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ES2588596T3 - Moléculas de anticuerpo que se unen a IL-17A e IL-17F - Google Patents

Moléculas de anticuerpo que se unen a IL-17A e IL-17F Download PDF

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ES2588596T3
ES2588596T3 ES07824232.8T ES07824232T ES2588596T3 ES 2588596 T3 ES2588596 T3 ES 2588596T3 ES 07824232 T ES07824232 T ES 07824232T ES 2588596 T3 ES2588596 T3 ES 2588596T3
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ES
Spain
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antibody
human
seq
present
dna
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ES07824232.8T
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English (en)
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Ralph Adams
Andrew George Popplewell
Stephen Edward Rapecki
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UCB Biopharma SRL
Original Assignee
UCB Biopharma SRL
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humana y a IL-17F humana, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 9 y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 7, o 5 una secuencia que es idéntica a las mismas en al menos un 95%, y en donde el anticuerpo presenta una afinidad por IL-17A mejor que 20 pM y una afinidad por IL-17F mejor que 2 nM.

Description

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respuesta biológica tal como una linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento conocido e inmunoglobulinas.
Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles por ejemplo en diagnosis. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleídos radioactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía de emisión positrónica), e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase de forma general la Patente de EE.UU. nº 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso en diagnosis. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los nucleídos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.
En otro ejemplo la molécula efectora puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar la administración de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmune. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO 05/117984.
Cuando la molécula efectora es un polímero puede, de forma general, ser un polímero sintético o natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, o un polisacárido ramificado o sin ramificar, p.ej., un homo-o hetero-polisacárido.
Los sustituyentes opcionales particulares que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.
Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(vinilalcohol) de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituidos, o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) sustituido opcionalmente tal como metoxipoli(etilenglicol) o sus derivados.
Los polímeros naturales particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.
“Derivados”, tal como se usa en la presente memoria, pretende incluir derivados de reacción, por ejemplo grupos reactivos selectivos a tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar ligado al polímero directamente o a través de un segmento ligando. Cabe destacar que el residuo de dicho grupo en algunos casos formará parte del producto como grupo ligando entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero puede variarse según se desee, pero generalmente estará en un rango de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da, preferiblemente de 5000 a 40000 Da, y más preferiblemente de 20000 a 40000 Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse en concreto en función del uso pretendido para el producto, por ejemplo, la capacidad para localizarse en determinados tejidos tales como tumores o de extender la vida media en circulación (para una revisión véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por tanto, por ejemplo, cuando el producto esté destinado a abandonar la circulación y penetrar en un tejido, por ejemplo, para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de bajo peso molecular, por ejemplo con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.
Los polímeros particularmente preferidos incluyen un polímero de polialquileno, tal como poli(etilenglicol) o, especialmente un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.
En un ejemplo, los anticuerpos para uso en la presente invención se unen a grupos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden unirse a través de cualquier amino ácido disponible en la cadena lateral o de cualquier grupo funcional aminoácido terminal, localizados en el fragmento del anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden existir de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden introducirse en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véase por ejemplo las Patentes de EE.UU. nº 5.219.996; 5.667.425, y el documento WO 98/25971). En un ejemplo la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en el que la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Preferiblemente, los aminoácidos adicionales forman una región de bisagra que contiene uno o más residuos de cisteína, a los cuales se puede unir la molécula efectora. Se pueden usar sitios múltiples para unir dos o más moléculas de PEG.
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Preferiblemente, las moléculas de PEG se unen covalentemente mediante un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar ligada covalentemente al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. Generalmente, el enlace covalente será un enlace de disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de anclaje, se pueden usar moléculas efectoras adecuadamente activadas, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como se ha descrito anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo tiol tal como un ácido ó éster α-halocarboxílico, p.ej., yodoacetamida, una imida, p.ej., maleimida, una sulfona de vinilo o un disulfuro. Dichos materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo en Nektar, antes Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles comercialmente empleando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (que se puede obtener en Nektar, antes Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (que se puede obtener en Nektar, antes Shearwater).
En una realización, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado que está PEGilado, es decir, tiene un PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente, p.ej., según el método descrito en el documento EP 0948544 [véase también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and
S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. En un ejemplo se une PEG a una cisteína de la región de bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida ligado covalentemente a un único grupo tiol en una región de bisagra modificada. Se puede ligar covalentemente un residuo de lisina al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amino del residuo de lisina se puede unir un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tenga un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede ser, por tanto, de aproximadamente 40.000 Da.
En una realización, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad por IL-17A humana y por IL-17F humana, que es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 7 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de bisagra modificada que contiene al menos un residuo de cisteína al cual se une una molécula efectora. Preferiblemente, la molécula efectora es PEG y se une usando los métodos descritos en los documentos WO 98/25971 y WO 2004072116, mediante los cuales se une un grupo lisil-maleimida al residuo de cisteína del extremo C-terminal de la cadena pesada, y cada grupo amino del residuo lisilo lleva unido covalentemente un residuo metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al anticuerpo es por tanto de aproximadamente 40.000 Da.
En otro ejemplo se pueden unir moléculas efectoras a los fragmentos de anticuerpo usando los métodos descritos en las Solicitudes de Patente Internacionales WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171.
La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica las cadenas pesada y ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido mediante procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.
Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse mediante métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se pueden sintetizar según se desee secuencias de ADN que codifican para parte o para la totalidad de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo a partir de determinadas secuencias de ADN o en base a las correspondientes secuencias de aminoácido.
El ADN que codifica para secuencias estructurales aceptoras está disponible ampliamente para los especialistas en la técnica y puede sintetizarse fácilmente en base a sus secuencias de aminoácidos conocidas.
Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden sintetizar las secuencias de ADN deseadas completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden usar las técnicas de mutagénesis sito-dirigida y de reacción en cadena de polimerasa (PCR) según se juzgue apropiado.
Los ejemplos de secuencias adecuadas se proporcionan en las SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. Los nucleótidos 1-57 de la SEQ ID NO: 18 y 1-60 de la SEQ ID NO: 14 codifican la secuencia de péptido señal del anticuerpo de ratón B72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505), que se divide para proporcionar una molécula de anticuerpo neutralizante de la presente invención.
La presente invención también se refiere a un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o expresión
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La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo para uso en el control de enfermedades inflamatorias. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo puede usarse para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio.
La presente invención también proporciona la molécula de anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que esté mediado por IL-17A y/o por IL-17F, o que esté asociado a un nivel incrementado de IL-17A y/o de IL-17F. Preferiblemente, la afección patológica se selecciona del grupo que consiste en infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias), el choque endotóxico asociado a infección, artritis, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celiaca, enfermedad de vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, soriasis, vasculitis, adhesiones quirúrgicas, apoplejía, diabetes de tipo I, artritis de Lyme, meningoencefalitis, trastornos inflamatorios de origen inmune del sistema nervioso central y periférico, tal como esclerosis múltiple y síndrome de Guillain-Barr, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugía), enfermedad de injerto-contra-hospedante, rechazo de trasplante, cáncer (tanto tumores sólidos como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, cánceres de células transicionales, cánceres de ovario y malignidades hematológicas, y en particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, cáncer gástrico y cáncer de colon), enfermedad cardiaca que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio, así como aterosclerosis, coagulación intravascular, reabsorción ósea, osteoporosis, periodontitis e hipoclorhidria.
La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo según la presente invención para uso en el tratamiento o la profilaxis del dolor.
La presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo según la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL17A y/o IL-17F, o que está asociado a un nivel incrementado de IL-17A y/o de IL-17F. Preferiblemente, el trastorno patológico es artritis reumatoide o esclerosis múltiple.
La presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo según la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis del dolor.
Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser utilizada en cualquier terapia en la que se desee reducir los efectos de IL-17A y/o de IL-17F en el cuerpo humano o de un animal. La IL-17A y/o la IL-17F pueden estar en circulación en el cuerpo o pueden estar presentes en un nivel indeseablemente elevado localizadas en un sito concreto del cuerpo, por ejemplo en una zona de inflamación.
Una molécula de anticuerpo según la presente invención se usa preferiblemente para el control de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes o cáncer.
La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen o que están en riesgo de padecer un trastorno mediado por IL-17A y/o IL-17F, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo de la presente invención.
Una molécula de anticuerpo según la presente invención se usa también en diagnosis, por ejemplo en diagnosis in vivo y en técnicas de imagen de estados de enfermedad que implican IL-17A y/o IL-17F.
La presente invención se describe adicionalmente, meramente a modo ilustrativo, en los siguientes ejemplos, que están referidos a las Figuras acompañantes, en las que:
Figura 1:
a) Región V de cadena ligera del anticuerpo CA028_0496 (SEQ ID NO: 7)
b) Región V de cadena pesada del anticuerpo CA028_0496 (SEQ ID NO: 9)
c) CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5), CDRL3 (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo CA028_496.
d) Cadena ligera del anticuerpo CA028_496 (SEQ ID NO: 11).
e) Cadena pesada del anticuerpo CA028_496 (SEQ ID NO: 15).
f) ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo CA028_496 que incluye la secuencia señal (SEQ ID NO: 14).
g) ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo CA028_496 que incluye la secuencia señal (SEQ ID NO: 18).
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Figura 2:
a) Efecto del anticuerpo CA028_0496 (designado Ab#496 en la leyenda) sobre la producción de IL-6 inducida por IL-17 humana en células Hela.
b) Efecto del anticuerpo CA028_0496 (designado Ab#496 en la leyenda) sobre la producción de IL-6 inducida por IL-17F humana en células Hela.
Manipulaciones de ADN y métodos generales
Se usó la cepa de E. coli INVαF’ (Invitrogen) para la transformación y el crecimiento de cultivo rutinario. Las enzimas de restricción y modificación de ADN fueron obtenidas en Roche Diagnostics Ltd. y en New England Biolabs. Las preparaciones de plásmido se llevaron a cabo usando kits de purificación Maxi Plasmid (QIAGEN, nº de catálogo 12165). Las reacciones de secuenciamiento de ADN se llevaron a cabo usando el kit de secuenciamiento ABI Prism Big Dye terminator (nº de catálogo 4304149) y se ejecutaron en un secuenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems). Los datos fueron analizados usando el programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Los oligonucleótidos se obtuvieron en Invitrogen. La concentración de IgG fue determinada usando ELISA de montaje de IgG.
Isoformas de IL-17
La IL-17A y la IL-17F recombinantes fueron adquiridas en R&D Systems.
El heterodímero IL-17A/F recombinante fue producido uniendo IL-17A e IL-17F con un ligando GS. El heterodímero presentaba la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 19).
MGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRN EDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEK ILVSVGCTCVTPIVHHVAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRKIPKVGHTFFQKPESCP PVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCRNL GCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCTCVTPVIHHV Q
IL-17F recombinante de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 20)
MRKIPKVGHTFFQKPESCPPVPEGSMKLDTGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPN RYPSEVVQAQCKHLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVLRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCT CVTPVIHHVQ
La secuencia de ADN que codifica el heterodímero IL-17A/F fue sintetizada químicamente por Entelechon GmbH y se subclonó en pET43.1a en los sitios NdeI/XhoI.
Se usó ADN pET43.1a que codifica las isoformas de IL-17 para transfectar células BL21(DE3) y se cultivaron clones resistentes a carbenicilina seleccionados a 37ºC durante una noche en caldo de cultivo 2TY que contenía un 2% de glucosa y 50 μg/mL de carbenicilina. Los cultivos fueron diluidos a continuación y cultivados en el mismo medio hasta una DO600 de 0,5-0,7, inducida con IPTG 1 mM y cultivada a 37ºC durante otras 4-5 horas.
Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y se prepararon cuerpos de inclusión a partir de las células. Los cuerpos de inclusión fueron solubilizados en Tris-HCl 50 mM, hidrocloruro de guanidinio 5M, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, glutationa reducida 2 mM, glutationa oxidada 0,2 mM, pH 8,5. La proteína IL-17 se replegó mediante la adición gota a gota de la proteína solubilizada al tampón anterior sin hidrocloruro de guanidinio, con fuerte agitación. El volumen final se eligió de tal modo que la concentración de proteínas final no fue superior a 0,1 mg/mL.
La disolución de proteína replegada se concentró según se requiriera, antes de cambiar el tampón por MES 10 mM pH 6. A continuación se aplicó la proteína a una columna de Sepharose SP HP equilibrada con MES 20 mM pH 6. La proteína fue eluída con un gradiente linear de NaCl 0-500 mM en MES pH 6 a lo largo de 10 volúmenes de columna. Para la IL-17F se extendió el gradiente hasta NaCl 600 mM. A fin de purificar adicionalmente la IL-17, se agrupó la fracción relevante de la columna SP HP de Sepharose, se concentró y se diluyó con CAPSO 20 mM (pH 10) y se aplicó a una columna Mono Q equilibrada con CAPSO 20 mM. La proteína fue eluída con un gradiente linear de NaCl 0-250 mM en CAPSO 20 mM a lo largo de 20 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían IL-17 fueron agrupadas y neutralizadas usando MES 1M pH 6.
Ejemplo 1: Producción de un anticuerpo anti-IL-17 neutralizante
Se inmunizaron ratas Sprague Dawly hembras con IL-17 humana recombinante (adquirida en R&D systems). Las ratas recibieron cuatro inmunizaciones de 20 μg de IL-17 en 100 μL de adyuvante de Freund. El anticuerpo 225 que se une a IL-17 humana fue aislado usando los métodos descritos en el documento WO 04/051268. Los genes correspondientes al dominio variable de cadena pesada (VH) y al dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo 225 fueron aislados y secuenciados tras la clonación mediante PCR de transcripción inversa.
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Se diseñó una serie de regiones VL y VH humanizadas usando estructuras aceptoras de región V humanas y variando el número de residuos donantes de las regiones estructurales. Se diseñaron ocho regiones VL ancladas (gL1-8) y 9 regiones VH ancladas (gH1-9) y se construyeron los genes mediante montaje de oligonucleótidos y mutagénesis de PCR.
Las secuencias ancladas de cadena ligera fueron sub-clonadas en el vector de expresión de cadena ligera humana pKH10.1 que contiene el ADN que codifica la región constante C-Kappa humana (alotipo Km3). Las secuencias ancladas de cadena pesada fueron sub-clonadas en el vector de expresión gamma-4 humano pVhg4P FL, que contiene el ADN que codifica la región constante gamma-4 humana que contiene la mutación estabilizante de bisagra S241P (Angal et al., ver anterior). Los plásmidos fueron co-transfectados en células CHO y los anticuerpos producidos fueron escrutados en función de su actividad en ensayos de unión y neutralización de IL-17. Se llevaron a cabo transfecciones de células CHO usando el procedimiento LipofectamineTM 2000 siguiendo las instrucciones del fabricante (InVitrogen, nº de catálogo 11668).
Se seleccionó el injerto óptimo en base a la expresión, afinidad y potencia de neutralización (gL7gH9) y se denominó CA028_0496. Las secuencias de región V de este anticuerpo se muestran en la Figura 1 (a) y (b) y en las SEQ ID NOs: 7 y 9 para la cadena ligera (gL7) y la cadena pesada (gH9), respectivamente.
La estructura aceptora de cadena pesada es la secuencia de línea germinal humana VH3 1-3 3-07 con estructura 4 procedente de esta porción de JH4 de línea germinal de región JH. La estructura aceptora de cadena ligera es la secuencia de línea germinal humana VK1 2-1-(1) L4, con la estructura 4 procedente de esta porción de la JK1 de línea germinal humana de región JK humana.
Ejemplo 2: el Anticuerpo CA028_0496 neutraliza IL-17 e IL-17F y heterodímero IL-17A/F
Células Hela
Se evaluó la potencia del anticuerpo CA028_0496 contra IL-17 recombinante humana e IL-17F recombinante humana en células Hela y se comparó con el anticuerpo CDP435 (WO 06/054059). Las células Hela fueron obtenidas del banco de células de ATCC (ATCC CCL-2). Las células fueron cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal de ternero, penicilina, gentamicina y glutamina. Se llevaron a placa 1x104 células en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Las células fueron incubadas durante una noche y lavadas una vez en tampón de ensayo. Se incubó IL-17A humana (25 ng mL1) o IL-17F humana (125 ng mL-1) en presencia de una concentración fija de TNF-α humano, dicha mezcla se preincubó con anticuerpo CA028_0496 o con anticuerpo CDP435. A continuación se añadió la citoquina más el anticuerpo a las células Hela, que fueron incubadas durante una noche. La producción de IL-6 en el sobrenadante del cultivo celular era proporcional a la cantidad de IL-17a/IL-17F añadida a las células. Se midieron los niveles de IL-6 humana mediante ELISA y se cuantificaron por comparación con concentraciones conocidas de patrón de IL-6 humana.
Los datos (Figuras 2a y 2b) indican que el anticuerpo CA028_0496 neutralizó de forma potente la IL-17A recombinante humana, y también presentó algo de actividad contra la IL-17F humana. Los datos de estos experimentos indicaron que el anticuerpo CA028_496 dio lugar a una IC50 de 43 ng/mL contra IL-17 recombinante humana (25 ng mL-1) y 1477 ng/mL contra IL-17F recombinante (125 ng mL-1). Por consiguiente, el anticuerpo CA028_0496 proporcionó una IC50 de 0,29 M frente a IL-17 recombinante humana (0,78 nM) y de 10,18 nM frente a IL-17F recombinante humana (4,16 nM) en este ensayo (cálculo basado en IgG suponiendo un peso molecular de
145.000 como IgG4 promedio y suponiendo que la IL-17A y la IL-17F eran dímeros).
Células de microglía humanas
Se llevaron a placa células microgiales humanas (TCS Cellworks) en una placa de fondo plano de 96 pocillos a una concentración de 5.000 células por pocillo en un volumen total de 100 µL y se dejaron 24 horas para que se unieran al plástico. En ese momento se añadieron a los pocillos por triplicado valoraciones (5, 1, 0,2 y 0,04 µg/mL) de IL-17A recombinante humana, IL-17F recombinante humana, IL-17F recombinante de mono cynomolgus y heterodímero IL-17A/F recombinante humano, en presencia y en ausencia de 10 ng/mL de TNFα recombinante humano. Los pocillos control no contenían ningún estímulo, IL-17A sola (100 ng/mL), TNFα solo e IL-17A y TNFα juntos. Todas las citoquinas fueron añadidas en un volumen total de 110 µL/pocillo, completando un volumen de pocillo total de 210 µL. En los experimentos que implican anticuerpos, las células fueron llevadas a placa del mismo modo. Tras 24 horas, se añadieron los anticuerpos y las citoquinas al mismo tiempo para proporcionar las concentraciones finales establecidas en un volumen final total de 200 µL.
Después de otras 24 horas de incubación a 37ºC, se recolectaron los sobrenadantes y se congelaron a -20ºC hasta su análisis. Para el análisis, los sobrenadantes fueron diluidos 1/10 y se determinó la IL-6 usando un kit IL-6 MSD humano, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Todas las isoformas de IL-17 evaluadas fueron activas en el ensayo, particularmente en presencia de TNFα.
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