ES2414460T3 - Anticuerpos para Dkk-1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que se une específicamente a una proteína Dkk-1 humana madura, que consiste en los aminoácidos 32-266 del SEQ ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende dos bucles, estando formados dichos bucles por enlaces disulfuro y encontrándose dichos bucles entre 220 y 237 del SEQ ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEQ 5 ID NO: 2.

Description

Anticuerpos para Dkk-1.

Campo de la invención

La invención se refiere a agentes de unión selectiva para la proteína dickkopf-1 (Dkk-1), y más concretamente, a anticuerpos y dominios de unión a antígeno y regiones CDR que median la unión selectiva a un epítopo localizado en la mitad carboxilada de la proteína Dkk-1.

Antecedentes de la invención

El tejido óseo vivo muestra un equilibrio dinámico entre el depósito y la resorción de hueso. Estos procesos están mediados principalmente por dos tipos de células: osteoblastos, que secretan moléculas que comprenden la matriz orgánica del hueso, y osteoclastos, que median la disolución de la matriz ósea y la solubilización de las sales del hueso. En individuos jóvenes con hueso en crecimiento, la tasa de depósito óseo excede la tasa de resorción ósea, mientras en individuos de edad más avanzada la tasa de resorción puede exceder el depósito conduciendo a una pérdida neta de masa ósea. Esta última situación puede conducir a un incremento del riesgo de fractura ósea y a una reparación lenta o incompleta de los huesos rotos. La comprensión del mecanismo molecular que subyace a estos procesos es crítica para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades óseas. La genética humana ha jugado un papel principal en la elucidación de estos mecanismos y ha permitido la identificación de múltiples factores implicados en la actividad tanto catabólica como anabólica del hueso (Janssens and Van Hul, Hum Mol Gen, 11(20):2385-93, 2002; Ralston, J Clin Endocrin Metab. 87(6):2460-66, 2002).

Dickkopf-1 (Dkk-1) es un miembro de la familia de proteínas dickkopf que se ha demostrado que son reguladores negativos de la ruta de señalización canónica de Wnt, que tiene un papel central en el desarrollo y la formación de hueso (véanse, por ejemplo, Glinka et al., Nature 391:357-62 (1998); Fedi et al., J Biol Chem 274(27):19465-72 (1999); Zorn, Curr Biol 11:R592-95 (2001); y Krupnik et al., Gene 238: 301-13 (1999)). Dkk-1 inhibe la señalización Wnt a través de su correlación con los receptores de Wnt LRP5 o LRP6 y las proteínas kremen (véanse, por ejemplo, Bafico et al, Nature Cell Biol 3:683 (2001); Mao et al, Nature 411(17):321 (2001); Mao et al, Nature 417:664 (2002); y Semënov et al, Curr Biol 11:951-61 (2001). Por medio de la unión de LRP5 (LRP6) y proteínas kremen, Dkk-1 evita que LRP5 o LRP6 se asocien con miembros de la ruta Wnt y de ese modo evita la transducción de la señal mediada por Wnt, que a su vez da como resultado la inhibición de la formación de hueso.

LRP5 es una proteína clave en la regulación de la masa ósea (véanse, por ejemplo, Gong et al., Cell 107:513-23 (2001); Patel, N Eng J Med 346(20):1572 (2002)). Se ha identificado un trastorno recesivo autosómico caracterizado por una baja masa ósea (síndrome de osteoporosis-pseudoglioma, u "OPPG") que está causado por mutaciones de pérdida de función en LRP5 (Gong et al, 2001). Además, se ha demostrado que las mutaciones de ganancia de función en LRP5 dan como resultado una masa ósea elevada dominante autosómica en seres humanos (Little et al., Am J Human Genetics. 70 (1):11-19, 2002). Las mismas mutaciones en LRP5 que dan como resultado una masa ósea elevada pueden interferir en la capacidad de Dkk-1 para inhibir la señalización de LRP5 (véase, por ejemplo, Boyden et al., N Eng J Med. 346(20):1513-1521, 2002). De este modo, Dkk-1 se caracteriza apropiadamente por ser un regulador negativo del depósito óseo.

En vista de la implicación de Dkk-1 en la regulación de la formación de hueso y su papel en otras diversas enfermedades que están asociadas con la pérdida de hueso (p. ej., cáncer y diabetes), existe una necesidad de anticuerpos anti-Dkk-1 mejorados para uso terapéutico y para otros propósitos.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmento inmunológicamente funcionales de los mismos que se unen específicamente a una proteína de Dkk-1 humana madura que consiste en los aminoácidos 32-266 del SEC ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende dos bucles, estando formados dichos bucles por enlaces disulfuro y estando dichos bucles entre 220 y 237 del SEC ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEC ID NO: 2.

Los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos pueden comprender:

(a)

(i)

una CDR1 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 70; y

(ii)

una CDR2 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 72; y

(iii) una CDR3 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 74; y

(b)

(i)

una CDR1 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 76; y

(ii)

una CDR2 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 78; y

(iii) una CDR3 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 80.

En un aspecto relacionado, los anticuerpos aislados y los fragmentos inmunológicamente funcionales comprenden:

una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEC ID NO: 84; y

una región variable de la cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEC ID NO: 91.

De acuerdo con una realización preferida adicional, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que compiten con los anticuerpos definidos anteriormente por la unión específica a un polipéptido Dkk-1.

En otro aspecto, la presente invención proporcionar un ácido nucleico que codifica

una CDR de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 70, 72 y/o 74; y/o

una CDR de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 70, 78 y/o 80,

en donde el ácido nucleico codifica un anticuerpo como se ha definido anteriormente.

La presente invención proporciona adicionalmente vectores de expresión que comprenden los respectivos ácidos nucleicos y células aisladas que comprenden los respectivos vectores de expresión.

Adicionalmente se proporcionan métodos para producir un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo que comprende la etapa de cultivar las respectivas células. De acuerdo con una realización adicionalmente preferida de la presente invención se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo como se ha descrito anteriormente y un componente seleccionado del grupo que consiste en un tampón, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un portador, un agente solubilizador, un emulsionante y un conservante.

Los anticuerpos y los fragmentos inmunológicamente activos de los mismos descritos anteriormente también se pueden utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en la reparación ósea o para tratar una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en artritis, un trastorno óseo y un cáncer que incrementa la actividad de los osteoclastos e induce la resorción ósea.

En aspectos relacionados, los anticuerpos y los fragmentos inmunológicamente activos de los mismos se pueden utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un paciente con cáncer que experimenta terapia con radiación o quimioterapia y para tratar el mieloma múltiple.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama de cintas que representa la estructura tridimensional de un segmento de Dkk-1 humana localizado cerca del extremo carboxi de la proteína. Todos los números de aminoácidos indicados en la figura corresponden a la secuencia de aminoácidos del SEC ID NO: 2. Las dos secuencias de péptidos representadas en la figura representan regiones que son importantes para que el anticuerpo monoclonal 11H10 se una específicamente a esta proteína. Se cree que los aminoácidos que se encuentran subrayados juegan un papel importante para la unión del anticuerpo a la proteína de Dkk-1. Los bucles que comprenden el epítopo están sombreados, estando uno de los dos bucles del epítopo sombreado ligeramente más oscuro que el otro bucle. Las porciones de color muy claro del diagrama de cintas representan partes del polipéptido que se cree que desempeñan un papel menor en la interacción de unión entre 11H10 y Dkk-1 humana.

Las Figuras 2A y 2B muestran resultados μCT para ratones jóvenes y viejos tratados con 11H10 de rata. La Figura 2A es una representación gráfica del número trabecular a diferentes niveles de dosificación de 11H10 de rata (5, 10

o 20 mg/kg) tanto en ratones viejos (8,5 meses de edad) como en ratones jóvenes (6 semanas de edad) frente al vehículo (control negativo) y PTH (control positivo). La Figura 2B es un gráfico del perímetro endosteal a diferentes niveles de dosificación de 11H10 de rata (5, 10 o 20 mg/kg) en ratones viejos (8,5 meses de edad) frente a vehículo (control negativo) y PTH (control positivo).

Las Figuras 3A y 3B son gráficos que representan el porcentaje de cambio en la DMO en ratones oviarectomizados (OVX) 28 días después de ser tratados con 11H10 de rata (3, 10 o 30 mg/kg) frente a vehículo o PTH (100 mg/kg). Los ratones se utilizaron 5 meses después de la OVX. La Figura 3A muestra el cambio en la DMO en la tibia el día 28 con respecto al período inicial. La Figura 3B muestra el cambio en la DMO en la zona lumbar el día 28 con respecto al período inicial.

La Figura 4 es un gráfico del porcentaje de cambio en la DMO en ratones jóvenes tres semanas después de haberles administrado 11H10 RT IgG1 o 11H10 RT IgG2 con respecto a 11H10 de rata o PTH.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

A menos que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que son comúnmente entendidos por los expertos normales en la técnica. Adicionalmente, a menos que sea requerido por el contexto, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los mecanismos de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritos en la presente memoria son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. Los métodos y mecanismos de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se comentan a lo largo de la presente memoria a menos que se indique lo contrario. Véanse, p. ej., Sambrook et al Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989.) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), que se incorporan a la presente memoria como referencia. Las reacciones enzimáticas y los mecanismos de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, según se consigue comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. La terminología utilizada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y los mecanismos de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritos en la presente memoria son aquellos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se pueden utilizar mecanismos convencionales para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación y la liberación, y el tratamiento de los pacientes.

Se entenderá que los siguientes términos utilizados en esta descripción, a menos que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados:

Según se utiliza en la presente memoria "Dkk-1" incluye, por ejemplo, las formas nativas de rata, murinas y humanas de Dkk-1. Las secuencias de nucleótidos ilustrativas que codifican las proteínas de Dkk-1 humana y murina se muestran, respectivamente, en los SEC ID NO: 1 y 3; las secuencias de aminoácidos correspondientes se muestran, respectivamente, en los SEC ID NOS: 2 y 4. La proteína Dkk-1 humana (SEC ID NO: 2) tiene una secuencia líder que consiste en los aminoácidos 1-31 del SEC ID NO: 2. Una secuencia de la proteína Dkk-1 de rata ilustrativa aparece en el acceso de GenBank XP_219804. El término también incluye variantes de tales secuencias nativas que presentan una reacción cruzada desde el punto de vista inmunológico con estas proteínas nativas. Estas proteínas pueden inhibir la interacción entre LRP5 o LRP6 con Wnt. Una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica LRP5 humana se proporciona en el SEC ID NO: 5, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en el SEC ID NO: 6. Una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica LRP6 humana se proporciona en el SEC ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en SEC ID NO: 8. El término también se puede referir a un fragmento de una forma nativa o variante de Dkk-1 que contiene un epítopo al que puede unirse específicamente un anticuerpo.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", representa polímeros de cadena sencilla o de cadena doble. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases, tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de la ribosa, tales como 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones de la unión internucleótido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El término incluye tanto las formas de cadena sencilla y doble.

El término "oligonucleótido" representa un polinucleótido que comprende 200 nucleótidos o menos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud. En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble, p. ej., para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos efectores o antisentido. Un oligonucleótido de la invención puede incluir una marca, incluyendo una radiomarca, una marca fluorescente, un hapteno o una marca antigénica, para los análisis detección. Los oligonucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no están asociados con todo o una porción de un polinucleótido con el cual se encuentra el polinucleótido aislado en la naturaleza, o está conectado a un polinucleótido al que no está conectado en la naturaleza. Para los fines de esta descripción, se debe entender que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos concreta, no incluye cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias de ácido nucleico especificadas puede incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte proteínas diferentes o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras conectadas operablemente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácidos nucleicos citadas, y/o pueden incluir secuencias de vectores.

A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótidos de cadena sencilla comentado en la presente memoria es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena es referida como la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes es referida como dirección de transcripción; las regiones de secuencia de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que se encuentran 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas arriba"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que se encuentran 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas abajo".

El término "secuencia de control" hace referencia a una secuencia de polinucleótido que puede afectar a la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las cuales está ligada. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo anfitrión. En realizaciones concretas, las secuencias de control de procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión ribosomal, y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para los factores de transcripción, secuencias intensificadoras de la transcripción, y la secuencia de terminación de la transcripción. Las "secuencias de control" de acuerdo con la invención pueden incluir secuencias líder y/o secuencias de compañeros de fusión.

El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (p. ej., ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) utilizado para transferir información codificante de la proteína a una célula anfitriona.

El término "vector de expresión" o "constructo de expresión" hace referencia a un vector que es adecuado para la transformación de una célula anfitriona y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen o controlan (junto con la célula anfitriona) la expresión de una o más regiones codificantes heterólogas conectadas operativamente al mismo. Un constructo de expresión puede incluir, pero está limitado a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, la traducción, y, si están presentes intrones, afectan al empalme de ARN de una región codificante conectada operablemente a la misma.

Según se utiliza en la presente memoria, "conectado operablemente" significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está "conectado operablemente" a una secuencia codificante de la proteína está ligada al mismo, de modo que la expresión de la secuencia codificante de la proteína se consigue en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

El término "célula anfitriona" significa una célula que ha sido transformada, o es susceptible de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y de ese modo expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula parental, ya sea la progenie idéntica o no en morfología o en composición genética a la célula parental original, siempre que el gen de interés esté presente.

El término "transducción" significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, generalmente por bacteriófagos. "Transducción" hace referencia también a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus.

El término "transfección" significa la captación de ADN foráneo o exógeno por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. Diversos mecanismos transfección son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. Véanse, por ejemplo, Graham y col., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Id.; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; y Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tales técnicas se pueden utilizar para introducir uno o más radicales de ADN exógeno en células anfitrionas adecuadas.

El término "transformación" hace referencia a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula ha sido transformada cuando ha sido modificada para que contenga un nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula es transformada cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo mediante la introducción de nuevo material genético a través de la transfección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula integrándose físicamente en el cromosoma de la célula, o se puede mantener transitoriamente como un elemento episómico sin ser replicado, o puede replicarse independientemente en forma de un plásmido. Se considera que una célula ha sido "transformada de forma estable" cuando el ADN transformante se replica con la división de la célula.

Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, es decir, una proteína producida por una célula de origen natural y no recombinante, o producida por una célula diseñada mediante ingeniería genética o recombinante, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones, adiciones, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan específicamente y anticuerpos anti-Dkk-1, o secuencias que tienen deleciones, adiciones, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un anticuerpo anti-Dkk-1. El término "fragmento de polipéptido" hace referencia a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal, una deleción carboxi terminal, y/o deleciones internas en comparación con la proteína nativa completa. Tales fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados en comparación con la proteína nativa. En ciertas realizaciones, los fragmentos tienen aproximadamente de 5 a 500 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, los fragmentos pueden tener al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptidos útiles para la presente invención incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso del anticuerpo anti-Dkk-1, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a una región CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una porción de una cadena de anticuerpo o simplemente su región variable incluyendo dos CDR, y similares.

El término "proteína aislada" referido en la presente memoria significa que una proteína sujeto (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las que normalmente se encontraría, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma procedencia, p. ej., de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) está asociada operablemente (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza, o (6) no existe en la naturaleza. El ADN genómico, el ADNc, el ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos pueden codificar tal proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían en su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro uso.

Una "variante" de un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos se insertan, eliminan y/o se sustituyen en la secuencia de aminoácidos con respecto a otra secuencia de polipéptido. Las variantes de la invención incluyen proteínas de fusión.

Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) que ha sido modificado químicamente de alguna forma distinta de las variantes de inserción, deleción, o sustitución, p. ej., por medio de conjugación a otro radical químico.

El término "anticuerpo" hace referencia a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento de la misma que puede competir con el anticuerpo intacto por la unión específica al antígeno diana, e incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, y biespecíficos. Un anticuerpo intacto generalmente comprenderá al menos dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas tales como los anticuerpos de origen natural de los camélidos que pueden comprender solamente las cadenas pesadas. Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden derivarse exclusivamente de una sola fuente, o pueden ser "quiméricos", es decir, las diferentes porciones del anticuerpo pueden derivar de dos anticuerpos diferentes. Por ejemplo, las regiones CDR se pueden obtener de rata o tener origen murino, mientras que la región marco de la región V se obtiene de una fuente animal diferente, tal como un ser humano. Los anticuerpos o los fragmentos de unión de la invención se pueden producir en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" incluye, además de los anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, derivados, variantes, fragmentos, y muteínas de los mismos, cuyos ejemplos se describen a continuación.

El término "cadena ligera" incluye una cadena ligera completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de la región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena ligera completa incluye un dominio de la región variable, VL, y un dominio de la región constante, CL. El dominio de la región variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido. Las cadenas ligeras de acuerdo con la invención incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.

El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de la región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada completa incluye un dominio de la región variable, VH, y tres dominios de la región constante, CH1, CH2, y CH3. El dominio VH está en el extremo amino del polipéptido, y los dominios CH están en el extremo carboxilo, siendo CH3 el más cercano al extremo -COOH. Las cadenas pesadas de acuerdo con la invención pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo los subtipos IgA e IgA2), IgM e IgE.

El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de una cadena de inmunoglobulina, según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una porción de una cadena ligera o una cadena pesada de anticuerpo que carece al menos de algunos de los aminoácidos presentes en una cadena completa, pero que es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos ya que se unen específicamente al antígeno diana y pueden competir con anticuerpos intactos por la unión específica a un determinado epítopo. En un aspecto de la invención, tal fragmento conservará al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada completa, y en algunas realizaciones comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o porción de las mismas. Estos fragmentos biológicamente activos se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante, o se pueden producir mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales de la invención incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena sencilla, y puede derivar de cualquier fuente de mamífero, incluyendo pero sin limitarse a, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla adicionalmente que una porción funcional de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, una o más CDR, pueda estar unida covalentemente a una segunda proteína o una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a una diana concreta en el organismo, poseyendo propiedades terapéuticas bifuncionales, o teniendo una vida media en suero prolongada.

Un "fragmento Fab" se compone de una cadena ligera y regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

Una región "Fc" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por medio de dos o más enlaces disulfuro y por medio de interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que se pueden formar un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2.

Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 se compone por lo tanto de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por medio de un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras, pero carece de las regiones constantes.

Los "anticuerpos de cadena sencilla" son moléculas Fv en las que las regiones variables de la cadena pesada y ligera han sido conectadas por un conector flexible para formar una sola cadena polipeptídica, que forma una región de unión a antígeno. Los anticuerpos de cadena sencilla se comentan con detalle en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 88/01649 y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.946.778 y 5.260.203, cuyas descripciones se incorporan como referencia.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente con un conector peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Los dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden elegir como diana el mismo o diferentes antígenos.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión al antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades antigénicas. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más abajo).

Un "anticuerpo multiespecífico" es aquel que se dirige a más de un antígeno o epítopo.

Un anticuerpo "biespecífico", de "especificidad dual" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Los anticuerpos biespecíficos son una especie de anticuerpo multiespecífico y se pueden producir mediante una variedad de métodos, incluyendo, pero no limitados a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véanse, p. ej.., Songsivilai y Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de un anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma o diferentes dianas proteicas.

El término "anticuerpo neutralizador" hace referencia a un anticuerpo que se une a un ligando, previene la unión del ligando a su compañero de unión e interrumpe la respuesta biológica que de otro modo resultaría de la unión del ligando a su compañero de unión. En la evaluación de la unión y la especificidad de un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmentos inhibirá sustancialmente la unión de un ligando a su compañero de unión cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de compañero de unión unido al ligando en al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más (medido en un análisis de unión competitiva in vitro). En el caso de los anticuerpos para Dkk-1, un anticuerpo neutralizador disminuirá la capacidad de Dkk-1 para unirse a LRP5 o LRP6, induciendo de ese modo un aumento medible en la actividad de Wnt.

El término "compite" cuando se utiliza en el contexto de anticuerpos que compiten por el mismo epítopo significa la competición entre anticuerpos determinada mediante un análisis en el que el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional a prueba impiden o inhiben la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (p. ej., Dkk-1 o un fragmento del mismo). Se pueden utilizar numerosos tipos de análisis de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoanálisis directo o indirecto en fase sólida (RIA), inmunoanálisis enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA), análisis competitivo sándwich (véase, p. ej., Stahli et al (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (véase, p. ej., Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619), análisis de marcaje directo en fase sólida, análisis sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press), RIA de marcaje directo en fase sólida utilizando la marca I-125 (véase, p. ej., Morel et al (1988) Molec. Immunol. 25:715); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (véase, p. ej., Cheung, et al. (1990) Virology 176:546-552); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Típicamente, tal análisis implica el uso de un antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de éstos, una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unida a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Por lo general, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante el análisis competitivo (anticuerpos competitivos) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido al anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico. Los detalles adicionales referentes a los métodos para determinar la unión competitiva se proporcionan en los ejemplos de la presente memoria. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algún caso, la unión es inhibida en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% o más.

El término "antígeno" hace referencia a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse a agente de unión selectiva, tal como un anticuerpo, y adicionalmente susceptible de ser utilizado en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos que son capaces de interactuar con anticuerpos diferentes.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o a un receptor de células T. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo que se dirige específicamente a ese antígeno, y cuando el antígeno es una proteína, incluye los aminoácidos específicos que entran contacto directo con el anticuerpo. Muy a menudo, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otros tipos de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes epitópicos pueden incluir agrupamiento superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana concreto reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Se dice que un anticuerpo de la invención "se une específicamente" a su antígeno diana cuando la constante de disociación (Kd) es ≤ 10-8 M. El anticuerpo se une específicamente al antígeno con una "alta afinidad" cuando la Kd es ≤ 5 x 10-9 M, y con una "afinidad muy alta" cuando la Kd es ≤ 5 x 10-10 M. En una realización de la invención, el anticuerpo tiene una Kd≤ 10-9 M y una velocidad de disociación de aproximadamente 1 x 10-4/seg. En una realización de la invención, la velocidad de disociación es < 1x10-5. En otras realizaciones de la invención, los anticuerpos se unirán a Dkk-1 humano con una Kd entre aproximadamente 10-8 M y 10-10 M, y en otra realización más se unirán con una Kd≤ 2 x 10-10.

El término "identidad" hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptidos o dos o más moléculas de ácido nucleico, según se determina mediante alineamiento y comparación de las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos de las moléculas comparadas y se calcula basándose en el tamaño de la más pequeña de las moléculas que se están comparando. Para estos cálculos, los espacios en los alineamientos (si los hubiera) deben ser tratados mediante un modelo matemático o un programa de informático concretos (es decir, un "algoritmo"). Los métodos que se pueden utilizar para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carrillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.

Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se están comparando se alinean de una manera que proporciona el mayor emparejamiento entre las secuencias. El programa informático utilizado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al, 1984, Nucl Acid Res 12:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se utiliza para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para un emparejamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos o nucleótidos (el "tramo emparejado", según se determina mediante el algoritmo). Se utilizan junto con el algoritmo una penalización de apertura del espacio (que se calcula como 3X la diagonal media, en donde la "diagonal media" es la media de la diagonal de la diagonal de la matriz de comparación que se está utilizando; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada emparejamiento de aminoácidos perfecto por la matriz de comparación concreta) y una penalización de prolongación del espacio (que es usualmente 1/10 veces la penalización de apertura del espacio), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. En ciertas realizaciones,

también se utiliza con el algoritmo una norma matriz de comparación patrón (véase Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. USA 89: 10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).

Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para secuencias de polipéptidos o nucleótidos utilizando el programa GAP, son los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;

Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al.,1992, más arriba;

Penalización del espacio: 12 (pero sin penalización por espacios en los extremos)

Penalización por longitud del espacio: 4

Umbral de similitud: 0

Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado el apareamiento de solamente una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta a pesar de que no exista una relación significativa entre las dos secuencias completas. En consecuencia, el método de alineamiento seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si así se desea para dar como resultado una alineamiento que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.

Según se utiliza en la presente memoria, "sustancialmente puro" significa que la especie de molécula descrita es la especie predominante presente, es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En ciertas realizaciones, una molécula sustancialmente pura es una composición en la que la especie objeto comprende al menos 50% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes en otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos 80%, 85%, 90 %, 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras realizaciones, la especie objeto se purifica hasta la homogeneidad esencial en donde las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición por métodos de detección convencionales y por lo tanto la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.

El término "osteopenia" hace referencia a un paciente con pérdida de hueso de al menos una desviación típica en comparación con un paciente patrón que se considera que tienen una densidad mineral ósea (DMO) normal. Para los fines de la presente invención, la medición se determina mediante Absorciometría de Rayos X de Energía Dual (DEXA) y la DMO del paciente se compara con un patrón de la misma edad y sexo (puntuación Z). En la determinación de la osteopenia, las mediciones de la DMO pueden tomarse de uno o más huesos.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a la cantidad de un anticuerpo anti-Dkk-1 determinada para producir una respuesta terapéutica en un mamífero. Tales cantidades terapéuticamente eficaces son determinadas fácilmente por un experto normal en la técnica.

"Aminoácido" incluye su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos origen natural y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Sythesis, 2a Edición, (E. S. Golub y D. R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991), incorporada a la presente memoria como referencia para cualquier fin. Los estereoisómeros (p. ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α-,α-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la invención. Los ejemplos de los aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina , σ-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej., 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en la presente memoria, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso y la convención normalizados.

II. Visión de conjunto

La presente invención proporciona composiciones novedosas que comprenden anticuerpos y sitios de unión a antígenos de inmunoglobulinas como se ha escrito anteriormente, que son específicos para Dkk-1 (p. ej., un polipéptido que consiste en los aminoácidos 32-266 del SEC ID NO: 2 o un polipéptido que consiste en los aminoácidos 32 a 272 del SEC ID NO: 4). Algunos de estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden reaccionar de forma cruzada con Dkk-1 de varias fuentes de mamíferos, incluyendo Dkk-1 rata, ratón y humana. Algunos de los anticuerpos y fragmentos tienen una mayor afinidad por Dkk-1 de una especie que de otra (p. ej., algunos anticuerpos y fragmentos de tener mayor afinidad por Dkk-1 humana en comparación con Dkk-1 de rata o murina; otros anticuerpos tienen una mayor afinidad por Dkk-1 de rata o murina en comparación con Dkk-1 humana). La invención también proporciona anticuerpos neutralizadores novedosos, incluyendo anticuerpos quiméricos, humanizados, así como anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que se unen a un epítopo conformacional de Dkk-1 humana. También se describen los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y fragmentos, así como los métodos para la expresión de los anticuerpos usando estos ácidos nucleicos. En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas (p. ej., fragmentos inmunológicamente funcionales y polipéptidos) que son capaces de mostrar las propiedades de unión inmunológicas de los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos.

Los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se describen en la presente memoria tienen una variedad de utilidades. Algunos de los anticuerpos y fragmentos, por ejemplo, son útiles en análisis de unión específica, purificación por afinidad de Dkk-1 o sus ligandos y en análisis de escrutinio para identificar otros antagonistas de la actividad de Dkk-1. Algunos de los anticuerpos se pueden utilizar para tratar diversas enfermedades que están asociadas con la actividad de Dkk-1. Algunos anticuerpos y fragmentos se pueden utilizar por lo tanto en una variedad de tratamientos relacionados con los huesos, tales como el aumento de la densidad mineral ósea, la síntesis de hueso nuevo, el tratamiento de la pérdida ósea sistémica (p. ej., erosiones óseas), la reparación del hueso, y tratamientos para diversas formas de artritis. Algunos anticuerpos también se pueden utilizar para aumentar la actividad de los osteoclastos e inducir la resorción ósea.

III. Anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales

Se proporciona una variedad de anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos como se ha descrito anteriormente. Estos pueden contener un dominio de unión a antígeno (p. ej., anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio, immunoadherencias, y polipéptidos con una región de unión a antígeno) y se unen específicamente a un polipéptido Dkk-1 (p. ej., un polipéptido Dkk-1 humano, de rata y/o murino). Algunos de los agentes, por ejemplo, son útiles en la inhibición de la unión de Dkk-1 a LRP5 y/o LRP6, y por lo tanto se pueden utilizar para estimular una o más de las actividades asociadas con la señalización de Wnt.

A. Estructura de anticuerpos de origen natural

Algunos de los agentes de unión que se proporcionan tienen la estructura típicamente asociada con los anticuerpos de origen natural. Las unidades estructurales de estos anticuerpos comprenden típicamente uno o más tetrámeros, cada uno compuesto de dos pareados idénticos de cadenas polipeptídicas, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solamente una única cadena pesada. En un anticuerpo típico, cada par o pareado incluye una cadena "ligera" completa (en ciertas realizaciones, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" completa (en ciertas realizaciones, aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta de varios "dominios de inmunoglobulina", que consisten cada uno en aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y que expresan un patrón de plegamiento característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que están compuestos los polipéptidos anticuerpo. La porción amino-terminal de cada cadena incluye típicamente un dominio variable que es responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal está más conservada evolutivamente que el otro extremo de la cadena y es referida como "región constante" o "región C". Las cadenas ligeras humanas se clasifican generalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y cada una de ellas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como cadenas mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y éstas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. La IgG tiene varios subtipos, incluyendo, pero sin limitarse a, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Los subtipos de IgM incluyen IgM1 e IgM2. Los subtipos de IgA incluyen IgA1 e IgA2. En los seres humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de la cadena pesada comprende típicamente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de la región constante de la cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen cada una tres dominios de la región C conocidos como CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En ciertas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-Dkk-1 es del subtipo a IgG1, IgG2 o IgG4.

En las cadenas ligeras y pesadas completas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, p. ej., Fundamental Immunology, 2a ed., Cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nueva York: Raven Press (incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman típicamente el sitio de unión al antígeno.

Las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulinas exhiben generalmente la misma estructura general, que comprende regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, más a menudo denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par de cadena pesada /cadena ligera mencionado anteriormente están alineadas típicamente por las regiones marco para formar una estructura que se une específicamente a un epítopo específico de la proteína diana (por ejemplo, Dkk-1). Desde el extremo N-terminal al C-terminal, las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de origen natural conforman ambas típicamente el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se ha ideado un sistema de numeración para asignar números a los aminoácidos que ocupan las posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of

Immunological Interest (1987 y 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md), o Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342: 878-883.

Los ejemplos específicos de algunas de las cadenas ligeras y pesadas completas de los anticuerpos que se proporcionan y sus correspondientes secuencias de nucleótidos y aminoácidos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Cadenas ligera y pesada

Designación Interna

Nombre Abrev. Tipo de Cadena Secuencia de NT (SEC ID NO :) Secuencia de AA (SEC ID NO :)

11H10

L1 Ligera 81 82

11H10 CR

L2 Ligera 25 26

11H10 A1D

L3 Ligera 29 30

11H10

H1 Pesada 88 89

11H10 RT IgG1

H2 Pesada 33 34

11H10 ATT IgG1

H3 Pesada 37 38

11H10 RT IgG2

H4 Pesada 41 42

11H10 LT IgG2

H5 Pesada 45 46

11H10 SKLT IgG2

H6 Pesada 49 50

11H10 D3A IgG2

H7 Pesada 53 54

11H10 D23A IgG2

H8 Pesada 57 58

11H10 D32A IgG2

H9 Pesada 61 62

11H10 D89A IgG2

H10 Pesada 65 66

Cada una de las cadenas ligeras enumeradas en la Tabla 1 se puede combinar con cualquiera de las cadenas pesadas que se muestran en la Tabla 1 para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen L1 combinada con H1-H10 o L2 combinada con H1-H10 y L3 combinada con H1-H10 (es decir, L1H1, L1H2, L1H3, L1H4, L1H5, L1H6, L1H7, L1H8, L1H9, L1H10, L2H1 , L2H2, L2H3, L2H4, L2H5, L2H6, L2H7, L2H8, L2H9, L2H10, L3H1, L3H2, L3H3, L3H4, L3H5, L3H6, L3H7, L3H8, L3H9 y L3H10. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera de las enumeradas en la Tabla 1. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir dos cadenas ligeras L1 y dos cadenas pesadas H1, o dos cadenas ligeras L2 y dos cadenas pesadas H3, o dos cadenas ligeras L2 y dos cadenas pesadas H4 o dos L2 y dos cadenas pesadas H5 y otras combinaciones similares de pares de cadenas ligeras y pares de cadenas pesadas enumeradas en la Tabla 1.

Como ejemplo específico de tales anticuerpos, en una realización, el anticuerpo anti-Dkk-1 es un anticuerpo monoclonal derivado de ratas. Los anticuerpos ilustrativos capaces de unirse al epítopo conformacional anteriormente mencionado son los anticuerpos monoclonales 11H10 y 1F11 (véanse, los ejemplos de más abajo), cada uno de los cuales comprende una cadena ligera y una cadena pesada. La cadena ligera completa de 11H10 está codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEC ID NO: 9, y la cadena pesada completa de 11H10 por la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEC ID NO: 11. La secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y pesada correspondientes de 11H10 se muestran, respectivamente, en los SEC ID NO: 10 y 12. Los residuos 1-20 del SEC ID NO: 10 y los residuos 1-19 del SEC ID NO: 12 corresponden a las secuencias señal de estas cadenas ligera y pesada de 11H10, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera sin la secuencia señal se muestra en el SEC ID NO: 82, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que carece de la secuencia señal se muestra en el SEC ID NO: 89.

De este modo, en un aspecto de la realización anterior, la cadena pesada puede consistir en los aminoácidos 20-465 del SEC ID NO: 12 (es decir, H1, correspondiente al SEC ID NO: 89), y en otro aspecto de esta realización, la cadena ligera puede consistir de los aminoácidos 21-234 del SEC ID NO: 10 (es decir, L1, correspondiente al SEC ID NO: 82). En otro aspecto de esta realización, el anticuerpo comprende tanto una cadena pesada que consiste en los aminoácidos 20-465 del SEC ID NO: 12 como una cadena ligera consiste en los aminoácidos 21-234 del SEC ID

NO: 10. En algunos casos, el anticuerpo consiste en dos cadenas pesadas idénticas que consisten cada una en los aminoácidos 20-465 del SEC ID NO: 12 y dos cadenas ligeras idénticas que consisten cada una en los aminoácidos 21-234 del SEC ID NO: 10. Otro ejemplo específico es un anticuerpo que incluye la cadena ligera L2 (SEC ID NO: 26) y la cadena pesada H2 (SEC ID NO: 34). Las secuencias codificantes para estas cadenas ligera y pesada se presentan, respectivamente, en los SEC ID NO: 25 y 33. Estos anticuerpos pueden incluir dos cadenas pesadas y ligeras idénticas. Las otras cadenas pesadas y cadenas ligeras enumeradas en la Tabla 1 se pueden combinar de una manera similar.

Otros anticuerpos que se proporcionan son variantes de anticuerpos formados por la combinación de las cadenas pesadas y ligeras que se muestran en la Tabla 1 y comprenden cadenas ligeras y/o pesadas que tienen cada una identidad de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con las secuencias de aminoácidos de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos tales formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

B. Dominios variables de anticuerpos

También se proporcionan anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en VL1, VL2, VL3 y/o una región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en VH1-VH10 como se muestra en la Tabla 2 a continuación, y fragmentos, derivados, muteínas y variantes inmunológicamente funcionales de estas regiones variables de la cadenas ligera y la cadena pesada.

Los anticuerpos de este tipo se pueden designar generalmente por la fórmula "VLxVHy", donde "x" es el número de la región variable de la cadena ligera e "y" corresponde al número de la región variable de la cadena pesada que se enumera en la Tabla 2. En general, x e y son cada uno 1 o 2.

Tabla 2: regiones variables

Designación interna

Nombre Abrev. Tipo de Cadena Secuencia de NT (SEC ID NO :) Secuencia de AA (SEC ID NO :)

11H10

VL1 Ligera 83 84

11H10 CR

VL2 Ligera 27 28

11H10 A1D

VL3 Ligera 31 32

11H10

VH1 Pesada 90 91

11H10 RT IgG1

VH2 Pesada 35 36

11H10 ATT IgG1

VH3 Pesada 39 40

11H10 RT IgG2

VH4 Pesada 43 44

11H10 LT IgG2

VH5 Pesada 47 48

11H10 SKLT IgG2

VH6 Pesada 51 52

11H10 D3A IgG2

VH7 Pesada 55 56

11H10 D23A IgG2

VH8 Pesada 59 60

11H10 D32A IgG2

VH9 Pesada 63 64

11H10 D89A IgG2

VH10 Pesada 67 68

De este modo, VL2VH1 hace referencia a un anticuerpo con un dominio de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de VL2 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de VH1. Los anticuerpos que se proporcionan por tanto, incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen la siguiente forma: VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VH10, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, y VL3VH10. En algunos casos, los anticuerpos anteriores incluyen dos dominios de la región variable de la cadena ligera y dos dominios de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, VL12VH12 etc.).

Como ejemplo específico de tales anticuerpos, ciertos anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos comprenden la región variable de la cadena ligera o la región variable de la cadena pesada de 11H10,

en donde la región variable de la cadena ligera consiste en los aminoácidos 21-127 del SEC ID NO: 10 (es decir, VL1, correspondiente al SEC ID NO: 84) y la región variable de la cadena pesada consiste en los aminoácidos 20139 del SEC ID NO: 12 (es decir, VH1, correspondiente al SEC ID NO: 91). En un aspecto de esta realización, el anticuerpo consiste en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas.

También se proporciona, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera que consiste en los aminoácidos 21-127 de la SEC ID NO: 10 o un fragmento unión al antígeno o uno inmunológicamente funcional del mismo que comprende adicionalmente una región variable de la cadena pesada que consiste en los aminoácidos 20-139 del SEC ID NO: 12.

Ciertos anticuerpos comprenden un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de la cadena ligera seleccionada entre L1, L2 o L3 en solo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos, en donde cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente una deleción, una inserción o una sustitución de un aminoácido. La región variable de la cadena ligera en algunos anticuerpos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de VL1, VL2 o VL3.

Algunos anticuerpos que se proporcionan comprenden un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del dominio variable de la cadena pesada seleccionada entre H1-H10 en sólo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos, en donde cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente una deleción, una inserción o una sustitución de un aminoácido. La región variable de la cadena pesada en algunos anticuerpos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9; VH10. Sin embargo, otros anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales incluyen formas variantes de una cadena ligera variante y una cadena pesada variante como se acaba de describir.

C. CDR de anticuerpos

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado se pueden identificar usando el sistema descrito por Kabat et al. en SECuences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication Núm. 91-3242, 1991. Ciertos anticuerpos que se describen en la presente memoria comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas o tienen una identidad de secuencia sustancial con las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR como se resume en la Tabla 3.

Tabla 3: CDR

Cadena

CDR Secuencia de NT (SEC ID NO:) Secuencia de AA

Ligera

CDR1 69 o 85 LASEDIYSDLA (SEC ID NO: 70)

Ligera

CDR2 71 o 86 NANSLQN (SEC ID NO: 72)

Ligera

CDR3 73 o 87 QQYNNYPPT (SEC ID NO: 74)

Pesada

CDR1 75 o 92 DYAMA (SEC ID NO: 76)

Pesada

CDR2 77 o 93 TIIYDGSSTYYRDSVKG (SEC ID NO: 78)

Pesada

CDR3 79 o 94 GLGIATDYFDY (SEC ID NO: 80)

Los anticuerpos y los fragmentos funcionales inmunológicos que se proporcionan pueden incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco o las seis CDR enumeradas anteriormente. Algunos anticuerpos o fragmentos incluyen tanto la CDR3 de la cadena ligera como la CDR3 de la cadena pesada. Ciertos anticuerpos tienen formas variantes de las CDR enumeradas en la Tabla 3, teniendo una o más (es decir, 2, 3, 4, 5 o 6) de cada una de las CDR una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90% o 95% con una secuencia de CDR enumerada en la Tabla 3. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede incluir tanto una CDR3 de la cadena ligera y una CDR3 de la cadena pesada que tienen cada una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90% o 95% con la secuencia de la CDR3 de la cadena ligera y la CDR3 de la cadena pesada, respectivamente, enumeradas en la Tabla 3. Las secuencias de CDR de algunos de los anticuerpos que se proporcionan también pueden diferir de las secuencias de CDR enumeradas en la Tabla 3 de manera que la secuencia de aminoácidos para cualquier CDR dada difiere de la secuencia enumerada en la Tabla 3 en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos. Las diferencias de las secuencias enumeradas son por lo general sustituciones conservativas (véase más adelante).

Como ejemplo específico, los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan pueden comprender una o más de las siguientes secuencias de CDR de la cadena ligera de 11H10:

CDR1: aminoácidos 44-54 del SEC ID NO: 10, que también corresponde al SEC ID NO: 70 (codificado por los nucleótidos 130-162 del SEC ID NO: 9 (SEC ID NO: 85) o SEC ID NO: 69);

CDR2: aminoácidos 70-76 del SEC ID NO: 10, que también corresponde al SEC ID NO: 72 (codificado por los nucleótidos 208-228 del SEC ID NO: 9 (SEC ID NO: 86) o SEC ID NO: 71);

CDR3: los aminoácidos 109-117 de la SEC ID NO: 10, que también corresponde al SEC ID NO: 74 (codificado por los nucleótidos 325-351 del SEC ID NO: 9 (SEC ID NO: 87) o SEC ID NO: 73);

Los anticuerpos y fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales adicionales de la invención puede comprender una o más de las siguientes secuencias de CDR de la cadena pesada de 11H10:

CDR1: aminoácidos 50-54 del SEC ID NO: 12, que también corresponde al SEC ID NO: 76 (codificado por los nucleótidos 148-162 del SEC ID NO: 11 (SEC ID NO: 92) o SEC ID NO: 75);

CDR2: aminoácidos 69-85 del SEC ID NO: 12, que también corresponde al SEC ID NO: 78 (codificado por los nucleótidos 205-255 del SEC ID NO: 11 (SEC ID NO: 93) o SEC ID NO: 77);

CDR3: los aminoácidos 118-128 de la SEC ID NO: 12, que también corresponde al SEC ID NO: 80 (codificado por los nucleótidos 352-384 del SEC ID NO: 11 (SEC ID NO: 94) o el SEC ID NO: 79).

Los polipéptidos que comprenden una o más de las CDR de la cadena ligera o pesada se pueden producir mediante el uso de un vector adecuado para expresar los polipéptidos en una célula anfitriona adecuada como se describe con más detalle a continuación.

Las regiones variables de la cadena pesada y ligera y las CDR que se describen en la Tabla 2 y 3 se pueden utilizar para preparar cualquiera de los diferentes tipos de fragmentos inmunológicamente funcionales que se conocen en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena sencilla y scFv.

D. Anticuerpos y epítopos de unión

Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo en de los residuos especificados, tal como Dkk-1, por ejemplo, lo que se quiere decir es que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que consiste en los residuos especificados (p. ej., un segmento especificado de Dkk-1). Tal anticuerpo no entra necesariamente en contacto con cada residuo en de Dkk-1. Ni cada sustitución o deleción de un único aminoácido en Dkk-1 afectan necesariamente de manera significativa a la afinidad de unión. La especificidad de epítopo de un anticuerpo se puede determinar de diferentes maneras. Un enfoque, por ejemplo, implica someter a ensayo una colección de péptidos solapantes de aproximadamente 15 aminoácidos que abarcan la secuencia de Dkk-1 y que difiere en incrementos de un pequeño número de aminoácidos (p. ej., 3 aminoácidos). Los péptidos se inmovilizan en los pocillos de una placa de microtitulación. La inmovilización se puede efectuar mediante biotinilación de un extremo de los péptidos. Opcionalmente, se pueden biotinilar diferentes muestras del mismo péptido en el extremo N y C e inmovilizarlas en pocillos separados con fines comparativos. Esto resulta útil para la identificación de anticuerpos específicos de los extremos. Opcionalmente, se pueden incluir péptidos adicionales que terminan en un aminoácido concreto de interés. Este enfoque es útil para la identificación de anticuerpos específicos del extremo para fragmentos internos de Dkk-1. Un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional se escruta para determinar la unión específica a cada uno de los diversos péptidos. El epítopo se define como el que aparece con un segmento de aminoácidos que es común a todos los péptidos para los cuales el anticuerpo muestra una unión específica. Los detalles relativos a un enfoque específico para la definición de un epítopo se expone en el Ejemplo 6.

También se proporcionan anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos que se unen a un epítopo conformacional que se encuentra en la porción carboxi terminal de Dkk-1 (véase la Figura 1). El extremo carboxi de Dkk-1 contiene varios residuos de cisteína que forman un conjunto de enlaces disulfuro que crea varios bucles. La invención proporciona anticuerpos que se unen a dos de estos bucles, neutralizando así la capacidad de Dkk-1 para suprimir la actividad de Wnt. Los anticuerpos ilustrativos capaces de unirse al epítopo conformacional antes mencionado son los anticuerpos monoclonales 11H10 y 1F11, cada uno de los cuales comprende una cadena ligera y una cadena pesada. La cadena ligera completa de 11H10 está codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEC ID NO: 9, y la cadena pesada completa de 11H10 por la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEC ID NO: 11. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y pesada correspondientes de 11H10 (incluyendo las secuencias señal) se muestran, respectivamente, en los SEC ID NOS: 10 y 12. Las formas maduras sin las secuencias señal corresponden a los SEC ID NO: 82 y 89.

El epítopo que comprende estos dos bucles está formado por enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína 220 y 237 del SEC ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEC ID NO: 2. El cuerpo de los dos bucles que forman el epítopo incluye por lo tanto los aminoácidos 221-236 y 246-262 del SEC ID NO: 2. Los segmentos dentro de este bucle que están implicados en la unión incluyen los aminoácidos 221-229 del SEC ID NO: 2 y los aminoácidos 246-253 del SEC ID NO: 2. De este modo, ciertos anticuerpos y fragmentos que se proporcionan en la presente memoria se unen específicamente a la región o las regiones anteriores. Algunos de los anticuerpos y fragmentos, por ejemplo, se unen a un péptido que comprende o consiste en los aminoácidos 221 a 262 del SEC ID NO: 2.

En un aspecto de la invención, se proporcionan péptidos que comprenden o consisten en los aminoácidos 221-229 y/o 246-253 del SEC ID NO: 2. Otros péptidos comprenden o consisten en los aminoácidos 221-236 y/o 246-262 del SEC ID NO: 2. Otros péptidos que se proporcionan comprenden o consisten en la región de los aminoácidos 221 a 262 del SEC ID NO: 2 o 221-253 del SEC ID NO: 2. Tales péptidos son más cortos que la secuencia de la proteína completa de una Dkk-1 nativa (p. ej., los péptidos pueden incluir una o más de las regiones anteriores y tener 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, o 200 aminoácidos de longitud). Estos péptidos pueden fusionarse con otro péptido para aumentar la inmunogenicidad y así estar en forma de una proteína de fusión.

E. Anticuerpos competidores

También se proporcionan anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que compiten con uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales ilustrados por la unión específica a Dkk-1. Tales anticuerpos y fragmentos también pueden unirse al mismo epítopo que uno de los anticuerpos ilustrados. Se espera que los anticuerpos y los fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítopo que el anticuerpo o fragmento ilustrado muestren propiedades funcionales similares. Los anticuerpos y fragmentos ilustrados incluyen los descritos anteriormente, incluyendo aquellos con las cadenas pesada y ligera, los dominios de las región variable y las CDR enumerados en las Tablas 1-3. Los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales competidores pueden incluir aquellos que se unen al epítopo descrito en la sección sobre anticuerpos y epítopos de más arriba.

Como ejemplo específico, algunos anticuerpos o fragmentos competidores incluyen aquellos que se unen específicamente a una proteína Dkk-1 que consiste en los aminoácidos 32 a 266 del SEC ID NO: 2 o los aminoácidos 32 a 272 del SEC ID NO: 4 y pueden evitar o reducir la unión a Dkk-1 humana de un anticuerpo que consiste en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en donde dichas cadenas pesadas consisten en los aminoácidos 20-465 del SEC ID NO: 12 y dichas cadenas ligeras consisten en los aminoácidos 21234 del SEC ID NO: 10. Otros anticuerpos competidores evitan o reducen la unión a Dkk-1 humana de un anticuerpo que consiste en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, tales como las enumeradas en la Tabla 1.

F. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos que se proporcionan incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a Dkk-1. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando cualquier mecanismo conocido en la técnica, p. ej., inmortalizando las células de bazo recogidas de animales transgénicos después de la finalización del programa de inmunización. Las células del bazo se pueden inmortalizar usando cualquier mecanismo conocido en la técnica, p. ej., fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en los procedimientos de fusión para producir hibridomas son preferiblemente no productoras de anticuerpos, tienen alta eficacia de fusión, y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento solamente de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para uso en fusiones de ratón incluyen SP-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, SP210-GA14, FO, NSO/U, MPC11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de las líneas celulares utilizadas en las fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para las fusiones celulares son U266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En algunos casos, se produce una línea celular de hibridoma inmunizando un animal con un inmunógeno Dkk-1; cosechando las células de bazo del animal inmunizado; fusionando las células de bazo cosechadas con una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; establecimiento las líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma, e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipéptido Dkk-1. Tales líneas celulares de hibridoma, y anticuerpos monoclonales anti-Dkk-1 producidos por las mismas, están abarcados por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma se pueden purificar utilizando cualquier mecanismo conocido en la técnica. Los hibridomas o mAb se pueden escrutar adicionalmente para identificar mAb con propiedades concretas, tales como la capacidad de bloquear una actividad inducida por Wnt. Los ejemplos de tales escrutinios se proporcionan en los ejemplos siguientes.

G. Anticuerpos quiméricos y humanizados

También se proporcionan anticuerpos quiméricos y humanizados basados en las secuencias anteriores. Los anticuerpos monoclonales para su uso como agentes terapéuticos pueden ser modificados de diversas maneras antes de su uso. Un ejemplo es un anticuerpo "quimérico", que es un anticuerpo compuesto de segmentos de proteínas de diferentes anticuerpos que se unen covalentemente para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas funcionales o porciones inmunológicamente funcionales de las mismas. En general, una porción de la cadena pesada y/o de la cadena ligera es idéntica u homóloga a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el resto de la cadena o de las cadenas es o son idénticas u homólogas a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos. Para los métodos referentes a los anticuerpos quiméricos, véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6851-6855 (1985), que se incorporan a la presente como referencia. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089, y 5.530.101, que se incorporan todas a la presente como referencia para todos los propósitos.

En general, el objetivo de elaborar un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que se maximiza el número de aminoácidos de la especie del paciente pretendido. Un ejemplo es el anticuerpo "injertado con CDR", en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una especie concreta o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos concretas, mientras que el resto de la cadena o de las cadenas de anticuerpo es o son idénticas u homólogas a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos. Para su uso en los seres humanos, a menudo se injertan la región V o CDR seleccionadas de un anticuerpo de roedor en un anticuerpo humano, remplazando las regiones V o CDR de origen natural del anticuerpo humano.

Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo "humanizado". Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal producido inicialmente en un animal no humano. Ciertos residuos de aminoácidos en este anticuerpo monoclonal, típicamente en las porciones del anticuerpo que no son de reconocimiento de antígeno, se modifican para que sean homólogos a los residuos correspondientes en un anticuerpo humano del isotipo correspondiente. La humanización se puede realizar, por ejemplo, utilizando diversos métodos mediante la sustitución de al menos una parte de una región variable de roedor por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.585.089, y 5.693.762; Jones y col., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-36).

En un aspecto de la invención, las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria (véase la Tabla 3) se injertan en las regiones marco (FR) de anticuerpos de la misma especie filogenética, o de una diferente. Por ejemplo, las CDR de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo 11H10 se pueden injertar en FR humanas consenso. Para crear FR humanas consenso, se pueden alinear las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas o cadenas ligeras humanas para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. En otras realizaciones, las FR de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo 11H10 se remplazan por las FR de una cadena pesada o una cadena ligera diferentes. En un aspecto de la invención, los aminoácidos raros de las FR de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-Dkk-1 no se remplazan, mientras que el resto de los aminoácidos de la FR se remplazan. Un "aminoácido raro" es un aminoácido específico que se encuentra en una posición en la que este aminoácido concreto no se encuentra generalmente en una FR. Alternativamente, las regiones variables injertadas del anticuerpo 11H10 se pueden utilizar con una región constante que es diferente de la región constante de 11H10. En otras realizaciones de la invención, las regiones variables injertadas forman parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla.

En ciertas realizaciones, se pueden utilizar regiones constantes de especies distintas a la humana junto con la región o las regiones variables humanas para producir anticuerpos híbridos.

H. Anticuerpos completamente humanos

Se proporcionan métodos para producir anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer a los seres humanos al antígeno ("anticuerpos completamente humanos"). Uno de los medios para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la "humanización" del sistema inmunitario humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que se han inactivado genes de Ig endógenos es uno de los medios de producción de anticuerpos monoclonales completamente humanos (Mab) en ratón, un animal que puede ser inmunizado con cualquier antígeno deseable. Mediante el uso de anticuerpos completamente humanos se pueden minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que a veces pueden ser causadas por la administración de Mab de ratón o derivatizados de ratón a seres humanos como agentes terapéuticos.

Se pueden producir anticuerpos completamente humanos mediante la inmunización de animales transgénicos (generalmente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Los antígenos para este fin tienen típicamente seis o más aminoácidos contiguos, y se conjugan opcionalmente con un portador, tal como un hapteno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. En un ejemplo de tal método, se producen animales transgénicos incapacitando los loci de inmunoglobulina de ratón endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera de ratón en el mismo, e insertando en el genoma de ratón grandes fragmentos de ADN del genoma humano que contienen loci que codifican las proteínas de las cadenas pesada y ligera humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de loci de inmunoglobulina humana, son cruzados a continuación para obtener un animal que tenga todas las modificaciones del sistema inmunitario deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno, pero tienen secuencias de aminoácidos humanas en lugar de murinas, incluyendo las regiones variables. Para más detalles de tales métodos, véase, por ejemplo, los documentos WO 96/33735 y WO 94/02602, que se incorporan a la presente como referencia. Los métodos adicionales relativos a los ratones transgénicos para producir anticuerpos humanos se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.545.807; 6.713.610; 6.673.986; 6.162.963; 5.545.807; 6.300.129; 6.255.458; 5.877.397; 5.874.299 y 5.545.806; en las publicaciones PCT WO91/10741, WO90/04036, y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1.

Los ratones transgénicos descritos anteriormente, referidos en la presente memoria como "ratones HuMab", contienen un minilocus del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena

pesada humana (μ y γ) y ligera κ no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena μ y κ endógenos (Lonberg et al, 1994, Nature 368: 856-859). Por consiguiente, los ratones muestran una expresión reducida de la IgM o κ de ratón en respuesta a la inmunización, y los transgenes de cadena pesada y ligera humanas introducidos experimentan cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG κ humanos de alta afinidad (Lonberg et al., más arriba; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. NY Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación de ratones HuMab es descrita en detalle por Taylor et al, 1992, Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295; Chen et al, 1993, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al, 1994, Nature 368: 856859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49-101; Taylor et al., , 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. NY Acad. Sci.

764: 536-546; Fishwild et al, 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse adicionalmente las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; así como la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.807; las publicaciones internacionales números WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918. Las tecnologías utilizadas para la producción de anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se describen también en el documento WO 98/24893, y Méndez et al, 1997, Nature Genetics 15: 146-156. Por ejemplo, se pueden utilizar las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 para generar anticuerpos anti-Dkk-1 humanos.

Utilizando la tecnología de hibridomas, se pueden producir y seleccionados MAb humanos específicos de antígenos con la especificidad deseada a partir de los ratones transgénicos tales como los descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden clonarse y expresarse utilizando un vector y una célula anfitriona adecuados, o se pueden cosechar los anticuerpos a partir de células de hibridoma cultivadas.

Los anticuerpos completamente humanos también pueden obtenerse de genotecas de presentación en fagos (como describen Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Las técnicas de presentación de fagos imitan la selección inmunitaria por medio de la presentación de repertorios de anticuerpos sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, y la posterior selección de fagos por medio de su unión a un antígeno de elección. Una de tales técnicas se describe en la Publicación PCT Núm. WO 99/10494, que describe el aislamiento de alta afinidad y anticuerpos agonísticos funcionales para receptores MPL y msk utilizando tal enfoque.

I. Anticuerpos biespecíficos o bifuncionales

Los anticuerpos que se proporcionan también incluyen anticuerpos biespecíficos y bifuncionales que incluyen una o más CDR o una o más regiones variables como se ha descrito anteriormente. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos, incluyendo, pero no limitados a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véanse, p. ej., Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553.

J. Otras formas diversas

Algunos de los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan son formas variantes de los anticuerpos y fragmentos descritos anteriormente (p. ej., los que tienen las secuencias enumeradas en las

Tablas 1-3). Por ejemplo, algunos de los anticuerpos o fragmentos son los que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en una o más de las cadenas pesada o ligera, regiones variables o CDR enumeradas en las Tablas 1-3.

Los aminoácidos de origen natural pueden dividirse en clases basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) alcalinos: His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar residuos de aminoácidos de origen no natural, que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas de radicales de aminoácidos revertidas o invertidas.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homólogas a los anticuerpos humanos, o en regiones no homólogas de la molécula.

Al realizar tales cambios, de acuerdo con ciertas realizaciones, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. El perfil hidropático de una proteína se calcula mediante la asignación a cada aminoácido de un valor numérico ("índice de hidropatía") y a continuación promediando repetitivamente estos valores a lo largo de la cadena peptídica. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobia y carga. Estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5) ; aspartato (-3,5), asparragina (-3,5), lisina (-3,9) y arginina (4,5).

La importancia del perfil hidropático para conferir una función biológica interactiva a una proteína es comprendida en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios basados en el índice hidropático, en ciertas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2. En algunos aspectos de la invención, se incluyen aquellos que están dentro de ± 1, y en otros aspectos de la invención, se incluyen aquellos dentro de ± 0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar eficazmente basándose en la hidrofilia, concretamente cuando la proteína o péptido biológicamente funcionales creados de ese modo está destinados al uso en realizaciones inmunológicas, como en el presente caso. En ciertas realizaciones, la mayor hidrofilia media local de una proteína, que se rige por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y unión al antígeno o inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1), serina (+0,3); asparragina (+0,2); glutamina (+0,2), glicina (0); treonina (0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al realizar cambios basados en valores de hidrofilia similares, en ciertas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de ± 2, en otras realizaciones, se incluyen los que están dentro de ± 1, y en otras realizaciones más, se incluyen aquellos dentro de ± 0,5. En algunos casos, se puede, identificar también epítopos procedentes de secuencias de aminoácidos primarias basándose en la hidrofilia. Estas regiones son también conocidas como "regiones centrales epitópicas".

Las sustituciones de aminoácidos conservativas ilustrativas se exponen en la Tabla 4.

Tabla 4

Sustituciones de aminoácidos

Residuos originales

Sustituciones ilustrativas

Ala

Val, Leu, Ile

Arg

Lys, Gln, Asn

Asn

Gln

Ásp

Glu

Cys

Ser, Ala

Gln

Asn

Glu

Ásp

Gly

Pro, Ala

His

Asn, Gln, Lys, Arg

Ile

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina

Leu

Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe

Lys

Arg, Gln, Asn, ácido 1,4-diaminobutírico

Met

Leu, Phe, Ile

Phe

Leu, Val, Ile, Ala, Tyr

Pro

Ala

Ser

Thr, Ala, Cys

Thr

Ser

Trp

Tyr, Phe

Tyr

Trp, Phe, Thr, Ser

Val

Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina

Un experto en la técnica será capaz de determinar las variantes de polipéptidos adecuadas como se expone en la presente memoria utilizando mecanismos bien conocidos. Un experto en la técnica puede identificar zonas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad eligiendo como blanco regiones que se

5 cree que no son importantes para la actividad. El experto en la técnica también será capaz de identificar los residuos y porciones de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. En realizaciones adicionales, incluso las zonas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden ser objeto de sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del polipéptido.

10 Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. A la vista de tal comparación, se puede pronosticar la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes

15 pronosticados.

Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de tal información, un experto en la técnica puede pronosticar el alineamiento de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no realizar cambios radicales a los residuos de aminoácidos 20 que se pronostica que están en la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden estar involucrados en importantes interacciones con otras moléculas. Por otra parte, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes

se pueden escrutar a continuación utilizando análisis para determinar la actividad neutralizadora de Dkk-1, (véanse los ejemplos de más abajo) proporcionando de ese modo información referente a cuales los aminoácidos se pueden cambiar y cuales no se deben cambiar. En otras palabras, basándose en la información recopilada a partir de tales experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de aminoácidos en las que se deben evitar sustituciones adicionales ya sea solas o combinadas con otras mutaciones.

Numerosas publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véanse Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; y Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Por otra parte, están disponibles en la actualidad programas informáticos para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método de predicción de la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30%, o similitud mayor de 40% a menudo tienen topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de las bases de datos estructurales de proteínas (PDB) ha proporcionado una mejor previsibilidad de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos en la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que hay un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dados y que una vez que se han resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural llegará a ser notablemente más precisa.

Los métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen el "enhebrado" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "Análisis del perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253:164170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), y "conexión evolutiva" (Véase Holm, 1999, más arriba, y Brenner, 1997, más arriba).

En algunas realizaciones de la invención, se realizan sustituciones de aminoácidos que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión de ligando o antígeno, y/o (4) confieren otras propiedades fisicoquímicas o funcionales a estos polipéptidos o las modifican. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de un solo o múltiples aminoácidos (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural. Las sustituciones se pueden realizar en aquella porción del anticuerpo que se encuentra fuera del dominio o los dominios formando contactos intermoleculares). En tales realizaciones, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos conservativas que no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (p. ej., remplazo de uno o más aminoácidos que no desorganizan la estructura secundaria que caracteriza el anticuerpo parental o nativo). Los ejemplos de las estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed.), 1984, W. H. Nueva York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds.), 1991, Nueva York: Garland Publishing; y Thornton et al, 1991, Nature 354: 105, que se incorporan a la presente memoria como referencia.

La invención también abarca variantes de glicosilación de los anticuerpos de la invención en las que se han alterado el número y/o tipo de sitios de glicosilación en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido original. En ciertas realizaciones, las variantes de proteínas de anticuerpos comprenden un número mayor o un menor de sitios de glicosilación ligado a N que el anticuerpo nativo. Un sitio de glicosilación ligado a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato ligada a N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia evitarán la adición de una cadena de carbohidrato ligada a N presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilación puede reducirse mediante la supresión de una Asn o mediante la sustitución de la Asn por un aminoácido diferente. En otras realizaciones, se crean uno o más sitios ligados a N nuevos. Los anticuerpos tienen típicamente un sitio de glicosilación ligado a N en la región Fc. Por ejemplo, el anticuerpo 11H10 descrito en la presente memoria tiene un sitio de glicosilación ligado a N en el aminoácido 315 (SEC ID NO: 12).

Las variantes de anticuerpos preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en donde uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos parental o nativa son suprimidos o sustituidos por otro aminoácido (p. ej. serina). Las variantes de cisteína son útiles, entre otros cuando los anticuerpos deben ser replegados a una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener menos residuos de cisteína que el anticuerpo nativo, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones que resultan de las cisteínas desemparejadas.

Las cadenas pesadas y ligeras, los dominios de las regiones variables y las CDR que se han descrito se pueden utilizar para preparar polipéptidos que contienen una región de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un polipéptido Dkk-1. Por ejemplo, se pueden incorporar una o más de las CDR enumeradas en la Tabla 3 a una molécula (p. ej., un polipéptido) de forma covalente o no covalentemente para formar una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede conectar covalentemente las CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno concreto de interés (p. ej., un polipéptido Dkk-1 o epítopo del mismo).

También se proporcionan derivados de los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se describen en la presente memoria. El anticuerpo o fragmento derivatizados pueden comprender cualquier molécula

o sustancia que confiera una propiedad deseada al anticuerpo o fragmento, tal como un aumento de la vida media en un uso concreto. El anticuerpo derivatizado puede comprender, por ejemplo, un radical detectable (o de marcaje)

(p. ej., una molécula radiactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una cuenta detectable (tal como una cuenta magnética o electrodensa (p. ej., oro)), o una molécula que se une a otra molécula (p. ej., biotina o estreptavidina)), un radical terapéutico o de diagnóstico (p. ej., un radical radiactivo, citotóxico, o farmacéuticamente activo), o una molécula que aumenta la idoneidad del anticuerpo para un uso concreto (p. ej., la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Los ejemplos de las moléculas que se pueden utilizar para derivar un anticuerpo incluyen albúmina (p. ej., albúmina de suero humano) y polietilenglicol (PEG). Se pueden preparar derivados unidos a albúmina y PEGilados de anticuerpos utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica. En una realización, el anticuerpo se conjuga o se une de otra manera a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o la variante de TTR se pueden modificar químicamente, por ejemplo, con un agente químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli (N-vinilpirrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propropilenglicol, co-polímeros óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y poli(alcoholes vinílicos).

Otros derivados incluyen productos conjugados covalentes o de agregación de anticuerpos anti-Dkk-1, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de anticuerpo anti-Dkk-1. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido señal heterólogo (o líder), p. ej., el líder del factor alfa de levadura, o un péptido tal como un epítopo tag. Las proteínas de fusión que contienen anticuerpo anti-Dkk-1 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación del anticuerpo anti-Dkk-1 (p. ej., Poli-His). Un polipéptido de anticuerpo anti-Dkk-1 también puede estar conectado al péptido FLAG como describen Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, y Patente de los Estados Unidos Núm.

5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente a un anticuerpo monoclonal (mAb) específico, permitiendo un análisis rápido y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para la preparación de proteínas de fusión en las que el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido dado son asequibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).

Los oligómeros que contienen uno o más polipéptidos de anticuerpo anti-Dkk-1 se pueden emplear como antagonistas de Dkk-1. Los oligómeros pueden estar en la forma de dímeros, trímeros, u oligómeros superiores unidos covalentemente o unidos no covalentemente. Se contempla el uso de oligómeros que comprenden dos o más polipéptidos de anticuerpos anti-Dkk-1, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrımeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etcétera.

Una realización está dirigida a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos de anticuerpo anti-Dkk-1 ensamblados a través de interacciones covalentes o no covalentes entre radicales peptídicos fusionados a los polipéptidos de anticuerpos anti-Dkk-1. Tales péptidos pueden ser conectores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de polipéptidos de anticuerpos anti-Dkk-1 anclados a los mismos, como se describe con más detalle a continuación.

En realizaciones concretas, los oligómeros pueden comprenden de dos a cuatro polipéptidos de anticuerpos antiDkk-1. Los radicales de anticuerpos anti-Dkk-1 del oligómero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, p. ej., variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden polipéptidos de anticuerpos anti-Dkk-1 que tienen actividad de unión a Dkk-1.

En una realización, se prepara un oligómero utilizando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, p. ej., por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 - 10/19/11.

Una realización de la presente invención está dirigida a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando de un fragmento de unión a Dkk-1 de un anticuerpo anti-Dkk-1 a la región Fc de un anticuerpo. El dímero se puede elaborar, por ejemplo, insertando una fusión génica que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión génica en células anfitrionas transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble en forma de moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los radicales de Fc para proporcionar el dímero.

El término "polipéptido de Fc" según se utiliza en la presente memoria incluye las formas nativas y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden radicales Fc (y los oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de una fácil purificación mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 y en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.426.048 y 5.262.522 (cada una de los cuales se incorpora a la presente como referencia), es un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta el extremo C nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína de Fc descrita en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe una afinidad reducida por los receptores Fc.

En otras realizaciones, la porción variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-Dkk-1 tal como se describe en la presente memoria puede ser sustituida por la porción variable de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo.

Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos de anticuerpos antiDkk-1, con o sin conectores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los conectores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.751.180 y 4.935.233.

Otro método para la preparación de derivados de anticuerpos anti-Dkk-1 oligoméricos implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los péptidos de origen natural y los derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de los dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D de tensioactivo pulmonar (SPD) descrita por Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, incorporada a la presente como referencia. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma es descrita por Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-Dkk-1 o un derivado fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células anfitrionas adecuadas, y los fragmentos de anticuerpos anti-Dkk-1 oligoméricos solubles o derivados que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo

Algunos anticuerpos que se proporcionan tienen una afinidad de unión (Ka) para Dkk-1 de al menos 104 o 105/M x segundo medida, por ejemplo, como se describe en los ejemplos de más abajo. Otros anticuerpos tienen una ka de al menos 106, 107, 108 o 109/M x segundo. Ciertos anticuerpos que se proporcionan tienen una baja velocidad de disociación. Algunos anticuerpos, por ejemplo, tienen una Koff 1 x 10-4s-1, 1 x 10-5s-1 o inferior. En otra realización, la Koff es la misma que en un anticuerpo que tiene las siguientes combinaciones de dominios de la región variable VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VH10, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, VL3VH10.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-Dkk-1, que tiene una vida media de al menos un día in vitro o in vivo (p. ej. cuando se administra a un sujeto humano). En una realización, el anticuerpo tiene una vida media de al menos tres días. En otra realización, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de cuatro días o más. En otra realización, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de ocho días o más. En otra realización, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo son derivatizados o modificados de tal manera que tienen una vida media más larga en comparación con el anticuerpo no derivatizado o no modificado. En otra realización, el anticuerpo contiene mutaciones puntuales para aumentar la vida media en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de Febrero de 2000, incorporado como referencia.

IV. Ácidos nucleicos

También se proporcionan los ácidos nucleicos descritos anteriormente que codifican una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o de ADN, y variantes artificiales de los mismos (p. ej., ácidos peptidonucleicos).

El ADN que codifica polipéptidos de anticuerpos (p. ej., cadena pesada o ligera, solamente dominio variable, o completo) se puede aislar de células B de ratones que han sido inmunizados con Dkk-1 o un fragmento inmunogénico del mismo. El ADN puede ser aislado mediante procedimientos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presentación en fagos es otro ejemplo de una técnica conocida por medio de la cual se pueden preparar derivados de anticuerpos. En un enfoque, los polipéptidos que son componentes de un anticuerpo de interés se expresan en cualquier sistema de expresión recombinante adecuado, y se permite que los polipéptidos expresados se ensamblen para formar moléculas de anticuerpo.

Los ácidos nucleicos ilustrativos que codifican las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y las CDR de los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan se enumeran en las Tablas 1-3 de más arriba. Debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias de polipéptidos enumeradas en las Tablas 1-3 también está codificada por un gran número de otras secuencias de ácidos nucleicos, además de las enumeradas en las Tablas 1-3. La presente invención proporciona cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica cada anticuerpo de la invención.

Se pueden introducir cambios mediante mutación en un ácido nucleico, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido (p. ej., un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invención) que codifica. Las mutaciones se pueden introducir utilizando cualquier mecanismo conocido en la técnica. En una realización, se cambian uno o más residuos de aminoácidos concretos utilizando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis dirigida al sitio. En otra realización, se cambian uno o más residuos seleccionados al azar utilizando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis al azar. No obstante, con independencia de cómo se elabore, un polipéptido mutante puede ser expresado y escrutado para determinar una propiedad deseada.

Se pueden introducir mutaciones en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica del polipéptido que codifica. Por ejemplo, se puede realizar sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos no esenciales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una porción del mismo (p. ej., un fragmento que contiene una o más CDR o uno o más dominios de la región variable). Los ejemplos de vectores incluyen, pero se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores de mamíferos no episómicos y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitriona. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células anfitrionas que se van a utilizar para la expresión, que están conectadas operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células anfitrionas (p. ej., el intensificador del gen temprano de SV40, el promotor del virus del sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células anfitrionas (p. ej., Secuencias reguladoras específicas de tejidos, véanse Voss et al., 1986, Trends Biochem Sci. 11:287, Maniatis y col., 1987, Science 236:1237, incorporadas como referencia en la presente memoria en su totalidad), y aquellas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a un tratamiento o afección concretos (p. ej., el promotor de la metalotioneína en células de mamífero y el promotor sensible a tet y/o sensible a estreptomicina en sistemas tanto procarióticos como eucarióticos (véase id.). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células anfitrionas para producir de este modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células anfitrionas en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula anfitriona puede ser cualquier célula procariótica (p. ej., E. coli) o células eucariótica (p. ej., células de levadura, insecto, o mamífero (p. ej., células CHO)). El ADN vector se puede introducir en células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizados, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., para la resistencia a antibióticos) en las células anfitrionas junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección con fármacos (p. ej., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán), entre otros métodos.

V. Preparación de Anticuerpos

Los anticuerpos no humanos que se proporcionan pueden derivar, por ejemplo, de cualquier animal productor de anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como mono (p. ej., cynomolgus o mono rhesus) o simios (p. ej., chimpancé)). Se pueden utilizar anticuerpos no humanos, por ejemplo, en las aplicaciones basadas en el cultivo in vitro de células y en cultivos celulares, o cualquier otra aplicación en la que no se produzca o sea insignificante, se pueda prevenir, no sea una preocupación, o se desee una respuesta inmunitaria al anticuerpo. En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos se pueden producir mediante la inmunización con Dkk-1 completa o con la mitad carboxi-terminal de Dkk-1. Alternativamente, los anticuerpos no humanos mencionados se pueden originar mediante inmunización con los aminoácidos 221-236 y/o los aminoácidos 246 a 262 del SEC ID NO: 2, que son segmentos de Dkk-1 humana que forman parte del epítopo al cual se unen ciertos anticuerpos proporcionados en la presente memoria (p. ej., 11H10, véase la Figura 1). Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, o pueden ser sintetizados en células anfitrionas mediante la expresión de ADN recombinante.

Los anticuerpos completamente humanos se pueden preparar como se ha descrito anteriormente mediante la inmunización de animales transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana o mediante la selección de una genoteca de presentación en fagos que está expresando un repertorio de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología de anticuerpos monoclonales convencional, p. ej., la técnica de hibridación de células somáticas estándar de Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495. Alternativamente, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal adecuado para la preparación de hibridomas es el sistema murino, que es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y los mecanismos para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. Para tales procedimientos, las células B de ratones inmunizados se fusionan con un compañero de fusión inmortalizado adecuado, tal como una línea celular de mieloma murino. Si se desea, se pueden inmunizar además ratas u otros mamíferos en lugar de ratones y se pueden fusionar células B procedentes de estos animales con la línea celular de mieloma murino para formar hibridomas. Alternativamente, se puede utilizar una línea celular de mieloma de una fuente que no sea de ratón. Los procedimientos de fusión para la elaboración de hibridomas también son bien conocidos.

Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan se pueden formar conectando fragmentos del dominio variable (región Fv) de la cadena pesada y ligera (véase, p. ej., la Tabla 2) a través de un puente de aminoácidos (conector peptídico corto), dando como resultado una única cadena polipeptídica. Tales Fv de cadena sencilla (scFv) se pueden preparar fusionando el ADN que codifica un conector peptídico entre los ADN que codifican los dos polipéptidos del dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes se pueden volver a plegar sobre sí mismos para formar monómeros de unión al antígeno, o pueden formar multímeros (p. ej., dímeros, trímeros, o tetrámeros), en función de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Ing. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Mediante la combinación de diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH, se puede formar scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyen las descritas en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a los scFv que comprenden las combinaciones de dominios variables: VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VH10, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, VL3VH10.

Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria que son de una subclase se pueden cambiar a anticuerpos de una subclase diferente utilizando métodos de cambio de subclase. De este modo, los anticuerpos IgG pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a antígenos de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero también exhiben propiedades biológicas asociadas a un isotipo o subclase de anticuerpo diferentes de los del anticuerpo parental. Se pueden emplear técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo concretos se puede emplear en tales procedimientos, p. ej., el ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase, p. ej., Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16.

Por consiguiente, los anticuerpos que se proporcionan incluyen los que comprenden, por ejemplo, las siguientes combinaciones de dominios variables: VL1VH1, VL1VH2, VL1VH3, VL1VH4, VL1VH5, VL1VH6, VL1VH7, VL1VH8, VL1VH9, VL1VH10, VL2VH1, VL2VH2, VL2VH3, VL2VH4, VL2VH5, VL2VH6, VL2VH7, VL2VH8, VL2VH9, VL2VH10, VL3VH1, VL3VH2, VL3VH3, VL3VH4, VL3VH5, VL3VH6, VL3VH7, VL3VH8, VL3VH9, VL3VH10 que tiene un isotipo deseado (p. ej., IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, e IgD), así como fragmentos Fab o F(ab ')2 de los mismos. Por otra parte, si se desea una IgG4, también puede ser deseable introducir una mutación puntual

(CPSCP → CPPCP) en la región de bisagra como describen Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, que se

incorpora a la presente memoria como referencia) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro entre las cadenas H que puede conducir a la heterogeneidad de los anticuerpos IgG4.

Por otra parte, también se conocen técnicas para obtener anticuerpos que tienen diferentes propiedades (esto es, afinidades variables para el antígeno al que se unen). Una de estas técnicas, conocida como barajado de cadenas, implica desplegar repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulina sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, a menudo referida como presentación en fagos. El barajado de cadenas se ha utilizado para preparar anticuerpos de alta afinidad para el hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como describen Marks et al., 1992, Biotechnology, 10:779.

Se pueden realizar modificaciones conservativas en las cadenas pesadas y ligeras descritas en la Tabla 1 (y las modificaciones correspondientes de los ácidos nucleicos que codifican) para producir un anticuerpo anti-Dkk-1 que tiene características funcionales y bioquímicas. Los métodos para lograr tales modificaciones se han descrito anteriormente.

Los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos de acuerdo con la invención se pueden modificar adicionalmente de diversas maneras. Por ejemplo, si se van a utilizar para fines terapéuticos, se pueden conjugar con polietilenglicol (pegilación) para prolongar la vida media en suero o para mejorar la liberación de proteínas. Alternativamente, la región V de los anticuerpos sujeto o fragmentos de los mismos se pueden fusionar con la región Fc de una molécula de anticuerpo diferente. La región Fc utilizada para este propósito se puede modificar de modo que no se una al complemento, reduciendo así la probabilidad de inducir la lisis de las células en el paciente cuando se utiliza la proteína de fusión como agente terapéutico. Además, los anticuerpos sujeto o fragmentos funcionales de los mismos se pueden conjugar con albúmina de suero humano para mejorar la vida media en suero del anticuerpo

o fragmento del mismo. Otro compañero de fusión útil para los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos es la transtiretina (TTR). La TTR tiene la capacidad de formar un tetrámero, de este modo una proteína de fusión de anticuerpo-TTR puede formar un anticuerpo multivalente que puede aumentar su avidez de unión.

Alternativamente, se pueden lograr modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de los anticuerpos y fragmentos descritos en la presente memoria mediante la creación de sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena molecular principal en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) la voluminosidad de la cadena lateral. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo que tiene poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en esa posición. Por otra parte, también se puede sustituir cualquier residuo nativo en el polipéptido por alanina, como se ha descrito previamente para la mutagénesis de barrido con alanina.

Las sustituciones de aminoácidos (ya sea conservativas o no conservativas) de los anticuerpos sujeto pueden ser implementadas por los expertos en la técnica mediante la aplicación de mecanismos rutinarios. Las sustituciones de aminoácidos se pueden utilizar para identificar residuos importantes de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, o para aumentar o disminuir la afinidad de estos anticuerpos por la Dkk-1 humana o para modificar la afinidad de unión de otros anticuerpos anti-Dkk-1 descritos en la presente memoria.

VI. Expresión de anticuerpos anti-Dkk-1

Los anticuerpos anti-Dkk-1 y los fragmentos funcionales inmunológicos se pueden preparar mediante cualquiera de diversas técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos anti-Dkk-1 mediante sistemas de expresión recombinante, utilizando cualquier mecanismo conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Kennet et al. (Eds.) Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar en líneas celulares de hibridoma o en líneas celulares distintas de hibridomas. Los constructos de expresión que codifican los anticuerpos se pueden usar para transformar una célula anfitriona de mamífero, insecto o microbiana. La transformación puede realizarse usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona, incluyendo, por ejemplo el empaquetamiento del polinucleótido en un virus o un bacteriófago y la transducción de una célula anfitriona con el constructo por medio de procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ilustra mediante las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455 (cuyas patentes se incorporan a la presente como referencia para cualquier propósito). El procedimiento de transformación óptimo utilizado dependerá de qué tipo de célula anfitriona está siendo transformado. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en el liposoma, mezclado de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Los constructos de expresión recombinantes de la invención comprenden típicamente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más de los siguientes: una región constante de la cadena pesada (p. ej., CH1, CH2 y/o CH3) una región variable de la cadena pesada, una región constante de la cadena ligera, una región variable de la cadena ligera, una o más CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-Dkk-1. Estas secuencias de ácidos nucleicos se insertan en un vector de expresión apropiado utilizando técnicas de ligación convencionales. En una realización, la región constante de la cadena pesada o ligera de 11H10 se añade al extremo C de la región variable de la cadena pesada o ligera específica de Dkk-1 y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula anfitriona concreta empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula anfitriona, lo que permite que se pueda producir la amplificación y/o expresión del gen). En algunas realizaciones, se utilizan vectores que emplean análisis de complementación de fragmentos de proteínas utilizando informadores proteicos, tales como dihidrofolato reductasa (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.270.964, que se incorpora a la presente como referencia). Los vectores de expresión adecuados se pueden adquirir, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (antes "Clontech"). Otros vectores útiles para la clonación y expresión de los anticuerpos y fragmentos de la invención incluyen los descritos por Bianchi y McGrew, Biotech Biotechnol Bioeng 84 (4): 439-44 (2003), que se incorpora a la presente por referencia. Los vectores de expresión adecuados adicionales se comentan, por ejemplo, en Methods Enzymol, vol. 185 (DV Goeddel, ed.), 1990, Nueva York: Academic Press, que se incorpora a la presente como referencia.

Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células anfitrionas contienen secuencias para el mantenimiento de plásmido o virus y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente como "secuencias flanqueantes" incluyen típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos conectadas operativamente: un promotor, una o más secuencias intensificadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio donador y aceptor de empalme, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptidos, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia codificante "etiqueta", es decir, una molécula de oligonucleótido situada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificante, una secuencia de oligonucleótidos que codifica poliHis (tal como hexahis), u otra "etiqueta" para la cual existen anticuerpos asequibles comercialmente, tales como FLAG®, HA (hemaglutinina del virus de influenza), o myc. La etiqueta se fusiona típicamente a la proteína de anticuerpo después de la expresión, y puede servir como un medio para purificación por afinidad del anticuerpo a partir de la célula anfitriona. La purificación por afinidad puede lograr, por ejemplo, mediante cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente del polipéptido de anticuerpo purificado mediante diversos medios tales como el uso de ciertas peptidasas para la escisión.

Las secuencias flanqueantes en el vector de expresión puede ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula anfitriona), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula anfitriona), (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria de la célula anfitriona.

Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención se pueden obtener por medio de cualquiera de diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente memoria habrán sido identificadas previamente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y de ese modo pueden ser aisladas de la fuente tisular apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante puede ser conocida. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar usando los métodos descritos en la presente memoria para la síntesis de ácidos o clonación nucleicos.

Cuando es conocida la totalidad o sólo una porción de la secuencia flanqueante, ésta se puede obtener utilizando la PCR y/o escrutando una biblioteca genómica con un oligonucleótido adecuado y/o un fragmento de secuencia flanqueante de la misma o de otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante de una pieza más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen u otros genes. El aislamiento se puede completar mediante digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido de aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA), u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para los expertos en la técnica.

Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procariotas, particularmente los adquiridos comercialmente, y el origen ayuda a la amplificación del vector en una célula anfitriona. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, se puede sintetizar uno químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligar en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas y son útiles diversos orígenes (p. ej., SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), o papilomavirus tales como HPV o BPV) para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, no se necesita un origen de replicación de mamífero para los vectores de expresión en mamíferos (p. ej., el origen de SV40 es utilizado a menudo sólo porque contiene el promotor temprano).

Los vectores de expresión y clonación de la presente invención contendrán típicamente un promotor que es reconocido por el organismo anfitrión y está conectado operablemente a un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo. Los promotores son secuencias no transcritas situadas aguas arriba (es decir, 5') con respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician el aumento de los niveles de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otra parte, inician la producción continua del producto génico; esto es, existe poco o ningún control experimental sobre la expresión génica. Se conoce un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células anfitrionas potenciales. Un promotor adecuado está conectado operablemente al ADN que codifica el anticuerpo anti-Dkk-1 mediante la eliminación del promotor del ARN de origen mediante digestión con enzimas de restricción o amplificando el promotor por medio de la reacción en cadena de la polimerasa e insertando la secuencia promotora deseada en el vector.

Los promotores adecuados para su uso con anfitriones de levadura también son bien conocidos en la técnica. Los intensificadores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para su uso con células anfitrionas de mamífero son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos de genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y lo más preferiblemente virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamíferos adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de la actina.

Los promotores concretos útiles en la práctica de los vectores de expresión recombinantes de la invención incluyen, pero no se limitan a: la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-10); el promotor de CMV; el promotor contenido en la repetición terminal 3' larga del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al, 1980, Cell, 22:. 787-97); el promotor de la timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Ciencia. U.S.A. 78: 1444-1445); las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al, 1982, Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-31); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25). También se encuentran disponibles para su uso las siguientes regiones de control transcripcional animales, que presentan especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de la elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al, 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515), La región de control del gen de la insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); la región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al, 1986, Cell 45:. 485-95); la región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel. 1: 268-76); la región de control del gen de alfa-feto-proteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235: 53-58); la región de control del gen de la alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-71); la región de control del gen de la beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al, 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al, 1986, Cell 46: 89-94); la región de control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al, 1987, Cell, 48:. 703-12); la región de control del gen de la cadena-2 ligera de la miosina que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature

314: 283-86); la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Mason et al, 1986, Science 234: 1372-78); y muy concretamente la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al, 1984, Cell, 38: 647-58; Adames et al, 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444).

Se puede insertar una secuencia intensificadora en el vector para aumentar la transcripción en eucariotas superiores de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo de la presente invención. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre los promotores para aumentar la transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y la posición. Se han encontrado 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen numerosas secuencias intensificadoras disponibles de genes de mamífero (p. ej., globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). También se puede utilizar una secuencia intensificadora de un virus. El intensificador de SV40, el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma, y los intensificadores de adenovirus son elementos intensificadores ilustrativos para la activación de promotores eucarióticos. Si bien un intensificador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a una molécula de ácido nucleico, éste se coloca típicamente en un sitio 5' con respecto al promotor.

En los vectores de expresión, una secuencia de terminación de la transcripción se localiza típicamente 3' del extremo de una región codificante del polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Una secuencia de terminación de la transcripción utilizada para la expresión en células procarióticas es típicamente un fragmento rico en GC seguido de una secuencia poli-T. Si bien la secuencia es clonada fácilmente a partir de una genoteca o incluso adquirida comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos para la síntesis de ácido nucleico tales como los descritos en la presente memoria.

Un elemento de un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula anfitriona desarrollada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos utilizados en los vectores de expresión que codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células anfitrionas procarióticas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos. Los ejemplos de los marcadores seleccionables incluyen el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. También se puede utilizar un gen de resistencia a neomicina bacteriano para la selección tanto en células anfitrionas procarióticas como eucarióticas.

Se pueden utilizar otros genes de selección para amplificar el gen que será expresado. La amplificación es un proceso por medio del cual los genes que no pueden ser expresados en una única copia a niveles suficientemente elevados como para permitir la supervivencia y el crecimiento de las células en condiciones de selección determinadas se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de los marcadores seleccionables amplificables adecuados para las células de mamífero incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina quinasa sin promotor. En el uso de estos marcadores los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección en donde solo los transformantes están adaptados excepcionalmente para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se incrementa sucesivamente, permitiendo de esta manera la supervivencia de solamente aquellas células en las que se ha amplificado el gen de selección. Bajo estas circunstancias, el ADN adyacente al gen de selección, tal como el ADN que codifica un anticuerpo de la invención, es co-amplificado con el gen de selección. Como resultado, se sintetizan cantidades crecientes de un polipéptido anti-Dkk-1 a partir del ADN amplificado.

Normalmente es necesario un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción del ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento está situado típicamente 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia codificante del polipéptido que se va a expresar.

En algunos casos, por ejemplo cuando se desea la glicosilación en un sistema de expresión de una célula anfitriona eucariótica, se pueden manipular diversas presecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal concreto, o añadir pro-secuencias, que también pueden afectar a la glicosilación. El producto proteico final puede tener, en la posición -1 (con respecto al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales que inciden en la expresión, que pueden no haber sido totalmente eliminado. Por ejemplo, el producto proteico final puede tener uno o dos residuos de aminoácidos encontrados en el sitio de escisión de la peptidasa, anclados al extremo amino. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escisión de enzimas puede dar como resultado una forma ligeramente truncada todavía activa del polipéptido deseado, si la enzima corta en dicha zona dentro del polipéptido maduro.

Cuando un vector de expresión disponible en el mercado carece de algunas de las secuencias flanqueantes deseadas como descritas anteriormente, el vector puede ser modificado ligando individualmente estas secuencias en el vector. Después de haber seleccionado y modificado el vector según se desee, se inserta una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo en el sitio apropiado del vector.

El vector completado que contiene secuencias que codifican el anticuerpo de la invención o el fragmento inmunológicamente funcional del mismo se inserta en una célula anfitriona adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo en una célula anfitriona seleccionada puede lograrse mediante métodos bien conocidos que incluyen métodos tales como transfección, infección, cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, método de DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado estará en parte en función del tipo de célula anfitriona que se vaya a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica.

La célula anfitriona transformada, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza un anticuerpo anti-Dkk-1

o un fragmento funcional del mismo que se puede recoger con posterioridad del medio de cultivo (si la célula anfitriona lo secreta al medio) o directamente de la célula anfitriona que lo produce (si no es secretado). La selección de una célula anfitriona apropiada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones polipeptídicas que son deseables o necesarias para la actividad (tales como la glicosilación o la fosforilación) y la facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como anfitriones para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de cría hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), y un otras diversas líneas celulares. En ciertas realizaciones, la mejor línea celular para expresar un constructo de ADN concreto se puede seleccionar sometiendo a ensayo diferentes líneas celulares para determinar cuáles tienen los niveles más altos de los niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión a Dkk-1 constitutivas.

VI.

Composiciones farmacéuticas

A.

Ejemplos de formulaciones

En ciertas realizaciones, la invención también proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos anti-Dkk1 sujeto o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos junto con uno o más de los siguientes: un diluyente farmacéuticamente aceptable; un portador; un solubilizante; un emulsionante; un conservante; y/o un coadyuvante. Tales composiciones pueden contener una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo. De este modo, también se incluye el uso de anticuerpos y fragmentos inmunológicamente activos que se proporcionan en la presente memoria en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento. Tales composiciones se pueden utilizar en el tratamiento de una variedad de enfermedades tales como las enumeradas a continuación en la sección de utilidades ilustrativas.

Los componentes de formulación aceptables para las preparaciones farmacéuticas son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Además de los anticuerpos y de los fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan, las composiciones de acuerdo con la invención pueden contener componentes para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. Los materiales adecuados para la formulación de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina); antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como acetato, borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes volumétricos (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcares (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes para mejorar la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes mejoradores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehículos de liberación; diluyentes; excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticos. (Véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, (AR Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company), incorporada a la presente como referencia.

El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica pueden ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Los vehículos o portadores adecuados para tales composiciones incluyen agua para inyectables, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente con un suplemento de otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ilustrativos adicionales. Las composiciones que comprenden anticuerpos antiDkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden preparar para su almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Adicionalmente, los anticuerpos anti-Dkk-1 o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden formular en forma de productos liofilizados utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Los componentes de la formulación están presentes a concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Los tampones se usan ventajosamente para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,5, o alternativamente, entre aproximadamente 5,0 y 8,0. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender tampón TRIS de aproximadamente pH 6,5 a 8,5, o tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.

Una composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos mezclados con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las disoluciones se pueden preparar en una forma de dosificación unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, materiales inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.

Las composiciones farmacéuticas adicionales están en la forma de formulaciones de liberación sostenida o controlada. Se pueden utilizar técnicas para formular una variedad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables o cuentas porosas e inyecciones de depósito (véase, por ejemplo, el documento PCT/US93/00829, que describe la administración controlada de micropartículas poliméricas porosas para la liberación de composiciones farmacéuticas). Las preparaciones de administración sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas, poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.773.919 y Patente Europea EP 058.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al, 1983, Biopolymers 22:. 547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al, 1981, J Biomed Mater Res 15: 167-277) y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., ídem.) o ácido poli-D(-)-3hidroxibutírico (Patente Europea EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar mediante cualquiera de diversos métodos conocidos en la técnica. Véanse p. ej., Eppstein et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692; Patente Europea EP 036.676; Patente Europea EP

088.046 y Patente Europea EP 143.949.

La composición farmacéutica que se va a utilizar para la administración in vivo es típicamente estéril. La esterilización puede conseguirse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Si la composición está liofilizada, la esterilización puede llevarse a cabo ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. En ciertas realizaciones, las composiciones parenterales se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa para solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por medio de una aguja de inyección hipodérmica, o una jeringa precargada estéril lista para usar para la inyección.

Una vez que la composición farmacéutica de la invención ha sido formulada, ésta se puede almacenar en viales estériles en forma de disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o en forma de un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para su uso o en una forma (p. ej., liofilizada) que se reconstituye antes de la administración.

Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de gran pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente nocivos (p. ej., al menos de grado alimentario (NF), generalmente al menos de grado analítico, y más típicamente al menos de grado farmacéutico). Por otra parte, las composiciones destinadas al uso in vivo son habitualmente estériles. En la medida en que un compuesto dado debe ser sintetizado antes de su uso, el producto resultante está típicamente sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueda estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para la administración parental son también estériles, sustancialmente isotónicas y elaboradas en condiciones GMP.

La presente invención proporciona kits para la producción de unidades de administración de múltiples dosis o de una sola dosis. Por ejemplo, los kits de acuerdo con la invención pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene un diluyente acuoso, incluyendo por ejemplo jeringas precargadas de una sola y múltiples cámaras (p. ej., jeringas de líquido, liojeringas o jeringas sin aguja).

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden liberar por vía parenteral, típicamente mediante inyección. Las inyecciones pueden ser intraoculares, intraperitoneales, intraportales, intramusculares, intravenosas, intratecales, intracerebrales (intraparenquimales), intracerebroventriculares, intraarteriales, intralesionales, perilesionales o subcutáneas. Se pueden utilizar gotas oculares para la administración intraocular. En algunos casos, las inyecciones se pueden localizar en las proximidades de uno hueso o varios huesos concretos a los que se dirige el tratamiento. Para la administración parenteral, los anticuerpos se pueden administrar en una disolución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos que comprende los anticuerpos anti-Dkk-1 deseados o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es el agua destilada estéril en la que se formulan los anticuerpos anti-Dkk-1 o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos en forma de una disolución isotónica, estéril, apropiadamente conservada.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las anticuerpos anti-Dkk-1 sujeto y los fragmentos funcionales de los mismos se pueden administrar mediante inyección en embolada o mediante infusión continua, mediante dispositivos de implantación, sistemas de liberación sostenida u otros medios para lograr una liberación prolongada. La composición farmacéutica también se puede administrar localmente a través de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u órgano adecuado, y la liberación de la molécula deseada puede ser mediante difusión, embolada de liberación temporizada, o de liberación continua. La preparación se puede formular con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, o ácido copoli(láctico/glicólico) (PLGA), cuentas o liposomas, que pueden proporcionar una liberación controlada o sostenida del producto que puede ser administrado a continuación a través de una inyección de depósito. La formulación con ácido hialurónico tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación.

Las composiciones sujeto que comprenden un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento funcional del mismo se pueden formular para su inhalación. En estas realizaciones, se formula un anti-anticuerpo Dkk-1 en forma de un polvo seco para su inhalación, o también se pueden formular disoluciones de inhalación de anticuerpo anti-Dkk-1 con un propelente para la administración en aerosol, por ejemplo mediante nebulización. Adicionalmente se describe la administración pulmonar en el documento PGT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente, y que se incorpora a la presente como referencia.

Ciertas composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas a través del tracto digestivo, por ejemplo por vía oral. Los anticuerpos anti-Dkk-1 sujeto o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que se administran de esta manera se pueden formular con o sin los portadores utilizados habitualmente en la composición de las formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación pre-sistémica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción del anticuerpo anti-Dkk-1 o fragmento funcional del mismo. Para la administración oral, se pueden utilizar aminoácidos modificados para conferir resistencia a las enzimas digestivas. También se pueden emplear diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos, y aglutinantes.

Las composiciones sujeto que comprenden los anticuerpos anti-Dkk-1 o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos también se pueden usar ex vivo. En tales casos, células, tejidos u órganos que han sido retirados del paciente son expuestos a o se cultivan con el anticuerpo anti-Dkk-1. Las células cultivadas se pueden volver a implantar a continuación en el paciente o en un paciente diferente o se pueden utilizar para otros fines.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-Dkk-1 o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden administrar implantando ciertas células que se han modificado genéticamente, usando métodos tales como los descritos en la presente memoria, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogénicas, o pueden ser inmortalizadas. Con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente recintos o membranas poliméricos semipermeables, biocompatibles que permiten la liberación del producto o los productos proteicos pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

B. Dosis

Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Una "cantidad eficaz" hace referencia generalmente a una cantidad que es una cantidad suficiente, pero no tóxica, de ingrediente activo (es decir, un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo) para lograr el efecto deseado, que es una reducción o eliminación de la gravedad y/o frecuencia de los síntomas y/o una mejora o remedio del daño. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad que es suficiente para remediar un estado de enfermedad o sus síntomas, o prevenir, impedir, retrasar o revertir de otro modo el progreso de una enfermedad o cualquier otro síntoma no deseable. Una "cantidad profilácticamente eficaz" hace referencia a una cantidad que es eficaz para prevenir, impedir o retardar la aparición de un estado de enfermedad o sus síntomas.

En general, la toxicidad y la eficacia terapéutica del anticuerpo o fragmento se pueden determinar de acuerdo con procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares y/o animales experimentales, incluyendo, por ejemplo, la determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la razón DL50/DE50. Se prefieren las composiciones que exhiben índices terapéuticos grandes.

Los datos obtenidos a partir de los estudios de cultivo celulares y/o en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificaciones para los seres humanos. La dosificación del ingrediente activo se encuentra típicamente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.

La cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que se va a emplear terapéuticamente o profilácticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y de los objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento, de acuerdo con determinadas realizaciones, variará de ese modo dependiendo, en parte, de la molécula liberada, la indicación para la que se esté utilizando el anticuerpo antiDkk-1, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o el estado (la edad y salud general) del paciente. Un médico clínico puede valorar la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Las dosificaciones típicas oscilan desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En ciertas realizaciones, la dosificación puede oscilar de 0,1 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg; o de 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo anti-Dkk-1 o el fragmento inmunológicamente funcional del mismo en la formulación. Por ejemplo, un médico clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. La composición se puede administrar por lo tanto como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o un catéter. El tratamiento puede ser continuo o intermitente a lo largo del tiempo. La mejora adicional de la dosificación apropiada es realizada de forma rutinaria por los expertos normales en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por los mismos. Las dosificaciones apropiadas se pueden lograr mediante el uso de datos de dosis-respuesta apropiados.

Para tratar un trastorno médico caracterizado por una expresión anormal o exceso de Dkk-1, se puede administrar al paciente una composición que comprende los anticuerpos anti-Dkk-1 sujeto o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida en al menos un indicador que refleje la gravedad del trastorno. Una mejora se considera "sostenida" si el paciente presenta la mejoría en al menos dos ocasiones separadas por al menos uno a siete días, o en algunos casos una a seis semanas. El intervalo apropiado dependerá en cierta medida de qué afección se esté tratando; está dentro del alcance del médico experto determinar el intervalo apropiado para determinar si la mejora es sostenida. El grado de mejora se determina basándose en signos o síntomas, y también se pueden emplear cuestionarios que están dirigidos al paciente, tales como cuestionarios de calidad de vida.

Los diferentes indicadores que reflejan el grado de la enfermedad del paciente se pueden evaluar para determinar si la cantidad y el tiempo del tratamiento son suficientes. El valor en el período inicial para el indicador o los indicadores seleccionados se establece mediante el examen del paciente antes de la administración de la primera dosis de anticuerpo. Preferiblemente, el examen en el período inicial se realiza dentro de aproximadamente 60 días de la administración de la primera dosis. Si el anticuerpo se está administrando para tratar síntomas agudos, tal como por ejemplo, para tratar un hueso roto, la primera dosis se administra tan pronto como sea posible prácticamente después de que se haya producido la lesión.

La mejora se induce mediante la administración de los anticuerpos anti-Dkk-1 sujeto o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos hasta que el paciente manifiesta una mejora sobre el período inicial para el indicador o los indicadores escogidos. En el tratamiento de las afecciones crónicas, este grado de mejora se obtiene mediante la administración repetida de este medicamento durante un período de al menos un mes o más, p. ej., durante uno, dos, o tres meses o más, o indefinidamente. A menudo es suficiente un período de una a seis semanas, o incluso una sola dosis, para el tratamiento de las condiciones agudas. Para las lesiones o afecciones agudas, puede ser suficiente una sola dosis.

Aunque el grado de la enfermedad del paciente después del tratamiento puede parecer mejorado de acuerdo con uno o más indicadores, el tratamiento debe continuar indefinidamente al mismo nivel o a una dosis o frecuencia reducidas. Una vez que el tratamiento se ha reducido o interrumpido, se puede reanudar más tarde al nivel original si reaparecieran los síntomas.

VII.

Utilidades ilustrativas para los anticuerpos anti-Dkk-1

A.

Detección y Escrutinio

Los anticuerpos anti-Dkk-1 sujeto y los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden utilizar para detectar Dkk-1 en muestras biológicas. Tales usos permiten la identificación de células o tejidos que producen la proteína o sirven como diagnóstico para la detección de afecciones patológicas en las que Dkk-1 se produce en exceso o se produce de manera insuficiente.

Los anticuerpos y fragmentos que son proporcionados también se pueden usar en métodos para detectar una molécula que se une a Dkk-1. Se puede utilizar, por ejemplo una variedad de métodos de escrutinio competitivos. En algunos métodos, se ponen en contacto una molécula de Dkk-1 o un fragmento de la misma al cual se une un anticuerpo anti-Dkk-1, con un anticuerpo o fragmento descritos en la presente memoria junto con otra molécula (es decir, una molécula candidato). Una reducción en la unión entre el anticuerpo o fragmento y Dkk-1 es una indicación de que la molécula se une a Dkk-1. La unión del anticuerpo o fragmento se puede detectar utilizando una variedad de métodos, por ejemplo, un ELISA. La detección de la unión entre el anticuerpo anti-Dkk-1 o el fragmento a Dkk-1 se puede simplificar marcando de forma detectable el anticuerpo. En algunos métodos, se analiza adicionalmente una molécula que exhibe unión en el escrutinio inicial para determinar si ésta inhibe una actividad de Dkk-1 (p. ej., si la molécula activa de señalización de Wnt).

B. Tratamiento de trastornos óseos relacionados

En otros aspectos, algunos de los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan se pueden utilizar para tratar pacientes con una variedad de enfermedades diferentes que incluyen, por ejemplo, enfermedades que son sensibles a la inhibición de la actividad de Dkk-1. Estos anticuerpos y fragmentos también se pueden utilizar para tratar enfermedades que son sensibles a la inducción de la señalización de Wnt. El término "paciente", según se utiliza en la presente memoria incluye sujetos humanos y animales a menos que se indique lo contrario. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, una variedad de enfermedades que implican un trastorno óseo incluyendo afecciones de baja masa ósea, pérdida ósea sistémica, supresión de la formación de hueso y erosiones óseas. Algunos de los anticuerpos y fragmentos también se pueden utilizar en la reparación ósea.

Algunos de los anticuerpos o fragmentos tienen uso terapéutico en la estimulación de la actividad de los osteoblastos y el aumento de la densidad mineral ósea o de la masa ósea. Estos anticuerpos y fragmentos son por tanto útiles para el tratamiento de pacientes que sufren de diversos trastornos médicos que implican pérdida ósea excesiva o pacientes que requieren la formación de hueso nuevo, aun cuando puede no haber necesariamente una actividad excesiva de los osteoclastos. El bloqueo de la actividad de Dkk-1 da lugar a la activación de los osteoblastos a través de la señalización transmitida por las proteínas Wnt. La actividad excesiva de los osteoclastos está asociada con numerosos trastornos osteopénicos que se pueden tratar con los anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales que se proporcionan, incluyendo ostopenia, osteoporosis, periodontitis, enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a inmovilización, metástasis óseas líticas y artritis, incluyendo artritis reumatoide, artritis soriásica, espondilitis anquilosante y otras afecciones que implican la erosión ósea.

También se pueden tratar otras diferentes afecciones de baja masa ósea incluyendo una variedad de formas de osteoporosis, incluyendo, pero sin limitarse a, osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida después del trasplante, osteoporosis asociada con quimioterapia (es decir, osteoporosis inducida por quimioterapia), osteoporosis inducida por inmovilización, la osteoporosis debida a descarga mecánica, y osteoporosis asociada con el uso anticonvulsivos. Las enfermedades óseas adicionales que se pueden tratar con algunos anticuerpos o fragmentos incluyen la enfermedad ósea asociada con insuficiencia renal y enfermedades óseas nutricionales, gastrointestinales y/o hepáticas asociadas.

También se pueden tratar diferentes formas de artritis, incluyendo los ejemplos osteoartritis y artritis reumatoide. Los anticuerpos y fragmentos también se pueden utilizar para tratar la pérdida ósea sistémica asociada con la artritis (p. ej., artritis reumatoide). En el tratamiento de la artritis, los pacientes pueden beneficiarse mediante inyecciones intralesionales o perilesionales de los presentes anticuerpos o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, el anticuerpo

o fragmento del mismo se pueden inyectar adyacentes a o directamente en una articulación inflamada, estimulando de este modo la reparación de hueso dañado en el sitio.

Se sabe que algunos tipos de cáncer aumentan la actividad de los osteoclastos e inducen la resorción ósea, tales como el cáncer de mama y de próstata. El mieloma múltiple, que se origina en la médula ósea, también se asocia con la pérdida de hueso, en parte, debido probablemente al aumento de la expresión de Dkk-1 por las células plasmáticas, que a su vez suprime la actividad de formación de hueso de los osteoblastos en las proximidades. La reducción de la actividad Dkk-1 por medio de la administración de anticuerpos sujeto o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos puede dar como resultado un aumento de la actividad de los osteoblastos que sirve para contrarrestar el exceso de actividad de los osteoclastos, reduciendo de ese modo la gravedad de los trastornos mencionados anteriormente, reduciendo la erosión ósea e induciendo la formación de hueso nuevo en el paciente. El tratamiento con algunos de los anticuerpos específicos anti-Dkk-1 o fragmentos inmunológicamente funcionales puede inducir un aumento significativo en la densidad mineral ósea en un paciente que padece un trastorno osteopénico.

La inhibición de Dkk-1 con los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales descritos en la presente memoria también se puede utilizado en diversas aplicaciones de reparación ósea. Por ejemplo, ciertos anticuerpos y fragmentos pueden ser útiles para retrasar la osteolisis inducida por restos de desgaste asociada con articulaciones artificiales, la aceleración de la reparación de fracturas óseas, y la mejora de la incorporación de injertos de hueso en el hueso vivo circundante en el que se han injertado.

Los anticuerpos anti-Dkk-1 o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden administrar solos o combinados con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, combinados con agentes para la terapia de cáncer, con agentes que inhiben la actividad de los osteoclastos o con otros agentes que potencian la actividad de los osteoblastos. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden administrar a pacientes de cáncer sometidos a terapia de radiación o quimioterapia. Las quimioterapias utilizadas combinadas con los anticuerpos de la invención pueden incluir antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, oxaloplatino, Velcade® (ácido [(1R)-3metil-1-[[(2S)-1-oxo-3-fenil-2-[(pirazinilcarbonil)amino]propil]amino]butil]-borónico) y/u otros fármacos de molécula pequeña que se utilizan en el tratamiento del cáncer. Los pacientes con cáncer de mama se beneficiarán de la administración de un inhibidor de la aromatasa simultáneamente a los tratamientos combinados que comprenden un agente quimioterapéutico y un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo.

Los anticuerpos anti-Dkk-1 y los fragmentos de inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden utilizar solos para el tratamiento de las afecciones referidas anteriormente que producen pérdida de masa ósea o combinados con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente promotor del crecimiento óseo (anabólico) o un agente anti-resorción ósea incluyendo, pero no limitado a: factores morfogénicos óseos denominados BMP-1 a BMP-12; factor de crecimiento transformante β y miembros de la familia de TGF-β; factores de crecimiento de fibroblastos FGF-1 a FGF-10; inhibidores de interleucina-1 (incluyendo IL-1ra, anticuerpos para IL-1 y anticuerpos para receptores de IL-1); inhibidores de TNFα (incluyendo etanercept, adalibumab y infliximab); inhibidores del ligando RANK (incluyendo RANK soluble, osteoprotegerina y anticuerpos antagónicos que se unen específicamente a RANK o ligando de RANK); hormona paratiroidea, prostaglandinas de la serie E, bisfosfonatos y minerales que mejoran el hueso tales como fluoruro y calcio. Los agentes anabólicos que se pueden utilizar combinados con los anticuerpos de la invención y los fragmentos funcionales de los mismos incluyen la hormona paratiroidea y el factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF), en donde el último agente se compleja preferiblemente con una proteína de unión a IGF. Un antagonista del receptor de IL-1 adecuado para tal tratamiento combinado se describe en el documento WO89/11540 y un receptor de TNF de tipo 1 soluble adecuado se describe en el documento WO98/01555. Los antagonistas ilustrativos del ligando RANK se describen, por ejemplo, en el documento WO 03/086289, el documento WO 03/002713, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.740.511 y 6.479.635. Todas las patentes y solicitudes de patente mencionadas anteriormente se incorporan a la presente como referencia).

Además, los anticuerpos anti-Dkk-1 se pueden administrar a pacientes combinados con anticuerpos que se unen a células tumorales e inducen un efecto citotóxico y/o citostático sobre el crecimiento tumoral. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a las proteínas de la superficie celular Her2, CDC20, CDC33, glicoproteína de tipo mucina y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) presentes en las células tumorales e inducen un efecto citostático y/o citotóxico sobre las células tumorales que presentan estas proteínas. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen HERCEPTIN® para el tratamiento de cáncer de mama y RITUXAN® para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, y también incluyen fármacos basados en anticuerpos tales como ERBITUX® y Avastin®. Asimismo, la terapia combinada puede incluir como agentes de terapia del cáncer polipéptidos que inducen selectivamente la apoptosis en las células tumorales, tales como el polipéptido relacionado con TNF TRAIL.

Los anticuerpos sujeto o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden administrar concurrentemente con otros tratamientos y agentes terapéuticos que se administran para la misma afección. "Administración concurrente", según se utiliza en la presente memoria, incluye los tratamientos que se administran simultáneamente o sucesivamente. Los anticuerpos anti-Dkk-1 o los fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos se pueden administrar profilácticamente para evitar o mitigar el comienzo de la pérdida de masa ósea por el cáncer en fase temprana (fases I o II), o se pueden administrar para aliviar una afección existente de pérdida de masa ósea debida a metástasis en el hueso.

Los anticuerpos anti-Dkk-1 de la invención se pueden utilizar para evitar y/o tratar el crecimiento de células tumorales en el hueso. El cáncer que produce metástasis en el hueso se puede extender fácilmente ya que las células tumorales estimulan la resorción de la matriz ósea interna por los osteoclastos. El tratamiento con un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo ayudará a mantener la densidad mineral ósea en el sitio de tales metástasis mediante la estimulación del aumento de actividad de los osteoblastos. Cualquier tipo de cáncer que tenga potencial de producir metástasis en el hueso puede ser evitado o tratado con un anticuerpo anti-Dkk-1 administrado antes o después de que se haya producido la metástasis.

El mieloma múltiple es un ejemplo de un tipo de cáncer que puede prevenirse y/o tratarse con un anticuerpo antiDkk-1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Los pacientes afectados presentan típicamente una pérdida de masa ósea debida a un aumento de la activación de los osteoclastos en regiones localizadas del hueso. Las células de mieloma producen directa o indirectamente ligando RANK, una proteína que activa los osteoclastos que da como resultado la lisis del hueso que rodea las células del mieloma incrustadas en los espacios de la médula ósea. Los osteoclastos normales adyacentes a la célula de mieloma producen a su vez IL-6, lo que conduce al crecimiento y proliferación de células de mieloma. Además las células de mieloma múltiple producen Dkk-1 inhibiendo de ese modo la actividad de los osteoblastos y fomentando adicionalmente la actividad de resorción ósea en esta enfermedad. El tratamiento de un animal con un anticuerpo anti-Dkk-1 o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo instigará la actividad de los osteoblastos, produciendo de ese modo un aumento de la masa ósea en el sitio de los tumores. Tal tratamiento puede dar como resultado la reducción de dolor óseo, y puede bloquear metástasis adicionales en el hueso mediante la prevención de la actividad de resorción que libera los nutrientes óseos utilizados por las células tumorales. En el tratamiento de esta enfermedad, el anticuerpo anti-Dkk-1

o el fragmento inmunológicamente funcional del mismo se pueden administrar concurrentemente con anticuerpos antagónicos dirigidos contra el ligando de RANK o anticuerpos contra IL-6.

VIII. Kits

También se proporcionan kits que incluyen un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional o una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria. Algunos kits incluyen tal anticuerpo, fragmento

o composición en un recipiente (p. ej., vial o ampolla), y también pueden incluir instrucciones para uso del anticuerpo

o fragmento en las diferentes aplicaciones de detección, escrutinio y terapéuticas descritas anteriormente. El anticuerpo, fragmento o composición pueden estar en diversas formas, incluyendo, por ejemplo, como parte de una disolución o como un sólido (p. ej., polvo liofilizado). Las instrucciones pueden incluir una descripción de cómo preparar (p. ej., disolver o resuspender) el anticuerpo o fragmento en un fluido apropiado y/o la forma de administrar el anticuerpo o fragmento para el tratamiento de las enfermedades descritas anteriormente (p. ej., trastornos óseos, tales como baja masa ósea, pérdida ósea sistémica, supresión de la formación de hueso y erosiones óseas).

Los kits también pueden incluir otros varios componentes, tales como tampones, sales, iones de metales complejantes y otros agentes descritos anteriormente en la sección de composiciones farmacéuticas. Estos componentes pueden ser incluidos con el anticuerpo o fragmento o pueden estar en recipientes separados. Los kits también pueden incluir otros agentes terapéuticos para la administración con el anticuerpo o fragmento. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes para el tratamiento de cánceres, agentes promotores de hueso y anticuerpos que se unen a las células tumorales, y otros agentes enumerados anteriormente.

Ejemplo 1

Generación de anticuerpos monoclonales para Dkk-1 murina en ratones y ratas

A. Inmunización

Se clonó Dkk-1 murina recombinante que se había utilizado como antígeno a partir de una biblioteca de ADNc de placenta de ratón utilizando secuencias disponibles públicamente (Núm. de Acceso GenBank AF030433.1). La clonación de Dkk-1 humana, que se había utilizado para someter a ensayo la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-Dkk-1 de ratón, fue como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.344.541. Para preparar la Dkk-1 de ratón para su uso como un antígeno, se sembraron botellas rodadoras 850 cm2 con 4-5 x 107 células 293T adherentes (células de riñón de embriones humanos, obtenidas de Cellular and Molecular Technologies) durante la noche en DMEM con FBS al 5%, 1x aminoácidos no esenciales, 1x pen/estrept/glut y 1x piruvato de sodio (DMEM completo, Gibco, Grand Island NY).

Las células se transfectaron el día siguiente. Se diluyeron 675 µl de reactivo de transfección FuGene6 en 6,75 ml de DMEM sin de suero (Roche Diagnostics) y 112,5 µg de ADN pcDNA3.1 (este plásmido expresa Dkk-1 de ratón conjugada con FLAG). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadió la mezcla de ADN a cada botella rodadora (alrededor de 30 botellas en total) y se incubó en una incubadora con CO2 al 5%. Después de 24 horas, se añadieron a cada botella 100 ml de DMEM sin suero que contenía 1x aminoácidos no esenciales, 1x pen/estrept/glut, 1x piruvato de sodio, 1x suplemento de insulina-transferrina-selenio (Invitrogen) y DMSO al 0,5%. El medio se recogió y se sustituyó por medio de nueva aportación cada 48 horas durante 14 días. La Dkk-1 de ratón se purificó a partir del medio de cultivo aclarado reunido.

Los ratones y las ratas se inmunizaron como se describe a continuación mediante inyección con Dkk-1 murina recombinante completa. En algunos experimentos, se inyectó a los ratones (pero no las ratas) muDkk-1 recombinante que se había conjugado antes de la inyección a un péptido PADRE (Epimmune). La conjugación se llevó a cabo haciendo reaccionar la Dkk-1 murina con un exceso molar de 25 veces de 6 maleimideocaproato de Nsuccinimidilo (MICA) (Fluka Núm. 63177) a temperatura ambiente durante 3 horas. La Dkk-1 murina activada con maleimida se separó del MICA no tratado por medio de una columna de 8 mm x 125 mm cargada con Sephadex G

25. Se incubó 1 mg de la Dkk-1 murina activada con maleimida con 0,5 mg de péptido PADRE (AKFVAAWTLKAAAC; SEC ID NO: 13) y 0,5 mg de un segundo péptido PADRE (CAKXVAAWTLKAAA (X = ciclohexil-alanina); SEC ID NO: 14) a temperatura ambiente durante 1 hora y después se sometió a diálisis frente a PBS.

Se inmunizaron ratones Balb/c y ratones C57BL/6 (Jackson Laboratories), así como ratones AGP3 transgénicos (Khare et al, PNAS 97: 3.370-3375, 2000) eligiendo como diana los ganglios linfáticos de drenaje periféricos o el bazo como se describe a continuación. Se inmunizaron ratas Lewis eligiendo como diana solo el bazo.

Para dirigirse a los ganglios linfáticos, se administraron inyecciones 5 veces en 12 puntos por vía subcutánea (6 dorsal, 6 ventral) a lo largo de 10-13 días utilizando una proporción 1:1 de Dkk-1:coadyuvante. El adyuvante utilizado fue o bien mezcla de adyuvante de Freund completo/incompleto (Pierce) o bien RIBI (Corixa). De uno a tres días después de la última inyección, los ganglios linfáticos periféricos de cada ratón inyectado se cosecharon y se fusionaron con células de mieloma SP2/0.Ag14 murinas (Núm. ATCC CRL 1581) utilizando fusión celular dielectroforética, como se describe a continuación. Para las ratas inyectadas, se extirparon los ganglios linfáticos 13 días después de la última inyección de antígeno y los linfocitos se fusionaron con células compañeras de fusión Y3 Ag 1.2.3 (Núm. ATCC CRL 1631), que derivan de rata.

Para dirigirse al bazo, los ratones se inyectaron por vía subcutánea en 2-4 sitios utilizando una proporción 1:1 o bien de muDkk-1:coadyuvante completo de Freund o bien muDkk-1-PADRE:coadyuvante completo de Freud. Se administró una segunda inmunización 2 semanas después utilizando la proporción 1:1 de muDkk:coadyuvante RIBI

o muDkk-PADRE:coadyuvante RIBI en 2 sitios subcutáneos y 1 sitio intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre 10 días después para analizarlas para determinar la respuesta de anticuerpos anti-mDkk-1. Los mejores respondedores se reforzaron mediante inyección intraperitoneal con mDkk-1 en PBS. Cinco días más tarde, los bazos se extrajeron para la preparación de linfocitos que se iban a fusionar con las células de mieloma SP2/0.Ag14 murinas.

B.

Protocolo fusión de linfocitos

Se fusionaron linfocitos aislados de los ganglios linfáticos o el bazo de animales inmunizados con células SP2/0.Ag14 murinas o Y3 Ag 1.2.3 de rata utilizando el siguiente protocolo optimizado.

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de células de bazo o células de ganglios linfáticos periféricos (PLN), y se filtraron a través de un filtro de células de 100 µm en un tubo de 50 ml, utilizando 30-40 ml de medio sin suero. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos para recoger las células. Para lisar los glóbulos rojos (cuando estuvieran presentes), las células se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis RBC (8,3 g/L de cloruro de amonio en Tris/HCl 0,01 M, pH 7,2), y se añadió tampón de lisis adicional hasta un total de 30 ml. Las células se dejaron reposar durante 2-5 minutos, después se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos. Este procedimiento de lisis se repitió si persistió un color rojo en el sedimento. Después de la etapa de lisis, las células se resuspendieron en un medio SF, se retiró una alícuota para el recuento, a continuación, las células se lavaron en un total de 50 ml de medio SF.

Antes de ser utilizadas para la fusión, estas células se sometieron a dos rondas del siguiente procedimiento de "selección". Esta selección se realizó con el fin de seleccionar las células que eran resistentes a estas manipulaciones y se repitió dos veces de la siguiente manera. La selección consistió en someter las células a varias etapas del protocolo de fusión, a saber, centrifugación, incubación en tampón de fusión ECF (Cytopulse Sciences Cytofusion Medium C, Núm. de catálogo CPS-LCM) y exposición a la fase de alineamiento actual del proceso de fusión. Las células de mieloma SP2/0.AG 14 que se habían sometido a esta selección se denominaron células "SP2/0-ECF-F" y las células Y3.AG 1.2.3 habían experimentado esta selección se denominaron células "ECF-Y3-F".

Se llevó a cabo una etapa de enriquecimiento de células B solo para ratones, excepto que no se llevó a cabo cuando se utilizaron ratones AGP3. En resumen, esta etapa consistió en suspender 107 células de bazo o de los ganglios linfáticos en SF, añadir 10 µl de cuentas magnéticas CD 90+ (Miltenyi Biotec Núm. de Cat. 130-049-101) que se habían lavado previamente con medio SF, mezclar suavemente e incubar a 4-12°C durante 15 minutos. A continuación, las células se diluyeron 1:3 con medio y se filtraron a través de un filtro de 40 micras. Se cargaron hasta 2 × 108 células totales (108 células positivas) en una Columna LS+ (Miltenyi Biotec Núm. de Cat 130-042-401) y se recogió el eluyente como la fracción CD 90-.

Antes de llevar a cabo la fusión, las cámaras de fusión se esterilizaron con etanol del 70%, después se secaron al aire en una campana estéril. Si se había realizado el enriquecimiento de células B, se combinaron 1:1 mieloma y células CD 90- y se mezclaron bien en un tubo de 50 ml. Cuando no se había realizado el enriquecimiento de células B, se combinaron mieloma y esplenocitos o PMN en una proporción 1:2,5. Se añadió medio sin suero hasta 40 ml y las células se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces en 25 ml de tampón de fusión isoosmolar (ECF). Las células se resuspendieron en un volumen de ECF para dar una concentración final de 2x106 a 1x107 por ml. Se transfirieron 2 ml de las células suspendidas a la cámara de fusión de 2 ml, y se conectaron los cables. Se aplicaron 60 V de CA durante 30 segundos, seguido de 3 pulsos sucesivos separados 1 segundo de 1500 V de CC durante 30 microsegundos, seguido de 60 V de CA durante 3 segundos. Durante este procedimiento la exposición de las células al tampón de fusión isoosmolar; incluyendo lavados, se mantuvo durante 3 horas o menos. Después de la fusión, siempre se permitió que las células se asentaran sin interrupciones en la cámara de fusión a temperatura ambiente durante 15-45 minutos antes de continuar.

Las células fusionadas se retiraron de la cámara de fusión y se resuspendieron a 1-5x105 células/ml en medio de BD Quantum Yield (Becton Dickinson) que contenía FBS con bajo contenido de IgG al 15% (Gibco), 1x PSG (Gibco), 55 μm de β-mercaptoetanol (Gibco), 1x OPI (Sigma) y factor de clonación Origen al 5% (Igen International). En experimentos que involucraban el compañero de fusión Y3Ag1.2.3, se sustituyó el factor de clonación Origen por 1 ng/ml de IL-6. Los pocillos individuales de placas de cultivo de 96 pocillos (Falcon) se sembraron con 100 μl de las células y se incubaron a 37°C en CO2 al 6,5%. Al día siguiente, se añadieron 100 μl del mismo medio que contenía 1xHAT (Sigma) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 7 días más, después de lo cual el medio se retiró y se reemplazó por 200 μl del mismo medio. El escrutinio de ELISA se realizó después de un total de 10-14 días de incubación.

Todas las fusiones se realizaron en Cytopulse Sciences Cytofusion Medium C Cell (Núm. de Cat. CPS-LCM). La fusión celular con las células de mieloma se llevó a cabo como sigue, utilizando ECM 2001 y Enhancer 400 Pulse Monitor. Las condiciones utilizadas se muestran a continuación en la Tabla 5.

Tabla 5

Condición

Ratón (SP2/0-ECF-F) Rata (Y3-ECF-F)

Alineamiento:

60v, 30 seg 60v, 30 seg

Rotura de la membrana:

1500V, 30μs, 3X 2000V, 30μs, 3X

Pulso post-fusión:

60V, 3 seg 60V, 3 seg

Generalmente, los linfocitos fusionados se congelaron directamente después de la fusión para su posterior análisis. Para la congelación, se sembraron matraces t-150 con híbridos recién fusionados a una densidad de células de mieloma de entre 1-3x105/ml en medio de fusión, a continuación, se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, las células se cosecharon y se congelaron en un FBS al 90% que contenía DMSO al 10%.

Ejemplo 2

Aislamiento de hibridomas que producen anticuerpos neutralizadores contra Dkk-1

Los hibridomas descritos en el Ejemplo 1 se escrutaron en primer lugar utilizando un análisis ELISA. Se prepararon placas para el ELISA mediante la adición de 50 µl de una muDkk-1 recombinante de 1-5 µg/ml en disolución salina tamponada con fosfato (PBS; GIBCO) a cada pocillo de una placa de ELISA de alta unión (COSTAR®) durante 1 hora. A continuación, los pocillos se incubaron durante 1 hora con 200 µl de PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (BSA) y de suero de cabra al 1% (GIBCO) para bloquear la unión no específica de los sobrenadantes de los hibridomas. Las placas se lavaron con PBS, se añadieron 40 µl de sobrenadante de hibridoma a cada pocillo, a continuación, se incubaron las placas durante una hora. Después de otro lavado con PBS, se añadieron 50 µl de una dilución 1:10.000 de anti-muIgG de cabra (específico de Fc) que se había conjugado con HRP (Pierce) o anti-IgG H + L de rata de cabra conjugado con HRP (Zymed) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo en PBS, después de lo cual se añadieron 50 µl de sustrato ABTS (2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico; KPL) por pocillo. Este sustrato produce un producto de color verde soluble en agua tras la reacción con HRP. La densidad óptica se leyó usando un lector de placas Spectramax (Molecular Devices) y los datos se interpretaron utilizando el programa Softmax pro (Molecular Devices). La siguiente Tabla 6 muestra el número de clones positivos para el ELISA obtenidos a partir de cada categoría de animales inmunizados. Todos los hibridomas reactivos con el antígeno se expandieron en cultivo celular para la producción y el ensayo adicional de los anticuerpos.

Tabla 6

Anticuerpo

Antígeno Fuente de linfocitos Animales Positivo para el ELISA Positivo para el análisis de luciferasa

mDkk-1 de ratón

mDkk-1 Ganglios linfáticos periféricos 2 x ratones transgénicos AGP3, 2 x Balb/C 9 3

mDkk-1 de rata

mDkk-1 Ganglios linfáticos periféricos 2 x ratas Lewis 48 7

mDkk-1 de ratón

mDkk-1 conjugada con PADRE Bazo 2 x C57BL/6 78 0

mDkk-1 de ratón

mDkk-1 conjugada con PADRE Ganglios linfáticos periféricos 3 x C57BL/6 593 0

A. Análisis TCF/lef-luciferasa

Se sometieron a ensayo varios cientos de los hibridomas obtenidos como se ha descrito en el Ejemplo 1 utilizando un constructo informador TCF/lef-luciferasa en el que la expresión de luciferasa está bajo el control de Wnt. Cuando las células transfectadas con este constructo se exponen a Wnt biológicamente activa, se induce la actividad luciferasa. La actividad luciferasa inducida por Wnt se puede suprimir mediante la adición de proteína Dkk-1 recombinante a las células que contienen este constructo. Para los presentes experimentos, se añadieron primero tanto Wnt3a como Dkk-1 a las células en cantidades optimizadas para suprimir aproximadamente el 80% de la expresión de la luciferasa dependiente de Wnt. Se espera que la nueva adición de un anticuerpo anti-Dkk-1 a estas mismas células restaure la actividad Wnt, lo que da como resultado de este modo un aumento de la expresión de luciferasa. Los sobrenadantes de los hibridomas se sometieron de este modo a ensayo para determinar si eran capaces de restaurar la expresión de luciferasa en las células transfectadas con el constructo Wnt/luciferasa. La actividad luciferasa se cuantificó como se describe a continuación.

El día cero, se cultivaron en placa células 293T recién tripsinizadas a 2,5x104 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con fibronectina. A continuación las células se co-transfectaron con ADN que codificaba luciferasa de luciérnaga y ADN que codificaba luciferasa de Renilla. El día 1, para cada pocillo, se mezclaron 10 ng de ADN de TCF/lef-luciferasa (TOPflash de Upstate, Núm. 21-170) y 1 ng de ADN de luciferasa de Renilla (pRL-TK; Promega Núm. E2241) en 30 µl de DMEM (menos antibiótico) con 20 µl de reactivo de transfección Polyfect® 1:10 (Qiagen 301107) y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de un complejo Polyfect-ADN. Después de esta incubación, se añadieron 100 µl de medio de crecimiento al complejo. A continuación, se retiró el medio de cultivo de cada pocillo y se añadió al pocillo el complejo en medio de crecimiento. El medio de crecimiento de los pocillos se retiró tres horas más tarde y se reemplazó por medio acondicionado.

Después de tres días, las células se lavaron una vez con PBS, y se añadieron a cada pocillo 40 µl del tampón de lisis pasiva recién elaborado incluido en el kit Dual Luciferase (Promega Núm. PAE1960). El tampón de lisis pasiva también se encuentra disponible por separado de Promega (Núm. E1941). Las placas se sacudieron durante 20 minutos a temperatura ambiente para inducir la lisis. Se utilizaron 10 µl de producto lisado por análisis para llevar a cabo el análisis Dual Luciferase en placas de 96 pocillos de color blanco (VWR 62402-980), utilizando Promega Núm. PAE1960 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilizando Lmax de Molecular Devices (luminómetro con inyectores duales), se registraron las señales luminiscentes de las luciferasas tanto de luciérnaga como de Renilla y se utilizó la proporción de esas señales para determinar la CE50 y para trazar curvas de dosis-respuesta. En primer lugar, el sustrato de la luciferasa de luciérnaga se inyectó en un pocillo con producto lisado celular y se registró la señal luminiscente; a continuación se inyectó el sustrato de luciferasa de Renilla en el mismo pocillo y se registró la segunda señal luminiscente resultante. La Tabla 2 anterior informa sobre los números de hibridomas que indujeron un resultado positivo en este análisis, indicando de ese modo que los anticuerpos monoclonales que producían eran capaces de neutralizar Wnt.

Escrutinio de hibridoma utilizando un análisis de células ST2

Se utilizó la línea celular de estroma ST2 (RIKEN, Cell RCB0224), derivada de la médula ósea de ratón, para el escrutinio adicional de los hibridomas que dieron positivo en el análisis de luciferasa. En respuesta a la señalización Wnt3a, células ST2 se diferencian en osteoblastos que expresan proteína marcadora de osteoblastos fosfatasa alcalina (ALP). La inducción de ALP por Wnt3a en estas células se puede bloquear mediante la adición del inhibidor de Wnt Dkk-1 al medio de cultivo. La expresión de ALP media se puede restaurar en estas condiciones exponiendo las células a un agente capaz de neutralizar la actividad de Dkk-1, tal como un anticuerpo neutralizador anti-Dkk-1. Por consiguiente, los hibridomas se escrutaron para determinar su capacidad para restaurar la actividad de ALP en células ST2 en presencia de Wnt3a.

En la preparación para el análisis, las células ST2 se cultivaron en MEM-α, que contenía suero bovino fetal al 10%, 1 x penicilina/estreptomicina/glutamina y 1 x piruvato de sodio (todos estos reactivos se obtuvieron de GIBCO). Las células se cultivaron en placa a 1 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos con 22 µl de medio de cultivo por pocillo. Las células se incubaron durante la noche durante un máximo de 24 horas a 37°C en una incubadora humidificada con CO2 al 5%.

En el día cero del análisis, se añadieron a cada pocillo 200 ng de Dkk-1 murina o humana recombinante a 20 µl de tampón más 20 µl de medio acondicionado con Wnt3a derivado de una línea celular estable L-Wnt3a murina. El medio condicionado proporcionó una fuente de Wnt3a. Estas cantidades de estos dos reactivos (es decir, Dkk-1 y Wnt3a) se ajustaron entre sí para permitir aproximadamente 10% de todo el intervalo dinámico de la expresión de ALP en estas células. A continuación, cada anticuerpo que se iba a someter a ensayo se tituló en DMEM a intervalos

1:2 para determinar su capacidad para restaurar la actividad de ALP. En el extremo superior del intervalo de prueba, cada pocillo recibió 100 µg de anticuerpo por ml. El anticuerpo policlonal anti-Dkk-1 humana de cabra (R & D Systems, Núm. de Cat: AF1096) sirvió como control positivo. Se utilizó como control negativo cualquier medio acondicionado transfectado de manera simulada o el medio de cultivo ST2 descrito anteriormente. Después de la adición de anticuerpo o medio de control, las placas se incubaron a 37° durante 72 horas.

El día 3, los medios se retiraron y las células se enjuagaron con Tris 0,1 M (pH 7,4). A continuación, se añadieron por pocillo 150 µl de Igepal CA-630 al 0,1% (Sigma: Núm. de Cat. I-3021) en tampón de glicina, después de lo cual las placas se congelaron a -80ºC y después se descongelaron. Una vez descongeladas, se transfirieron 100 µl de cada producto lisado celular a nuevas placas de 96 pocillos que iban a analizar para determinar la ALP. Como sustrato, se añadieron 100 µl de p-nitrofenol fosfato disódico de 4 mg/ml (Sigma: Núm. de Cat. 104-40) en tampón de glicina (glicina 0,1 M, MgCl2 1 mM, pH 10,5) por pocillo a una concentración de sustrato final de 2 mg/ml. Tras la hidrólisis por ALP, este sustrato produce p-nitrofenol, que tiene un color amarillo. Las placas se incubaron a continuación durante 30 minutos a 37C para permitir la hidrólisis del sustrato por ALP. Después de esta incubación, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 50 µl de NaOH 0,5 N por pocillo. Las placas se leyeron a 405410 nM. El análisis de ALP se normalizó utilizando BCA Protein Assay, realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce Núm. de Cat 23223, 23224). La normalización (nmoles PNP /mg de proteína) se llevó a cabo para compensar la variación del número de células encontrada en cada pocillo que podría interferir en la determinación de la inducción de la fosfatasa alcalina real.

Los resultados del análisis de ALP se compararon con los controles positivos y negativos y los resultados se refirieron en la Tabla 7. Los datos de la Tabla 7 indican que del gran número de clones sometidos a ensayo, los dos que expresaban la actividad de neutralización más potente fueron 1F11-2 y 11H10, ambos derivados de rata.

Tabla 7

Fuente de anticuerpos

Dkk-1 de ratón Dkk-1 humana

CE50 (nM)

CE50 (nM)

Monoclonal de Ratón

5H6-1

2068 479

7D6-1

490 1465

7D6-3

770 533

10A7-1

272 1032

10A7-3

276 63

Monoclonal de rata

1F11-1

18,3 33,8

1F11-2

24,0 25,5

4A3

1113 1128

6d8

5908 8852

7H52

2706 481

8D11

604 1567

8D12

1346 537

13F41

190 1027

13F42

2549 2183

11H10

6,1 3,5

Policlonal de Cabra

R & D

57,9 14,1

En resumen, se escrutaron un total de 19.250 hibridomas en el análisis ELISA. De estos, 728 se unieron a Dkk-1 en los análisis de ELISA y 10 fueron positivos en uno o ambos análisis de neutralización (análisis de informador TCR/lef

o análisis de células ST2). Los datos de la Tabla 7 indican que de los clones positivos, el clon 11H10 tuvo la mejor

5 actividad. Por ejemplo, el clon 11H10 tuvo una CE50 de 3,5 nM frente a Dkk-1 humana 8 nm y una CE50 de 6,1 nM frente a Dkk-1 murina 8 nm.

Ejemplo 3

Unión de afinidad de anticuerpos monoclonales contra Dkk-1

Como se observó anteriormente, los hibridomas que mostraban la mejor actividad neutralizadora de Dkk-1 en los

10 análisis basados en células fueron 11H10 y 1F11 derivados de rata (véase el Ejemplo 2). El anticuerpo 11H10 es del isotipo IgG1. Este ejemplo ilustra que estos dos anticuerpos se unen ambos con alta afinidad a Dkk-1 murina, de rata y humana. En consonancia con su mejor actividad neutralizadora, el clon 11H10 también tuvo una afinidad superior por Dkk-1 en estos análisis que 1F11.

Se realizaron análisis cinéticos para estudiar la unión de los anticuerpos 11H10 y 1F11 a Dkk-1 utilizando BiaCore

15 2000 (BIACORE, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron Dkk-1 de rata (260 µg/ml), Dkk-1 murina (690 µg/ml) y Dkk-1 humana (900 µg/ml) sobre la superficie de un chip CM5, y se inyectaron diversas concentraciones (de 0,78 nM a aproximadamente 100 nM ) de los anticuerpos sobre las superficies con Dkk-1 inmovilizadas. Los sensogramas de unión se analizaron utilizando BIAevaluation 3.2. Los datos se resumen en las Tablas 8 y 9 a continuación.

40 Tabla 8. Cinética de unión de 1F11 determinada mediante BiaCore

Dkk-1 de rata

Dkk-1 de ratón Dkk-1 humana

ka (1/Ms)

1,4 x 105 1,2 x 105 1,2 x 105

kd (1/s)

3,1 x 10-4 3,6 x 10-4 3,3 x 10-4

Kd (M)

2,2 x 10-9 2,9 x 10-9 2,8 x 10-9

Tabla 9. Cinética de unión de 11H10 determinado mediante BiaCore

Dkk-1 de rata

Dkk-1 de ratón Dkk-1 humana

ka (1/Ms)

5,4 x 104 5,4 x 104 5,2 x 104

kd (1/s)

1,54 x 10-5 <5 x 10-5 <5 x 10-5

Kd (pM)

290 <100 <100

Resultó evidente a partir de los resultados de BiaCore que 11H10 tenía la mayor afinidad por Dkk-1, y que su afinidad por la diana excedió los límites de sensibilidad del análisis BiaCore. Por consiguiente, se evaluó adicionalmente la afinidad de unión de 11H10 a Dkk-1 mediante un análisis de unión en equilibrio utilizando el KinExA® 3000 más sensible (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para estas mediciones, se recubrieron previamente cuentas Reacti-Gel 6X (Pierce, Rockford, IL) con Dkk-1 de ratón, de rata o humana y se bloquearon con BSA. Se mezclaron 100 pM, 300 pM, o 1000 pM del anticuerpo 11H10 con diversas concentraciones de Dkk-1 humana, de ratón o de rata, con una concentración que oscilaba de 1 pM a 50 nM, y se equilibraron a temperatura ambiente durante 8 horas. A continuación las mezclas se hicieron pasar sobre las cuentas recubiertas con Dkk-1. Se cuantificó la cantidad de anticuerpo anti-Dkk-1 unido a las cuentas utilizando un anticuerpo anti-IgG de rata de cabra marcado con una etiqueta fluorescente (Cy5; Jackson Immuno Research, West Grove, PA). La cantidad de señal fluorescente medida fue proporcional a la concentración de anticuerpo anti-Dkk-1 libre en cada mezcla de reacción en equilibrio. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se obtuvo a partir de la regresión no lineal de las curvas de competición utilizando un modelo de unión homogénea de curva dual de un sitio usando el programa KinExA. Los resultados de los análisis RinExA para 11H10 indicaron que la Kd para la Dkk-1 humana fue de 1,3 x 10-10 M, y para la Dkk-1 de ratón y de rata fue de 1,65 x 10-10 M y 5,4 x 10-10 M, respectivamente.

Los estudios cinéticos de unión se llevaron a cabo con varias combinaciones diferentes de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas (pares idénticos de cada cadena) enumeradas en la Tabla 1 anterior. En general, estos anticuerpos tienen valores de ka entre 104 y 106/Mxsegundos, y unos valores koff (kd) de entre 10-4 y 10-5s-1.

Ejemplo 4

Ensayo in vivo de hibridoma 11H10

Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la neutralización de Dkk-1 en un modelo animal de ratón joven causaría un aumento en la densidad mineral ósea (DMO) y en la osteocalcina en suero, un marcador de formación ósea.

Para estos experimentos, el anticuerpo 11H10 se purificó a partir del medio de células de hibridoma 11H10 cultivadas. El medio de cultivo recogido se concentró 12 veces utilizando un dispositivo de ultrafiltración Pellicon (Amicon) equipado con un casete de pantalla de canal MWCO de 50 kD (Millipore). El medio concentrado se filtró a través de un filtro de poro de 0,2 µm, después se unió a Protein G Sepharose (Pharmacia). Después de lavar la Protein G Sepharose con al menos cuatro volúmenes de PBS, el anticuerpo se hizo eluir con tampón de elución de IgG (Pierce), después, se tamponó a pH neutro mediante la adición de Tris-HCl 1M al 5% v/v. A continuación, el anticuerpo se dializó frente a PBS. El producto dializado se filtró a través de un filtro de 0,2 µm y se sometió a ensayo para determinar la endotoxina con viales de 0,06 UE/ml Pyrotell LAL (Associates of Cape Cod). La concentración de proteína en el anticuerpo purificado se determinó mediante absorbancia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 1,35.

A ratones BDF-1 macho de cuatro semanas de edad (APR 233.757, Charles River) se les inyectó subcutáneamente a lo largo de un periodo de tres semanas una de tres dosis del anticuerpo monoclonal 11H10 purificado (5, 10 ó 20 mg/kg), como se indica en la tabla 10. Se utilizaron cinco ratones por grupo. A los ratones de control negativo se les inyectó vehículo (PBS), y los ratones de control positivo se les inyectó hormona paratiroidea (aminoácidos 1-34), que es conocida por estimular el aumento de densidad ósea en estos ratones (Dempster et al., Endocrine Reviews 14 (6): 690-709 (1993)). Se utilizaron 100 µg/kg de PTH (1-34) en HCl 0,001 N, NaCl 0,15 M, BSA al 2%, pH 8,0 por inyección. Este experimento se repitió una segunda vez exactamente como se muestra en la Tabla 10, pero con un

grupo adicional de ratones de control negativo que recibieron 20 mg de IgG de rata. Además, estos experimentos se han repetido con 11H10 expresado recombinantemente.

Tabla 10

Grupo

Dosis Programa N

Vehículo

1xPBS 3x/semana MWF 5

Control de PTH

PTH B. 5x/semana MF 5

PTH

100 μg/kg 5x/semana MF 5

11-H-10

5 mg/kg 3x/semana MWF 5

11-H-10

10 mg/kg 3x/semana MWF 5

11-H-10

20 mg/kg 3x/semana MWF 5

Se recogió sangre al inicio del estudio (día 0) y los días 3, 5, 7, 14 (retro-orbital), y el día 21 (punción cardíaca terminal) para los análisis de osteocalcina y paneles de química clínica.

Los niveles de osteocalcina en suero se determinaron utilizando un análisis kit de inmunorradiométrico (IRMA) específico para la osteocalcina de ratón (Immunotopics, Inc. San Clemente, CA). Las muestras de suero antes del análisis se equilibraron a temperatura ambiente y todos los análisis se realizaron por duplicado. Los análisis emplearon dos anticuerpos diferentes para osteocalcina de ratón. El primero fue un anticuerpo de cabra policlonal purificado por afinidad que reconoce la región media del extremo C-terminal de la molécula de osteocalcina; este anticuerpo se inmovilizó sobre cuentas de plástico para ser utilizado como reactivo de captura. El otro anticuerpo fue un anticuerpo policlonal purificado por afinidad que reconoce el extremo amino terminal de la molécula de osteocalcina, este anticuerpo se marcó radiactivamente para su uso en la detección de la osteocalcina. Las muestras de suero de ratón se incubaron con una cuenta recubierta de anticuerpo y el anticuerpo marcado con 125I a temperatura ambiente durante 18 a 24 horas para permitir que la osteocalcina se uniera al anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo radiomarcado formara un "sándwich" unido a las cuentas marcadas. Después de la incubación, las cuentas se lavaron dos veces para eliminar el anticuerpo marcado no unido, se contaron en un contador gamma, y las cuentas se corrigieron para el fondo. En estos análisis, la reactividad del complejo de anticuerpo fue directamente proporcional a la cantidad de osteocalcina de ratón en el suero. Las concentraciones de osteocalcina de ratón en las muestras se determinaron directamente a partir de una curva patrón generada a partir de la osteocalcina de control proporcionada para este propósito en el kit.

Al rededor del día 3 y a partir de entonces, todas las dosis de 11H10 habían inducido un aumento de la osteocalcina en comparación con los ratones tratados con vehículo. La magnitud del aumento era dependiente de la dosis. Para las dosis de 10 mg/kg y de 20 mg/kg, la magnitud del aumento fue estadísticamente significativa frente al vehículo el día 5, y para la dosis de 20 mg/kg, se mantuvo estadísticamente significativa el día 7. Para todas las dosis administradas, se observó una inducción de osteocalcina tan pronto como tres días después de que hubiera comenzado el tratamiento con 11H10 y las magnitudes de los aumentos globales observados fueron similares a o mayores que la observada en los animales tratados con PTH.

Para el análisis de la DMO, se tomaron radiografías de ratón completo al final de la primera, segunda y tercera semanas a 56 kVp durante 49 segundos utilizando un sistema de rayos X Faxitron Núm. 43855A (Buffalo Grove, IL) y Película Kodak X-OMAT TL ( Rochester, NY). Las películas de rayos X resultantes se inspeccionaron visualmente para determinar el aumento de densidad ósea en 10 huesos diferentes. No se observaron aumentos en los grupos tratados con vehículo o tampón de PTH. Sin embargo, los grupos tratados con PTH (1-34) o 11H10 mostraron un incremento de la densidad en cinco o más huesos en una semana, y en la mayoría de los diez huesos al final de la semana tres.

Al final del periodo de inyección de tres semanas, se llevó a cabo el análisis DMO pQCT en la metáfisis proximal de la tibia y se midió para determinar la densidad total, trabecular y cortical. La DMO total medida mediante pQTC mostró una respuesta positiva a la dosis más alta de 11H10, en su mayor parte debida a un aumento de la DMO trabecular. La Tabla 11 presenta las mediciones de la DMO obtenidas en uno de los dos experimentos que se habían llevado a cabo. Se obtuvieron resultados similares en ambos experimentos. Los números de la Tabla 11 representan el porcentaje de cambio en comparación con el control de vehículo. Los asteriscos de la Tabla 11 indican que hubo una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo con 11H10 y el grupo de control (ANOVA p <0.05). En general, la cantidad de aumento de DMO inducida por 11H10 fue comparable a la cantidad de aumento inducida por el control positivo de PTH (1-34).

Tabla 11. Densidad mineral ósea en los ratones tratados con 11H10

% de Cambio en Comparación con Ratones a los que se Había Inyectado Vehículo

Dosis de 11H10

Densidad total (metáfisis tibial proximal) Densidad trabecular (metáfisis tibial proximal) Densidad cortical (metáfisis tibial proximal)

5 mg/kg

4,1 9,8 -0,49

10 mg/kg

10,2 16,8 * 0.59

20 mg/kg

12,2 * 19,5 * 4,3

PTH-(1-34) 100 μg/kg

10,6 16,7 7,9

Control con Tampón PTH

-2,2 2,0 -5,3

Ejemplo 5

Ensayo in vivo de diferentes anticuerpos

Para facilitar aún más la capacidad de neutralizar Dkk1 para aumentar la masa ósea se trataron ratones tanto jóvenes (6 semanas de edad) como viejos (8,5 meses de edad) con 11H10 de rata como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. Los ratones se analizaron para determinar los cambios de DMO mediante pQCT y microCT (μCT). Para μCT, se examinaron arquitectura trabecular y la geometría cortical en los fémures de ratón utilizando un eXplore Locus SP Micro-CT System (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin, USA). Los fémures se colocaron en crio-tubos de 2 ml con un fantasma de densidad ósea, cargados con PBS, y se estabilizaron con una gasa. Los fémures completos se escanearon a rotaciones 0,5° durante 200° (80 kVp, 80 uA) calibrados con el fantasma de densidad y se reconstruyeron para producir imágenes con un tamaño de voxel de 18 x 18 x 18 μm.

Las regiones de interés se analizaron para determinar los parámetros morfométricos y de densidad corticales y trabeculares (programa GEHC MicroView). El 10% central (en longitud) de la diáfisis del fémur se analizó para determinar los perímetros medios del endostio y el periostio, así como de la zona cortical y la DMO volumétrica (umbral = 640 mg/cc). Las regiones de hueso trabecular del fémur distal se aislaron y se analizaron para determinar la DMO y los parámetros de estereología, incluyendo la fracción volumétrica del hueso (BV/TV), el espesor trabecular (Tb.Th), el número trabecular (Tb.N), y la DMO volumétrica (umbral = 320 mg/cc). Estas regiones se seleccionaron basándose en la longitud del fémur (10% de la longitud) y se situaron próximas a la esponjosa de la placa de crecimiento.

Tanto pQCT como μCT mostraron cambios significativos en la DMO en ratones jóvenes y viejos tratados con 11H10 de rata. Además, μCT permitió demostrar que la actividad neutralizadora de Dkk1 con 11H10 rata conducía a

aumentos significativos en el número trabecular en ratones tanto jóvenes como viejos (Figura 2). La dosis más alta de 11H10 de rata en los ratones viejos dio como resultado en una disminución en el perímetro del endostio, lo que indica que 11H10 de rata también afectaba positivamente al crecimiento del hueso cortical, además del hueso esponjoso.

Para determinar si la neutralización de Dkk1 podía ayudar a restaurar la pérdida de hueso debida a la falta de estrógenos, se trataron ratones oviarectomizados (OVX) con 11H10 de rata (3, 10, 30 mg/kg dos veces por semana mediante inyección subcutánea). En el experimento se trataron ratones CDF-1 de 7 meses de edad, 5 meses después de la OVX, con 11H10 de rata, PTH (100 mg/kg) o vehículo. La DMO se analizó mediante pQCT en el período inicial, el día 7, 14, 21 y 28. Los datos del día 28 se muestran a continuación como el porcentaje de cambio desde el momento inicial para la tibia y las vértebras lumbares (Figura 3).

En un experimento separado, se determinó la eficacia del isotipo h11H10 RT IgG1 y el isotipo h11H10 RT IgG2 (véanse las Tablas 1 y 2 para las secuencias de las cadenas ligeras y pesadas y las regiones variables) en ratones jóvenes utilizando un protocolo similar al descrito anteriormente con la modificación de que se compararon el isotipo h11H10 RT IgG1 y el isotipo h11H10 RT IgG2 con 11H10 de rata y PTH (Figura 4). Los datos indican que estos dos anticuerpos también aumentaron la DMO, según se determinó mediante análisis DEXA, en ratones.

Los resultados de los experimentos descritos anteriormente indican que la neutralización de la actividad de Dkk-1 con algunos de los anticuerpos descritos en la presente memoria tiene un efecto anabólico sobre la formación de hueso.

Ejemplo 6

Caracterización de epítopos de Dkk-1 humana que se unen al anticuerpo 11H10 La Dkk-1 humana contiene dos dominios ricos en disulfuro situados cerca del extremo N y cerca del final del extremo C, referidos aquí como dominios disulfuro N- y C-terminales. El dominio disulfuro N-terminal (referido más adelante "dominio disulfuro 1") contiene 55 residuos de aminoácidos (aminoácidos 85-139 del SEC ID NO: 2) y tiene 10 cisteínas que forman enlaces 5 disulfuro intramoleculares. El dominio disulfuro C-terminal (referido más adelante "dominio disulfuro 2") contiene aproximadamente 75 aminoácidos (aminoácidos 189 a 263 del SEC ID NO: 2) y contiene 10 cisteínas que forman 5 puentes disulfuro intramoleculares, que dan como resultado la formación de siete bucles en la proteína completamente plegada (véase la Figura 1). Se ha propuesto que el dominio disulfuro 2 de Dkk-1 tiene una estructura molecular similar al plegamiento de la colipasa canónica, cuya estructura cristalina ha sido determinada utilizando colipasa porcina (Aravind, A. y Koonin, E.V., Current Biology 8: R477-479 (1998)). Los siete bucles del dominio disulfuro 2 de la Dkk-1 humana consisten de los aminoácidos 190-194, 196-199, 202-209, 211-219, 221-236, 240-244 y 246-262 del SEC ID NO: 2.

El tratamiento con un agente reductor anuló la capacidad de Dkk-1 para unirse a 11H10, lo que indica que el epítopo elegido como diana por este anticuerpo era conformacional y requería el mantenimiento de al menos algunos de los enlaces disulfuro de esta proteína. Para caracterizar este epítopo conformacional, se aplicó una estrategia que implicaba fragmentar Dkk-1 humana con bromuro de cianógeno (CNBr) y varias proteasas diferentes, a continuación, sometiendo a ensayo después los fragmentos resultantes para ver si todavía se podían unir al anticuerpo 11H10. Los datos resultantes permitieron determinar la localización del epítopo. En resumen, se incubaron los productos digeridos del péptido con o sin el anticuerpo, se hicieron pasar a través de una membrana de corte 10 K para atrapar cualquiera de los péptidos que se habían unido al anticuerpo (~ 150.000 Da), después se sometió a mapeo de péptidos mediante HPLC. Una reducción de la altura de un pico de la HPLC en una muestra expuesta a anticuerpo indicó que los péptidos de ese pico se habían unido al anticuerpo y por lo tanto formaban parte del epítopo. Se recogieron los picos de la HPLC individuales y los péptidos se identificaron y mapearon mediante secuenciación N-terminal. Para determinar si los péptidos se podrían unir a 11H10, se sometieron a análisis de interacción bioespecífica en tiempo real con una estación de trabajo BiaCore, utilizando anticuerpo antiDkk-1 atrapado con Proteína A como biosensor para la unión.

Todos los análisis de HPLC para estos estudios se llevaron a cabo utilizando una columna C5 de fase inversa (1 mm

d.i. x 10 cm de longitud). El mapeo del péptidos por HPLC se realizó con un gradiente lineal de ácido trifluoroacético al 0,05% (fase móvil A) a acetonitrilo al 90% en ácido trifluoroacético al 0,05%. Las columnas se desarrollaron durante 70 minutos a una velocidad de flujo de 0,15 ml/min.

Digestión CNBr

La escisión con CNBr de hDkk-1 generó dos fragmentos grandes, CNBr1 y CNBr2. Estos representaron, respectivamente, el dominio disulfuro 2 y el dominio disulfuro 1. CNBr1 consistió en dos péptidos (aminoácidos 179206 del SEC ID NO: 2 y aminoácidos 207 a 266 del SEC ID NO: 2) mantenidos unidos mediante enlaces disulfuro. CNBr2 consistió de un modo similar en dos péptidos (aminoácidos 32-122 del SEC ID NO: 2 y aminoácidos 127 a 178 del SEC ID NO: 2), también mantenidos unidas mediante enlaces disulfuro. Los resultados del análisis BiaCore indicaron que 11H10 era capaz de unirse de manera significativa a CNBr1, pero no se unía en absoluto a CNBr2. De este modo, se concluyó que 11H10 se une a un epítopo localizado en el dominio disulfuro 2 de Dkk-1.

Digestión con tripsina

La Dkk-1 humana se digirió a continuación con tripsina, que escinde después de Arg y Lys. Se incubaron aproximadamente 200 µg de Dkk-1 a 0,5-1,0 mg/ml en PBS (pH 7,2) durante 20 horas a 37°C con 8 µg de una u otra de estas proteasas para lograr una digestión completa de la Dkk-1.

La cromatografía HPLC de los productos digeridos con tripsina produjo múltiples picos. Para determinar cual, si lo hubiera, de los fragmentos trípticos conservaba la capacidad de unirse al anticuerpo, el producto de la digestión se incubó con el anticuerpo 11H10 a una razón molar 1:2 a 0°C durante 2 horas. El anticuerpos y cualquiera de los péptidos unidos a él se capturaron sobre una membrana Microcon (peso molecular de corte 30000). Los péptidos en el flujo directo del filtro Microcon se analizaron mediante HPLC para determinar qué picos se reducían o eliminaban debido a haberse unido al anticuerpo. Los resultados de la HPLC para las muestras expuestas a anticuerpo se compararon con productos digeridos de control que se habían sometido a los mismos procedimientos sin 11H10. Como se comenta más abajo, ninguno de los fragmentos generados mediante la digestión con tripsina conservó la capacidad de unirse 11H10.

El análisis de la secuencia se llevó a cabo para identificar y mapear los péptidos en los picos recuperados de la HPLC después de la digestión con tripsina. Se confirmó que dos picos, Tryp40.5 (tiempo de retención 40,5 minutos) (~ 6-7 kDa) y Tryp45 (~8 kDa), contenían secuencias que mapeaban, respectivamente, el dominio disulfuro 2 y el dominio disulfuro 1. Ni Tryp40.5 ni Tryp45 se unieron a 11H10 cuando se sometieron a ensayo mediante la captura con la membrana Microcon o mediante experimentos de unión BiaCore. Tryp40.5 consistió en siete péptidos pequeños (6 a 12 aminoácidos de longitud) mantenidos juntos por los cinco enlaces de disulfuro de dominio disulfuro

2. Tres segmentos pequeños de la secuencia del dominio disulfuro 2 faltaban de Tryp40.5. Estas secuencias perdidas fueron los aminoácidos 204-208, 223-226 y 247-249 del SEC ID NO: 2). Puesto que Tryp40.5 no se puede unir a 11H10, parece que uno o más de estos tres péptidos perdidos deben formar una parte esencial del epítopo al que se une este anticuerpo.

Digestión con Endo Lys C

La digestión de Dkk-1 humana con Endo LysC (escinde solo después de lys) también generó varios picos cuando se sometió a HPLC como se ha descrito anteriormente. Solo una fracción de HPLC, LysC48.7, mostró una reducción en la altura del pico cuando el producto de digestión se incubó con el anticuerpo antes del análisis mediante HPLC. LysC48.7 consistió en tres fragmentos peptídicos mantenidos juntos por los cinco enlaces disulfuro del dominio disulfuro 2. El análisis de la secuencia indicó que estos tres péptidos consistían en los aminoácidos 183-222, 227249, y 250-266 del SEC ID NO: 2. El análisis de la secuencia reveló que LysC48.7 carecían solo de un segmento del dominio disulfuro 2, a saber, un péptido localizado en los aminoácidos 223-226 del SEC ID NO: 2. De este modo, LysC48.7 estaba estructuralmente más intacto que Tryp40.8, que carecía de los tres segmentos del dominio disulfuro 2.

La capacidad de 11H10 para unir las fracciones LysC se determinó usando el análisis de unión BIAcore. Solo la fracción LysC48.7 mostró alguna actividad de unión. La fracción LysC48.7 mostró una fuerte tasa de asociación de unión al anticuerpo. Sin embargo, la tasa de disociación fue muy rápida disminuyendo rápidamente la unión a los niveles de fondo. Estos datos indican que el epítopo diana para 11H10 no conservará la unión al anticuerpo cuando los aminoácidos 223-226 del SEC ID NO: 2 se recorten del dominio disulfuro 2. Por lo tanto, se concluyó que los residuos 223 a 226 pueden entrar en contacto directo con 11H10 cuando éste se une a Dkk-1 o que estos residuos son esenciales para mantener la estructura tridimensional que permite que el anticuerpo entre en contacto eficazmente otros residuos de aminoácidos en la inmediatas proximidades de los aminoácidos 223-226 de la proteína plegada.

Digestión con ASPN

Para definir con mayor precisión el epítopo de unión a 11H10, se digirió hDkk-1 con la proteasa ASPN y los fragmentos resultantes se analizaron como se ha descrito anteriormente. De los principales picos de la HPLC generados mediante digestión con ASPN, tres se redujeron en altura si el producto digerido se había expuesto previamente a 11H10, lo que indica que estos péptidos se habían unido al anticuerpo. Los picos que se unieron al anticuerpos fueron AspN48.7, AspN49.6 y AspN52. El análisis de secuencia indicó que estos tres picos reactivos con el anticuerpo derivaban del dominio disulfuro 2. AspN48.7 y AspN49.6 tenían una secuencia de aminoácidos idéntica y cada uno de ellos consistía en dos péptidos mantenidos juntos por los cinco enlaces disulfuro en el dominio disulfuro 2. La diferencia en la migración en la HPLC de estos dos picos se debió probablemente a la heterogeneidad de los radicales carbohidrato anclados a Asn256. Estos dos péptidos consistían en los aminoácidos 166 a 231 y 232 a 266 del SEC ID NO: 2. AspN52 contenía solo un único péptido, correspondiente a los aminoácidos 166-266 del SEC ID NO: 2. De este modo, AspN52 es evidentemente un producto de digestión parcial cuya secuencia se solapa en gran medida con AspN48.7 y 49.6, aunque los dos últimos recibieron un recorte adicional entre Leu231 y Glu232 con respecto a AspN52. Este recorte se produce en el bucle que se encuentra entre los aminoácidos 221 y 236 del SEC ID NO: 2. Estos tres picos mostraron una unión significativa a 11H10 en los experimentos de captura Microcon y en el análisis de unión de Biacore. Estos datos indican que la interrupción del enlace peptídico entre los aminoácidos 231 y 232 de hDkk-1 (SEC ID NO: 2) no afecta a la capacidad de 11H10 para reconocer su epítopo diana.

Análisis de los resultados de la digestión

Los resultados anteriores indican que 11H10 se une a un epítopo no lineal de Dkk-1 humana localizado en el dominio disulfuro 2 de la proteína, y que el epítopo reside en los dos bucles grandes formados por enlaces disulfuro Cys220-Cys245, Cys239-Cys263 y Cys200-Cys237 del SEC ID NO: 2 (véase la Figura 1). Como se ilustra en la Figura 1, los dos bucles que forman el epítopo se encuentran entre Cys220 y Cys237 y entre Cys245 y Cys263, comprendiendo el cuerpo de los dos bucles por lo tanto los aminoácidos 221-236 y 246-262 del SEC ID NO: 2. La digestión con tripsina de Dkk-1 abrió los bucles Cys220/Cys237 y Cys245/Cys263 mediante la eliminación de los aminoácidos 223-226 y 247

249. Con estos dos péptidos eliminados, los productos de la digestión con tripsina no se pudieron unir a 11H10. Un tercer péptido (aminoácidos 204-208 del SEC ID NO: 2) también fue suprimido mediante la digestión con tripsina, pero se consideró que se encontraba fuera del epítopo porque las otras proteasas fueron capaces de reducir la unión del anticuerpo sin cortar el bucle en el que residen estos aminoácidos. La digestión con LysC, que redujo drásticamente la unión al anticuerpo, también abrió el bucle Cys220/Cys237 mediante la eliminación de los aminoácidos 223-226 del SEC ID NO: 2 y el bucle Cys245/Cys263 mediante la escisión de un solo enlace peptídico en Lys249 (SEC ID NO: 2). De este modo, los resultados de la digestión con LysC implicaron de nuevo los bucles Cys220/Cys237 y Cys245/Cys263 en la unión a 11H10. La digestión AspN cortó en Glu232 (SEC ID NO: 2) en el bucle Cys220/Cys237 sin reducir la unión del anticuerpo, lo que sugiere que la conservación de la conformación adecuada del epítopo no requería este bucle de estar absolutamente intacta. Sin embargo, este bucle es claramente importante porque, como se muestra arriba, la eliminación de los aminoácidos 223-226 del SEC ID NO: 2 por LysC de este mismo bucle destruyó la unión del anticuerpo.

De acuerdo con estos análisis, el epítopo que se une a 11H10 está localizado en las proximidades de los bucles Cys220/Cys237 y Cys245/Cys263 en el dominio disulfuro 2, por lo tanto, los aminoácidos 220-237 y los aminoácidos 245263 del SEC ID NO: 2 son muy importantes para la unión del anticuerpo. Los bucles formados por los otros enlaces disulfuro de este agrupamiento de disulfuros en el dominio C-terminal no parecían estar implicados en el reconocimiento por este anticuerpo. Los resultados muestran también que los enlaces disulfuro de este dominio deben estar intactos para mantener el epítopo en una configuración que permita la unión del anticuerpo. Dentro del epítopo, las porciones mínimas que parecerían necesarias para conservar la unión incluirían los aminoácidos 221229 del SEC ID NO: 2 (esto deriva del hecho de que la escisión en Glu232 no tuvo ningún efecto sobre la unión) y los aminoácidos 246-253 del SEC ID NO: 2, como consideraciones estructurales indican que Asn256 está conectada a grupos carbohidrato voluminosos que pueden ocultar los otros aminoácidos de este bucle de cara a la unión a 11H10.

Ejemplo 7

El anticuerpo 1F11 compite con 11H10 por la unión a Dkk-1

Se llevaron a cabo experimentos para determinar si el anticuerpo monoclonal 1F11 se podría unir al mismo epítopo en Dkk-1 que 11H10. Este asunto tenía interés debido a que estos anticuerpos monoclonales neutralizan la actividad biológica de Dkk-1. Como se muestra en la Tabla 12 a continuación, 1F11 neutraliza la actividad Dkk-1 de ratón, rata y humana en el análisis TCF-lef, aunque no tan bien como 11H10.

Tabla 12

CE50 (nM)

Anticuerpo (200 ng/ml)

Dkk-1 de ratón Dkk-1 de rata Dkk-1 humana

11H10

11,5 5,0 4,0

1F11

62,6 21,2 19,5

Los experimentos de competición entre 11H10 y 1F11 se llevaron a cabo utilizando BIAcore 2000, como se describió anteriormente. Se utilizaron chips BIAcore sobre los cuales se habían inmovilizado 11H10 o 1F11 para capturar Dkk1 humana. Después de la etapa de captura, se inyectaron 1F11 o 11H10 sobre las superficies de los chips para ver si se podía lograr una unión adicional a Dkk-1. En estos experimentos, ninguno de los anticuerpos inyectado sobre los chips fue capaz de unirse a la Dkk-1 humana capturada, es decir, 11H10 no fue capaz de unirse a Dkk-1 humano que había sido capturada por 1F11, ni 1F11 pudo unirse a Dkk-1 humana que había sido capturada por 11H10. Estos datos indican claramente que estos dos anticuerpos se unen al mismo epítopo en Dkk-1 humana, lo que sugiere que la elección como diana de este epítopo concreto es un método particularmente eficaz para neutralizar la actividad de Dkk-1.

Se llevaron a cabo otros experimentos para determinar si algunos de los otros anticuerpos, que incluían las cadenas pesadas y ligeras que figuran en la Tabla 1 (pares idénticos de cadenas pesadas y ligeras) podían competir por el mismo epítopo reconocido por 11H10 y 1F11 de rata y se encontró que lo hacían.

Ejemplo 8

11h10 bloquea la unión de Dkk-1 a LRP6

Para determinar si 11H10 estaba ejerciendo su efecto biológico al interferir con la interacción de Dkk-1 y LRP6, y por inferencia LRP5, se estableció un análisis de unión de Dkk-1 a LRP6 utilizando citometría de flujo. Este análisis utiliza una proteína de fusión LRP6-Fc obtenida comercialmente (R & D Systems, Núm. 1505-LR) y una Dkk-1 humana etiquetada con biotina amino-terminal. El constructo de fusión de Dkk-1 etiquetada con biotina se generó mediante clonación de ADN que codificaba hDkk-1, de modo que fuera expresada fusionada al extremo C de la biotina en un constructo de expresión de mamífero. Este constructo se transfectó de transitoriamente a células 293T y el medio acondicionado se recogió 48 horas después de la transfección.

Para determinar si 11H10 era capaz de interferir en la unión de Dkk-1 a LRP6, se añadió LRP6 al medio acondicionado con y sin 11H10. Después se añadieron cuentas de estreptavidina a esta preparación, lo que permitió la unión de la proteína de fusión de biotina Dkk1 a las cuentas. La unión de LRP6 a Dkk-1 se determinó mediante el uso de un anticuerpo conjugado con FITC específico para la porción Fc del constructo de fusión LRP6-Fc. La unión de LRP6 a Dkk-1 se detectó mediante el uso de citometría de flujo. Se detectó una señal de unión específica (la unión específica es igual a la señal total observada menos la señal observada en ausencia de Dkk-1) de 6,46 con LRP6 y Dkk-1. La incubación de Dkk-1 con 11H10 antes de la adición de LRP6 redujo esta señal a 2,66, que fue inferior al 50% de la unión específica observada sin el anticuerpo, lo que indica que 11H10 interfiere en la unión de Dkk-1 a LRP6.

Ejemplo 9 Clonación de los ADNc de la cadena pesada y ligera de 11h10

El ARN total se aisló de células de hibridoma de rata 11H10 con reactivo TRIzol® (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, después se purificó adicionalmente usando una columna Qiagen RNeasy®. Se ligó un oligonucleótido 5' RACE (del inglés "Rapid Amplification of cDNA Ends" amplificación rápida de extremos de ADNc) (5'-CGA CUG GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3', SEC ID NO: 15) al ARN

utilizando los componentes y de protocolo del kit GeneRacer™ (Invitrogen). Este oligonucleótido proporciona dos

sitios de cebado únicos en los extremos 5' de las moléculas de ARNm. El ADNc de la primera cadena se sintetizó a partir de este ARN modificado utilizando un cebador al azar con un adaptador de extensión (5'-GGC CGG ATA GGC CTC ACN NNN NNT-3'; SEC ID NO: 16).

Tomando ventaja de las secuencias conservadas en los genes de anticuerpos de rata, se llevaron a cabo reacciones de PCR con 5' RACE para amplificar los ADNc que codificaban el anticuerpo anti-muDkk-1. Para clonar la cadena ligera completa de 11H10, se realizó una PCR con RACE usando el cebador 5' GeneRacer™ (5' CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3', SEC ID NO: 17) como cebador directo, y utilizando 5'-GCA ACA GTG GTA GGT CGC TTG TGG-3' (SEC ID NO: 18) como cebador inverso. Este cebador inverso corresponde a los nucleótidos 74-98 en la región no traducida 3' de la cadena kappa de la rata. Este producto de PCR se utilizó después como molde para una PCR anidada utilizando el cebador anidado 5' GeneRacer™ (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3' (SEC ID NO: 19)) como cebador directo y el mismo cebador inverso (SEC ID NO: 18).

La PCR RACE para la región variable de las cadenas pesadas utilizó el cebador GeneRacer™ como cebador directo y como cebador inverso utilizó 5'-AGG AGC CAG TGG ATA GAC AGA-3' (SEC ID NO: 20) que corresponde a los nucleótidos diecinueve a treinta y nueve de la región constante de IgG de rata. Este producto de PCR se utilizó

después como molde para una PCR anidada utilizando el cebador anidado 5' GeneRacer™ como cebador directo y

el mismo cebador inverso 5'-AGG AGC CAG TGG ATA GAC AGA-3' (SEC ID NO: 20).

Los productos de la PCR RACE se clonaron después en el vector de clonación pCR4-TOPO TA (Invitrogen). Las secuencias de ADN de estos clones se determinaron utilizando cebadores del vector pCR4 que flanqueaban el sitio de clonación, nucleótidos marcados con colorante y secuenciadores de ADN ABI. Secuencias consenso para las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada 11H10 se ensamblaron y se utilizaron para diseñar cebadores de PCR 5' dirigidos a los extremos amino terminales de las secuencias codificantes. Estos cebadores también contenían un sitio de restricción SalI para la clonación y una secuencia Kozak. El cebador de PCR 5' diseñado para la cadena ligera tenía la siguiente secuencia de nucleótidos: 5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GGT GTG CCT ACT CAT CTC-3' (SEC ID NO: 21); para la cadena pesada, 5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATC AGG CTC AGC TTG G 3' (SEC ID NO: 22). Estos cebadores 5' se utilizaron después con los cebadores 3' dirigidos a los extremos carboxi terminales de las secuencias codificantes y que contenían un sitio de restricción NotI para la clonación. El cebador 3' para la cadena ligera tenía la siguiente secuencia de nucleótidos: 5'-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG A-3' (SEC ID NO: 23), y el cebador 3' para la cadena pesada, 5'-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAG TGG GAG-3' (SEC ID NO: 24). Estos cebadores se usaron en reacciones de PCR para amplificar las regiones codificantes completas de los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo 11H10. Las secuencias clonadas se expresaron en células CHO como describen Bianchi y McGrew, 2003.

Las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada completas de 11H10 se muestran en los SEC ID NOS: 9 y 11, respectivamente, y los SEC ID NOS: 10 y 12 representan las secuencias de aminoácidos. La cadena ligera de 11H10 tiene una secuencia líder que consiste en los aminoácidos 1-20 (codificados por los nucleótidos 1-60 del SEC ID NO: 9), de este modo la proteína madura comienza en el aminoácido 21 del SEC ID NO: 10. La región variable de la cadena ligera de 11H10 está codificada por los nucleótidos 61-381 del SEC ID NO: 9 (véase también el SEC ID NO: 83), que corresponde a los aminoácidos 21-127 del SEC ID NO: 10 (véase, también el SEC ID NO: 84). La CDR1 de la cadena ligera de 11H10 está codificada por los nucleótidos 130-162 de la SEC ID NO: 9 (véase también el SEC ID NO: 85), que codifica los aminoácidos 44-54 del SEC ID NO: 10 (véase también el SEC ID NO: 70); la CDR2 de la cadena ligera de 11H10 son los residuos codificados por 208-228 del SEC ID NO: 9 (véase también el SEC ID NO: 86), que codifica los aminoácidos 70-76 del SEC ID NO: 10 (véase también el SEC ID NO: 72); y la CDR3 de 11H10 está codificada por los nucleótidos 325-351 del SEC ID NO: 9 (véase también el SEC ID NO: 87), que codifica los aminoácidos 109-117 del SEC ID NO: 10 (véase también el SEC ID NO: 74) .

La cadena pesada 11H10 tiene una secuencia líder que consiste en los aminoácidos 1-19 (codificada por los nucleótidos 1-57 del SEC ID NO: 11), de este modo la proteína madura comienza en el residuo 20 del SEC ID NO: 12 y está codificada por los nucleótidos 58-1395. La región variable de la cadena pesada está codificada por los nucleótidos 58-417 del SEC ID NO: 11 (véase también el SEC ID NO: 90), que codifica los aminoácidos 20-139 del SEC ID NO: 12 (véase también el SEC ID NO: 91). La CDR1 de la cadena pesada está codificada por los nucleótidos 148-162 del SEC ID NO: 11 (véase también el SEC ID NO: 92), que codifica los aminoácidos 50-54 del SEC ID NO: 12 (véase también SEC ID NO: 76); la CDR2 de la cadena pesada 11H10 está codifica por los nucleótidos 205-255 del SEC ID NO: 11 (véase también el SEC ID NO: 93), que codifica los aminoácidos 69-85 del SEC ID NO: 11 (véase también el SEC ID NO: 78); y la CDR3 de la cadena pesada de 11H10 está codifica por los nucleótidos 352-384 del SEC ID NO: 11 (véase también el SEC ID NO: 94), que codifica los aminoácidos 118-128 del SEC ID NO: 12 (véase también el SEC ID NO: 80).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AMGEN INC. LI, Ji LU, Hsieng Sen

5 SHEN, Wenyan RICHARDS, William

<120> Anticuerpos para DKK-1.

<130> A-941(WO)

<140> --para ser asignado -10 <141>

<150> US 60/598,791

<151>

<160> 94

<170> PatentIn versión 3.3

15 <210> 1

<211> 801

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 20 <221> CDS

<222> (1)..(801)

<400> 1

5

<210><211><212><213> 2 266 PRT Homo sapiens

<400>

2

5

<210><211><212><213> 3 819 ADN Ratón

<220> <221><222>

CDS (1)..(819)

<400>

3

5

<210><211><212><213> 4 272 PRT Ratón

<400>

4

5

<210><211><212><213> 5 4848 ADN Homo sapiens

<220> <221><222>

CDS (1)..(4848)

<400>

5

5

<210><211><212><213> 6 1615 PRT Homo sapiens

<400>

6

5

<210><211><212><213> 7 4842 ADN Homo sapiens

<220> <221><222>

CDS (1)..(4842)

<400>

7

-

<210> 8

<211> 1613

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

5

<210><211><212><213> 9 702 ADN Rata

<220> <221><222>

CDS (1)..(702)

<400>

9

5

<210><211><212><213> 10 234 PRT Rata

<400>

10

5

<210><211><212><213> 11 1395 ADN Rata

82

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1395)

<400> 11

5

<210><211><212><213> 12 465 PRT Rata

<400>

12

5

<210><211><212><213> 13 14 PRT Artificial

<220> <223>

péptido PADRE

<400>

13

10

<210><211><212><213> 14 14 PRT Artificial

15

<220> <223> péptido PADRE

<220> <221><222><223>

CARACTERÍSTICAS_MISCELÁNEA (4)..(4) X = ciclohexil-alanina

20

<400> 14

25

<210><211><212><213> 15 44 ARN Artificial

<220> <223>

oligonucleótido RACE

<400>

15

cgacuggagc acgaggacac ugacauggac ugaaggagua gaaa

44

30

<210><211><212><213> 16 24 ADN Artificial

35

<220> <223> oligonucleótido RACE

<220> <221>

característica_miscelánea

<222> (18)..(23)

<223> N = cualquier nucleótido

<400> 16 ggccggatag gcctcacnnn nnnt 24

<210> 17

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 17 cgactggagc acgaggacac tga 23

<210> 18

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 18 gcaacagtgg taggtcgctt gtgg 24

<210> 19

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 19 ggacactgac atggactgaa ggagta 26

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 20 aggagccagt ggatagacag a 21

<210> 21

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de PCR

<400> 21 aagctcgagg tcgactagac caccatgggt gtgcctactc atctc

<210> 22

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223>

Cebador de PCR

<400>

22

aagctcgagg tcgactagac caccatggac atcaggctca gcttgg

46

<210><211><212><213>

23 40 ADN Artificial

<220> <223>

Cebador de PCR

<400>

23

aaccgtttaa acgcggccgc ctaacactca ttcctgttga

40

<210><211><212><213>

24 42 ADN Artificial

<220> <223>

Cebador de PCR

<400>

24

aaccgtttaa acgcggccgc tcatttaccc ggagagtggg ag

42

<210><211><212><213>

25 642 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

<220> <221><222>

CDS (1)..(642)

<400>

25

5

<210><211><212><213> 26 214 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

26

<210>

<211>5 <212>

<213>

<220>

<223>

<220> 10 <221>

<222> 27 321 ADN Secuencia Artificial

Quimera

CDS (1)..(321)

<400> 27

5

<210><211><212><213> 28 107 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

28

<210><211><212><213>

29 642 ADN Secuencia Artificial

5

<220> <223> Quimera

<220> <221><222>

CDS (1)..(642)

10

<400> 29

5

<210><211><212><213> 30 214 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

30

5

<210><211><212><213> 31 321 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(321)

<400>

31

5

<210><211><212><213> 32 107 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

32

<210> 33

<211><212><213>

1350 ADN Secuencia Artificial

5

<220> <223> Quimera

<220> <221><222>

CDS (1)..(1350)

<400>

33

5

<210><211><212><213> 34 450 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

34

5

<210><211><212><213> 35 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

35

<210><211><212><213>

36 120 PRT Secuencia Artificial

5

<220> <223> Constructo Sintético

<400>

36

10

<210><211><212><213> 37 1350 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Chimera

15

<220> <221><222> CDS (1)..(1350)

<400>

37

5

<210><211><212><213> 38 450 PRT Secuencia Artificial

<220>

104

<223> Construto Sintético

<400> 38

<210>

39

<211>

360

106

<212><213>

ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

5

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

39

10

<210><211><212><213> 40 120 PRT Secuencia Artificial

15

<220> <223> Constructo Sintético

<400>

40

5

<210><211><212><213> 41 1338 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

41

5

<210><211><212><213> 42 446 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

42

5

<210><211><212><213> 43 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

43

5

<210><211><212><213> 44 120 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

44

<210>

45

<211>

1338

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

5

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

45

5

<210><211><212><213> 46 446 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

46

5

<210><211><212><213> 47 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

47

15

<210><211><212><213> 48 120 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

48

5

<210><211><212><213> 49 1338 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

49

5

<210><211><212><213> 50 446 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

50

5

<210><211><212><213> 51 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

51

5

<210><211><212><213> 52 120 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

52

5

<210><211><212><213> 53 1338 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

53

5

<210><211><212><213> 54 446 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

54

5

<210><211><212><213> 55 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

55

<210> 56

<211><212><213>

120 PRT Secuencia Artificial

5

<220> <223> Constructo Sintético

<400>

56

10

<210><211><212><213> 57 1338 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Quimera

15

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

57

5

<210><211><212><213> 58 446 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

58

5

<210><211><212><213> 59 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Chimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

59

5

<210><211><212><213> 60 120 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

60

5

<210><211><212><213> 61 1338 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Chimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

61

5

<210><211><212><213> 62 446 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

62

5

<210><211><212><213> 63 360 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Chimera

10

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

63

5

<210><211><212><213> 64 120 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

64

10

<210><211><212><213> 65 1338 ADN Secuencia Artificial

15

<220> <223> Chimera

<220> <221><222>

CDS (1)..(1338)

<400>

65

5

<210><211><212><213> 66 446 PRT Secuencia Artificial

<220>

143

<223> Constructo Sintético

<400> 66

5

<210><211><212><213> 67 360 ADN Secuencia Artificial

<220>

145

<223>

Chimera

<220> <221><222>

CDS (1)..(360)

5

<400> 67

10

<210><211><212><213> 68 120 PRT Secuencia Artificial

<220> <223>

Constructo Sintético

<400>

68

<210> 69

<211> 33

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(33)

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 70

<210> 71

<211> 21

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(21)

<400> 71

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 72

<210> 73

<211> 27

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(27)

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 74

<210> 75

<211> 15

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(15)

<400> 75

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 76

<210> 77

<211> 51

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(51)

<400> 77

5

<210><211><212><213> 78 17 PRT Rattus sp.

<400>

78

10

<210><211><212><213> 79 33 ADN Rattus sp.

<220> <221><222>

CDS (1)..(33)

15

<400> 79

20

<210><211><212><213> 80 11 PRT Rattus sp.

<400>

80

25

<210><211><212><213> 81 642 ADN Rattus sp.

<220> <221><222>

CDS (1)..(642)

30

<400> 81

5

<210><211><212><213> 82 214 PRT Rattus sp.

<400>

82

5

<210><211><212><213> 83 321 ADN Rattus sp.

<220> <221><222>

CDS (1)..(321)

10

<400> 83

5

<210><211><212><213> 84 107 PRT Rattus sp.

<400>

84

<210>

85

10

<211> 33

<212>

ADN

<213>

Rattus sp.

<400>

85

ctagcaagtg aggacattta cagtgattta gca

33

5

<210><211><212><213> 86 21 ADN Rattus sp.

<400>

86

aatgcaaata gcttgcaaaa t

21

10

<210><211><212><213> 87 27 ADN Rattus sp.

<400>

87

15

caacaatata acaattatcc tccgacg 27

<210><211><212><213>

88 1338 ADN Rattus sp.

20

<220> <221><222> CDS (1)..(1338)

<400>

88

5

<210><211><212><213> 89 446 PRT Rattus sp.

<400>

89

<210> 90

<211><212><213>

360 ADN Rattus sp.

5

<220> <221><222> CDS (1)..(360)

<400>

90

10

<210><211><212><213> 91 120 PRT Rattus sp.

<400>

91

5

<210><211><212><213> 92 15 ADN Rattus sp.

<400>

92

gactatgcca tggcc 15

10

<210><211><212><213> 93 51 ADN Rattus sp.

<400>

93

accattattt atgatggtag tagcacttac tatcgagact ccgtgaaggg c

51

15

<210><211><212><213> 94 33 ADN Rattus sp.

<400>

94

ggtctgggta tagctacgga ctactttgat tac

33

20

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo aislado o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que se une específicamente a una proteína Dkk-1 humana madura, que consiste en los aminoácidos 32-266 del SEQ ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende dos bucles, estando formados dichos bucles por enlaces disulfuro y encontrándose dichos bucles entre 220 y 237 del SEQ ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEQ ID NO: 2.

2. 2.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional se une a dos regiones separadas localizadas entre los aminoácidos 221262 del SEQ ID NO: 2.

3. 3.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional se une a dos regiones separadas, en donde una región consiste en los aminoácidos 221-236 del SEQ ID NO: 2 y la segunda región consiste los aminoácidos 246-262 del SEQ ID NO: 2.

4. 4.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 2, en donde una región consiste en los aminoácidos 221-229 del SEQ ID NO: 2 y la segunda región consiste en los aminoácidos 246-253 del SEQ ID NO: 2.

5. 5.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende:

   (a)

   (i)

   una CDR1 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 70; y

   (ii)

   una CDR2 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 72; y

   (iii) una CDR3 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 74; y

   (b)

   (i)

   una CDR1 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 76; y

   (ii)

   una CDR2 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 78; y

   (iii) una CDR3 de HC la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 80.

6. 6.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que consiste en dos VH idénticas y dos VL idénticas.

7. 7.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que consiste en dos VH idénticas y dos VL idénticas, en donde

   la VL tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 84; y la VH la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NIO: 91.

8. 8.

   El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 7, que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 89.

9. 9.

   Un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que compite con un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, por la unión específica a un polipéptido Dkk-1.

10. 10.

    El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 9, que compite con un anticuerpo que consiste en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en el que dichas cadenas pesadas consisten en los aminoácidos 20-465 del SEQ ID NO: 12 y dichas cadenas ligeras consisten en los aminoácidos 21-234 del SEQ ID NO: 10.

11. 11.

    El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 10, que se disocia del polipéptido Dkk-1 con una kd de 5 x 10-4 s-1 o menos.

12. 12.

    El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un anticuerpo monoclonal.

13. 13.

    El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un scFv, un Fab, un Fab' o un (Fab')2.

14. 14.

    El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo humanizado.

15. 15.

    Un ácido nucleico que codifica

    (A) una CDR de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 70, 72 y/o 74, y/o

    (B) una CDR de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 76, 78 y/o 80, en donde el ácido nucleico codifica un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. 16.

    Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la VH, la VL o tanto la VH como la VL del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

17. 17.

    Un ácido nucleico que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica la VH, la VL o tanto la VH como la VL del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de la reivindicación 7.

18. 18.

    Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 16.

19. 19.

    Una célula aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 18.

20. 20.

    Un método de producción de un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, que comprende la etapa de cultivar una célula de acuerdo con la realización 19.

21. 21.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un componente seleccionado del grupo que consiste de un tampón, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un portador, un solubilizante, un emulsionante y un conservante.

22. 22.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para su uso en un método para reparar hueso o para tratar una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en artritis, un trastorno óseo y un cáncer que aumenta la actividad de los osteoclastos e induce la resorción ósea.

23. 23.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona entre artritis reumatoide, artritis soriásica, y osteoartritis.

24. 24.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en osteopenia, osteoporosis, enfermedad de Paget, espondilitis anquilosante, periodontitis, reparación de hueso, pérdida de hueso debida a inmovilización o metástasis óseas líticas.

25. 25.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la reparación de hueso es el tratamiento de una fractura ósea.

26. 26.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo estimula la actividad de los osteoblastos y aumenta la densidad mineral ósea o la masa ósea.

27. 27.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el tratamiento es una terapia combinada que comprende la administración del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo combinado con un agente promotor del crecimiento óseo o un agente anti-resorción ósea.

28. 28.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el agente promotor del crecimiento óseo o agente anti-resorción ósea se selecciona del grupo que consiste en factor morfogénico óseo BMP-1 a BMP-12, factor de crecimiento transformante β, factores de crecimiento de fibroblastos FGF-1 a FGF-10, un inhibidor de interleucina 1, un inhibidor de TNFα, un inhibidor de ligando RANK, hormona paratiroidea, una

    prostaglandina de la serie E, un bisfosfonato, un mineral potenciador de hueso, y un agente anabólico.

29. 29.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde

    (a)

    el inhibidor de interceucina 1 es IL-1ra, un anticuerpo para IL-1 o un anticuerpo para receptores de IL-1,

    (b)

    el inhibidor de TNFα es etanercept, adalibumab o infliximab;

    (c)

    el inhibidor del ligando RANK es RANK soluble, osteoprotegerina o un anticuerpo antagónico que se une específicamente a RANK o ligando de RANK;

    (d)

    el mineral potenciador de hueso es fluoruro o calcio.

30. 30.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para su uso en un método para tratar a un paciente con cáncer que experimenta terapia de radiación o quimioterapia.

31. 31.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo se administra combinado con una antraciclina, taxol, tamoxifeno, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, oxaloplatino, o ácido [(1R)-3-metil-1-[[(2S)-1-oxo-3-fenil-2[(pirazinilcarbonil)amino]propil]amino]butil]borónico).

32. 32.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 30 o 31, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo se administra combinado con un inhibidor de aromatasa y un agente quimioterapéutico para pacientes con cáncer de mama.

33. 33.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo se administra combinado con un anticuerpo que se une a células tumorales e induce un efecto citotóxico y/o citostático sobre el crecimiento del tumor.

34. 34.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el anticuerpo que induce un efecto citotóxico y/o citostático sobre el crecimiento del tumor es un anticuerpo que se une a proteínas de la superficie celular HER2, CDC20, CDC33, glicoproteína de tipo mucina o receptor del factor de crecimiento epidérmico.

35. 35.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo se administra combinado con un polipéptido que induce selectivamente la apoptosis en células tumorales.

36. 36.

    La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el polipéptido es TRAIL.

37. 37.

    La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 y 30, y la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23-29 y 31-36, en donde la terapia combinada incluye tratamientos que se administran simultáneamente o sucesivamente.

38. 38.

    La composición farmacéutica de una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el mieloma múltiple.