CN107312863A - 利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的Ig基因分布的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的Ig基因分布的方法。该方法包括：1)根据5种Ig重链C区设计五套引物，每套引物中包含反转录引物、扩增引物和/或taqman探针；反转录引物与增引物中的下游引物相同；2)同一待测样本等量的5份RNA，反转录成cDNA后进行数字PCR检测，获得5份cDNA中相应Ig基因的原始拷贝数，计算待测样本中5种Ig基因的拷贝数分布。本发明方法可鉴定五种Ig基因的表达情况且不存在偏好性问题，可反应原始样本五种Ig的比例。本发明用数字PCR技术鉴定Ig基因分布可验证测序结果是否存在偏好性，利于引物扩增偏好性的纠正。Ig比例的准确性有助于疾病免疫反应、疫苗评估等研究。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的Ig基因分布的方法。
背景技术
数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量方法，采用绝对定量，不依赖标准曲线或参考基因，比传统Realtime PCR有更高的灵敏度。通过将微样品进行倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过一个，再将所有样本在相同条件下进行PCR扩增，能够测量只含有一个目标分子的样品。可以用染料法或者Taqman探针法进行PCR扩增，根据反应的荧光信号进行结果分析。由于其绝对定量的方法原理及高度灵敏检测特性，dPCR能够应用于不同的领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。其优势主要表现在：1、对于稀有目标分子及突变的检测，能够精确灵敏进行。例如疾病无创(自血液、脱落细胞中)体外诊断筛查技术、体液(血液、尿液、粪便等)中肿瘤核酸标记物高分辨率检测。由于体液(血、尿液、粪便等)中或无创样本(自血液、脱落细胞中)，所含目标检测分子极少，而正常体细胞中背景信号极强，而dPCR技术能够通过微量化有效的减少背景的干扰，同时极其灵敏检测到低含量的目标分子。目前已经应用dPCR的技术有：肿瘤靶向药物基因检测、癌肿分子标记检测、无创产前等技术。2、病原微生物高灵敏度的定性及定量检测。在常规检测方法下，有极少部分病原微生物结果呈现为“弱阳性”。主要是由于这些常规技术在低拷贝检测时，由于方法限制无法检出。而通过dPCR技术则能够对该部分样本进行高灵敏度及特异性的检测，同时能够对病原微生物载量进行定量分析。3、实验室标准品绝对含量检测。分子生物学实验中，常需要对各种中间产物及其他核酸分子进行定量。而这些定量过程中使用的标准品含量通常是通过紫外发光或染料法测后倍比稀释而来，过程中的操作会极大影响标准品的准确性及后续实验。通过dPCR的高灵敏度绝对定量，可以对标准品含量进行准确检测或对样本直接进行绝对定量。
成熟的B淋巴细胞抗体基因由VDJ基因重排后组成，如图1所示，重排后的VDJ基因后面是恒定区基因C。V基因根据功能分为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3五个区域，V基因部分区域和D基因(轻链无D基因)、J基因部分区域、随机插入片段(N)组成CDR3区域。对基因组DNA而言，J基因和C基因之间存在内含子，对表达的成熟信使RNA而言，J基因和C基因的内含子被剪切，J基因和C基因如图1连接在一起。人免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)的重链胚系基因定位于第14号染色体长臂，由V、D、J、C四种基因片段组成，包含40个VH基因片段、25个D基因片段、6个JH基因片段和9个CH基因片段。B细胞接触不同抗原刺激后，IgC区基因的表达情况发生特异性改变，相继出现产生IgM以外的Ig如IgG、IgA或IgE。Ig基因将发生类别转换或者同种型转换产生多种不同类别的Ig。Ig的种类总共是五种，分别是IgA、IgM、IgG、IgD、IgE，C基因决定Ig的类别。
目前，利用免疫组库技术可以扩增B淋巴细胞Ig基因中的VC区域。并且对于B淋巴细胞Ig重链基因来说，扩增VC区域比VJ区域更有价值，C区可以反应五种Ig的比例及变化情况。在免疫组库建库技术中通常必须设计多对V引物和C引物进行多重PCR或者设计多条C引物进行5’race建库，这样PCR过程中会产生偏好性，影响后续分析的准确性，特别是对五种Ig比例的分析。无法确定是否产生偏好性，也无法得到具体是哪些引物产生偏好性，无法针对性地进行引物比例调整，无法验证Ig基因数据分析结果是否可靠，缺乏一种评价PCR偏好性的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的Ig基因分布的方法。
本发明所提供的利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布的方法，可包括如下步骤：
(A1)根据5种Ig的C区基因序列设计五套引物，每套引物中包含反转录引物、用于扩增C区基因的扩增引物和taqman探针。
其中，所述反转录引物的序列与所述扩增引物中的下游引物序列既可以相同，也可以不同。
(A2)取来自同一个受检者等量的5份RNA作为待测样本，每份RNA对应一套引物，采用所述反转录引物将所述RNA反转录成cDNA；采用所述扩增引物和所述taqman探针对所述cDNA做数字PCR检测，从而获得5份cDNA样本中相应Ig的C区基因的原始拷贝数，进而计算所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布。
在本发明的一个实施例中，所述五套引物具体如下：
(B1)针对IgE的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列1所示；所述扩增引物为由序列表中序列1和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列15所示；
(B2)针对IgM的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列2所示；所述扩增引物为由序列表中序列2和序列7所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列12所示；
(B3)针对IgD的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列3所示；所述扩增引物为由序列表中序列3和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列14所示；
(B4)针对IgA的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列4所示；所述扩增引物为由序列表中序列4和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列11所示；
(B5)针对IgG的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列5所示；所述扩增引物为由序列表中序列5和序列10所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列13所示。
所述taqman探针5’端标记有荧光基团，如FAM。所述taqman探针3’端标记有淬灭基团，如BQH1。
在所述方法中，作为所述待测样本的RNA具体可为从所述受检者外周血中提取的RNA。
所述方法在如下中的应用也属于本发明的保护范围：鉴定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性。
本发明还提供了一种鉴定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性的方法。
本发明所提供的鉴定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性的方法，可包括如下步骤：
(C1)利用上述方法(即利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布的方法)检测受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布；
(C2)利用免疫组库测序法检测所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布；
(C3)根据(C1)和(C2)的检测结果按照如下确定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性：若(C1)所得所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布情况与(C2)所得所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布情况一致，则利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物不存在扩增偏好性；反之，则利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物存在扩增偏好性。
前文所述两种方法在如下中的应用也属于本发明的保护范围：对利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的原本存在扩增偏好性的多重PCR扩增引物的用量和/或配比进行调整，以纠正原本存在的扩增偏好性，使偏好性达到最小，从而准确反应原始样本中B淋巴细胞的5种Ig的C区基因表达的分布比例。
本发明还请求保护如上所述的五套引物，以及这五套引物在利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布情况中的应用。
本发明提出一种可以验证扩增C基因时，使用多对引物的PCR是否存在扩增偏好性的技术。该方法分别使用一条引物做RNA反转，一对引物扩增cDNA的Ig基因，过程不存在多对引物扩增效率互相影响的偏好性。并且使用探针法dPCR精确定量cDNA的拷贝数，数据结果可靠。可以准确的反应C基因中5种Ig的C区基因的表达量，从而验证高通量免疫组库多重PCR中C区引物扩增的准确性，使测序的数据分析结果更加可信。提供了一种有效、准确度高的方法验证测序数据中5种Ig的C区基因的表达量是否存在偏好性，为多重PCR中的引物是否存在偏好性提供有力的证据。Ig比例的准确性有助于疾病免疫反应、疫苗评估等研究。
附图说明
图1为VDJ基因重排。
图2为dPCR鉴定B淋巴细胞Ig基因分布的技术流程图。
图3为微滴分析仪分析后5中Ig基因的cDNA拷贝数。各图依次为IGHA、IGHM、IGHG、IGHD、IGHE。
图4为微滴式分析仪中显示的拷贝数形式。
图5为免疫组库测序法得到的Ig的C区基因的拷贝数分布图。
图6为免疫组库测序法得到的Ig的C区基因的拷贝数分布图。
图7为数字PCR鉴定Ig的C区基因的拷贝数分布图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的Ig基因分布
一、技术流程
如图2所示，首先根据5种Ig的C区基因序列设计五套引物，每套引物中包含反转录引物、用于扩增C区基因的扩增引物和taqman探针；其中，所述反转录引物的序列与所述扩增引物中的下游引物序列相同。引物序列如表1至表3所示。
表1 5种Ig的C区基因序列的反转录引物
| IGHER | CCCACGCACCCGAGAC(序列1) |
| IGHMR | GTGAGGTGGCTGCGTACTTGC(序列2) |
| IGHDR | CCACGCATTTGTACTCGC(序列3) |
| IGHAR | GGGCAGGGCACAGTCACATCC(序列4) |
| IGHGR | GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC(序列5) |
表2 5种Ig的C区基因序列的扩增引物
| IGHEF | gtcttccccttgacccgct(序列6) |
| IGHMF | ctgtgagaattccccgtcgga(序列7) |
| IGHDF | catcatatcagggtgcagacac(序列8) |
| IGHAF | gtggtcrtcgcmtgcctggt(序列9) |
| IGHGF | gtcttccccctggcrccct(序列10) |
| IGHER | CCCACGCACCCGAGAC(序列1) |
| IGHMR | GTGAGGTGGCTGCGTACTTGC(序列2) |
| IGHDR | CCACGCATTTGTACTCGC(序列3) |
| IGHAR | GGGCAGGGCACAGTCACATCC(序列4) |
| IGHGR | GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC(序列5) |
表3 5种Ig的C区基因序列的taqman探针
| ddHA | CCGCTTTCGCTCCAGGTCACACT(序列11) | 5'-FAM；3'-BQH1 |
| ddHM | aagccccgggtrctgctga(序列12) | 5'-FAM；3'-BQH1 |
| ddHG | aggactacttcccmgaaccggtg(序列13) | 5'-FAM；3'-BQH1 |
| ddHD | TACCACCCAACGTCCGTGACT(序列14) | 5'-FAM；3'-BQH1 |
| ddHE | CCCTCCAATGCCACCTCCGTGACT(序列15) | 5'-FAM；3'-BQH1 |
然后抽取人的外周血1-2ml，提取RNA。分别取5份等量的RNA样本，实施例中以0.5μg为例。分别用表1中的C区特异性反转录引物反转为cDNA。取相同体积的cDNA做dPCR。
利用Bio-Rad型号QX200TM的数字PCR仪，由微滴生成仪和微滴分析仪组成。采用油包水微滴式乳化技术，在一个反应管内乳化成上万个独立的PCR反应器，从而实现数字PCR技术。一个样本产生20000个微滴，每个微滴体积为1nl，仪器一次能检测96个样本，灵敏度万分之一。使用Bio-rad微滴式数字PCR(dPCR)探针法试剂盒Droplet PCR Supermix(货号1863024)，体系如下表4，放到微滴生成仪上自动化生成微滴。PCR运行条件为95℃10分钟，94℃30秒，56℃1分钟，98℃10分钟，4℃保存，第2和第3步循环40次，温度上升和下降梯度为2℃/S。把样本放到微滴分析仪上，用QuantaSoft进行分析，最后会显示每个孔内的cDNA分子拷贝数。
表4探针法dPCR体系
| 试剂组分 | 体积(μl) |
| Mix | 11 |
| 引物(5μM) | 2.2 |
| 探针(10μM) | 1.1 |
| cDNA样本 | 1-7.7 |
| 水 | 补到22μl |
| 总计 | 22 |
二、结果
图3为微滴分析仪分析后5中Ig基因的cDNA拷贝数，图示依次为IGHA、IGHM、IGHG、IGHD、IGHE。由于人体中占大部分的免疫球蛋白是IGHA、IGHM、IGHG，IGHD、IGHE含量很少。于是，取相同体积的cDNA中，IGHA、IGHM、IGHG cDNA稀释了20倍，IGHD、IGHE没有稀释。样本浓度太高可能会导致ddPCR失败，可能微滴数太多，结果也会不准确。表5为5种Ig基因的表达量，并按各自的拷贝数计算了5种Ig基因表达量的比例分布，蓝色的点为有荧光信号的微滴数。微滴式分析仪中显示的拷贝数形式可见图4。
表5 5种Ig重链C区基因的cDNA拷贝数
| 目标区域 | 20×cDNA浓度(拷贝数/μl) | cDNA浓度(拷贝数/μl) | 百分比 |
| IGHA | 787 | 15740 | 70％ |
| IGHM | 71.2 | 1424 | 6％ |
| IGHG | 218 | 4360 | 20％ |
| IGHD | 无 | 825 | 4％ |
| IGHE | 无 | 14.9 | 0％ |
另外，本发明的发明人用上述的DNA样本进行免疫组库建库测序，图5和图6为免疫组库测序法得到的Ig的C区基因的拷贝数分布图，图7为数字PCR鉴定Ig的C区基因的拷贝数分布图。图5和图6是不同的两套引物，图6中使用的这套引物为文献Lineage Structure ofthe Human Antibody Repertoire in Response to Influenza VaccinationNing Jianget al.Sci Transl Med 5,171ra19(2013)报道的，对Ig重链的C基因分布无明显偏好的引物。图5与图7比较，图5使用的引物存在明显的扩增偏好，无法反映原始的Ig基因的表达量。图6与图7比较，两者Ig的C区基因的拷贝数的分布结果比较一致。
<110> 深圳华大基因研究院
<120> 利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的Ig基因分布的方法
<130> GNCLN171539
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cccacgcacc cgagac 16
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gtgaggtggc tgcgtacttg c 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ccacgcattt gtactcgc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gggcagggca cagtcacatc c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
ggaaggtgtg cacgccgctg gtc 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
gtcttcccct tgacccgct 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ctgtgagaat tccccgtcgg a 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
catcatatca gggtgcagac ac 22
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> r为g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> m为a或c
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gtggtcrtcg cmtgcctggt 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> r为g或a
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gtcttccccc tggcrccct 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ccgctttcgc tccaggtcac act 23
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> r为g或a
<400> 12
aagccccggg trctgctga 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> m为a或c
<400> 13
aggactactt cccmgaaccg gtg 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
taccacccaa cgtccgtgac t 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
ccctccaatg ccacctccgt gact 24
Claims (8)
1.一种利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布的方法，包括如下步骤：
(A1)根据5种Ig的C区基因序列设计五套引物，每套引物中包含反转录引物、用于扩增C区基因的扩增引物和taqman探针；
(A2)取来自同一个受检者等量的5份RNA作为待测样本，每份RNA对应一套引物，采用所述反转录引物将所述RNA反转录成cDNA；采用所述扩增引物和所述taqman探针对所述cDNA做数字PCR检测，从而获得5份cDNA样本中相应Ig的C区基因的原始拷贝数，进而计算所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述五套引物如下：
(B1)针对IgE的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列1所示；所述扩增引物为由序列表中序列1和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列15所示；
(B2)针对IgM的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列2所示；所述扩增引物为由序列表中序列2和序列7所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列12所示；
(B3)针对IgD的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列3所示；所述扩增引物为由序列表中序列3和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列14所示；
(B4)针对IgA的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列4所示；所述扩增引物为由序列表中序列4和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列11所示；
(B5)针对IgG的C区基因：所述反转录引物的序列如序列表中序列5所示；所述扩增引物为由序列表中序列5和序列10所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述taqman探针的序列如序列表中序列13所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：作为所述待测样本的RNA为从所述受检者外周血中提取的RNA。
4.权利要求1-3中任一所述方法在如下中的应用：鉴定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性。
5.一种鉴定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性的方法，包括如下步骤：
(C1)利用权利要求1-3中任一所述的方法检测受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布；
(C2)利用免疫组库测序法检测所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布；
(C3)根据(C1)和(C2)的检测结果按照如下确定利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物是否存在扩增偏好性：若(C1)所得所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布情况与(C2)所得所述受检者B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布情况一致，则利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物不存在扩增偏好性；反之，则利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的多重PCR扩增引物存在扩增偏好性。
6.权利要求1-3中任一所述方法或权利要求5所述方法在如下中的应用：对利用免疫组库测序法检测B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布时所采用的原本存在扩增偏好性的多重PCR扩增引物的用量和/或配比进行调整，以纠正原本存在的扩增偏好性。
7.成套引物，其特征在于：所述成套引物为权利要求2中所述的五套引物。
8.权利要求7所述的成套引物在利用数字PCR鉴定B淋巴细胞的5种Ig的C区基因的拷贝数分布情况中的应用。
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