CN101076542A

CN101076542A - 特异性针对肝细胞癌和其他癌的抗体及其用途

Info

Publication number: CN101076542A
Application number: CNA2005800305418A
Authority: CN
Inventors: V·巴特瑞; D·S·威尔森
Original assignee: Ivo Nicks Zhan Ltd By Share Ltd; Evogenix Inc
Current assignee: Ivo Nicks Zhan Ltd By Share Ltd; Arana Therapeutics Inc
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2007-11-21
Also published as: WO2006029459A1

Abstract

提供了抗体、人源化抗体、超人源化^TM抗体、表面重建抗体、抗体片段、衍生抗体和所述抗体带有或不带有细胞毒剂的缀合物，它们都特异性结合肝细胞癌和其他癌的细胞并减少所述靶细胞的存活。所述抗体及其片段可用于对例如肝细胞癌等的抗原表达水平升高的肿瘤患者的治疗。

Description

特异性针对肝细胞癌和其他癌的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及与CD147结合的抗体和抗体片段，以及它们用于治疗表达CD147的癌细胞的用途。更具体而言，本发明涉及非人类抗体和抗体片段，它们经过了突变从而降低了它们在人体内的免疫原性。

背景技术

原发性肝癌——肝细胞癌(HCC)——是全世界第四常见的癌症类型，每年大约造成130万人死亡(Venook，2000)。死亡例数少则在美国每年有一万七千例，多则在中国每年超过二十五万例。由于目前约有四百万美国人感染流行性丙型肝炎，所以预计在未来的10-20年，在美国的死亡例数会急剧增加。由于HCC通常在其晚期才能被检出，所以它是最具致死性的癌症形式之一，患者在初始症状出现后平均只能存活3-4个月。因此急需新型的疗法。

虽然外科手术切除是目前的首选治疗手段，但是由于例如转移或者肝硬变等因素，仅有不到10％的患者适于治疗性的切除(为综述可参见Alsowmely & Hodgson)。一些方法显示可以缩小肿瘤以使肿瘤可以被切除，例如于经动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolisation)、化疗和放疗的结合、化疗药物灌注并进行肝动脉结扎、放射免疫疗法等(Lau，2002)。但是这些疗法仅对一小部分患者有显著效果。

HCC是已知对化疗药物抵抗性最强的肿瘤类型之一(Alsowmely &Hodgson，2002)。许多药物已被研究出并投入使用，包括5-氟尿嘧啶、多柔比星、米托蒽醌、顺铂和依托泊苷。然而全身性化疗几乎显示不出临床效果，而且所有这些疗法都伴随明显的毒性。目前还没有通过FDA认证的专门针对HCC的药物。

正在开发一些用于HCC疗法的与毒素或放射性同位素缀合的HCC特异性抗体，这些抗体包括：

抗体	抗原	状态	参考文献
抗体	抗原	状态	参考文献	Mab-白喉毒素	290kD	在豚鼠模型中有活性	Bernhard et al.，1983
Mab-相思豆毒蛋白A链	未知	在豚鼠模型中有活性	Hwang et al.，1984	Mab-白喉毒素	290kD	在豚鼠模型中有活性	Bernhard et al.，1983
Mab-相思豆毒蛋白A链	未知	在豚鼠模型中有活性	Hwang et al.，1984	Mab 336	30kD	在体外有活性	Stein et al.，1991
HEPAMA-1	43kD	在体外有活性	Fuhrer et al.，1991	Mab 336	30kD	在体外有活性	Stein et al.，1991
HEPAMA-1	43kD	在体外有活性	Fuhrer et al.，1991	HEPAMA-1-天花粉蛋白		在体外有活性	Wang et al.，1991
¹³¹I-HEPAMA-1		II期试验	Zeng et al.，1998	HEPAMA-1-天花粉蛋白		在体外有活性	Wang et al.，1991
¹³¹I-HEPAMA-1		II期试验	Zeng et al.，1998	Fab’-平阳霉素	未知	在动物模型中有活性	Liu et al.，2001
Hab 18F(ab’)2-葡萄球菌肠毒素A(staphenterotoxin A)	CD147	在体外III期试验中有活性	Yang et al.，2001	Fab’-平阳霉素	未知	在动物模型中有活性	Liu et al.，2001

称作Hab18的鼠类抗体是通过用人HCC组织免疫小鼠而产生的(Chen，1992)。在证实了该抗体的肿瘤特异性后，用表达克隆的方法(Chen，et al.，1999)鉴定该抗原为细胞表面蛋白CD147(亦被称为Hab18G、basigin、EMMPRIN、neurothelin、5A11、CE9、HT7、M6、OX-47或gp42)。其他描述该抗体的文章包括：Xing et al.(2003)、Liu et al.(2003)、Li et al.(2002)、Lou et al.(2002)、Yang et al.(2001)、Bian et al.(2000)、Qiu et al.(1998)、Sui et al.(1998)、Sui etal.(1996)、Sui(1992)和Ji(1991)。

正在开发的用于HCC疗法的最先进的HCC特异性抗体之一是¹³¹I--Hab18缀合抗体，它是特异性结合HCC细胞的放射性碘化小鼠单克隆抗体片段。通过蛋白水解方法将鼠类Hab18抗体处理为F(ab)’₂片段，再进行放射性标记并将其给予携带人HCC肿瘤的小鼠(Lou et al.，2002；Bian et al.，2000；Qiu et al.，1998)。上述研究表明在这种动物模型中肿瘤明显被吸收，并证实了使用这种抗体(具体而言为F(ab)’₂片段)的被标记形式用于人类治疗的手段的有效性。还制备了该抗体与葡萄球菌肠毒素A融合的形式，显示该形式可有效地杀死HCC细胞(Yanget al.，2001)。

Hab18的靶标CD147是已知表达最广泛的癌症抗原之一。其功能并未完全清楚，但是其在癌症中最相关的作用似乎是增加基质金属蛋白(MMP)的表达，基质金属蛋白参与基底膜的降解，基底膜的降解是肿瘤细胞游离出来并转移至新部位的必要步骤。人CD147的氨基酸序列示于SEQ ID NO：70。CD147由269个氨基酸组成，具有由两个C2型免疫球蛋白环和三个Asn连接的寡糖组成的187个氨基酸的一个胞外结构域、一个24个氨基酸的跨膜结构域、一个短的单跨膜结构域和一个39个氨基酸的胞质结构域。第一个免疫球蛋白结构域是参与MMP诱导和寡聚化的反受体活性所需要的。第二个免疫球蛋白结构域是与导致细胞表面上自联作用降低的窖蛋白-1的连接所需要的。

基底膜通过基质金属蛋白酶的降解是包括肿瘤血管发生、肿瘤生长、局部侵袭和后续的远距离转移的肿瘤疾病进程的多个时期中的最关键步骤之一(Nelson et al.，2000；Fang et al.，2000；Bergers et al.，2000)。MMP是一个包括25个以上的金属依赖内肽酶的家族，这些内肽酶都有一个共同的模块结构域结构。MMP在肿瘤局部环境中过多地产生。这些酶能共同裂解实质和血管基底膜的所有胞外基质成分，实质和血管基底膜通常是肿瘤细胞迁移和侵袭的机械屏障。高水平的MMP与体内和体外肿瘤侵袭能力增加相关(Gilles et al.，1994；Gilles et al.，1996)。MMP与其内源性抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的产生的不平衡导致肿瘤的血管发生和转移(Fang et al.，2000；Bergers etal.，2000；Lokeshwar et al.，1993；Powell et al.，1993；Wood etal.，1997；Sehgal et al.，1998；Kuniyasu et al.，2000)。

由于CD147可增加MMP的表达，它又被称为胞外基质金属蛋白酶诱导剂(EMMPRIN)(Guo et al.，1997；Lim et al.，1998)。EMMPRIN最初从癌细胞质膜中以糖蛋白的形式被纯化，该糖蛋白的分子量为58000，约一半的质量由碳水化合物形成。由于它能够刺激成纤维细胞合成胶原酶-1(MMP-1)，它曾被命名为肿瘤胶原酶刺激因子(TCSF)(Biswas etal.，1995；Ellis et al.，1989)。后来的研究证实EMMPRIN还诱导成纤维细胞合成MMP-2、MMP-3，以及膜1型MMP(MT1-MMP)和MT2-MMP，MT1-MMP和MT2-MMP起MMP-2内源性激活剂的作用(Guo et al.，1997；Kataoka et al.，1993；Sameshima et al.，2000)。

因此，EMMPRIN在肿瘤局部环境中起MMP产生的上游调节因子的作用。EMMPRIN阳性肿瘤细胞刺激周围的成纤维细胞表达MMP，由此促进肿瘤侵袭和转移。

一些临床研究表明，EMMPRIN在肿瘤区室中的表达水平比肿瘤周围间质组织的高。这些肿瘤包括发源于肺(Polette et al.，1997)、乳房(Polette et al.，1997)、膀胱(Muraoka et al.，1993；Javadpour& Guirguis 1992)和神经胶质瘤(Sameshima et al.，2000a)的肿瘤。

通过对从癌症患者骨髓中分离的个体癌细胞的转录组分析和比较基因组杂交技术，显示EMMPRIN是在原发性肿瘤和微转移细胞中表达最频繁的蛋白质(Klein et al.，2002)，说明它在肿瘤发展和早期转移中起中心作用。

使用重组EMMPRIN或从肿瘤细胞中纯化的天然EMMPRIN进行的体外试验研究了EMMPRIN在肿瘤细胞中表达增加的生物学意义。显示EMMPRIN刺激由成纤维细胞产生的各种MMP的表达(Guo et al.，1997；Lim et al.，1998)。这种诱导发生于转录水平并且至少部分地由促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38激酶信号传导途径介导(Lim et al.，1998)。使用EMMPRIN过表达人乳腺癌细胞直接说明了EMMPRIN在肿瘤生长和转移中的作用。MDA MB 463细胞植入裸小鼠时为正常缓慢生长的细胞。然而当这些细胞用EMMPRIN转染后，它们变为生长速度和转移表型均加快的更具侵入性的生长形式(Zucker et al.，2001)。CD147还显示具有同型粘附特性，目前还不清楚这一特性与其MMP诱导活性如何关联及关联程度。

CD147还在激活的T细胞和B细胞以及刺激它们的其它附属细胞中表达(Deeg et al.，2001)。因此有建议用靶向该抗原的抗体手段减弱对外源组织移入的免疫反应。急性移植物抗宿主疾病(GVHD)是异基因造血干细胞移植(HSCT)的主要并发症。GVHD是由将受体组织识别为外源的供体T细胞引发的。产生的细胞激活和细胞因子的释放导致宿主组织的破坏和GVHD。尽管对GVHD有体内药物预防，但是还是有多达30％(人类白细胞抗原[HLA]相同的供体)至75％(不相关供体)的移植受体发生需要进行其他治疗的急性GVHD。急性GVHD初期治疗的标准为甲泼尼龙。初期诊断为更严重疾病的患者中通常发生类固醇抗性GVHD。

抗CD147抗体ABX-CBL为一种鼠类免疫球蛋白M(IgM)，其描述于公布号为WO 99/45031(Abgenix Inc.)的PCT申请中。在体外激活的T细胞和B细胞可被ABX-CBL杀死，而静息淋巴细胞不受影响。ABX-CBL在体外通过补体依赖细胞毒性机制杀死单核细胞、树突细胞和激活的淋巴细胞，从而抑制混合淋巴细胞反应。在公布的I期/II期试验(Deeg etal.，2001)中，27个类固醇抵抗的急性GVHD患者以每天0.01(认为无效果的剂量)、0.1、0.2或0.3mg/kg的剂量接受ABX-CBL，另外还有32个患者被给予每天0.2或0.15mg/kg的ABX-CBL。所有的患者都经过异基因移植并接受了GVHD预防。在51名可进行有效性评估的患者中，有26人(51％)有反应，其中13人有完全反应(CR)，13人有部分反应(PR)。CR持续14天或以上的患者或PR持续7天或以上的患者共21人(41％；8人CR，13人PR)。肌痛(肌肉疼痛)为剂量限制性的，消退后没有后遗症，并且可通过麻醉剂的预治疗控制。在ABX-CBL疗法开始后的6个月，仍有26名(44％)患者存活。

Hab18抗体描述于公布号为2005/0176933(Chen Zhinan et al.)的美国专利申请中。其它已知的抗CD147的抗体述于下表：

1996年11月10日至14日在日本神户召开的第六届国际人类白细胞分化抗原协作组会议上新指定的CD147特异性Mab。

名称(协作组号)	来源或参考文献
名称(协作组号)	来源或参考文献	AAA6	Walter Knapp，Vienna；Kasinrerk et al.，1992.
UM-8D6	David A.Fox，Michigan	AAA6	Walter Knapp，Vienna；Kasinrerk et al.，1992.
UM-8D6	David A.Fox，Michigan	HI197	De-Cheng Shen，Tianjin
HIM6	De-Cheng Shen，Tianjin	HI197	De-Cheng Shen，Tianjin
HIM6	De-Cheng Shen，Tianjin	H84	Kimitaka Sagawa，Kurume

其它CD147特异性参照抗体的选择

名称(协作组号)	来源或参考文献
名称(协作组号)	来源或参考文献	132	Walter Knapp，Vienna
MEM-M6/1	Vaclav Horejsi，Prague	132	Walter Knapp，Vienna
MEM-M6/1	Vaclav Horejsi，Prague	MEM-M6/10	Vaclav Horejsi，Prague

目前本领域仍然需要对癌症特别是原发性肝癌有效的治疗方法。

发明内容

发明人发现，靶向CD147的非人类抗体或抗体片段在该抗体或抗体片段的可变区被突变以降低其对人类的免疫原性时，可作为用于治疗人类癌症的潜在可用的药物。

因此，在第一方面，本发明提供一种含有可变区的非人类抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段特异性结合CD147，其中所述可变区被突变以降低所述抗体或抗体片段在人体中的免疫原性。

本发明的抗体或抗体片段提供了治疗癌症特别是肝癌的潜在可用的新方法，该方法可避免目前的抗体治疗带来的不期望的副作用。

在第二方面，本发明提供一种缀合物，其包括与细胞毒剂相连接的第一方面的抗体或抗体片段。

在第三方面，本发明提供一种药物组合物，其包括一种可药用的载体和第一方面的抗体或抗体片段或第二方面的缀合物。

在另一方面，本发明提供一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括将癌细胞与根据第一方面的抗体或抗体片段、根据第二方面的缀合物或根据第三方面的药物组合物接触。

在另一方面，本发明提供一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括给予患者有效量的根据第一方面的抗体或抗体片段、根据第二方面的缀合物或根据第三方面的药物组合物。

在另一方面，本发明提供一种诊断疑似患有癌症的受试者的方法，所述方法包括给予受试者一种缀合物，所述缀合物包括与可在受试者体内被检出的标记相连接的根据第一方面的抗体或抗体片段。

在另一方面，本发明提供一种特异性结合CD147的改进的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段由下述方法制备：(a)提供编码抗体或其片段的DNA，所述DNA包括选自SEQ ID NO：1至69的至少一段序列；(b)在所述DNA中引入至少一处核苷酸突变、缺失或插入，以使得由所述DNA编码的所述抗体或抗体片段的氨基酸序列被改变；(c)表达所述抗体或抗体片段；以及(d)筛选具有所述改进的所述表达的抗体或抗体片段，由此制得所述改进的抗体或抗体片段。

在另一方面，本发明提供一种结合CD147的抗体或抗体片段，其中所述重链可变区为SEQ ID NO：7的突变形式，在重链可变区中含有1至20个之间的突变，这使得其与天然人类重链的氨基酸序列的同一性比SEQ ID NO：7所示重链可变区序列的更高。

在另一方面，本发明提供一种人源化抗体重链，所述重链包括一个或多个来源于鼠类抗体Hab18重链的CDR，还包括一个来源于人类抗体可变重链的框架序列，所述人类抗体可变重链具有1型正则结构(canonical structure)的CDR1和根据Kabat抗体编号系统长度为19的CDR2。

在另一方面，本发明提供一种人源化抗体重链，所述重链包括一个或多个来源于鼠类抗体Hab18重链的CDR，还包括一个来源于人类抗体可变重链的框架序列，所述人类抗体可变重链具有1型正则结构的CDR1和3型正则结构的CDR2。

在另一方面，本发明提供一种人源化抗体轻链，所述轻链包括一个或多个来源于鼠类抗体Hab18轻链的CDR，还包括一个来源于人类抗体可变轻链的框架序列，所述人类抗体可变轻链具有2型正则结构的CDR1、1型正则结构的CDR2和1型正则结构的CDR3。

在另一方面，本发明提供编码根据本发明各方面的抗体或抗体片段的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的载体。

附图说明

图1：(i)显示Hab18抗体重链V区域与具有1型(对CDR1)和4型(对CDR2)正则结构的人类种系可变外显子的比对。(ii)显示Hab18抗体CDR3与人JH序列的比对。(iii)显示具有1型(对CDR1)和4型或“类4型”(对CDR2)正则结构的人类种系可变外显子根据与Hab18重链V区域在CDR区域的同源性的评分。(iv)显示三种人源化Hab18重链可变区序列(h3-72*01、h3-49*01和h3-73*01)与Hab18鼠类可变区重链序列的比对。

图2：显示Hab18重链可变区序列与具有1型(对CDR1)和3型(对CDR2)正则结构的人类种系V外显子序列的比对。

图3：(i)显示Hab18抗体轻链V区域与具有2型(对CDR1)、1型(对CDR2)和1型(对CDR3)正则结构的人类种系可变外显子的比对。(ii)显示具有2型(对CDR1)、1型(对CDR2)和1型(对CDR3)正则结构的人类种系可变外显子根据与Hab18抗体轻链V区域的同源性的评分。(iii)显示Hab18可变区轻链CDR3/J区域与人类种系Jκ(JK)区域的比对。(iv)显示两种人源化Hab18轻链(h1-6*01和h3-11*01)与Hab18轻链可变区的比对。

图4：显示用于超人源化^TMscFv抗体的表达的载体构建体，其中：La cP＝乳糖启动子；Ld＝夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarnosequence)+起始ATG+前导序列；Vheavy＝重链可变域；Vlight＝轻链可变域；Fl＝Flag标记＝DYKDDDDK；6H＝HHHHHH；T＝框架内终止密码子(*)；Amp抗性＝编码抗生素抗性的基因；OR＝复制起点。

图5：显示ELISA结果，表明基于Hab18的人源化抗CD147抗体的特异性结合。

序列表说明

SEQ ID NO：1：鼠类Hab18的重链的CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2：鼠类Hab18的重链的CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3：鼠类Hab18的重链的CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4：鼠类Hab18的轻链的CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5：鼠类Hab18的轻链的CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6：鼠类Hab18的轻链的CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7：鼠类Hab18的重链的V区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8：人类种系的可变区3-15*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9：人类种系的可变区3-15*03的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10：人类种系的可变区3-49*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11：人类种系的可变区3-72*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12：人类种系的可变区3-73*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13：Hab18的CDR3/JH区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14：人类种系的JH区域(JH1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15：人类种系的JH区域(JH2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16：人类种系的JH区域(JH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17：人类种系的JH区域(JH4)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18：人类种系的JH区域(JH5)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19：人类种系的JH区域(JH6)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20：基于全部3个鼠类CDR和人类种系可变区序列3-72*01/JH2的人源化Hab18重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21：基于全部3个鼠类CDR和人类种系可变区序列h3-49*01/JH2的人源化Hab18重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22：基于全部3个鼠类CDR和人类种系可变区序列h3-73*01/JH1的人源化Hab18重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23：人类种系可变区1-2*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24：人类种系可变区1-2*02的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25：人类种系可变区1-3*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26：人类种系可变区1-Q*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27：人类种系可变区1-46*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28：人类种系可变区1-58*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29：人类种系可变区3-07*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30：人类种系可变区3-09*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31：人类种系可变区3-11*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32：人类种系可变区3-20*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33：人类种系可变区3-21*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34：人类种系可变区3-23*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：35：人类种系可变区3-23*02的氨基酸序列。

SEQ ID NO：36：人类种系可变区3-30*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：37：人类种系可变区3-30*02的氨基酸序列。

SEQ ID NO：38：人类种系可变区3-30*06的氨基酸序列。

SEQ ID NO：39：人类种系可变区3-30*18的氨基酸序列。

SEQ ID NO：40：人类种系可变区3-30-3*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：41：人类种系可变区3-33*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42：人类种系可变区3-43*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43：人类种系可变区3-48*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：44：人类种系可变区3-48*03的氨基酸序列。

SEQ ID NO：45：人类种系可变区3-64*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：46：人类种系可变区3-74*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47：鼠类Hab18的轻链V区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：48：人类种系可变区1-6*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：49：人类种系可变区1-9*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：50：人类种系可变区1-12*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：51：人类种系可变区1D-16*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：52：人类种系可变区1D-16*02的氨基酸序列。

SEQ ID NO：53：人类种系可变区1-17*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：54：人类种系可变区1-33*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：55：人类种系可变区1-39*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：56：人类种系可变区1D-43*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57：人类种系可变区3-11*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：58：人类种系可变区3-11*02的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59：人类种系可变区3-15*01的氨基酸序列。

SEQ ID NO：60：鼠类Hab18的轻链CDR3/J区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61：人类种系的Jκ区域JK1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：62：人类种系的Jκ区域JK2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63：人类种系的Jκ区域JK3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：64：人类种系的Jκ区域JK4的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65：人类种系的Jκ区域JK5的氨基酸序列。

SEQ ID NO：66：基于人类可变(κ)区轻链序列h1-6*01/JK3的Hab18的人源化可变区轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO：67：基于人类可变(κ)区轻链序列h3-11*01/JK3的Hab18的人源化可变区轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO：68：基于重链SEQ ID NO：20和轻链SEQ ID NO：66的超人源化^TM抗体scFv片段scFv-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：69：基于重链SEQ ID NO：20和轻链SEQ ID NO：67的超人源化^TM抗体scFv片段scFv-2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：70：CD147的氨基酸序列。

具体实施方式

在下文的描述中提到了多种出版物，这些出版物可帮助本领域普通技术人员最大限度的理解和实施本发明。因此，在下文描述中所引用的每一篇参考文献的全部内容都以援引的方式纳入本文。

本说明书中包括的所有文件、行为、材料、装置、文章等的讨论，都仅仅是出于为本发明提供背景的目的。并不应看作承认上述事物中的任一项或全部就如本申请每项权利要求的优先权日之前的状况一样构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识。

定义

“成熟抗体基因”为编码免疫球蛋白的基因序列，所述免疫球蛋白表达于例如下列的经过成熟过程以至于表达特定免疫球蛋白的细胞中：例如B细胞等的淋巴细胞、杂交瘤细胞或任何生产抗体的细胞。该术语包括编码上述成熟基因的成熟基因组、cDNA或其它核酸序列，这些基因是为在其它细胞类型中表达而被分离和/或被基因工程重组改造的。成熟抗体基因经过各种突变和重排，这些突变和重排使得它们在结构上与除淋巴细胞外的所有其它细胞中编码的抗体基因不同。在人类、啮齿类和其它许多哺乳动物中的成熟抗体基因是通过下述方式形成的：通过V和J基因片段的融合形成抗体轻链，通过V、D和J基因片段的融合形成抗体重链。许多成熟抗体基因需要在融合后进行点突变，一些这样的点突变增加了抗体蛋白质对特异性抗原的亲和性。

“种系抗体基因”或基因片段为非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞没有经过为了特定免疫球蛋白的表达导致基因重排和突变的成熟过程。由本发明的各个实施方案提供的有利之处之一来自以下认识：种系抗体基因与成熟抗体基因相比更倾向于保留动物种类个体的必需的氨基酸序列结构特性，因此当其用于治疗该物种时比较不易被识别为外源物。

“CDR”为抗体可变序列内的互补决定区域。在可变重链和可变轻链每条链的序列中有三个CDR，对于每个可变区分别命名为CDR1、CDR2和CDR 3。根据不同的系统认定的这些CDR的精确边界会有所不同，但是它们均具有在可变序列范围内在组成所谓“高变区”处重叠的残基。由Kabat et al.(1991)和Wu and Kabat(1970)描述的系统不但提供了可用于抗体任意可变区的明确的残基编号系统，还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia et al.(1987)；Chothia et al.(1992)；Tomlinson et al.(1995))发现Kabat CDR中的某些亚区域虽然在氨基酸序列水平上差异很大，但是却具有几乎相同的肽主链构象。这些亚区域被命名为L1、L2和L3或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别代表轻链和重链区域。这些区域可被称为Chothia CDR，其边界与Kabat CDR重叠。表1示出了根据Kabat残基编号系统Chothia CDR和Kabat CDR的重叠。

表1 根据Kabat残基编号系统Chothia CDR和Kabat CDR的重叠

链	CDR	Kabat	Chothia
链	CDR	Kabat	Chothia	轻链	CDR1	24-34	26-32
轻链	CDR2	50-56	50-52	轻链	CDR1	24-34	26-32
轻链	CDR2	50-56	50-52	轻链	CDR3	89-96	91-96
重链	CDR1	31-35	26-32	轻链	CDR3	89-96	91-96
重链	CDR1	31-35	26-32	重链	CDR2	50-65	52-56
重链	CDR 3	95-102	无唯一定义	重链	CDR2	50-65	52-56

其它的与Kabat CDR重叠的定义CDR的边界描述于Padlan et al.(1995)或MacCallum et al.(1996)。还有其它与上述系统均不完全相同的CDR边界定义，虽然它们与Kabat CDR可能有重叠，但是它们却可能根据预言或试验的发现被缩短或延长，所述预言或试验发现为特定残基或残基簇或甚至整个CDR都不会显著影响抗原结合。根据任何这些系统定义的CDR都可应用于本文所用的方法，但是优选的实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。

“框架”或“框架序列”为可变区除去CDR后剩下的序列。因为CDR序列的精确定义可由不同系统确定，所以框架序列的含义也相应的有不同的解释。为明确本文使用的含义，框架序列意为在抗体可变区内除了定义为CDR序列之外的那些序列，这样框架的精确序列就仅仅取决于CDR如何定义。例如，本文提供的方法中所使用的CDR通常为被认为是Kabat CDR的一个亚群，但是例如对于重链的CDR1，也包括在Kabat系统中被分类为框架残基的残基。

“CDR正则结构型”是由Chothia命名的结构类型(Chothia et al.(1987)；Chothia et al.(1992)；Toml inson et al.(1995))。Chothia及其同事发现，许多抗体的CDR的关键部分虽然在氨基酸序列水平上差异很大，但是却具有几乎相同的肽主链构象。因此，Chothia对每条链的每个CDR定义了一个或几个“正则结构”。每种正则结构主要具体指一组肽主链的扭转角从而使连续的一段氨基酸残基形成一个环。Chothia定义的CDR正则结构型列于表2。

表2 Chothia定义的CDR正则结构型

链	CDR	正则结构型
链	CDR	正则结构型	κ	CDR1	1-6
κ	CDR2	1	κ	CDR1	1-6
κ	CDR2	1	κ	CDR3	1-6
重链	CDR1	1-3	κ	CDR3	1-6
重链	CDR1	1-3	重链	CDR2	1-4
λ	CDR1	1-4	重链	CDR2	1-4
λ	CDR1	1-4	λ	CDR2	1
λ	CDR3	1-2	λ	CDR2	1

“对应的CDR”相对地指两个不同的可变序列间的CDR，它们在这两个不同的可变序列中的位置是相互对应的。因此，例如小鼠轻链CDR1对应人类轻链CDR1，反之亦然，因为不论CDR的真实边界是否按Kabat系统、Chothia系统或其他系统定义，每一个CDR都对应Kabat编号系统中的确定位置。类似地，“对应的”残基、序列或氨基酸也相对地指由Kabat编号系统规定的两个不同肽序列间的残基位置。

“基本相同”这一术语在应用于氨基酸序列时在本文中定义为一个序列与另一个氨基酸序列有至少约90％、更优选地有至少约95％的序列同一性，所述同一性是通过根据Pearson和Lipman(1988)的FASTA搜索方法测定的。

“非人类抗体”可来自任何来源。优选的它们来源于哺乳动物。更优选地它们来源于鼠类。非人类抗体具有对CD147的结合特异性。如果一种抗体对CD147的结合常数至少为10⁵M^-1，并且比它对大多数其它蛋白的亲和常数高至少10倍，该抗体被认为是具有CD147的结合特异性；更优选地，它对CD147的结合常数至少为10⁶M^-1并且比它对其它大多数蛋白的亲和常数高至少10倍；再更优选地，它对CD147的结合常数至少为10⁷M^-1并且比它对其它大多数蛋白的亲和常数高至少100倍；再更优选地，它对CD147的结合常数至少为10⁸M^-1并且比它对其它大多数蛋白的亲和常数高至少100倍；再更优选地，它对CD147的结合常数至少为10⁹M^-1并且比它对其它大多数蛋白的亲和常数高至少1000倍；

“抗体片段”或“抗体的片段”优选地具有与其来源的抗体相比相近或相同的对CD147的结合特异性。片段包括具有与抗体可变区的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。这类片段可含有Fab片段的一个或一对或F(ab’)₂片段。优选地，抗体片段含有完整抗体的全部六个互补决定区，然而含有少于上述全部互补决定区的片段——例如含有三个、四个、或五个CDR的片段——也可起作用，并被包涵于本发明之内。

片段还包括单链抗体片段，具体而言被称为单链可变区片段(scFv)。这些片段含有连接于抗体可变轻链序列(VL)的至少一个片段的抗体可变重链氨基酸序列(VH)的至少一个片段，可以使用或不使用互连连接物将它们连接。这类连接物可以是选定的短的柔性肽，以保证(VL)和(VH)结构域在连接时发生正确的三维折叠，从而可保留该单链抗体片段来源的完整抗体的对靶分子的结合特异性。通常，可将(VL)或(VH)的羧基端用上述的肽连接物与互补的(VL)和(VH)序列的氨基酸末端共价连接。单链抗体片段可用分子克隆、抗体噬菌体展示或类似的技术产生。这些蛋白质可在真核细胞或包括大肠埃希氏菌(E.coli)的原核细胞中产生。scFv可与抗体分子的其它部分相融合。例如，可以通过天然或人造的肽连接物将scFv连接到IgG的CH2-CH3区域，以形成二价的scFv-Fc构建体。

非人类抗体或抗体片段包括可变区。非人类抗体或抗体片段至少要含有一个可变区重链或轻链序列，优选地为重链序列。优选地，非人类抗体或抗体片段既含有可变重链序列，又含有可变轻链序列。非人类抗体或抗体片段有时被称为受试抗体或抗体片段。

“降低”抗体或抗体片段在人体中的“免疫原性”意为制造这样一种分子，在其被给予至人体时具有减弱的引起免疫反应的趋势(Hwang et al，2005a)；减弱的趋势意为对该分子显示免疫反应的患者比对亲本分子显示免疫反应的患者少，或者某些患者对该分子产生免疫反应的程度比对亲本分子产生免疫反应的程度低。免疫反应的程度可以通过在体外分析中测量患者血清中的抗体效价或分子激活T细胞的能力来确定。

短语“突变以降低免疫原性”意在涵盖对非人类抗体可变区进行的任何形式的修饰或改造，所述修饰和改造导致了向人类给药时引起免疫反应的趋势减弱。突变可包括例如在可变区的框架区中的一个或多个点突变，或者可包括可变区框架序列的一个或多个区域的置换。应当理解并不是必须产生原始的非人类可变区以用于后续的突变或改造。可以通过合成方式或将CDR环嫁接到选定的人类框架序列上的方法直接产生突变的可变区。可用于降低免疫原性的突变技术的实例包括抗体或抗体片段的去免疫化(deimmunizing)、人源化、超人源化^TM和表面重建(resurfacing)。

本发明还涵盖在抗体和抗体片段的可变区中进行突变以降低其对人类的免疫原性的抗体和抗体片段的“功能性等价物”。功能性等价物具有与抗体和抗体片段相近的结合特性，包括例如嵌合抗体和单链抗体。生产这类功能性等价物的方法公开于公布号为WO 93/21319的PCT申请(CetusOncology Corp)、公布号为239,400的欧洲专利申请(Winter)、公布号为WO 89/09622的PCT申请(Protein Design Labs Inc)、公布号为338,745的欧洲专利申请(Cell tech Ltd)和公布号为332,424的欧洲专利申请(Hybritech Inc)中，以上文献的全部内容分别以援引的方式纳入本文。

功能性等价物包括具有与本发明的抗体或抗体片段的可变区或高变区的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。

功能性等价物还包括具有与完整抗体相同或相近的结合特性的抗体的片段。这类片段可含有Fab片段的一个或一对或F(ab’)₂片段。优选地，抗体片段含有完整抗体的全部六个互补决定区，然而含有少于上述全部互补决定区的片段——例如含有三个、四个、或五个CDR的片段——也可起作用。此外，功能性等价物可为下列免疫球蛋白种类或其亚类中的任意一员或其组合：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。

功能性等价物还涵盖了含有修饰的抗体或抗体片段，所述修饰基本等价于在其序列中进行保守性替换，所述替换不会使抗体或抗体片段的结合特异性有任何明显程度的改变。

示例性的保守性替换

原始残基	示例性替换
原始残基	示例性替换	Ala(A)	val；leu；ile；gly
Arg(R)	lys	Ala(A)	val；leu；ile；gly
Arg(R)	lys	Asn(N)	gln；his
Asp(D)	glu	Asn(N)	gln；his
Asp(D)	glu	Cys(C)	ser
Gln(Q)	asn；his	Cys(C)	ser
Gln(Q)	asn；his	Glu(B)	asp
Gly(G)	pro，ala	Glu(B)	asp
Gly(G)	pro，ala	His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala	His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala	Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg	Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg	Met(M)	leu；phe；
Phe(F)	leu；val；ala	Met(M)	leu；phe；
Phe(F)	leu；val；ala	Pro(P)	gly
Ser(S)	thr	Pro(P)	gly
Ser(S)	thr	Thr(T)	ser
Trp(W)	tyr	Thr(T)	ser
Trp(W)	tyr	Tyr(Y)	trp；phe
Val(V)	ile；leu；met；phe，ala	Tyr(Y)	trp；phe

此外，如果需要的话，还可以在本发明的多肽中以置换或添加的方式引入非天然存在的氨基酸或化学方法制得的氨基酸类似物。这类氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、氟代氨基酸、氨基酸设计物例如(3-甲基)氨基酸、C-α-甲基氨基酸、N-α-甲基氨基酸和通常的氨基酸类似物。

功能性等价物还包括抗体和抗体片段的化学修饰衍生物，这可提供例如使多肽的稳定性和循环时间增加等有利之处。衍生的化学部分可选自水溶性聚合物，例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等等。

此外，抗体或抗体片段可在合成过程中或合成后被不同地修饰，例如通过生物素化、苯甲基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/封闭基团衍生化、蛋白酶剪切等等。抗体或抗体片段可在分子内随机位置或者在分子内预定位置被修饰，可包括一个、两个、三个或多个附加的化学部分。这些修饰例如可增加本发明的结合部分的稳定性和/或生物活性。

可以通过在特定系列的CDR侧面的可变区和恒定区序列内突变、缺失和/或插入而容易地生产各种抗体和抗体片段以及抗体模拟物。因此例如，可以通过不同重链的替换得到具有给定系列的CDR的不同类别抗体，由此可生产例如IgG1-4、IgM、IgA1-2，IgD、IgE抗体型和同种型。类似地，可以如US 6,818,418所述，通过将给定系列的CDR嵌入例如人纤连蛋白多肽序列结构域等的完全合成框架中而生产本发明范围内的人造抗体。

术语“可变的”在本文用于描述各个抗体之间序列不相同的可变域的某些部分，这些部分用于每个具体抗体对其抗原的结合和特异性。然而，可变性通常不是平均分布于抗体的整个可变域中。可变性通常集中在重链和轻链可变域中被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个片段上。可变域中保守性更高的部分被称为框架(FR)。每条重链和轻链的可变域包括四个框架区，它们大多具有β-片层构型，由三个CDR相连接，CDR形成环状连接，有时也构成β-片层的一部分。每条链上的CDR都通过FR区域紧密地聚集在一起，并且和另一条链上的CDR共同形成抗体的抗原结合位点(Kabat et al.，1991)。恒定区通常不直接参与抗体与抗原的结合，但可具有各种效应子功能，例如参与抗体的抗体依赖细胞毒性作用。

降低免疫原性

重组DNA方法学的出现使得可以对抗体基因进行结构基因工程改造，并可以产生具有杂交瘤技术无法获得的属性的修饰抗体分子。在治疗领域，该方法学的一个目的是通过改变鼠类单克隆抗体的一级氨基酸结构来降低其在人体中的免疫原性。降低治疗性抗体的免疫原性是合乎需要的，因为产生免疫反应可能在患者体内引起一系列的不良反应，轻者造成治疗性抗体的清除加快，疗效随之丧失，重者在极端情况下可导致致命的过敏反应。

降低外源单克隆抗体的免疫原性的一个策略是将单克隆抗体的轻链和重链恒定域用人类来源的相似结构域替换，保留外源抗体完整的可变区结构域。轻链和重链的可变区结构域负责抗体和抗原之间的相互作用。连接可变域和恒定域的连接结构域位于远离抗原结合位点的区域，因此，可变域和恒定域之间的连接结构域通常不会干扰抗原结合。具有与人类恒定域相连接的小鼠可变域的嵌合抗体通常以与嵌合抗体来源的小鼠抗体基本相同的亲和常数结合抗原。这类嵌合抗体在人体中的免疫原性比与其对应的完整鼠类抗体要低。然而，保留全部鼠类可变域的抗体还是可能在相当一部分患者体内引起免疫反应(Hwang et al.，2005a)。例如INFLIXIMAB^TM是一种被认为安全的广泛用于处方的嵌合抗体，但它在4 7名克罗恩病患者中的7名患者体内引起人抗嵌合抗体的反应(Rutgeerts et al.，1999)。

鉴于上述人体内的不期望的免疫反应，研究者们试验了获得具有更多人类特征的可变域的方法。通常被称为“人源化”的一类方法的目的是将鼠类单克隆抗体的可变域转化为更接近人类的形式，所述转化是通过重组构建同时具有小鼠和人类特征的抗体可变域实现。人源化策略是基于来源于抗体结构数据库的一些公认的概念。第一，可变域包含在物种内保守但在例如小鼠和人类等的进化上较远的物种间不同的肽序列的连续部分。第二，其他连续部分在物种内不保守，而且在同一个体内不同的抗体产生细胞之间也不相同。第三，抗体和抗原之间的接触主要通过可变域的非保守区域发生。第四，抗体可变域的分子构造在各物种间足够一致，从而各物种间的对应氨基酸残基的位置可以仅基于位置确定而不必基于实验数据。

人源化策略同样基于这一前提：将具有鼠类序列特征的氨基酸残基替换为人类抗体相应位置存在的残基可降低所得抗体在人体中的免疫原性。支持这一观点的数据已有公布(Hwang et al.，2005a)。然而，在物种间的序列替换通常导致抗体-抗原结合的减弱。因此，人源化的技术依赖于在替换原始鼠类序列以降低免疫原性和人源化分子保留可用于治疗的足够抗原结合能力的需要之间保持平衡。

发明人发现并改进了特异性结合细胞表面的CD147的新抗体。他们成功地降低了靶向CD147的抗体对人体的免疫原性，同时还保持了抗体对CD147有效的亲和性。

因此，在第一方面，本发明提供一种含有可变区的非人类抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段特异性结合CD147，其中所述可变区已被突变以降低所述抗体或抗体片段在人体内的免疫原性。

一种被本申请称为“表面重建”的方法示例性地由美国专利No.5,869,619(Studnicka)以及Padlan(1991)描述，在该方法中，鼠类可变域残基被人类残基特征性替换，所述鼠类可变域残基被测定为或被预言为：(i)在与抗原的相互作用中不起明显的化学作用和(ii)位于伸出至溶剂中的侧链处。这样远离抗原结合位点的外部残基为人源化的，而内部残基抗原结合残基以及形成可变域之间界面的残基还保持为鼠类的。这种方法的一个缺陷是需要大量的实验数据以确定一个残基是否在抗原的结合中不起明显的化学作用或其将在特定的三维抗体结构中位于溶剂中。本发明包括用于降低例如鼠类等的非人类抗体的免疫原性的这类方法的用途及其产品。

在由美国专利No.5,225,539(Winter)和Jones et al.(1986)示例性描述的一种更通用的方法中，可将认为是保守的鼠类可变域肽序列的连续部分用来自人类抗体的对应部分替换。在这种更通用的方法中，除了参与抗原结合的非保守区域以外，所有的可变域残基都被人源化。为确定适于替换的连续部分，可按US 5,225,539和Jones et al.(1986)所述应用Wu and Kabat(1970)开发的抗体可变域序列的分类方法。

Wu和Kabat开创了抗体肽序列比对的先河，他们在这方面的贡献有以下几点。第一，他们通过可变域之间的序列相似性研究，确定了在所有脊椎动物物种中的所有抗体均或多或少同源的对应残基，这是由于它们都具有相类似的三维结构、起到相类似的功能作用、与邻近的残基相类似地相互作用及存在于相类似的化学环境中。第二，他们设计了一种肽序列编号系统，在这一系统中相应的免疫球蛋白残基被指定相同的位置号。本领域技术人员可以清楚地对任何可变域序列指明其通常所称的Kabat编号，而无需依赖任何序列本身之外的实验数据。第三，对于每一个Kabat编号的序列位置，Kabat和Wu都计算了其可变性，该可变性意为在可变域序列比对时可能发现的氨基酸种类的多少。他们确定三个高可变性的连续区域嵌入在四个可变性较小的连续区域中。以前也有其他的研究者注意到大致在这些区域(高变区)的可变性，并假定这些高度可变的区域代表了用于抗原结合的氨基酸残基。Kabat和Wu为构成这些可变部分的残基正式划定了边界，并根据抗体和抗原之间的化学互补性将它们命名为“互补决定区”(CDR)。剩下的低可变区起到可变域中三维折叠作用而不是起抗原识别作用，该低可变区现在被命名为“框架区”。第四，Kabat和Wu建立了抗体的肽序列和核酸序列的公用数据库，该数据库现在还在继续维持并为本领域技术人员所熟知。

由U.S.5,225,539(Winter)和Jones et al.(1986)公开的使用Kabat分类方法的人源化方法得到了一种包括来源于一种抗体的CDR和来源于另一种抗体的框架区的嵌合抗体，所述两种原始抗体的物种来源、特异性、亚群或其他特征均不同。然而并没有将特定的序列或属性归于框架区。实际上，U.S.5,225,539(Winter)教导了任何系列的框架区可与任何系列的CDR相组合。从此认识到框架区序列对于维持抗体可变区的三维结构十分重要，而这种三维结构又是维持足够的抗原结合性所必需的。那么由U.S.5,225,539(Winter)和Jones et al.(1986)所描述的一般人源化的方法就有经常产生无活性抗体的缺陷，因为这些参考文献没有提供从许多种可能的人类框架序列中做出合理选择所需的信息，所选出的人框架序列应最可能有利于来源于非人类抗体的特定CDR区域所需的抗原结合。在本领域中后续的发展是U.S.5,225,539(Winter)范围内的优化，以处理观察到的人源化抗体相对其对应的小鼠抗体的抗原亲合力损失的情况。亲合力是在存在抗原、接近化学平衡的条件下，游离形式和与抗原结合的形式之间的抗体分配的定量量度。对于溶液中的不经过多价结合作用的反应，亲合力等于亲和力，亲和力为一个生化平衡常数。

美国专利No.5,693,761(Queen et al.)公开了U.S.5,225,539(Winter)的人源化抗体的一个优化方案，它基于下述前提：亲合力损失是归因于人源化框架的结构性基序的问题，由于立体的或其他化学上的不相容性，使该基序干扰了CDR折叠成小鼠抗体中存在的可结合构象。为解决这一问题，U.S.No.5,693,761(Queen et al.)教导使用在线性肽序列上与待人源化的小鼠抗体框架序列近似的人类框架序列。因此，U.S.5,693,761(Queen et al.)的方法致力于比较物种间的框架序列。通常将所有可用的人类可变域序列与一个特定的小鼠序列相比较，并计算对应框架残基之间的同一性百分比。选择具有最高百分比的人类可变域从而为人源化工程提供框架序列。U.S.5,693,761(Queen et al.)还教导了在人源化框架中保留来自小鼠框架的对于使CDR保持为可结合构象十分关键的某些氨基酸残基是很重要的。潜在的关键性通过分子模型测评。可保留的候选残基通常是那些在线性序列上与CDR邻近的残基或者与任意CDR残基物理距离在6埃以内的残基。本发明包括U.S.5,693,761(Queen etal.)教导的这类方法用于Hab18抗体的人源化的用途及其产品。

在其他方法中，当获得了低亲合力人源化构建体后，可以通过将单个残基换回为小鼠序列的残基并用如Riechmann et al.(1988)所述的方法测定抗原结合，从而试验确定特定的框架氨基酸残基的关键性。另一种确定框架序列中的氨基酸的关键性的方法实例公开于美国专利No.5,821,337(Carter et al.)和5,859,205(Adair et al.)。这些参考文献公开了框架中的具体的Kabat残基位置，这些位置在人源化抗体中需要用对应的小鼠氨基酸替换以保留亲合力。本发明包括这类方法用于Hab18抗体的人源化的用途及其产品。

U.S.5,693,761(Queen et al.)所述的优化方案和Riechmann et al.(1988)、U.S.5,821,337(Carter et al.)和U.S.5,859,205(Adair et al.)的方法的一个缺陷是：需要相当大量的人类框架序列用于比较，和/或为保留关键氨基酸残基的指导策略不能完全充分地预言功能性。因此，所得的一部分来源于人一部分来源于小鼠的框架构建体仍然经常表现出对人体的免疫原性或较低的抗原结合性，因此，为获得适用于治疗用途的框架还需要在框架构建中进行很多重复试验。

在表面重建技术中，将建立分子模型、统计学分析和诱变相结合以调整可变区的非CDR表面，以使其与目标宿主的已知抗体的表面相像。抗体表面重建的策略和方法以及其他在不同宿主中降低抗体的免疫原性的方法公开于美国专利No.5,639,641(Pedersen et al.)，其全部内容以援引的方式纳入本文。

抗体或抗体片段的去免疫化可以通过从例如小鼠等的非人类抗体或抗体片段中鉴定和消除潜在免疫原性的鼠类T细胞和B细胞表位的方式实现。T细胞表位的移除可通过从抗体可变区中鉴定这类表位的方式实现。例如，可通过三维“肽穿线(peptide threading)”方法分析可变区的氨基酸序列以检测MHC II类结合基序的存在。至少一个或全部B细胞表位从可变区的移除可通过对不会影响抗体识别的表面残基的“覆盖”的方式实现。

上述方法的任何一项都可用于使特异性结合CD147的抗体或抗体片段的可变区突变，以降低抗体或抗体片段对人体的免疫原性。

在一个优选的实施方案中，通过CDR嫁接方法降低免疫原性。CDR嫁接方法提供了一种用于获得可用于使受试非人类抗体人源化的合适人类框架序列的策略。本发明的优选的CDR嫁接方法是被称为超人源化^TM的方法，所述方法基于公布号为US 2003/0039649(Foote)的美国专利申请和公布号为WO 04/006955(Foote)的PCT申请的具体描述，并由Tanet al.(2002)和Hwang et al.(2005b)进行了进一步阐释。公布号为US 2003/0039649(Foote)的美国专利申请将这种方法命名为“抗体超人源化^TM”，并将由此制备的抗体命名为“超人源化^TM抗体”。与基于人类框架与受试(鼠类)框架比较而选择人源化框架序列的先前的CDR嫁接技术不同，“抗体超人源化^TM”的方法是由基于CDR与受试非人类抗体的CDR的相似性的人类抗体提供人源化框架，而不必比较两种抗体之间的框架序列。

对每个结构域都在两个水平上评价了候选人类抗体CDR序列和受试CDR之间的相似性。首先，寻找CDR肽主链的相同的三维构象。试验测定的受试CDR的原子坐标大多数时候都不可用，因此要通过测定受试CDR的Chothia正则结构型并且不进一步考虑具有不同正则结构型的候选者来近似测得三维相似性。其次，考虑受试CDR和其余人类候选CDR之间的残基与残基的同源性，同源性最高的候选者入选。

选择最高的同源性基于各种标准，这些标准用于对具有与受试非人类可变区相同正则结构的候选人类可变区排序。对选出系列的成员进行排序的标准可以是氨基酸序列同一性或氨基酸同源性或二者兼备。氨基酸同一性只是氨基酸残基的位置与位置匹配的评分。通过氨基酸同源性得出的相似性是考虑了残基结构和特性的位置与位置的相似性。例如，可以根据Henikoff and Henikoff(1992)所述的表格和过程或者通过Henikoff and Henikoff(1996)所述的BLOSUM系列来对同源性评分。

该方法的步骤如下：

(i)测定结合CD147的受试抗体的重链和轻链可变域的肽序列。这可以通过任意一些方法测得，例如：在常规cDNA克隆后对各个基因的DNA测序；从反转录物或受试杂交瘤细胞系的DNA用聚合酶链式反应扩增出克隆产物并对其DNA测序；或者对纯化的抗体蛋白质进行肽测序。

(ii)将Kabat编号系统(Kabat et al.，1991)应用于受试非人类CD147结合抗体的重链和轻链序列中。

(iii)测定与CD147结合的受试非人类抗体的每一个CDR的正则结构型。这种测定是按照Chothia and Lesk(1987)、Chothia etal.，(1992)、Tomlinson et al.(1995)、MacCallum et al.(1996)和A1-Lazikani et al.(1997)中讨论的指导策略进行肽序列检测完成的。每一个CDR的正则结构型测定的显著特征列出如下。

对于重链CDR1，目前已知三种正则结构型。因为每个正则结构型都有不同数目的残基，所以新序列的指定是简单易行的。如A1-Lazikaniet al.(1997)所述，当指定序列用Kabat编号时，可按下表根据各正则结构分别对残基31-35编号。

链	正则结构型	残基
链	正则结构型	残基	重链CDR1	1型	31，32，33，34，35
2型	31，32，33，34，35，35a			1型	31，32，33，34，35
2型	31，32，33，34，35，35a	3型		31，32，33，34，35，35a，35b
重链CDR2	1型	3型		31，32，33，34，35，35a，35b	52，53，54，55，56
	1型	2型	52，52a，53，54，5552a为Pro或Ser55为Gly或Ser		52，53，54，55，56
	3型	2型	52，52a，53，54，5552a为Pro或Ser55为Gly或Ser	52，52a，53，54，5554为Gly，Ser，Asn，或Asp
	3型	4型	52，52a，52b，52c，53，54，55，56	52，52a，53，54，5554为Gly，Ser，Asn，或Asp
	轻链CDR1	4型	52，52a，52b，52c，53，54，55，56	1型	27，29，30，31
2型		27，28，29，30，31		1型	27，29，30，31
2型		27，28，29，30，31	3型	27，27a，27b，27c，27d，27e，27f，28，29，30，31
4型		27，27a，27b，27c，27d，27e，28，29，30，31	3型	27，27a，27b，27c，27d，27e，27f，28，29，30，31
4型		27，27a，27b，27c，27d，27e，28，29，30，31	5型	27，27a，27b，27c，27d，28，29，30，31.
6型		27，27a，28，29，30，31	5型	27，27a，27b，27c，27d，28，29，30，31.
6型		27，27a，28，29，30，31	轻链CDR3	1型	91，92，93，94，95，96，9790为Gln，Asn，或His95为Pro
	3型	91，92，93，94，95，97.	轻链CDR3	1型	91，92，93，94，95，96，9790为Gln，Asn，或His95为Pro
	3型	91，92，93，94，95，97.	5型	91，92，93，94，95，96，96a，97

对于重链CDR2，目前已知四种正则结构型。一些结构型具有与其他结构型不同的残基数目，可以根据它们52-56位置的唯一Kabat编号容易地将它们区分出来。重链CDR2的2型和3型正则结构具有相同的残基数目，因此必须用Chothia et al.(1992)中讨论的方法根据其序列内的提示来区分它们。2型正则结构在52a位置为Pro或Ser，在55位置为Gly或Ser，其他位置没有限制。3型正则结构在54位置为Gly、Ser、Asn或Asp，其他位置没有限制。这些标准在大多数情况下足够完成正确的指定。此外，对2型正则结构，框架残基71通常为Ala、Val、Leu、Ile或Thr；对3型正则结构，框架残基71通常为Arg。

重链CDR3是所有CDR中最具多样性的。它是由遗传方法产生的，具有一些随机的性质，但是每个淋巴细胞产生的重链CDR3是唯一的。因此CDR3的正则结构难以预测。因为人类种系V基因片段终止于Kabat位置94，而位置95至102编码CDR3；所以在任何情况下，V基因片段不编码CDR3的任何部分。出于上述理由，在选择候选人类序列时不考虑CDR3的正则结构。

对于轻链CDR1，目前已知κ链中的CDR1有六种正则结构型。每种正则结构的残基数目均不一样，因此根据Kabat编号的残基位置27-31可以清楚地为新序列指定一种正则结构型。

对于轻链CDR2，目前已知κ链中的CDR2仅有一种正则结构型，因此除了特殊的受试抗体序列之外，可自动进行指定。

对于轻链CDR3，目前描述过的κ链中的CDR3最多有六种正则结构型，但是其中有三种很少见。三种较常见的结构型可根据它们的长度区分，反映到Kabat编号系统中为残基91-97位置。

在确定了受试非人类抗体的CDR正则结构型之后，可确定与受试抗体具有相同正则结构型组合、相同链类型(重链或轻链)的人类基因组成候选的一系列人类序列。在优选的实施方案中，仅考虑将人类种系免疫球蛋白VH和Vk基因片段的肽序列用于比较。这些基因片段的大多数已被发现并且已被指定了正则结构型(Chothia et al.(1992)；Tomlinson et al.(1995))。上述参考文献未公开的其他V基因片段公开于公布号为2003/0039649的美国专利申请(Foote)中。对于重链，评估了CDR1和CDR2与小鼠的正则结构型的相符程度，并排除不相符的基因。对于轻链，首先评估每个人类序列的CDR1和CDR2与受试抗体的正则结构型的相符程度。通过使候选Vk基因与J区域融合并对融合序列应用用于CDR3的CDR正则结构型确定的标准，藉此评估候选Vk基因的89-95残基形成与受试抗体正则结构型相同的CDR3的潜能，排除不相符的序列。

在另一个实施方案中，当受试抗体的可变域为人类基因组无法产生的正则结构型时，考虑将具有与受试抗体的三维正则结构型相近但不相同的人类种系V基因用于比较是适当的。这种情况在涉及鼠类抗体的κ链CDR1时经常发生。在鼠类抗体的这一CDR中已观察到全部6种可能的正则结构型，而人类基因组仅编码2、3、4和6型正则结构。在这种情况下，可选择氨基酸残基长度与受试非人类序列的氨基酸残基长度相差在两个残基之内的CDR正则结构型用于比较。例如，当发现受试抗体为1型正则结构时，可使用具有2型正则结构的人类Vk序列进行比较。当发现鼠类抗体为5型正则结构时，可使用具有3型或4型正则结构的人类Vk序列进行比较。

在另一个实施方案中，可考虑将成熟的重排人类抗体序列用于序列比较。在多种情况下进行上述考虑是适当的，所述情况包括但不限于：当成熟人类序列(1)与种系相当接近时；(2)已知在人体中没有免疫原性时；或(3)含有与受试抗体相同但不存在于人类种系中的正则结构型时。

在一个优选的实施方案中，对于每个具有匹配正则结构型的候选V基因，还要评估它与受试序列的残基对残基的同一性和/或同源性，以对候选的人类序列排序。在一个具体的实施方案中，被评估的残基如下所示：

链	CDR	残基位置
链	CDR	残基位置	κ(轻链)	1	26-32
κ(轻链)	2	50-52	κ(轻链)	1	26-32
κ(轻链)	2	50-52	κ(轻链)	3	91-96
重链	1	31-35	κ(轻链)	3	91-96
重链	1	31-35	重链	2	50-60

在优选的实施方案中，首先根据受试序列和候选人类序列之间的相同氨基酸残基的数目对残基对残基同源性进行评分。用于后续转化抗体构建的人类序列是从得分最高的25％的候选序列中选择的。在其他实施方案中，当一些候选序列具有相近的同一性得分时，再考虑不相同的氨基酸残基之间的相似性是适当的。受试残基和对象残基之间如果有脂肪族-脂肪族、芳香族-芳香族或极性-极性氨基酸的匹配就可以加分。在另一个实施方案中，可使用例如Henikoff and Henikoff(1992)中的BLOSUM62矩阵的氨基酸替换矩阵来进行序列同源性的定量评估。

框架区的C端至CDR3序列间的合适序列选自已知人类种系J片段的系列。通过使用上述具体用于评估候选V基因的评分标准，对每个J片段的CDR3和J重叠的序列位置进行残基对残基的同源性评估，从而选出优选的J肽序列。用于后续转化抗体构建的J基因片段肽序列是从得分最高的25％的候选序列中选择的。重链的CDR3是重链JH区域的一部分，从其序列上无法预言出有限数目的三维结构，然而根据本方法，可使用任何JH区域构建人源化重链可变区。

在所有的实施方案中，人源化分子包括至少一个可变区，优选地为重链可变区。优选地该分子还包括另一个轻链可变区。优选地，人源化可变区含有至少一个、至少两个或至少三个来源于受试非人类抗体的CDR区域。

在一个实施方案中，抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区时，仅有重链可变区的CDR3来源于受试非人类抗体的CDR3或者基本上与受试非人类抗体的CDR3相同，而其余5个CDR来源于人类抗体序列。在一个更优选的实施方案中，在6个可能的CDR中至少有2个(其中一个是重链可变区CDR3)来源于受试非人类抗体的对应CDR或者基本上与受试非人类抗体的对应CDR相同。在一个再更优选的实施方案中，在6个可能的CDR中至少有3个(其中一个是重链可变区CDR3)来源于受试非人类抗体的对应CDR或者基本上与受试非人类抗体的对应CDR相同。优选地，在6个可能的CDR中至少有4个或5个(其中一个是重链可变区CDR3)来源于受试非人类抗体的对应CDR或者基本上与受试非人类抗体的对应CDR相同。在一个实施方案中，全部6个可能的CDR均来源于受试非人类抗体的对应CDR或者基本上与受试非人类抗体的对应CDR相同。

在其他实施方案中，当只有重链可变区时，仅有重链可变区的CDR3来源于受试非人类抗体的CDR3或者基本上与受试非人类抗体的CDR3相同，而其余2个CDR来源于人类抗体序列。在其他实施方案中，另两个CDR中的一个或两个(CDR1和/或CDR2)也来源于受试非人类抗体。

然而，在所有情况下，优选人源化抗体分子在框架序列中含有的与候选人类可变区的框架序列不同的氨基酸残基不多于10个。

优选地，来源于候选人类抗体的抗体或抗体片段的框架序列与天然的候选人类框架序列具有至少65％、更优选至少75％、更优选至少80％、再更优选至少85％、再更优选至少90％和再更优选至少95％的序列同一性。

在另一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体与针对CD147产生的受试鼠类抗体(优选Hab18)相比，对CD147的亲和力下降不超过100倍，更优选地亲和力下降不超过25倍，更优选地亲和力下降不超过5倍，更优选地与针对CD147产生的受试鼠类抗体相比，对CD147的亲和力基本相等。

在另一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体对CD147的亲和力至少为Kd 1nM、10nM、100nM或1μM。

在另一个实施方案中，当需要提高人源化抗体的亲和力时，将转化抗体的CDR中的残基用其他的氨基酸再进行替换是适当的。通常在一个CDR中被改变的氨基酸残基不超过4个，最通常在一个CDR中被改变的氨基酸残基不超过2个，但是重链CDR2除外，重链CDR2中被改变的残基可多达10个。类似地，在某些实施方案中，框架序列的一些氨基酸可被改变。优选地，被改变的氨基酸残基不超过10个。

然后可以通过本领域人员已知的基因合成和重组蛋白质表达的方法物理组装人源化抗体序列。具有通过本文公开的方法制备的嵌合可变链的人源化序列的最终形式可有多种形式。最通常地，嵌合抗体可通过构建编码嵌合可变链的核酸序列并在合适类型的细胞中重组表达嵌合可变链而制备。最通常地，可将可变区连接至人类免疫球蛋白基因的恒定区，从而使得在表达时产生完整大小的免疫球蛋白。在许多情况下完整大小的IgG是优选的形式。在另一些情况下，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE可能是优选的。

本发明还包括在本说明书前文所述的抗体的功能性等价物。

结合CD147并可被突变以降低对人的免疫原性的优选的非人类抗体或抗体片段为鼠类抗体或抗体片段。一种优选的鼠类抗体为Hab18抗体，该抗体描述于Xing et al.(2003)、Liu et al.(2003)、Li et al.，(2002)、Lou et al.(2002)、Yang et al.(2001)、Bian et al.(2000)、Qui et al.(1998)、Sui(1992)、Sui et al.(1996)、Sui et al.(1998)、Chen(1992)和Ji(1991)。

Hab18抗体的重链和轻链可变区的序列均描述于公布号为2005/0176933(Chen Zhinan et al.)的美国专利申请中。但是上述专利申请公布的氨基酸序列中有一处错误。由该申请中的DNA序列产生的正确的氨基酸序列示于图1和SEQ ID NO：7和8。

Hab18抗体的鼠类重链的可变区示于SEQ ID NO：7。Hab18抗体的鼠类轻链的可变区示于SEQ ID NO：47。Hab18抗体的CDR序列示于SEQID NO：1-6：SEQ ID NO：1为鼠类重链CDR1；SEQ ID NO：2为鼠类重链CDR2；SEQ ID NO：3为鼠类重链CDR3；SEQ ID NO：4为鼠类轻链CDR1；SEQ ID NO：5为鼠类轻链CDR2；SEQ ID NO：6为鼠类轻链CDR3。

本发明的抗体或抗体片段还可以通过改变重链和轻链的CDR1、CDR2、CDR3或框架区的基因序列而产生，所使用的方法例如寡核苷酸介导的定向诱变、盒式诱变、错配PCR、DNA改组、大肠埃希氏菌(E.coli)增变株(Vaughan et al.，1998；Adey et al.，1996)或如公布号为WO 99/58661的PCT申请(Diatech Pty Ltd)所述的例如来自Qβ噬菌体的RNA指导的RNA聚合酶。这些改变抗体一级序列的方法可使得抗体次级结构的亲和力提高(Gram et al.，1992；Boder et al.，2000；Davies and Riechmann，1996；Thompson et al.，1996；Short et al.，2002；Furukawa et al.，2001)。

通过改变抗体的一个或多个氨基酸残基的相似策略，本发明所述的抗体序列可用于开发具有改进功能的抗CD147抗体。

在一个优选实施方案中，本发明的非人类抗体或抗体片段包括重链，在所述重链中在下述Kabat残基号的位置进行了一个或多个突变：H3、H5、H18、H19、H23、H37、H40、H41、H42、H49、H73、H76、H77、H78、H82b、H83、H84、H88、H89、H93和H105。优选地，在下述Kabat残基号的位置进行一个或多个突变：H3、H5、H18、H23、H40、H42、H49、H77、H78、H82a、H84、H88和H89，更优选地，在下述Kabat残基号的位置进行一个或多个突变：H3、H5、H18、H23、H42、H77、H78、H88和H89。

在一个优选实施方案中，非人类抗体或抗体片段包括具有SEQ ID NO：7所示序列的重链，所述重链中下述残基的一个或多个已被突变：3、5、18、19、23、37、40、41、42、49、76、79、80、81、87、89、90、94、95、99或109。

在这些位置上优选的突变如下：

残基号(SEQ ID NO：7)	突变	Kabat残基号
残基号(SEQ ID NO：7)	突变	Kabat残基号	3	K→Q	H3
5	E→V	H5	3	K→Q	H3
5	E→V	H5	18	M→L	H18
19	K→R	H19	18	M→L	H18
19	K→R	H19	23	V→A或T	H23
37	V→F	H37	23	V→A或T	H23
37	V→F	H37	40	S→A	H40
41	P→S	H41	40	S→A	H40
41	P→S	H41	42	E→G	H42
49	A→G	H49	42	E→G	H42
49	A→G	H49	76	D→G	H73
79	S→N	H76	76	D→G	H73
79	S→N	H76	80	I→S或T	H77
81	I→L或A	H78	80	I→S或T	H77
81	I→L或A	H78	87	N→S	H82b
89	R→K	H83	87	N→S	H82b
89	R→K	H83	90	A→T	H84
94	G→A	H88	90	A→T	H84
94	G→A	H88	95	I→V	H89
99	T→A	H93	95	I→V	H89
99	T→A	H93	109	Q→R	H105

应当理解这些突变的一个或多个或全部的任意组合都涵盖于本发明范围之内。

在另一个优选实施方案中，本发明的非人类抗体或抗体片段包括轻链，在所述轻链中在下述Kabat残基号的位置进行了一个或多个突变：L1、L3、L4、L7、L9、L10、L12、L13、L15、L17、L19、L21、L22、L42、L43、L49、L58、L60、L63、L67、L73、L77、L78、L79、L80、L83、L85、L87、L100、L104和L105。优选地，在下述Kabat残基号的位置进行一个或多个突变：L1、L7、L9、L10、L12、L13、L15、L43、L49、L60、L63、L67、L73、L77、L78、L80、L83和L87，更优选地，在下述Kabat残基号的位置进行一个或多个突变：L7、L9、L10、L12、L15、L49、L63、L67、L73、L77、L83和L87。

在一个优选实施方案中，非人类抗体或抗体片段包括具有SEQ ID NO：47所示序列的轻链，所述轻链中下述残基的一个或多个被突变：1、3、4、7、9、10、12、13、15、17、19、21、22、42、43、49、58、60、63、67、73、77、78、79、80、83、85、87、100、104或105。

在这些位置上优选的突变如下：

残基号(SEQ ID NO：47)	突变	Kabat残基号
残基号(SEQ ID NO：47)	突变	Kabat残基号	1	S→A或E	L1
3	V→Q	L3	1	S→A或E	L1
3	V→Q	L3	4	M→L	L4
7	T→S	L7	4	M→L	L4
7	T→S	L7	9	T→S或A	L9
10	F→S或T	L10	9	T→S或A	L9
10	F→S或T	L10	12	V→S	L12
13	V→A或L	L13	12	V→S	L12
13	V→A或L	L13	15	A→V或P	L15
17	D→E	L17	15	A→V或P	L15
17	D→E	L17	19	V→A	L19
21	I→L	L21	19	V→A	L19
21	I→L	L21	22	T→S	L22
42	Q→K	L42	22	T→S	L22
42	Q→K	L42	43	S→A	L43
49	F→Y	L49	43	S→A	L43
49	F→Y	L49	58	V→I	L58
60	D→S或A	L60	58	V→I	L58
60	D→S或A	L60	63	T→S	L63
67	Y→S	L67	63	T→S	L63
67	Y→S	L67	73	F→L	L73
77	T→S	L77	73	F→L	L73
77	T→S	L77	78	V→L	L78
79	Q→E	L79	78	V→L	L78
79	Q→E	L79	80	A→P	L80
83	L→F	L83	80	A→P	L80
83	L→F	L83	85	V→T	L85
87	F→Y	L87	85	V→T	L85
87	F→Y	L87	100	S→P	L100
104	L→V	L104	100	S→P	L100
104	L→V	L104	105	E→D	L105

应当理解对重链的一个或多个突变的任意组合可以与对轻链的一个或多个突变的任意组合相组合。

优选地，其有一个或多个氨基酸残基突变的变异的抗体或抗体片段框架与天然受试非人类框架序列相比，有至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、再更优选至少80％、再更优选至少85％以及再更优选至少90％的序列同一性。

在一个优选实施方案中，抗体为超人源化^TMHab18抗体。Hab18抗体可按下述方法超人源化^TM。

首先，通过检测重链和轻链的CDR的序列确定其正则结构，所述检测根据公布号为US 2003039649(Foote)的美国专利申请和公布号为WO04/006955(Foote)的PCT申请所教导的、由Tan et al.(2002)和Hwanget al.(2005b)和本申请进一步阐释的方法。

重链CDR1为1型正则结构，重链CDR2为类4型正则结构。由于在残基52之后插入了三个另外的残基，重链CDR2与4型正则结构非常相像。然而，该正则结构通常在55位置为酪氨酸，54位置为丝氨酸或赖氨酸残基。Hab18中的55位置为组氨酸，54位置为天冬酰胺，这使得该CDR应被归类为最接近4型正则结构的一种不规则正则结构(下文称为“类4型”)。

轻链CDR1为2型正则结构，轻链CDR2为1型正则结构，轻链CDR3为1型正则结构。

对于重链，优选地用CDR1为1型正则结构、CDR2为4型正则结构的人类种系V区域外显子(Hwang et al.，2005b)进行比对，如图1所示将这些CDR与Hab18抗体的VH区域进行比对。这些种系序列(如SEQ ID NO：8至12所示)中的任一个都可为制备人源化重链提供框架区。然而具有这一系列正则结构的人类种系可变区的数量是有限的。由于3型正则结构与4型正则结构类似，所以还可用Hab18的CDR与CDR1为1型正则结构、CDR2为3型正则结构的人类种系V序列进行比对(图2)。这些种系序列(如SEQ ID NO：23至46所示)中的任一个也都可为制备人源化重链提供框架区。

在一个优选的实施方案中，选择命名为3-72*01的人类种系可变区序列(如SEQ ID NO：11所示)作为合适的制备人源化重链的框架区。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包括人源化Hab18抗体重链，所述重链含有根据SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。

如图3所示，优选地将Hab18的轻链可变区与3个CDR为相同正则结构的人类种系Vκ区域序列进行比对。这些序列(如SEQ ID NO：48至59所示)中的任一个都可作为使Hab18轻链人源化的框架序列，优选地，选择命名为1-6*01(SEQ ID NO：48)或3-11*01(SEQ ID NO：57)的人类种系可变区序列作为制备人源化轻链的合适框架区。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包括人源化Hab18抗体轻链，所述轻链含有根据SEQ ID NO：66或67所示的氨基酸序列。

本发明的范围并不限于包括改造的Hab18抗体或其片段的抗体和片段。所有特异性结合CD147并被改造以降低其对人的免疫原性的非人类抗体和片段均落入本发明的范围。因此，与本文所述不同的、使用不同的CDR和/或不同框架区的抗体和抗体片段也包括在本发明中。

然而，本文所述的有关Hab18抗体及其人源化变体的氨基酸和核酸序列的知识也可被用于开发其他结合CD147并由此直接或间接导致细胞死亡或减少转移的抗体。一些研究考察了基于对抗体一级序列的认识在抗体序列的各个位置引入一个或多个氨基酸的改变，从而对其例如结合力和表达水平等的性质的影响(Yang et al.，1995；Rader et al.，1998；Vaughan et al.，1998)。

因此，在另一个实施方案中，抗体或抗体片段使用了来源于具有1型正则结构的CDR1和4型正则结构的CDR2的人类抗体可变重链的框架序列。具有这类CDR正则结构型的合适的人类种系VH区域基因的实例示于图1。

或者，抗体或抗体片段使用来源于具有1型正则结构的CDR1和3型正则结构的CDR2的人类抗体可变重链的框架序列。具有这类CDR正则结构型的合适的人类种系VH区域基因的实例示于图2。

在另一个实施方案中，抗体或抗体片段使用了来源于人类抗体可变轻链的框架序列，所述人类抗体可变轻链具有2型正则结构的CDR1、1型正则结构的CDR2和1型正则结构的CDR3。具有这类正则结构型的合适的人类种系Vκ区域外显子的实例示于图3。

本发明的缀合物包括与细胞毒剂连接的本文公开的抗体、片段及其类似物。优选的细胞毒剂为美登类化合物(maytansinoids)、紫杉烷类和CC-1065的类似物。缀合物可用体外方法制备。为将细胞毒剂连接到抗体上，可使用连接基团。合适的连接基团为本领域所熟知，包括二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团为二硫基和硫醚基。例如，可在抗体和细胞毒剂之间使用二硫化物交换反应或形成硫醚键而构建缀合物。

美登类化合物和美登类类似物是优选的细胞毒剂。合适的美登类化合物的实例包括美登醇和美登醇类似物。合适的美登类化合物公开于美国专利No.4,424,219、4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,450,254、4,322,348、4,371,533、6,333,410、5,475,092、5,585,499和5,846,545。

紫杉烷类也是优选的细胞毒剂。适用于本发明的紫杉烷类公开于美国专利No.6,372,738和6,340,701。

CC-1065及其类似物也是用于本发明的优选的细胞毒性药物。CC-1065及其类似物公开于美国专利No.6,372,738、6,340,701、5,846,545、5,843,937和5,585,499。

用于制备这类细胞毒性缀合物的一个受到关注的候选物是CC-1065，它是从泽耳链球菌(Streptomyces zelensis)的培养肉汤中分离的一种有效的抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外的效力比例如多柔比星、甲氨蝶呤和长春新碱等通常使用的抗癌药物强大约1000倍(Bhuyan et al.，1982)。

例如甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥和刺孢霉素等的细胞毒性药物也适于制备本发明的缀合物，可通过例如血清清蛋白等中间载体分子将药物分子连接到抗体分子上。

对诊断应用而言，通常可用可检测的部分标记本发明的抗体。可检测部分可为任意一种能够直接或间接产生可检测信号的部分。例如，可检测部分可为例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹³¹I等的放射性同位素；例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素等的荧光化合物或者化学发光化合物；或者为例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶等的酶类。也可将放射性同位素用以靶向肿瘤，并通过电离辐射破坏肿瘤，从而达到治疗目的。具体而言，已广泛使用¹³¹I和⁹⁰Y来辅助抗体并增加抗体对被靶向癌细胞的破坏作用。F(ab)’2形式的鼠类Hab18抗体已经以¹³¹I缀合抗体的形式被给药至动物和患者(见背景技术部分)。

可使用任何本领域已知的将抗体和可检测部分缀合的方法，包括Hunter et al.，(1962)、David et al.，(1974)、Pain and Surolia(1981)和Nygren(1982)中所述的方法。

本发明的抗体可适用于任何已知的测定方法，例如竞争性结合测定、直接和间接夹心分析和免疫沉淀分析(Zola，1987)。

本发明的抗体也可以用于体内成像，其中将被例如不透射线药剂或放射性同位素等可检测部分标记的抗体给予受试者，优选地给药至血流中，然后分析被标记抗体的存在及存在部位。显像技术在恶性肿瘤的分期和治疗中很有用处。抗体可用任何在宿主中可检测的部分进行标记，可用本领域已知的核磁共振、放射学或其他检测手段进行检测。

出于治疗应用的目的，将本发明的抗体或缀合物以药物学上可接受的剂型给予受试者。它们可以以快速浓注或在一段时间内连续输注的方式静脉内给药、可以以肌内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入的途径给药。抗体还可经瘤内、瘤周围、病灶内或病灶周围的途径给予抗体，以发挥局部以及全身性疗效。对于肝细胞癌的治疗，抗体可通过肝动脉送递。本领域技术人员可根据临床情况确定已为其所熟知的合适的可药用的载体、稀释剂和赋形剂。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，含有约1mg/ml至25mg/ml人血清清蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v NaCl)，以及(3)5％(w/v)葡萄糖。对于放射性标记的抗体，可加入聚乙烯吡咯烷酮以保护抗体不受辐射分解。本发明的方法可在体外、体内或离体进行。

在其他疗法中，本发明的抗体、抗体片段或缀合物可与一种或多种其他治疗药剂共同给药。合适的治疗药剂包括但不限于细胞毒剂或细胞生长抑制剂。

癌症治疗药剂是那些欲杀死癌细胞或抑制癌细胞生长但对宿主伤害很小的药剂。因此，这类药剂可以充分利用癌细胞与健康宿主细胞性质上的任何差异(例如新陈代谢、血管化作用或细胞表面抗原呈递)。肿瘤形态学上的差异是介入的潜在位点：例如，第二种疗法可为例如抗VEGF抗体的一种抗体，它可有效地延缓实体瘤内部的血管化作用，由此减小其生长速度。其他治疗药剂包括但不限于：例如盐酸格拉司琼等的辅剂、例如醋酸亮丙立德等的雄激素抑制剂、例如多柔比星等的抗生素、例如他莫昔芬等的抗雌激素剂、例如干扰素α-2a等的抗代谢剂、例如紫杉醇等的细胞毒剂、例如ras法尼基转移酶抑制剂等的酶抑制剂、例如阿地白介素等的免疫调节剂和例如盐酸美法仑等的氮芥衍生物等等。

当以含水剂型而不是冻干形式存在时，抗体通常被配制为约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度，当然在上述范围之外的广泛变化也是允许的。对疾病治疗而言，抗体或缀合物的合适剂量取决于如上所述的待治疗疾病的类型、严重程度和病程、给予抗体的目的是为了预防还是治疗、之前疗法的过程、病人临床史和对抗体的反应以及主治医生的决断。抗体适于一次给予或者在一系列治疗中分次给予患者。

根据疾病的类型和严重程度，不论是例如一次或分次给药或连续输注，给予患者的初始候选剂量为约0.015至15mg抗体/kg患者体重。对于在几天或更长时间内重复给药的情况，根据情况可重复治疗直至出现所需的对疾病症状的抑制作用为止。然而也不排除其他可用的剂量方案。

参考下列实施例描述本发明，这些实施例仅仅是说明性的，并不意在限制本发明。

实施例

实施例1：鼠类抗体Hab18的人源化

根据公布号为US 2003/0039649(Foote)的美国专利申请和公布号为WO 04/006955(Foote)的PCT申请教导的、并由Tan et al.(2002)和Hwanget al.(2005b)及本申请进一步阐释的方法，通过确定重链和轻链的CDR的正则结构对鼠类Hab18抗体进行超人源化^TM。

首先，根据系列号为10/194975的美国专利申请和美国专利No.6,681,557教导的、并由Tan et al.(2002.J.Immunol.169(2)：1119-25)和Hwang et al.(2005b)及本申请(见上文)进一步阐释的方法，通过检测重链和轻链CDR的序列测定它们的正则结构如下。对于下述序列，上一行显示每一残基的Kabat编号，下一行显示每个残基的单字母氨基酸代码。

重链CDR1：1型正则结构(SEQ ID NO：1)

31	32	33	34	35
31	32	33	34	35	D	A	W	M	D

由于在残基35之后没有插入，CDR1具有1型正则结构。

重链CDR2：类4型正则结构(SEQ ID NO：2)

50	51	52	52a	52b	52c	53	54	55	56	57	58	59	60	61	62	63	64	65
50	51	52	52a	52b	52c	53	54	55	56	57	58	59	60	61	62	63	64	65	E	I	R	S	K	A	N	N	H	A	P	Y	Y	T	E	S	V	K	G

由于在残基52之后插入了三个另外的残基，重链CDR2与4型正则结构非常相像。然而，该正则结构通常在55位置为酪氨酸，54位置为丝氨酸或赖氨酸。在Hab18中的55位置为组氨酸，54位置为天冬酰胺，这使得该CDR应被归类为最接近4型正则结构的一种不规则正则结构(下文称为“类4型”)。

轻链CDR1：2型正则结构(SEQ ID NO：4)

24	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34
24	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34	K	A	S	Q	S	V	I	N	D	V	A

由于在残基27至31之间没有插入或缺失，CDR1具有2型正则结构。

轻链CDR2：1型正则结构(SEQ ID NO：5)

50	51	52	53	54	55	56
50	51	52	53	54	55	56	Y	A	S	N	R	N	T

这不是一个特殊的序列，为1型正则结构。

轻链CDR 3：1型正则结构(SEQ ID NO：6)

89	90	91	92	93	94	95	96	97
89	90	91	92	93	94	95	96	97	Q	Q	D	Y	S	P	P	F	T

基于序列的长度以及90位的谷氨酰胺和95位的脯氨酸，这一序列与1型正则结构相一致。

Hab18重链V区域的序列示于SEQ ID NO：7。CDR1为1型正则结构、CDR2为4型或类4型(CDR2中的残基数目相同但其序列在54和/或55位置不具有典型的“标志”残基)正则结构的人类种系VH区域序列被选择并示于SEQ ID NO：8至12。如图1所示，将这些序列与Hab18抗体的VH区域(SEQ ID NO：7)进行比对。

Hab18可变区重链的CDR 3/JH区域序列示于SEQ ID NO：13。人类种系JH区域序列(即JH1-JH6)分别示于SEQ ID NO：14至19。SEQID NO：8至12所示任意种系序列与上述六个可能的任意JH序列(SEQID NO：14至19)相组合，均可以为制备人源化重链提供框架区域。

将下述序列组合以设计超人源化^TM抗体可变区：重链可变域由来源于Hab18的重链Kabat CDR序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3)和与种系序列3-73*01(SEQ ID NO：12)、3-49*01(SEQ ID NO：10)或3-72*01(SEQ ID NO：11)相同的框架区组成。基于鼠类Hab 18 CDR和3-72*01(SEQ ID NO：11)和JH2(SEQ ID NO：15)种系序列的人源化重链可变区的一个实例由SEQ ID NO：20所示序列构成。基于鼠类Hab18CDR和3-49*01(SEQ ID NO：10)和JH2(SEQ ID NO：15)种系序列的人源化重链可变区的另一个实例由SEQ ID NO：21所示序列构成。基于鼠类Hab18 CDR和3-73*01(SEQ ID NO：12)和JH1(SEQ ID NO：14)种系序列的人源化重链可变区的又另一个实例由SEQ ID NO：22所示序列构成。

由于具有这一系列正则结构型的人类种系可变区的数目是有限的，又由于3型正则结构与4型正则结构相类似(见图2)，因此我们还将Hab18的CDR与具有1型正则结构CDR1和3型正则结构CDR2的人类种系V外显子进行了比对。上述任意这些种系序列(SEQ ID NO：23至46所示)与上述六个可能的任意JH序列(SEQ ID NO：14至19所示)相组合，均可以为制备人源化重链提供合适的框架区域。

将下述序列组合以设计超人源化^TM抗体轻链可变区序列：Kabat定义的CDR(SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)来源于鼠类Hab18抗体可变区轻链，框架来源于与鼠类Hab18轻链可变区具有相同正则结构(即在CDR1、CDR2和CDR3分别具有2型、1型和1型正则结构)的人类种系Vκ序列与五种可能的任意Jκ片段的任意组合。

Hab18轻链的V区域序列示于图3和SEQ ID NO：47。选定的与鼠类Hab18轻链可变区具有相同正则结构的人类种系Vκ序列也示于图3以及SEQ ID NO：48至59。

为选择最优选的人类轻链序列来进行操作，我们如图3所示将选定的人类种系Vκ序列与鼠类Hab18κ轻链可变区的CDR进行了比对。然后通过考虑在3个CDR中相同的氨基酸(即在Hab18CDR中的对应位置上相同)的总数或是在3个CDR的可能与抗原相接触的区域(氨基酸位置的精确列表见图3)中相同的氨基酸的总数来对它们进行排序。使用这些标准选出了两个优选的实例，名为1-6*01(SEQ ID NO：48)和3-11*01(SEQID NO：57)。1-6*01(SEQ ID NO：48)序列与鼠类Hab18在3个CDR的可能涉及与抗原相接触的区域具有最高的序列同一性。

Hab18可变轻链CDR3/J区域的序列示于SEQ ID NO：60。人类种系Jκ区域(JK1-JK5)的序列分别示于SEQ ID NO：61至65。由于JK3(SEQID NO：63)在Kabat残基96和97位与SEQ ID NO：60相同，因此选择它作为优选的实施方案。通过将1-6*01(SEQ ID NO：48)序列与JK3序列(SEQ ID NO：63)以及鼠类Hab18 CDR(如SEQ ID NO：4至6所示)相组合，产生了SEQ ID NO：66所代表的人源化Vκ(轻)链。

由于并不知道Hab18抗体与其靶标抗原结合的精确界面，我们还考虑了与鼠类Hab18在3个CDR中(考虑所有的CDR残基)具有最高序列同一性的3-11*01序列(SEQ ID NO：57)。通过将其与JK3序列(SEQ IDNO：63)以及鼠类Hab18 CDR(如SEQ ID NO：4至6所示)相组合，产生了SEQ ID NO：67所代表的人源化Vκ(轻)链。

实施例2：人源化Hab18 scFv片段的结合亲和力

为评价超人源化^TM过程在改变结合亲和力方面成功与否，通过基因合成方法(Stemmer et al.，1995.Gene 16：49-53)构建了下述超人源化^TM单链可变区片段：

scFv-1(SEQ ID NO：68)：将SEQ ID NO：20所示的人源化重链序列与SEQ ID NO：66所示的人源化轻链序列相结合。

scFv-2(SEQ ID NO：69)：将SEQ ID NO：20所示的人源化重链序列与SEQ ID NO：67所示的人源化轻链序列相结合。

组装了一个由超人源化^TM重链、超人源化^TM轻链以及连接它们的一个以(G₄S₃)基序为特征的15个残基的连接区域组成的盒(Huston etal.，1988)，所述组装在重链的起点、连接区域中和轻链的终点分别使用了NcoI、BamHI和NotI限制位点(见图4)。将完整的scFv构建体插入至一个基于pUC18的细菌表达载体中，该载体以N端的信号肽(在周质中裂解)和C端的六组氨酸标签为特征，使得产物可在Ni²⁺-螯合树脂上纯化。在其C端还包括由DYKDDDDK序列组成的FLAG标签(Slootstra et al.，1997)(见图5)，以便于使用抗FLAG表位的市售抗体进行检测或纯化。将表达构建体转化至大肠埃希氏菌HB2151菌株中并验证了其DNA序列。在添加0.05％葡萄糖的2xYT培养基中在30℃进行蛋白质表达，在对数生长晚期加入0.5mM IPTG诱导表达并过夜使表达增加。通过离心从培养基中分离细胞后，于冰上在添加了1mM EDTA的、30mM Tris(pH8)缓冲的20％蔗糖溶液中重悬和培养细胞以进行渗透压休克而释放周质部分，然后通过离心分离渗透部分。蛋白质印迹分析确认了单体scFv蛋白质的存在。每一构建体在周质部分中观察到的scFv的表达量大致相同。根据厂商说明书，使用Ni-NTA超流动(superflow)微球(Qiagen，Doncaster)进一步纯化蛋白质，得到的蛋白质经SDS PAGE测定纯度＞90％。

通过ELISA测定了Hab18与其靶标——细胞表面分子CD147的结合：将溶于0.1M碳酸钠(pH 9.5)的重组人类CD147(由AmProx，Carlsbad，CA提供，在大肠埃希氏菌中表达)按100ng/孔的量固定于平板上，4℃过夜。然后洗涤各孔并用4％脱脂乳在室温培养2小时进行封闭，再用添加0.05％Tween-20(Sigma，St Louis)的磷酸盐缓冲盐溶液(pH 7.4，PBS)洗涤，然后再与在PBS中系列稀释的超人源化^TMscFv的粗蛋白质周质部分一起在室温振荡培养2小时，然后再用添加0.05％Tween-20的PBS洗涤各孔。根据厂商的说明书，将抗FLAG-辣根过氧化物酶缀合物(Sigma，St Louis MO)加至孔中在室温振荡培养一小时以检测结合。用SureBlue过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg)显示结合。15分钟后加入0.1M HCl终止酶反应并通过在450nm处的分光吸收度测量过氧化物酶产物。用以Fab片段形式重组表达的亲代小鼠抗体作为阳性对照，将平行二次测量的平均值与阳性对照相比较(见图5)。小鼠Fab片段的表达和周质部分从大肠埃希氏菌中的提取使用的条件与scFv构建体的相似。发现构建体scFv-1(SEQ ID NO：68)似乎保留了小鼠Fab片段大约30％-50％的结合亲和力：由于scFv片段通常比对应的Fab片段的亲合力要低，所以这种人源化scFv(SEQ ID NO：68)比鼠类Fab的结合力稍低的原因有一部分应归于这一因素，并且/或者由于人源化序列本身就比鼠类序列的亲合力稍低。存在相同重链的scFv-1(SEQID NO：68)和scFv-2(SEQ ID NO：69)在结合力上的差异说明人源化轻链似乎也是很重要的。

本领域技术人员应当理解，诚如本发明的说明书所广泛描述的那样，可在不背离本发明精神或范围的条件下可对本发明的具体实施方案作出各种变化和/或改变。因此，上述的实施方案从任何角度来看都应被认为是说明性的而非限制性的。

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序列表

<110>EvoGenix Ltd

EvoGenix，Inc.

<120>特异性针对肝细胞癌和其他癌的抗体及其用途

<130>503805

<160>70

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>小鼠

<400>1

Asp Ala Trp Met Asp

1 5

<210>2

<211>19

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Pro Tyr Tyr Thr Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>小鼠

<400>3

Asp Ser Thr Ala Thr His

1 5

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠

<400>5

Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠

<400>6

Gln Gln Asp Tyr Ser Pro Pro Phe Thr

1 5

<210>7

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠

<400>7

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Ser Thr Ala Thr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>8

<211>100

<212>PRT

<213>人

<400>8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr

100

<210>9

<211>100

<212>PRT

<213>人

<400>9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Cys Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Val Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr

100

<210>10

<211>100

<212>PRT

<213>人

<400>10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Thr Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg

100

<210>11

<211>100

<212>PRT

<213>人

<400>11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg

100

<210>12

<211>100

<212>PRT

<213>人

<400>12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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Tyr Cys Thr Arg

100

<210>13

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠

<400>13

Asp Ser Thr Ala Thr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210>14

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>14

Ala Glu Tyr Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210>15

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>15

Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>16

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1 5 10 15

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>17

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 15

<210>18

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>18

Asn Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 15

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>19

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1 5 10 15

Thr Val Ser Ser

20

<210>20

<211>117

<212>PRT

<213>人源化重链

<400>20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>21

<211>117

<212>PRT

<213>人源化重链

<400>21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>22

<211>117

<212>PRT

<213>人源化重链

<400>22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Pro Tyr Tyr Thr Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>23

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>23

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>24

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>25

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<213>人

<400>25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg

<210>26

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<213>人

<400>26

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>27

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>28

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>28

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala

<210>29

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>30

<211>99

<212>PRT

<213>人

<400>30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp

<210>31

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>32

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>33

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>34

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>34

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys

<210>35

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys

<210>36

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pre Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>37

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys

<210>38

<211>99

<212>PRT

<213>人

<400>38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Ser Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg

<210>39

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>39

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys

<210>40

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>41

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>41

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>42

<211>99

<212>PRT

<213>人

<400>42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp

<210>43

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>44

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>45

<2ll>98

<212>PRT

<213>人

<400>45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>46

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>47

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠

<400>47

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Val Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Pro Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>48

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>48

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>49

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>49

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>50

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>51

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>52

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>53

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>54

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>55

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>56

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>56

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>57

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>57

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>58

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>58

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>59

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>59

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr

<210>60

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠

<400>60

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210>61

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>61

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210>62

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>62

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210>63

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>63

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

1 5 10

<210>64

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>64

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210>65

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>65

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210>66

<211>108

<212>PRT

<213>人工序列

<223>基于1-6*01和JK3的人源化Hab18轻链

<400>66

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Pro Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210>67

<211>108

<212>PRT

<213>人工序列

<223>基于3-11*01和JK3的人源化Hab18轻链

<400>67

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Pro Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210>68

<211>260

<212>PRT

<213>人工序列

<223>基于重链SEQ ID NO：20和轻链SEQ ID NO：66的超人源化抗体scFv片段

<400>68

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Pro Tyr TyrThr Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Thr Ala Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Val Ile Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr

210 215 220

Ser Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

225 230 235 240

Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His

245 250 255

His His His His

260

<210>69

<211>260

<212>PRT

<213>人工序列

<223>基于重链SEQ ID NO：20和轻链SEQ ID NO：67的超人源化抗体scFv片段

<400>69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Pro Tyr Tyr Thr Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Thr Ala Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Val Ile Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

165 170 175

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Ile Pro Ala

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr

210 215 220

Ser Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

225 230 235 240

Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His

245 250 255

His His His His

260

<210>70

<211>269

<212>PRT

<213>人

<400>70

Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr

1 5 10 15

His Gly Ala Ser Gly Ala Ala Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp

20 25 30

Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr

35 40 45

Glu Val Thr Gly His Arg Trp Leu Lys Gly Gly Val Val Leu Lys Glu

50 55 60

Asp Ala Leu Pro Gly Gln Lys Thr Glu Phe Lys Val Asp Ser Asp Asp

65 70 75 80

Gln Trp Gly Glu Tyr Ser Cys Val Phe Leu Pro Glu Pro Met Gly Thr

85 90 95

Ala Asn Ile Gln Leu His Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser

100 105 110

Ser Glu His Ile Asn Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser

115 120 125

Glu Ser Val Pro Pro Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp

130 135 140

Ser Glu Asp Lys Ala Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val

145 150 155 160

Ser Ser Ser Gln Gly Arg Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met

165 170 175

Glu Ala Asp Pro Gly Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly

180 185 190

Ser Asp Gln Ala Ile Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Ala

195 200 205

Leu Trp Pro Leu Leu Gly Ile Val Ala Glu Val Leu Val Leu Val Thr

210 215 220

Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Asp

225 230 235 240

Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln His Gln

245 250 255

Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser

260 265

Claims

1.一种含有可变区的非人类抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段特异性结合CD147，其中受试抗体或抗体片段可变区已被突变以降低所述抗体或抗体片段在人体中的免疫原性。

2.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段为去免疫化的。

3.根据权利要求1或权利要求2的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段为人源化的。

4.根据权利要求3的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段为超人源化^TM的。

5.根据前述权利要求任意一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段经过表面重建。

6.根据前述权利要求任意一项的抗体或抗体片段，其中所述可变区包括重链可变区，并且只有重链可变区的CDR3来源于受试非人类抗体或抗体片段或者与受试非人类抗体或抗体片段基本相同。

7.根据权利要求6的抗体或抗体片段，其中所述重链的CDR3来源于SEQID NO：3或者具有与SEQ ID NO：3基本相同的序列。

8.根据权利要求6或权利要求7的抗体或抗体片段，其中所述仅存的可变区为重链可变区。

9.根据权利要求9的抗体或抗体片段，其中所述CDR1和CDR2中的一个或两个来源于受试非人类抗体或抗体片段或者与受试非人类抗体或抗体片段基本相同。

10.根据权利要求1至7任意一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段含有重链可变区和轻链可变区。

11.根据权利要求10的抗体或抗体片段，其中所述可变区的六个CDR中的至少两个来源于受试抗体或抗体片段的对应CDR或者与受试抗体或抗体片段对应CDR基本相同，其中至少有一个CDR是重链可变区CDR3。

12.根据权利要求11的抗体或抗体片段，其中所述可变区的六个CDR中的至少三个、至少四个、至少五个或全部六个来源于受试抗体或抗体片段的对应CDR或者与受试抗体或抗体片段的对应CDR基本相同。

13.根据权利要求10的抗体或抗体片段，包括选自下列的至少1个、2个、3个或4个CDR：SEQ ID NO：1的重链CDR1、SEQ ID NO：2的重链CDR2、SEQ ID NO：4的轻链CDR1、SEQ ID NO：5的轻链CDR2和SEQ ID NO：6的轻链CDR3。

14.根据权利要求10的抗体或抗体片段，包括SEQ ID NO：1的重链CDR1、SEQ ID NO：2的重链CDR2、SEQ ID NO：4的轻链CDR1、SEQ ID NO：5的轻链CDR2和SEQ ID NO：6的轻链CDR3。

15.根据权利要求3任意一项的抗体或抗体片段，其中所述可变区含有根据SEQ ID NO：20的重链氨基酸序列。

16.根据权利要求3任意一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段含有根据SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67的轻链氨基酸序列。

17.根据权利要求3的抗体或抗体片段，其中所述可变区含有与SEQ IDNO：20表示氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的重链氨基酸序列。

18.根据前述权利要求任意一项的抗体或抗体片段，其中可变区已被突变的抗体或抗体片段在框架序列中含有不超过10个与候选人类可变区框架序列不同的氨基酸残基。

19.根据前述权利要求任意一项的抗体或抗体片段，其中可变区已被突变的抗体或抗体片段与针对CD147产生的受试鼠类抗体相比，对CD147的亲和力下降不超过100倍。

20.根据前述权利要求任意一项的抗体或抗体片段，其中可变区已被突变的抗体或抗体片段对CD147的亲和力至少为Kd 1nM、10nM、100nM或1μM。

21.根据权利要求3的抗体或抗体片段，其中可变区已被突变的抗体或抗体片段含有框架序列，所述框架序列来源于人类抗体可变重链的框架序列或者与人类抗体可变重链的框架序列基本相同，所述人类抗体可变重链具有1型正则结构的CDR1和4型正则结构的CDR2。

22.根据权利要求3的抗体或抗体片段，其中所述可变区已被突变的抗体或抗体片段含有框架序列，所述框架序列来源于人类抗体可变轻链的框架序列或者与人类抗体可变轻链的框架序列基本相同，所述人类抗体可变轻链具有2型正则结构的CDR1、1型正则结构的CDR2和1型正则结构的CDR3。

23.一种药物组合物，包括根据权利要求1至22任意一项的抗体或抗体片段和可药用的载体。

24.一种缀合物，包括与细胞毒剂相连接的根据权利要求1至22任意一项的抗体或抗体片段。

25.根据权利要求24的缀合物，其中所述细胞毒剂为放射性核素。

26.根据权利要求25的缀合物，其中所述放射性核素选自¹³¹I和⁹⁰Y。

27.一种药物组合物，包括根据权利要求24至26任意一项的缀合物和可药用的载体。

28.一种抑制癌细胞生长的方法，包括将所述细胞与根据权利要求1至22任意一项的抗体或抗体片段相接触。

29.一种治疗癌症患者的方法，包括给予所述患者有效量的根据权利要求1至22任意一项的抗体或抗体片段。

30.根据权利要求29的方法，还包括给予所述患者另一种治疗药剂。

31.根据权利要求30的方法，其中所述治疗药剂为细胞毒剂。

32.一种诊断疑似患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：

给予受试者一种缀合物，所述缀合物包括与可检测标记相连接的根据权利要求1至22任意一项的抗体或抗体片段；并检测所述受试者体内的所述标记缀合物的分布。

33.根据权利要求28至32任一项的方法，其中所述癌症为癌。

34.根据权利要求33的方法，其中所述癌为肝细胞癌。

35.一种可特异性结合CD147的改进的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段由下述方法制备：

(a)提供编码抗体或其片段的DNA，所述DNA包括选自SEQ ID NO：1至69的至少一段序列；

(b)在所述DNA中引入至少一处核苷酸突变、缺失或插入，以使得由所述DNA编码的所述抗体或抗体片段的氨基酸序列被改变；

(c)表达所述抗体或抗体片段；以及

(d)筛选具有所述改进的所述表达的抗体或抗体片段，

由此制得所述改进的抗体或抗体片段。

36.根据权利要求35的抗体或抗体片段，其中所述改进为对CD147亲和力的提高。

37.根据权利要求35或权利要求36的抗体或抗体片段，其中所述至少一处核苷酸突变、缺失或插入通过选自下列的方法制备：寡核苷酸介导的定向诱变、盒式诱变、简并寡核苷酸引物PCR、错配PCR、DNA改组和细菌增变株的使用。

38.根据权利要求35至37任意一项的抗体或抗体片段，其中所述至少一处突变位于CDR中。

39.一种多核苷酸，包括编码根据权利要求1至22任意一项的抗体或抗体片段的核酸序列。

40.一种载体，包括根据权利要求39的多核苷酸。

41.根据权利要求40的载体，其中所述载体为一种能够表达所述抗体或抗体片段的表达载体。

42.一种结合CD147的抗体或抗体片段，包括重链可变区，其中所述重链可变区为SEQ ID NO：7的突变形式，在重链可变区中含有1至20个之间的突变，这使得其与天然人类重链的氨基酸序列的同一性比SEQ ID NO：7所示重链可变区序列的更高。

43.根据权利要求42的抗体或抗体片段，还包括轻链可变区，其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO：4-6的一个、两个或三个CDR。

44.根据权利要求42的抗体或抗体片段，还包括轻链可变区，其中所述轻链包括选自SEQ ID NO：50的轻链的突变形式，其中所述突变形式在轻链可变区中含有1至20个之间的突变，这使得它具有更高的与天然人类轻链的氨基酸序列同一性。

45.一种结合CD147的表位的抗体，所述表位与Hab18的表位重叠，并且所述抗体与Hab18相比含有较少的非人类氨基酸。

46.根据权利要求45的抗体，所述抗体与Hab18相比具有较弱的免疫原性。

47.一种人源化抗体重链，所述重链包括一个或多个来源于鼠类抗体Hab18重链的CDR，还包括一个来源于人类抗体可变重链的框架序列，所述人类抗体可变重链具有1型正则结构的CDR1和根据Kabat抗体编号系统长度为19的CDR2。

48.根据权利要求47的人源化抗体重链，其中所述人类抗体可变重链具有与SEQ ID NO：8至12的任意一个基本相同的序列。

49.一种人源化抗体重链，所述重链包括一个或多个来源于鼠类抗体Hab18重链的CDR，还包括一个来源于人类抗体可变重链的框架序列，所述人类抗体可变重链具有1型正则结构的CDR1和3型正则结构的CDR2。

50.根据权利要求49的人源化抗体重链，其中所述人类抗体可变重链具有与SEQ ID NO：23至46的任意一个基本相同的序列。

51.根据权利要求47至50任意一项的人源化抗体重链，包括选自下列的至少1个CDR：SEQ ID NO：1的CDR1、SEQ ID NO：2的CDR2和SEQID NO：3的CDR3。

52.一种人源化抗体轻链，所述轻链包括一个或多个来源于鼠类抗体Hab18轻链的CDR，还包括一个来源于人类抗体可变轻链的框架序列，所述人类抗体可变轻链具有2型正则结构的CDR1、1型正则结构的CDR2和1型正则结构的CDR3。

53.根据权利要求52的人源化抗体轻链，其中所述人类抗体可变轻链具有与SEQ ID NO：48至59的任意一个基本相同的序列。

54.根据权利要求52或权利要求53的人源化抗体轻链，其中所述重链包括选自下列的至少1个CDR：SEQ ID NO：4的CDR1、SEQ ID NO：5的CDR2和SEQ ID NO：6的CDR3。

55.一种人源化抗体，包括根据权利要求47至51任意一项的重链和/或根据权利要求52至54任意一项的轻链。