adicional una adenina).
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH2, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH2 humano del SEQ ID NO: 3, en donde la variante comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.331.409 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia del SEQ ID NO: 3.
Opcionalmente, el vertebrado, celula o poblacion comprenden una pluralidad de segmentos del gen JH2, en donde la pluralidad comprende una variante del gen JH2 humano que es una secuencia antisentido de una variante descrita anteriormente.
Opcionalmente, el genoma comprende el SEQ ID NO: 3; opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig que uno, dos o mas de las variantes de JH2.
Opcionalmente, el genoma del vertebrado, celula o poblacion comprende dos o mas segmentos del gen JH diferentes seleccionados entre los SEQ ID NO: 1 a 3 y variantes descritas anteriormente; opcionalmente en donde dichos segmentos del gen JH estan en cis en el mismo locus de inmunoglobulina Ig.
Multiples variantes de segmentos del gen D humano
Una aplicacion espedfica de esta configuracion es la provision de multiples segmentos del gen D humano de la siguiente manera (tal como se establece en las clausulas numeradas, a partir de la clausula numero 154).
154. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 3 segmentos del gen D humano del mismo tipo (p. ej., segmentos del gen D2-2), en donde al menos dos de los segmentos del gen D humano son variantes que no son identicas entre sf (p. ej., D2-2ref y D2-2a).
En un ejemplo de cualquier aspecto de la sexta configuracion de la descripcion (V, D, J o C), una o mas o todas las variantes son segmentos de genes humanos de origen natural.
En un ejemplo de cualquier aspecto de la sexta configuracion de la descripcion (V, D, J o C), una o mas de las variantes puede ser una variante sintetica de un segmento del gen humano.
155. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen D no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., D2-2ref y D2-2a) en cis en el mismo locus de Ig.
156. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen D humano diferentes del mismo tipo (p. ej., D2-2ref y D2-2a) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen D humano (p. ej., (p. ej., D2-2ref, D2-2a o D2-2b) del mismo tipo, en donde el tercer D esta en cis con uno de dichos 2 segmentos del gen D diferentes.
157. Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio de segmentos del gen D humano, en donde la pluralidad comprende al menos 2 segmentos del gen D humano diferentes del mismo tipo (p. ej., segmentos de genes D2-2), el primero de dichos segmentos del gen D diferentes (p. ej., D2-2ref) se proporciona en el genoma de una primera poblacion de vertebrados, y el segundo de dichos segmentos del gen D diferentes (p. ej., D2-2a) se proporciona en el genoma de una segunda poblacion de vertebrados, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen D.
158. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen D no endogenos diferentes del
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mismo tipo (p. ej., segmentos del gen D2-2 humano), en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
159. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 3 segmentos del gen D humano del mismo tipo (p. ej., segmentos del gen D2-2), en donde al menos dos de los segmentos del gen D humano son variantes que no son identicas entre sf (p. ej., D2-2ref y D2-2a).
160. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen D no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., segmentos del gen D2-2 humano) en cis en el mismo locus de Ig.
161. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen D humano diferentes del mismo tipo (p. ej., D2-2Ref y D2-2a) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen D humano (p. ej., D2-2ref, D2-2a o D2-2b) del mismo tipo, en donde el tercer D esta en cis con uno de dichos 2 segmentos del gen D diferentes.
162. Un metodo para proporcionar un repertorio de segmentos del D de inmunoglobulina humana mejorado, comprendiendo el metodo proporcionar una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., un raton o rata) que comprende un repertorio de segmentos del gen D humano, en donde el metodo comprende proporcionar al menos 2 segmentos del gen D humanos diferentes del mismo tipo (p. ej., D2-2ref y D2-2a), en donde el primero de dichos segmentos del gen D diferentes se proporcionan en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos del gen D diferentes se proporcionan en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen D.
163. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen D no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., D2-2ref y D2-2a), en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
164. El vertebrado o celula de la clausula 154, 156 o 158, o el metodo de la clausula 159, 161 o 163, en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
165. El vertebrado o celula de la clausula 154, 155 o 156, o el metodo de una cualquiera de las clausulas 159 a 162 y 164, en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
166. El vertebrado o celula de una cualquiera de las clausulas de 154 a 157, o el metodo de una cualquiera de las clausulas de 159 a 162 y 165, en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes; opcionalmente en donde los individuos humanos diferentes son de diferentes poblaciones humanas.
167. El vertebrado, celula o metodo de la clausula 166, en donde los individuos no estan relacionados geneticamente.
168. El vertebrado, celula o metodo de una cualquiera de las clausulas de 154 a 167, en donde al menos uno de los diferentes segmentos de D es un mutante sintetico de un segmento del gen D de la lmea germinal humana.
169. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos de gen humano D del mismo tipo (p. ej., D2-2Ref y D2-2a), en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones; opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en el mismo locus de IgH en dicho genoma.
170. El vertebrado o celula de una cualquiera de las clausulas de 154 a 158 y 164 a 168, en donde el genoma comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen D humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos del gen humano D variantes, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen D complementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
171. La poblacion de la clausula 157, en donde la poblacion comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen D humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos del gen
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humano D variantes, en donde dichos repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen D complementary no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
172. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula no humana (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmento del gen D humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos de gen D humano variantes, en donde dichos repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen D complementario no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
173. Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen JH humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos del gen D humano variantes, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos del gen D complementario no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
174. El vertebrado o celula de la clausula 172 o la poblacion de la clausula 173, que comprenden un primer y un segundo segmentos del gen D seleccionados entre
D2-2ref y D2-2a; o D2-21ref y D2-21a; o D3-10ref y D3-10a; o D3-16ref y D3-16a; o D2-8ref y D2-8a; o D3-3ref y D3-3a; o D4-23ref y D4-23a; o D6-13ref y D6-13a; o D3-9ref y D3-9a; o D4-4ref y D4-4a; o D7-27ref y D7-27a;
Opcionalmente en donde el primer y/o segundo segmentos del gen D estan presentes en dos o mas copias.
Por ejemplo, se proporcionan dos o tres copias del primer segmento del gen, opcionalmente con una, dos o tres copias del segundo segmento del gen. Las copias se pueden disponer en cis o en trans.
175. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 174, que comprenden segmentos del gen D humano D2-2ref y D2-2a; y D3-3ref y D3-3a; y opcionalmente tambien D2-15.
En un ejemplo, el vertebrado, celula o poblacion comprenden uno o mas segmentos seleccionados entre D3-3, D2- 15, D3-9; D4-17; D3-10; D2-2; D5-24; D6-19; D3-22; D6-13; D5-12; D1-26; D1-20; D5-18; D3-16; D2-21; D1-14; D7- 27; D1-1; D6-25; D2-14 and D4-23 (p. ej., seleccionados entre D3-9*01; D4-17*01; D3-10*01; D2-2*02; D5-24*01; D6-19*01; D3-22*01; D6-13*01; D5-12*01; D1-26*01; D1-20*01; D5-18*01; D3-16*02; D2-21*02; D1-14*01; D7- 27*02; D1 -1*01; D6-25*01; D2-15*01; y D4-23*01 junto con la secuencia o secuencias de referencia de dicho segmento o segmentos seleccionados. Estos se encontraron en los dominios variables que teman una longitud de HCDR3 de al menos 20 aminoacidos (veanse los ejemplos de la presente memoria).
176. Un vertebrado no humano o celula de vertebrado de acuerdo con la clausula de 155, que comprende un genoma que comprende repertorios de los genes VH, D y JH que comprenden segmentos de genes humanos, comprendiendo el repertorio del gen D uno o mas de
una pluralidad de segmentos del gen D2-2 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D2-2 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D2-21 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D2-21 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-10 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-10 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-16 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-16 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D2-8 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D2-8 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-3 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-3 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D4-23 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D4-23 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D6-13 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D6-13 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-9 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-9 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D4-4 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D4-4 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma; y
una pluralidad de segmentos del gen D7-27 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D7-27 diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
5 opcionalmente en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes.
177. Un vertebrado no humano o celula de vertebrado de acuerdo con la clausula de 155, que comprende un genoma que comprende repertorios de los genes VH, D y JH que comprenden segmentos de genes humanos, comprendiendo el repertorio del gen D uno o mas de
10 una pluralidad de segmentos del gen D2-2 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D2-2 diferentes en trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D2-21 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D2-21 diferentes en trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-10 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-10 diferentes en 15 trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-16 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-16 diferentes en trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D2-8 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D2-8 diferentes en trans en dicho genoma;
20 una pluralidad de segmentos del gen D3-3 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-3 diferentes en trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D4-23 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D4-23 diferentes en trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D6-13 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen diferentes en D6-13 25 trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-9 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D3-9 diferentes en trans en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D4-4 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen D4-4 diferentes en trans en dicho genoma; y
30 una pluralidad de segmentos del gen D7-27 proporcionada por al menos 2 segmentos del gen diferentes en D7-27 trans en dicho genoma;
opcionalmente en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes.
178. Un vertebrado no humano o celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula B), de acuerdo con 35 la clausula 154, que comprende un genoma que comprende repertorios de los genes VH, D y JH que comprenden
segmentos de genes humanos, comprendiendo el repertorio del gen D uno o mas de
una pluralidad de segmentos del gen D2-2 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D2-2 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D2-21 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D2-21 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D3-10 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D3-10 diferentes;
40 una pluralidad de segmentos del gen D3-16 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D3-16 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D2-8 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D2-8 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D3-3 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D3-3 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D4-23 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D4-23 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D6-13 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D6-13 diferentes;
45 una pluralidad de segmentos del gen D3-9 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D3-9 diferentes;
una pluralidad de segmentos del gen D4-4 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D4-4 diferentes; y
una pluralidad de segmentos del gen D7-27 proporcionada por al menos 3 segmentos del gen D7-27 diferentes;
opcionalmente en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de dos o tres individuos humanos diferentes;
50 opcionalmente en donde al menos 2 6 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
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179. El vertebrado o celula de la clausula 176, 177 o 178, en donde los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
180. El vertebrado o celula de una cualquiera de las clausulas de 176 a 179, en donde los individuos no estan relacionados geneticamente.
181. El vertebrado o celula de una cualquiera de las clausulas de 176 a 180, en donde al menos uno de los segmentos de D diferentes es un mutante sintetico de un segmento del gen D de la lmea germinal humana.
182. A vertebrado no humano o celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula B) de acuerdo con la clausula 158, que comprende un genoma que comprende repertorios de genes VH, D y JH humanos, comprendiendo el repertorio del gen D uno o mas de
una pluralidad de segmentos del gen D2-2 proporcionada por al menos 2 genes D2-2 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D2-21 proporcionada por al menos 2 genes D2-21 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-10 proporcionada por al menos 2 genes D3-10 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-16 proporcionada por al menos 2 genes D3-16 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D2-8 proporcionada por al menos 2 genes D2-8 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-3 proporcionadas por al menos 2 genes D3-3 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D4-23 proporcionada por al menos 2 genes D4-23 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D6-13 proporcionada por al menos 2 genes D6-13 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D3-9 proporcionada por al menos 2 genes D3-9 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen D4-4 proporcionada por al menos 2 genes D4-4 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma; y
una pluralidad de segmentos del gen D7-27 proporcionada por al menos 2 genes D7-27 diferentes; opcionalmente en cis en dicho genoma;
en donde los segmentos del gen D derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
183. El vertebrado o celula de la clausula 182, en donde los individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
184. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 183, en donde uno o mas de los segmentos del gen D es una variante de un segmento del gen D de la lmea germinal humana, en donde el segmento del gen de la variante codifica una secuencia de aminoacidos que difiere en 1, 2 o 3 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos correspondiente codificada por el segmento del gen D de la lmea germinal humana, siempre que dicha secuencia de aminoacidos codificada por la variante no incluya un codon de parada cuando dicha secuencia de aminoacidos correspondiente no incluye un codon de parada.
Opcionalmente, los segmentos del gen D variantes y de la lmea germinal codifican las respectivas secuencias de aminoacidos en el marco de lectura 2 (numeracion IMGT). Vease Briney et al. 2012.
185. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 184, en donde dicha secuencia de aminoacidos correspondiente codificada por el segmento del gen D de la lmea germinal humana es una secuencia hidrofila o hidrofoba (de acuerdo con J Mol Biol. 25 de Jul 1997; 270(4): 587-97; Corbett SJ et al.; Tabla 2).
186. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 184 o 185, que comprende segmentos del gen D humano de dicha variante y dicha lmea germinal; opcionalmente en donde los segmentos del gen D humano variantes y de la lmea germinal estan en cis en el mismo cromosoma.
187. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 184 a 186, en donde el segmento del gen D humano de la lmea germinal es un segmento del gen de la familia D2, D3, D5 o D6; opcionalmente un segmento del gen D2-2, D2-15, D3-3, D3-9, D3-10, D3-22, D5-5, D5-18, D6-6, D6-13, D6-19.
Estos segmentos de D son utilizables en los tres marcos de lectura.
Opcionalmente se utiliza una variante de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todos estos segmentos del gen D de la lmea germinal humana.
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188. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 187, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D2-2, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen d2-2 que vanan entre sf en una o mas posiciones de nucleotidos correspondientes a las posiciones
106.382.687 y 106.382.711
en el cromosoma humano 14.
189. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 188, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-2 humano ((opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.382.687 en el cromosoma humano 14, y opcionalmente ninguna otra mutacion de la secuencia de D2-2ref.
190. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 188 o 189, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-2 humano que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.382.687 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2-2a.
191. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 188 a 190, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-2 humano que comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.382.711 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2- 2b.
192. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 188 a 191, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-2 humano que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.382.711 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2- 2ref.
193. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 192, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D7-27, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen D7-27 que vanan entre sf en una posicion de nucleotido correspondiente a la posicion 106.331.767 en el cromosoma humano 14.
194. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 193, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D7-27 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.331.767 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D7-27ref.
195. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 193 o 194, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D7-27 humano que comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.331.767 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D7-27a.
196. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 195, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D4-23, en donde la pluralidad comprende segmentos del gene D4-23 que vanan entre sf en una posicion de nucleotido correspondiente a la posicion 106.350.740 en el cromosoma humano 14.
197. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 196, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D4-23 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.350.740 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D4-23ref.
198. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 196 o 197, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D4-23 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.350.740 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D4-23a.
199. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 197, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D2-21, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen D2-21 que vanan entre sf en una posicion de nucleotido correspondiente a la posicion 106.354.418 en el cromosoma humano 14.
200. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 199, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-21 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una adenina
en una posicion correspondiente a la posicion 106.354.418 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2-21 ref.
201. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 199 o 200, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-21 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.354.418 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2-21a.
5
10
15
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25
30
35
40
45
50
202. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 201, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D3-16, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen D3-16 que vanan entre sf en una posicion de nucleotido correspondiente a la posicion 106.354.418 en el cromosoma humano 14.
203. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 202, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-16 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.361.515 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-16ref.
204. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 202 o 203, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-16 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.361.515 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-16a.
205. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 204, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D6-13, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen D6-13 que vanan entre sf en una posicion de nucleotido correspondiente a la posicion 106.367.013 en el cromosoma humano 14.
206. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 205, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D6-13 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.367.013 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D6-13ref.
207. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 205 o 206, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D6-13 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.367.013 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D6-13a.
208. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 207, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D3-10, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen D3-10 que vanan entre sf en una o mas posiciones de nucleotidos correspondientes a las posiciones
106.370.370 y
106.370.371
en el cromosoma humano 14.
209. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 208, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-10 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.370.370 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-10ref.
210. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 208 o 209, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-10 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.370.370 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-10a.
211. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 208, 209 o 210 en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-10 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.370.371 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-10ref.
212. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 208 a 211, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-10 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una guanina en una posicion correspondiente a la posicion 106.370.371 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-10b.
213. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 212, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D3-9, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen d3-9 que vanan entre sf en una posicion de nucleotido correspondiente a la posicion 106.370.567 en el cromosoma humano 14.
214. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 213, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-9 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.370.567 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-9ref.
215. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 213 o 214, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-9 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.370.567 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas
5
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15
20
25
30
35
40
45
50
de la secuencia de D3-9a.
216. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 215, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D2-8, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen d2-8 que vanan entre s^ en una o mas posiciones de nucleotidos correspondientes a las posiciones
106.373.085;
106.373.086 y
106.373.089
en el cromosoma humano 14.
217. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 216, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-8 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.373.085 en el cromosoma humano 14.
218. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 216 o 217, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-8 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.373.085 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2-8b.
219. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 216, 217 o 218 en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-8 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.373.086 en el cromosoma humano 14; y
opcionalmente ninguna otra mutacion de la secuencia de D2-8ref.
220. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 216 a 219, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D2-8 humano que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.373.086 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D2- 8ref.
221. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 220, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D4-4, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen d4-4 que vanan entre sf en una o mas posiciones de nucleotidos correspondientes a las posiciones
106.379.086; y
106.379.089
en el cromosoma humano 14.
222. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 221, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D4-4 (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.379.086 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D4-4ref.
223. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 221 o 222, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D4-4 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.379.086 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D4-4a.
224. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 221, 222 o 223 en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D4-4 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.379.089 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D4-4ref o una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.379.086 en el cromosoma humano 14.
225. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 221 a 224, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D4-4 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.373.089 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D4-4a.
226. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 154 a 225, que comprende una pluralidad de segmentos del gen D3-3, en donde la pluralidad comprende segmentos del gen d3-3 que vanan entre sf en una o mas posiciones de nucleotidos correspondientes a las posiciones
106.380,241; y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
106.380.246
en el cromosoma humano 14.
227. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 226, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-3 (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.380.241 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-3ref.
228. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 226 o 227, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-3 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una citosina en una posicion correspondiente a la posicion 106.380.241 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-3a.
229. El vertebrado, celula o poblacion de la clausula 226, 227 o 228 en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-3 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una adenina en una posicion correspondiente a la posicion 106.380.246 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-3ref.
230. El vertebrado, celula o poblacion de una cualquiera de las clausulas de 226 a 229, en donde la pluralidad comprende un segmento del gen D3-3 humano (opcionalmente dos copias y/o en estado homocigoto) que comprende una timina en una posicion correspondiente a la posicion 106.380.246 en el cromosoma humano 14; y, opcionalmente, ninguna mutacion mas de la secuencia de D3-3a.
Multiples variantes de segmentos del gen JL humano
Una aplicacion espedfica de esta configuracion es la provision de multiples segmentos del gen JL humano (Jk y/o JA) de la siguiente manera (tal como se establece en los parrafos numerados, comenzando en el parrafo numero 80).
80. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 3 segmentos del gen JL humano del mismo tipo (p. ej., Jk1), en donde al menos dos de los segmentos del gen JL humanos son variantes que no son identicas entre sf.
81. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JL no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1) en cis en el mismo locus de Ig.
82. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tiene un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JL humano diferentes del mismo tipo (p. ej., JK1) en trans en el mismo locus de Ig; y, opcionalmente, un tercer segmento del gen JL humano del mismo tipo, en donde el tercer JL esta en cis con uno de dichos 2 segmentos del gen JL diferentes.
83. Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio de segmentos del gen JL humano, en donde la pluralidad comprende al menos 2 segmentos del gen JL humano diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1), el primero de dichos segmentos del gen JL diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos del gen JL diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen JL.
84. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula de vertebrado no humano (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JL no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1 en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
85. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 3 segmentos del gen JL humano del mismo tipo (p. ej., Jk1), en donde al menos dos de los segmentos del gen JL humano son variantes que no son identicas entre sf.
86. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JL no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1) en cis en el mismo locus de Ig.
87. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JL humano diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1) en trans en el mismo locus de Ig; y opcionalmente un tercer segmento del gen JL humano del mismo tipo, en donde el tercer JL esta en cis con uno de dichos 2 segmentos del gen JL diferentes.
5
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20
25
30
35
40
45
50
55
88. Un metodo para proporcionar un mayor repertorio de segmentos del gen JL de inmunoglobulina humana, comprendiendo el metodo proporcionar una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., un raton o rata) que comprende un repertorio de segmentos del gen JL humano, en donde el metodo comprende proporcionar al menos 2 segmentos del gen JL humano diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1), en donde el primero de dichos segmentos del gen JL diferentes se proporciona en el genoma de un primer vertebrado de la poblacion, y el segundo de dichos segmentos del gen JL diferentes se proporciona en el genoma de un segundo vertebrado de la poblacion, en donde el genoma del primer vertebrado no comprende el segundo segmento del gen JL.
89. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen JL no endogenos diferentes del mismo tipo (p. ej., Jk1 en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
90. El vertebrado o celula del parrafo 80, 82 o 84, o el metodo del parrafo 85, 82 o 89, en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
91. El vertebrado o celula del parrafo 80, 81 o 82, o el metodo del parrafo 85, 86 o 87, en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
92. El vertebrado o celula del parrafo 80, 81 o 82, o el metodo del parrafo 85, 86 o 87, en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes; opcionalmente en donde los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
93. El vertebrado, celula o metodo del parrafo 92, en donde los individuos no estan relacionados geneticamente.
94. El vertebrado, celula o metodo de uno cualquiera de los parrafos 80 a 93, en donde al menos uno de los segmentos de JL diferentes es un mutante sintetico de un segmento del gen JL de la lmea germinal humana.
95. Un metodo para mejorar la diversidad de genes de inmunoglobulina humana de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), comprendiendo el metodo proporcionar al vertebrado un genoma que comprende al menos 2 segmentos del gen humano JL del mismo tipo (p. ej., Jk1) , en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones; opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en el mismo locus de IgL en dicho genoma.
96. El vertebrado o celula de uno cualquiera de los parrafos parrafo 80 a 82 y 84, en donde el genoma comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen Jk y/o JA humanos con un suplemento de uno, dos o mas segmentos de genes Jk y/o JA humanos respectivamente, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos de genes complementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
97. La poblacion del parrafo 83, en donde la poblacion comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos del gen JL humano con un suplemento de uno, dos o mas segmentos de genes Jk y/o JA humanos respectivamente, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos de genes complementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
98. Un vertebrado no humano (p. ej., un raton o rata) o una celula no humana (p. ej., una celula ES o una celula B) que tienen un genoma que comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos de genes Jk y/o JA humanos con un suplemento de uno, dos o mas segmentos de genes Jk y/o JA humanos, respectivamente, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos de genes complementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
99. Una poblacion de vertebrados no humanos (p. ej., ratones o ratas) que comprende un repertorio funcional sustancialmente completo de tipos de segmentos de genes Jk y/o JA humanos con un suplemento de uno, dos o mas segmentos de genes Jk y/o JA humanos respectivamente, en donde dicho repertorio funcional sustancialmente completo y los segmentos de genes complementarios no se encuentran juntos en el genoma de la lmea germinal de un individuo humano.
100. Un vertebrado no humano o celula de vertebrado de acuerdo con el parrafo 81, que comprende un genoma que comprende repertorios de genes VL y JL que comprenden segmentos de genes humanos, comprendiendo el repertorio del gen JL
una pluralidad de segmentos del gen Jk1 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen Jk2 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de una pluralidad de segmentos del gen diferentes en cis en el mismo locus de
Jk3 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
Jk4 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
Jk5 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
JA1 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
JA2 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
JA3 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
JA4 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
JA5 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
JA6 humano proporcionada Ig en dicho genoma; o JA7 humano proporcionada Ig en dicho genoma;
por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2 por al menos 2
segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del segmentos del
gen Jk1 humano gen Jk1 humano gen Jk1 humano gen JA1 humano gen JA2 humano gen JA3 humano gen JA4 humano gen JA5 humano gen JA6 humano gen JA7 humano
opcionalmente en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de dos o mas individuos humanos diferentes.
101. Un vertebrado o no humano celula de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula B), de acuerdo con el parrafo 80, que comprende un genoma que comprende repertorios de genes VL y JL que comprenden segmentos de genes humanos, comprendiendo el repertorio del gen JL
una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen Jk1 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen Jk2 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen Jk1 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen Jk1 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen Jk1 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA1 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA2 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA3 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA4 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA5 humano; una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA6 humano; o una pluralidad de segmentos del gen segmentos del gen JA7 humano;
Jk1 humano proporcionada por a Jk2 humano proporcionada por a Jk3 humano proporcionada por a humano Jk4 proporcionada por a humano Jk5 proporcionada por a Jk1 humano proporcionada por a JA2 humano proporcionada por a JA3 humano proporcionada por a JA4 humano proporcionada por a JA5 humano proporcionada por a JA6 humano proporcionada por a JA7 humano proporcionada por a
menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej. menos 3 (p. ej.
3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7) 3, 4, 5, 6, o 7)
opcionalmente en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de dos o tres humano diferentes;
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
diferentes
individuos
opcionalmente en donde al menos 2 o 3 de dichos segmentos de genes diferentes se proporcionan en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma.
102. El vertebrado o celula del parrafo 104 o 105, en donde los diferentes individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
103. El vertebrado o celula de uno cualquiera de los parrafos 104 a 106, en donde los individuos no estan relacionados geneticamente.
104. El vertebrado o de celulas de uno cualquiera de los parrafos 104 a 107, en donde al menos uno de los diferentes segmentos de JL es un mutante sintetico de un segmento del gen JL de la lmea germinal humana.
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105. Un vertebrado no humano o celulas de vertebrado (opcionalmente una celula ES o una celula B) de acuerdo con el parrafo 84, que comprende un genoma que comprende repertorios de genes VL y JL humanos, comprendiendo el repertorio del gen JL
una pluralidad de segmentos del gen Jk1 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen Jk2 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen Jk3 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen Jk4 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen Jk5 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen Jk1 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JA1 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JA1 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JA2 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JA2 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JA3 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JA3 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JA4 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JA4 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JA5 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JA5 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
una pluralidad de segmentos del gen JA6 humano proporcionada por al menos 2 segmentos del gen JA6 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma; o una pluralidad de segmentos del gen JA7 humano proporcionados por al menos 2 segmentos del gen JA7 humano diferentes, opcionalmente en cis en el mismo locus de Ig en dicho genoma;
en donde los segmentos del gen JL derivan de la secuencia del genoma de diferentes individuos humanos que no estan geneticamente relacionados a lo largo de al menos 3 generaciones.
106. El vertebrado o celula del apartado 109, en donde los individuos humanos son de diferentes poblaciones humanas.
El experto se dara cuenta de que las tecnicas convencionales de la biologfa molecular se pueden utilizar para proporcionar vectores que comprenden combinaciones sinteticas de segmentos de genes de inmunoglobulina (p. ej., V, D y/o J) para su uso en la invencion, de tal manera que los vectores se pueden utilizar para construir un locus de inmunoglobulina transgenico (p. ej., utilizando la recombinacion homologa y/o el intercambio de casete mediado por recombinasa como se conoce en la tecnica, p. ej., veanse los documentos US7501552 (Medarex), US5939598 (Abgenix), US6130364 (Abgenix), WO02/066630 (Regeneron), WO2011004192 (Genome Research Limited), WO2009076464, WO2009143472 y WO2010039900 (Ablexis. Por ejemplo, tales combinaciones sinteticas de segmentos de genes se pueden realizar utilizando tecnicas convencionales de modificacion genetica mediada por recombinacion en E coli para construir vectores de BAC que albergan la combinacion sintetica antes de la insercion en las celulas madre embrionarias mediante recombinacion homologa o RMCE (p. ej., utilizando la recombinacion espedfica del sitio cre/lox). Los detalles de la modificacion genetica mediada por recombinacion se pueden encontrar en
www.genebridges.com y en los documentos EP1034260 y EP1204740.
En una realizacion, es util desviar la respuesta inmunitaria de los vertebrados (y los anticuerpos principales resultantes) a un segmento de gen predeterminado, p. ej., uno conocido por ser utilizado comunmente en la respuesta inmunitaria humana natural a antfgenos, tales como antfgenos de patogenos de enfermedades infecciosas. Por ejemplo, VH1-69 se utiliza comunmente para producir anticuerpos en los seres humanos contra el virus de la influenza; es posible, por lo tanto, incluir dos o mas versiones de ADN polimorficas del segmento de VH VH1-69 en el locus de la descripcion. Los ejemplos siguientes ilustran como se puede construir semejante locus transgenico en el que la diversidad se amplfa al ampliar el repertorio de segmentos del gen VH1-69 basandose en variantes polimorficas de VH1-69 de origen natural.
En una realizacion en cualquier configuracion de la invencion, el genoma se ha modificado para prevenir o reducir la expresion de un anticuerpo totalmente endogeno. Los ejemplos de las tecnicas adecuadas para hacer esto se pueden encontrar en los documentos PCT/GB2010/051122, US7501552, US6673986, US6130364,
WO2009/076464, EP1399559 y US6586251. En una realizacion, la region VDJ de vertebrados no humanos del locus endogeno de cadena pesada de inmunoglobulina, y opcionalmente la region VJ de los loci endogenos de la cadena ligera de inmunoglobulina (loci lambda y/o kappa), se han inactivado. Por ejemplo, la totalidad o parte de la region de VDJ de vertebrado no humano se inactiva por inversion en el locus endogeno de la cadena pesada de inmunoglobulina del mairnfero, opcionalmente moviendo la region invertida aguas arriba o aguas abajo del locus endogeno de Ig (vease, p. ej., el documento WO2011004192). Por ejemplo, la totalidad o parte de la region VJ de vertebrado no humano se inactiva por inversion en el locus endogeno de la cadena kappa de inmunoglobulina del mai^ero, opcionalmente moviendo la region invertida aguas arriba o aguas abajo del locus endogeno de Ig. Por
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ejemplo, la totalidad o parte de la region VJ de vertebrado no humano se inactiva por inversion en el locus endogeno de la cadena lambda de inmunoglobulina del mairnfero, opcionalmente moviendo la region invertida aguas arriba o aguas abajo del locus endogeno de Ig. En una realizacion, el locus endogeno de cadena pesada se inactiva de esta manera como lo son uno o ambos de los loci endogenos kappa y lambda.
Adicionalmente o alternativamente, el vertebrado se ha generado en un fondo genetico que previene la produccion de linfocitos B y T anfitriones maduros, opcionalmente un fondo carente de RAG-1 y/o carente de RAG-2. Vease el documento US5859301 para las tecnicas de generacion de animales carentes de RAG-1.
Por lo tanto, en una realizacion de cualquier configuracion o aspecto de la invencion, se ha inactivado la expresion de la cadena pesada y ligera endogenas.
En una realizacion cada uno de dichos loci de la region constante es una region constante de vertebrado no humano de cadena pesada endogena (opcionalmente raton o rata anfitriones).
En una realizacion cada uno de dichos loci de la region constante es una region constante de vertebrado no humano de cadena ligera endogena (opcionalmente de raton o rata anfitriones).
La descripcion proporciona una composicion de anticuerpo monoclonal o policlonal preparado mediante inmunizacion de al menos un vertebrado (p. ej., raton o rata) de acuerdo con la descripcion, opcionalmente en donde el antfgeno es un antfgeno de un patogeno de una enfermedad infecciosa (p. ej., un antfgeno de patogeno bacteriano o viral), opcionalmente en donde el mismo antfgeno se utiliza para inmunizar todos los vertebrados; opcionalmente en donde el anticuerpo o los anticuerpos son de tipo IgG (p. ej., IgG1).
La descripcion tambien proporciona una mezcla de anticuerpos monoclonales o policlonales producidos por el metodo de la invencion o un anticuerpo derivado o mezcla de los mismos, p. ej., donde una o mas regiones constantes se han cambiado (p. ej., sustituido por una region constante diferente, tal como una region constante humana; o mutado para mejorar o anular la funcion efectora de Fc). En un aspecto de la descripcion, se proporciona una mezcla de anticuerpos monoclonales o policlonales para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion en un ser humano, p. ej., para el tratamiento y/o prevencion de una enfermedad infecciosa, en donde, opcionalmente, cada anticuerpo se une a un antfgeno de un patogeno de una enfermedad infecciosa, preferiblemente el mismo antfgeno.
En un aspecto de la descripcion, se proporciona el uso de un anticuerpo aislado, monoclonal o policlonal de acuerdo con la descripcion, o un anticuerpo mutante o derivado del mismo en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad o afeccion en un ser humano, p. ej., una enfermedad infecciosa, opcionalmente en donde la enfermedad infecciosa es una enfermedad causada por un patogeno bacteriano o viral.
Un ejemplo de un anticuerpo mutante es uno que tiene hasta 15 o 10 mutaciones de aminoacidos en sus regiones variables con respecto a un anticuerpo aislado (p. ej., un anticuerpo de tipo IgG, por ejemplo de tipo IgG1) obtenible u obtenido por el metodo de la invencion. Un ejemplo de un derivado es uno que ha sido modificado para reemplazar una region constante por una region constante diferente, tal como una region constante humana; o mutado para mejorar o anular la funcion efectora de Fc.
Los ejemplos de las enfermedades infecciosas son enfermedades causadas o mediadas por un patogeno bacteriano o viral. Por ejemplo, la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste de una enfermedad causada por un patogeno seleccionado del grupo que consiste en Haemophilus influenza, E. coli, Neisseria meningitidis, un virus de la familia del herpes, citomegalovirus (CMV), VIH y virus de la influenza.
Adaptacion de la incorporacion de V(D)J a loci de inmunoglobulina para la generacion de anticuerpos contra enfermedades infecciosas
Los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que sena deseable proporcionar vertebrados, celulas, metodos, etc. para la produccion de anticuerpos terapeuticos y/o profilacticos basandose en las respuestas inmunitarias humanas naturales a antfgenos, tales como antfgenos de patogenos de enfermedades infecciosas. A este respecto, la bibliograffa observa con frecuencia el uso de segmentos de genes de inmunoglobulina para aumentar las respuestas anti-infecciosas en seres humanos (Tabla 9).
En las diversas configuraciones, aspectos, realizaciones y ejemplos anteriores, la descripcion proporciona al destinatario experto la posibilidad de elegir segmentos de genes de inmunoglobulina en una forma que se adapta o sesga el repertorio para su aplicacion a la generacion de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades infecciosas. Los autores de la presente invencion han clasificado los siguientes grupos de segmentos de genes para su uso en la descripcion de acuerdo con la aplicacion deseada de los anticuerpos resultantes.
Lista A:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen un antfgeno expresado por un patogeno
(a) un segmento del gen VL seleccionado del grupo constituido por un miembro de la familia del gen VJI, VaVII 4A,
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VaII 2.1, VaVII 4A, un miembro de la familia del gen VA1, un miembro de la familia del gen VA3, IGLV1S2, VA3- cML70, lalh2, lalvl, la3h3, Kv325, un miembro de la familia del gen Vk, kI-15A (KL012), un miembro de la familia VkII, un miembro de la familia VkIII, un miembro de la familia del gen VJ, kI-15A (KL012), VkII A2 (opcionalmente la variante A2a), Vk A27 (Humkv325) y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(b) un segmento del gen Va seleccionado entre un miembro de la familia del gen VaII, VaVII 4A, VaII 2.1, VaVII 4A, un miembro de la familia del gen Va1, un miembro de la familia del gen Va3, IGLV1S2, Va3-cML70, lalh2, lalvl, la3h3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(c) un segmento del gen Vk seleccionado entre Kv325, un miembro de la familia del gen Vk, kI-15A (KL012), un miembro de la familia VkII, un miembro de la familia VkIII, un miembro de la familia del gen VJ, kI-15A (KL012), VkII A2 (opcionalmente la variante A2a), Vk A27 (Humkv325) y un segmento del gen de identico en al menos 80% al mismo.
(d) un segmento del gen Vh, un miembro de la familia del gen VhIII (opcionalmente, un miembro de la familia VHIIIa o VHIIIb), un miembro de la familia del gen VhIV, VhIII 9.1 (VH3-15), VhIII VH26 (VH3-23), Vh3-21, LSG6.1, LSG12.1, DP77 (V3-21), Vh H11, VhIGRR, ha3h2, VHI-ha1c1, VhIII-VH2-1, VH4.18, ha4h3, Hv1051, 71-2, Hv1f10, VH4.11, 714, VH251, VH1-69 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(e) un segmento del gen Ja seleccionado entre Ja2, Ja3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(f) un segmento del gen D seleccionado entre DK1, Dxp'1, Dn4r, D2r y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
Lista A1:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen a un antfgeno expresado por un patogeno
(a) un segmento del gen Va seleccionado entre un miembro de la familia del gen VaII, Va VII 4A, Va II 2.1, Va VII 4A y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(b) un segmento del gen Vk seleccionado entre un miembro de la familia del gen VJ, kI-15A (KL012), un miembro de la familia VkII, un miembro de la familia VkIII, un miembro de la familia del gen Vk, kI-15A (KL012), VkII A2 (opcionalmente la variante A2a), Vk A27 (Humkv325) y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(c) un segmento del gen Vh un miembro de miembro de la familia del gen Vh3 (opcionalmente, un miembro de la familia VHllla o VHIIIb), VhIII 9.1 (VH3-15), VhIII VH26 (VH3-23), Vh3-21, LSG6.1, LSG12.1, DP77 (V3-21), Vh H11 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(d) un segmento del gen Ja seleccionado entre Ja2, Ja3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(e) un segmento del gen Jh seleccionado entre Jh2, Jh3, Jh4 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
Lista A1.1:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen a un antfgeno expresado por H influenza
(a) un segmento del gen Va seleccionado entre un miembro de la familia del gen VaII, VaVII 4A, VaII 2.1, VaVII 4A y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(b) un segmento del gen Vk seleccionado entre un miembro de la familia VkII, un miembro de la familia VkIII, un miembro de la familia del gen Vk, kI-15A (KL012), VkII A2 (opcionalmente la variante A2a), Vk A27 (Humkv325) y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(c) un segmento del gen Vh, un miembro de la familia del gen Vh3 (opcionalmente, un miembro de la familia VHIIIb), VhIII 9.1 (VH3-15), VhIII VH26 (VH3-23), Vh3-21, LSG6.1, LSG 12,1, DP77 (V3-21) y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(d) un segmento del gen Ja seleccionado entre Ja2, Ja3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo. Lista A1.2:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen a un antfgeno expresado por E Coli o Neisseria meningitidis
(a) un segmento del gen Vh, un miembro de la familia del gen Vh3 (opcionalmente un miembro VHIIIa o VHIIIb), VhIII 9.1 (VH3-15), Vh H11, VhIII Vh26 (VH3-23) un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo, p. ej., VhIII 9.1 + Jh3; o VH H11 + JH4; o VhIII VH26 + Jh2.
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(b) un segmento del gen Vk seleccionado entre un miembro de la familia del gen VkI, kI-15A (KL012) y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(c) un segmento del gen Va seleccionado entre un miembro de la familia del gen VaII, VaII 2,1 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(d) un segmento del gen Jh seleccionado entre Jh2, Jh3, Jh4 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
A2:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen un antfgeno expresado por un patogeno viral
(a) un segmento del gen Vh seleccionado entre un miembro de la familia del gen VhIII, un miembro de la familia del gen VhIV, VhMI-VH26 (VH3-23), VhIGRR, ha3h2, VHl-ha1c1, VhMI-VH2-1, VH4.18, ha4h3, Hv1051, 71-2, Hv1f10, VH4.11, 71-4, VH251, VH1-69 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(b) un segmento del gen Va seleccionado entre un miembro de la familia del gen Va1, un miembro de la familia del gen Va3, IGLV1S2, Va3-cML70, lalh2, lalvl, la3h3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(c) un segmento del gen Vk seleccionado entre Kv325 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(d) un segmento del gen Jh seleccionado entre Jh3, Jh5, Jh6 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(e) un segmento del gen D seleccionado entre DK1, Dxp'1, Dn4r, D2r y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(f) un segmento del gen Ja seleccionado entre Ja2, Ja3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo. A2.1:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen un antfgeno expresado por la familia de virus del herpes (p. ej., VZV o HSV)
(a) un segmento del gen Vh seleccionado entre un miembro de la familia del gen VhIII, un miembro de la familia del gen VhIV, VhIII-VH26 (VH3-23), VH1GRR, ha3h2, VHI-ha1c1, VhIII-VH2-1, VH4.18, ha4h3, y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(b) un segmento del gen Va seleccionado entre un miembro de la familia del gen Va1, un miembro de la familia del gen Va3, IGLV1S2, Va3-cML70, lalh2, lalvl, la3h3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(c) un segmento del gen Jh seleccionado entre Jh3, Jh5, Jh6 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(d) un segmento del gen D seleccionado entre DK1, Dxp'1, Dn4r, D2r y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(e) un segmento del gen Ja seleccionado entre Ja2, Ja3 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo. A2.2:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen a un antfgeno expresado por CMV
(a) un segmento del gen Vh seleccionado entre Hv1051 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
(b) un segmento del gen Vk seleccionado entre Kv325 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo. A2.3:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen un antfgeno expresado por el VIH
(a) un segmento del gen Vh seleccionado entre 71-2, Hv1f10, VH4.11, 71-4, VH251, VH1-69 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
A2.4:
Segmentos de genes de inmunoglobulina para anticuerpos que se unen un antfgeno expresado por el virus Influenza (a) un segmento del gen Vh seleccionado entre VH1-69 y un segmento del gen identico en al menos 80% al mismo.
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Asf,
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa, se pueden seleccionar de la lista A1 uno o mas uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la exposicion que se describen en la presente memoria. Asf, por ejemplo, en (a) de la primera configuracion de la descripcion, el segmento del gen V de cadena pesada expuesto se selecciona entre los segmentos del gen VH de la Lista A, opcionalmente con un D de esa lista.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por un patogeno bacteriano, se pueden seleccionar de la lista A1 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por un patogeno viral, se pueden seleccionar de la lista A2 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por H influenza, se pueden seleccionar de la lista A1.1 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por E. coli o Neisseria meningitidis, se pueden seleccionar de la lista A1.2 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por la familia del virus del herpes (p. ej., VZV o HSV), se pueden seleccionar de la lista A2.1 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por CMV, se pueden seleccionar de la lista A2.2 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por el VIH, se pueden seleccionar de la lista A2.3 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J utilizados en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Cuando se desea generar un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad infecciosa causada o mediada por el virus Influenza, se pueden seleccionar de la lista A2.4 uno o mas o todos los segmentos de los genes V, D y/o J, en cualquier configuracion, aspecto, metodo, ejemplo o realizacion de la descripcion.
Opcionalmente cada segmento VH en el locus de la descripcion se selecciona entre las listas A1, A2, A1.1, A1.2, A2.1, A2.2, A2.3 o A2.4.
Opcionalmente cada segmento VL en el locus de la descripcion se selecciona entre la listas A1, A2, A1.1, A1.2, A2.1, A2.2, A2.3 o A2.4
Opcionalmente cada segmento D en el locus de la descripcion se selecciona entre las listas A1, A2, A1.1, A1.2, A2.1, A2.2, A2.3 o A2.4.
Opcionalmente cada segmento de JL en el locus de la descripcion se selecciona entre las listas A1, A2, A1.1, A1.2, A2.1, A2.2, A2.3 o A2.4.
Anticuerpos para la terapia y profilaxis de pacientes de ascendencia espedfica
Los autores de la presente invencion, despues de haber realizado el amplio ejercicio Bioinformatico descrito en la presente memoria, se dieron cuenta de que el resultado de este analisis ha permitido identificar segmentos de genes espedficos que son utiles para producir farmacos basados en el dominio VH y en anticuerpos que se adaptan espedficamente a la ascendencia de un paciente (es decir, el genotipo). Es decir, los anticuerpos se pueden seleccionar basandose en que son producidos in vivo en un vertebrado no humano transgenico (p. ej., raton o rata con loci de IgH transgenicos) y en particular derivados de segmentos de genes que son relativamente frecuentes en
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los miembros de la poblacion del paciente, es dedr, de individuos de la misma ascendencia humana. Dado que las distribuciones de las variantes difieren a traves de diferentes poblaciones (vease la Tabla 13), esto probablemente refleja los efectos de la evolucion, la adaptacion y la conservacion de los tipos de genes variantes utiles en esas poblaciones. Por lo tanto, mediante la adaptacion de los farmacos basados en anticuerpos de acuerdo con la revelacion, es posible hacer coincidir el farmaco con los sesgos de los genes de la poblacion, con el objetivo de producir mejores farmacos para esa poblacion espedfica de seres humanos. Mejor puede significar, por ejemplo, mas eficaz, mas neutralizador, mayor afinidad por el antigeno diana, menos inmunogenicos, menos reacciones del paciente frente al farmaco etc. Esto se puede determinar empmcamente, como es habitual en los procedimientos de investigacion y desarrollo de farmacos.
Por lo tanto, la descripcion proporciona las realizaciones siguientes (numeradas de la clausula 345 en adelante): -
345. Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente Chino, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno
y una region constante, en donde la region constante es una region constante humana seleccionada entre una region constante (p. ej., una region constante de IGHG) en la Tabla 13 que se encuentra en una poblacion China y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); y/o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron humano de la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) mutaciones.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente Chino, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante, en donde la region constante es una region constante humana seleccionada entre una region constante (p. ej., una region constante de IGHG) presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); y/o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. j., raton o rata).
En un ejemplo, la region constante se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, la region constante se encuentra en la Tabla 13.
346. El anticuerpo de la clausula de 345, en donde la region constante es una region constante IGHG1a, IGHG2a, IGHG3a, IGHG3b o IGHG4a.
347. El anticuerpo de la clausula de 345 o 346, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un
segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano,
seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH de la Tabla 13 que se encuentra en una poblacion China y
con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula de 345 o 346, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
348. El anticuerpo de la clausula de 345, 346 o 347, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un
segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano,
seleccionandose el segmento del gen D entre un D de la Tabla 13 encontrado en una poblacion China y con una
frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula de 345, 346 o 347, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen D entre D presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos el 5%.
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En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
349. El anticuerpo de la clausula 345, 346, 347 o 348 en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH de la Tabla 13 encontrado en una poblacion China y con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula 345, 346, 347 o 348 en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos el 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
350. Un dominio VH aislado identico a un dominio variable como el expuesto en una cualquiera de las clausulas 347 a 349, opcionalmente fusionado en su extremo C terminal a un polipeptido (p. ej., un Fc de anticuerpo).
En una realizacion, se proporciona un dominio VH aislado identico a un dominio variable como el expuesto en una cualquiera de las clausulas 347 a 349, que es parte de un producto conjugado, conjugado con una marca (p. ej., para formacion de imagenes en el paciente) o una toxina (p. ej., una carga util toxica radiactiva, por ejemplo para el tratamiento del cancer en el paciente) o un radical que prolonga la semivida (p. ej., PEG de albumina de suero humano).
351. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o dominio variable de una cualquiera de las clausulas de 345 a 350 junto con un excipiente, diluyente farmaceuticamente aceptable o un medicamento (p. ej., un dominio variable espedfico del antfgeno, cadena de anticuerpo o anticuerpo adicionales).
352. Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente Chino, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH de la Tabla 13 que se encuentra en una poblacion China y con una frecuencia acumulativa de al menos 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); y/o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de un vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de un vertebrado no humano (p. ej., raton o rata).
En otra realizacion, la descripcion proporciona
Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente Chino, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); y/o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de un vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata).
353. El anticuerpo de la clausula 352, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen D entre un D de la Tabla 13 que se encuentra en una poblacion China y con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula 352, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen D entre un D presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos el 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
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354. El anticuerpo de la clausula de 352 o 353, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento genico de VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH de la Tabla 13 que se encuentra en una poblacion China y con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula de 352 o 353, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
355. Un dominio VH aislado identico a un dominio variable como el expuesto en una cualquiera de las clausulas 352 a 354, opcionalmente fusionado en su extremo C terminal a un polipeptido (p. ej., un Fc de anticuerpo).
En una realizacion, se proporciona un dominio VH identico a un dominio variable como el expuesto en una cualquiera de las clausulas 352 a 354, que es parte de un producto conjugado, conjugado con una marca (p. ej., para la formacion de imagenes en el paciente) o una toxina (p. ej., una carga util toxica radiactiva, por ejemplo para el tratamiento del cancer en el paciente) o un radical de ampliacion de la semivida (p. ej., PEG de albumina de suero humano).
356. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o dominio variable de una cualquiera de las clausulas 352 a 355 junto con un excipiente, diluyente farmaceuticamente aceptable o un medicamento (p. ej., un dominio variable espedfico del antfgeno, una cadena de anticuerpo o un anticuerpo adicionales).
357. Una cadena pesada de anticuerpo o dominio VH (p. ej., proporcionado como parte de un anticuerpo) para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion medica en un paciente Chino, en donde la cadena pesada es una cadena pesada producida mediante las siguientes etapas (o es una copia de semejante cadena pesada):-
(a) Seleccion de una cadena pesada anticuerpo de espedfica para el antfgeno o un dominio VH de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), en donde la cadena pesada o el dominio VH derivan de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH de la Tabla 13 que se encuentra en una poblacion China y con una frecuencia acumulativa de al menos 5%;
(b) Humanizacion opcional de la cadena pesada mediante la combinacion del dominio variable de la cadena pesada con una region constante humana; o la humanizacion opcional del dominio VH seleccionado mediante la combinacion con una region constante humana.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
Una cadena pesada de anticuerpo o dominio VH (p. ej., proporcionado como parte de un anticuerpo) para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion medica en un paciente Chino, en donde la cadena pesada es una cadena pesada producida mediante las siguientes etapas (o una copia de semejante cadena pesada): -
(a) Seleccion de un anticuerpo de cadena pesada espedfica para el antfgeno o un dominio VH de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), en donde la cadena pesada o el dominio VH derivan de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos 5%;
(b) Humanizacion opcional de la cadena pesada combinando el dominio variable de la cadena pesada con una region constante humana; o humanizacion opcional del dominio VH seleccionado mediante la combinacion con una region constante humana.
En un ejemplo, el segmento del gen VH se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
358. La cadena pesada del anticuerpo o dominio VH de la clausula 357, en donde la region constante humana es la expuesta en la clausula de 345 o 346.
359. Una cadena pesada de anticuerpo o dominio VH como los expuestos en la clausula 357 o 358 para su uso en un medicamento para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion medica en un paciente Chino.
360. Un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad o afeccion medica en un paciente Chino, comprendiendo el metodo administrar al paciente una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de la cadena pesada de anticuerpo o dominio VH como se expone en la clausula 357 o 358.
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361. Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa
Occidental, del Sur de Asia o de America, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana,
comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno y una region constante, en donde la region constante es una region constante humana seleccionada entre una region constante (p. ej., una region constante de IGHG) de la Tabla 13 encontrada en una poblacion de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, respectivamente, y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata).
En otra realizacion, la descripcion proporciona
Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana,
comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antigeno y una region constante, en donde la region constante es una region constante humana seleccionada entre una region constante (p. ej., una region constante de IGHG) presente en una poblacion de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, respectivamente, con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron de AID de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata).
En un ejemplo, la region constante se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, la region constante se encuentra en la Tabla 13.
362. El anticuerpo de la clausula de 361 en donde la region constante es una region constante IGHG1a, IGHG2a, IGHG3a, IGHG3b o IGHG4a y el paciente es de ascendencia Europea.
363. El anticuerpo de la clausula de 361 o 362, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH de la Tabla 13 que se encuentra en dicha poblacion y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula de 361 o 362, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
364. El anticuerpo de la clausula 361, 362 o 363, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un
segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano,
seleccionandose el segmento del gen D entre un D de la Tabla 13 encontrado en dicha poblacion y con una
frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula 361, 362 o 363, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen D entre un D presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos el 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
365. El anticuerpo de la clausula 361, 362, 363 o 364 en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un
segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano,
seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH de la Tabla 13 que se encuentra en dicha poblacion y con una
frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
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En otra realizacion, la descripcion proporciona
El anticuerpo de la clausula 361, 362, 363 o 364 en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH presente en una poblacion China con una frecuencia acumulativa de al menos el 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
366. Un dominio VH aislado identico a un dominio variable expuesto en una cualquiera de las clausulas 363 a 365, opcionalmente fusionado en su extremo C terminal a un polipeptido (p. ej., un anticuerpo Fc).
367. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o dominio variable de una cualquiera de las clausulas 361 a 366 junto con un excipiente, diluyente farmaceuticamente aceptable o un medicamento (p. ej., un dominio variable espedfico de antfgeno, una cadena de anticuerpo o un anticuerpo adicionales).
368. Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental o de America, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH de la Tabla 13 encontrado en una poblacion de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, respectivamente, y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o el 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata).
En otra realizacion, la descripcion proporciona: -
Un anticuerpo aislado para la administracion a un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental o de America, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humana, comprendiendo la cadena pesada un dominio variable que es espedfico para un antfgeno y una region constante, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH presente en una poblacion de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, respectivamente, con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%; y en donde
(i) el dominio variable deriva de la recombinacion de dichos segmentos de genes humanos en un vertebrado no humano (p. ej., en un raton o una rata); o (ii) el dominio variable comprende mutaciones del patron AID de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata) y mutaciones del patron de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de vertebrado no humano (p. ej., raton o rata).
En un ejemplo, el segmento del gen VH se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
369. El anticuerpo de la clausula 368, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen D entre un D de la Tabla 13 que se encuentra en dicha poblacion y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
En otro ejemplo, se proporciona
El anticuerpo de la clausula 368, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen D entre un D presente en dicha poblacion con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen D se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
370. El anticuerpo de la clausula 368 o 369, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH de la Tabla 13 que se encuentra en dicha poblacion y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
En otro ejemplo, se proporciona
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El anticuerpo de la clausula 368 o 369, en donde el dominio variable deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen JH entre un JH presente en dicha poblacion y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%.
En un ejemplo, el segmento del gen JH se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
371. Un dominio VH aislado identico a un dominio variable expuesto en una cualquiera de las clausulas 368 a 370, opcionalmente fusionado en su extremo C terminal a un polipeptido (p. ej., un Fc de anticuerpo).
372. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o dominio variable de una cualquiera de las clausulas 368 a 371 junto con un excipiente, diluyente farmaceuticamente aceptable o un medicamento (p. ej., un dominio variable espedfico de antfgeno, una cadena de anticuerpo o un anticuerpo adicional).
373. Una cadena pesada de anticuerpo o un dominio VH (p. ej., proporcionado como parte de un anticuerpo) para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion medica en un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, en donde la cadena pesada es una cadena pesada producida mediante las siguientes etapas (o es una copia de semejante cadena pesada): -
(a) Seleccionar una cadena pesada de anticuerpo espedfica para el antfgeno o un dominio VH de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), en donde la cadena pesada o un dominio VH deriva de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH de la Tabla 13 que se encuentra en dicha poblacion y con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%;
(b) Humanizar opcionalmente la cadena pesada mediante combinacion del dominio variable de la cadena pesada con una region constante humana; o humanizar opcionalmente el dominio VH seleccionado mediante la combinacion con una region constante humana.
En otra realizacion, se proporciona: -
Una cadena pesada de anticuerpo o un dominio VH (p. ej., proporcionado como parte de un anticuerpo) para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion medica en un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, en donde la cadena pesada es una cadena pesada producida mediante las siguientes etapas (o es una copia de semejante cadena pesada): -
(a) Seleccionar una cadena pesada de anticuerpo espedfica para el antfgeno o un dominio VH de un vertebrado no humano (p. ej., un raton o una rata), en donde la cadena pesada o e dominio VH derivan de la recombinacion de un segmento del gen VH humano con un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, seleccionandose el segmento del gen VH entre un VH presente en dicha poblacion con una frecuencia acumulativa de al menos 1 o 5%;
(b) humanizar opcionalmente la cadena pesada mediante la combinacion del dominio variable de la cadena pesada con una region constante humana; o humanizar opcionalmente el dominio VH seleccionado mediante la combinacion con una region constante humana.
En un ejemplo, el segmento del gen VH se encuentra en la base de datos de 1000 Genomas. En un ejemplo, el segmento del gen se encuentra en la Tabla 13.
374. La cadena pesada de anticuerpo o dominio VH de la clausula 373, en donde la region constante humana se expone en la clausula de 361 o 362.
375. Una cadena pesada de anticuerpo o dominio VH como se expone en la clausula 373 o 374 para su uso en un medicamento para la terapia y/o profilaxis de una enfermedad o afeccion medica en un paciente de dicha ascendencia.
376. Un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad o afeccion medica en un paciente de ascendencia Europea, de Asia Oriental, de Africa Occidental, del Sur de Asia o de America, comprendiendo el metodo administrar al paciente una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de la cadena pesada del anticuerpo o el dominio VH como se expone en la clausula 373 o 374.
En realizaciones de la presente memoria, un paciente Chino puede ser un paciente Chino Han.
En realizaciones de la presente memoria, un paciente de ascendencia Europea puede ser un paciente de ascendencia del Norte de Europa o de Europa Occidental, de ascendencia Italiana, de ascendencia Britanica o Escocesa, de ascendencia Finlandesa o de ascendencia Iberica.
En realizaciones de la presente memoria, un paciente de ascendencia de Asia Oriental puede ser un paciente de
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ascendencia China Han, de ascendencia Japonesa, de ascendencia China Dai, de ascendencia vietnamita o de ascendencia Kinh.
En realizaciones de la presente memoria, un paciente de ascendencia de Africa Occidental puede ser un paciente de ascendencia Yoruba, de ascendencia Luhya, de ascendencia Gambiana o ascendencia de Malawi.
En realizaciones de la presente memoria, un paciente de ascendencia Americana puede ser un paciente de ascendencia Afroamericana, de ascendencia Afrocaribena, de ascendencia Mejicana, de ascendencia Puertorriquena, de ascendencia Colombiana o de ascendencia Peruana.
En realizaciones de la presente memoria, un paciente de ascendencia del sur de Asia puede ser un paciente de ascendencia Ahom, de ascendencia Kayadtha, de ascendencia Reddy, de ascendencia Maratha o de ascendencia Punjabi.
En un ejemplo de cualquier aspecto, la frecuencia acumulativa es de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95%.
Se entendera que las realizaciones particulares descritas en la presente memoria se muestran a modo de ilustracion y no como limitacion de la invencion. Las principales caractensticas de esta invencion se pueden emplear en diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la invencion. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar utilizando solamente estudios rutinarios, numerosos equivalentes a los procedimientos espedficos descritos en la presente memoria. Se considera que tales equivalentes estan dentro del alcance de esta invencion y estan abarcados por las reivindicaciones. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la tecnica a la que pertenece esta invencion. El uso del termino "un", "uno" o "una" cuando se usa junto con el termino "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero tambien es compatible con el significado de "uno o mas", "al menos uno" y "uno o mas de uno". El uso del termino "o" en las reivindicaciones se emplea para significar "y/o" a menos que se indique expresamente para referirse a alternativas solamente o a alternativas que son mutuamente excluyentes, aunque la descripcion apoya una definicion que se refiere solo a alternativas e "y/o". A lo largo de esta solicitud, el termino "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variacion inherente de error para el dispositivo, el metodo que se emplea para determinar el valor, o la variacion que existe entre los sujetos de estudio.
Segun se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, los terminos "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluyen" e "incluye") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contienen" y "contiene") son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos adicionales no citados, o etapas de procedimiento.
El termino "o combinaciones de los mismos", segun se utiliza en la presente memoria se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al termino. Por ejemplo, se pretende que "A, B, C, o combinaciones de los mismos incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, tambien BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, o CAB. Siguiendo con este ejemplo, se incluyen expresamente las combinaciones que contienen repeticiones de uno o mas elementos o terminos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCcC, CBBAAA, cAbABB, etc. El experto en la tecnica comprendera que normalmente no hay ningun lfmite en el numero de elementos o terminos en cualquier combinacion, a menos que resulte de otro modo evidente por el contexto.
Cualquier parte de esta descripcion puede leerse combinada con cualquier otra parte de la descripcion, a menos que resulte de otro modo evidente por el contexto.
Todas las composiciones y/o metodos descritos y reivindicados en la presente memoria se pueden preparar y ejecutar sin experimentacion indebida a la luz de la presente descripcion. Aunque las composiciones y metodos de esta invencion se han descrito en terminos de realizaciones preferidas, sera evidente para los expertos en la tecnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o metodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del metodo descrito en la presente memoria sin apartarse del concepto y el alcance de la invencion. Todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la tecnica se deben considerar dentro del alcance y el concepto de la invencion como se define por las reivindicaciones adjuntas.
La presente invencion se describe con mas detalle en los siguientes Ejemplos profeticos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
"Vectores BAC modificados geneticamente por medio de recombinacion para anadir regiones de V polimorficas al genoma de raton"
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Las Figuras 1 a 3 representan metodos de modificacion genetica mediada por recombinacion (veanse las referencias anteriores) que se pueden utilizar para introducir regiones de genes V polimorficas en el ADN genomico. En una realizacion, se inserta un fragmento genomico de la region de la cadena pesada humana en un vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC) por medio de tecnicas convencionales. Preferiblemente, semejante BAC, cuyo tamano puede variar de 20 kb a 200 kb o mas, se puede aislar de bibliotecas de BAC por medio de tecnicas convencionales, incluyendo busquedas de secuencias de las bibliotecas disponibles en el mercado o por medio de hibridacion con colonias bacterianas que contienen BAC para identificar aquellas con un BAC de interes.
Se selecciona un BAC que tiene varios segmentos del gen VH; en la Figura 1, estos se identifican genericamente como VH[a] a VH[z], por ejemplo. Un experto en la tecnica identificara facilmente los fragmentos genomicos adecuados, por ejemplo, un fragmento de aproximadamente 120 kb de VH5-78 a VH1-68 humano que incluye 5 segmentos del gen Vh activos endogenos y 7 pseudogenes VH. Utilizando tecnicas de modificacion genetica mediada por recombinacion, los segmentos del gen VH endogenos pueden ser reemplazados por VH polimorficos o segmentos del gen VL. En este ejemplo, se requieren dos etapas. La primera etapa sustituye el exon codificante de la region V de un segmento del gen VH endogeno VH por un operon de seleccion positiva-negativa, en este ejemplo, un operon que codifica un gen de resistencia a ampicilina (Amp) y una protema ribosomal de sensibilizacion frente a estreptomicina (rpsL). Se pueden seleccionar ciertas cepas de bacterias para determinar la ausencia del gen rpsL mediante la resistencia a la estreptomicina. Los tramos cortos de ADN homologos a las secuencias que flanquean el exon del gen VH endogeno se colocan 5' y 3' con respecto al operon rpsL-Amp. En presencia de factores de recombinacion apropiados por medio de tecnicas modificacion genetica mediada por recombinacion convencionales (veanse las referencias anteriores), la recombinacion entre el fragmento de operon y el BAC dara lugar a la sustitucion del exon del gen VH endogeno por el operon (Figura 1a) que se seleccionan por medio de la resistencia a la ampicilina. La segunda etapa utiliza las mismas secuencias homologas con el fin de reemplazar el operon insertado por un segmento del gen VH polimorfico deseado. En este ejemplo, se inserta un gen VH1-69 humano (Figura 1b y 1c). En particular, se utiliza la variante *02 de VH1-69 [ref IMGT y Figura 5]. Las integraciones satisfactorias del segmento del gen VH polimorfico se seleccionan en las bacterias que se vuelven resistentes a la estreptomicina debido a la perdida del operon, espedficamente la porcion rpsL.
En este ejemplo, el proceso de dos etapas descrito se puede repetir para cada uno de los segmentos del gen VH endogeno o para tantos segmentos de genes endogenos como se desee reemplazar por segmentos del gen V polimorfico (Figura 1d).
Como resulta evidente, cualquier segmento del gen V polimorfico se puede insertar de esta manera y cualquier segmento del gen V endogeno puede actuar como diana, incluyendo los pseudogenes. Los segmentos del gen V en cada uno de los loci de cadena pesada y los dos loci de cadena ligera pueden ser reemplazados utilizando esta tecnica con fragmentos genomicos apropiados disponibles como insertos de BAC.
La Figura 2 representa otro metodo para crear un fragmento genomico que codifique segmentos del gen V polimorficos. En este ejemplo, los segmentos del gen V polimorficos se insertan en una region de ADN genomico desprovista de otros genes, elementos de control u otras funciones. Tales regiones 'desiertas' se pueden seleccionar basandose en el analisis de la secuencia y los fragmentos de ADN correspondientes se clonaron en BAC o se identificaron en bibliotecas BAC existentes. A partir de semejante fragmento genomico, se pueden utilizar tecnicas de modificacion genetica mediada por recombinacion para insertar segmentos del gen V polimorfico a intervalos de, por ejemplo, 10 kb. En este ejemplo, un fragmento genomico de 150 kb podna alojar la introduccion de hasta 15 segmentos del gen V polimorficos. La insercion de los segmentos es un procedimiento de dos etapas. La primera etapa de modificacion genetica mediada por recombinacion inserta el operon rpsL-Amp operon en un sitio espedfico. Las secuencias homologas para un sitio espedfico se utilizan para flanquear el operon. Estos son utilizados por la modificacion genetica mediada por recombinacion para insertar el elemento espedficamente en el fragmento genomico BAC y se seleccionan los eventos positivos por la resistencia a la ampicilina (Figura 2a). La segunda etapa reemplaza el operon del fragmento genomico por un segmento del gen V polimorfico por medio de una etapa de modificacion genetica mediada por recombinacion similar utilizando la misma homologfa de secuencia (Figura 2b). En este ejemplo, se insertan tanto los exones como el elemento promotor de un segmento del gen VH polimorfico, lo que da como resultado la sustitucion del operon rpsL-Amp y por lo tanto la resistencia a la estreptomicina (Figura 2c).
La tecnica de dos etapas para la insercion de segmentos del gen V polimorficos en un sitio espedfico en el fragmento genomico se puede repetir varias veces dando como resultado un fragmento genomico BAC con varios segmentos de genes polimorficos, incluyendo sus elementos promotores. Es evidente que se pueden combinar los ejemplos mostrados en las Figuras 1 y 2, en donde se puede utilizar la tecnica de insercion para anadir segmentos del gen V polimorficos adicionales a un fragmento genomico BAC tal como se representa en la Figura 1. Se podna elegir anadir estos segmentos adicionales a un fragmento genomico IG puesto que semejante fragmento sena mas susceptible de expresion adecuada del gen IG una vez insertado en el genoma de un mairnfero no humano. Se sabe que un fragmento genomico puede tener elementos tales como potenciadores o elementos que contribuyen a determinadas conformaciones de la cromatina, ambos importantes en la expresion del gen de tipo salvaje.
La Figura 3 representa un metodo adicional para crear fragmentos genomicos con segmentos del gen V polimorficos. Este metodo depende de la eficacia con la que los fragmentos de ADN de hebra sencilla cortos
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(alrededor de 50 a 150 bases, preferiblemente 100 bases) se recombinan con una secuencia homologa usando la modificacion genetica mediada por recombinacion (Nat Rev Genet. 2001 Oct; 2(10): 769-79; Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics; Copeland NG, Jenkins NA, Court DL). Las recombinasas utilizadas en la modificacion genetica mediada por recombinacion preferentemente unen y utilizan tales fragmentos de hebra sencilla corta de ADN como un sustrato para iniciar la recombinacion homologa. La eficiencia puede ser tan alta como 10-2, es decir, se puede encontrar un evento positivo en aproximadamente 100 clones recogidos al azar (no seleccionados) resultantes de modificacion genetica mediada por recombinacion. Un evento positivo en este ejemplo se produce cuando uno o mas cambios de nucleotidos individuales introducidos en el gel del fragmento de hebra sencilla se transfieren al inserto de BAC que contiene los segmentos del gen V y que rodean el ADN genomico, produciendose dicho o dichos cambios de nucleotidos en una secuencia homologa en el BAC.
Los segmentos del gen V polimorfico pueden diferir de segmentos del gen V endogenos por solamente 1 o 2, o hasta 10 o 15 cambios de nucleotidos, por ejemplo. Un ejemplo de tales polimorfismos de nucleotidos se representa en la Figura 5. Las regiones de hebra sencilla cortas que abarcan los cambios de nucleotidos polimorficos se pueden sintetizar qmmicamente utilizando tecnicas convencionales. Los fragmentos de ADN de hebra sencilla resultantes se introducen en bacterias y por medio de tecnicas modificacion genetica mediada por recombinacion aproximadamente 1 de cada 100 fragmentos de BAC habran incorporado los nucleotidos polimorficos traves de la incorporacion homologa del fragmento de hebra sencilla (Figura 3a). Los BAC con el cambio de nucleotidos deseado se pueden identificar mediante escrutinio por ejemplo, de varios cientos de clones individuales por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion y secuenciacion, ambos mediante tecnicas convencionales. En el ejemplo, dos cambios de nucleotidos convertiran un segmento del gen VH1-69*01 en un segmento del gen VH1- 69*02 (Figura 3b).
Es evidente que este procedimiento se puede repetir para multiples segmentos del gen V endogenos contenidos en un unico fragmento genomico de BAC. Ademas, las tecnicas descritas en la Figura 2 se pueden utilizar para anadir segmentos del gen V polimorfico adicionales por insercion en regiones entre los segmentos del gen V existentes. Como sena evidente para un experto en la tecnica, se puede utilizar una combinacion de estas tecnicas para crear numerosas variaciones de los segmentos del gen V humano tanto polimorficos como endogenos. Y sena evidente que se pueden combinar varios fragmentos genomicos diferentes con segmentos del gen V polimorficos modificados y segmentos del gen V humano endogenos para crear aun mas variaciones.
Ejemplo 2
"Adicion de regiones V polimorficas al genoma usando SRMCE de BAC modificados"
Los BAC modificados con segmentos del gen V polimorfico creados utilizando los metodos descritos en el Ejemplo 1 se pueden utilizar para alterar el genoma de mairnferos no humanos. Estas alteraciones pueden dar como resultado un locus de Ig intacto en el que la recombinacion de la region de la inmunoglobulina da como resultado combinaciones de VDJ o VJ que incluyen los segmentos del gen V humano. Un ejemplo de como se puede crear semejante animal es mediante la alteracion del genoma, por ejemplo, de las celulas madre embrionarias de raton (ES) utilizando la estrategia descrita en la Figura 4.
Una tecnica para integrar los BAC modificados con segmentos del gen V polimorfico en un genoma es el intercambio de casete mediado por recombinasa secuencial (SRMCE). La tecnica se describe en el documento WO2011004192 (Genome Research Limited)
SRMCE preve un locus modificado con una 'pista de aterrizaje' insertada en un lugar espedfico. Esta insercion puede ser de novo a traves de recombinacion homologa o como consecuencia de una insercion de BAC anterior. En este ejemplo, la pista de aterrizaje esta insertada en el locus IGH de raton entre el "segmento del gen J mas 3' y el segmento del gen C|j y una insercion de BAC anterior v^a tecnicas SRMCE han dado como resultado la adicion de 5 segmentos del gen V humano y 2 pseudogenes de la region V. La pista de aterrizaje tiene elementos como se muestra en la Figura 4 que permitiran la seleccion de la correcta insercion de un segundo fragmento de BAC de orientacion. La especificidad de esta insercion es proporcionada por el intercambio mediado por recombinasa cre entre los sitios lox permisivos. Un sitio lox es permisivo para la recombinacion solo con un sitio lox compatible. En este ejemplo, el sitio loxP solo se recombinara con loxP y lox2272 solo se recombinara con lox2272.Esto proporciona direccionalidad para la insercion del fragmento de BAC como se representa en las Figuras 4b y 4c.
Los clones de celulas ES con inserciones correctas se seleccionan de una reserva de clones sin inserciones o con inserciones no productivas por la resistencia a puromicina. La resistencia a puromicina es el resultado de la yuxtaposicion de un elemento promotor activo, PGK, con la region codificante de puroTK. Las inserciones correctas se verifican mediante tecnicas convencionales, incluyendo PCR de las regiones de union, PCR de elementos internos, transferencia Southern, hibridacion genomica comparativa (CGH), secuenciacion, etc. En el ejemplo, la recombinacion lox2272-lox2272 y loxP-loxP correcta tambien da lugar a dos conjuntos de elementos intactos piggyBac que no existfan antes de la insercion. Un elemento piggyBac intacto se compone de un conjunto de repeticiones invertidas que se representa en la figura por "PB5" y "PB3"'. Un conjunto orientado apropiado de elementos piggyBac es el sustrato de la transposasa piggyBac que puede catalizar la recombinacion entre los elementos, lo que da como resultado la eliminacion de secuencias intermedias, asf como ambos elementos. El ADN
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que queda despues de una transposicion piggyBac transposicion se deja intacto y carece de cualquier remanente del elemento piggyBac. En el ejemplo, se seleccionan clones de celulas ES con una transposicion piggyBac satisfactoria por medio de la perdida del elemento puroTK activo que hace que las celulas sean resistentes al farmaco FIAU (Figura 4c y 4d).
El producto final del metodo SRMCE en este ejemplo es un locus IGH con varios segmentos del gen V polimorficos insertados junto con un conjunto de segmentos del gen VH no modificados endogenos entre las secuencias del genoma de raton en el lado 5' y los segmentos del gen de la region constante IGH de raton en el lado 3'. Los segmentos del gen V polimorfico estan colocados de manera que puedan participar en los eventos de recombinacion asociados con la maduracion de celulas B produciendo segmentos de genes VDJ. Estos segmentos de genes a continuacion se pueden transcribir y empalmar a la region constante de raton. La traduccion de estos transcritos dara como resultado la produccion de una cadena pesada de anticuerpo codificada por el segmento del gen V polimorfico, un segmento del gen DH humano, un segmento del gen JH humano y un segmento del gen de cadena pesada constante de raton.
Como es bien sabido por los expertos en la tecnica, se puede utilizar un clon de celulas ES para crear una lmea de ratones modificados geneticamente mediante inyeccion de dichas celulas en un embrion de blastocisto de raton, la transferencia del embrion inyectado a un receptor adecuado y la cna de la descendencia quimerica resultante. El locus del gen modificado se puede propagar a traves de cna y puede producir homocigotos o heterocigotos dependiendo del cruce genetico.
Resulta evidente a partir de la estructura del locus de IGH proporcionado en este ejemplo y por el conocimiento de los mecanismos implicados en reordenamientos de receptores de celulas B (BCR) y de genes de anticuerpos que se producira un gran conjunto de diferentes combinaciones de segmentos del gen V polimorficos con diversos segmentos de los genes DH y JH y estos pueden contribuir a un gran repertorio de genes de anticuerpos funcionales en una poblacion de celulas B en animales modificados geneticamente. En este ejemplo, se incorporan varios VH1- 69 polimorficos humanos diferentes para proporcionar diversidad VH superhumana. Se sabe que este segmento del gen VH particular, es prevalente en anticuerpos que se unen los agentes patogenos de enfermedades infecciosas (tales como el virus de la influenza) y, por tanto, se esperana que el repertorio de anticuerpos de un raton con la modificacion genetica de este ejemplo produjera anticuerpos con un sesgo a favor de los que se unen a agentes patogenos de enfermedades infecciosas. El repertorio, en otras palabras, tendna un subconjunto mas grande de anticuerpos con afinidades superiores para antfgenos de patogenos. Los ejemplos de tales patogenos incluyen el virus de la influenza, virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) (vease tambien la tabla anterior).
Ejemplo 3
"Alineamiento de 13 alelos VH1-69"
La construccion de un repertorio mas diverso de anticuerpos mediante la incorporacion de segmentos del gen V polimorficos adicionales requiere la disponibilidad de variantes polimorficas de segmentos del gen V. Una fuente de tales variantes incluye bases de datos de secuencias. En este ejemplo, se proporcionan 13 variantes distintas del segmento del gen VH1-69.
Estas secuencias variantes y las comparaciones se han extrafdo de la base de datos "IMmunoGeneTics" IMGT Information System (
www.imgt.com). La Figura 5 es un diagrama del alineamiento de las variantes *02 a *13 con la variante *01. La secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de VH1-69*01 se proporciona en la parte superior de la figura. Cuando las variantes restantes son identicas a la secuencia variante *01, se inserta un guion debajo de la secuencia. Las diferencias de nucleotidos se observaron junto con la variante apropiada y si el cambio en la secuencia da como resultado un cambio de codificacion de una protema, el cambio de aminoacido esta indicado por encima del triplete.
La Figura 5 representa entre 1 y 4 cambios de aminoacidos para cada variante en comparacion con la variante *01. Todos los cambios de aminoacidos se producen en la parte de la protema la cadena pesada que codifica las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Estas regiones son responsables de la especificidad de antfgeno y de la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Es evidente que la provision de CDR polimorficas adicionales en un repertorio de anticuerpos aumentara la probabilidad de que haya un anticuerpo con caractensticas de union superiores para diversos antfgenos. En varios informes, se ha observado que la region variable codificada por VH1-69 de la cadena pesada se encuentra a menudo en los anticuerpos que se unen a los antfgenos del virus de la influenza, el VHC y el VIH-1 (vease la tabla anterior). Por lo tanto la incorporacion de los segmentos de genes V polimorficos de este ejemplo a un modelo de animal transgenico usando los metodos de los Ejemplos 1 y 2 probablemente dana como resultado un repertorio de anticuerpos en dicho animal transgenico con mas anticuerpos que se unen a antfgenos asociados con estos y otros patogenos. Y como se conoce en la tecnica, un repertorio mas grande aumenta la probabilidad de encontrar anticuerpos monoclonales utilizando, por ejemplo, tecnologfa de hibridomas, que se unen con alta afinidad y especificidad a un antfgeno deseado.
Por tanto, esta descripcion describe en estos ejemplos un modelo de raton transgenico que puede ser inmunizado
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con patogeno o otros antigenos. Las celulas B plasmaticas de un raton inmunizado tales se pueden utilizar para elaborar una biblioteca de hibridomas que se puede escrutar para la produccion de anticuerpos que se unen a los antfgenos de patogenos. Esta biblioteca sera superior a las bibliotecas de ratones transgenicos tradicionales para la busqueda de tales anticuerpos, dada la adicion de segmentos de genes polimorficos VH1-69 al locus de IGH en dicho raton transgenico.
Estos ejemplos no son limitantes para los segmentos del gen V polimorfico humano que se pueden elegir ni de los metodos utilizados para introducirlos en un modelo animal. El metodo se puede utilizar para construir un locus transgenico con segmentos D y/o J de inmunoglobulina. Los segmentos V, D, J pueden ser de una pluralidad de fuentes humanas (opcionalmente mas de una poblacion etnica humana).
Ejemplo 4
Variantes del gen JH de IgH humana seleccionadas de la base de datos de 1.000 Genomas
Los datos se presentan para las variantes 5 y 6 de JH2 humano. En las Tablas 10A, 11A y 12A se enumeran muestras de seres humanos de diversas poblaciones en donde el analisis de la secuencia de los autores de la presente invencion ha revelado la presencia de polimorfismos en uno o ambos alelos JH de IgH. Los codigos de poblacion se explican en la Tabla 8 anterior. Los polimorfismos son variantes de nucleotidos de JH2, secuencias de referencia 5 y 6 (SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente; vease mas abajo). Todas las referencias son secuencias tomadas de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org). La referencia JH5 es J5-001 de IgH humana descrita en dicha base de datos. La referencia JH6 es J6-001 de IgH humana descrita en esa base de datos. La referencia JH2 es J2-001 de IgH humana descrita en dicha base de datos.
El nucleotido de referencia y las secuencias de aminoacidos codificadas se muestran en la siguiente pagina. Tambien se proporcionan los alineamientos con secuencias de aminoacidos codificadas, incluyendo los numeros de posicion correspondientes en el cromosoma humano 14.
Las Frecuencias de las Variantes se muestran en las Tablas 10A, 11A y 12A y estas se relacionan con la frecuencia de las variantes en la base de datos de 1000 Genomas (actual version de octubre de 2011).
Las Tablas 10B, 11B y 12B muestran los polimorfismos de nucleotidos no sinonimos en las variantes JH humanas, de una manera organizada por los autores de la presente invencion a partir de la base de datos de 1000 Genomas. Los numeros de posicion correspondientes a las posiciones de nucleotidos en el cromosoma humano 14 se muestran para las posiciones de las variantes (siendo el cromosoma 14 el cromosoma que lleva el locus IgH en los seres humanos). Asf, por ejemplo, la primera entrada en la Tabla 11B es "14:106330027: A/C" que se refiere a una posicion en una secuencia de la variante JH5 en donde la posicion corresponde a la posicion 106.330.027 en el cromosoma humano 14, siendo dicha posicion A (adenina) en la secuencia de referencia. La "C" indica que los autores de la presente invencion observaron una mutacion a citosina en esta posicion en las variantes que se encuentran en la base de datos de 1000 Genomas. Este cambio conduce a un cambio a nivel de aminoacidos de la secuencia codificada (es decir, un cambio "no sinonimo"), en este caso un cambio de una serina (que se encuentra en la referencia) a una alanina en la variante.
Ejemplo 5:
Identificacion de variantes de segmentos de genes de anticuerpos humanos y analisis de poblacion
Las coordenadas de la region codificante genomica para cada gen diana para el analisis de variantes fueron identificadas desde el sitio EnsemblWWW (
www.ensembl.org) utilizando las coordenadas del ensamblaje GRCh.p8 Human Genome (
www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc). Utilizando las coordenadas de localizacion de los genes recogidas, se extrajeron los datos de variantes del sitio ftp publico del Proyecto 1000 Genomas empleando Perl 'Variant Pattern Finder' (VPF -
www.1000genomes.org/variation-pattern-finder-api-documentation).
Los datos extrafdos por VPF se procesaron utilizando el soporte logico para extraer todas las variantes no sinonimas (NSS) con sus llamadas de genotipos asociados. Las llamadas de genotipos se ensamblan para formar haplotipos unicos, que representan grupos de variantes NSS asociados con los grupos de poblacion de 1000 Genomas y la frecuencia de aparicion dentro de esas poblaciones.
Los resultados del analisis dan como resultado tablas, tales como la Tabla 13. El cuerpo principal de la tabla describe cada haplotipo sucesivamente proporcionando un ID unico para ese gen (en el rango de a-z, aa-zz), las frecuencias de la poblacion y la aparicion de individuos y grupos de poblacion unicos; una o mas columnas posteriores describen la llamadas de bases de ADN en cada ubicacion que forman el haplotipo proporcionando tanto la base de la secuencia de referencia como la llamada de la base variante.
La Tabla 13 fue construida de esta manera. La tabla se puede leer de la siguiente manera:
Las primeras cuatro columnas (de izquierda a derecha) consisten en (1) la letra de ID del haplotipo ('ref indica referencia - la llamada de bases de ADN en cada localizacion genomica de la GRCh37 Human Reference Assembly)
(2) la frecuencia acumulativa observada del haplotipo entre las diferentes poblaciones (3) el numero de individuos en los que se observo un haplotipo espedfico (4) el numero de grupos de poblacion unicos a los que pertenecen los individuos identificados (los identificadores de grupo de poblacion reales se muestran como una serie de ID en la columna mas a la derecha para cada haplotipo. Por ejemplo el haplotipo 'a' tiene una serie de ID de la poblacion de 5 '3,4,9,13').
Las poblaciones se numeran como sigue (estando las marcas de poblacion de acuerdo con la nomenclature del Proyecto 1000 Genomas)
1= ASW;
2= CEU;
10 3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
15 8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
20 13=TSI;
14=YRI.
Las columnas siguientes detallan una variante de un solo punto y tienen el siguiente formato (de arriba a abajo) (1) la localizacion genomica humana de la variante (formato [numero de cromosoma]: [lugar], p. ej., '14:106204113'); (2) El identificador para la variante de punto como se define en dbSNP (
www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/); (3) Una o 25 mas filas muestran el cambio de aminoacidos como resultado de la variante para un transcrito espedfico (indicado por el ID del transcrito Ensembl en la columna mas a la derecha para cada fila), el formato es el aminoacido en la secuencia de referencia seguido por '->' y el aminoacido causado por la sustitucion de la variante en la secuencia de referencia (p. ej., 'Gly-> Arg' significa que la secuencia de referencia traducida dana como resultado una glicina en esa posicion, mientras que la sustitucion de la variante identificada dana como resultado la protema traducida que 30 contiene arginina) utilizando los codigos de aminoacidos tres letras de la IUPAC
(
http://pac.iupac.org/publications/pac/pdf/1972/pdf/3104x0639.pdf). Las filas subsiguientes (una por haplotipo) muestran la base de ADN en cada lugar, las bases que concuerdan con la secuencia de referencia se muestran en negro sobre fondo blanco, las bases que vanan con respecto a la referencia se muestran como texto en blanco sobre un fondo negro.
35 La columna mas a la derecha contiene el ID del transcrito Ensembl (p. ej., 'ENST00000390542') para cada uno de los transcritos genicos y se refiere a los cambios de aminoacidos a la izquierda de esta columna. Debido a que los transcritos son de diferentes longitudes cada posicion de la variante puede tener o no un cambio de aminoacido asociado en esa posicion.
Ejemplo 6:
40 Ratones transgenicos. Celulas B. Hibridomas. Anticuerpos y Cadenas pesadas Basados en JH602* humano
Un repertorio de segmentos de genes humanos funcionales (de Vh2-26 A Jh6, vease la base de datos IMGT para la estructura del locus IgH humano;
http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php7section = LocusGenes& repertoire = locus & species = human & group = IGK) fue sectorizado por los autores de la presente invencion para producir dos alelos de cadena pesada transgenica diferentes (denominados S2F y S3F) y los ratones correspondientes. Los 45 alelos transgenicos se expresaron en los ratones y los repertorios de cadena pesada se evaluaron a nivel de transcrito de ARN. El analisis de secuencia en profundidad se llevo a cabo utilizando metodos bioinformaticos para la evaluacion del uso de los genes V, D y JH, incluso en secuencias de dominio variable que tienen una longitud de HCDR3 de al menos 20 aminoacidos. Los segmentos de genes de la region variable de raton endogenos, se inactivaron por inversion (segun el metodo descrito en el documento WO2011004192).
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Secuenciacion de muestras de ADN de donante humano: Identificacion de la variante JH6*02 conservada
Se obtuvieron muestras de ADN de 9 donantes humanos anonimos que dieron su consentimiento tomando muestras de la mejilla.
Las muestras se procesaron y las muestras de ADN se extrajeron siguiendo el protocolo de QIAamp DNA Mini Kit (Num. Cat. 51304, Qiagen).
Las reacciones de PCR se ajustaron para amplificar la region JH6 y los productos de PCR fueron secuenciados (secuencia de PCR Oligos: Directo. 5'-AGGCCAGCAGAGGGTTCCATG-3' (SEQ ID NO: 444), Inv. 5'- GGCTCCCAGATCCTCAAGGCAC-3' (SEQ ID NO: 445)).
El analisis de secuencias se llevo a cabo mediante la comparacion con la secuencia de referencia de JH6 de la base de datos de IMGT anotada (
http://www.imgt.org/), y esto identifico que los 9 genomas de donantes conteman la variante JH6*02 humana, estando esta variante en el estado homocigoto en 7 de los 9 donantes. Los autores de la presente invencion tambien consultaron las secuencias genomicas disponibles publicamente para Jim Watson y Craig Venter en Ensembl human genome database [
http://www.ensembl.org/]. Estas tambien conteman la variante JH6*02 humana. Esto confirmo a los autores de la presente invencion que JH6*02 humano es una variante comun, conservada en los seres humanos, y por lo tanto un buen candidato para la construccion de un locus de IgH transgenico segun la invencion
Identificacion de BAC con la secuencia de ADN humano adecuado
Se identifico una serie de clones de cromosomas artificiales bacterianos humanos (BAC) a partir de busquedas en las bases de datos humanas Ensemble (
http://www.ensembl.org/index.html) o UCSC (
http://genome.ucsc.edu/) basandose en el nombre del gen (IGH) o la ubicacion (cromosoma 14: 10026574- 107346185). Se seleccionaron siete clones BAC RP11 humanos (vease un extracto de la base de datos UCSC en la Figura 10, estando los BAC identificados dentro de un drculo), se identificaron los BAC RP11-1065N8 que llevaban JH6*02 humano. En total, se identificaron los siguientes BAC como fuentes de ADN del locus IgH humano: RP11-1065N8, RP11-659B19, RP11- 141I7, RP-112H5, RP11-101G24, RP11-12F16 y RP11-47P23.
Con un enfoque similar, se pueden seleccionar los diferentes clones de BAC (p. ej., diferentes ID de clon RP11 o diferentes fuentes de RP11) o BAC modificados geneticamente para la insercion en el locus de IGH raton para proporcionar diferentes conjuntos de repertorios humanos en el raton transgenico.
Construccion de loci de IgH transgenicos
La insercion de segmentos de genes pesados humanos de un 1er BAC de IGH (RP11-1065N8) en el locus de IGH de celulas ES de raton AB2.1 (Baylor College of Medicine) se llevo a cabo para crear un alelo de cadena pesada indicado como el alelo S1. La secuencia humana insertada corresponde a la secuencia del cromosoma humano 14 desde la posicion 106494908 a la posicion 106328951 y comprende segmentos de genes pesados funcionales Vh2- 5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D4-11, D5-12, D6-13, D1-14, D2-15, D3-16, D4-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D3-22, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, D7-27, Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 y Jh6 (en orden 5' a 3'), en donde el JH6 fue elegido para que fuera la variante JH6*02 humana. La insercion se realizo entre las posiciones 114666435 y 114666436 en el cromosoma 12 de raton, que esta aguas arriba de la region C|j de raton. Los segmentos de los genes Vh, D y Jh de raton se mantuvieron en el locus, inmediatamente aguas arriba (en posicion 5' con respecto a) del ADN de la cadena pesada humana insertado.
Se construyo un segundo alelo, S2 en el que se insertaron mas segmentos del gen VH funcionales humanos aguas arriba (5') del Vh mas 5' insertado en el alelo S1 mediante la insercion secuencial de ADN humano a partir de un segundo BAC (BAC2). La secuencia humana insertada desde BAC2 corresponde a la secuencia del cromosoma humano 14 desde la posicion 106601551 a la posicion 106494909 y comprende segmentos de genes de cadena pesada funcionales Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7. Los segmentos de los genes Vh, D y Jh de raton se mantuvieron en el locus, inmediatamente aguas arriba (5' con respecto a) del ADN de la cadena pesada humana insertado. En una etapa posterior, estos se invirtieron para inactivarlos, produciendo de este modo ratones S2F en los que solo los segmentos de genes de la region variable de la cadena pesada humana estaban activos.
Se construyo un tercer alelo, S3 en el que se insertaron los segmentos del gen Vh funcional humano aguas arriba (5') del Vh mas 5' insertado en el alelo S2 por la insercion secuencial de ADN humano de un tercer BAC (BAC3). La secuencia insertada corresponde a la secuencia del cromosoma humano 14 desde la posicion 106759988 a la posicion 106609301, y comprende segmentos de genes de cadena pesada funcionales, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, y Vh3-15. Los segmentos de los genes Vh, D y Jh de raton se mantuvieron en el locus, inmediatamente aguas arriba (5' con respecto a) del ADN de la cadena pesada humana insertado. En una etapa posterior, estos se invirtieron para inactivarlos, produciendo de este modo ratones S3F en los que solo los segmentos de genes de la region variable de la cadena pesada humana estaban activos.
Los ratones que portaban la insercion de S2F o de S3F en un locus de cadena pesada endogeno fueron generados
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
a partir de las celulas ES, utilizando procedimientos convencionales. El otro locus de cadena pesada endogeno se inactivo en los ratones mediante la insercion de una secuencia de inactivacion que comprendfa neoR en el intron JH- Cp de raton (para producir el alelo "HA").
Procedimiento de inmunizacion
Los ratones transgenicos del genotipo S2F o S3F se cebaron con protemas recombinantes de 20 - 40 |jg obtenidas comercialmente o producidas en la empresa con el Antigeno 1 (OVA (Sigma A7641); el Antigeno 2 (un antigeno de patogeno de enfermedad infecciosa humana) y el Antigeno 3 (un antigeno humano) por v^a ip en Coadyuvante Completo de Freund (Sigma F 5881) y 10 jg/CpG animal (oligo CpG; Invivogen, San Diego, California, USA) y luego se reforzaron dos veces a intervalos de aproximadamente dos semanas con aproximadamente la mitad de la cantidad de antfgeno en Coadyuvante Incompleto de Freund (Sigma F 5506) y 10 jg/CpG animal. Se administraron refuerzos finales dos semanas mas tarde iv sin ningun coadyuvante y conteman 5-10 jg de protema en PBS.
Procedimiento de fusion de hibridoma
Los bazos se tomaron 3 dfas despues del refuerzo final y los esplenocitos se trataron con CpG (concentracion final 25 Am) y se dejaron hasta el dfa siguiente. Las celulas se fusionaron despues con celulas de mieloma SP0/2 Ag 14 (Cultivos HPA Num. Cat. 85072401) utilizando un aparato de electrofusion BTX ECM2001. Se dejo que las celulas fusionadas se recuperaran durante 20 minutos y luego se sembraron en un matraz T75 hasta la manana siguiente.
A continuacion, las celulas se centrifugaron y se cultivaron en placa mediante dilucion seriada en placas de cultivo de 96 pocillos y se dejaron durante aproximadamente 10 dfas antes del escrutinio. El medio se cambio 1-3 veces durante este periodo.
Escrutinio
Los sobrenadantes de cultivo de los pocillos de hibridoma anteriores se escrutaron utilizando el analisis de fluorescencia homogenea resuelto con el tiempo (htrf) utilizando IgG de raton marcada con criptato de europio (anti- Ig de raton criptato de europio Cisbio) y un antfgeno diana etiquetado con biotina con un donante conjugado con estreptavidina disponible comercialmente (Cisbio; D2 conjugado con estreptavidina) o por medio de ELISA de 384 pocillos espedfico de IgG. Los pocillos positivos identificados por htrf fueron modificados a escala en placas de 24 pocillos o se sometieron a un contra escrutinio inmediatamente utilizando un metodo ELISA de deteccion espedfica de IgG. Los positivos identificados por medio de escrutinio primario se ampliaron inmediatamente en placas de 24 pocillos. Una vez que los cultivos se expandieron a la fase de 24 pocillos y se alcanzo la confluencia, los sobrenadantes se sometieron a ensayo de nuevo utilizando htrf o ELISA espedfico de IgG para confirmar la union al antfgeno diana. El sobrenadante de tales cultivos confirmados se analizo tambien a continuacion por medio de resonancia de plasmon superficial utilizando un aparato BioRad Proteon XPR36. Para esto, se capturo el anticuerpo expresado en los cultivos de hibridoma en un chip biosensor GLM (BioRad 176-512) que tema un anti-IgG de raton (GE Healthcare BR-1008-38) covalentemente acoplado a la superficie del chip biosensor. A continuacion se utilizo el antfgeno como analito y se hizo pasar sobre la superficie con el anticuerpo de hibridoma capturado. Para el Antfgeno 2 y el Antfgeno 3, se utilizaron tfpicamente concentraciones de 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM y 1 nM, para el Antfgeno 1, se utilizaron tfpicamente concentraciones de 1028 nM, 256 nM, 64 nM, 16 nM y 4 nM, las curvas de union fueron doblemente referenciadas mediante una inyeccion 0 nM (es decir, tampon solo). La cinetica y las afinidades generales se determinaron utilizando el modelo 1:1 inherente al soporte logico del analisis BioRad Proteon XPR36.
Se utilizo cualquiera de los clones con actividad de union confirmada para la preparacion de ARN total, seguido de PCR para recuperar las secuencias de la region variable de la cadena pesada. Se llevo a cabo 5'-RACE convencional para analizar los transcritos de ARN de los loci de cadena pesada transgenicos en los ratones S2F y S3F. Ademas, se llevo a cabo el analisis de secuencias de profundidad de casi 2.000 secuencias producidas por los ratones.
Analisis bioinformatico
Las secuencias para el analisis se obtuvieron de dos metodos diferentes:
• La primera a partir del ARN extrafdo del bazo: se sintetizo la primera hebra de ADNc utilizando un oligo basado en la region Cmu del locus de IGH de raton como molde para la PCR. La PCR se realizo utilizando este oligo con un cebador de anclaje oligo dT. A continuacion, el producto de la PCR se clono en un vector pDrive (Qiagen) y a continuacion se secuencio. •
• La segunda a partir de hibridomas generados a traves de electro-fusion: Se extrajo el ARN total a partir de lmeas de hibridoma de interes utilizando metodos Trizol convencionales y se congelo a -80°C durante el almacenamiento a largo plazo. El ADNc se genero a partir de 100 ng de ARN total utilizando la transcriptasa inversa SuperScript III convencional y un cebador inverso espedfico del gen que se urna a todos los isotipos de IgG de raton para la cadena pesada y un cebador para la region constante kappa de raton para la amplificacion de la cadena ligera. A continuacion se utilizaron 2-3 jl de ADNc como molde en una reaccion PCR utilizando ADN polimerasa Pfu y un
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10
15
20
25
30
35
40
panel de cebadores directos degenerados que se reasocian con la secuencia Ifder del dominio variable de inmunoglobulina humana, as^ como un cebador inverso pan-IgG de raton. Se agotaron los productos de PCR de un gel de agarosa al 1% y las bandas de aproximadamente 350-450 pares de bases se extrajeron y se purificaron. El ADN se secuencio.
Las secuencias del primer metodo pueden ser o bien de IgM de ratones no sometidos a tratamiento previo o bien de IgG de los ratones inmunizados. Las muestras del segundo metodo son todas de IgG de ratones inmunizados, y espedficas para el antigeno de la inmunizacion. Se analizaron casi 2000 secuencias.
Las secuencias se obtuvieron como un par de lecturas de directas e inversas. Estas fueron recortadas primero para eliminar las llamadas de la base de baja calidad de los extremos de las lecturas (recortados de ambos extremos hasta que una ventana de 19 nucleotidos tuviera una puntuacion de calidad media de 25 o mas). Las lecturas se combinaron tomando el complemento inverso de la lectura inversa, y alineandolo frente a la lectura directa. La puntuacion del alineamiento fue de 5 para un emparejamiento, -4 para un emparejamiento erroneo, una penalizacion de hueco abierto de 10 y una penalizacion por extension de hueco de 1. A continuacion se produjo una secuencia consenso avanzando a traves del alineamiento y comparando las bases. Cuando hubo un desacuerdo se utilizo la base con el valor mas alto de calidad de la secuenciacion.
A continuacion se utilizo el programa BLAST© (Basic Local Alignment Search Tool) (Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., & Madden T.L. (2008) "BLAST©: architecture and applications". BMC Bioinformatics 10:421
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003500) 'blastn' para encontrar los segmentos de J y V de la lmea germinal utilizados en cada secuencia. Se utilizo un tamano de palabra de 30 para el emparejamiento con V, y de 15 para el emparejamiento con J. Se construyo la base de datos de busquedas a partir de la secuenciacion NGS de los BAC que fueron utilizados para generar el Kymouse.
Si una secuencia coincidfa tanto con el segmento de V como con el de J, la secuencia entre los dos se comparaba a continuacion con una base de datos de segmentos de D de la lmea germinal en el raton utilizando 'BLASTN' con un tamano de palabra de 4 y las opciones 'blastn-corto" y "sin huecos". Esto se utilizo para asignar un segmento de D, si era posible. La CDR3 se identifico mediante la busqueda de la secuencia conservada "TATTACTGT" en el segmento de V, y "CTGGGG" en el segmento de J. Si no se encontraban estos motivos, se permitfan hasta 4 emparejamientos erroneos. Se utilizo la definicion de IMGT de CDR3, por lo que la longitud de CDR3 se calcula desde despues de "TGT" hasta antes de "TGG" en J. Las secuencias con una union fuera del marco (aquellas que no tienen una longitud de nucleotidos de CDR3 divisible por 3) o que conteman un codon de parada ("TAA", "TAG" o "TGA") fueron excluidas.
La identidad del emparejamiento de los segmentos de V, J y D, asf como la longitud de la CDR3 de esta asignacion se guardaron en forma de tabla para el analisis aguas abajo. La razon de IGHJ6*02 utilizada aumento de los ratones no sometidos a tratamiento previo a los inmunizados, ademas de enriquecerse en el sub-poblacion de secuencias con una HCDR3 larga (que se define por consistir en 20 o mas aminoacidos):
Todas HCDR3>20 % HCDR3> 20
JH6*02%
Recuento total JH6*02% Recuento total
No sometido a tratamiento previo
22,31% 1340 91,11% 45 3,36%
Inmunizado
37,50% 256 66,67% 9 3,52%
Hibridoma
36,13% 119 63,64% 11 9,24%
Esto demuestra que el segmento del gen JH6*02 se selecciona por medio de inmunizacion, ya que la proporcion del uso de JH6*02 aumenta despues de la inmunizacion. JH6*02 tambien se utiliza en la mayona de los anticuerpos con una dimension HCDR3 larga, que es deseable para las dianas que son unidas espedficamente por anticuerpos con una dimension de HCDR3 larga.
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C
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G
G
G G A C
C C C
G G T
C C C T T
G G G A C
C A G T
6 G C
AGAGGAGTC Alineamiento JHS:
(Irnea superior SEQ ID NO: 1, Linea media=SEQ ID NO: 5, Lrnea inferior=SEQ ID NO:6)
s i
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§
si
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1 8 §
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G01CCCT1 G CCAGGGAA C

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GGAGCAGT&G CCT □ G T C A C C L V T

C A C A G G A GTC Gt GTCGT C A G V 5 &
lOG.330.tti2
IgH J6-0O1
A
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A
C
C
T G C A G A C C c C G T T T C C C T
G
G
T G C c A G T G G c A G A G G A G T
C
Alineamiento JH6:
(linea superior = SEQ ID NO: 2, Linea media = SEQ ID NO: 7, Linea inferior = SEQ ID NO: 8)
I
9
8
3
a
£
H
s'
9
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8
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oo
A
T G A T G A T Q A T G A T G A T Q T A C C T □ c A G A C c C C G 7 T 7
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A
G
G A
G T C
106,339.43*
G G G ft C C A C G G T C A C CG TCT C C T C A G GTTVTV S S
SEQ ID HO: 3 (JH2 Referenda)
A
T G A C C A T G A A G C T A G A G A C
C
C
C
G G C A C C G T G G G A C C A G T
LO
6
A C A G A G G A G T C CO
Alineamiento JH2:
(linea superior = SEQ ID NO; 3, Linea media = SEQ ID NO: 9, Linea inferior = SEQ ID NO: 10)
imagen1
1
ul
a
8
s'
8 1
A
T G A C c A T G A A G c T A G A G A C c c c G G c A C C G T G G G A C C A G T G A C A a A G a A G T C
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A C T G G T A C T T C G A T C T C T 0 0 a G c c 6 T G C C A C C c T G G T C A C 7 G T C T C c T C A G
Y W Y F O L w (3 H G T L V T V S S
106,331,455
TABLAS
En las tablas, la notacion se ilustra mediante el siguiente ejemplo
IGLV1-40
V140*02 X53936 g9>c|c10>g,L4>V|
La variante polimorfa IGV lambda V1-40*02 tiene el Num. de Acceso GenBank X53936 y en comparacion con la variante *01, la variante V1-40*02 tiene mutaciones en las posiciones 9, 10 y 4. Por ejemplo, en la posicion 9, una 5 "C" aparece en lugar de una "G". que esta presente en la variante *01. El "|" es simplemente un separador de
notacion, y no indica ninguna mutacion. Por ejemplo, la notacion "G282 I" indica que no hay cambio (es decir, la posicion 282 es una g). "Del #." significa que el residuo en esa posicion esta ausente.
Tabla 1: Variantes polimorfas V de IgH humana
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran explfatamente en la presente memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
subgrupo
IGHV IGHV Numero de acceso Descripcion de las mutaciones
1
IGHV1-2 IGHV1-2*01 X07448 SEQ ID NO: 11
IGHV1-2*02 X62106 |c163>t,R55>W| |g233>t,t234>g,S78>M| t299>c,V100>A|
IGHV1-2*03 X92208
c44>t,P15>L| d63>t,R55>W | |g233>t,t234>g,S78>M|t299>c,V100>A 1
IGHV1-2*04 Z12310 | cl63>t,R55>W | a223>t,R75>W | g233>t,t234>j >AI
IGHV1-3 IGHV1-3*01 X62109 SEQ ID NO: 12 c6 |t12 |t167,I56 |a208,K70 |a291 |c296,T99 |
IGHV1-3*02 X62107 c6>t |t12>g | t167>g,I56>S |a208>g,K70>E |a291>g| c296>t,T99>M|
IGHV1-8 IGHV1-8*01 M99637 SEQ ID NO: 13
IGHV1- 18 IGHV1- 18*01 M99641 g282 |
IGHV1- 18*02 X60503 g282>a|
IGHV1- 24 IGHV1- 24*01 M99642 SEQ ID NO: 14
IGHV1- 45 IGHV1- 45*01 X92209 SEQ ID NO: 15 g139 ,G47 |t237 |
IGHV1- 45*02 AB019438 |t237>c|
IGHV1- 45*03 Z17391 g139>a,G47>R|t237>c|
IGHV1- 46 IGHV1- 46*01 X92343 SEQ ID NO: 16 c92 ,T31 |g315 |
IGHV1- 46*02 J00240 c92>a,T31>N|
IGHV1- 46*03 L06612 |g315>t|
IGHV1- 58 £ 0 OO -r- * -L O < M29809 SEQ ID NO: 17 g115 ,V39 |
£ ° OO -r- * -b o < N> AB019438 g115>a,V39>M|
IGHV1- 69 IGHV1- 69*01 L22582 SEQ ID NO:18
IGHV1-
69*04
IGHV1-
69*05
IGHV1-
69*06
IGHV1-
69*07
IGHV1-
69*08
IGHV1-
69*09
Z27506
X92340
M83132
X67905
L22583
Z29978
Z14309
Z14307
g6>c | gl8>a | | glOO>a,A34>T | gl63>a,G55>R 11178>
| |g244>a,E82>K|
|g291>t,E97>D|
g6>c|
44>a,E82>K|
| g!63>a,G55>R | t!78>c, F60>L | cl8
g6>c| |g238>a,A80>T|
|g244>a,E82>K|
|g163>a,G55>R|
g6>c | gl8>a | | glOO>a,A34>T | gl63>a,G55>R | tl78>
|g244>a,E82>K|
| gl63>aJG55>R|tl78>c,F60>L|cl85>1
a,E82>K|
IGHV1-
69*10
Z14300
g6>c|
,E82>K|
Ig54>a|
]tl78>c,F60>L| c!85>t,
2
IGHVI-c
IGHV1-f
IGHV2-5
IGHV1-
69*11
IGHV1-
69*12
IGHV1-
69*13
IGHV1-c*01
IGHV1-f*01
IGHV1-f*02
IGHV2-5*01
IGHV2-5*02
IGHV2-5*03
IGHV2-5*04
Z14296
Z14301
Z14214(st)
Z18904
Z12305
Z29977
X62111
Z14072
X93619
L21963
IGHV2-5*05
IGHV2-5*06
L21964
L21966
g6>c| |g163>a,G55>R|t178>c,F60>L|
g6>c
g6>c| |g54>a|
SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 20 c201
c201>t|
SEQ ID NO: 21
|a175>g,N59>D|
|a175>g,N59>D| |c234>t|
|c299>g,A100>G|c314>t,A105>V|a317>g,c318>g,H
106>R|
|a175>g,N59>D|a202>g,S68>G|
|g39>a| |a175>g,N59>D|a202>g,S68>G| |c299>g,A100>G |c314>t,A105>V|
IGHV2-
26
IGHV2-
70
IGHV2-5*09
IGHV2-5*10
IGHV2-
26*01
IGHV2-
70*01
IGHV2-
70*02
IGHV2-
70*03
IGHV2-
70*04
IGHV2-
70*05
IGHV2-
70*06
L21972
X69690
M99648
L21969
X92241
X92238
Z12330
Z27502
X92239
X92243
a4>g,l2>V 1 a31>g,Tll>A ] | g60>a | gl03>a,V35>M | g
,G40>S|al75>g,N59>D|
imagen2
imagen3
SEQ ID NO: 22
SEQ ID NO: 23
imagen4
|a297>g| |a301>g,c302>t,T101>V|
| gl4>a,R5>K |
|tl64>g,L55>R |al97>t,Y66>F| 02>t,T101>V |
|tl0
|a29'
|gl4>a,R5>K|
| t!64>g;L55>R | al97>t,Y66>F |
ltlO
imagen5
jgl4>ajR5>K| |tl0
| tl64>g,L55>R | al97>t,Y66>F | t210>c | |
gJc302>tJT101>V|
imagen6
IGHV3-7
IGHV3-9
IGH3-11
IGHV2-
70*09
IGHV2-
70*10
IGHV2-
70*11
IGHV2-
70*12
IGHV2-
70*13
IGHV3-7*01
IGHV3-7*02
IGHV3-9*01
IGHV3-
11*01
IGHV3-
11*02
IGHV3-
11*03
X92245
L21962
L21965
L21967
L21970
AB019437
M99649
X92288
M99651
M99652
M15496
X92287
X92217
imagen7
| g4>a,V2>l | gl4>a,R5>K|g31>a,All>T] a60>g 1167
|g216>c,K72>h
G | | g303>a | | c314>t,A105>V |
imagen8
imagen9
| g4>a,V2>l | gl4>a,R5>K | g31>a,All>T | a60>g | | g317a,g318>c, R106> H i t320>gJ I107>R j
|c309>t|
SEQ ID NO: 24
g144>a|
SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 26
imagen10
9A10>insAt| |g32>del#,Gll>del#|g47>del#,G16 |a206>del#,D69>del#| |c243>g,C
>del#J99>del#|g301>t,g303>a,V101>L|t304>c,a305 8>c,c309>t,Y103>T|t312>c|c314>aJA105>E|
|gl3>t,V5>L[
Y | tl88>c,l63>T | tl96>a;Y66>N |
| gl78>a,G60>S |g240>a|
SEQ ID NO: 27
g9 ,Q3 |t52 ,S18 |g77 ,S26 |g95 ,532 |tl65 |tl67 R75 |
3
IGHV3-
15
IGHV3-
16
IGHV3-
19
IGHV3-
20
IGHV3-
21
IGHV3-
15*01
IGHV3-
15*02
IGHV3-
15*03
IGHV3-
15*04
IGHV3-
15*05
IGHV3-
15*06
IGHV3-
15*07
IGHV3-
15*08
IGHV3-
16*01
IGHV3-
16*02
IGHV3-
19*01
IGHV3-
20*01
IGHV3-
21*01
M99653
U29582
X92216
M99654
M99408
M99402
M99403
M99404
M99406
M99400
M99655
AB019440
M99656
M99657
AB019439
M99658
g9>t,Q3>H | t52>g,S18>A | | g95>a,S32>N | tl6!
g|
|c77>g,S26>C| |g224>a,R75>Q|
SEQ ID NO: 28
imagen11
|g32>c,G11>A|
g23>c,g24>c,G8>A | g32>c,Gll>A | a40>c,K14>Q| | al78>g,T6D>A|gl81>a,D61>N |
>V|
|a169>g,K57>E|
|c279>t|
|t159>c| |g196>a,D66>N|
|a81>t| |g119>a,S40>N|t159>c|
g23>c ,G8>A | |a40>c,K14>Q| t89>g,F30>C
R55>C j | al78>g,T60>A|gl81>a,D61>N | |
>t,N92>l | | a297>g | a320>g |
SEQ ID NO: 29 a6 |a9 |
a6>g|a9>g|
SEQ ID NO: 30
SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 32 g9 |
g9>a|
IGHV3-
30
IGHV3-
23*03
IGHV3-
23*04
IGHV3-
23*05
IGHV3-
30*01
IGHV3-
30*02
IGHV3-
30*03
IGHV3-
30*04
IGHV3-
30*05
IGHV3-
30*06
IGHV3-
30*07
IGHV3-
30*08
IGHV3-
30*11
M35415
U29481
AJ879486
AY757302
M83134
L26401
M99663
L06615
M77323
L06617
L06614
M62737
M77300
M77326
M77331
cl64 ,A55 |al69 ,gl70 ,S57 |gl72 ,1:174 ,G58 |al7 |c201 |C20B ,AG8 |c237 |c243 |
|c203>g,A68>G|c237>a|
cl64>t,A55>V | al69>t,gl70>a,S57>Y | gl72>a,tl74>c,C | gl81>a,G61>S | c201>t | |c243>t|
t13>g|
d154>t, g155>a, S>Y|g157>a, t159>a, G>S|g166>a, G>5|
imagen12
SEQ ID NO: 34
| a49>g, R17>G | c75>g | ] cl01>g,tl02>c
>g | gl63>t,V55>F | tl69>c,cl70>g,al71>g,S57>R | c20] |g317>a,R106>K|
imagen13
|a150>g|
| cl01>g,tl02>c,A34>G |
|a293>g,D98>G |
|c75>g| |c101>c,t102>c,A34>G|
|t288>c|
g18>c,E6>D| |g80>c,G27>A|
|a150>g| |a229>g,T77>A|
| g202>a,A68>T|
|c75>g|
IGHV3-
30-3
IGHV3-
33
IGHV3-
35
IGHV3-
30*13
IGHV3-
30*14
IGHV3-
30*15
IGHV3-
30*16
IGHV3-
30*17
IGHV3-
30*18
IGHV3-
30*19
IGHV3-30-
3*01
IGHV3-30-
3*02
IGHV3-
33*01
IGHV3-
33*02
IGHV3-
33*03
IGHV3-
33*04
IGHV3-
33*05
IGHV3-
35*01
IGHV3-
38*01
M77338
M77339
M77324
M77327
M77328
M77329
X92214
L06616
X92283
M77302
AB019439
M99665
M77305
M77335
M77334
M99666
M99669
AB019439
imagen14
| cl01>g,tl02>C,A34>G | | c257>g,T86>R |
|a150>g| |g267>t|
|a275>g,N92>S|
|t135>c|
|a138>g|
imagen15
|c75>g| |c101>g,t102>g,A34>G| |a150>g|
SEQ ID NO: 35 c75 |gA17 ,R106 |
c75>g|g317>a,R106>K|
SEQ ID NO: 36
g6 jglSO |gl70 ,gl71 ,W57 |tl77 |t212 ,V71 |t2^ ,Y88 |g317 ,R106 |
g6>a| |t212>c,V71>A| |a251>c,K84>T|a263>t,Y88>F|
|t246>c| |g317>a,R106>K|
|g150>a| |t177>c|
|g170>c,g171>a,W57>S|
SEQ ID NO: 37
SEQ ID NO: 38 c302,A101 |
c302>t,A101>V |
IGHV3-
43
M99672
SEQ ID NO: 39
t32 ,V11 |a100 ,T34 |g138 |t172 ,W58 |
Z18901
t32>g,V11>G|a100>g,T34>A|g138>a|t172>g,W58>
G|
IGHV3-
47
IGHV3-
47*02
IGHV3-
47*03
Z18900
SEQ ID NO: 40
c58 |c101 ,A34 |t149 ,L50 |t267 ,L89 |t270 ,H90 |t310 |
AB019438
c58>a|c101>t,A34>V|t149>c,L50>P|
|t270>a,H90>Q|
M99674
c58>a | d01>t,A34>V | tl49>c,L50>P | t267>del#,L89>d
10>g|
IGHV3-
48
IGHV3-
48*01
IGHV3-
48*02
IGHV3-
48*03
M99675
SEQ ID NO: 41
g48 |c96 |al00 ,gl01 ,cl02 ,S34 |al78 ,S60 |t246
AB019438
|c287>a,A96>D|
U03893
g48>a | c96>t | alO0>g,glOl>aJcl02>a,S34>E |al78>g, Ig303>t |
IGHV3-
49
IGHV3-
49*01
IGHV3-
49*02
IGHV3-
49*03
IGHV3-
49*04
IGHV3-
49*05
M99676
SEQ ID NO: 42
g50 ,R17 |t93 |g94 ,D32 | glOO ,A34 |tl24 ,F42 |
2 I
M99401
g50>c, R17>P | t93>g | g94>t, D32>Y | gl00>c,A34>P | tl2 8>A[g245>a,G82>D|
AB019438
|a202>g,T68>A|g245>a,G82>D|
AM940220
|t124>g,F42>V|a202>g,T68>A|g245>a,G82>D|
AM940221
|a202>g,T68>A|g245>a,G82>D|
IGHV3-
53
IGHV3-
53*01
M99679
t19 ,S7 |g133 ,A45 |c210 |g315 |a318 |
Z12342
SEQ ID NO: 43 t19>a,S7>T|
J03617
|g133>c,A45>P|c210>t|g315>t|a318>g|
IGHV3-
64
gl ,E1 [g26 ,G9 |g70 ,A24 |tl98 |t201 |a205 ,N6! ,L89 |g2/4 ,g275 ,G92 |c279 |t296 ,M99 jc314 ,A
IGHV3-
64*03
IGHV3-
64*04
IGHV3-
64*05
IGHV3- IGHV3-
66 66*01
IGHV3-
72
IGHV3-
73
IGHV3-
74
IGHV3-
66*02
IGHV3-
66*03
IGHV3-
66*04
IGHV3-
72*01
IGHV3-
72*02
IGHV3-
73*01
IGHV3-
73*02
IGHV3-
74*01
IGHV3-d
IGHV3-d*01
AB019437
|g26>a,G9>E| |a205>g,N69>D|
M77298
| g70>t,A24>S | tl98>c | t201>c | a205>g,N6« 67>c, L89>V | g274>a ,G92>S | c279>t | t296>C, M 99>
7>a,R106>K|
M77299
gl>c,El>Q| | g70>t,A24>S [ tl98>c |t201>c | a205
,t267>g, | g274>a,g275>a,G92>N | |t296>cJM99:
M77301
| g70>t,A24>S | tl98>c | t201>c j a205>g,N6! , L89>V | g274>a ,G92>S | c279>t | t296>c,M99>T | (
a,R106>K|
X92218
Z27504
AB019437
X70208
X92206
Z29979
X70197
AB019437
L33851
Z17392
J00239
Z18898
SEQ ID NO: 45
g24 |g37 ,V13 |a81 |g175 ,G59 |a223 |c288 |g319 | |a223>c|c288>t|
g24>a|g37>a,V13>I|a81>g|g175>t,G59>C|a223>c|c
288>t|
|g319>c|
SEQ ID NO: 46 t186 |
t186>c|
SEQ ID NO: 47 t21 |
t21>c|
SEQ ID NO: 48 c21 |g197 ,c198 ,S66 |
c21>t|
|g197>c,c198>g,S66>T|
SEQ ID NO: 49
IGHV3-h
IGHV4-
28
IGHV4-
30-2
IGHV3-h*01
IGHV4-4*02
IGHV4-4*03
IGHV4-4*04
IGHV4-4*05
IGHV4-4*06
IGHV4-4*07
IGHV4-
28*01
IGHV4-
28*02
IGHV4-
28*03
IGHV4-
28*04
IGHV4-
28*05
IGHV4-30-
2*01
IGHV4-30-
2*02
AJ879484
X92232
X92252
X92253
X92254
Z75355
X62112
X05714
M83133
X92233
X56358
X92260
L10089
M95122
SEQ ID NO: 50
imagen16
|g308>a,C103>Y|
imagen17
c20>t,S7>L|
|g308>a,C103>Y|
imagen18
| c46>t,P16>S | g50>a,G17>E|g70>a,A24>T | t99>c,S33>Y | al00>t, N34>Y | tl20>c | g 124>a,V42>l J cl P46>A | gl47>a | gl63>c,a 164>g,al65>t,E55>R | cl72>a T | g207>c | a234>g,l78>M | a245>c,K82>T | g308>a,C102 | a234>g,l78>M | a245>c,K82>T | g308>a, C103;
SEQ ID NO: 52 g48 |g49 ,c51 ,D17 |c185 ,T62 |g297 |c299 ,A100 |a319 |
g48>a|g49>c,c51>g,D17>Q|c185>t,T62>I|
|a319>g|
g297>c|c299>g,A100>G|
|c185>t,T62>I|
SEQ ID NO: 53
tl63 ,al64 ,cl65 ,Y55 ]d72 ,H58 |a237 |g245 ,RJ 0 |c315 |g319 |
|C288>t| |c315>g|
IGHV4-
30-4
IGHV4-
31
IGHV4-30-
4*01
IGHV4-30-
4*02
IGHV4-30-
4*03
IGHV4-30-
4*04
IGHV4-30-
4*05
IGHV4-30-
4*06
IGHV4-
31*01
IGHV4-
31*02
IGHV4-
31*03
IGHV4-
31*04
IGHV4-
31*05
IGHV4-
31*06
IGHV4-
31*07
IGHV4-
31*08
X92229
Z75351
Z14238
Z14239
X92274
X92275
Z75353
Z75360
L10098
M99683
Z14237
M95120
M95121
X92270
X92271
X92272
X92273
1163>a, a 164>g,c 165>t,Y55>S | cl72>t,H58>Y |a237>c | ] g291>a | c300>t | c315>g | g319>c |
|g245>c,R82>T| |g291>a| |c315>g|
SEQ ID NO: 54
gl8 ,E6 |a48 |c49 ,g51 ,Q17 |cl34 ,P45 |al66 ,15
1 I .
|a48>g|c49>g,g51>c,Q17>D| |c288>a|
|a291>g|
g18>c,E6>D| |a166>t,156>F|
|t228>c|
|c134>a,P45>H|
SEQ ID NO: 55
imagen19
|c69>t| |t224>g,L75>R|
|t224>g,L75>R|
a8>g,Q3>R| |t224>g,L75>R|
imagen20
|g100>a,G34>S| |t224>g,L75>R|
|c84>a| |t224>g,L75>R|
imagen21
|t224>g,L75>R| | ,c245>a,T82>K|t249>c|t285>c|
IGHV4-
34
IGHV4-
34*01
IGHV4-
34*02
IGHV4-
34*03
IGHV4-
34*04
IGHV4-
34*05
IGHV4-
34*06
IGHV4-
34*07
IGHV4-
34*08
IGHV4-
34*09
IGHV4-
34*10
IGHV4-
34*11
Z14235
AB019439
M99684
X92255
X92236
X92237
X92256
X92258
M95113
Z14241
Z14242
X05716
X56591
|g37>t,V13>L| c, ,T82>P|t249>c|
|al64>g,V55>Cjt22/
|t304>g,Yl
SEQ ID NO: 56
a 12 |gl5 |cl6 ,Q6 |g20 ,W7 |g25 ,A9 |t37 ,L13 |g48 |g49 ,E17 |t85 ,S29 |tSS ,F30 | alls ,S40 |cl29 |cl37 ,P46 |gl47 |gl63 ,al65 ,E55 |al69 ,al70 ,tl71 ,N57 |cl72 ,H58 |alSO |tl99 ,Y67 |g207 |g226 ,t2 27 ,c228 ,W6 |a234 ,178 |c249 |c263 ,S88 |g270 ,K90 |a274 ,S92 |c2 85 |t300 |a308 ,Y103 |
|g15>a|
|t300>c|
imagen22
|a274>g,S92>G| |t300>c|
,tl71>c
|t300>c|
|t85>a,S29>T|
al2>g | | cl6>g,Q6>E | g20>c, W7>S | g25>c,A9>P | t37>g,L13>V | g48>a | g49
>c,E17>Q| | gl47>a |
| c228>t | |c249>t |
|c285>t|t300>c|
al2>g I I cl6>g,Q6>E | g20>c,W7>S | g25>c,A9>P | t37>g,L13>V |
| gl47>a|
[ g226>a, ,V76>l|a234>g,l78>M| | c263>a,S88>Y |
| t30O>c|
| t88>g,F30>V | 1C129
>g| | gl63>t,al65>t,E55>Y |al69>t ,N57>Y|cl72>t,H58>Y|
al80>g|tl99>a,Y67>N|g207>c| t227>c ,V76>A| |g
270>c, K90>N | | t300>c | a308>g,Y103>C |
| a170>t ,N57>I|
imagen23
subgrupo
IGHV IGHV Numero de acceso Descripcion de las mutaciones
IGHV4- 34*13 Z75356 |g207>c|
IGHV4- 39 IGHV4- 39*01 AB019439 SEQ ID NO: 57 a2 ,Q1 |t56 ,L19 |c237 |g258 ,Q86 |t262 ,S88 |a291 |t300 |c319 |
IGHV4- 39*02 X05715 |g258>c,Q86>H| |c319>g|
IGHV4- 39*03 X92259 |t300>c|
IGHV4- 39*04 X92297 |a291>g|
IGHV4- 39*05 M95116 |t56>c,L19>P|
IGHV4- 39*06 Z14236 a2>g,Q1>R| |c237>a| |t262>c,S88>P|a291>g|t300>c|
IGHV4- 39*07 AM940222 |c237>a| |a291>g|t300>c| c319>g
IGHV4- 55 IGHV4- 55*01 M99685 SEQ ID NO: 58 C44 ,P15 |c237 |a251 ,K84 |c255 ,N85 |a263 ,Y88 |c288 |c290 ,A97 |g291 |t319 |
IGHV4- 55*02 X92223 |c237>a|
IGHV4- 55*03 X92263 |c237>a| |a263>c,Y88>S|
IGHV4- 55*04 X92265 c44>t,P15>L|c237>a|
IGHV4- 55*05 X92266 c44>t,P15>L|
IGHV4- 55*06 X92267 |c255>g,N85>K| |c288>t|
IGHV4- 55*07 X92268 |a251>g,K84>R| |a263>c,Y88>S| |g291>a|
IGHV4- 55*08 X92234 |c237>a| |t319>g|
IGHV4- 55*09 X92235 |a263>c,Y88>S| |c290>t,A97>V| |t319>a|
IGHV4- 59 IGHV4- 59*01 AB019438 SEQ ID NO: 59 gl2 |gl6 ,E6 |c20 ,57 |c25 ,P9 |g37 |g51 ,E17 |a70 ,T24 |t76 ,c77 , 526 |a88 ,130 |cl35 |cl36 ,al38 ,P46 |al47 |tl63 ,al64 ,tl65 ,Y55 | tl72 ,al73 ,cl74 ,Y58 |a!96 ,N66 |c207 |c228 |a234 ,178 |a237 |c24 9 |g258 |c285 |t288 |g291 |c300 |g319 a320 |
IGHV4- 59*02 M29812 |a88>g,I30>V|
IGHV4- 59*03 M95114 |g258>a|
IGHV4- 59*04 M95117 | ,cl74>t |al96>t,N66>Y|c207>g| | a234>g,l78>M | | t288>c|g291>a|c300>t
imagen24
100
subgrupo
IGHV IGHV Numero de acceso Descripcion de las mutaciones
IGHV5- 51*05
Z27449 |g139>a,G47>R|
IGHV5-a
IGHV5-a*01 X92227 SEQ ID NO: 63 t21 |c148 |c225 ,H75 |c288 ,A96 |
IGHV5-a*02
X92279 |c148>t| |c288>del#,A96>del#|
IGHV5-a*03
X56375 t21>c|
IGHV5-a*04
X56376 |c225>g,H75>Q|
6
IGHV6-1 IGHV6-1*01 X92224/J04 097 SEQ ID NO: 64
IGHV6-1*02
Z14223 a27>g|
7
IGHV7- 4-1 IGHV7-4- 1*01 L10057 SEQ ID NO: 65
IGHV7-4- 1*02
X62110 t274>a,C92>S|
IGHV7-4- 1*03
X92290 t274>a,C92>S|g278>c,c279>g,S93>T|
IGHV7- 81
IGHV7- 81*01 AB019437 SEQ ID NO: 66
Tabla 2: Variantes polimorfas D de IgH humana
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran explfcitamente en la presente memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
Subgrupo IGHD
Nombre IGHD Nombre variante Numero Acceso Genbank Secuencia
1
IGHD1-1 IGHD1- 1*01 X97051 SEQ ID NO: 67
IGHD1-7
IGHD1- 7*01 X13972 SEQ ID NO: 68
IGHD1- 14
IGHD1- 14*01 X13972 SEQ ID NO: 69
IGHD1- 20
IGHD1- 20*01 X97051 SEQ ID NO: 70
IGHD1- 26
IGHD1- 26*01 X97051 SEQ ID NO: 71
2
IGHD2-2 IGHD2- 2*01 J00232 SEQ ID NO: 72 AGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATGCC
IGHD2- 2*02
X97051 G>A
IGHD2- 2*03
M35648 A>T
IGHD2-8
IGHD2- 8*01 X13972 SEQ ID NO: 73 AGGATATTGTACTAATGGTGTATGCTATACC
IGHD2- 8*02
J00233 AA>GG
IGHD2- 15
IGHD2- 15*01 J00234 SEQ ID NO: 74
IGHD2- 21
IGHD2- 21*01 J00235 SEQ ID NO: 75 AGCATATTGTGGTGGTGATTGCTATTCC
IGHD2- 21*02
X97051 !>C
3
IGHD3-3 IGHD3- 3*01 X13972 SEQ ID NO: 76 GTATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTATACC
IGHD3- 3*02
X93618 CG>GC
IGHD3-9
IGHD3- 9*01 X13972 SEQ ID NO: 77
IGHD3- 10
IGHD3- 10*01 X13972 SEQ ID NO: 78 GTATTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAAC
IGHD3- 10*02
X93615 G>[OMITTED]
IGHD3- 16
IGHD3- 16*01 X93614 SEQ ID NO: 79 GTATTATGATTACGTTTGGGGGAGTTAT GCTTATACC
IGHD3- 16*02
X97051 GC>CG
IGHD3- 22
IGHD3- 22*01 X93616 SEQ ID NO: 80
4
IGHD4-4 IGHD4- 4*01 X13972 SEQ ID NO: 81
Subgrupo IGHD
Nombre IGHD Nombre variante Numero Acceso Genbank Secuencia
IGHD4- 11
D4-11*01 X13972 SEQ ID NO: 82
IGHD4- 17
IGHD4- 17*01 X97051 SEQ ID NO: 83
IGHD4- 23
IGHD4- 23*01 X97051 SEQ ID NO: 84
5
IGHD5-5 IGHD5- 5*01 X13972 SEQ ID NO: 85
IGHD5- 12
IGHD5- 12*01 X13972 SEQ ID NO: 86
IGHD5- 18
IGHD5- 18*01 X97051<A<< B> SEQ ID NO: 87
IGHD5- 24
IGHD5- 24*01 X97051 SEQ ID NO: 88
6
IGHD6-6 IGHD6- 6*01 X13972 SEQ ID NO: 89
IGHD6- 13
IGHD6- 13*01 X13972 SEQ ID NO: 90
IGHD6- 19
IGHD6- 19*01 X97051 SEQ ID NO: 91
IGHD6- 25
IGHD6- 25*01 X97051 SEQ ID NO: 92
7
IGHD7- 27 IGHD7- 27*01 J00256 SEQ ID NO: 93
Los nucleotidos subrayados en la variante *01 son posiciones que son diferentes en otras variantes, p. ej., GC> CG para IGHD3-16*02 indica que GC en la variante *01 esta en lugar del CG en la variante 02*. Todas las demas posiciones son identicas a entre 01*y la otra variante. Se utiliza una notacion similar en otras tablas de mas abajo 5 para indicar cambios entre variantes de segmentos de genes.
Tabla 3: Variantes polimorfas de J de IgH humana
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran expKcitamente en la presente 10 memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
nombre IGHV
Nombre variante Numero GenBank Secuencia
IGHJ1
J1*01 J00256 SEQ ID NO: 94
IGHJ2
J2*01 J00256 SEQ ID NO: 95
SEQ ID NO: 96
IGHJ3
J3*01 J00256 TGATGCTTTTGATGTCTGG GGC CAA GGG ACA ATG GTCACC GTCTCTTCAG
nombre IGHV
Nombre variante Numero GenBank Secuencia
J3*02 X86355 G>A
SEQ ID NO: 97
J4*01 J00256 AC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGA ACC CTG GTC ACC GTCTCCTCAG
IGHJ4
AA> AG
J4*02 X86355
CA> GC
GA> GG
J4*03 M25625
SEQ ID NO: 98
IGHJ5
J5*01 J00256 AC MC TGG TTC GAC ICC TGG GGC CM GGA ACC CTG GTC ACC GTCTCCTCAG
T> C
A>G
J5*02 X86355
SEQ 10 NO: 99
J6*01 J00256 AT TAC TAC TAC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGG CM GGG ACC ACG GTC ACC GTCTCCTCAG .
IGHJ6
GG> GC
J6*02 X86355
J6*03 X86356 GGT> TAC
GG> GC
nombre IGHV
Nombre variante Numero GenBank Secuencia
California> AA
GG> GC
CA> AA
J6*04 AJ8794887
Tabla 4: Variantes polimorfas de Vk de Ig humana
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran explfcitamente en la presente 5 memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
1
IGKV1-5 IGKV1- 5*01 Z00001 SEQ ID NO: 100 GAC ATC CAG AT6 ACC CAG TCT CCT TCC ACC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATCACTTGC CGG GCC AGT CAG AGT ATT AGT AGC TGG ;...............TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GAT GCC TCC.......................AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA ... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAT GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCT CC
IGKV1- 5*02
M23851 AC>AT
IGKV1- 5*03
X72813 GAT>AAG GCC>GCG
TCC>TCT TTG>TTA
IGKV1-6
IGKV1- 6*01 M64858 SEQ ID NO: 7.01
IGKV1-8
IGKV1- 8*01 Z00014 SEQ ID NO: 102
IGKV1D-8
IGKV1D- 8*01 Z00008 SEQ ID NO: 103
IGKV1-9
IGKV1- 9*01 Z00013 SEQ ID NO: 104
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
IGKV1-12
o < V01577 SEQ ID NO: 105 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCTTCC GTG TCT GCATCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT ATT AGC AGCTGG ...................TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT GCA TCC......................AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAT TGT CAA CAG GCT AAC AGT TTC CCT CC
IGKV1D-12
IGKV1D- 12*01 X17263 TCC>TCT ACC>ACT
IGKV1- 12/IGKV1D- 12 (1)
IGKV1- 12*02/1D- 12*02 V01576 CC>TC
IGKV1-13
IGKV1- 13*01 Z00010 SEQ ID NO: 106 GCC ATC CAG TTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG.TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT AGC AGT GCT ...................TTA GCC TGA TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GAT GCC TCC......................AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CAA CAG TTT AAT MI TAC CCT CA
IGKV1- 13*02
Z00006 TGA>TGG AAT>AGT
IGKV1D-13
IGKV1D- 13*01 X17262 TGA>TGG
IGKV1-16
IGKV1- 16*01 J00248 SEQ ID NO: 107 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGC ATT AGC AAT TAT ...................TTA GCC TGG TTT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC.......................AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA .....TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCT CC
IGKV1- 16*02
FM164406 AGG>AAG
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
IGKV1D-16
IGKV1D- 16*01 K01323 SEQ ID NO: 108 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCTCCATCC TCACTG TCT GCATCTGTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG A£I CAG GGT ATT AGC AGCTGG ...................TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC......................AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GATTTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCT CC
IGKV1D- 16*02
V00558 AGT>AGG
IGKV1-17
IGKV1- 17*01 X72808 SEQ ID NO: 109 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT AGA AAT GAT ...................TTA GGC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CGC CTG ATC TAT GCT GCA TCC.......................AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CTA CAG CAT AAT AGT TAC CCT CC
IGKV1- 17*02
D88255 AGC> AAC
IGKV1D-17
IGKV1D- 17*01 X63392 SEQ ID NO: 110 AAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCT GCC ATG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGG CAG GGC ATT AGC AAT TAT ...................TTA GCC TGG TTT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GTC CCT AAG CAC CTG ATC TAT GCT GCA TCC.......................AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA... TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CTA CAG CAT AAT AGT TAC CCT CC '
IGKV1D- 17*02
FM164407 AAC>GAC CAC>CGC
IGKV1-27
IGKV1- 27*01 X63398 SEQ ID NO: 111
IGKV1-33
IGKV1- 33*01 M64856 SEQ ID NO: 112
IGKV1D-33
IGKV1D- 33*01 M64855 SEQ ID NO: 113
IGKV1-37
IGKV1- 37*01 X59316 SEQ ID NO: 114
IGKV1D-37
IGKV1D- 37*01 X71893 SEQ ID NO: 115
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
IGKV1-39
W o o < X59315 SEQ ID NO:116 G AC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT ...................TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT GCA TCC.......................AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA,.. TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA.....TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CC
IGKV1- 39*02
X59318 TCC>TTC TAC>TAT CAA CAG AGT> CAG TGT GGT ACC>ACA
IGKV1D-39
IGKV1D- 39*01 X59312 SEQ ID NO: 117
IGKV1D-42
IGKV1D- 42*01 X72816 SEQ ID NO: 118
IGKV1D-43
IGKV1D- 43*01 X72817 SEQ ID NO: 119
2
IGKV2-24 N? G) * 5 o < hO X12684 SEQ ID NO: 120
IGKV2D-24
IGKV2D- 24*01 X63401 SEQ ID NO: 121
IGKV2-28
JO G) O < hO X63397 SEQ ID NO: 122
IGKV2D-28
IGKV2D- 28*01 X12691 SEQ ID NO: 123
IGKV2-29
JO Q O < hO X63396 SEQ ID NO: 124 GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCT CTG TCC GTC ACC CCT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AAG TCT AGT CAG AGC CTC CTG CAT AGT GAT GGA AAG ACC TAT... TTG TAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG
TCT CCA CAG CTC CTG ATC TAT GAA GTT TCC......................AGC CGG TTC TCT GGA GTG CCA ... GAT AGG TTC AGT GGC AGC GGG.....TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC CGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TAC TGA ATG CAA GGT ATA CAC CTT CCT CC
IGKV2- 29*02
U41645 CTG> CTA TGA> TGC
IGKV2- 29*03
AJ783437 TGA> TGC
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
IGKV2D-29
IGKV2D- 29*01 M31952 SEQ ID NO: 125 GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCT CTG TCC GTC ACC CCT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AAG TCT AGT CAG AGC CTC CTG CAT AGT GAT GGA AAG ACC TAT TTG TAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG CCT CCA CAG CTC CTG ATC TAT GAA GTT TCC.......................AAC CGG TTC TCT GGA GTG CCA ... GAT AGG TTC AGT GGC AGC GGG.....TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC CGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TAC TGC ATG CAA AGT ATA CAG CTT CCT CC
IGKV2D- 29*02
U41644 CCT>TCT
IGKV2-30
IGKV2- 30*01 X63403 SEQ ID NO: 126 GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC GTC ACC CTT GGA CAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT CAA AGC CTC GTA TAC AGT GAT GGA AAC ACC TAC... TTG AAT TGG TTT CAG CAG AGG CCA GGC CAA TCT CCA AGG CGC CTA ATT TAT AAG GTT TCT.......................AAC CGG GAC TCT GGG GTC CCA... GAC AGA TTC AGC GGC AGT GGG.....TCA GGC ACT GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGG GTT TAT TAC TGC ATG CAA GGT ACA CAC TGG CCT CC
IGKV2- 30*02
FM164408 TAC>CAC
IGKV2D-30
IGKV2D- 30*01 X63402 SEQ ID NO: 127
IGKV2-40
£ G) * 5 o < hO X59314 SEQ ID NO: 128 GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCC GTC ACC CCT GGA GAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT CAG AGC CTC TTG GAT AGT GAT GAT GGA AAC ACC TAT TTG GAC TGG 1 AC CTG CAG AAG CCA GGG CAG TCT CCA CAG CTC CTG ATC TAT ACG CTT TCC.......................TAT CGG GCC TCT GGA GTC CCA ... GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG.....TCA GGC ACT GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGA GTT TAT TAC TGC ATG CAA CGT ATA GAG TFT CCT TC
IGKV2- 40*02
X59317 GAC TGG>GAT TGT GGC>GAC
IGKV2D-40
IGKV2D- 40*01 X59311 SEQ ID NO: 129
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
3
IGKV3-7 IGKV3- 7*01 X02725 SEQ ID NO: 130 GAA ATT GTA ATG ACA CAG TCT CCA CCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GTC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC................TTA ACC TGG TAT CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCG CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC......................ACC AGG GCC ACT . AGC ATC CCA... GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG.....TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG GAT CAT AAC TTA CCT CC
IGKV3- 7*02
X72812 ACC>TCC TAT>TAC GGC>GGG GCG>GCT AGC>GGC ACA>AGA CAT>TAT
IGKV3- 7*03
K02769 SEQ ID NO: 131 GAA ATT GTA ATG ACA CAG TCT CCA CCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GTC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC................TTA ACC TGG TAT CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCG CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC......................ACC AGG GCC ACT AGC ATC CCA... GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG.....TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG GAT CAT AAC TTA CCT CC
IGKV3- 7*04
FM164409 CAT>TAT
IGKV3D-7
IGKV3D- 7*01 X72820 SEQ ID NO: 132
IGKV3-11
IGKV3- 11*01 X01668 SEQ ID NO: 133 GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC TAC ...................TTA GCC TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GAT GCA TCC......................AAC AGG GCC ACT GGC ATC CCA ... GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG.....TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CC
IGKV3- 11*02
K02768 ACA>AGA
IGKV3D-11
IGKV3D- 11*01 X17264 SEQ ID NO:134
Sub- grupo IGKV
Nombre IGKV Nombre variante Numero acceso Secuencia
IGKV3-15
IGKV3- 15*01 M23090 SEQ ID NO: 135
IGKV3D-15
IGKV3D- 15*01 X72815 SEQ ID NO:136 GAA ATA GTG ATG ACG CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT GTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AAC ...................TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC......................ACC AGG GCC ACT GGC ATC CCA... GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG.....TCT GGG ACA GAG TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG TCT GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG TAT AAT AAC TGG CCT CC
IGKV3D- 15*02
M23091 ACG>ATG TGG>TGA
IGKV3-20
IGKV3- 20*01 X12686 SEQ ID NO:137 GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC................TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC.......................AGC AGG GCC ACT GGC ATC CCA... GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG.....TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AG A CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAG TAT GGT AGC TCA CCT CC
IGKV3- 20*01, Tou- kv325
X56593 ACC>CCC CTG>TGT TCT> CTT TTG> TGT TCT> CTC
IGKV3- 20*02
L37729 ACG>ACA GGC>GCC
GAC>GCA
IGKV3D-20
IGKV3D- 20*01 X12687 SEQ ID NO: 138
4
IGKV4-1 IGKV4- 1*01 Z00023 SEQ ID NO: 139
5
IGKV5 2 IGKV5- 2*01 X02485 SEQ ID NO: 140
6
IGKV6-21 w Q o < CT> X63399 SEQ ID NO:141
IGKV6D-21
IGKV6D- 21*01 X12683 SEQ ID NO: 142
IGKV6D-41
IGKV6D- 41*01 M27751 (3) SEQ ID NO: 143
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran explfcitamente en la presente memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
Subgrupo IGLV
Nombre gen IGLV Nombre variante IGLV Numero acceso Secuencias y Descripcion de mutaciones
1
IGLV1-36 V1-3601 Z73653 SEQ ID NO: 144
IGLV1-40 V1-40*01 M94116 SEQ ID NO: 145
V1-40*02 X53936 g9>c|c10>g,L4>V|
V1-40*03 Z22192 g9>c|c10>g,L4>V|a253>g,T85>A|
IGLV1-41 V-41*01 M94118 SEQ ID NO: 146
V-41*02 D87010 g295>t,E99>*|c332>t,P111>L|
IGLV1-44 V1-44*01 Z73654 SEQ ID NO: 147
IGLV1-47 V1-47*01 Z73663 SEQ ID NO: 148
V1-47*02 D87016 g168>t,R56>S|
IGLV1-50 V1-50*01 M94112 SEQ ID NO: 149
IGLV1-51 V1-51*01 Z73661 SEQ ID NO: 150
V1-51*02 CD ,^r ,^r o CO LU A CD LO Q <0 A CO CD O O A CM CD -i—»__
2
IGLV2-8 V2-8*01 X97462 SEQ ID NO: 151
V2-8*02 L27695 g37>a,G13>R|
V2-8*03 Y12418 |c230>t,S77>F|
IGLV2-11 V2-11*01 Z73657 SEQ ID NO: 152
V2-11*02 CO CT> CM CM N i i CD O) V CO
V2-11*03 Y12415 |g132>a|
IGLV2-14 V2-14*01 Z73664 SEQ ID NO: 153
V2-14*02 L27822 c87>t | t93>e I g94>a,G32>S | tl03>c,al04>t,Y35>L | | tl70>g,V57>G | tl98>g,N66>K |
V2-14*03 Y12412 |g132>a|g168>t,E56>D|
V2-14*04 Y12413 |g168>t,E56>D|
IGLV2-18 V2-18*01 Z73642 SEQ ID NO: 154
V2-18*02 L27697 |t317>c,L106>S|
V2-18*03 L27694 |t272>c,I91>T|t317>c,L106>S|
V2-18*04 L27692 t227>c,F76>S|t249>c| |t317>c,L106>S|
IGLV2-23 V2-23*01 X14616 SEQ ID NO: 155
V2-23*02 Z73665 g170>t,G57>V|a339>c,L113>F|
V2-23*03 D86994 |a339>c,L113>F|
IGLV2-33 V2-33*01 Z73643 SEQ ID NO: 156
V2-33*02 L27823 a3>g|
V2-33*03 L27691 |t96>c|a256>g,M86>V|
3
IGLV3-1 V3-1*01 X57826 SEQ ID NO: 157
Subgrupo IGLV
Nombre gen IGLV Nombre variante IGLV Numero acceso Secuencias y Descripcion de mutaciones
IGLV3-9 V3-9*01 X97473 a52 ,T18 |a82 ,I28 |a88 ,g89 ,S30 |a95 ,N32 |g173 ,S58 |
V3-9*02 X74288 a52>g,T18>A| a82>c,l28>L] a88>t,g89>a,S30>Y| a95>g ,N32>5 | gl73>a,558>N |
V3-9*03 X51754 a52>g,T18>A| a82>c,l28>L| a88>t,g89>a,S30>Y| a95>del#,N32>del# | gl73>a,S58>N |
IGLV3-10 V3-10*01 X97464 SEQ ID NO: 158
V3-10*02 L29166 gl66>a, E56>K| c207>a | t270>c | c299>a,A100>D | a319>g,T107>A | a325> t,g326>a,S109>Y|
IGLV3-12 V3-12*01 Z73658 SEQ ID NO: 159
V3-12*02 D86998 a259>g,T87>A|
IGLV3-16 V3-16*01 X97471 SEQ ID NO: 160
IGLV3-19 V3-19*01 X56178 SEQ ID NO: 161
IGLV3-21 V3-21*01 X71966 SEQ ID NO: 162
V3-21*02 D87007 a27>g|a49>c,K17>Q|a160>g,I54>V|t166>g,Y56>D|c324>t|
V3-21*03 M94115 a27>g| |a160>g,I54>V|t166>g,Y56>D|c324>t|
IGLV3-22 V3-22*01 Z73666 SEQ ID NO: 163
V3-22*02 X71967 c53>a,T18>K | g88>a,E30>K | gl40>del#,G47>del# | cl48>tJcl49>g,tl50> a, P50>* 1150A 151>insAtatac#,50A51>insAY# | g3 22>a, D108>N | c330>t |
IGLV3-25 V3-25*01 X97474 SEQ ID NO: 164
V3-25*02 D86994 t14>c,g15>a,M5>T|
V3-25*03 L29165 t14>c,g15>a,M5>T|t294>c|
IGLV3-27 V3-27*01 D86994 SEQ ID NO: 165
IGLV3-32 V3-32*01 Z73645 SEQ ID NO: 166
4
IGLV4-3 V4-3*01 X57828 SEQ ID NO: 167
IGLV4-60 V4-60*01 Z73667 SEQ ID NO: 168
V4-60*02 D87000 a288>t,L96>F|
V4-60*03 AF073885 t287>c,a288>t,L96>S|
IGLV4-69 V4-69*01 Z73648 SEQ ID NO: 169
V4-69*02 U03868 c198>t|
5
IGLV5-37 V5-37*01 Z73672 SEQ ID NO: 170
IGLV5-39 V5-39*01 Z73668 t81 ,g135>t|
V5-39*02 AF216776 t81>c,g135>t|
IGLV5-45 V5-45*01 Z73670 SEQ ID NO: 171
V5-45*02 Z73671 g22>t,A8>S|g75>a|
V5-45*03 D86999 g22>t,A8>S|
IGLV5-48 V5-48*01 Z73649 SEQ ID NO: 172
IGLV5-52 V5-52*01 Z73669 SEQ ID NO: 173
Subgrupo IGLV
Nombre gen IGLV Nombre variante IGLV Numero acceso Secuencias y Descripcion de mutaciones
6
IGLV6-57 V6-57*01 Z73673 SEQ ID NO: 174
7
IGLV7-43 V7-43*01 X14614 SEQ ID NO: 175
IGLV7-46
V7-46*01 Z73674 SEQ ID NO: 176
V7-46*02
D86999 |c275>t,S92>L|
V7-46*03
Z22210 c271>del#|L91>del#|
8
IGLV8-61 V8-61*01 Z73650 SEQ ID NO: 177
V8-61*02
U03637 |c223>t,R75>C|
V8-61*03
AF266511 g210>c|
9
IGLV9-49 V9-49*01 Z73675 SEQ ID NO: 178
V9-49*02
Z73675 |g291>a|
V9-49*03
U03869 g153>a|
10
IGLV10- 54 V10-54*01 Z73676 SEQ ID NO: 179
V10-54*02
D86996 |a86>t,N29>l| |a228>c,L76>F|g320>t,W107>L|
V10-54*03
S70116 g33>c| |t125>c,g126>t,L42>P|c127>g,Q43>E|
11
IGLV11 - 55 V11-55*01 D86996 SEQ ID NO: 180
Tabla 6: Variantes polimorfas de Jk de IgH humana
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran explfcitamente en la presente 5 memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
Nombre gen IGKJ
Nombre Variante Numero acceso Secuencia
IGKJ1
IGKJ1*01 J00242 SEQ ID NO: 181
IGKJ2
IGKJ2*01 J00242 SEQ ID NO: 182 TG TAC ACT TTT GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA C
IGKJ2*02 Z70260 #c TAC>TGC
IGKJ2*03 U95246 #c ACT >AGT
IGKJ2*04 L40735 #c TAC>TGC
ACT>AGT
IGKJ3
IGKJ3*01 J00242 SEQ ID NO: 183
IGKJ4
IGKJ4*01 J00242 SEQ ID NO: 184 G CTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA C
IGKJ4*02 AF103571 #c ACT>ACG
IGKJ5
IGKJ5*01 J00242 SEQ ID NO: 185
Tabla 7: Variantes polimorfas de JA de IgH humana
Todas las secuencias variantes que aparecen en Genbank con los Numeros de Acceso enumerados se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia como si se expusieran explfcitamente en la presente 10 memoria y para su posible inclusion en cualquiera de las reivindicaciones de la presente memoria
114
Nombre gen IGLJ
Nombre variante Numero acceso Secuencia
IGLJ1
J1*01 X04457 SEQ ID NO: 186
IGLJ2
J2*01 M15641 SEQ ID NO: 187
IGU3
J3*01 M15642 SEQ ID NO: 188 T GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA G
J3*02
D87023(1) GTG> TGG GTA> GTG
IGLJ4
J4*01 X51755 SEQ ID NO:189
IGLJ5
J5*01 X51755 SEQ ID NO: 190 C TGG GTG TTT GGT GAG GGG ACC GAG CTG ACC GTC CTA G
J5*02
D87017 ACC>ACG
IGU6
J6*01 M18338 SEQ ID NO: 191
IGU7
J7*01 X51755 SEQ ID NO: 192 T GCT GTG TTC GGA GGA GGC ACC CAG CTG ACC GTCCTC G
J7*02
D87017 GTC>GCC
Tabla 8: Poblaciones humanas del Proyecto 1000 Genomas
Mas abajo se resume la poblacion etnica de origen de las muestras que secuencia el Proyecto 1000 Genomas
Poblacion
Ascendencia europea
Residentes de Utah (CEPH) con ascendencia del Norte y el Oeste de Europa (CEU) Toscanos en Italia (TSI)
Britanicos de Inglaterra y Escocia (GBR)
Finlandes de Finlandia (FIN)
Poblaciones ibericas de Espana (IBS)
Ascendencia del Este de Asia
Chinos Han en Beijing, China (CHB)
Japoneses en Toyko, Japon (JPT)
Chinos Han del Sur (CHS)
Chinos Dai de Xishuangbanna (CDX)
Kinh de la Ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam (KHV)
Chinos de Denver, Colorado (CHD) (someter a prueba solo 3)
Ascendencia de Africa Occidental
Yoruba de Ibadan, Nigeria (YRI)
Luhya de Webuye, Kenya (LWK)
Gambianos de Western Division, Gambia (GWD)
Poblacion
Ascendencia de Asia Oriental
Chinos Han en Beijing, China (CHB)
Japones en Tokio, Japon (JPT)
Han China del Sur (CHS)
Dai en Xishuangbanna Chino (CDX)
Kinh en Ho Chi Minh, Vietnam (KHV)
China en Denver, Colorado (CHD) (piloto 3 solamente)
Ascendencia de Africa Occidental
Yoruba en Ibadan, Nigeria (YRI)
Luhya en Webuye, Kenia (LWK)
Gambia en la Division Occidental, Gambia (DAS)
Malawi en Blantyre, Malawi (MAB)
Poblacion
Poblacion de Africa Occidental (TBD)
Americas
Ascendencia africana del Suroeste de Estados Unidos (ASW) Afroamericanos de Jackson, MS (AJM)
Afrocaribenos de Barbados (ACB)
Ascendencia Mejicana de Los Angeles, CA (MXL) Puertorriqueno de Puerto Rico (PUR)
Colombianos de Medellin, Colombia (CLM)
Peruanos de Lima, Peru (PEL)
ascendencia del Sur de Asia
Ahom en el estado de Assam, India Kayadtha en Calcuta, India Reddy de Hyderabad, India Maratha de Bombay, India Punjabi de Lahore, Pakistan
Tabla 9: Uso de genes de inmunoglobulina en las respuestas de anticuerpos humanos a patogenos de
enfermedades infecciosas
GENES V KAPPA • Gen de la lmea germinal Vk II A2 + JK3 • Gen familia Vk II + JK4 • identico en 94% al gen de la lmea germinal A27 (Humkv325) • un miembro de la familia de genes
Polisacarido tipo b de Haemophilus influenzae (Hib PS) Haemophilus influenzae 1. Lonberg, Nat Biotech 2005; [PBMC humanas]
2. Adderson et al., J Clin Invest 1992; [PBL humanos]
VkI; kI-15A (KL012) GENES V LAMBDA • Cuatro miembros de la familia VA VII que son identicos en 96-98%
3. Chung et al., J Immunol 1993
4. Nadel et al., J Immunol 1998
entre s^ • Miembros de la familia VA II (homologos en 82,89 y 91% al ge VA2.1) + segmentos VHIII altamente homologos al gen de la lmea germinal 9.1 • VaVII 4A • Todos con JA homologo a JA2 y JA3 de la lmea germinal GENES VH
5. Feeney et al., J Clin Invest 1996
6. Lucas et al., Infect Immun 1994; [PBL Humanos]
7. Adderson et al., J Clin Invest 1993; [PBL Humanos]
• VH identico en 96% al segmento del gen de la lmea germinal VH DP77 (V3-21) • LSG6.1, LSG12.1, VhIII VH26, VhIII 9.1 COMBINACIONES DE VH y VL • VhIII 9.1+ VaVII 4A • VhIII 9.1 + VaII 2.1 • VhIII 9.1 + VkII A2 • VhIII VH26 + VaII 2.1
8. Granoff et al., J Clin Invest 1993; [PBL humanos]
9. Azmi et al., Infect Immun 1994; [celulas tonsila humana]
• VhIII 9.1; VHIII H11; VhIII VH26 • kI 15A • VA2.1
• Capsula polisacaridos de E coli K1 • Polisacarido Meningococico B; Acido poli [a(2^8)-N- acetilneurammico • E coli K1 • Neisseria meningitidis Grupo B 9. Azmi et al., Infect Immun 1994
• Miembro de la familia VHIII o VHIV • Miembro VAI o VA3 • VH26 + Dk1 + JH6 con IGLV1S2 + JA2 • VH4.18 • VH2-1 (VH3) + region D Dxp'1 + JH5 con VA3 cML70 + JA3
• Glicoprotema de 120- kD de HSV • Glicoprotemas de 116, 105, 64 kD de VZV • Virus familia Herpes • Virus Herpes simplex (HSV); HSV-1; HSV-2 • Virus Varicella zoster (VZV) 10. Huang et al., J Clin Invest 1992; [tonsilas humanas]
• VH1GRR+JH3 + Dn4r o D2r con IGLV1S2 + JAZ • Para Ab VZV: ha3h2 (VH3) con Ialh2 (VA); o halcl (VH1) con lalvl (VA1) • Para Ab VZV: ha4h3 (VH4) con Ia3h3(VA3)
• Hv1051 (VH) • Kv325 (Vk)
• Cytomegalovirus (CMV) 10. Huang et al., J Clin Invest 1992;
• 71-2 (VH) • Hv1f10 (VH) • VH4.11 • 71-4 (VH) • VH251 • VH1-69
• HIV 10. Huang et al., J Clin Invest 1992; 11. Wang & Palese, Science 2011
• VH1-69
Hemaglutinina (HA) • Virus Influenza, p. ej., Grupo 1 y/o Grupo 2 de virus Influenza A; p. ej., virus influenza H1N1, H2N2, o H3N2 o H7N2 o H7N7 12. Ekiert et al., Science 2009 13. Throsby et al., PLoS One 2008 14. Sui et al., Nat Struct Mol Biol 2009 15. Ekiert et al., Science 2011
POBLACION HUMANA
■ *' V '' u> ' 1 . Y . . i. *■ ■ ■ TIPO VARiANTE J5 IGH
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HAUSUj RA127U y otro(s) HJH3517; NA1K$B y otro(s) 2 hSW5» MG013S3 HSOfllBS HGM2&3; M«Wi3& WAIS337 RAIS*** MA1533-1 MfidOT4D 0017
HA] 1594 HG005B; .HGUQ5S1. | 4GTHH&7; | H50O276 HGM137 ttUHSC Nu$an n«o»« lULUHU: RAI0U7 y otrofs) (Mill
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POBLACION HUMANE
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fuqhh; NAHSH y otro(s) 19
M412546; HA1M46 ^ otno(s) SIA15531J *JA10WI y atno(s) 58 HlElMSJS, HCM550 y atro(s) 57 H.30145L; HMUTS V atro(jO 33 HG0027B; h&M-aia y ot roc's') 57 1&&002S9; y ot roC's') 53 H(T01619j HG01616 y otrofs) -J ATir-F;=,: NAUDH y at rot's') 48 . N A NAIK2I y otrot's') 2D NA197J7; NA19795 y ot rot's') 48 . ltd 00640; KSOllOJ y <jtro(s) 22 rtOOTM; HUH15 y otro(s) 58 N419172: ij.urjw y otno(s) 8 0.500
HA20U7; V otro^s)
HA12J4B; WA10S51 y atno^s) 17 MAlflWSj JJAUm y otro^s) 9 HnnruE4,; MGoaeni y atro(s) 16 HGD3435; HGDT55Di y otro(s) 7 HGUUiid; Heonaei y strops) 12 rt&ofidas- HGQ0245 y otro(s) h GO1620; MG01625 y at no NA1B5M2; HA 19004 V otro(s) 11 PWiS038f WAIW1 y ot rot's') 17 . NA|9725i NA19773 y otro(s) rtiflllDi HH1U72 y atno(s) 12 NO0fa7; 1*00754 y atno(s) 14 NMSJlfi; Hussn y <jtro(s) 22 0,175
nazobw: NA20G17 y ot rot's') 'n
U4QG9&9; HA 1204-1 V otro(s) ID NA1HEOS; NA1BG24 y ot rot's') ie HGOM3G; HrCKlflM •y otro(s) J3 Htifia.337; HGIU4E1 V otro(s) ID ' HGOO 1*8; HGUQ2SZ V otro(s) ID rtGDOHB; HCmilB y atro(s5 16 wsaisis NA1H974: NA1897® y at rot's') 17 WA19372; NAI9474 V ot rot's') 16 I44147S8; rfA197fl y <ytno(s) 14 l«£01131j uraiixji y otno^s^ 7 NMM1S y otro^s) 14 HAI05W; MU99Q3 y otno(s) 16 0,171 7 -
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(i) Variances JH6 de IgH humana Ho-Sinonimas
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Tabla 14A: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 5% o 10%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA ACUMULATIVA >10% UNICAS
C Pesada
IGHA
IGHA1-a 0.31385 Si 14
IGHA
IGHA2-a 0.35655 Si 14
IGHA
IGHA2-b 0.1647 S] 14
IGHG
IGHG2-a 0.28675 S] 12
IGHG
IGHG3-a 0.2813 S] 14
IGHG
IGHG3-b 0.19955 S] H
IGHG
IGHG4-a 0.19825 S] 12
IGHM
IGHM-a 0.7527 S] 14
IGHM
IGHM-b 0.15245 S] 14
J Pesada
IGHJ
IGHJ6-a 0.6845 S] 14
V Pesada
IGHV
IGHV1-2-a 0.3268 S] 14
IGHV
IGHV1-2-b 0.1304 S] 14
IGHV
IGHV1-2-c 0.0797 No 14
IGHV
IGHV1-3-a 0.3564 S] 14
IGHV
IGHV1-3-b 0.0724 No 13
IGHV
IGHV1-45-a 0.1286 S] 12
IGHV
IGHV1-45-b 0.1126 S] 12
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA ACUMULATIVA >10% UNICAS
IGHV
IGHV1-58-a 0.4503 Si 14
IGHV
IGHV1-58-b 0.3144 Si 14
IGHV
IGHV1-69-a 0.1689 Si 14
IGHV
IGHV1-69-b 0.1543 Si 14
IGHV
IGHVI-69-c 0.0561 No 13
IGHV
IGHV2-26-a 0.06135 No 13
IGHV
IGHV2-5-a 0.6657 Si 14
IGHV
IGHV2-70-a 0.31 Si 14
IGHV
IGHV2-70-b 0.16595 Si 14
IGHV
IGHV2-70-d 0.06035 No 13
IGHV
IGHV3-13-a 0.15245 Si 13
IGHV
IGHV3-15-a 0.0572 No H
IGHV
IGHV3-16-a 0.11075 Si 13
IGHV
IGHV3-20-a 0.2829 Si 14
IGHV
IGHV3-20-b 0.1209 Si 13
IGHV
IGHV3-23-a 0.09825 No 12
IGHV
IGHV3-33-a 0.145 Si 12
IGHV
IGHV3-35-a 0.11765 Si 14
IGHV
IGHV3-35-b 0.09695 No 10
IGHV
IGHV3-38-a 0.0723 No 14
IGHV
IGHV3-43-a 0.2428 Si 14
IGHV
IGHV3-43-b 0.08365 No 13
IGHV
IGHV3-48-a 0.3355 Si 14
IGHV
IGHV3-48-b 0.20455 Si 14
IGHV
IGHV3-49-a 0.38705 Si 14
IGHV
IGHV3-49-b 0.28555 Si 13
IGHV
IGHV3-53-a 0.2535 Si 14
IGHV
IGHV3-53-b 0.2264 Si 13
IGHV
IGHV3-64-a 0.47965 Si 14
IGHV
IGHV3-64-b 0.06225 No 13
IGHV
IGHV3-66-a 0.27865 Si 14
IGHV
IGHV3-66-b 0.12575 Si 14
IGHV
IGHV3-66-C 0.0649 No 13
IGHV
IGHV4-28-a 0.41435 Si 14
IGHV
IGHV4-28-b 0.13715 Si 14
IGHV
IGHV4-28-C 0.07385 No 14
IGHV
IGHV4-28-d 0.06485 No 13
IGHV
IGHV4-31-a 0.5475 Si 14
IGHV
IGHV4-31-b 0.2035 Si 14
IGHV
IGHV4-31-C 0.1554 Si 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA ACUMULATIVA >10% UNICAS
IGHV
IGHV4-39-a 0.10295 Si 14
IGHV
IGHV4-39-b 0.0918 No 14
IGHV
IGHV4-4-a 0.1136 Si 14
IGHV
IGHV4-4-d 0.0817 No 14
IGHV
IGHV4-4-f 0.06675 No 14
IGHV
IGHV4-4-b 0.06385 No 13
IGHV
IGHV4-4-C 0.0599 No 14
IGHV
IGHV4-4-e 0.05215 No 12
IGHV
IGHV4-61-a 0.5701 Si 14
IGHV
IGHV4-61-b 0.18115 Si 14
IGHV
IGHV4-61-C 0.13535 Si 13
IGHV
IGHV4-61-f 0.05855 No 14
C Kaooa
IGKC
IGKC-a 0.2427 Si 14
V Kappa
IGKV
IGKV1-17-a 0.08655 No 13
IGKV
IGKV1-17-b 0.0545 No 12
IGKV
IGKV1-8-a 0.20315 Si 14
IGKV
IGKV1-8-b 0.1334 Si 14
IGKV
IGKV1-9-a 0.1854 Si 14
IGKV
IGKV1D-42-a 0.22345 Si 14
IGKV
IGKV1D-8-a 0.1872 Si 14
IGKV
IGKV2-24-a 0.1708 Si 13
IGKV
IGKV2-30-a 0.24085 Si 13
IGKV
IGKV2D-26-a 0.325 Si 14
IGKV
IGKV2D-29-a 0.30175 Si 14
IGKV
IGKV3-7-a 0.2018 Si 14
IGKV
IGKV3D-11-a 0.35105 Si 14
IGKV
IGKV3D-15-a 0.2061 Si 14
IGKV
IGKV5-2-a 0.32315 Si 14
C Lambda
IGLC
IGLC7-a 0.0751 No 14
J Lambda
IGU
IGU2-a 0.0741 No 13
IGU
IGU7-a 0.93225 Si 14
V Lambda
IGLV
IGLV10-54-a 0.50725 Si 14
IGLV
IGLV10-54-b 0.09425 No 14
IGLV
IGLV11-55-a 0.4463 Si 14
IGLV
IGLV1-36-a 0.0942 No 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA ACUMULATIVA >10% UNICAS
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 Si 14
IGLV
IGLV1-50-a 0.19325 Si 14
IGLV
IGLV1-51-a 0.1177 Si H
IGLV
IGLV2-14-a 0.48365 Si 14
IGLV
IGLV2-14-c 0.08855 No 14
IGLV
IGLV2-14-b 0.0804 No 10
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 Si 14
IGLV
IGLV2-23-a 0.34655 Si 14
IGLV
IGLV2-8-a 0.1451 Si H
IGLV
IGLV3-12-a 0.38715 Si 14
IGLV
IGLV3-12-b 0.1116 Si 14
IGLV
IGLV3-12-c 0.0774 No 14
IGLV
IGLV3-19-a 0.10015 Si 12
IGLV
IGLV3-21-a 0.31195 Si 14
IGLV
IGLV3-21-b 0.178 Si 14
IGLV
IGLV3-21-c 0.1613 Si 14
IGLV
IGLV3-22-a 0.2962 Si 14
IGLV
IGLV3-25-a 0.6581 Si 14
IGLV
IGLV3-25-b 0.19965 Si 14
IGLV
IGLV4-60-a 0.4868 Si 14
IGLV
IGLV4-60-b 0.3607 Si 14
IGLV
IGLV5-37-a 0.1266 Si 13
IGLV
IGLV5-45-a 0.1706 Si 12
IGLV
IGLV5-48-a 0.0873 No 14
IGLV
IGLV6-57-a 0.3734 Si 14
IGLV
IGLV6-57-b 0.2802 Si 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 Si 14
IGLV
IGLV8-61-a 0.2193 Si 12
Tabla 14B: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 20%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
C PESADA
IGHA
IGHA1-a 0.31385 14
IGHA
IGHA2-a 0.35655 14
IGHG
IGHG2-a 0.28675 12
IGHG
IGHG3-a 0.2813 14
IGHM
IGHM-a 0.7527 14
J PESADA
IGHJ
IGHJ6-a 0.6845 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
V PESADA
IGHV
IGHV1-2-a 0.3268 14
IGHV
IGHV1-3-a 0.3564 14
IGHV
IGHV1-58-a 0.4503 14
IGHV
IGHV1-58-b 0.3144 14
IGHV
IGHV2-5-a 0.6657 14
IGHV
IGHV2-70-a 0.31 14
IGHV
IGHV3-20-a 0.2829 14
IGHV
IGHV3-43-a 0.2428 14
IGHV
IGHV3-48-a 0.3355 14
IGHV
IGHV3-48-b 0.20455 14
IGHV
IGHV3-49-a 0.38705 14
IGHV
IGHV3-49-b 0.28555 13
IGHV
IGHV3-53-a 0.2535 14
IGHV
IGHV3-53-b 0.2264 13
IGHV
IGHV3-64-a 0.47965 14
IGHV
IGHV3-66-a 0.27865 14
IGHV
IGHV4-28-a 0.41435 14
IGHV
IGHV4-31-a 0.5475 14
IGHV
IGHV4-31-b 0.2035 14
IGHV
IGHV4-61-a 0.5701 14
C Kaooa
IGKC
IGKC-a 0.2427 14
IGKV1-8-a 0.20315 14
V Kappa
IGKV
IGKV
IGKV1D-42-a 0.22345 14
IGKV
IGKV2-30-a 0.24085 13
IGKV
IGKV2D-26-a 0.325 14
IGKV
IGKV2D-29-a 0.30175 14
IGKV
IGKV3-7-a 0.2018 14
IGKV
IGKV3D-11-a 0.35105 14
IGKV
IGKV3D-15-a 0.2061 14
IGKV
IGKV5-2-a 0.32315 14
J Lambda
IGU
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV
IGLV10-54-a 0.50725 14
IGLV
IGLV11-55-a 0.4463 14
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
IGLV
IGLV2-14-a 0.48365 14
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 14
IGLV
IGLV2-23-a 0.34655 14
IGLV
IGLV3-12-a 0.38715 14
IGLV
IGLV3-21-a 0.31195 14
IGLV
IGLV3-22-a 0.2962 14
IGLV
IGLV3-25-a 0.6581 14
IGLV
IGLV4-60-a 0.4868 14
IGLV
IGLV4-60-b 0.3607 14
IGLV
IGLV6-57-a 0.3734 14
IGLV
IGLV6-57-b 0.2802 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
IGLV
IGLV8-61-a 0.2193 12
Tabla 14C: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 30%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
C pesada
IGHA
IGHA1-a 0.31385 14
IGHA
IGHA2-a 0.35655 14
IGHM
IGHM-a 0.7527 14
J Pesada
IGHJ
IGHJ6-a 0.6845 14
V Pesada
IGHV
IGHV1-2-a 0.3268 14
IGHV
IGHV1-3-a 0.3564 14
IGHV
IGHV1-58-a 0.4503 14
IGHV
IGHV1-58-b 0.3144 14
IGHV
IGHV2-5-a 0.6657 14
IGHV
IGHV2-70-a 0.31 14
IGHV
IGHV3-48-a 0.3355 14
IGHV
IGHV3-49-a 0.38705 14
IGHV
IGHV3-64-a 0.47965 14
IGHV
IGHV4-28-a 0.41435 14
IGHV
IGHV4-31-a 0.5475 14
IGHV
IGHV4-61-a 0.5701 14
IGKV
IGKV2D-26-a 0.325 14
IGKV
IGKV2D-29-a 0.30175 14
IGKV
IGKV3D-11-a 0.35105 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
IGKV
IGKV5-2-a 0.32315 14
J Lambda
IGLJ
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV
IGLV10-54-a 0.50725 14
IGLV
IGLV11-55-a 0.4463 14
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 14
IGLV
IGLV2-14-a 0.48365 14
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 14
IGLV
IGLV2-23-a 0.34655 14
IGLV
IGLV3-12-a 0.38715 14
IGLV
IGLV3-21-a 0.31195 14
IGLV
IGLV3-25-a 0.6581 14
IGLV
IGLV4-60-a 0.4868 14
IGLV
IGLV4-60-b 0.3607 14
IGLV
IGLV6-57-a 0.3734 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
Tabla 14D: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 40%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
C Pesada
IGHM
IGHM-a 0.7527 14
J Pesada
IGHJ
IGHJ6-a 0.6845 14
V Pesada
IGHV1-58-a 0.4503 14
IGHV
IGHV
IGHV2-5-a 0.6657 14
IGHV
IGHV3-64-a 0.47965 14
IGHV
IGHV4-28-a 0.41435 14
IGHV
IGHV4-31-a 0.5475 14
IGHV
IGHV4-61-a 0.5701 14
J Lambda
IGU
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV
IGLV10-54-a 0.50725 14
IGLV
IGLV11-55-a 0.4463 14
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 14
IGLV
IGLV2-14-a 0.48365 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 14
IGLV
IGLV3-25-a 0.6581 14
IGLV
IGLV4-60-a 0.4868 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
Tabla 14E: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 50%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
C Pesada
IGHM
IGHM-a 0.7527 14
J Pesada
IGHJ
IGHJ6-a 0.6845 14
V Pesada
IGHV
IGHV2-5-a 0.6657 14
IGHV
IGHV4-31-a 0.5475 14
IGHV
IGHV4-61-a 0.5701 14
J Lambda
IGU
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV10-54-a 0.50725 14
IGLV
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 14
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 14
IGLV
IGLV3-25-a 0.6581 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
Tabla 14F: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 60%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
C Pesada
IGHM
IGHM-a 0.7527 14
J Pesada
IGHJ
IGHJ6-a 0.6845 14
V Pesada
IGHV
IGHV2-5-a 0.6657 14
J Lambda
IGLJ
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 14
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 14
IGLV
IGLV3-25-a 0.6581 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
Tabla 14G: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 70%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
C Pesada
IGHM
IGHM-a 0.7527 14
J Lambda
IGU
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV
IGLV1-47-a 0.8413 14
IGLV
IGLV2-18-a 0.763 14
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
Tabla 14H: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 80%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
J Lambda
IGU
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV1-47-a 0.8413 14
IGLV
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
Tabla 14I: Variantes que tienen una frecuencia acumulativa mayor de 90%
SEGMENTO
NOMBRE FRECUENCIA POBLACIONES NO
GEN
VARIANTE ACUMULATIVA UNICAS
J Lambda
IGLJ
IGU7-a 0.93225 14
V Lambda
IGLV
IGLV7-46-a 0.9166 14
TABLA 15A: Uso de J - Todos sin tratamiento previo
J
Lonaitud Promedio HCDR3 Recuento %
IGHJ1*01
11 12 0.90%
IGH2*01
12 47 3.51%
IGHJ3*02
12 205 15.30%
IGHJ4*02
11 689 51.42%
IGHJ5*02
13 88 6.57%
IGHJ6*02
16 299 22.31%
HCDR3 No sometida a tratamiento previo >=20
J
Lonaitud Promedio HCDR3 Recuento %
IGHJ3 *02
20 1 2.22%
IGHJ4*02
20 1 2.22%
IGHJ5*02
20 2 4.44%
IGHJ6*02
21 41 91.11%
HCDR3 Laraa No sometida a tratamiento
previo utilizando IGHJ6*02
Lonaitud HCDR3
Recuento
20
19
21
10
22
7
23
3
24
1
26
1
TABLA 15B: Uso de J v D - Todos sin
tratamiento previo
J
D Lonaitud Promedio Recuento
HCDR3
IGHJ6*02
IGHD3- 9*01 19 21
IGHJ6*02
IGHV4- 17*0 18 7
IGHJ6*02
IGHD3- 10*01 17 98
IGHJ6*02
IGHD2- 2*02 17 4
IGHJ6*02
IGHD5- 24*01 17 1
IGHJ6*02
IGHD6- 19*01 16 30
IGHJ6*02
IGHD3- 22*01 16 5
TABLA 15B: Uso de J v D - Todos sin
tratamiento previo
J
D Longitud Promedio Recuento
HCDR3
IGHJ6*02
IGHD6- 13*01 16 33
IGHJ6*02
IGHD5- 12*01 15 7
IGHJ6*02
IGHD1- 26*01 15 25
IGHJ6*02
IGHD1- 20*01 14 6
IGHJ6*02
IGHD5- 18*01 14 3
IGHJ6*02
IGHD3- 16*02 14 6
IGHJ6*02
IGHD2- 21*02 13 5
IGHJ6*02
IGHD1- 14*01 13 4
IGHJ6*02
IGHD7- 27*02 12 8
IGHJ6*02
IGHD-1*01 12 8
IGHJ6*02
IGHD6- 25*01 12 3
IGHJ6*02
IGHD4- 23*01 11 2
HCDR3 No sometida a tratamiento previo >=20
J
D
Longitud Promedio HCDR3 Recuento
IGHJ6*02
IGHD6-19*01
23
1
IGHJ6*02
IGHD4-17*01
22
IGHJ6*02
IGHD3-9*01
21
11
IGHJ6*02
IGHD3-10*01
21
25
IGHJ6*02
IGHD6-13*01
20
IGHJ6*02
IGHD3-22*01
20
2
1
1
TABLA 15C: Uso de V v J - Todos sin tratamiento previo
V
J Longitud Promedio HCDR3 Recuento
IGHV3-21*03
IGHJ6*02 O CM 5
IGHV1-18*01
IGHJ6*02 O CM 10
IGHV1-2*02
IGHJ6*02 19 5
IGHV3-13*01
IGHJ6*02 19 3
IGHV3-7*01
IGHJ6*02 19 6
IGHV-8*01
IGHJ6*02 19 21
IGH7-4-1*01
IGHJ6*02 19 9
IGHV3-9*01
IGHJ6*02 18 13
IGHV4-61*1
IGHJ6*02 17 20
TABLA 15C: Uso de V v J - Todos sin tratamiento Drevio
V
J Lonaitud Promedio HCDR3 Recuento
IGHV3-23*04
IGHJ6*02 17 6
IGHV4-4*02
IGHJ6*02 16 34
IGHV-3*01
IGHJ6*02 16 39
IGHV3-20*d01
IGH6*02 16 1
IGHV6-1*01
IGHJ6*02 14 69
IGHV2-5*10
IGHJ6*02 14 8
IGHV3-11*01
IGHJ6*02 14 3
IGHV3-66*03
IGHJ6*02 13 21
IGHV3-15*01
IGHJ6*02 12 3
HCDR3 No sometida a tratamiento previo>=20
V
J Longitud Promedio HCDR3 Recuento
IGHV3-21*03
IGHJ6*02 23 3
IGHV3-13*01
IGHJ6*02 22 1
IGHV3-7*01
IGHJ6*02 22 3
IGH6-1*01
IGHJ6*02 21 3
IGHV1-8*01
IGHJ6*02 21 10
IGHV1-2*02
IGHJ6*02 21 3
IGH7-4-1*01
IGHJ6*02 21 3
IGHV-3*01
IGHJ6*02 21 4
IGHV1-18*01
IGHJ6*02 21 5
IGHV4-4*02
IGHJ6*02 20 3
IGHV3-9*01
IGHJ6*02 20 2
IGHV3-23*04
IGHJ6*02 20 1
TABLA 16: REPERTORIOS DE CADENAS PESADAS INMUNIZADAS
TABLA 16A: Uso de J - Todos Inmunizados
J
Longitud de HCDR3 Recuento %
IGHJ*01
11 2 0.78%
IGHJ2*01
14 7 2.73%
IGHJ3*02
15 12 4.69%
IGHJ4*02
15 120 46.88%
IGHJ5*02
15 19 7.42%
IGHJ6*02
17 96 37.50%
HCDR3>20
J
Longitud HCDR3 Recuento %
IGHJ4*02
22 2 22.22%
IGHV5*02
LO CM 1 11.11%
IGHJ6*02
21 6 66.67%
HCDR3 larga inmunizada utilizando IGHJ6*02
Lonaitud HCDR3
Recuento
20
4
21
1
24
1
TABLA 16B: Uso de J y D - Todos inmunizados
J
D Lonaitud HCDR3 Recuento
IGHJ6*02
IGHD4-17*01 18 1
IGHJ6*02
IGHD-26*01 18 5
IGHJ6*02
IGHD6-19*01 17 27
IGHJ6*02
IGHD3-10*01 17 42
IGHJ6*02
IGHD6-13*01 16 2
IGHJ6*02
IGHD5-18*01 15 2
IGHJ6*02
IGHD4-23*01 15 5
IGHJ6*02
IGHD5-12*01 14 3
IGHJ6*02
IGHD3-16*02 14 3
IGHJ6*02
IGHD3-22*01 13 3
IGHJ6*02
IGHD3-9*01 12 1
IGH6*02
IGHD1-20*01 11 1
HCDR3>20
J
D Longitud HCDR3 Recuento
IGHJ6*02
IGHD3-10*01 21 4
IGHJ6*02
IGHD6-19*01 20 1
IGHJ6*02
IGHD1-26*01 20 1
TABLA 16C: Uso de V y J - Todos inmunizados
V
J Longitud HCDR3 Recuento
IGHV3-7*01
IGHJ6*02 18 33
IGHV-8*01
IGHJ6*02 17 3
IGHV3-9*01
IGHJ6*02 17 22
IGHV3-13*01
IGHJ6*02 17 5
IGHV1-2*02
IGHJ6*02 16 8
IGHV3-11*01
IGHJ6*02 16 3
IGHV4-4*02
IGHJ6*02 15 9
IGHV6-1*01
IGHJ6*02 15 6
IGHV1-3*01
IGHJ6*02 15 6
HCDR3>20
V
J Lonaitud HCDR3 Recuento
IGHV3-7*01
IGHJ6*02 21 4
IGHV3-11*01
IGHJ6*02 21 1
IGHV4-4*02
IGHJ6*02 o CM 1
TABLA 17: REPERTORIOS DE CADENAS PESADAS ESPECIFICAS DE ANTIGENOS
TABLA 17A: Uso de J - Todos esoecificos de antigenos
J
Lonaitud HCDR3 Recuento %
IGHJ3*02
12 2 1.68%
IGHJ3*02
17 4 3.36%
IGHJ4*02
13 64 53.78%
IGHJ5*02
19 6 5.04%
IGHJ6*02
17 43 36.13%
HCDR3>20
J
Longitud HCDR3 Recuento %
IGHJ4*02
22 1 9.09%
IGHJ5*02
21 3 27.27%
IGHJ6*02
21 7 63.64%
HCDR3 larga Inmunizada utilizando IGHJ6*02
Longitud HCDR3
Recuento
20
4
21
1
22
1
24
1
TABLA 17B: Uso J v D - Todos espeaficos de antigenos
J
D Longitud Recuento
HCDR3
IGHJ6*02
IGHD3-9*01 19 6
IGHJ6*02
IGHD3-10*01 19 12
IGHJ6*02
IGHD6-19*01 17 13
IGHJ6*02
IGHD5-12*01 16 2
IGHJ6*02
IGHD2-15*01 16 1
IGHJ6*02
IGHD1-26*01 15 7
IGHJ6*02
IGHD3-16*02 12 1
IGHJ6*02
IGHD5-18*01 11 1
TABLA 17B: Uso J v D - Todos esoecificos de antiaenos
J
D Lonaitud HCDR3 Recuento
HCDR3>20
J
D Longitud HCDR3 Recuento
IGHJ6*02
IGHD3-9*01 21 1
IGHJ6*02
IGHD3-10*01 21 6
TABLA E 17C: Uso V v J - Todos espeaficos de antfaenos
V
J Lonaitud HCDR3 Recuento
IGHV-3*01
IGHJ6*02 18 1
IGHV3-7*01
IGHJ6*02 18 6
IGHV3-9*01
IGHJ6*02 18 6
IGHV-8*01
IGHJ6*02 17 6
IGHV3-20*d01
IGHJ6*02 17 3
IGH3-11*01
IGHJ6*02 17 8
IGHV4-4*02
IGHJ6*02 17 5
IGH3-15*01
IGHJ6*02 15 5
IGHV3-13*01
IGHJ6*02 15 3
HCDR3>20
V
J Lonaitud HCDR3 Recuento
IGHV4-4*02
IGHJ6*02 20 2
IGHV-8*01
IGHJ6*02 22 2
IGHV3-9*01
IGHJ6*02 20 1
IGH3-11*01
IGHJ6*02 21 1
IGHV3-20*d01
IGHJ6*02 22 1
Tabla 18: Tabla correlacion secuencias
SEQ ID MO:
DESCR1PCIOH
1
referenda JHS (secuencia nucleotidos)
2
referenda JHG*G3=JHG (secuencia nucleotidos)
a
referenda JH2 (secuencia nucleotidos)
4
JHG*02 (secuencia nucleotidos)
5
' referenda JHS (secuencia nucleotidos)
6
referenda JHS (secuencia aminoacidos)
7
referenda JH6*03=JH6 (secuencia nucleotidos)
S
referenda JH6*03=JH6 (secuencia aminoacidos)
9
referenda JH2 (secuencia nucleotidos)
10
referenda JH2 (secuencia aminoacidos)
11
IGHVl-2'01
n
1GHV1-3*01
13
<GHV1-8*01
14
IGHV1-24*01 .
IS
IGHV1-45*01
IB
IGHV1-4&"01
17
IGHVl-SB'Ol
13
IGHV1-69'01
19
IGHVl-c*01
20
IGHVl‘f*01
21
IGHV2-5*01
22
IGHV2-26*01
23
IGHV2-70*01
24
IGHV3-7*01
25
IGHV3-9*01
26
IGHV3-11*01
27
IGHV3-13*01
28
IGHV3-15*01
29
IGHV3-16*01
30
IGHV3-19*01
31
IGHV3-20*01
32
IGHV3-21*01
33
IGHV3-23*01
34
JGHV3-30*01
35
IGHV3-30-3*01
36
IGHV3-33*01
37
IGHV3-35*01
38
IGHV3-38*01
39
IGHV3-43*01
40
IGHV3-47*01
41
IGHV3-48*01
42
1GHV3-49*01
43
IGHV3-53*01
44
IGHV3-64*01
45
IGHV3-66*01
46
IGHV3-72*01
47
IGHV3-73*01
48
IGHV3-74*01
49
IGHV3-d*01
50
IGHV3-h*01
51
IGHV4-4*01
52
IGHV4-28*01
53
IGHV4-30-2*01
54
IGHV4-30-4*01
55
IGHV4-31*01
56
IGHV4-34*01
57
IGHV4-39*01
58
IGHV4-55*01
59
IGHV4-59*01
60
IGHV4-61*01
61
IGHV4-b*01
62
IGHV5-51*01
63
IGHV5-a*01
64
IGHV6-1*01
65
IGHV7-4-l*01
66
IGHV7-81*01
67
IGHD1-1*01
68
IGHD1-7*01
69
IGHD1-14*01
70
IGHD1-20*01
71
IGHD1-26*01
72
IGHD2-2*01
73
IGHD2-8*01
74
IGHD2-15*01 .
75
IGHD2-21*01
76
IGHD3-3*01
77
IGHD3-9*01
78
IGHD3-10*01
79
IGHD3-16*01
80
IGHD3-22*01
81
IGHD4-4*01
82
IGHD4-11*01
83
IGHD4-17*01
84
IGHD4-23*01
85
IGHD5-5*01
86
IGHD5-12*01
87
IGHD5-18*01
88
IGHD5-24*01
89
IGHD6-6*01
90
IGHD6-13*01
91
IGHD6-19*01
92
IGHD6-25*01
93
IGHD6-25*01
94
JH1*01
95
JH2*01
96
JH3*01
97
JH4*01
98
JH5*01
99
JH6*01
100
IGKV1-5*01
101
IGKV1-6*01
102
IGKV1-8*01
103
IGKV1D-8*01
104
IGKV1-9*01
105
IGKV1-12*01
106
IGKV1-13*01
107
IGKV1-16*01
108
IGKV1D-16*01
109
IGKV1-17*01
110
IGKV1D-17*01
111
IGKV1-27*01
112
IGKV1-33*01
113
IGKV1D-33*01
114
IGKV1-37*01
115
IGKV1D-37*01
116
IGKV1-39*01
117
IGKV1D-39
118
IGKV1D-42*01
119
IGKV1D-43*01
120
IGKV2-24*01
121
IGKV2D-24*01
122
IGKV2-28*01
123
IGKV2D-28*01
124
IGKV2-29*01
125
IGKV2D-29*01
126
IGKV2-30*01
127
IGKV2D-30*01
128
IGKV2-40*01
129
IGKV2D-40*01
130
IGKV3-7*01
131
IGKV3-7*03
132
IGKV3D-7*01
133
IGKV3-11*01
134
IGKV3D-11*01
135
IGKV3-15*01
136
IGKV3D-15*01
137
IGKV3-20*01
138
IGKV3D-20*01
139
IGKV4-1*01
140
IGKV5-2*01
141
IGKV6-21*01
142
IGKV6D-21*01
143
IGKV6D-41*01
144
IGLV1-36*01
145
IGLV1-40*01
146
IGLV1-41*01
147
IGLV1-44*01
148
IGLV1-47*01
149
IGLV1-50*01
150
IGLV1-51*01
151
IGLV2-8*01
152
IGLV2-11*01
153
IGLV2-14*01
154
IGLV2-18*01
155
IGLV2-23*01
156
IGLV2-33*01
157
IGLV3-1*01
158
IGLV3-10*01
159
IGLV3-12*01
160
IGLV3-16*01
161
IGLV3-19*01
162
IGLV3-21*01
163
IGLV3-22*01
164
IGLV3-25*01
165
IGLV3-27*01
166
IGLV3-32*01
167
IGLV4-3*01
168
IGLV4-60*01
169
IGLV4-69*01
170
IGLV5-37*01
171
IGLV5-45*01
172
IGLV5-48*01
173
IGLV5-52*01
174
IGLV6-57*01
175
IGLV7-43*01
176
IGLV7-46*01
177
IGLV8-61*01
178
IGLV9-49*01
179
IGLV10-54*01
180
IGLV11-55*01
181
IGKJ1*01
182
IGKJ2*01
183
IGKJ3*01
184
IGKJ4*01
185
IGKJ5*01
186
IGU1*01
187
IGU2*01
188
IGU3*01
189
IGL)4*01
190
IGU5*01
191
IGL)6*01
192
IGU7*01
193
IGKV2D-26*01
194
IGLV1-36*01
195
IGLV1-47*01
196
IGLV1-50*01
197
IGLV1-51*01
198
IGLV10-54*01
199
IGLV11-55*01 .
200
1GLV2-14*01
201
1GLV2-18*01
202
IGLV2-23*01
203
IGLV2-8*01
204
IGLV3-1*01
205
IGLV3-12*01
206
IGLV3-19*01
207
IGLV3-21*01
208
IGLV3-22*01
209
IGLV3-25*01
210
IGLV4-60*01
211
1GLV5-37*01
212
IGLV5-45*01
213
IGLV5-48*01
214
IGLV6-57*01
215
IGLV7-46*01
216
IGLV8-61*01
217
IGHG3
218
IGHA2
219
IGHG2
220
IGHE
221
IGHE
222
IGHA1
223
IGHG1
224
IGHG1
225
IGHM
US
IGHGl
111
IGHD
226
IGHG4
225
IGHE
230
IGKC
231
IGLC2
232
IGLC1
233
IGLC3
234
IGLC7
235
JH6*02 (secuencia nucleotidos)
236
JH6*01 y JH6*02 (secuencia aminoacidos)
237
RSS-JH6*02 humane
236
RSS humano
239
IGHJ1 ref
240
IGHJ2 ref
241
IGHJ3 ref
242
IGHJ4 ref
243
IGHJ5 ref
244
IGHJ6 ref
245
IGHV1-18 ref
246
IGHV1-2 ref
247
IGHV1-24 ref
248
IGHV1-3 ref
249
IGHV1-45 ref
250
IGHV1-46 ref
251
IGHV1-58 ref
252
IGHV1-69 ref
253
IGHV1-8 ref
254 >
IGHV2-26 ref
255
IGHV2-5 ref
256
IGHV2-70 ref
257
IGHV3-11 ref
258
IGHV3-13 ref
259
IGHV3-15 ref
260
IGHV3-16 ref
261
IGHV3-20 ref
262
IGHV3-21 ref
263
IGHV3-23 ref
264
IGHV3-30 ref
265
IGHV3-33 ref
266
IGHV3-35 ref
267
IGHV3-38 ref
268
IGHV3-43 ref
269
IGHV3-48 ref
270
IGHV3-49 ref
271
1GHV3-53 ref
272
IGHV3-64 ref
273
IGHV3-66 ref
274
IGHV3-7 ref
275
IGHV3-72 ref
276
IGHV3-73 ref
277
IGHV3-74 ref
278
IGHV3-9 ref
279
IGHV4-28 ref
280
IGHV4-31 ref
281
IGHV4-34 ref
282
IGHV4-39 ref
283
IGHV4-4 ref
284
IGHV4-59 ref
285
IGHV4-61 ref
286
IGHV5-51 ref
287
IGHV6-1 ref
288
IGHV7-81 ref
289
IGKJ2 ref
290
IGKJ3 ref
291
IGKJ4 ref
292
IGKJ5 ref
293
IGKV1-16 ref
294
IGKV1-17 ref
295
IGKV1-5 ref
296
IGKV1-6 ref
297
IGKV1-8 ref
298
IGKV1-9 ref
299
IGKV1D-12 ref
300
IGKV1D-16 ref
301
IGKV1D-17 ref
302
IGKV1D-42 ref
303
IGKV1D-43 ref
304
IGKV1D-8 ref
305
IGKV2-24 ref
306
IGKV2-30 ref
307
IGKV2D-24 ref
308
IGKV2D-26 ref
309
IGKV2D-29 ref
310
IGKV2D-30 ref
311
IGKV3-11 ref
312
IGKV3-20 ref
313
IGKV3-7 ref
314
IGKV3D-11 ref
315
IGKV3D-15 ref
316
IGKV3D-20 ref
317
IGKV4-1 ref
318
IGKV5-2 ref
319
IGKV6-21 ref
320
IGKV6D-21 ref
321
IGKV6D-41 ref
322
IGU1 ref
323
IGU2 ref
324
IGU3 ref
325
IGU5 ref
326
IGU6 ref
327
IGU7 ref
328
IGLV10-54 ref
329
IGLV11-55 ref
330
IGLV1-36 ref
331
IGLV1-40 ref
332
IGLV1-44 ref
333
IGLV1-47 ref
334
IGLV1-50 ref
335
IGLV1-51 ref
336
IGLV2-11 ref
337
IGLV2-14 ref
338
IGLV2-18 ref
339
IGLV2-23 ref
340
IGLV2-33 ref
341
IGLV2-8 ref
342
IGLV3-1 ref
343
IGLV3-10 ref .
344
IGLV3-12 ref
345
IGLV3-16 ref
346
IGLV3-19 ref
347
IGLV3-21 ref
348
IGLV3-22 ref
349
IGLV3-25 ref
350
IGLV3-27 ref
351
IGLV3-32 ref
352
IGLV3-9 ref
353
IGLV4-3 ref
354
IGLV4-60 ref
355
IGLV4-69 ref
356
IGLV5-37 ref
357
IGLV5-45 ref
358
IGLV5-48 ref
359
IGLV5-52 ref
360
IGLV6-57 ref
361
IGLV7-43 ref
362
IGLV7-46 ref
363
IGLV8-61 ref
364
IGLV9-49 ref
369
IGHG2 ref- GENOMIC
370
IGHG2 ref-CDS (ID transcrito ensembl ENSTOQ00039Q545)
371
IGHG2-0 CDS
372
IGKG2-3 GENOMIC
373
IGHG3 ref* GENOMIC
374
IGHG3 ref-CDS (ID transcrito ensembl E NSTODO003SO551}
375
IGJHGS-a CDS
365
IGHG1 ref GENOMIC
366
IGHG1 ref-CDS (ID transcrito ensembl EN5TOO0DO390542)
367
IGHG1 ref-CDS (ID transcrito Ensembl ENST0000039054S)
363
IGHG1 ref-CDS (ID transcrito ensembl ENSTO0OO039Q548) '
332
(GHG4-a GENOMIC
383
IGHA1 nef GENOMIC
3S4 .
IGHA1 ref-CCS (ID transcrito ensembl E N5TODOOC3 90S47)
335
IGHAl-a GENOMIC
336
IGHAl-a CDS
387
IGHA2 ref GENOMIC
333
IGHA2 ref-CDS (ID transcrito ensembl ENSTODOOO390535)
376
IGHG3-B GENOMIC
377
IGKG3-b CDS
37a
IGHG3-b GENOMIC
379
IGHGA ref- GENOMIC
380
IGHG4 ref-CDS (ID transcrito ensembl ENSTO0OWJ3W543)
381
IGHG4-a CDS
359
IGHA2-S GENOMIC
390
lGHA2-a CDS
391
IGHA2-b GENOMIC
392
IGHA2-b CDS
393
iGHDref GENOMIC
394
IGHD ref- CDS (ID transcrito ensembl ENST00000390556)
395
IGHE ref GENOMIC
396
1GHE ref-CDS (ID transcrito ensembl ENSn00000390541J
397
IG HE ref-CDS (ID transcrito ensembl EN5TOOOOOS76077)
39S
IGHE ref- CDS (ID transcrito ensembl ENS700000S 77108}
399
IGKM ref GENOMIC
400
IGHM ref- CDS (ID transcrito ensembl ENST<KXJQ03905&9) ______________
401
1GHM <i GENOMIC
402
IGHM-a CDS
403
IGHM bGEMOMIC
404
]GHW-b CDS
40S
IGKD7-27 GFNOMIC
406
1GHD2-1S GEMDMIC
407
IGHD3-16 GENOMIC
40S
1GHD6-G ref GENOMIC
409
IGHD5-18 ref GENOMIC
410
IGHD2-2 ref GENOMIC
411
LCH04-11 ref GENOMIC
412
[QH05-12 ref
GENOMIC
413
IGKD3-3 ref GENOMIC
414
IGHD2-8 ref GENOMIC
415
LGHD4-4 ref GENOMIC
416
IGH04-23 ref GENOMIC
417
IGH01-14 ref GENOMIC
418
IGHD3-10 ref GENOMIC
419
IGHD1-26 ref GENOMIC
420
IGHD3-9 ref GENOMIC
421
IGHD1-1 ref GENOMIC
422
1GHD6-25 ref GENOMIC
423
IGHDS-24 ref GENOMIC
424 '
IGH 02-21 ref GENOMIC
425
IGH D1-20 ref GENOMIC
425
IGHD6-13 ref GENOMIC
427
IGHD4-17 ref GENOMIC
428
LGHD3-22 ref GENOMIC
429
IGH 05-5 ref GENOMIC
430
IGHD6-19 ref GENOMIC
431
IGHD1-7 ref GENOMIC
432
JH6 conejo (aminoacido)
433
JH6 conejo (nucleotido)
434
JH6 oueja (aminoacido)
435
JH6 oueja (nucleotido)
436
JH6 bouino (aminoacido) -
437
JH6 bouino (nucleotido)
438
JH3 perro (aminoacido)
439
JH3 perro (nucleotido)
440
JH6*02 humano (aminoacido)
441
JH6*02 humano (nucleotido)
442
Secuencia lider (nucleotido)
443
Secuencia lider (aminoacido)
444
CEBADOR
445
CEBADOR
igGi igG2 igG3 igG4
Activacion complemento
Ruta clasica
+ + + + + + + -
Ruta alternativa
- + - -
Reconocimiento receptor Fc
FcyRI
+ + + - + + + + +
FcYRIla, 131R/R
+ + - + + -
FcYRIla, 131H/H
+ + + + -
FcYRIIb
+ + - + + +
FcyRIII
+ +/- + +/-
Tabla 20
Tabla 20A: Variantes encontradas en no mas de 3 poblaciones humanas
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV1D-8-b 0.01785 1.79% 36 3
IGHV
IGHV3-11-a 0.01695 1.70% 36 3
IGHV
IGHV5-51-a 0.0164 1.64% 35 3
IGHV
IGHV2-5-b 0.01055 1.06% 18 3
IGLV
IGLV2-14-g 0.0104 1.04% 22 3
IGHV
IGHV7-81-b 0.01005 1.01% 21 3
IGKV
IGKV1D-42-b 0.01005 1.01% 21 3
IGKV
IGKV3-7-b 0.01 1.00% 19 3
IGHV
IGHV1-69-d 0.00995 1.00% 22 3
IGLV
IGLV2-14-e 0.00995 1.00% 19 3
IGLV
IGLV9-49-a 0.00865 0.87% 18 3
IGLV
IGLV1-44-b 0.00775 0.78% 16 2
IGLV
IGLV2-11-a 0.00775 0.78% 17 3
IGKV
IGKV3-11-d 0.0073 0.73% 14 3
IGKV
IGKV1D-43-b 0.00685 0.69% 14 3
IGHV
IGHV3-38-d 0.0064 0.64% 13 3
IGLJ
IGU6-a 0.00595 0.60% 13 3
IGHV
IGHV5-51-b 0.0055 0.55% 11 3
IGLV
IGLV5-45-c 0.00545 0.55% 12 2
IGHV
IGHV4-31-i 0.0054 0.54% 10 3
IGKV
IGKV2D-26-b 0.00455 0.46% 9 3
IGLV
IGLV1-36-c 0.00455 0.46% 10 2
IGHV
IGHV1-24-c 0.00415 0.42% 9 3
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGHV
IGHVI-8-c 0.00405 0.41% 8 2
IGLV
IGLV1-47-d 0.00405 0.41% 9 3
IGHV
IGHV3-43-i 0.00365 0.37% 8 3
IGHV
IGHV3-53-h 0.0036 0.36% 8 2
IGLV
IGLV10-54-e 0.0036 0.36% 8 3
IGLV
IGLV1-36-f 0.0036 0.36% 8 2
IGLV
IGLV5-45-d 0.0036 0.36% 8 3
IGHV
IGHV1-46-b 0.0032 0.32% 7 3
IGHV
IGHV2-26-C 0.0032 0.32% 7 2
IGU
IGU6-b 0.0032 0.32% 7 3
IGLV
IGLV3-32-a 0.0032 0.32% 7 3
IGLV
IGLV9-49-b 0.0032 0.32% 7 2
IGHJ
IGHJ6-b 0.00315 0.32% 7 2
IGHV
IGHV3-16-d 0.00315 0.32% 7 3
IGHV
IGHV4-28-k 0.00315 0.32% 7 3
IGKJ
IGKJ2-d 0.00315 0.32% 6 3
IGLV
IGLV10-54-f 0.00315 0.32% 7 2
IGLV
IGLV2-8-C 0.00315 0.32% 7 3
IGLV
IGLV3-10-C 0.00315 0.32% 6 2
IGLV
IGLVI-40-c 0.00275 0.28% 6 2
IGLV
IGLV1-51-b 0.00275 0.28% 6 3
IGHV
IGHV1-69-m 0.0027 0.27% 6 3
IGHV
IGHV3-33-e 0.0027 0.27% 6 3
IGHV
IGHV3-49-C 0.0027 0.27% 6 3
IGHV
IGHV3-66-g 0.0027 0.27% 6 3
IGHV
IGHV4-4-U 0.0027 0.27% 6 3
IGKV
IGKVID-42-c 0.0027 0.27% 6 1
IGKV
IGKVID-43-c 0.0027 0.27% 5 3
IGLV
IGLV10-54-h 0.0027 0.27% 6 2
IGLV
IGLV10-54-i 0.0027 0.27% 6 2
IGLV
IGLV1-36-g 0.0027 0.27% 6 3
IGLV
IGLV2-8-d 0.0027 0.27% 6 3
IGLV
IGLV3-22-e 0.0027 0.27% 6 1
IGLV
IGLV3-22-d 0.0027 0.27% 6 3
IGHJ
IGHJ2-b 0.00225 0.23% 4 3
IGHV
IGHVI-3-u 0.00225 0.23% 5 2
IGHV
IGHV1-3-v 0.00225 0.23% 5 2
IGHV
IGHV1-3-ap 0.00225 0.23% 4 3
IGHV
IGHVI-46-c 0.00225 0.23% 5 3
IGHV
IGHV1-58-f 0.00225 0.23% 5 3
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGHV
IGHV1-69-j 0.00225 0.23% 5 3
IGHV
IGHV3-13-e 0.00225 0.23% 5 3
IGHV
IGHV3-23-f 0.00225 0.23% 5 3
IGHV
IGHV3-23-g 0.00225 0.23% 5 3
IGHV
IGHV4-28-p 0.00225 0.23% 5 3
IGHV
IGHV4-31-j 0.00225 0.23% 5 3
IGKV
IGKV1-17-d 0.00225 0.23% 4 1
IGKV
IGKV3-20-a 0.00225 0.23% 5 3
IGKV
IGKV3-7-C 0.00225 0.23% 5 3
IGKV
IGKV3-7-d 0.00225 0.23% 5 3
IGKV
IGKV3D-11-b 0.00225 0.23% 5 3
IGU
IGU3-a 0.00225 0.23% 4 2
IGLV
IGLV11-55-g 0.00225 0.23% 5 3
IGLV
IGLVI-50-c 0.00225 0.23% 5 3
IGLV
IGLV2-11-g 0.00225 0.23% 5 3
IGLV
IGLV2-14-n 0.00225 0.23% 5 3
IGLV
IGLV2-23-f 0.00225 0.23% 5 2
IGLV
IGLV3-19-C 0.00225 0.23% 5 2
IGLV
IGLV5-37-C 0.00225 0.23% 4 2
IGLV
IGLV5-48-k 0.00225 0.23% 5 3
IGLV
IGLV2-14-i 0.00185 0.19% 4 2
IGHJ
IGHJ1-a 0.0018 0.18% 3 3
IGHV
IGHV1-2-g 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV1-3-y 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV1-3-ar 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV1-3-ai 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHVI-69-s 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV1-8-d 0.0018 0.18% 4 2
IGHV
IGHV2-5-d 0.0018 0.18% 4 2
IGHV
IGHV3-13-j 0.0018 0.18% 4 2
IGHV
IGHV3-21-d 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV3-23-n 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV3-33-d 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV3-64-e 0.0018 0.18% 4 2
IGHV
IGHV3-9-g 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV4-39-y 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV4-39-n 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV4-39-0 0.0018 0.18% 4 3
IGHV
IGHV7-81-C 0.0018 0.18% 4 3
IGKJ
IGKJ2-e 0.0018 0.18% 4 3
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV2D-26-C 0.0018 0.18% 4 1
IGKV
IGKV3D-11-g 0.0018 0.18% 3 2
IGKV
IGKV3D-11-f 0.0018 0.18% 4 3
IGKV
IGKV4-1-W 0.0018 0.18% 3 3
IGU
IGLI1 -a 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLV10-54-k 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLV11-55-e 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV1-36-e 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV1-40-f 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV1-44-d 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV1-44-e 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV1-47-g 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLV1-50-d 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLV1-51-d 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLVI-51-c 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV2-14-r 0.0018 0.18% 4 1
IGLV
IGLV2-33-b 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV2-8-e 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLV3-16-h 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV3-21-j 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV3-22-g 0.0018 0.18% 4 3
IGLV
IGLV3-22-h 0.0018 0.18% 4 2
IGLV
IGLV5-48-j 0.0018 0.18% 4 3
IGHJ
IGHJ4-d 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV1-18-d 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV1-18-e 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV1-2-h 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV1-2-f 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV1-3-aa 0.00135 0.14% 3 1
IGHV
IGHV1-3-ak 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHVI-3-w 0.00135 0.14% 3 1
IGHV
IGHV1-3-at 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV1-69-k 0.00135 0.14% 3 1
IGHV
IGHV1-69-ac 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV1-8-e 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV1-8-f 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV2-70-y 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV2-70-Z 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV2-70-af 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV2-70-h 0.00135 0.14% 3 3
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGHV
IGHV3-13-g 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV3-16-e 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV3-20-f 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV3-30-d 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV3-30-C 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV3-33-h 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV3-43-k 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV3-43-m 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV3-53-n 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV3-53-m 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV3-64-f 0.00135 0.14% 3 1
IGHV
IGHV3-73-C 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV3-9-h 0.00135 0.14% 2 1
IGHV
IGHV4-31-h 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV4-39-U 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV4-39-t 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV4-39-q 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV4-4-ao 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV4-4-ac 0.00135 0.14% 3 1
IGHV
IGHV4-4-ae 0.00135 0.14% 3 2
IGHV
IGHV5-51-g 0.00135 0.14% 3 3
IGHV
IGHV7-81-e 0.00135 0.14% 3 1
IGKJ
IGKJ2-f 0.00135 0.14% 3 2
IGKJ
IGKJ3-d 0.00135 0.14% 3 3
IGKJ
IGKJ4-g 0.00135 0.14% 3 3
IGKJ
IGKJ5-C 0.00135 0.14% 3 3
IGKJ
IGKJ5-b 0.00135 0.14% 3 3
IGKV
IGKVI-5-c 0.00135 0.14% 3 3
IGKV
IGKV1-9-j 0.00135 0.14% 3 3
IGKV
IGKVID-17-c 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV1D-17-b 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV1D-42-e 0.00135 0.14% 3 1
IGKV
IGKV1D-42-d 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV2D-24-b 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV2D-30-C 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV3-20-d 0.00135 0.14% 3 3
IGKV
IGKV3-20-f 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV3D-11-d 0.00135 0.14% 3 2
IGKV
IGKV4-1-r 0.00135 0.14% 3 3
IGKV
IGKV4-1-X 0.00135 0.14% 3 2
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV4-1-e 0.00135 0.14% 3 3
IGKV
IGKV4-1-0 0.00135 0.14% 3 2
IGU
IGLI6-C 0.00135 0.14% 3 2
IGU
IGU7-b 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV10-54-g 0.00135 0.14% 3 1
IGLV
IGLV11-55-h 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV11-55-f 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV1-40-g 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV1-44-f 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV1-47-f 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV2-23-e 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-12-d 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-16-d 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-19-d 0.00135 0.14% 3 1
IGLV
IGLV3-19-1 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV3-1-ag 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-1-y 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-1-S 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-1-X 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-1-ad 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV3-1-1 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-1-p 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV3-21-t 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV3-22-f 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV3-22-i 0.00135 0.14% 3 1
IGLV
IGLV3-25-e 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV5-48-t 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV5-48-S 0.00135 0.14% 3 3
IGLV
IGLV5-52-d 0.00135 0.14% 3 2
IGLV
IGLV5-52-C 0.00135 0.14% 3 1
IGLV
IGLV7-43-C 0.00135 0.14% 3 2
IGHJ
IGHJ5-d 0.0009 0.09% 2 2
IGHJ
IGHJ6-e 0.0009 0.09% 2 2
IGHJ
IGHJ6-h 0.0009 0.09% 2 2
IGHJ
IGHJ6-f 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV1-18-f 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV1-24-g 0.0009 0.09% 2 1
IGHV
IGHV1-2-i 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV1-2-m 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV1-2-I 0.0009 0.09% 2 2
z
z
%60'0 6000 0 3-frZ-eAHOI AH0I
z
z
%60'0 6000 0 M-99-OAHOI AH0I
l
z %60'0 6000 0 M-fr9-eAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 d-et^-eAHOi AH0I
z
z
%60'0 6000 0 i-ee-eAHOi AH0I
z
z
%60'0 6000 0 M-ez-eAH0i AH0I
l
z %60'0 6000 0 r-ez-eAHOi AH0I
z
z
%60'0 6000 0 LHZ-eAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 o-|-Z-eAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 P-OZ-9AH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 m-eAH0i AH0I
z
z
%60'0 6000 0 q-U-9AH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 qe-OZ-ZAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 S-OZ-ZAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 6-OZ-ZAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 O-S-ZAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 i-9Z-ZAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 M-8HAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 O-69HAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 ue-69HAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 U-69HAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 PB-69-I-AH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 iB-69-l,AH0l AH0I
l
z %60'0 6000 0 OB-69- I-AH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 1-69HAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 MB-69-I-AH0I AH0I
l
z %60'0 6000 0 6-8SHAH0I AH0I
z
z
%60'0 6000 0 u-9t?-l,AH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 B-9t7HAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 >)-9t7-PAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 UB-e-l,AH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 BB-e-i,AH0i AH0I
z
z
%60'0 6000 0 MB-e-i,AH0i AH0I
z
z
%60'0 6000 0 PB-0HAH0I AH0I
l
z %60'0 6000 0 Z-6-I-AH0I AH0I
l
z %60'0 6000 0 b-eHAH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 S-6-I-AH0I AH0I
l
z %60'0 6000 0 bB-e-l,AH0l AH0I
z
z
%60'0 6000 0 re-e-i-AH0i AH0I
z
z
%60'0 6000 0 6b-£-1,AH0I AH0I
saNoiovnaod#
sonaiMQNi# (%) ovoayd 0V03dd 31NVIdVA Odll
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGHV
IGHV3-9-0 0.0009 0.09% 2 1
IGHV
IGHV4-28-S 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-28-n 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-31-t 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-31-m 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-31-I 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-34-d 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-34-g 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-34-b 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-39-aa 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-39-S 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-39-X 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-39-p 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-4-aa 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-4-af 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-4-X 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-4-ad 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV4-4-ai 0.0009 0.09% 2 1
IGHV
IGHV5-51-d 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV5-51-k 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV5-51-C 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV6-1-a 0.0009 0.09% 2 2
IGHV
IGHV6-1-C 0.0009 0.09% 2 1
IGHV
IGHV7-81-d 0.0009 0.09% 2 2
IGKJ
IGKJ2-g 0.0009 0.09% 2 2
IGKJ
IGKJ3-b 0.0009 0.09% 2 2
IGKJ
IGKJ4-j 0.0009 0.09% 2 1
IGKJ
IGKJ4-C 0.0009 0.09% 2 2
IGKJ
IGKJ4-k 0.0009 0.09% 2 2
IGKJ
IGKJ4-h 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV1-16-d 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV1-17-e 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV1-5-d 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV1-8-h 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV1-9-i 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKVID-16-c 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV1D-16-b 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV1D-42-g 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV1D-42-f 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV1D-43-e 0.0009 0.09% 2 1
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV1D-43-d 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV1D-8-d 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV1D-8-f 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV2D-26-d 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV2D-26-f 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV2D-29-b 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV3-11-g 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV3-11-f 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV3-20-j 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV3-20-i 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV3-20-e 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV3-20-C 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV3D-11-h 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV3D-11-i 0.0009 0.09% 2 1
IGKV
IGKV3D-20-d 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV4-1-y 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV4-1-g 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV4-1-t 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV4-1-i 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV4-1-n 0.0009 0.09% 2 2
IGKV
IGKV4-1-I 0.0009 0.09% 2 2
IGU
IGU2-e 0.0009 0.09% 2 2
IGU
IGU2-c 0.0009 0.09% 2 2
IGU
IGU5-b 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV10-54-n 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV10-54-j 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV1-40-h 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV1-40-e 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV1-47-e 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV1-51-g 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-11 -j 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-11-f 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-11 -i 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-11-e 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV2-14-p 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-14-q 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV2-14-0 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV2-23-k 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-23-0 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV2-33-C 0.0009 0.09% 2 1
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGLV
IGLV3-19-j 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-19-k 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-19-h 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV3-19-i 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV3-19-p 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-1-ah 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-1-d 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-1-j 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV3-1-g 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-1-Z 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-1-ac 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-1-ae 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-21-k 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-21-r 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV3-21-i 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-22-j 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV3-22-n 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-22-m 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-22-0 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-25-g 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV3-25-I 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-27-a 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-32-C 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-9-a 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV3-9-b 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV4-3-d 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV4-60-g 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV4-60-n 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV4-60-O 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-45-g 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-48-U 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-48-q 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-48-r 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-48-n 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-48-m 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV5-48-1 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV5-52-b 0.0009 0.09% 2 1
IGLV
IGLV7-46-C 0.0009 0.09% 2 2
IGLV
IGLV9-49-C 0.0009 0.09% 2 2
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC(%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV1D-8-b 0.01785 1.79% 36 3
IGHV
IGHV3-11-a 0.01695 1.70% 36 3
IGHV
IGHV5-51-a 0.0164 1.64% 35 3
IGHV
IGHV2-5-b 0.01055 1.06% 18 3
IGLV
IGLV2-14-g 0.0104 1.04% 22 3
IGHV
IGHV7-81-b 0.01005 1.01% 21 3
IGKV
IGKV1D-42-b 0.01005 1.01% 21 3
IGKV
IGKV3-7-b 0.01 1.00% 19 3
IGHV
IGHV1-69-d 0.00995 1.00% 22 3
IGLV
IGLV2-14-e 0.00995 1.00% 19 3
IGLV
IGLV9-49-a 0.00865 0.87% 18 3
IGLV
IGLV1-44-b 0.00775 0.78% 16 2
IGLV
IGLV2-11-a 0.00775 0.78% 17 3
IGKV
IGKV3-11-d 0.0073 0.73% 14 3
IGKV
IGKV1D-43-b 0.00685 0.69% 14 3
IGHV
IGHV3-38-d 0.0064 0.64% 13 3
IGU
IGU6-a 0.00595 0.60% 13 3
IGHV
IGHV5-51-b 0.0055 0.55% 11 3
IGLV
IGLV5-45-c 0.00545 0.55% 12 2
IGHV
IGHV4-31-i 0.0054 0.54% 10 3
IGLV
IGLV1-36-c 0.00455 0.46% 10 2
Tabla 20C: Variantes encontradas en no mas de 3 poblaciones humanas y en al menos 20 individuos
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV1D-8-b 0.01785 1.79% 36 3
IGHV
IGHV3-11-a 0.01695 1.70% 36 3
IGHV
IGHV5-51-a 0.0164 1.64% 35 3
IGLV
IGLV2-14-g 0.0104 1.04% 22 3
IGHV
IGHV7-81-b 0.01005 1.01% 21 3
IGKV
IGKV1D-42-b 0.01005 1.01% 21 3
IGHV
IGHV1-69-d 0.00995 1.00% 22 3
Tabla 20D: Variantes encontradas en no mas de 3 poblaciones humanas y en al menos 30 individuos
TIPO
VARIANTE FREC.AC FREC.AC (%) #INDIVIDUOS #POBLACIONES
IGKV
IGKV1D-8-b 0.01785 1.79% 36 3
IGHV
IGHV3-11-a 0.01695 1.70% 36 3
IGHV
IGHV5-51-a 0.0164 1.64% 35 3
388
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
239
IGHJ1 ENSG00000211905 14:106331617-106331668 ENST00000390565 14:106331617-106331668
240
IGHJ2 ENSG00000211904 14:106331409-106331460 ENST00000390564 14:106331409-106331460
241
IGHJ3 ENSG00000242887 14:106330797-106330845 ENST00000463911 14:106330797-106330845
242
IGHJ4 ENSG00000240041 14:106330425-106330470 ENST00000461719 14:106330425-106330470
243
IGHJ5 ENSG00000242472 14:106330024-106330072 ENST00000488476 14:106330024-106330072
244
IGHJ6 ENSG00000211900 14:106329408-106329468 ENST00000390560 14:106329408-106329468
245
IGHV1-18 ENSG00000211945 14:106641563-106642056 ENST00000390605 14:106641952-106642056
14:106641563-106641867
246
IGHV1-2 ENSG00000211934 14:106452671-106453170 ENST00000390594 14:106453061-106453170
14:106452671-106452975
247
IGHV1-24 ENSG00000211950 14:106733144-106733639 ENST00000390610 14:106733534-106733639
14:106733144-106733448
248
IGHV1-3 ENSG00000211935 14:106471246-106471723 ENST00000390595 14:106471636-106471723
14:106471246-106471550
249
IGHV1-45 ENSG00000211961 14:106962931-106963424 ENST00000390621 14:106963321-106963424
14:106962931-106963235
250
IGHV1-46 ENSG00000211962 14:106967049-106967788 ENST00000390622 14:106967439-106967788
14:106967049-106967353
251
IGHV1-58 ENSG00000211968 14:107078373-107078869 ENST00000390628 14:107078763-107078869
14:107078373-107078677
252
IGHV1-69 ENSG00000211973 14:107169931-107170428 ENST00000390633 14:107170322-107170428
14:107169931-107170235
253
IGHV1-8 ENSG00000211939 14:106539079-106539577 ENST00000390599 14:106539470-106539577
14:106539079-106539383
254
IGHV2-26 ENSG00000211951 14:106757650-106758116 ENST00000390611 14:106758047-106758116
14:106757650-106757960
255
IGHV2-5 ENSG00000211937 14:106494135-106494597 ENST00000390597 14:106494532-106494597
14:106494135-106494445
256
IGHV2-70 ENSG00000211974 14:107178820-107179338 ENST00000390634 14:107179217-
389
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
10717933814:107178820-107179130
257
IGHV3-11 ENSG00000211941 14:106573233-106573800 ENST00000390601 14:106573635-106573800
14:106573233-106573537
258
IGHV3-13 ENSG00000211942 14:106586137-106586667 ENST00000390602 14:106586542-106586667
14:106586137-106586438
259
IGHV3-15 ENSG00000211943 14:106610313-106610852 ENST00000390603 14:106610727-106610852
14:106610313-106610623
260
IGHV3-16 ENSG00000211944 14:106621894-106622419 ENST00000390604 14:106622300-106622419
14:106621894-106622198
261
IGHV3-20 ENSG00000211946 14:106667581-106668095 ENST00000390606 14:106667988-106668095
14:106667581-106667885
262
IGHV3-21 ENSG00000211947 14:106691673-106692203 ENST00000390607 14:106692079-106692203
14:106691673-106691977
263
IGHV3-23 ENSG00000211949 14:106725201-106725733 ENST00000390609 14:106725609-106725733
14:106725201-106725505
264
IGHV3-30 ENSG00000211953 14:106791005-106791536 ENST00000390613 14:106791411-106791536
14:106791005-106791309
265
IGHV3-33 ENSG00000211955 14:106815722-106816253 ENST00000390615 14:106816128-106816253
14:106815722-106816026
266
IGHV3-35 ENSG00000211957 14:106845323-106845789 ENST00000390617 14:106845729-
10684578914:106845323-106845627
267
IGHV3-38 ENSG00000211958 14:106866406-106866934 ENST00000390618 14:106866811-106866934
14:106866406-106866707
268
IGHV3-43 ENSG00000232216 14:106926188-106926724 ENST00000434710 14:106926599-106926724
14:106926188-106926495
269
IGHV3-48 ENSG00000211964 14:106993814-106994346 ENST00000390624 14:106994222-106994346
14:106993814-106994118
270
IGHV3-49 ENSG00000211965 14:107012938-107013477 ENST00000390625 14:107013352-107013477
14:107012938-107013248
271
IGHV3-53 ENSG00000211967 14:107048672-107049341 ENST00000390627 14:107049075-
10704934114:107048672-107048973
390
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
272
IGHV3-64 ENSG00000223648 14:107113741-107114274 ENST00000454421 14:107114149-107114274
14:107113741-107114045
273
IGHV3-66 ENSG00000211972 14:107131033-107131560 ENST00000390632 14:107131436-107131560
14:107131033-107131334
274
IGHV3-7 ENSG00000211938 14:106518400-106518932 ENST00000390598 14:106518808-106518932
14:106518400-106518704
275
IGHV3-72 ENSG00000225698 14:107198932-107199471 ENST00000433072 14:107199346-
10719947114:107198932-107199242
276
IGHV3-73 ENSG00000211976 14:107210932-107211471 ENST00000390636 14:107211346-
10721147114:107210932-107211242
277
IGHV3-74 ENSG00000224650 14:107218676-107219365 ENST00000424969 14:107219084-107219365
14:107218676-107218980
278
IGHV3-9 ENSG00000211940 14:106552285-106552809 ENST00000390600 14:106552684-106552809
14:106552285-106552592
279
IGHV4-28 ENSG00000211952 14:106780513-106781017 ENST00000390612 14:106780900-106781017
14:106780513-106780817
280
IGHV4-31 ENSG00000231475 14:106805209-106805716 ENST00000438142 14:106805599-
10680571614:106805209-106805516
281
IGHV4-34 ENSG00000211956 14:106829594-106830076 ENST00000390616 14:106829979-106830076
14:106829594-106829895
282
IGHV4-39 ENSG00000211959 14:106877619-106878126 ENST00000390619 14:106878010-106878126
14:106877619-106877926
283
IGHV4-4 ENSG00000211936 14:106478110-106478603 ENST00000390596 14:106478494-106478603
14:106478110-106478411
284
IGHV4-59 ENSG00000224373 14:107081806-107083830 ENST00000390629 14:107083640-107083830
14:107083256-107083557
284
IGHV4-59 ENSG00000224373 14:107081806-107083830 ENST00000455737 14:107083640-107083725
14:107083240-107083557
14:107081806-107082728
285
IGHV4-61 ENSG00000211970 14:107095126-107095662 ENST00000390630 14:107095516-107095662
14:107095126-107095433
391
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
286
IGHV5-51 ENSG00000211966 14:107034729-107035221 ENST00000390626 14:107035117-107035221
14:107034729-107035033
287
IGHV6-1 ENSG00000211933 14:106405611-106406108 ENST00000390593 14:106406008-106406108
14:106405611-106405924
288
IGHV7-81 ENSG00000211979 14:107282792-107283280 ENST00000390639 14:107283181-107283280
14:107282792-107283096
289
IGKJ2 ENSG00000211596 2:89161037-89161074 ENST00000390241 2:89161037-89161074
290
IGKJ3 ENSG00000211595 2:89160733-89160770 ENST00000390240 2:89160733-89160770
291
IGKJ4 ENSG00000211594 2:89160398-89160434 ENST00000390239 2:89160398-89160434
292
IGKJ5 ENSG00000211593 2:89160080-89160117 ENST00000390238 2:89160080-89160117
293
IGKV1-16 ENSG00000240864 2:89399352-89399854 ENST00000479981 2:89399773-89399854 2:89399352-
89399647
294
IGKV1-17 ENSG00000240382 2:89416833-89417335 ENST00000490686 2:89417254-89417335 2:89416833-
89417128
295
IGKV1-5 ENSG00000243466 2:89246819-89247475 ENST00000496168 2:89247240-89247475 2:89246819-
89247114
296
IGKV1-6 ENSG00000239855 2:89265781-89266286 ENST00000464162 2:89266203-89266286 2:89265781-
89266076
297
IGKV1-8 ENSG00000240671 2:89291928-89292450 ENST00000495489 2:89292349-89292450 2:89291928-
89292223
298
IGKV1-9 ENSG00000241755 2:89309479-89310012 ENST00000493819 2:89309900-89310012 2:89309479-
89309774
299
IGKV1D- ENSG00000240834 2:90198535-90199190 ENST00000390276 2:90198535-90198770 2:90198895-
12
90199190
300
IGKV1D- ENSG00000241244 2:90139078-90139580 ENST00000492446 2:90139078-90139159 2:90139285-
16
90139580
301
IGKV1D- ENSG00000242766 2:90121477-90122133 ENST00000483379 2:90121477-90121712 2:90121838-
17
90122133
302
IGKV1D- ENSG00000211633 2:90229045-90229531 ENST00000390278 2:90229045-90229119 2:90229236-
42
90229531
303
IGKV1D- ENSG00000242580 2:90248739-90249395 ENST00000468879 2:90248739-90248974 2:90249100-
392
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
43 90249395
304
IGKV1D-8 ENSG00000239819 2:90259593-90260248 ENST00000471857 2:90259593-90259828 2:90259953-
90260248
305
IGKV2-24 ENSG00000241294 2:89475812-89476644 ENST00000484817 2:89476566-89476644 2:89475812-
89476122
306
IGKV2-30 ENSG00000243238 2:89544264-89545079 ENST00000468494 2:89545001-89545079 2:89544264-
89544574
307
IGKV2D- ENSG00000241566 2:90043607-90044439 ENST00000462693 2:90043607-90043685 2:90044129-
24
90044439
308
IGKV2D- ENSG00000211623 2:90024732-90025512 ENST00000390268 2:90024732-90024810 2:90025202-
26
90025512
309
IGKV2D- ENSG00000243264 2:89986322-89987079 ENST00000491977 2:89986322-89986400 2:89986769-
29
89987079
310
IGKV2D- ENSG00000239571 2:89975669-89976489 ENST00000474213 2:89975669-89975752 2:89976179-
30
89976489
311
IGKV3-11 ENSG00000241351 2:89326668-89327228 ENST00000483158 2:89327133-89327228 2:89326668-
89326963
312
IGKV3-20 ENSG00000239951 2:89442057-89442643 ENST00000492167 2:89442543-89442643 2:89442057-
89442355
313
IGKV3-7 ENSG00000243063 2:89277987-89278600 ENST00000390247 2:89278455-89278600 2:89277987-
89278285
314
IGKV3D- ENSG00000211632 2:90211643-90212253 ENST00000390277 2:90211643-90211788 2:90211958-
11
90212253
315
IGKV3D- ENSG00000224041 2:90153696-90154258 ENST00000417279 2:90153696-90153793 2:90153963-
15
90154258
316
IGKV3D- ENSG00000211625 2:90077680-90078311 ENST00000390270 2:90077680-90077825 2:90078013-
20
90078311
317
IGKV4-1 ENSG00000211598 2:89184913-89185669 ENST00000390243 2:89184913-89185136 2:89185356-
89185669
318
IGKV5-2 ENSG00000211599 2:89196748-89197300 ENST00000390244 2:89196748-89196859 2:89197005-
89197300
393
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
319
IGKV6-21 ENSG00000211611 2:89459235-89459850 ENST00000390256 2:89459741-89459850 2:89459235-
89459530
320
IGKV6D- ENSG00000225523 2:90060377-90060995 ENST00000436451 2:90060377-90060489 2:90060700-
21
90060995
321
IGKV6D- ENSG00000211626 2:90108504-90109080 ENST00000390271 2:90108504-90108578 2:90108785-
41
90109080
322
IGLI1 ENSG00000211674 22:23235872-23235998 ENST00000390320 22:23235872-23235998
323
IGU2 ENSG00000211676 22:23241661-23241835 ENST00000390322 22:23241661-23241835
324
IGU3 ENSG00000211678 22:23247030-23247205 ENST00000390324 22:23247030-23247205
325
IGLI5 ENSG00000211681 22:23256408-23256479 ENST00000390327 22:23256408-23256479
326
IGU6 ENSG00000211682 22:23260304-23260373 ENST00000390328 22:23260304-23260373
327
IGU7 ENSG00000211684 22:23263562-23263607 ENST00000390330 22:23263562-23263607
328
IGLV10- ENSG00000211642 22:22569184-22569660 ENST00000390287 22:22569184-22569242 22:22569355-
54
22569660
329
IGLV11- ENSG00000211641 22:22556057-22556600 ENST00000390286 22:22556057-22556114 22:22556233-
55
22556600
330
IGLV1-36 ENSG00000211655 22:22786296-22786802 ENST00000390301 22:22786296-22786381 22:22786497-
22786802
331
IGLV1-40 ENSG00000211653 22:22764098-22764614 ENST00000390299 22:22764098-22764194 22:22764305-
22764614
332
IGLV1-44 ENSG00000211651 22:22735135-22735715 ENST00000390297 22:22735135-22735294 22:22735410-
22735715
333
IGLV1-47 ENSG00000211648 22:22712087-22712608 ENST00000390294 22:22712087-22712188 22:22712304-
22712608
334
IGLV1-50 ENSG00000211645 22:22681658-22682172 ENST00000390291 22:22681658-22681754 22:22681865-
22682172
335
IGLV1-51 ENSG00000211644 22:22676828-22677336 ENST00000390290 22:22676828-22676909 22:22677019-
22677336
336
IGLV2-11 ENSG00000211668 22:23134980-23135496 ENST00000390314 22:23134980-23135067 22:23135185-
23135496
394
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
337
IGLV2-14 ENSG00000211666 22:23101189-23101707 ENST00000390312 22:23101189-23101275 22:23101393-
23101707
338
IGLV2-18 ENSG00000211664 22:23077095-23077584 ENST00000390310 22:23077095-23077153 22:23077270-
23077584
339
IGLV2-23 ENSG00000211660 22:23040274-23040892 ENST00000390306 22:23040274-2304048122:23040599- 23040892
340
IGLV2-33 ENSG00000211656 22:22930626-22931145 ENST00000390302 22:22930626-22930729 22:22930852-
22931145
341
IGLV2-8 ENSG00000211671 22:23165153-23165787 ENST00000390317 22:23165153-23165360 22:23165476-
23165787
342
IGLV3-1 ENSG00000211673 22:23222886-23223576 ENST00000390319 22:23222886-23222983 22:23223277-
23223576
343
IGLV3-10 ENSG00000211669 22:23154244-23154782 ENST00000390315 22:23154244-23154324 22:23154478-
23154782
344
IGLV3-12 ENSG00000211667 22:23114317-23115079 ENST00000390313 22:23114317-2311437122:23114775-
23115079
345
IGLV3-16 ENSG00000211665 22:23089870-23090398 ENST00000390311 22:23089870-23089953 22:23090108-
23090398
346
IGLV3-19 ENSG00000211663 22:23063108-23063630 ENST00000390309 22:23063108-23063193 22:23063340-
23063630
347
IGLV3-21 ENSG00000211662 22:23054174-23055688 ENST00000390308 22:23054174-23054290 22:23054770-
2305494922:23055384-23055688
348
IGLV3-22 ENSG00000211661 22:23046750-23047307 ENST00000390307 22:23046750-23046859 22:23047009-
23047307
349
IGLV3-25 ENSG00000211659 22:23029190-23029735 ENST00000390305 22:23029190-23029278 22:23029445-
23029735
350
IGLV3-27 ENSG00000211658 22:23010758-23011276 ENST00000390304 22:23010758-23010841 22:23010984-
23011276
351
IGLV3-32 ENSG00000211657 22:22936998-22937501 ENST00000390303 22:22936998-22937079 22:22937226-
22937501
352
IGLV3-9 ENSG00000211670 22:23161507-23162253 ENST00000390316 22:23161507-23161667 22:23161954-
23162253
395
SEQ
Nombre ID Gen Ensembl Localizacion aen INombre ID Transcrito Posiciones exon fNombre
ID NO
Gen cromosoma:lnicio Cr Gen (nbl- Ensembl cromosoma:lnicio Cr exon (nb)-Final Cr
asociado
Final CrGen (nb)l exon (pb)l
353
IGLV4-3 ENSG00000211672 22:23213686-23214214 ENST00000390318 22:23213686-23213763 22:23213890-
23214214
354
IGLV4-60 ENSG00000211639 22:22516592-22517074 ENST00000390284 22:22516592-22516643 22:22516765-
22517074
355
IGLV4-69 ENSG00000211637 22:22385332-22385870 ENST00000390282 22:22385332-22385440 22:22385561-
22385870
356
IGLV5-37 ENSG00000211654 22:22781876-22782371 ENST00000390300 22:22781876-22781926 22:22782049-
22782371
357
IGLV5-45 ENSG00000211650 22:22730355-22730874 ENST00000390296 22:22730355-22730428 22:22730552-
22730874
358
IGLV5-48 ENSG00000211647 22:22707289-22707781 ENST00000390293 22:22707289-22707334 22:22707459-
22707781
359
IGLV5-52 ENSG00000211643 22:22673082-22673581 ENST00000390289 22:22673082-22673132 22:22673254-
22673581
360
IGLV6-57 ENSG00000211640 22:22550113-22550686 ENST00000390285 22:22550113-22550244 22:22550370-
22550686
361
IGLV7-43 ENSG00000211652 22:22749356-22749827 ENST00000390298 22:22749356-22749435 22:22749523-
22749827
362
IGLV7-46 ENSG00000211649 22:22723982-22724454 ENST00000390295 22:22723982-2272406122:22724151 -
22724454
363
IGLV8-61 ENSG00000211638 22:22453110-22453622 ENST00000390283 22:22453110-22453216 22:22453316-
22453622
364
IGLV9-49 ENSG00000223350 22:22697539-22698084 ENST00000427632 22:22697539-2269762122:22697759-
22698084
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Referencias:
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Claims (25)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    1. Un metodo para producir una cadena pesada, un dominio VH o un anticuerpo espedficos para un antfgeno diana, en donde la cadena pesada, el dominio Vh o el anticuerpo comprenden una HCDR3 de al menos 20 aminoacidos de longitud, comprendiendo el metodo
    proporcionar un vertebrado no humano, opcionalmente un raton o una rata, que tiene un genoma que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segmento de un gen humano no reordenado JH6*02, uno o mas segmentos del gen VH y uno o mas segmentos del gen D aguas arriba de una region constante; en donde los segmentos de genes en el locus de la cadena pesada estan conectados operablemente a la region constante de la misma de manera que el vertebrado es capaz de producir una cadena pesada de anticuerpo producida mediante recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D humano y un segmento de VH humano,
    en donde el segmento del gen JH6*02 comprende la siguiente secuencia de nucleotidos:
    ATTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAG, y
    en donde el vertebrado ha sido inmunizado con el antfgeno diana y produce una cadena pesada de anticuerpo espedfica para el antfgeno diana en donde el dominio variable de la cadena pesada es el producto de la recombinacion entre un VH, D y JH6*02 humanos y en donde la longitud de la HCDR3 es de al menos 20 aminoacidos, y
    aislar del vertebrado no humano la cadena pesada, el dominio VH o un anticuerpo espedficos para el antfgeno diana o una celula productora de la cadena pesada, el dominio VH o el anticuerpo, en donde la cadena pesada, el dominio VH o el anticuerpo comprenden una HCDR3 que deriva de la recombinacion de JH6*02 humano con un segmento del gen VH humano y un segmento del gen D humano,
    opcionalmente en donde la region constante del locus es una region constante del vertebrado no humano (p. ej., raton o rata), y la region constante no humana de la cadena pesada aislada o el anticuerpo es remplazada por una region constante humana.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende aislar una cadena pesada, un dominio VH o un anticuerpo, en donde la longitud de la HCDR3 es de al menos 20 aminoacidos.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, que comprende aislar una celula B o un hibridoma que expresan un dominio VH de una cadena pesada que es identico al dominio VH de la cadena pesada de la reivindicacion 2.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la region constante es de raton o rata.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9; D4-17; D3-10; D2-2; D5-24; D6-19; D3-22; D6-13; D5-12; D1-26; D1-20; D5-18; D3-16; D2-21; D1-14; D7-27; D1-1; D6-25; D2-14; y D4-23, opcionalmente en donde el locus comprende uno, mas o todos los segmentos del gen D humano D3-9, D3-10, D6-19, D4-17, D6-13, D3-22, D2-2, D2-25 y D3-3.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1 o 5, en donde i) el JH6*02 es el unico segmento de gen de tipo JH6 en el genoma o ii) el JH6*02 es el segmento del gen JH mas proximo a la region constante en el locus.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, 5 o 6, en donde el locus comprende una pluralidad de segmentos del gen D humano y el JH6*02 es una configuracion de la lmea germinal humana con respecto al segmento del gen D humano mas 3'.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, 5, 6 o 7, en donde el locus comprende uno, mas o todos los segmentos de genes humanos seleccionados entre V3-21, V3-13, V3-7, V6-1, V1-8, V1-2, V7-4-1, V1-3, V1-18, V4-4, V3-9, V3-23, V3-11, V3-20, D3-9*01, D3-10*01, D6-19*01, D6-13*01, D1-26*01, IGHV1-8*01, IGHV4-61*01, IGHV6-1*01, IGHV4-4*02, IGHV1-3*01, IGHV3-66*03, IGHV3-7*01 e IGHV3-9*01.
  9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 8, en donde la cadena pesada de anticuerpo es un producto de la recombinacion de JH6*02 con un segmento del gen VH humano expuesto en la reivindicacion 8 y/o un segmento del gen D expuesto en la reivindicacion 5.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9, en donde todos los segmentos de genes de la region variable de la cadena pesada del vertebrado no humano endogenos se han inactivado en el genoma y/o en donde el genoma es homocigoto para dicho locus de la cadena pesada.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el vertebrado es un raton que comprende los segmentos de genes de cadena pesada funcionales VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VHI-3, VHI-2, VH6-1, D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D4-11, D5-12, D6-13, D1-14, D2-15, D3-16, D4-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D3-22, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, D7-27, JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 y JH6, en orden 5' a 3',
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    en donde JH6 es la variante JH6*02 humana,
    en donde la insercion del ADN humano se realiza entre las posiciones 114666435 y 114666436 en el cromosoma 12 de raton;
    en donde los segmentos de genes de la cadena pesada funcionales humanos VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7 se insertan aguas arriba de VH2-5;
    en donde los segmentos de genes VH, D y JH de raton se conservan en el locus, inmediatamente aguas arriba (5' con respecto a) el ADN de cadena pesada humana insertado;
    y en donde los segmentos de VH, D y J de raton se invierten para inactivarlos, produciendo de ese modo ratones en los que solamente los segmentos de genes de la region variable de la cadena pesada humana son activos.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11 que comprende adicionalmente VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, y VH3-15 insertados aguas arriba (5') con respecto al VH mas 5'.
  13. 13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde
    (i) el antfgeno diana es un antfgeno de un patogeno de una enfermedad infecciosa;
    (ii) el antfgeno diana es un receptor, y la cadena pesada del anticuerpo se une espedficamente a una hendidura del receptor; o
    (iii) el antfgeno diana es una enzima, y la cadena pesada del anticuerpo se une espedficamente al sitio activo de la enzima.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en donde el antfgeno diana es un antfgeno de un patogeno bacteriano o viral.
  15. 15. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende eliminar los linfocitos B del vertebrado y seleccionar uno o mas linfocitos B que expresen anticuerpos que se unan al antfgeno, opcionalmente inmortalizando dichos linfocitos B seleccionados o progenie de los mismos, opcionalmente produciendo hibridomas a partir de los mismos, y aislando un anticuerpo expresado por los linfocitos B.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 15, que comprende adicionalmente aislar de dichos linfocitos B el acido nucleico que codifica dicho anticuerpo.
  17. 17. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en donde la region constante del locus es una region constante de un vertebrado no humano (p. ej., raton o rata), y el metodo comprende adicionalmente remplazar la region constante no humana de la cadena pesada o el anticuerpo por una region constante humana.
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 16, que comprende adicionalmente intercambiar la secuencia de nucleotidos de la region constante de la cadena pesada del anticuerpo por una secuencia de nucleotidos que codifica una region constante de la cadena pesada humana o humanizada, y opcionalmente madurar la afinidad de la region variable de dicho anticuerpo.
  19. 19. El metodo de la reivindicacion 16 o la reivindicacion 18, que comprende adicionalmente insertar dicho acido nucleico en un vector de expresion y opcionalmente una celula anfitriona.
  20. 20. El metodo de la reivindicacion 19, que comprende expresar la cadena pesada, el dominio VH o el anticuerpo a partir de la celula anfitriona y proporcionar una cadena pesada, dominio VH o anticuerpo aislados.
  21. 21. El uso de JH6*02 humano para generar una HCDR3 de al menos 20 aminoacidos en un vertebrado no humano cuyo genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende el segmento del gen humano JH6*02, uno o mas segmentos del gen VH humano y uno o mas segmentos del gen D humano aguas arriba de una region constante; en donde los segmentos de genes en el locus de la cadena pesada estan conectados operablemente a la region constante de la misma de manera que el vertebrado es capaz de producir una cadena pesada de anticuerpo producida mediante recombinacion de JH6*02 humano con un segmento de D humano y un segmento de VH humano y en donde el segmento del gen JH6*02 comprende la siguiente secuencia de nucleotidos: ATTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAG.
  22. 22. El uso de acuerdo con la reivindicacion 21, en donde la cadena pesada del anticuerpo se une espedficamente a un antfgeno diana.
  23. 23. El uso de la reivindicacion 21, en donde el vertebrado se inmuniza con un antfgeno diana.
  24. 24. El uso de la reivindicacion 21, en donde el vertebrado comprende un Ej y un S|j de raton en el locus de la cadena pesada entre JH6*02 y la region constante.
  25. 25. El uso de la reivindicacion 21, en donde Ej y Sj son Ej y Sj de un genoma derivado de raton 129 o de un genoma derivado de raton C57BL/6.
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