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CN118681005A - 一种二价il-17治疗性疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种二价il-17治疗性疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118681005A
CN118681005A CN202310292263.3A CN202310292263A CN118681005A CN 118681005 A CN118681005 A CN 118681005A CN 202310292263 A CN202310292263 A CN 202310292263A CN 118681005 A CN118681005 A CN 118681005A
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CN
China
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vaccine
antigen
therapeutic
seq
crm197
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张文耀
陈国友
万涛
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Shanghai Huidun Yintai Biotechnology Co ltd
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Shanghai Huidun Yintai Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种IL‑17治疗性疫苗，及其制备方法和应用。具体地，本发明提供了一种靶向IL‑17A和IL‑17F的二价IL‑17治疗性疫苗，其包含IL‑17A和IL‑17F抗原活性片段分别通过与载体蛋白融合表达或与载体蛋白偶联后形成的疫苗抗原。所述IL‑17治疗性疫苗与液体佐剂联合使用后可以诱导小鼠和恒河猴体内产生高滴度IL‑17A和IL‑17F中和抗体，阻断IL‑17信号通路，从而抑制自身免疫炎症，达到治疗银屑病、强直性脊柱炎、类风湿关节炎等自身免疫疾病的目的。

Description

一种二价IL-17治疗性疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及一种二价白细胞介素-17(IL-17)治疗性疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
白细胞介素17(IL-17)是银屑病、强直性脊柱炎等自身免疫疾病关键靶点，IL-17单克隆抗体获批应用于银屑病、强直性脊柱炎的治疗。
IL-17包含A、B、C、D、E、F六个亚型，其中IL-17A和IL-17F是参与自身免疫疾病关键的亚型。目前上市的IL-17单克隆抗体主要是靶向IL-17A，以及同时可以靶向IL-17A和IL-17F，同时可以靶向IL-17A和IL-17F的单克隆抗体的治疗效果显著优于靶向IL-17A的单克隆抗体。虽然文献有报道IL-17A的多肽疫苗，多肽片段长度均少于30个氨基酸残基，但含IL-17A空间表位的白介素17疫苗未见报道，同时含IL-17A和IL-17F抗原表位的疫苗也未见报道。
本领域亟待研发一种稳定性更高且治疗效果更好的IL-17治疗性疫苗
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向IL-17A和IL-17F的二价IL-17治疗性疫苗，所述疫苗中的疫苗抗原包括IL-17A片段(至少含58-151，但不超过39-155氨基酸范围)、IL-17F片段(至少含70-156，但不超过11-158氨基酸范围)，所述IL-17片段具有低IL-17活性但保留抗原空间表位，与载体蛋白融合表达，或是与载体蛋白共价交联，从而形成疫苗抗原，该疫苗与液体佐剂组合后可以打破免疫机体免疫耐受，诱导机体持续产生抗IL-17A和IL-17F中和抗体。
本发明的第一方面，提供了一种IL-17治疗性疫苗，所述治疗性疫苗包含：(a)结构如式(I)所示IL-17A疫苗抗原；和(b)结构如式(II)所示IL-17F疫苗抗原；
Z1-L-Z3(I)
Z2-L-Z3(II)
其中，Z1为IL-17A抗原活性片段；
Z2为IL-17F抗原活性片段；
Z3为载体蛋白；
L为接头，所述接头选自通过交联剂交联形成的共价键，或用于融合蛋白表达的连接肽或肽键；
“-”表示连接上述元件的连接的化学键。
在另一优选例中，所述IL-17A抗原活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示。
在另一优选例中，所述Z1的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，较佳地，至少95％的序列同一性，更佳地至少96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述IL-17F抗原活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQID NO：4所示。
在另一优选例中，所述Z2的氨基酸序列与如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，较佳地，至少95％的序列同一性，更佳地至少96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述Z3为白喉毒素突变体CRM197，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述L为通过交联剂交联形成的共价键。
在另一优选例中，所述交联剂选自下组：戊二醛、碳二亚胺(EDC)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、sulfo-SMCC、SATP(N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐)、或其组合，优选戊二醛。
在另一优选例中，所述交联剂为戊二醛。
在另一优选例中，所述交联剂为sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)与SATP(N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐)的组合。
在另一优选例中，所述IL-17A疫苗抗原为融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在另一优选例中，所述IL-17F疫苗抗原为融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在另一优选例中，所述IL-17A疫苗抗原和所述IL-17F疫苗抗原均为融合蛋白。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，所述IL-17A疫苗抗原(融合蛋白)的含量为0.375mg/mL；所述IL-17F疫苗抗原(融合蛋白)的含量为0.375mg/mL。
在另一优选例中，所述IL-17A疫苗抗原和所述IL-17F疫苗抗原均为偶联物。
在另一优选例中，所述偶联物中IL-17A/IL-17F抗原活性片段与CRM197蛋白的摩尔比为(6～10):1，较佳地，8:1。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，所述IL-17A疫苗抗原(偶联物)的含量为0.4mg/mL；所述IL-17F疫苗抗原(偶联物)的含量为0.2mg/mL。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原的含量比为(0.5～4):1。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原的含量比为1:1。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原的含量比为2:1。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原的含量比为1:2。
在另一优选例中，在所述IL-17治疗性疫苗中，IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原的含量比为4:1。
在另一优选例中，所述IL-17治疗性疫苗具有以下特征：同时包含IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原，并且所述的IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原分别可以刺激机体产生抗IL-17A和IL-17F的中和抗体。
本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的IL-17治疗性疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)分别制备IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原；
(ii)将步骤(i)中制备的IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原按照(0.5～4):1的比例混合，即获得所述IL-17治疗性疫苗。
在另一优选例中，所述IL-17A/IL-17F疫苗抗原为IL-17A/IL-17F-CRM197偶联物，其按照以下步骤制备：
(1)提供经表达纯化的IL-17A/IL-17F蛋白，和白喉毒素突变体CRM197蛋白；
(2)将所述IL-17A/IL-17F蛋白与CRM197蛋白混匀后，添加交联剂进行交联反应，从而获得IL-17A/IL-17F-CRM197偶联物；
(3)将步骤(2)中获得的IL-17A/IL-17F-CRM197偶联物进行超滤浓缩，从而获得所述的IL-17A/IL-17F疫苗抗原。
在另一优选例中，所述IL-17A蛋白的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，较佳地，至少95％的序列同一性，更佳地至少96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述IL-17A蛋白的氨基酸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述IL-17F蛋白的氨基酸序列与如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，较佳地，至少95％的序列同一性，更佳地至少96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述IL-17F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
在另一优选例中，所述CRM197蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述交联剂为戊二醛，其在交联反应中的工作终浓度为0.05％～0.15％(v/v)。
在另一优选例中，所述交联反应的反应温度为室温(25℃±2℃)，反应时间为1小时至3小时。
在另一优选例中，所述IL-17A-CRM197偶联物中IL-17A蛋白与CRM197蛋白的摩尔比为(6～10):1，较佳地，8:1。
在另一优选例中，所述IL-17F-CRM197偶联物中IL-17F蛋白与CRM197蛋白的摩尔比为(6～10):1，较佳地，8:1。
在另一优选例中，所述IL-17A/IL-17F疫苗抗原为IL-17A/IL-17F-CRM197融合蛋白，其按照以下步骤制备：
(A)构建包含编码IL-17A/IL-17F-CRM197融合蛋白基因的表达载体；
(B)将所述表达载体转导进入宿主细胞中，并诱导所述宿主细胞表达所述IL-17A/IL-17F-CRM197融合蛋白；
(C)纯化所述的IL-17A/IL-17F-CRM197融合蛋白，即获得所述IL-17A/IL-17F疫苗抗原。
在另一优选例中，所述IL-17A-CRM197融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在另一优选例中，所述IL-17F-CRM197融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所述的IL-17治疗性疫苗，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物或疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的组合物包括包裹疫苗的纳米脂质体，纳米脂质体成分为离子化脂质、胆固醇、脂质与聚乙二醇结合物(PEG-脂质)、辅助型脂质的组合物。
在另一优选例中，所述组合物是疫苗组合物，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。
在另一优选例中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合；
在另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
在另一优选例中，所述佐剂选自下组：Montanide ISA 51VG、Montanide ISA720VG、磷酸铝佐剂、MF59、AS04、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物被制备为液态制剂。
在另一优选例中，所述组合物被制备为注射剂、悬浮液、或喷雾剂。
本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的IL-17治疗性疫苗在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述疾病为自身免疫疾病。
在另一优选例中，所述疾病选自下组：类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、或其组合。
本发明的第五方面，提供了一种治疗和/或预防疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明第一方面所述的IL-17治疗性疫苗，或本发明第三方面所述的组合物。
在另一优选例中，所述疾病为自身免疫疾病。
在另一优选例中，所述疾病选自下组：类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、或其组合。
在另一优选例中，所述有需要的受试者为人类或非人类哺乳动物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了IL-17A还原型SDS-PAGE纯度鉴定图。
图2显示了IL-17F还原型SDS-PAGE纯度鉴定图。
图3显示了本发明的二价治疗性疫苗(偶联物)免疫小鼠后，诱导小鼠产生高滴度的IL-17A抗体和IL-17F抗体。
图4显示了本发明的二价治疗性疫苗(融合蛋白)免疫小鼠后，诱导小鼠产生高滴度的IL-17A抗体和IL-17F抗体。
图5显示了本发明的IL-17截短体和IL-17截短体与CRM197融合蛋白诱导MC-3T3细胞表达IL-6活性降低。
图6显示了本发明的二价治疗性疫苗免疫后血清阻断IL-17A诱导MC-3T3细胞表达IL-6。
图7显示了本发明的二价治疗性疫苗免疫后血清阻断IL-17F诱导MC-3T3细胞表达IL-6。
图8显示了本发明的二价治疗性疫苗与单独使用IL-17A-CRM197偶联物或IL-17F-CRM197偶联物对改善小鼠银屑病症状的作用效果比较。
图9显示了本发明的二价治疗性疫苗与单独使用IL-17A-CRM197偶联物或IL-17F-CRM197偶联物对改善小鼠类风湿关节炎症状的作用效果比较。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次研发了一种靶向IL-17A和IL-17F的二价IL-17治疗性疫苗，所述治疗性疫苗以IL-17A抗原活性片段-CRM197偶联物和IL-17F抗原活性片段-CRM197偶联物，或IL-17A抗原活性片段-CRM197融合蛋白和IL-17F抗原活性片段-CRM197融合蛋白为主要活性成分。所述治疗性疫苗中IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原为截短体，抗原稳定性高，同时可以尽量减少抗原片段的非必要序列，减少非中和抗体产生，减少赖氨酸活性基团，降低偶联物分子量。该治疗性疫苗施用于机体后，可打破机体免疫耐受，诱导机体持续产生高滴度的抗IL-17A和IL-17F中和抗体，免疫效果显著优于单独施用IL-17A或IL-17F单价疫苗。
在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解相同。
IL-17A和IL-17F
IL-17包含A、B、C、D、E、F六个亚型，其中IL-17A和IL-17F是参与自身免疫疾病关键的亚型。
如本发明所用，术语“IL-17A疫苗抗原”是指包含IL-17A抗原活性片段的疫苗抗原，所述IL-17A抗原活性片段至少包含IL-17A全长的第58-151位氨基酸片段(如SEQ IDNO：2所示)，但不超过第39-155位氨基酸范围(如SEQ ID NO：1所示)。在另一优选例中，所述IL-17A抗原活性片段的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，较佳地，至少95％的序列同一性，更佳地至少96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
如本发明所用，术语“IL-17F疫苗抗原”是指包含IL-17F抗原活性片段的疫苗抗原，所述IL-17F抗原活性片段至少包含IL-17F全长的第70-156位氨基酸片段(如SEQ IDNO：4所示)，但不超过第11-158位氨基酸范围(如SEQ ID NO：3所示)。在另一优选例中，所述IL-17F抗原活性片段的氨基酸序列与如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，较佳地，至少95％的序列同一性，更佳地至少96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
IL-17A(39-155aa)(SEQ ID NO：1)
KNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA
IL-17A(58-151aa)(SEQ ID NO：2)
TNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGN VDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVH
IL-17F(11-158aa)(SEQ ID NO：3)
MVKYLLLSILGLAFLSEAAARKIPKVGHTFFQKPESCPPVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCRNLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCTCVTPV
IL-17F(70-156aa)(SEQ ID NO：4)
MSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCRNLGCINAQGKEDIS MNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCTCVT
CRM197
如本发明所用，术语“CRM197”是指白喉毒素突变体CRM197，具体是白喉毒素第52位点上的甘氨酸突变为谷氨酸，其具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。该突变体毒素A片段不能与细胞核内延长因子II结合，使其丧失了细胞毒作用，但在抗原性与免疫原性仍基本与天然的白喉毒素保持一致。
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS(SEQ ID NO：5)
本发明的IL-17治疗性疫苗
在本发明的一个方面，提供了一种IL-17治疗性疫苗，所述疫苗为二价疫苗，其包含：(a)结构如式(I)所示IL-17A疫苗抗原；和(b)结构如式(II)所示IL-17F疫苗抗原；
Z1-L-Z3(I)
Z2-L-Z3(II)
其中，Z1为IL-17A抗原活性片段；
Z2为IL-17F抗原活性片段；
Z3为载体蛋白，在另一优选例中，所述载体蛋白为白喉毒素突变体CRM197，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
L为接头，所述接头选自通过交联剂交联形成的共价键，或用于融合蛋白表达的连接肽或肽键；
“-”表示连接上述元件的连接的化学键。
在本发明的一个优选实施方式中，所述IL-17A疫苗抗原和所述IL-17F疫苗抗原均为偶联物，即所述IL-17治疗性疫苗包含IL-17A-CRM197偶联物和IL-17F-CRM197偶联物。所述偶联物分别由IL-17A抗原活性片段或IL-17F抗原活性片段通过交联剂交联形成，所述交联剂包括(但不限于)戊二醛、碳二亚胺(EDC)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、sulfo-SMCC、SATP(N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐)、或其组合，优选戊二醛。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述IL-17A疫苗抗原和所述IL-17F疫苗抗原均为融合蛋白，即所述IL-17治疗性疫苗包含IL-17A-CRM197融合蛋白和IL-17F-CRM197融合蛋白。在另一优选例中，所述IL-17A-CRM197融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述IL-17F-CRM197融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
IL17A(58-151)-CRM197融合蛋白序列
TNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHGGGGSMGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKV NSKLSLFFEIKS(SEQ ID NO：6)
IL17F(70-156)-CRM197融合蛋白序列
MSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCRNLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCTCVTGGGGSMGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS(SEQ ID NO：7)
如本发明所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的融合蛋白(如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列)的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数15个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6×His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本发明的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.：6或7任一所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的制备方法
本发明的还提供了本发明第一方面所述IL-17治疗性疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(i)分别制备IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原；
(ii)将步骤(i)中制备的IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原按照(0.5～4):1的比例混合，即获得所述IL-17治疗性疫苗。
在本发明的一个优选实施例中，所述IL-17A/IL-17F疫苗抗原为IL-17A/IL-17F-CRM197偶联物，其中，所述IL-17A-CRM197偶联物按照以下步骤制备：
(1)提供纯化的人白细胞介素-17的A亚型(IL-17A)蛋白，和白喉毒素突变体CRM197蛋白；
(2)将所述IL-17A蛋白稀释至1.0～3.0mg/ml范围内，将CRM197稀释至1mg/ml左右，混匀后添加0.05％～0.15％终浓度范围的戊二醛，室温(25℃±2℃)，反应时间为1小时至3小时，从而获得IL-17A-CRM197偶联物。
(3)将上述偶联物利用50kDa超滤膜超滤浓缩后，利用Sephacryl S200填料分子筛层析分离偶联物并收集大分子组分，即为IL-17A-CRM197偶联物疫苗抗原原液。
所述/IL-17F-CRM197偶联物参照上述IL-17A-CRM197偶联物制备方法制备。
在本发明的另一个优选实施例中，所述IL-17A/IL-17F疫苗抗原为IL-17A/IL-17F-CRM197融合蛋白，其中，所述IL-17A-CRM197融合蛋白按照以下步骤制备：
(1)将IL-17A编码基因通过连接肽与CRM197基因连接并构建至含sumo标签的载体上，所述载体上含可在大肠杆菌胞质共表达大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的基因；将该载体转化表达菌株，并在20～30℃条件下诱导表达。
(2)破菌会后利用his-tag亲和标签亲和纯化，纯化后用sumo标签特异性蛋白酶切除标签。再次利用亲和层析分离标签。
(3)利用阴离子交换层析，在pH 8.0～8.5的条件下，使用5％～15％的含1M NaCl的buffer B洗杂，15～20％的含1M NaCl的buffer B洗脱，收集目的蛋白组分。
(4)利用Sephacryl S200填料的凝胶过滤层析，上样后收集目的蛋白组分，即为纯化的IL-17A-CRM197融合蛋白。
所述IL-17F-CRM197融合蛋白参照上述IL-17A-CRM197融合蛋白制备方法制备，其中，不同点在于，在步骤(3)中，利用阴离子交换层析，在pH 8.0～8.5的条件下，使用15～20％的含1M NaCl的buffer B洗杂，20～25％的含1M NaCl的buffer B洗脱，收集目的蛋白组分。
本发明的组合物
本发明还提供了一种组合物。所述组合物含有上述的IL-17治疗性疫苗，以及药学上可接受的载体、稀释剂、稳定剂和/或增稠剂，并可制备成如冻干粉、片剂、胶囊、糖浆、溶液或悬浮液的药剂类型。
“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。所述药物组合物用于(a诱导产生阻滞IL-17A和IL-17F与受体结合的中和抗体；(b)用于治疗或预防自身免疫疾病。
所述的自身免疫疾病包括(但不限于)类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、或其组合。
此外，所述组合物可以单独或与其他药物制剂组合施用于需要的对象，用于治疗或预防所述疾病。
本发明提供的组合物优选是疫苗组合物。所述疫苗组合物包含本发明第一方面所述的IL-17治疗性疫苗以及疫苗上可接受的载体，所述疫苗上可接受的载体优选为药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂，所述佐剂优选为液体佐剂。将本发明的疫苗组合物与液体佐剂混合乳化后，可接种于人或非人类哺乳动物，诱导体内抗IL-17A和IL-17F中和抗体的产生。
在另一优选例中，所述佐剂选自下组：Montanide ISA 51VG、磷酸铝佐剂、MF59、AS04、或其组合。
治疗/预防性应用
本发明还提供了一种治疗/预防疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明第一方面所述的IL-17治疗性疫苗，或本发明第三方面所述的组合物。其中，所述疾病为自身免疫疾病。在另一优选例中，所述疾病选自下组：类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、或其组合。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明将IL-17抗原与载体蛋白偶联或融合，抗原诱导体内突破免疫耐受产生抗IL-17抗体，产生抗IL-17抗体，阻断IL-17信号通路，阻断炎症信号通路，达到治疗自身免疫疾病的效果。
(2)本发明的IL-17治疗性疫苗为二价疫苗，其同时包含IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原，在施用于人体后，所述的IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原分别可以刺激机体产生抗IL-17A和IL-17F的中和抗体，免疫效果显著优于单独使用IL-17A疫苗抗原或IL-17F疫苗抗原的效果。
(3)本发明的IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原均选用截短体，截短体不包含N端和C端不规则结构，抗原稳定性高，降低IL-17活性，同时可以尽量减少抗原片段的非必要序列，减少非中和抗体产生；减少赖氨酸活性基团，降低偶联物分子量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：重组白细胞介素-17A(IL-17A)制备
根据大肠杆菌的密码子偏性，人工合成编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的IL-17A(30-155aa)DNA序列(如SEQ ID NO：8所示)。将DNA序列构建至含有sumo标签的pCDFDuet-1-DsbC载体上，构建后载体为pCDF-Duet-1-sumoIL-17A-DsbC，其中sumoIL-17A在第1个开放阅读框中，大肠杆菌二硫键异构酶DsbC在第2个开放阅读框中。
将pCDF-Duet-1-sumoIL-17A-DsbC转化至大肠杆菌Origami B(DE3)菌株中，筛选在链霉素抗性LB平板上生长的克隆。将克隆挑取至LB培养基中，并经两级扩大培养至含20L的发酵培养基中，发酵参数：搅拌速度：600rpm、溶氧控制20-50％、扩大培养温度：37℃、诱导后温度：30℃。诱导后8-10小时，终止培养，采用7000g离心的方法收集菌体。
收集菌体采用高压匀浆法破碎，破碎后9000g离心收集上清。利用螯合镍离子的亲和填料捕获含his-tag的目的蛋白，收集400mM咪唑洗脱液。添加含标签蛋白总量1/500的sumo标签特异性蛋白酶切除标签。再次利用含Ni离子的亲和填料捕获含标签蛋白，收集不含标签蛋白。利用Source 30S阳离子层析填料，在pH 7.4的缓冲条件下，等度梯度洗脱，设置32％含1M NaCl的buffer B洗杂，设置含45％含1M NaCl的buffer B洗脱收集IL-17A。收集后的IL-17A进行还原型SDS-PAGE鉴定，结果如图1，SDS-PAGE纯度大于95％。
实施例2：重组白细胞介素-17F(IL-17F)制备
根据大肠杆菌的密码子偏性，人工合成编码如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的IL-17A(11-158aa)DNA序列(如SEQ ID NO：9所示)。将DNA序列构建至含有sumo标签的pCDFDuet-1-DsbC载体上，构建后载体为pCDF-Duet-1-sumoIL-17F-DsbC，其中sumoIL-17F在第1个开放阅读框中，大肠杆菌二硫键异构酶DsbC在第2个开放阅读框中。
表达、破菌、亲和层析及标签去除步骤同实施例1。利用Source 30S阳离子层析填料，在pH 6.8的缓冲条件下，等度梯度洗脱，设置22％含1M NaCl的buffer B洗杂，设置含32％含1M NaCl的buffer B洗脱收集IL-17F。收集后的IL-17F进行还原型SDS-PAGE鉴定，结果如图2，SDS-PAGE纯度大于95％。
实施例3：重组IL-17A-CRM197/IL-17F-CRM197偶联物制备
按照以下步骤制备重组IL-17A-CRM197偶联物：
(1)结合反应：取适量的25％戊二醛，用磷酸盐缓冲液(PBS：20mM PB,150mM NaCl,pH 7.0)配制浓度为0.5％的戊二醛。取一定量的IL-17A用PBS稀释至1.8mg/ml，取一定量的白喉毒素突变体CRM197用PBS稀释至1mg/ml，二者等体积混匀，摩尔比大约为8:1。滴加0.5％的戊二醛至戊二醛终浓度为0.08％。将反应容器放入25℃恒温摇床中，设置摇床转速130rpm，反应2小时。
(2)超滤纯化：反应后，用50kDa超滤膜，超滤浓缩。
(3)利用Sephacryl S200填料分子筛层析，设置柱体积2％的上样体积，分离偶联物并收集大分子组分，即为IL-17A-CRM197偶联物原液。
重组IL-17F-CRM197偶联物制备参照上述重组IL-17A-CRM197偶联物制备方法，其中在步骤(1)中IL-17F用PBS稀释至2.1mg/ml，其余步骤与重组IL-17A-CRM197偶联物制备方法相同。
实施例4：二价IL-17治疗性疫苗(偶联物)制备及体内生物学活性测定
将重组IL-17A-CRM197偶联物原液稀释至1.6mg/ml，将重组IL-17F-CRM197偶联物原液稀释至0.8mg/ml，将两种稀释后的偶联物以1:1的体积比混匀，即为二价IL-17治疗性疫苗(偶联物形式)。
取二价IL-17治疗性疫苗稀释10倍，取0.5ml稀释后疫苗至2ml注射器中，另取0.5ml液体佐剂Montanide ISA 51VG至另一支2ml注射器中，将两支注射器用接头连接，先慢速来回推动15轮，后再以尽可能地快速来回推动30次即完成乳化。乳化结束后，将所有乳液推动至一侧的注射器中。将乳化液以0.1ml/只的量注射至小鼠皮下，共8只小鼠，间隔1周再注射1次，分别在第2次注射后1、3、5周眼眶取血，取血后分别检测抗IL-17A和IL-17F的抗体滴度。
抗IL-17A/IL-17F抗体滴度检测方法：
(1)包被：取ELISA检测96孔板，将IL-17A或IL-17F蛋白用Na2CO3-NaHCO3，pH9.6的包被缓冲液稀释至0.5μg/ml，分别取100μL稀释后IL-17A或IL-17F蛋白加至96孔板的各个孔中，2～8℃孵育过夜。
(2)封闭：次日，弃去包被液，每孔加入150μL含0.05％(v/v)Tween-20、1％BSA的PBS封闭液，37℃孵育封闭1小时；
(3)洗涤：弃去封闭液后每孔用200μL含0.05％(v/v)Tween-20的PBS反复洗涤3次，并吸干孔中的液体；
(4)将采集的小鼠血清稀释，取100μL稀释后血清加入96孔板的最左侧孔中，每只小鼠为1行，从左到右倍比稀释，共稀释12个梯度，并以未免疫小鼠血清为对照，加入血清后37℃，孵育1h；孵育后，弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤3次；
(5)用封闭液将二抗HRP酶标抗鼠抗体稀释为1:5000，每孔加HRP酶标抗体100μL，37℃，孵育1h；弃去孵育液，如上所述洗涤方式反复洗涤5次；
(6)显色：每孔加入100μl TMB，室温避光孵育15min；
(7)终止：每孔加入100μl 0.5mol/L的硫酸终止显色；
(8)终止后，用微孔板分光光度计检测各个孔OD450的光吸收值。于450nm处测定光吸收值，确定血清样品OD值/生理盐水对照组样品OD值≥2.1的最高稀释倍数。
检测结果如图3和表1所示，二价IL-17治疗性疫苗(偶联物)免疫小鼠后，分别可以诱导小鼠产生高滴度IL-17A抗体和IL-17F抗体。在二次免疫后1周，所有小鼠血清IL-17A和IL-17F抗体滴度均高于1:4000的转阳标准。在二次免疫后5周，小鼠血清IL-17A和IL-17F抗体滴度几何平均值达到40万以上。
表1
实施例5：二价IL-17治疗性疫苗(融合蛋白)制备及体内生物学活性测定
根据大肠杆菌的密码子偏性，人工合成编码如SEQ ID NO：6所示的IL17A(58-151)-CRM197氨基酸序列的DNA序列。将DNA序列构建至含有sumo标签的pCDFDuet-1-DsbC载体上，构建后载体为pCDF-Duet-1-sumoIL-17A-CRM197-DsbC，其中sumoIL-17A-CRM197在第1个开放阅读框中，大肠杆菌二硫键异构酶DsbC在第2个开放阅读框中。
将pCDF-Duet-1-sumoIL-17A-CRM197-DsbC转化大肠杆菌Origami B(DE3)菌株中，筛选在链霉素抗性LB平板上生长的克隆。将克隆挑取至LB培养基中，并经两级扩大培养至含20L的发酵培养基中，发酵参数：搅拌速度：600rpm、溶氧控制20-50％、扩大培养温度：37℃、诱导后温度：25℃。诱导后10-16小时，终止培养，采用7000g离心的方法收集菌体。
收集菌体采用高压匀浆法破碎，破碎后9000g离心收集上清。利用螯合镍离子的亲和填料捕获含his-tag的目的蛋白，收集400mM咪唑洗脱液。添加含标签蛋白总量1/500的sumo标签特异性蛋白酶切除标签。再次利用含Ni离子的亲和填料捕获含标签蛋白，收集不含标签蛋白。利用Source 30Q阴子层析填料，在pH 8.0条件下，等度梯度洗脱，设置10％含1M NaCl的buffer B洗杂，设置含15％含1M NaCl的buffer B洗脱收集再利用SephacrylS200填料的凝胶过滤层析收集IL-17A-CRM197融合蛋白组分。
根据如上述IL17A(58-151)-CRM197制备方法，人工合成编码如SEQ ID NO：7所示的IL-17F(70-156)-CRM197氨基酸序列的DNA序列，并构建pCDF-Duet-1-sumoIL-17F-CRM197-DsbC载体，纯化制备区别在于，在pH 8.0～8.5的条件下，15～20％洗杂，20～25％洗脱，收集目的蛋白组分，再利用Sephacryl S200填料的凝胶过滤层析收集目的蛋白组分即为纯化后IL-17F-CRM197融合蛋白。
将重组IL-17A-CRM197融合蛋白和IL-17F-CRM197融合蛋白原液均稀释至1.5mg/ml，将两种稀释后的融合蛋白以1:1的体积比混匀，即为二价IL-17治疗性疫苗(融合蛋白形式)。如实施例4方法检测体内生物学活性，本实施例仅检测二次免疫后1周血清抗体滴度。
结果如图4所示，二价IL-17治疗性疫苗(融合蛋白)免疫后可以同时诱导小鼠产生高滴度的抗IL-17A和抗IL-17F的抗体。
实施例6：IL-17A(39-155)、IL-17F(11-158)、IL-17A(58-151)-CRM197和IL-17F(70-156)-CRM197的IL-17活性测定
本发明选用截短的IL-17A和IL-17F做为抗原，截短体的IL-17活性显著低于全长。采用MC-3T3细胞法检测截短体和截短体的融合蛋白的IL-17活性，原理和步骤如下：
在含低浓度的肿瘤坏死因子(TNFα)的条件下，若培养基中存在IL-17A或IL-17F活性，可诱导细胞表达IL-6，通过检测细胞培养上清中IL-6的表达量可检测IL-17A或IL17F的生物学活性。
具体步骤如下(IL-17A与IL-17F方法相同，以下统称为IL-17)：
在96孔板中，每孔接种8-10万/孔的MC-3T3细胞，培养20-24小时。
配制含0.6％FBS、4ng/ml TNFα的α-MEM培养液，并用该培养液分别将IL-17(全长对照品)、IL-17截短体或IL-17截短体-CRM197融合蛋白稀释至10nmol/L，加入培养的MC-3T3细胞中，设置3个复孔，继续培养24小时后，收集培养液上清。阴性对照为稀释缓冲液。
根据小鼠IL-6检测试剂盒(Sigma-Aldrich，货号：RAB0311-1KT)说明书方法检测培养上清中的IL-6。
结果如图5所示，IL-17截短体和IL-17截短体-CRM197融合蛋白诱导MC-3T3细胞表达IL-6的活性显著降低，说明截短的IL-17A和IL-17F生物学活性显著降低。
实施例7：小鼠免疫后血清可同时抑制IL-17A和IL17F的生物学活性
IL-17A和IL-17F具有相似的生物学活性，均可以用MC-3T3细胞进行测活，参照实施例6中IL-17A或IL17F的生物学活性检测方法。
具体步骤如下(IL-17A与IL-17F方法相同，以下统称为IL-17)：
在96孔板中，每孔接种8-10万/孔的MC-3T3细胞，培养20-24小时。
配制含0.6％FBS、4ng/ml TNFα和200ng/ml IL-17的α-MEM培养液。取实施例4中二价IL-17治疗性疫苗免疫小鼠二次免疫后5周小鼠血清，用α-MEM培养液(不含FBS、TNFα和IL-17)将血清分别稀释50倍、100倍和200倍。
将稀释不同倍数后的培养基分别与含0.6％FBS、4ng/ml TNFα和400ng/ml IL-17的α-MEM培养液等体积混匀后，加入培养的MC-3T3细胞中，设置3个复孔，继续培养24小时后，收集培养液上清。阴性对照为未免疫小鼠血清，阳性对照为购买的IL-17抗体。
根据小鼠IL-6检测试剂盒(Sigma-Aldrich，货号：RAB0311-1KT)说明书方法检测培养上清中的IL-6。
结果如图6和图7所示，二价IL-17治疗性疫苗免疫后血清(稀释50倍)可同时阻断IL-17A和IL-17F诱导MC-3T3细胞表达IL-6，显示了诱导后血清分别抗IL-17A和IL-17F的中和活性。
实施例8：二价IL-17治疗性疫苗可以显著抑制小鼠的银屑病症状
选用8周龄的C57BL/6小鼠，如实施例4描述的乳化方法，分别在第1、8、15、22天免疫二价IL-17治疗性疫苗，同时分别选用佐剂对照、IL-17A-CRM197偶联物和IL-17F-CRM197偶联物为对照。
在第29天开始诱导银屑病，用拔毛法除去小鼠背部的毛发，连续5天每日局部涂抹0.125g 5％咪喹莫特乳膏[6.25mg咪喹莫特(Perrigo)]。应用咪喹莫特致表皮增厚来模拟人类斑块型银屑病并增加IL-17和其他炎症细胞因子，选择与这些细胞因子表达相关的表皮厚度作为结果衡量指标。
最后一次涂抹药物的24小时后，处死小鼠，取皮肤进行组织学检查。
如图8结果所示，IL-17A-CRM197偶联物和IL-17F-CRM197偶联物均可以一定程度上改善银屑病症状，不过二价IL-17治疗性疫苗抑制银屑病症状效果显著优于单独使用IL-17A-CRM197偶联物或IL-17F-CRM197偶联物的作用效果。
实施例9：二价IL-17治疗性疫苗可以显著抑制小鼠的类风湿关节炎症状选用6周龄左右的雄性DBA小鼠，每组8只小鼠，共4组；
将完全弗氏佐剂5ml加入混匀管中，然后置于冰上，将乳化头浸入佐剂中液面以下，开启乳化仪(10000rpm～30000rpm)，然后逐滴加入5ml鸡Ⅱ型胶原，并上下移动乳化管，使得乳化均匀，乳化2min。
将乳液冰浴5min后，再次开启乳化仪(10000rpm～30000rpm)，并上下移动乳化管，使得乳化均匀，乳化2min。
乳化结束后，可通过滴水试验判断是否乳化完全。
通过乳化管的三通接头，将乳液抽入汉密尔顿注射器内。
Ⅱ型胶原免疫：在小鼠尾部进行Ⅱ型胶原免疫，每只小鼠注射体积为100μl。
首次Ⅱ型胶原免疫记为day0，在day21再进行一次Ⅱ型胶原加强免疫，Ⅱ型胶原加强免疫操作与Ⅱ型胶原首次免疫相同。
Ⅱ型胶原加强免疫结束后，每周对小鼠进行关节炎评分，小鼠预计在第28天左右开始发病，第42天到达发病高峰，第60天以后发病症状自发缓解。
给药：如实施例4描述的乳化方案，分别在第5、12、19、26天免疫二价IL-17治疗性疫苗，同时分别选用佐剂对照、IL-17A-CRM197偶联物和IL-17F-CRM197偶联物为对照。
从第21天开始，每周对小鼠四个爪子根据以下评分标准评分，每只小鼠的总分值为4个爪子评分值的总和。
评分 标准
0 无变化
0.5 一趾明显肿胀和发红
1 两趾肿胀和红斑
2 爪子轻微肿胀和红斑或两趾以上肿胀
3 爪子明显肿胀和红斑
4 肢体最大肿胀和发红，并扩散至踝关节
如图9结果所示，IL-17A-CRM197偶联物和IL-17F-CRM197偶联物均可以一定程度上抑制类风湿关节炎症状进展，但是二价IL-17治疗性疫苗抑制关节炎症状效果显著优于单独使用IL-17A-CRM197偶联物或IL-17F-CRM197偶联物的作用效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种IL-17治疗性疫苗，其特征在于，所述治疗性疫苗包含：(a)结构如式(I)所示IL-17A疫苗抗原；和(b)结构如式(II)所示IL-17F疫苗抗原；
Z1-L-Z3(I)
Z2-L-Z3(II)
其中，Z1为IL-17A抗原活性片段；
Z2为IL-17F抗原活性片段；
Z3为载体蛋白；
L为接头，所述接头选自通过交联剂交联形成的共价键，或用于融合蛋白表达的连接肽或肽键；
“-”表示连接上述元件的连接的化学键。
2.如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，其特征在于，所述IL-17A抗原活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，其特征在于，所述IL-17F抗原活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
4.如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，其特征在于，所述Z3为白喉毒素突变体CRM197，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，其特征在于，所述IL-17A疫苗抗原为融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，并且
所述IL-17F疫苗抗原为融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
6.如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，其特征在于，所述IL-17A疫苗抗原和所述IL-17F疫苗抗原均为偶联物，并且，所述偶联物中IL-17A/IL-17F抗原活性片段与CRM197蛋白的摩尔比为(6～10):1。
7.如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，其特征在于，在所述IL-17治疗性疫苗中，IL-17A疫苗抗原与IL-17F疫苗抗原的含量比为(0.5～4):1。
8.一种制备如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)分别制备IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原；
(ii)将步骤(i)中制备的IL-17A疫苗抗原和IL-17F疫苗抗原按照(0.5～4):1的比例混合，即获得所述IL-17治疗性疫苗。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗，以及药学上可接受的载体。
10.一种如权利要求1所述的IL-17治疗性疫苗在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
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