ES2381505T3 - Polimerización activada por pirofosforólisis relativa a un extremo en 2' - Google Patents

Abstract

Método para retirar un nucleótido extremo en 2' de un oligonucleótido que comprende: incubar al menos un ácido nucleico diana con: pirofosfato al menos un primer biocatalizador que comprende una actividad de pirofosforólisis, y al menos un oligonucleótido que comprende un nucleótido extremo en 2', siendo dicho oligonucleótido al menos parcialmente complementario a al menos una primera subsecuencia del ácido nucleico diana, bajo condiciones en las que el primer biocatalizador retira al menos el nucleótido extremo en 2' del oligonucleótido produciendo un nucleótido extremo en 2' retirado y un oligonucleótido acortado, retirando de este modo el nucleótido del oligonucleótido

Description

Polimerización activada por pirofosforólisis relativa a un extremo en 2’

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de forma general a la biología molecular y la química de ácidos nucleicos. De forma más específica, la presente invención se refiere a la polimerización y amplificación de ácidos nucleicos en las que intervienen extremos en 2’.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La polimerización activada por pirofosforólisis (PAP) es un proceso en el que interviene la activación mediada por pirofosforólisis de cebadores activables por pirofosforólisis hibridados con ácidos nucleico diana o molde seguida de la extensión de los cebadores activados. Los cebadores activables por pirofosforólisis incluyen típicamente nucleótidos extremos, tales como los dideoxinucleótidos (ddNMPs) en su extremo 3’. Estos nucleótidos extremos deben, de forma general, retirarse enzimáticamente de dichos cebadores hibridados y bloqueados mediante reacciones de pirofosforólisis que consumen pirofosfato produciendo los cebadores activados para que pueda proceder la extensión de los cebadores. Dado que la activación de los cebadores requiere típicamente de cebadores y ácido nucleicos diana que se correspondan perfectamente, estas reacciones generan generalmente una cantidad limitada, si es que generan alguna, de productos no específicos, por ejemplo, debido a la formación de dímeros de cebador u otros artefactos del cebado. A modo de ejemplo entre las aplicaciones de la PAP se incluyen, entre otras, la provisión de métodos alternativos para la amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo como parte de procesos de detección de alelos raros, ensayos de detección de mutaciones somáticas, etc.).

Tal como se ha mencionado más arriba, algunas estrategias relacionadas con la PAP utilizan cebadores terminados con ddNMP y ADN polimerasas termoestables capaces de incorporar ddNMP (por ejemplo, enzimas mutados que contienen una mutación “F a Y” en la “Hélice O”) para llevar a cabo la pirofosforólisis de los cebadores con un grupo ddNMP 3-terminal en presencia de pirofosfato (PPi) tras la primera unión/hibridación al molde. Estas estrategias presentan en general diversas desventajas. Por ejemplo, estas técnicas utilizan típicamente concentraciones limitantes muy bajas de dNTPs, lo cual reduce (enlentece) la velocidad de extensión (número de nucleótidos polimerizados por segundo). Más específicamente, cuando en estas reacciones se libera un ddNMP en posición terminal 3’ en forma de ddNTP, la concentración muy baja de dNTPs (es decir “el tamaño del pool”) aumenta la posibilidad de reincorporar la concentración siempre en aumento de ddNTPs (resultante de los ciclos sucesivos de PAP) antes de la extensión completa de los cebadores (necesaria para una PCR eficiente). Esta reincorporación es en general no deseable, requiriéndose PAP adicionales para retirar los ddNMP incorporados y además contribuye a la extensión incompleta de los cebadores y compromete la eficiencia de los productos de extensión completa de los cebadores de cada ciclo. Además, varias de estas estrategias previas PAP son capaces de generar solamente amplicones muy cortos, por ejemplo en algunos casi incluso más cortos que los dímeros de cebadores. Por lo tanto, la eficiencia de los ciclos de PCR de estas estrategias anteriores está generalmente alterada, requiriéndose típicamente muchos ciclos para detectar dianas poco abundantes. Zhang y otros (2005), Trends in Biotechnology vol. 23/nº 2: 92-96, describen, por ejemplo, la utilización de la actividad exonucleasa 3’ de las polimerasas para retirar los nucleótidos discrepantes del extremo 3’ de un cebador. La actividad de corrección de errores de la actividad exonucleasa 3’ de las polimerasas no retira nucleótidos extremos en 2’ de los oligonucleótidos.

De lo anteriormente expuesto, es evidente que son deseables métodos adicionales en relación con la PAP. La presente invención da a conocer métodos en relación con la PAP que utilizan nucleótidos extremos en 2’, así como una serie de características adicionales que serán evidentes tras la revisión completa de la siguiente descripción.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la polimerización y amplificación de ácidos nucleicos. La presente invención en concreto da a conocer métodos relacionados con la PAP que implican el acoplamiento seriado de la pirofosforólisis y la polimerización. Estos métodos pueden utilizarse, por ejemplo, para el análisis de SNP y la detección de mutaciones somáticas raras, entre otras aplicaciones.

A modo de ejemplo, los métodos y otros aspectos descritos en la presente invención incrementan la especificidad general de las reacciones de síntesis mediadas por oligonucleótidos. Por ejemplo, de forma análoga a otros métodos “de inicio en caliente” (por ejemplo, “inicio en caliente” mediada por anticuerpos, aptámeros o enzimas modificados químicamente de forma reversible), se reduce o elimina la “extensión del ciclo número cero” (pre-PCR). Contrariamente a estos otros métodos, la activación de los cebadores se realiza en todas y cada una de las nuevas etapas de síntesis mediada por oligonucleótidos. Ello mejora la especificidad global de la reacción, minimizando la generación de productos secundarios no deseados. Por consiguiente, se mejora la detección de secuencias con un bajo número de copias o incluso con una sola copia. Además, también se mejora el rendimiento en reacciones de amplificación múltiplex (en el que se amplifican algunas o muchas dianas diferentes) al disminuir o eliminar la generación de productos de síntesis no específicos y no deseados, por ejemplo dímeros de cebadores en el caso de la PCR.

La invención en concreto da a conocer un método para retirar un nucleótido extremo en 2’ de un oligonucleótido. El método incluye la incubación de al menos un ácido nucleico diana con; pirofosfato en al menos un primer biocatalizador que contiene actividad pirofosforólisis y al menos un oligonucleótido (por ejemplo un ácido nucleico cebador, un ácido nucleico sonda, etc.) que comprende un nucleótido extremo en 2’ (por ejemplo en el extremo 3’), 5 siendo dicho oligonucleótido al menos parcialmente complementario a al menos una primera subsecuencia del ácido nucleico diana, bajo condiciones en las que el primer biocatalizador retira al menos el nucleótido extremo en 2’ del oligonucleótido produciendo un nucleótido con el extremo en 2’ retirado y un oligonucleótido acortado, retirando de este modo el nucleótido del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el método incluye la incubación del ácido nucleico diana con el primer biocatalizador, el oligonucleótido y pirofosfato, añadiéndose el pirofosfato para retirar el

10 nucleótido extremo en 2’.

Los nucleótidos extremos en 2’ utilizados en los oligonucleótidos descritos en la presente invención incluyen diversas realizaciones. En algunas realizaciones, por ejemplo, el nucleótido extremo en 2’ comprende un nucleótido 2’-monofosfato-3’-hidroxilo. Para ejemplificarlo más, en algunas realizaciones, el nucleótido extremo en 2’ comprende la fórmula:

en la que R1 es OH; B es al menos un anillo homocíclico, al menos un anillo heterocíclico, al menos un grupo arilo o combinaciones de los mismos; BG es un grupo bloqueador seleccionado del grupo formado por: CN, NO2, un grupo fosfato, un grupo aldehído o combinaciones de los mismos; Z es O ó CH2; y ----- representa un enlace sencillo o doble. Además, el nucleótido extremo en 2’ es típicamente no extensible gracias a uno o más nucleótidos que 20 incorporan biocatalizadores seleccionados del grupo formado por, por ejemplo, una ADN polimerasa G46E E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671 F E678 CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, una polimerasa'ZO5R, ADN Taq E615G, una polimerasa de Thermus flavus, una polimerasa TMA-25, una polimerasa E678G TMA-25, una polimerasa TMA-30, una polimerasa E678G TMA-30, una ADN polimerasa Tth, una polimerasa 25 de la especie Thermus, una polimerasa Taq E615G, una polimerasa Thermus ZO5R, una ADN polimerasa T7, una ADN polimerasa I Kornberg, una ADN polimerasa Klenow, una ADN polimerasa Taq, una ADN polimerasa microcócica, una ADN polimerasa alfa, una transcriptasa inversa, una transcriptasa inversa AMV, una transcriptasa inversa M-MuLV, una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una ARN polimerasa de E. coli, una ARN polimerasa SP6, una ARN polimerasa T3, una ADN polimerasa T4, una ARN polimerasa T7, una ARN polimerasa II, una

30 transferasa terminal, una polinucleótido fosforilasa, una ADN polimerasa que incorpora análogos de ribonucleótidos, una ADN polimerasa que incorpora ribonucleótidos, y similares.

En algunas realizaciones ejemplares, el ácido nucleico diana contiene al menos una posición de nucleótido polimórfica, y el método comprende la detección de la retirada del nucleótido extremo en 2’ del oligonucleótido, correlacionándose dicha retirada con el oligonucleótido que contiene al menos una posición de nucleótido que se 35 corresponde con la posición del nucleótido polimórfica. En estas realizaciones, el nucleótido extremo en 2’ se corresponde típicamente con la posición de nucleótido polimórfica. En algunas realizaciones, el oligonucleótido contiene al menos un marcador, y el método comprende la detección de una señal detectable emitida por el marcador. En algunas de estas realizaciones, el marcador contiene una fracción dadora y/o una fracción aceptadora y la señal detectable comprende la emisión de luz, y el método comprende la incubación del ácido nucleico diana

40 con el primer biocatalizador, el oligonucleótido, y al menos un modificador de la emisión de luz soluble y la detección de la emisión de luz desde la fracción dadora y/o la fracción aceptadora. Opcionalmente, el nucleótido extremo en 2’ contiene la fracción dadora y/o la fracción aceptadora.

Para una mayor ejemplificación, en algunas realizaciones el primer biocatalizador comprende una actividad incorporadora de nucleótidos (es decir, además de la actividad pirofosforólisis), y el método comprende la incubación 45 del ácido nucleico diana con el primer biocatalizador, el oligonucleótido acortado, y al menos un nucleótido adicional bajo condiciones en las que el primer biocatalizador incorpora el nucleótido adicional en el extremo del oligonucleótido acortado generando un oligonucleótido extendido. Opcionalmente, el método comprende la incubación del ácido nucleico diana con al menos un segundo biocatalizador que comprende una actividad incorporadora de nucleótidos, el oligonucleótido acortado, y al menos un nucleótido adicional bajo condiciones en las

50 que el segundo biocatalizador incorpora el nucleótido adicional en el extremo del oligonucleótido acortado produciendo un oligonucleótido extendido. A modo de ejemplo, la actividad incorporadora de nucleótidos incluye típicamente una actividad polimerasa. El primer y/o segundo biocatalizador comprende un enzima seleccionado entre, por ejemplo, una polimerasa y una transcriptasa inversa.

En ciertas realizaciones, el primer y/o segundo biocatalizador comprende una ADN polimerasa CS5 que contiene 55 una o más mutaciones en posiciones de aminoácidos seleccionadas entre, por ejemplo, G46, L329, Q601, D640, I669, S671, y E678. En algunas de estas realizaciones, las mutaciones comprenden una mutación G46E, una mutación L329A, una mutación Q601R, una mutación D640G, una mutación I669F, una mutación S671F y/o una mutación E678G.

En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos del oligonucleótido se extienden más allá del extremo del ácido nucleico diana cuando el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se hibridan para formar un ácido nucleico hibridado. En algunas realizaciones, al menos un oligonucleótido adicional comprende el nucleótido adicional. El nucleótido adicional comprende un nucleótido extensible y/o un nucleótido terminador. En algunas realizaciones, el nucleótido adicional contiene al menos un marcador, y el método comprende la detección de la señal emitida por el marcador. Por ejemplo, el marcador comprende opcionalmente una fracción dadora y/o una fracción aceptadora y la señal detectable comprende la emisión de luz, y el método comprende la incubación del ácido nucleico diana con al menos un modificador de la emisión de luz soluble y la detección de la emisión de luz desde el marcador.

Para una mayor ejemplificación, el método incluye opcionalmente la incubación del ácido nucleico diana con al menos un ácido nucleico sonda que contiene al menos un marcador, siendo dicho ácido nucleico sonda al menos parcialmente complementario con al menos una segunda subsecuencia del ácido nucleico diana, y la detección de una señal detectable emitida desde el marcador del ácido nucleico sonda o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la señal detectable comprende la emisión de luz, y el método comprende además la incubación del ácido nucleico diana con al menos un modificador de la emisión de luz soluble y la detección de la emisión de luz desde el marcador. Por ejemplo, el ácido nucleico sonda comprende opcionalmente una sonda nucleasa-5’ y el primer y/o segundo biocatalizador se extiende a lo largo del oligonucleótido acortado en dirección de 5’ a 3’ y comprende una actividad exonucleasa 5’ a 3’. Opcionalmente, el ácido nucleico sonda comprende una sonda de hibridación y/o una sonda horquilla.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana contiene al menos una posición de nucleótido polimórfica, y el método comprende la detección de la extensión del oligonucleótido acortado, correlacionándose dicha extensión con el oligonucleótido extendido que contiene al menos una posición de nucleótido que se corresponde con la posición del nucleótido polimórfica. En algunas de estas realizaciones, el nucleótido extremo en 2’ se corresponde típicamente con la posición de nucleótido polimórfica.

La invención se refiere, además, a un sistema que incluye (a) al menos un contenedor o soporte que comprende un oligonucleótido que contiene un nucleótido extremo en 2’. El sistema también incluye al menos uno entre: (b) al menos un modulador térmico configurado para comunicar térmicamente con el contenedor o soporte para modular la temperatura en los mismos; (c) al menos un componente de transferencia de fluidos que transfiere fluidos hacia y/o desde el contenedor o soporte, y (d) al menos un detector configurado para detectar señales detectables producidas en el contenedor o soporte. En algunas realizaciones, el sistema incluye un controlador conectado operativamente a: el modulador térmico para ejecutar la modulación de la temperatura en el contenedor o soporte, el componente de transferencia de fluidos para ejecutar la transferencia de fluidos hacia y/o desde el contenedor o soporte, y/o el detector para ejecutar la detección de las señales detectables producidas en el contenedor o soporte.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra de forma esquemática un ensayo de detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), según una realización de la presente invención.

Las figuras 2A-D muestran esquemáticamente nucleótidos extremos en 2’ ejemplares.

Las figuras 3 A y B muestran esquemáticamente algunas realizaciones de nucleótidos extremos en 2’.

La figura 4 en un diagrama de bloques que muestra un sistema representativo.

La figura 5 muestra esquemáticamente un oligonucleótido bloqueado, según una realización de la invención.

La figura 6 muestra esquemáticamente una trayectoria de síntesis en fase sólida para oligonucleótidos bloqueados, según una realización de la invención.

La figura 7 muestra de forma esquemática un 3’-O-TBDMS-2’-O-fosforamidito.

La figura 8 es una fotografía de un gel que muestra la detección de productos de la PCR de un análisis en el que se realizaron titulaciones de moldes de ADN de VIH mediante PAP.

La figura 9 es un gráfico que muestra los valores observados de ciclo umbral (CT) para diversos número de copias de moldes de plásmido K-Ras mutado utilizados en amplificaciones con cebadores bloqueados o no bloqueados.

La figura 10 es un gráfico que muestra los valores observados de ciclo umbral (CT) para varios enzimas y concentraciones de enzimas utilizados en amplificaciones con el molde plásmido K-Ras.

La figura 11 en un gráfico de barras que muestra el efecto de la concentración de enzima en los valores de ciclo umbral (CT) en las reacciones de polimerización activada por pirofosforólisis (PAP) utilizando una ADN polimerasa G46E L329A E678G (GLE) CS5. El eje Y representa el valor CT y el eje x representa la concentración de enzima (nM). La leyenda que acompaña al gráfico muestra el número de copias del ácido nucleico molde correspondiente a cada señal en el gráfico (no copias del ácido nucleico molde (no temp), 1e4 copias del ácido nucleico molde (1E4/rxn), 1e5 copias del ácido nucleico molde (1E5/rxn) y 1e6 copias del ácido nucleico molde (1E6/rxn).

La figura 12 es un gráfico de barras que muestra el efecto de la concentración de enzimas en los valores de ciclo umbral (CT) en las reacciones de polimerización activada por pirofosforólisis (PAP) utilizando una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G (GLDSE) CS5. El eje Y representa el valor CT y el eje x representa la concentración de enzima (nM). La leyenda que acompaña al gráfico muestra el número de copias del ácido nucleico molde correspondiente a cada señal en el gráfico (no copias del ácido nucleico molde (no temp), 1e4 copias del ácido nucleico molde (1E4/rxn), 1e5 copias del ácido nucleico molde (1E5/rxn) y 1e6 copias del ácido nucleico molde (1E6/rxn).

La figura 13 es un gráfico de barras que muestra datos de las reacciones de transcripción inversa PAP sobre ARN de VHC en las que se determinaron los productos de la reacción ADNc utilizando un ensayo PCR cuantitativo específico para el ADNc del VHC. El eje Y representa el valor CT mientras que el eje x representa las Unidades de enzima utilizadas en las reacciones, Tal como se indica, los enzimas utilizadas en estas reacciones fueron la ADN polimerasa ZO5 (ZO5) o mezclas de las ADN polimerasas G46E L329A Q601 R D640G S671F E678G (GLQDSE) y G46E L329A Q601 R D640G S671F (GLQDS) CS5.

La figura 14 muestra las curvas de crecimiento de la PCR de amplificaciones del oncogén BRAF generadas al realizar una PAP bidireccional. El eje x muestra la fluorescencia acumulada normalizada y el eje Y muestra los ciclos de la amplificación PAP PCR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. DEFINICIONES

Antes de proceder a la descripción detallada de la presente invención, debe entenderse que ésta no queda limitada a métodos, mezclas de reacción o sistemas particulares, los cuales pueden variar. Tal como se utiliza en la presente especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” también incluyen los plurales correspondientes a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente invención tiene solamente como objeto la descripción de realizaciones particulares, y no pretende tener carácter limitante. Además, a no ser que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención poseen el mismo significado del habitualmente entendido por aquellos con un conocimiento normal de la técnica a la que pertenece la invención. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología, y variantes gramaticales de la misma, según las definiciones establecidas a continuación.

Un “nucleótido extremo en 2’” se refiere a un análogo de nucleótido que comprende un grupo bloqueador (BG) en la posición 2’ del grupo azúcar del nucleótido. Un “grupo bloqueador” se refiere a un grupo o fracción química que evita típicamente la extensión de un ácido nucleico (es decir, un nucleótido extremo en 2’ es típicamente no extensible por uno o más biocatalizadores que incorporan nucleótidos). Es decir, una vez se incorpora al ácido nucleico el nucleótido extremo en 2’ (por ejemplo en el extremo 3’ del ácido nucleico), el grupo bloqueador evita la extensión adicional del ácido nucleico por al menos un biocatalizador que incorpora nucleótidos seleccionado, por ejemplo, entre: ADN polimerasa G46E E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671 F E678G CS5, ADN polimerasa G46E E678G CS6, polimerasa 'ZO5R, ADN polimerasa Taq E615G, polimerasa de Thermus flavus, polimerasa TMA-25, polimerasa TMA-30, ADN polimerasa Tth, polimerasa de la especie Thermus SPS-17, polimerasa Taq E615G, polimerasa Thermus ZO5R, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa I Kornberg, ADN polimerasa Klenow, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa microcócica, ADN polimerasa alfa, transcriptasa inversa, transcriptasa inversa AMV, transcriptasa inversa M-MuLV, ADN polimerasa, ARN polimerasa, ARN polimerasa de E. Coli, ARN polimerasa SP6, ARN polimerasa T3, ADN polimerasa T4, T7, ARN polimerasa II, transferasa terminal, polinucleótido fosforilasa, ADN polimerasa que incorpora ribonucleótidos o análogos de ribonucleótidos, y similares. Un grupo bloqueador ejemplar es el grupo fosfato. En la presente invención también se describen otros grupos bloqueadores representativos. Como nucleótidos extremos en 2’ ejemplares se incluyen los 2’-monofosfato-3’-hidroxil-5’-trifosfato nucleósidos y los 2’-monofosfato-3’-hidroxil-5’-difosfato nucleósidos. En la presente invención y en las solicitudes de patente U.S número 2005/0037991, de título "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF 2’-TERMINATOR NUCLEOTIDES” (“Síntesis y composiciones de nucleótidos extremos en 2’” depositada el 28 de junio de 2004 por Bodepudi y otros, y número 2005/0037398, actualmente Patente U.S. nº 7.572.581, de título "2’-TERMINATOR NUCLEOTIDE RELATED METHODS AND SYSTEMS," (“Sistemas y métodos relativos a nucleótidos extremos en 2’”) publicada el 11 de agosto de 2009 y concedida a Gelfand y otros, también se describen otros nucleótidos extremos en 2’.

Una “sonda 5’nucleasa” se refiere a un oligonucleótido marcado capaz de producir un cambio de señal detectable al ser escindido. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones la sonda nucleasa-5’ comprende dos fracciones marcador y emite radiación de mayor intensidad al escindirse, o separarse de cualquier otro modo, del oligonucleótido uno de las fracciones marcador. En algunas de estas realizaciones, por ejemplo, la sonda nucleasa5’ está marcada con una fracción silenciadora en el extremo 5’ y una fracción reportera en el extremo 3’ de la sonda. En algunas realizaciones, las sondas nucleasa-5’ están marcadas en una o más posiciones distintas a, o además de, estas posiciones terminales. Cuando la sonda está intacta, típicamente se produce una transferencia de energía entre las fracciones marcadoras de manera que la fracción silenciadora silencia al menos en parte la emisión fluorescente de la fracción aceptadora. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, se escinde la sonda nucleasa-5’ unida al ácido nucleico molde por la actividad nucleasa 5’ a 3’ de, por ejemplo, la polimerasa Taq u otra polimerasa que posea dicha actividad de manera que la emisión fluorescente de la fracción aceptadora deja de estar silenciada. Para una mayor ejemplificación, en algunas realizaciones las sondas nucleasa-5’ incluyen regiones autocomplementarias de manera que las sondas son capaces de formar estructuras en horquilla bajo condiciones concretas. En estas realizaciones, las sondas nucleasa5’ también se denominan en la presente invención “sondas horquilla”. Por ejemplo, en las patentes U.S nº 5.210.015, de título "HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE," (“Sistema de ensayo homogéneo que utiliza la actividad nucleasa de una polimerasa de ácidos nucleicos”) publicada el 11 de mayo de 1993 y concedida a Gelfand y otros, nº 5.994.056, de título "HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION," (“Métodos homogéneos de amplificación y detección de ácidos nucleicos”) publicada el 30 de noviembre de 1999 y concedida a Higuchi, y nº 6.171.785, de título "METHODS AND DEVICES FOR HEMOGENEOUS NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTOR," (“Métodos y dispositivos para la amplificación y detección homogénea ácidos nucleicos”) publicada el 9 de enero de 2001 y concedida a Higuchi se describen sondas nucleasa-5’ ejemplares que pueden adaptarse para ser utilizadas con los métodos descritos en la presente invención.

Una “fracción aceptadora” o “aceptor” se refiere a una fracción que es capaz de aceptar o absorber la energía transferida desde una fuente de energía. En algunas realizaciones, las fracciones aceptadoras también son capaces de emitir energía (por ejemplo luz, calor, etc.) al absorber una cantidad suficiente de energía transferida. En estas realizaciones, los aceptores también se denominan “fracciones reporteras” o “reporteros”. Como fracciones aceptadoras ejemplares se incluyen, sin carácter limitante, diversos fluoróforos tales como LightCycler®-Red 610 (LC-Red 610), LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, JA-270, CY5 y CY5.5, entre muchos otros.

Un “grupo alcohol” se refiere a un grupo orgánico que incluye al menos un grupo hidroxi.

Un “grupo aldehído” se refiere a un grupo orgánico que incluye al menos la fórmula CHO.

Un “grupo alquenilo” se refiere a una fracción hidrocarbonada lineal, ramificada o cíclica que comprende uno o más dobles enlaces carbono-carbono Como grupos alquenilo ejemplares se incluyen etenilo, 2-propenilo, 2-butenilo, 3butenilo, 1-metil-2-propenilo, 2-metil-2-propenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-metil-2-butenilo, 2-metil-2butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-metil-3-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 3-metil-3-butenilo, 1,1-dimetil-2-propenilo, 1,2dimetil-2-propenilo, 1-etil-2-propenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5-hexenilo, 1-metil-2-pentenilo, 2-metil-2pentenilo, 3-metil-2-pentenilo, 4-metil-2-pentenilo, 1-metil-3-pentenilo, 2-metil-3-pentenilo, 3-metil-3-pentenilo, 4metil-3-pentenilo, 1-metil-4-pentenilo, 2-metil-4-pentenilo, 3-metil-4-pentenilo, 4-metil-4-pentenilo, 1,1-dimetil-2butenilo, 1,1-dimetil-3-butenilo, 1,2-dimetil-2-butenilo, 1,2-dimetil-3-butenilo, 1,3-dimetil-2-butenilo, 1,3-dimetil-3butenil, 2,2-dimetil-3-butenil, 2,3-dimetil-2-butenil, 2,3-dimetil-3-butenil, 3,3-dimetil-2-butenil, 1-etil-2-butenilo, 1-etil-3butenilo, 2-etil-2-butenilo, 2-etil-3-butenilo, 1,1,2-trimetil-2-propenilo, 1-etil-1-metil-2-propenilo, 1-etil-2-metil-2propenilo, y similares. Un grupo alquenilo comprende típicamente entre 1 y 20 átomos de carbono y más típicamente entre 2 y 15 átomos de carbonº Los grupos alquenilo pueden estar sustituidos o no sustituidos.

Un “grupo alquenilamina” se refiere a un grupo amino que comprende al menos un grupo alquenilo.

Un “grupo alcoxi” se refiere a un grupo alquilo que comprende un átomo de oxígeno e incluye, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentoxi, heptiloxi, octiloxi, y similares.

Un “grupo alquilo” se refiere a una fracción hidrocarbonada saturada lineal, ramificada o cíclica e incluye todos los isómeros posicionales tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, 1metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2dimetilpropilo, 1-etilpropilo, hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-1-metilpropilo y 1-etil-2-metilpropilo, n-hexilo, ciclohexilo, n-heptilo, n-octilo, 2-etilhexilo, n-nonilo, n-decilo, y similares. Un grupo alquilo comprende típicamente entre 1 y 20 átomos de carbono y más típicamente entre 2 y 15 átomos de carbonº Los grupos alquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos.

Un “grupo alquilamina” se refiere a un grupo amino que comprende al menos un grupo alquilo.

Un “grupo alquinilo” se refiere a una fracción hidrocarbonada insaturada lineal, ramificada o cíclica que comprende uno o más triples enlaces carbono-carbonº Como grupos alquinilo representativos se incluyen, por ejemplo, 2propinilo, 2-butinilo, 3-butinilo, 1-metil-2-propinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 1-metil-2-butinilo, 1-metil-3butinilo, 2-metil-3-butinilo, 1,1-dimetil-2-propinilo, 1-etil-2-propinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 5-hexinilo, 1metil-2-pentinilo, 1-metil-3-pentinilo, 1-metil-4-pentinilo, 2-metil-3-pentinilo, 2-metil-4-pentinilo, 3-metil-4-pentinilo, 4metil-2-pentinilo, 1,1-dimetil-2-butinilo, 1,1-dimetil-3-butinilo, 1,2-dimetil-3-butinilo, 2,2-dimetil-3-butinilo, 3,3-dimetil-1butinilo, 1-etil-2-butinilo, 1-etil-3-butinilo, 2-etil-3-butinilo, 1-etil-1-metil-2-propinilo, y similares. Un grupo alquinilo comprende típicamente entre 1 y 20 átomos de carbono y más típicamente entre 2 y 15 átomos de carbonº Los grupos alquinilo pueden estar sustituidos o no sustituidos.

Un “grupo alquinilamina” se refiere a un grupo amino que comprende al menos un grupo alquinilo.

Un “amplicón” se refiere a una molécula generada copiando o transcribiendo otra molécula, por ejemplo, como ocurre en la transcripción, clonación, y/o las reacciones en cadena de la polimerasa (“PCR”) (por ejemplo amplificación PCR por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación PCR dúplex, etc.) u otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. Típicamente, un amplicón es una copia de un ácido nucleico seleccionado (por ejemplo un ácido nucleico diana o moldes) o es complementario al mismo.

El término “amplificar” o “amplificación” en el contexto de los ácidos nucleicos se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o una parte de un polinucleótido, típicamente a partir de una pequeña cantidad de polinucleótido ( por ejemplo, una única molécula de polinucleótido), en la que los productos de la amplificación o amplicones son generalmente detectables. La amplificación de polinucleótidos abarca varios procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula de ADN diana o molde durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR) son formas de amplificación. La amplificación no se limita a la estricta duplicación de la molécula de partida. Por ejemplo, la generación de múltiples moléculas de ADNc a partir de una cantidad limitada de ARN en una muestra utilizando la RT-PCR es una forma de amplificación. Además, la generación de múltiples moléculas de ARN a partir de una única molécula de ADN durante el proceso de transcripción también es una forma de amplificación.

Un “grupo arilo” se refiere a un grupo de átomos o fracción sustituyente derivado de un compuesto aromático. Se incluyen como grupos ejemplares, por ejemplo, grupos fenilo, grupos benzilo, grupos tolilo, grupos xiloilo, o similares. Los grupos arilo incluyen opcionalmente múltiples anillos aromáticos (por ejemplo grupos difenilo, etc.). Además, los grupos arilo pueden estar sustituidos o no sustituidos.

Un “grupo ariloxi” se refiere a un grupo arilo que comprende un átomo de oxígeno e incluye, por ejemplo, fenoxi, clorofenoxi, metilfenoxi, metoxifenoxi, butilfenoxi, pentilfenoxi, benziloxi, y similares.

Un “biocatalizador” se refiere a un catalizador que actúa para disminuir la energía de activación de una reacción química que incluye otros compuestos o “substratos” en un sistema biológico (por ejemplo, un sistema biológico in vitro, un sistema biológico in vivo, etc.). Los biocatalizadores pueden poseer una o más actividades catalíticas, tales como actividades de retirada de nucleótidos (por ejemplo, actividad pirofosforólisis, actividad nucleasa (por ejemplo, actividad endonucleasa y/o exonucleasa, etc.)) y/o actividades de incorporación de nucleótidos (por ejemplo, actividad polimerasa, actividad ligasa, actividad transcriptasa inversa, etc.).

Un “complemento” en el contexto de los ácidos nucleicos se refiere a un ácido nucleico, o a un segmento del mismo, que puede combinarse en asociación antiparalela o hibridarse con al menos una subsecuencia de un ácido nucleico. La asociación antiparalela puede ser intramolecular, por ejemplo en forma de un asa en horquilla dentro de un ácido nucleico, o intermolecular, tal como ocurre cuando dos o más ácidos nucleicos de cadena única se hibridan entre sí. Pueden incluirse entre los ácidos nucleico aquí mencionados algunas bases no halladas habitualmente en los ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, la hipoxantina y la 7-deazaguanina entre otras. No es necesario que la complementariedad sea perfecta, por ejemplo, dobletes o tripletes estables, pueden contener pares de bases desapareadas o bases no apareadas. Es decir, bajo ciertas circunstancias pueden producirse asociaciones antiparalelas, ya sean intramoleculares o intermoleculares, cuando los ácidos nucleicos son solamente “parcialmente complementarios”. Los expertos en la técnica de la química de los ácidos nucleicos pueden determinar, por ejemplo, la estabilidad de dobletes o tripletes considerando de forma empírica una serie de variables, tales como la longitud de una región de complementariedad, la composición de bases y la secuencia en una región de complementariedad, la fuerza iónica, la temperatura de fusión (Tm) y la incidencia de bases desapareadas.

El término “correlaciona” se refiere al establecimiento de una relación entre dos o más cosas. En algunas realizaciones, por ejemplo, la detección de la extensión del cebador de una reacción determinada indica que el ácido nucleico diana posee un determinado polimorfismo.

El término “correspondiente” se refiere idéntico o complementario a una determinada posición de nucleótido o secuencia de nucleótidos dentro de un ácido nucleico. La aplicación exacta del término será evidente para los expertos en la técnica, según el contexto en el que se utilice el término

Una “fracción dadora” se refiere a una fracción capaz de transferir, emitir, o donar una o más formas de energía de excitación a una o más fracciones aceptadoras.

Un “nucleótido extensible” se refiere a un nucleótido al cual puede añadirse o enlazar de forma covalente al menos otro nucleótido, por ejemplo, en una reacción catalizada por un biocatalizador una vez que el nucleótido extensible se incorpora dentro de un polímero de nucleótidos. Como ejemplos de nucleótidos extensibles se incluyen los desoxiribonucleótidos y los ribonucleótidos. Un nucleótido extensible se extiende típicamente añadiendo otro nucleótido en la posición 3’ de la fracción azúcar del nucleótido extensible.

El término “extender” en el contexto de los ácidos nucleicos se refiere a un proceso en el cual se añaden, o se incorporan de cualquier otro modo, uno o más nucleótidos a un ácido nucleico determinado.

El término “oligonucleótido extendido” se refiere a un oligonucleótido (por ejemplo, un ácido nucleico cebador) al cual se han añadido, o incorporado de cualquier otro modo (por ejemplo, mediante una unión covalente), uno o más nucleótidos adicionales.

El término “sonda en horquilla” se refiere a un oligonucleótido que puede utilizarse para realizar la detección de ácidos nucleicos diana y que incluye al menos una región de auto-complementariedad de manera que dicha sonda es capaz de formar una horquilla o estructura en bucle a bajo condiciones determinadas. Típicamente, las sondas en horquilla incluyen una o más fracciones marcadoras. En una realización ejemplar, se sitúan fracciones silenciadoras y fracciones reporteras de forma relacionada entre sí en las sondas en horquilla de manera que las fracciones silenciadores silencian al menos en parte las emisiones de luz desde las fracciones reporteras cuando las sondas se hallan en conformaciones en horquilla. Por el contrario, cuando las sondas de estas realizaciones no se hallan en conformaciones en horquilla (por ejemplo, cuando las sondas se hibridan con ácidos nucleicos diana), las emisiones de luz de las fracciones reporteras son generalmente detectables. En algunas realizaciones las sondas en horquilla también se denominan balizas moleculares. Las sondas en horquilla también pueden actuar como sondas nucleasa5’ o sondas de hibridación en algunas realizaciones.

Un “anillo heterocíclico” se refiere a un anillo monocíclico o bicíclico saturado, insaturado o aromático que comprende uno o más heteroátomos seleccionados de forma independiente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Un anillo heterocíclico puede estar unido a una fracción azúcar, o a un análogo de la misma, de un nucleótido de la presente invención a través de un heteroátomo o un átomo de carbonº Como anillos heterocíclicos ejemplares se incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, isoindolilo, azaindolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cinnolinilo, eftalazinilo, quinazolinilo, y similares.

Un “anillo homocíclico” se refiere a un anillo carbocíclico saturado o insaturado (pero no aromático) tales como, ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, ciclohexeno, y similares.

Una “sonda de hibridación” se refiere a un oligonucleótido que incluye al menos una fracción marcador que puede utilizarse para realizar la detección de ácidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, las sondes de hibridación funcionan en pares. En algunas realizaciones, por ejemplo, una primera sonda de hibridación de un par de sondas incluye al menos una fracción dadora en su extremo 3’ o en las proximidades del mismo, mientras que la segunda sonda de hibridación del par incluye, como mínimo, una fracción aceptadora (por ejemplo, LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, JA-270, CY5, o CY5.5) en o próxima a su extremo 5’. Las sondas se diseñan de manera que ambas hibridan con al ácido nucleico diana o molde (por ejemplo durante una PCR), la primera sonda de hibridación se une en el lado del extremo 5’ o aguas arriba de la segunda sonda de hibridación y con una proximidad suficiente para que se produzca la transferencia de energía entre las fracciones dadoras y aceptadoras para producir de este modo una señal detectable. Típicamente, la segunda sonda de hibridación también incluye un fosfato u otro grupo en su extremo 3’ para evitar la extensión de la sonda durante una PCR.

Los ácidos nucleicos se “hibridan” o se “reasocian” en una interacción de apareamiento de bases de un polinucleótido con otro polinucleótido (típicamente un polinucleótido antiparalelo) que da lugar a la formación de dobletes u otras estructuras de órdenes más elevados, denominado típicamente complejo de hibridación. La interacción primaria entre polinucleótidos antiparalelos es típicamente específica de base, por ejemplo A/T y G/C, mediante interacciones tipo Watson/Crick y/o tipo Hoogsteen. Para conseguir la hibridación no es un requisito que los dos polinucleótidos posean un 100% de complementariedad en toda su longitud. En algunos aspectos, puede formarse un complejo de hibridación a partir de interacciones intermoleculares, o alternativamente, a partir de interacciones intramoleculares. La hibridación se produce debido a una serie de fuerzas bien caracterizada, incluyendo los enlaces de hidrógeno, la exclusión por solventes y el apilamiento de bases. En Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes (“Técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular – Hibridación con sondas de ácidos nucleicos”) , parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (“Visión global de los principios de la hibridación y estrategia de los ensayos con sondas de ácidos nucleicos”) Elsevier (1993) puede hallarse una extensa guía de hibridación de ácidos nucleicos.

Un “marcador” se refiere a una fracción unida (de forma covalente o no covalente), o capaz de unirse a una molécula, proporcionando o siendo capaz de proporcionar dicha fracción información sobre la molécula (por ejemplo información descriptiva, identificadora, etc. sobre la molécula). Como marcadores ejemplares se incluyen fracciones dadoras, fracciones aceptadoras, marcadores fluorescentes, marcadores no fluorescentes, marcadores colorimétricos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores radioactivos, grupos modificadores de masa, anticuerpos, antígenos, biotina, haptenos, y enzimas (incluyendo, por ejemplo, la peroxidasa, fosfatasa, etc.).

Un “modificador de la emisión de luz” se refiere a una sustancia que se asocia de forma no covalente con un ácido nucleico en una mezcla y que modifica la emisión detectable de radiación desde una fuente de radiación asociada con el ácido nucleico cuando la sustancia está próxima a la fuente de radiación. En algunas realizaciones, por ejemplo, algunos modificadores de la emisión de luz descritos en la presente invención reducen o silencian la emisión de luz que de otro modo sería emitida (por ejemplo, una emisión basal de luz) desde oligonucleótidos que incluyen al menos una fracción emisora de luz (por ejemplo, sondas nucleasa-5’, etc.) cuando los modificadores de la emisión de luz entran en contacto con dichos oligonucleótidos. Los modificadores de la emisión de luz son típicamente solubles y en estas realizaciones también se denominan “silenciadores solubles” o “modificadores de la emisión de luz solubles”. Además, el nivel de modificación de la emisión de luz que produce el modificador de la emisión de luz desde un oligonucleótido determinado es típicamente proporcional a la longitud del oligonucleótido. Por ejemplo, si el oligonucleótido se escindió en una reacción nucleasa-5’, un modificador de la emisión de luz en concreto, modificará generalmente menos la emisión de luz desde los fragmentos marcados del oligonucleótido que desde el oligonucleótido intacto. Como modificadores de la emisión de luz ejemplares se incluyen diversos colorantes diazina y tiazina, descritos más extensamente en la presente invención y en, por ejemplo, la solicitud de patente U.S. número 11/474.062, titulada "LIGHT EMISSION MODIFIERS AND THEIR USES IN NUCLEIC ACID DETECTION, AMPLIFICATION AND ANALYSIS," (“Modificadores de la emisión de luz y sus usos en la detección, amplificación y análisis de ácidos nucleicos”) depositada el 23 de junio de 2006 por Gupta y otros.

Una “fracción” o “grupo” se refiere a las partes en que algo, tal como una molécula, está o puede ser dividido (por ejemplo, grupo funcional, grupo sustituyente o similares). Por ejemplo, un oligonucleótido descrito en la presente invención incluye en algunas realizaciones al menos una fracción dadora y/o al menos una fracción aceptadora.

El termino “mutación” se refiere a un ácido nucleico que ha sido alterado en su secuencia de ácidos nucleicos o a una proteína producto de un ácido nucleico que ha sido modificada en su secuencia de aminoácidos en relación con una forma no alterada o nativa del ácido nucleico o de la proteína codificada. Dichas alteraciones incluyen, por ejemplo, mutaciones puntuales o substituciones, delecciones, o inserciones.

Un nucleótido “no extensible” se refiere a un nucleótido, que tras su incorporación dentro de un ácido nucleico evita la extensión adicional del ácido nucleico por, por ejemplo, al menos un biocatalizador.

El término “ácido nucleico” o “polinucleótido” se refiere a un polímero que puede corresponder a un ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), o un análogo de los mismos. Ello incluye polímeros de nucleótidos tales como el ARN o el ADN, así como formas modificadas de los mismos, ácidos péptido nucleicos (PNAs), ácidos nucleicos inaccesibles (LNA™s), y similares. En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede ser un polímero que incluye múltiples tipos de monómeros, por ejemplo, tanto subunidades de ARN como de ADN. Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o un segmento de cromosoma, un vector (por ejemplo un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero ADN o ARN desnudo, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda, un cebador, etc. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de una cadena, dos cadenas, tres cadenas, etc., y no está limitada por ninguna longitud concreta. A no ser que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico concreta comprende o codifica opcionalmente secuencias complementarias, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.

Los ácidos nucleicos no se limitan a moléculas que poseen estructuras o secuencias de polinucleótidos naturales, esqueletos naturales, y/o enlaces entre nucleótidos naturales. Por ejemplo, también se incluyen dentro de esta definición ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos (Jenkins y otros (1995) Chem. Soc. Rev. pp169-176). Para una mayor ejemplificación, aunque un ácido nucleico contendrá generalmente enlaces fosfodiéster, en algunos casos se incluyen análogos de ácidos nucleicos que poseen esqueletos alternativos. Entre estos se incluyen sin carácter limitante, la fosforamida (Beaucage y otros (1993) Tetrahedron 49(10):1925 y las referencias incluidas en el mismo; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl y otros (1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger y otros (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai y otros (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger y otros (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; y Pauwels y otros (1986) Chemica Scripta 26:1419), el fosfotioato (Mag y otros (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437 y patente U.S. nº 5.644.048), el fosforoditioato (Briu y otros (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321), los enlaces O-metilfoforoamidita (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (“Oligonucleótidos y análogos: Un enfoque práctico”), Oxford University Press (1992)), y los esqueletos y enlaces péptido ácido nucleico (Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier y otros (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature 365:566; y Carlsson y otros (1996) Nature 380:207). Otros análogos de ácidos nucleicos incluyen aquellos con esqueletos de carga positiva (Denpcy y otros (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92:6097); esqueletos no iónicos (Patentes U.S. números 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger y otros (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger y otros (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; capítulos 2 y 3, de ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" (“Modificación de carbohidratos en la investigación anti-sentido”), Ed. Y. S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker y otros (1994) Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs y otros (1994) J.

Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y esqueletos sin ribosa, incluyendo los descritos en las Patentes U.S. números 5.235.033 y 5.034.506, y los capítulos 6 y 7 de ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research (“Modificaciones de carbohidratos en la investigación anti-sentido”), Ed. Y. S. Sanghvi y P. Dan Cook. También se describen diversos análogos de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 página 35. Las modificaciones del esqueleto ribosa-fosfato pueden realizarse para facilitar la adición de fracciones adicionales, tales como fracciones marcadoras, o para alterar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en ambientes fisiológicos.

Además de las bases heterocíclicas naturales halladas típicamente en los ácidos nucleicos (por ejemplo, adenina, guanina, timidina, citosina y uracilo), los análogos de ácidos nucleicos también incluyen bases heterocíclicas, o modificadas de otro modo, no naturales. A modo de ejemplo, opcionalmente se incluyen ciertas bases utilizadas en nucleótidos que actúan como modificadores de la temperatura de fusión (Tm). Por ejemplo, entre ellas se incluyen las 7-deazapurinas (por ejemplo 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo, propinil-dU, propinil-dC, etc.), y similares. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. número 5.990.303, titulada "SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2’-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES," (“Síntesis de nucleótidos 7-deaza-2’deoxiguanosina”) publicada el 23 de noviembre de 1999 y concedida a Seela. Como otras bases heterocíclicas representativas se incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina; derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitosina; 5fluorocitosina; 5-clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5-metilcitosina; 5-propinilcitosina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-iodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5etiniluracilo; 5-propiniluracilo, y similares. Se describen muchas bases no naturales, por ejemplo, en Seela y otros (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein y otros (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, y Seela y otros (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640.

Se describen también ejemplos adicionales de bases y nucleótidos modificados en, por ejemplo; la patente U.S. número 5.484.908, titulada "OLIGONUCLEOTIDES CONTAINING 5-PROPYNYL PYRIMIDINES," (“Oligonucleótidos que contienen 5-propinil pirimidinas”) publicada el 16 de enero de 1996, concedida a Froehler y otros, patente U.S. número 5.645.985, titulada "ENHANCED TRIPLE-HELIX AND DOUBLE-HELIX FORMATION WITH OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES," (“Formación de triples hélices y dobles hélices potenciada por oligómeros que contienen pirimidinas modificadas“) publicada el 8 de julio de 1997 y concedida a Froehler y otros, patente U.S. número 5.830.653, titulada "METHODS OF USING OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES," (“Métodos de utilización de oligómeros que contienen pirimidinas modificadas”) publicada el 3 de noviembre de 1998, y concedida a Froehler y otros, patente U.S. número. 6.639.059, titulada "SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES," (“Síntesis de [2.2.1]biciclo nucleósidos”) publicada el 28 de octubre de 2003, y concedida a Kochkine y otros, patente U.S. número 6.303.315, titulada "ONE STEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES," (“Preparación de muestras y detección de ácidos nucleicos en una etapa en muestras biológicas complejas”) publicada el 16 de octubre de 2001, y concedida a Skouv, y la solicitud de patente U.S. número 2003/0092905, titulada "SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES," (“Síntesis de [2.2.1]biciclo nucleósidos”) por Kochkine y otros publicada el 15 de mayo de 2003.

Un “nucleósido” se refiere a un componente de un ácido nucleico que comprende una base o grupo básico (que comprende, por ejemplo, al menos un anillo homocíclico, al menos un anillo heterocíclico, al menos un grupo arilo, y/o similares) unido covalentemente a una fracción azúcar (por ejemplo, un azúcar ribosa, etc.), un derivado de una fracción azúcar o un equivalente funcional a una fracción azúcar (por ejemplo, un análogo, tal como un anillo carbocíclico). Por ejemplo, cuando un nucleósido incluye una fracción azúcar, la base está típicamente unida a una posición 1’ de dicha fracción azúcar. Tal como se ha descrito más arriba, la base puede ser una base natural (por ejemplo, una base purina tal como la adenina (A) o guanina (G), una base pirimidina tal como la timina (T), la citosina (C) o el uracilo (U)) o no natural (por ejemplo, una base 7-deazapurina, una base pirazolo[3,4-d]pirimidina, una base propinil-dN, etc.). Como nucleósidos ejemplares se incluyen los ribonucleósidos, desoxirribonucleótidos, dideoxiribonucleósidos, nucleósidos carbocíclicos, etc.

Un “nucleótido” se refiere a un éster de un nucleósido, por ejemplo, un éster fosfato de un nucleósido. A modo de ejemplo, un nucleótido puede incluir 1, 2, 3 o más grupos fosfato unidos covalentemente a una posición 5’ de una fracción azúcar del nucleósido.

Un “biocatalizador incorporador de nucleótidos” se refiere a un catalizador que cataliza la incorporación de nucleótidos a un ácido nucleico. Los biocatalizadores incorporadores de nucleótidos son típicamente enzimas. Un “enzima” es un biocatalizador basado en proteínas y/o ácidos nucleicos que actúa reduciendo la energía de activación de una reacción química que comprende otros compuestos o “substratos”. Un “enzima incorporador de nucleótidos” se refiere a un enzima que cataliza la incorporación de nucleótidos a un ácido nucleico durante, por ejemplo, la amplificación de ácidos nucleicos o similares. Como ejemplos de enzimas incorporadores de nucleótidos se incluyen, por ejemplo, las polimerasas, las transferasas terminales, las transcriptasas inversas, las telomerasas, las polinucleótido fosforilasas y similares. Un “enzima termoestable” se refiere a un enzima que es estable al calor, resistente al calor y que retiene una actividad catalítica suficiente cuando se somete a temperaturas elevadas durante períodos seleccionados de tiempo. Por ejemplo, una polimerasa termoestable retiene actividad suficiente para realizar las reacciones de extensión de cebadores subsiguientes cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para que lleve a cabo la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos son bien conocidas por los expertos en la técnica y quedan ejemplificadas en la Patente U.S. número 4.683.202, titulada "PROCESS FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID SEQUENCES," (“Proceso para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos”) publicada el 28 de julio de 1987 y concedida a Mullis y la Patente U.S. número 4.683.195, titulada "Process FOR AMPLIFYING, DETECTING, AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID SEQUENCES," (“Proceso para la amplificación, detección y/o clonación de secuencias de ácidos nucleicos”) publicada el 28 de julio de 1987 y concedida a Mullis, ver también la Patente U.S. número 4.965.188. Para una mayor ejemplificación, una “polimerasa termoestable” se refiere a un enzima que es adecuado para ser utilizado en una reacción con ciclado de la temperatura, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”). En una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catalización de la combinación de nucleótidos de forma adecuada para formar productos de extensión de un cebador que son complementarios a un ácido nucleico molde.

Un “oligonucleótido” se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monómero de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos), típicamente más de tres unidades monómero, y más típicamente más de diez unidades monómero. El tamaño exacto de un oligonucleótido depende generalmente de diversos factores, incluyendo el uso o función última del oligonucleótido. Típicamente, los monómeros de nucleósido se unen mediante enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos, incluyendo fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares, incluyendo los contra-iones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, Na+ y similares, si dichos contra-iones están presentes. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado incluyendo, pero sin carácter limitante, aislamiento de una secuencia natural o existente, amplificación o replicación de ADN, transcripción inversa, clonación y digestión de restricción de secuencias adecuadas, o síntesis química mediante un método tal como el método fosfotriéster de Narang y otros (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; el método fosfodiéster de Brown y otros (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; el método dietilfosforamidita de Beaucage y otros (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; el método triéster de Matteucci y otros (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191; métodos de síntesis automatizada, o el método en soporte sólido de la patente US nº 4.458.066, titulada "PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES," (“Proceso para la preparación de polinucleótidos” publicada el 3 de julio de 1984 concedida a Caruthers y otros, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Un “polimorfismo” o una “posición de nucleótido polimórfica” se refieren a un sitio o sitios de ácidos nucleicos que pueden poseer uno de una serie de genotipos. El polimorfismo puede ser cualquier polimorfismo conocido por los expertos en la técnica incluyendo mutaciones, inserciones o delecciones posibles. El polimorfismo puede ser en un solo sitio o en múltiples sitios de un ácido nucleico. A los efectos de la presente invención, “un polimorfismo” puede referirse a un polimorfismo que ocurre en un sitio de un ácido nucleico o a un sitio concreto de un polimorfismo que puede producirse en múltiples sitios. En algunas realizaciones, no es necesario que el polimorfismo sea bien conocido o incluso mínimamente conocido por los expertos en la técnica. El polimorfismo puede ser simplemente cualquier diferencia entre un ácido nucleico control y un ácido nucleico diana.

Un “ácido nucleico cebador” o un “cebador” es un ácido nucleico que puede hibridarse con un ácido nucleico diana o molde permitiendo la extensión o elongación de la cadena utilizando, por ejemplo, un biocatalizador incorporador de nucleótidos, tal como una polimerasa, bajo condiciones de reacción adecuadas. Los ácidos nucleicos cebadores son típicamente oligonucleótidos naturales o sintéticos (por ejemplo oligodesoxirribonucleótidos de cadena única). Aunque se utilicen opcionalmente otras longitudes, los cebadores comprenden típicamente regiones de hibridación de una longitud entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. Los ácidos nucleicos cebadores cortos requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con los ácidos nucleicos molde. Típicamente es suficiente para hibridar con el molde produciéndose la extensión un ácido nucleico cebador que sea al menos parcialmente complementario a una subsecuencia de un ácido nucleico molde. Los ácidos nucleicos cebadores pueden marcarse, si se desea, incorporando un marcador detectable mediante, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, fotoquímicas, bioquímicas, inmunoquímicas, químicas u otras. A modo de ejemplo, se incluyen como marcadores útiles fracciones dadoras, fracciones silenciadoras, radioisótopos, reactivos electrodensos, enzimas (tal como se utilizan habitualmente para realizar ELISAs), biotina, o haptenos y proteínas de los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. Muchos de estos y otros marcadores se describen en mayor detalle en la presente invención y/o son conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán que, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos cebador también pueden utilizarse como ácidos nucleicos sonda.

El término “ácido nucleico sonda” o “sonda” se refiere a un oligonucleótido marcado o no marcado capaz de hibridarse selectivamente con un ácido nucleico diana o molde bajo condiciones adecuadas. Típicamente, las sondas son suficientemente complementarias a una secuencia diana específica contenida en un muestra de ácido nucleico para formar un doblete de hibridación estable con la secuencia diana bajo unas condiciones de hibridación seleccionadas, tal como, pero sin carácter limitante, condiciones de hibridación rigurosas. Un ensayo de hibridación realizado utilizando un sonda bajo condiciones de hibridación lo suficientemente rigurosas permite la detección selectiva de una secuencia diana específica. El término “región de hibridación” se refiere a aquella región de un ácido nucleico que es exactamente o substancialmente complementaria a, y por tanto capaz de hibridarse con, la secuencia diana. Para ser utilizada en un ensayo de hibridación para la discriminación de diferencias de secuencia de un solo nucleótido, la región de hibridación tiene típicamente una longitud entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos. Aunque la región de hibridación se refiere en general a todo el oligonucleótido, la sonda puede incluir secuencias de nucleótidos adicionales que actúan, por ejemplo, como sitios de unión de enlazadores para proporcionar un sitio para la unión de una secuencia sonda a un soporte sólido. Las sondas de la presente invención están generalmente incluidas en un ácido nucleico que comprende uno o más marcadores (por ejemplo, fracciones dadoras, fracciones aceptadoras, y/o fracciones silenciadoras), tales como una sonda nucleasa5’, una sonda de hibridación, una sonda de transferencia de energía resonante fluorescente (FRET), una sonda en horquilla, una baliza molecular, que también puede utilizarse para detectar la hibridación entre la sonda y ácidos nucleicos diana en una muestra. En algunas realizaciones, la región hibridación de la sonda es completamente complementaria a la secuencia diana. Sin embargo, en general, no es necesaria la complementariedad completa (es decir, los ácidos nucleicos pueden ser parcialmente complementarios entre sí); los complejos de hibridación pueden contener bases desapareadas o bases no apareadas. Puede ser necesaria la modificación de las condiciones rigurosas para permitir un complejo de hibridación estable con uno o más pares de bases desapareados o bases no apareadas. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (“Clonación molecular: Un manual de laboratorio”), 3ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) proporciona directrices para una modificación adecuada. La estabilidad del complejo diana/sonda de hibridación depende de una serie de variables incluyendo la longitud del oligonucleótido, la composición de bases y la secuencia del oligonucleótido, la temperatura y las condiciones iónicas. Los expertos en la técnica reconocerán que, en general, el complemento exacto de una sonda determinada es igualmente útil como sonda. Los expertos en la técnica también reconocerán que, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos sonda también pueden utilizarse como ácidos nucleicos cebador.

El término “pirofosforólisis” se refiere a la retirada de uno o más nucleótidos de un ácido nucleico en presencia de pirofosfato (PPi) para generar uno o más nucleósidos trifosfato.

Una “fracción silenciadora” o “silenciador” se refiere a una fracción capaz de reducir la emisión detectable de radiación, por ejemplo de radiación fluorescente o luminiscente, desde una fuente que de otro modo habría emitido dicha radiación. Los silenciadores típicamente reducen la radiación detectable emitida por la fuente al menos un 50%, típicamente al menos un 80%, y más típicamente al menos un 90%. Algunos silenciadores pueden re-emitir la energía absorbida desde, por ejemplo, un colorante fluorescente con una señal característica de dicho silenciador y por tanto, un silenciador también puede ser una fracción aceptadora. Este fenómeno es conocido generalmente como transferencia de energía resonante fluorescente o FRET. Alternativamente, un silenciador puede disipar la energía absorbida desde un colorante fluorescente en una forma diferente a la luz, tal como calor. Las moléculas utilizadas en las aplicaciones FRET incluyen, por ejemplo, fluoresceína, FAM, JOE, rodamina, R6G, TAMRA, ROX, DABCYL y EDANS. Si un colorante fluorescente es aceptor o silenciador queda definido por sus espectros de excitación y emisión y por el colorante fluorescente con el que se aparea. Por ejemplo, FAM es excitado con máxima eficiencia por una luz con una longitud de onda de 488nm, y emite luz con un espectro entre 500 y 650 nm, y una emisión máxima a 525 nm. FAM es una fracción dadora adecuada para ser utilizada con, por ejemplo, TAMRA como silenciador, el cual posee una excitación máxima a 514 nm. Como ejemplos de silenciadores no fluorescentes o silenciadores oscuros que disipan la energía absorbida desde un colorante fluorescente se incluyen los Black Hole Quenchers™ comercializados por Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA, EE.UU.). Los Black Hole Quenchers™ son estructuras que comprenden al menos tres radicales seleccionados entre compuestos arilo o heteroarilo substituidos o no substituidos, o combinaciones de los mismos, en los cuales al menos dos de los residuos están unidos mediante un enlace diazo exocíclico (ver por ejemplo, la Publicación internacional número WO 01/86001, titulada "DARK QUENCHERS FOR DONOR-ACCEPTOR ENERGY TRANSFER," (“Silenciadores oscuros para la transferencia de energía donor-aceptor”) publicada el 15 de noviembre de 2001, concedida a Cook y otros). También se dan a conocer silenciadores ejemplares en, por ejemplo, la Patente U.S. número 6.465.175, titulada "OLIGONUCLEOTIDE PROBES BEARING QUENCHABLE FLUORESCENT LABELS, AND METHODS OF USE THEREOF," (“Sondas oligonucleótido portadoras de marcadores fluorescentes silenciables, y métodos de utilización de los mismos”), publicada el 15 de octubre de 2002 concedida a Horn y otros.

Una “secuencia” de un biopolímero se refiere al orden e identidad de unidades monómero (por ejemplo nucleótidos, etc.) en el biopolímero. La secuencia (por ejemplo la secuencia de bases) de un ácido nucleico se lee típicamente en dirección 5’ a 3’.

Un “grupo sililo” se refiere a una clase de compuestos que incluye la fórmula general SiRR1R2, siendo R, R1 y R2 independientemente H, grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo o una combinación de dichos grupos.

Una “subsecuencia” se refiere a cualquier parte o a toda la secuencia del biopolímero, tal como una secuencia de un ácido nucleico.

Un “sistema” en el contexto de la instrumentación analítica se refiere a un grupo de objetos y/o dispositivos que forman una red para llevar a cabo el objetivo deseado.

Una “diana” se refiere a una biomolécula (por ejemplo, un ácido nucleico, etc.) o a una parte de la misma que quiere amplificarse, detectarse y/o analizarse de otro modo.

Un “nucleótido extremo” se refiere a un nucleótido, cuya incorporación dentro de un ácido nucleico evita substancialmente la extensión adicional del ácido nucleico, por ejemplo, por al menos un biocatalizador incorporador de nucleótidos.

Un “grupo tioéter” se refiere a una fracción lineal, ramificada o cíclica que comprende dos átomos de carbono unidos a un solo átomo de azufre e incluye, por ejemplo, metiltiometilo, metiltioetilo, metiltiopropilo, y similares.

II. INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a diversas aplicaciones para oligonucleótidos que incluyen nucleótidos extremos en 2’ en su extremo 3’ y que por lo tanto están bloqueados. Es decir, los nucleótidos extremos en 2’ evitan de en general la extensión por uno o más de los biocatalizadores aquí mencionados. Estos oligonucleótidos bloqueados son, sin embargo, generalmente “activables” ya que pueden ser extendidos si se retira el extremo en 2’. De acuerdo con la invención, los oligonucleótidos aquí descritos son activados mediante pirofosforólisis, la cual es simplemente la reacción inversa de la polimerización de los ácidos nucleicos. Además, en presencia de pirofosfato, los nucleótidos extremos en 2’ pueden ser retirados de ácidos nucleicos de doble cadena produciendo nucleósidos trifosfato y oligonucleótidos acortados en su extremo 3’, que pueden extenderse mediante reacciones de polimerización. El acoplamiento seriado de pirofosforólisis y polimerización en aplicaciones relacionadas con la PAP proporciona una especificidad mejorada en comparación con los procesos que carecen de activación mediante pirofosforólisis porque la amplificación no específica bajo condiciones de PAP requiere tanto de una pirofosforólisis desacoplada y de una incorporación errónea por parte del biocatalizador, lo cual es un evento raro. Además la actividad 3’-5’exonucleasa correctora de errores de ciertos biocatalizadores enzimáticos descritos en la presente invención de forma sorprendente no retira los grupos bloqueadores de los cebadores descritos en la presente invención (es decir, activa los cebadores), ya sea cuando los cebadores están en solución o hibridados con los ácidos nucleico molde correspondientes. Por lo tanto, la actividad correctora de errores de estos enzimas proporciona típicamente una fidelidad de síntesis más elevada de los productos de extensión de los cebadores que otras estrategias basadas en la PAP previamente existentes que utilizan enzimas que carecen de actividad correctora de errores. Tal como se ejemplifica en la presente memoria, los oligonucleótidos bloqueados descritos aquí pueden ser utilizados en esencialmente cualquier proceso de polimerización o amplificación, incluyendo el análisis de SNP y la detección de mutaciones somáticas raras, entre otras aplicaciones que serán evidentes para los expertos en la técnica.

Tal como se ha mencionado más arriba, las estrategias basadas en la PAP descritas en la presente invención (por ejemplo con la participación de ADN polimerasas incorporadoras de ribonucleótidos termoactivas y/o termoestables) mejora generalmente la especificidad de las reacciones de síntesis mediadas por oligonucleótidos en relación con las estrategias previamente existentes. Además son permisibles concentraciones relativamente elevadas y no limitantes cinéticamente de dNTPs y NTPs. Ello conlleva típicamente unas velocidades de extensión más rápidas al no “desabastecer” el enzima de substrato al contrario de diversas estrategias previas basadas en la PAP. Además, ello generalmente significa que la posibilidad de reincorporación de extremo en 2’ trifosfato liberado por la pirofosforólisis es mucho menor. Además, los enzimas aquí referidos poseen típicamente velocidades de extensión más veloces con dNTPs (y NTPs). Ello acorta el tiempo necesario para la extensión, incrementa la eficiencia de la extensión completa de los cebadores e incrementa la eficiencia de la PCR de estos métodos. Detalles referentes a estos enzimas también se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente U.S. número 2009/0148891, titulada "MUTANT DNA POLYMERASES AND RELATED METHODS", (“ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados”) depositada el 18 de octubre de 2006 por Bauer y otros. Además, los cebadores bloqueados aquí referidos se pueden preparar fácilmente y de forma económica. En concreto, la síntesis de estos oligonucleótidos bloqueados también se describe en, por ejemplo, la solicitud internacional número WO 2005/026184, titulada "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF NUCLEIC ACIDS COMPRISING 2’-TERMINATOR NUCLEOSIDES" “Síntesis y composiciones de ácidos nucleicos que comprenden nucleósidos extremos en 2’”), depositada el 29 de junio de 2004 por Bodepudi y otros.

Para una mayor ejemplificación, la figura 1 muestra de forma esquemática un ensayo de detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Tal como se muestra en la Reacción A, un ácido nucleico cebador -100- se hibrida con un ácido nucleico moldes -102-. El cebador -100- está bloqueado porque incluye un nucleótido extremo en 2’ (T*) en su extremo 3’. Además, la posición del nucleótido extremo en 2’ del cebador -100- corresponde a una posición polimórfica del molde -102-y en el esquema mostrado, es complementario al nucleótido en dicha posición (A). En presencia de pirofosfato (PPi) y de un biocatalizador con actividad pirofosforólisis, se produce una reacción de pirofosforólisis de manera que el nucleótido extremo en 2’ es retirado activándose el cebador -100-. Tal como se muestra adicionalmente, el cebador -100- activado es extendido a continuación en presencia de un biocatalizador (por ejemplo, una polimerasa de ácidos nucleicos, etc.) y dNTPs (o mezclas de dNTPs y NTPs) (es decir, ribonucleótidos) en una reacción de polimerización produciendo el cebador extendido -104-, que se correlaciona con el molde -102- y posee un alelo A en la posición polimórfica. El cebador extendido -104- puede detectarse utilizando esencialmente cualquier técnica de detección disponible, incluyendo la utilización de sondas nucleasa-5’, sondas en horquilla, sondas de hibridación, espectrometría de masas o similares. Para una mayor ejemplificación, en algunas realizaciones T* está marcado con una fracción reportera. En algunas de estas realizaciones, se marca otra posición del cebador -100- con una fracción silenciadora con una proximidad suficiente a la fracción reportera para silenciar la emisión de luz por parte de la fracción silenciadora. En estas realizaciones, si se desarrolla la pirofosforólisis (por ejemplo, tal como se muestra en la Reacción A de la figura 1), la emisión de luz por parte de la fracción reportera será detectable en el momento que T* sea retirado del cebador -100- y esté suficientemente separado de la fracción silenciadora. Al contrario que en la reacción A, en la reacción B el nucleótido extremo en 2’ del cebador -100- no es complementario al nucleótido (G) en la posición polimórfica del ácido nucleico molde -106-. Como consecuencia de

5 este desapareamiento, se produce poca, o ninguna, pirofosforólisis o polimerización incluso en presencia de biocatalizador y PPi y en consecuencia se produce, poca, o ninguna, extensión de cebadores. También pueden utilizarse muchas otras variaciones de este proceso basado en la PAP con los oligonucleótidos activables por pirofosforólisis descritos en la presente invención. Más adelante se describen algunos ejemplos representativos de las mismas.

10 Además de diversos métodos, también se dan a conocer mezclas de reacción que incluyen oligonucleótidos activables por pirofosforólisis y sistemas relacionados. A continuación se describen estas y otras características relacionadas con la presente invención, incluyendo ejemplos.

III. NUCLEOTIDOS EXTREMOS EN 2’

La presente invención se refiere a un método que supone la utilización de oligonucleótidos que incluyen nucleótidos

15 extremos en 2’ (es decir, oligonucleótidos bloqueados con extremos en 2’). A continuación se describe en mayor detalle la síntesis de oligonucleótidos y los reactivos de síntesis de ácidos nucleicos correspondientes. A modo de ejemplo, los nucleótidos utilizados en diversas realizaciones de la presente invención incluyen típicamente un grupo hidroxilo en una posición 3’ de un anillo de azúcar intacto y un grupo bloqueador (por ejemplo, un grupo bloqueador con carga negativa, un grupo bloqueador voluminoso, y/o similares) en una posición 2’ de la fracción azúcar.

20 Algunos de los biocatalizadores descritos en la presente invención comprenden la capacidad de extender ácidos nucleicos cebadores con estos nucleótidos extremos en 2’ de forma dirigida por moldes. Tras la incorporación de un nucleótido extremo en 2’ en el extremo 3’ de un ácido nucleico cebador, típicamente el ácido nucleico se vuelve no extensible por el biocatalizador. Además, algunos biocatalizadores incluyen la capacidad de retirar los nucleótidos extremos en 2’ de los oligonucleótidos, por ejemplo, a través de pirofosforólisis. En, por ejemplo, la Solicitud de

25 patente U.S. número 2009/0148891, titulada "MUTANT DNA POLYMERASES AND RELATED METHODS", (ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados”) depositada el 18 de octubre de 2006 por Bauer y otros, la Solicitud internacional nº WO 2005/026184, titulada "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF NUCLEIC ACIDS COMPRISING 2’-TERMINATOR NUCLEOSIDES" (“Síntesis y composiciones de ácidos nucleicos que comprenden nucleósidos extremos en 2’”), depositada el 29 de junio de 2004 por Bodepudi y otros, la Solicitud de patente U.S. número

30 2005/0037398, ahora Patente U.S. 7,572,581, titulada "2’-TERMINATOR NUCLEOTIDE RELATED METHODS AND SYSTEMS," “Métodos y sistemas relacionados con nucleótidos extremos en 2’”), publicada el 11 de agosto de 2009 y concedida a Gelfand y otros, y la Solicitud de patente U.S. número 2005/0037991, titulada "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF 2’-TERMINATOR NUCLEOTIDES," (“Síntesis y composiciones de nucleótidos extremos en 2’”) depositada el 28 de junio de 2004 y concedida a Bodepudi y otros, se describen detalles adicionales relativos a la

35 síntesis de nucleótidos extremos en 2’ y oligonucleótidos bloqueados con nucleótidos extremos en 2’ y/o sobre biocatalizadores relacionados.

Los nucleótidos extremos en 2’ utilizados en los métodos de la presente invención incluyen por lo general la fórmula:

en la que R1 es OH; B es al menos un anillo homocíclico, al menos un anillo heterocíclico (con o sin heteroátomos

40 exocíclicos), al menos un grupo arilo, o combinaciones de los mismos; BG es un grupo bloqueador seleccionado de grupo formado por: CN, NO2, un grupo fosfato, un grupo aldehído o combinaciones de los mismos; Z es O o CH2; y ----- representa un enlace simple o doble. En algunas realizaciones, estos nucleósidos y nucleótidos están marcados. Además, estos nucleótidos extremos en 2’ comprenden generalmente 1, 2, 3 o más grupos fosfato unidos en la posición 5’. En una realización, por ejemplo, un nucleótido extremo en 2’ comprende un nucleósido 2’

45 monofosfato-3’-hidroxil-5’-trifosfato.

La figuras 2A-D muestran esquemáticamente diversas realizaciones de nucleótidos extremos en 2’. En concreto, la figura 2A muestra esquemáticamente un nucleósido extremo adenosina tetrafosfato, la figura 2B describe esquemáticamente un nucleótido extremo guanosina tetrafosfato, la figura 2C muestra un nucleótido extremo uridina tetrafosfato y la figura 2D muestra esquemáticamente un nucleótido extremo citidina tetrafosfato.

50 A. BASES

Esencialmente cualquier anillo heterocíclico o grupo arilo (es decir, la base o grupo B) que puede aparearse por las bases con otro ácido nucleico, por ejemplo, a través de un enlace de hidrógeno o mediante un mecanismo de apilamiento de bases se incluye opcionalmente en la posición 1’ de la fracción azúcar del nucleósido o nucleótido extremo en 2’. Por consiguiente, la presente invención no tiene la intención de describir todos los grupos posibles que pueden utilizarse. Sin embargo, a continuación se dan a conocer algunos grupos B representativos a modo de ejemplo. En algunas realizaciones, por ejemplo, B comprende la fórmula:

en la que X1 y X2 se seleccionan independientemente entre CR8 y N; R2 es H, OH o NR4R5; R3 es H, OH, o NR6R7; R4, R5, R6 y R7 se seleccionan independientemente entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi y combinaciones de los mismos; y R8 es H, un grupo halo, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alquil amino, un grupo alquenil amino, un grupo alquinil amino, un grupo alquil 10 alcohol, un grupo alquenil alcohol, un grupo alquinil alcohol, polietilénglicol no substituido o polietilénglico substituido.

En otras realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que X1 y X2 se seleccionan independientemente entre CH y N; R2 es O ó S; R3 es H, OH o NR4R5; y R4 y R5 se seleccionan independientemente entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo bencilo, un grupo arilo y 15 combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que R2 es H, OH o NR4R5; R3 es H, OH o NR6R7; y R4, R5, R6 y R7 se seleccionan independientemente entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo o combinaciones de los 20 mismos.

En otras realizaciones, B comprende la fórmula: en la que X es CH ó N; R2 y R3 se seleccionan independientemente entre H; OH y NHR4; R4 es H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, o combinaciones de los mismos; y R5 es OH, NH2, SH, un grupo halo, un grupo éter, un grupo tioéter, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alquilamina, un grupo alquenilamina, un grupo alquinilamina o combinaciones de los mismos.

En otras realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que X es CH ó N; R2 es O o S; R3 es H, OH, o NHR4; R4 es H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, o combinaciones de los mismos; y R5 es OH, NH2, SH, un grupo halo, un grupo éter, un grupo tioéter, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo alquilamina, un grupo alquenilamina, un

10 grupo alquinilamina o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que X1 y X2 se seleccionan independientemente entre CH y N; R2 se selecciona entre H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi o combinaciones de los mismos; y R3 es O ó S.

15 En otras realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente entre O y S; y R4 y R5 se seleccionan independientemente entre H, NH2, SH, OH, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo alcoxi, un grupo halo o combinaciones de los mismos.

20 En algunas realizaciones, B comprende la fórmula: en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente entre O y S; y R4 es H, NH2, SH, OH, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo alcoxi, un grupo halo o combinaciones de los mismos.

En otras realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente entre O y S. En algunas realizaciones, B comprende la fórmula:

10 en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente entre O y S; y R4 es H, un grupo alquilo, un grupo alquenilo o un grupo alquinilo.

En otras realizaciones, B comprende la fórmula:

en la que R2 es O ó S; R3 y R4 se seleccionan independientemente entre H, NH2, SH, OH, COOH, COOCH3,

15 COOCH2CH3, CHO, NO2, CN, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo bencilo, un grupo arilo, un grupo ariloxi, un grupo alcoxi, un grupo halo o combinaciones de los mismos; y R5 es un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo arilo, un grupo bencilo, o combinaciones de los mismos.

B. GRUPOS BLOQUEADORES

Los grupos bloqueadores (BG) utilizados en la posición 2’ de la fracción también incluyen diversas realizaciones. En 20 algunas realizaciones, por ejemplo, el BG es un grupo cargado negativamente y/o un grupo voluminoso. A modo de ejemplificación adicional, BG se selecciona entre CN, NO2, un grupo fosfato, un grupo aldehído, y combinaciones de los mismos. De forma más específica, el BG comprende opcionalmente la fórmula:

en la que Q es O, S o NH; X es H, OH, CH3, BH3, F, o SeH; y Z es O, S, o Se. La figura 2B muestra esquemáticamente un nucleótido que comprende un grupo bloqueador que posee esta fórmula. Para una mayor ejemplificación, el BG comprende opcionalmente la fórmula:

en la que Q es O, S o NH; X es O, S o NH; y Z es O, S, o Se; y R es un grupo alquilo, un grupo alquenilo o un grupo 10 alquinilo. La figura 2A muestra esquemáticamente un nucleótido extremo en 2’ que comprende un grupo bloqueador que posee esta fórmula. En otra realización ejemplar, el BG comprende la fórmula:

en la que Q es O, S o NH; X es O, S o NH; y Z es O, S, o Se; L es -CONH(CH2)nNH-, - CO(CH2)nNH-, o 15 CONH(CH2CH2O)nCH2CH2NH-; n es un número entero mayor a 0; y R es NH2, SH, COOH, una fracción silenciadora, una fracción reportera, biotina o una fracción de afinidad.

IV. SINTESIS DE NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS EXTREMOS EN 2’

Los nucleósidos y nucleótidos extremos en 2’ incluidos en los oligonucleótidos descritos en la presente invención pueden sintetizarse utilizando diversos métodos. Por ejemplo, un método para la producción de nucléotidos no 20 extensibles marcados incluye unir al menos un grupo fosfato a una posición 5’ de una fracción azúcar de un nucleósido (por ejemplo, un ribonucleósido, un nucleósido carbocíclico, etc.) y unir al menos un grupo bloqueador en una posición 2’ de la fracción azúcar del nucleósido. Aquí se describen los grupos bloqueadores y bases ejemplares incluidas opcionalmente en los nucleósidos utilizados en este método. El método también incluye unir al menos un marcador a la fracción azúcar, el grupo bloqueador y/o la base del nucleósido. Más adelante se describen los

25 marcadores adecuados.

Para una mayor ejemplificación, un método de producción de nucleósidos 2’-monofosfato utilizado opcionalmente incluye hacer reaccionar un nucleótido que comprende la fórmula:

en la que P es al menos un grupo fosfato; n es un número entero mayor a 0; R1 es H. OH, un grupo hidrofílico, o un

5 grupo hidrofóbico; B es al menos un anillo homocíclico, al menos un anillo heterocíclico, al menos un grupo arilo o combinaciones de los mismos; Z es O ó CH2; y ----- representa un enlace sencillo o doble; con trimetafosfato trisódico (NaPO3)3 bajo condiciones efectivas para la producción de nucleósidos 2’-monofosfato. En algunas realizaciones, por ejemplo, el nucleótido comprende dos grupos fosfato, mientras que en otras, el nucleótido comprende tres fosfatos o más grupos. Las condiciones efectivas para la producción de nucleótidos incluyen

10 generalmente realizar las reacciones en solución a un pH alcalino Por ejemplo, la síntesis se realiza típicamente a un pH superior a aproximadamente 8,0, más típicamente a un pH superior a aproximadamente 10,0, y aún más típicamente un pH superior a aproximadamente 12,0 (por ejemplo a aproximadamente 12,5, 13,0, 13,5 o 14). Pueden utilizarse diversos compuestos básicos para ajustar el pH de la mezcla de reacción incluyendo, por ejemplo, KOH y NaOH, entre muchos otros ampliamente conocidos en la técnica. Típicamente, el reactivo limitante es el

15 nucleótido. Aunque opcionalmente pueden utilizarse otras condiciones de temperatura, estas reacciones de síntesis se realizan generalmente a temperatura ambiente o casi ambiente (es decir, entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 30ºC, por ejemplo a aproximadamente 23ºC, 24ºC, 25ºC, 26ºC etc.). Además, generalmente se deja que estas reacciones se produzcan durante al menos aproximadamente 4 horas, típicamente durante al menos aproximadamente 6 horas, e incluso más típicamente durante al menos aproximadamente 16 horas.

20 Además, también pueden utilizarse diversas trayectorias sintéticas específicas de región o al menos selectivas de región, de manera que la purificación del producto generalmente se minimiza, si no se elimina por completo. Estas trayectorias sintéticas incluyen típicamente la utilización de diversos grupos protectores (por ejemplo TBDMS, SiR, TOM, BOC, etc.) en posición 3’ de las fracciones azúcar. La síntesis de nucleótidos extremos en 2’, incluyendo trayectorias específicas de región también se describe en la Solicitud de patente U.S nº. 2005/0037991, titulada

25 "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF 2’-TERMINATOR NUCLEOTIDES," (“Síntesis y composiciones de nucleótidos extremos en 2’”) depositada el 28 de junio de 2004 por Bodepudi y otros.

Son generalmente conocidas y descritas en, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (“Química orgánica avanzada: Reacciones, mecanismos y estructura”), 4ª Ed., John Wiley & Sons, Inc. (1992), y en Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry Part A: Structure and Mechanism

30 (“Química orgánica avanzada. Parte A: Estructura y mecanismos”), 4ª Ed., Plenum Press (2000) diversas técnicas sintéticas que pueden adaptarse para ser utilizadas en los protocolos de síntesis de la presente invención. Los productos químicos de partida y otros componentes de reacción útiles en la síntesis de los nucleótidos de la presente invención están directamente disponibles de diversos suministradores comerciales incluyendo, por ejemplo, Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO).

35 V. SÍNTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS BLOQUEADOS QUE CONTIENEN NUCLEÓSIDOS EXTREMOS EN 2’

La síntesis de oligonucleótidos bloqueados que contienen nucleósidos extremos en 2’ puede llevarse a cabo utilizando diversos tipos de reactivos de síntesis de ácidos nucleicos. A modo de ejemplo, pueden sintetizarse oligonucleótidos enzimáticamente, por ejemplo, utilizando un biocatalizador incorporador de nucleótidos (por ejemplo una ADN polimerasa, una ligasa, etc.) o mediante síntesis química, por ejemplo, utilizando el método de la 40 fosforamidita o el método del fosfito-triéster (Herdewijn, Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, (“Síntesis de oligonucleótidos: Métodos y aplicaciones”) Humana Press (2005), Gait (Ed.), Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984), Vorbruggen y otros, Handbook of Nucleoside Synthesis (“Manual de síntesis de nucleósidos”), John Wiley & Sons, Inc. (2001), y Hermanson, Bioconjugate Techniques (“Técnicas de bioconjugación”) Elsevier Science (1996)). Pueden introducirse marcadores durante la síntesis enzimática, por 45 ejemplo, monómeros de nucleósido trifosfato marcados (por ejemplo, nucleótidos extensibles marcados, nucleótidos extremos en 2’ marcados, etc.) o durante la síntesis química utilizando fosforamiditas nucleótido o no nucleótido marcadas, o puede introducirse después de la síntesis. La síntesis de oligonucleótidos bloqueados con extremos en 2’ también se describe en, por ejemplo, la Solicitud Internacional nº WO 2005/026184, titulada "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF NUCLEIC ACIDS COMPRISING 2’-TERMINATOR NUCLEOSIDES", (“Síntesis y

50 composiciones de ácidos nucleicos que comprenden nucleósidos extremos en 2’) depositada el 29 de junio de 2004 por Bodepudi y otros. La síntesis de oligonucleótidos bloqueados también se describe con mayor detalle más adelante en los ejemplos.

Un procedimiento ejemplar para la síntesis enzimática de oligonucleótidos marcados incluye la desnaturalización del ácido nucleico molde o diana y la hibridación de un par de cebadores con el molde. En algunas realizaciones, se añade a la mezcla de reacción una mezcla de desoxinucleósidos trifosfato (por ejemplo dGTP, dATP, dCTP y dTTP) en la que al menos una parte de uno de los desoxirribonucleótidos está marcado tal como se describe aquí. A continuación, generalmente se añade a la mezcla de reacción un catalizador incorporador de nucleótidos, tal como un enzima ADN polimerasa, bajo condiciones en las que el enzima es activo. Mediante la incorporación de desoxinucleótidos marcados durante la síntesis de cadena por la polimerasa, se forma un oligonucleótido marcado. La ADN polimerasa utilizada en este método es generalmente termoestable, y la temperatura de reacción se cicla típicamente entre temperaturas de desnaturalización y extensión para llevar a cabo la síntesis de cadenas complementarias marcadas del ácido nucleico diana mediante PCR (Edwards y otros (Eds.), Real-Time PCR: An Essential Guide (“PCR en tiempo real: Una guía esencial”), Horizon Scientific Press (2004), Innis y otros (Eds.), PCR Strategies (“Estrategias de PCR”), Elsevier Science & Technology Books (1995), e Innis y otros (Eds.), PCR Protocols (“Protocolos de PCR”), Academic Press (1990). A continuación, el amplicón deseado es separado de los otros componentes de la mezcla de reacción utilizando diversas técnicas de purificación conocidas por los expertos en la técnica. A continuación el amplicón puede desnaturalizarse e hibridarse con el ácido nucleico molde bajo condiciones en las que se incorporan los nucleótidos extremos en 2’ en los extremos 3’ de las cadenas individuales del amplicón dando lugar a los oligonucleótidos bloqueados deseados. Alternativamente, pueden ligarse los oligonucleótidos (sintetizados enzimática o químicamente) que contienen los nucleósidos extremos en 2’ con las cadenas del amplicón dando lugar a los oligonucleótidos bloqueados deseados. Otras variaciones de estas estrategias de síntesis de oligonucleótidos bloqueados serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los oligonucleótidos bloqueados generados utilizando la síntesis química se producen generalmente utilizando el método de la fosforamidita, aunque opcionalmente pueden utilizarse otras estrategias. La síntesis basada en fosforamidita se realiza habitualmente con cadenas de oligonucleótidos crecientes unidas a soportes sólidos, de manera que los reactivos en exceso, que se hallan en la fase líquida, pueden eliminarse fácilmente mediante filtración. Ello elimina la necesidad de otras etapas de purificación entre ciclos.

En una descripción breve de un ciclo de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida ejemplar que utiliza el método de la fosforamidita, típicamente un soporte sólido que incluye un monómero de nucleótido protegido es inicialmente tratado con un ácido (por ejemplo, ácido tricloroacético) para retirar el grupo protector 5’-hidroxilo, liberando el grupo hidroxilo para una reacción de acoplamiento subsiguiente. A continuación se forma generalmente un compuesto intermediario activado añadiendo simultáneamente a la reacción un monómero nucleósido fosforamidita protegido y un ácido débil (por ejemplo, tetrazol). El ácido débil protona el nitrógeno de la fosforamidita formando un producto intermediario reactivo. La adición de nucleósidos a la cadena de ácido nucleico creciente se completa generalmente en 30 segundos. A continuación, se realiza típicamente una etapa de nivelación para terminar todas las cadenas de oligonucleótidos que no experimenten adición de nucleósidos. La nivelación puede realizarse, por ejemplo, con anhídrido acético, 1-metilimidazol o similares. A continuación, la unión entre nucleótidos se convierte de fosfito a fosfotriéster, que es más estable, mediante oxidación utilizando, por ejemplo, yodo como agente oxidante y agua como donante de oxígeno Tras la oxidación, típicamente se retira el grupo protector hidroxilo con un ácido prótico (por ejemplo, ácido tricloroacético o ácido dicloroacético) y se repite el ciclo hasta que se completa la elongación de las cadenas. Tras la síntesis, generalmente el oligonucleótido sintetizado es escindido del soporte sólido utilizando una base, tal como el hidróxido de amonio o la t-butil amina. La reacción de escisión también retira todos los grupos protectores fosfato (por ejemplo cianoetilo). Finalmente, se retiran los grupos protectores en las aminas exocíclicas de las bases y los grupos protectores hidroxilo en la o las fracciones de marcado tratando el oligonucleótido bajo condiciones básicas a una temperatura elevada (por ejemplo hasta 55ºC).

También se facilitan descripciones de la química utilizada para formar oligonucleótidos mediante métodos basados en la fosforamidita, por ejemplo, en la Patente U.S. nº 4,458,066, titulada "PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES," (“Proceso de preparación de nucleótidos”) publicada el 3 de julio de 1984, concedida a Caruthers y otros, y la Patente U.S. nº 4,415,732, titulada "PHOSPHORAMIDITE COMPOUNDS AND PROCESSES," (“Compuestos y procesos de fosforamidita”) publicada el 15 de noviembre de 1983, concedida a Caruthers y otros.

Según se desee, puede marcarse cualquiera de los monómeros de nucleósido fosforamidita. En algunas realizaciones, si se desea marcar el extremo 5’ del oligonucleótido, puede utilizarse una fosforamidita no nucleotídica durante la etapa de condensación final. Si se desea marcar una posición interna del oligonucleótido, puede utilizarse una fosforamidita nucleotídica durante cualquiera de las etapas de condensación. Además, tras la síntesis, también pueden marcarse los oligonucleótidos en un número esencial de posiciones (Eckstein y otros (Eds), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (“Oligonucleótidos y análogos: Un enfoque práctico”), Oxford University Press (1992), Chu y otros (1983) "Derivatization of unprotected polynucleotides," (“Derivatización de polinucleótidos no protegidos”) Nucleic Acids Res. 11(18): 6513-6529, y Patente U.S. nº 5,118,800, titulada "Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide," (“Oligonucleótidos que poseen un grupo amino primario en el nucleótido terminal”) publicada el 2 de junio de 1992, concedida a Smith y otros). Para una mayor ejemplificación, los oligonucleótidos también pueden marcarse en su esqueleto fosfodiéster (Eckstein y otros (1992) supra) o en el extremo 3’ (Nelson y otros (1992) "Oligonucleotide labeling methods. 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone," (“Métodos de marcado de oligonucleótidos. 3. Marcado directo de oligonucleótidos utilizando un esqueleto 2-aminobutil-1,3propanediol no nucleosídico novedoso”) Nucleic Acids Res. 20(23):6253-6259, Patente U.S. nº 5.401.837, titulada "Method for labeling the 3’ terminus of a synthetic oligonucleotide using a unique multifunctional controlled pore glass (MF-CPG) reagent in solid phase oligonucleotide synthesis," (“Método de marcado del extremo 3’ de un oligonucleótido sintético utilizando un reactivo en vidrio multifuncional de porosidad controlada novedoso”) publicada el 28 de marzo de 1995, concedida a Nelson, y la Patente U.S. nº 5.141.813, titulada "Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis," (Reactivo en vidrio multifuncional de porosidad controlada para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida”) publicada el 25 de agosto de 1992 concedida a Nelson).

En algunas realizaciones, se incluyen nucleótidos modificados en los oligonucleótidos bloqueados aquí descritos. A modo de ejemplo, la introducción de nucleótidos modificados dentro de secuencias de oligonucleótidos puede, por ejemplo, alterar la temperatura de fusión de los oligonucleótidos, tal como se desee. En algunas realizaciones, ello puede resultar en una mayor sensibilidad en comparación con los oligonucléotidos no modificados correspondientes incluso en presencia de uno o más desapareamientos en la secuencia entre el ácido nucleico diana y el oligonucleótido en concreto. Como nucleótidos modificados que pueden actuar como sustituyentes en o ser añadidos a los oligonucleótidos se incluyen, por ejemplo, C5-etil-dC, C5-metil-dC, C5-etil-dU, 2,6-diaminopurinas, C5-propinil-dC, C7-propinil-dA, C7-propinil-dG, C5-propargilamino-dC, C5-propargilamino-dU, C7-propargilamino-dA, C7-propargilamino-dG, 7-deaza-2-deoxixantosina, análogos de la pirazolopirimidina, pseudo-dU, nitro-pirrol, nitroindol, 2’-0-metil Ribo-U, 2’-0-metil Ribo-C, un 8-aza-dA, un 8-aza-dG, un 7-deaza-dA, un 7-deaza-dG, N4-etil-dC y N6-metildA. Para una mayor ejemplificación, como otros ejemplos de oligonucleótidos modificados se incluyen aquellos que poseen uno o más monómeros LNA™. También se describe nucleótidos como éstos en, por ejemplo, la Patente U.S. nº 6.639.059, titulada "SYNTHESIS OF [2.2.1] BICYCLO NUCLEOSIDES," (“Síntesis de [2.2.1] biciclo nucleósidos”) publicada el 28 de octubre de 2003 concedida a Kochkine y otros, la Patente U.S. nº 6.303.315, titulada "ONE STEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES," (“Preparación de muestras y detección de ácidos nucleicos en una etapa en muestras biológicas complejas”) publicada el 16 de octubre de 2001, y concedida a Skouv, y la solicitud de patente U.S. número 2003/0092905, titulada "SYNTHESIS OF [2.2.1]BICYCLO NUCLEOSIDES," (“Síntesis de [2.2.1]biciclo nucleósidos”) por Kochkine y otros publicada el 15 de mayo de 2003. Los oligonucleótidos que contienen monómeros LNA™ están comercializados, por ejemplo, por Exiqon A/S (Vedbæk, Dinamarca). En la presente invención se citan modificaciones de oligonucleótidos adicionales, incluidas en las definiciones anteriormente proporcionadas.

Los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores, sondas, etc.) utilizados ,tal como se describe en la presente invención, pueden diseñarse utilizando esencialmente cualquier estrategia conocida por los expertos en la técnica. A modo de ejemplo, en, por ejemplo, Chen y otros (2003) "Primer Design Assistant (PDA): a web-based primer design tool" (“Asistente para el diseño de cebadores (PDA): Una herramienta de diseño tipo web”) Nucleic Acids Res. 31(13):3751-3754, Miura y otros (2005) "A novel strategy to design highly specific PCR primers based on the stability and uniqueness of 3’-end subsequences" (“Una estrategia novedosa para el diseño de cebadores de PCR altamente específicos basada en la estabilidad y unicidad de subsecuencia en el extremo 3’”) Bioinformatics 21(24):4363 4370, Hyyro y otros (2005) "Genome-wide selection of unique and valid oligonucleotides" (“Selección de oligonucleótidos válidos y únicos basada en todo el genoma”) Nucleic Acids Res. 33(13):e115, y Weckx y otros (2005) "SNPbox: a modular software package for large-scale primer design" (“SNPbox: Un paquete de software modular para el diseño de cebadores a gran escala”) Bioinformatics 21(3): 385-387, se describen técnicas que pueden opcionalmente adaptarse para ser utilizadas en el diseño de oligonucleótidos.

VI. MARCADO

Los oligonucleótidos (por ejemplo cebadores, sondas, etc.) descritos en la presente invención puede opcionalmente marcarse, por ejemplo, para facilitar su detección ulterior. En algunas realizaciones, los reactivos de síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, los precursores fosforamidita de los nucleótidos extremos en 2’, precursores fosforamidita de otros nucleótidos, etc.) se marcan antes de la síntesis de los oligonucleótidos. Por ejemplo, opcionalmente se une un marcador, por ejemplo a un anillo homocíclico, a un anillo heterocíclico, o a un grupo arilo de un nucleótido extremo en 2’ u otro nucleótido (por ejemplo a través del C5 de una pirimidina, N4 de una citidina, N7 de una purina, N6 de una adenosina, C8 de una purina, u otros sitios de unión conocidos en la técnica), por ejemplo mediante un enlace amida, éster, tioéster, éter, tioéter, carbono-carbono u otros tipos de enlace covalente. Además,

o alternativamente, el marcador se une a una fracción azúcar (por ejemplo, un azúcar ribosa, etc.), o a un análogo de la misma (por ejemplo, un anillo carbocíclico, etc.), de un nucleótido extremo en 2’ u otro nucleótido (por ejemplo un dNTP o similar), y/o a un grupo fosfato de un nucleótido extremo en 2’ u otro nucleótido, mediante un enlace covalente amida, éster, tioéster, éter, tioéter, carbono-carbono u otro enlace. Los enlaces covalentes se forman típicamente en reacciones entre grupos electrofílicos y nucleofílicos de los marcadores y los nucleótidos. En algunas realizaciones, los marcadores y nucleótidos se conjugan directamente entre sí (por ejemplo mediante enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromáticos, o a través de enlaces carbono-nitrógeno, enlaces nitrógenonitrógeno, enlaces carbono-oxígeno, enlaces carbono-azufre, enlaces fósforo-oxígeno, enlaces fósforo-nitrógeno, etc.). Opcionalmente, un enlazador une el marcador a un nucleótido extremo en 2’ u otro nucleótido. En la conjugación de marcadores y nucleótidos pueden utilizarse o adaptarse una amplia variedad de enlazadores. En la presente invención se citan, sin carácter limitante, varios ejemplos de dichos enlazadores.

Esencialmente, se utiliza opcionalmente cualquier marcador para marcar los nucleótidos y nucleótidos utilizado en los oligonucleótidos descritos en la presente invención. En algunas realizaciones, por ejemplo, el marcador contiene un colorante fluorescente por ejemplo, un colorante con rodamina (por ejemplo, R6G, R110, TAMRA, ROX, etc.), un colorante con fluoresceína (por ejemplo, JOE, VIC, TET, HEX, FAM, etc.), un colorante con halofluoresceína, un colorante con cianina (por ejemplo, CY3, CY3.5, CY5, CY5.5, etc.), un colorante BODIPY® (por ejemplo, FL, 530/550, TR, TMR, etc.), un colorante ALEXA FLUOR® (por ejemplo, 488, 532, 546, 568, 594, 555, 653, 647, 660, 680, etc.), un colorante con diclororodamina, un colorante de transferencia de energía (por ejemplo, los colorantes BIGDYE™ v 1, los colorantes BIGDYE™ v 2, los colorantes BIGDYE™ v 3, etc.), los colorantes Lucifer (por ejemplo, Lucifer amarillo, etc.), CASCADE BLUE®, Oregon Green, y similares. En, por ejemplo, Haugland, Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (Manual de sondas fluorescentes y productos en investigación), 9ª Ed. (2003) y las actualizaciones del mismo se proporcionan detalles adicionales relativos a los colorantes fluorescentes. Los colorantes fluorescentes en general están fácilmente disponibles en diversos suministradores comerciales, por ejemplo, Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, EE.UU.), Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, EE.UU.), Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.), etc. Como otros marcadores se incluyen, por ejemplo, la biotina, los marcadores fluorescentes débiles (Yin y otros (2003) Appl Environ Microbiol. 69(7):3938, Babendure y otros (2003) Anal. Biochem. 317(1):1, y Jankowiak y otros (2003) Chem Res Toxicol. 16(3): 304), marcadores no fluorescentes, marcadores colorimétricos, marcadores quimioluminiscentes (Wilson y otros (2003) Analyst. 128(5):480 y Roda y otros (2003) Luminescence 18(2):72), marcadores Raman, marcadores electroquímicos, marcadores bioluminiscentes (Kitayama y otros (2003) Photochem Photobiol. 77(3):333, Arakawa y otros (2003) Anal. Biochem. 314(2):206, y Maeda (2003) J. Pharm. Biomed. Anal. 30(6):1725), fracciones dadoras no fluorescentes (tal como se describe, por ejemplo en la Solicitud internacional nº WO 2007/039301, titulada "NON-FLUORESCENT ENERGY TRANSFER," (“Transferencia de energía no fluorescente”) publicada el 12 de abril de 2007 por Will y otros), y un reactivo marcador alfa-metil-PEG (tal como se describe en, por ejemplo, la Solicitud de patente U.S. nº 10/719.257, titulada "DETECTABLE LABELED NUCLEOSIDE ANALOGS AND METHODS OF USE THEREOF" (“Análogos de nucleósidos marcados detectables, y métodos de utilización de los mismos”), ahora Patente U.S. 7.220.847publicada el 22 de mayo de 2007 concedida a Bodepudi y otros). En algunas realizaciones, el marcador contiene un radioisótopo, como por ejemplo, H3, C14, Na22, P32, P33, S35, K42, Ca45, Fe59, I125, Hg203, o similares. A modo de mayor ejemplificación, el marcador también incluye opcionalmente al menos un grupo modificador de masa. Por ejemplo, el grupo modificador de masa se selecciona opcionalmente entre, por ejemplo, deuterio, F, Cl, Br, I, S, N3, XY, CH3, SPO4, BH3, SiY3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5), Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3,(CH2)nCH3, (CH2)nNY2, CH2CONY2, (CH2)nOH, CH2F, CHF2, CF3, un grupo fósforotioato, en el que X es O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2)nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-alquilo) y OP(O-alquilo), n es un número entero entre 1 y 20 ambos inclusive; e, Y es H, deuterio un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo arilo, un grupo polioximetileno, un grupo polioximetileno monoalquilado, un grupo polietilénimina, un grupo poliamida, un grupo poliéster, un grupo sililo alquilado, un heteroóligo, un poliaminoácido, un grupo heteroóligo/poliaminoácido, o un grupo politilénglicol. Por ejemplo, en Sterky y otros (2000) "Sequence analysis of genes and genomes," (“Análisis de secuencias de genes y genomas”) J. Biotech. 76(2000):1, Sensen (Ed.) Biotechnology. Volumen 5B, Genomics and Bioinformatics (“Genómica y bioinformática”) , John Wiley & Sons, Inc. (2001), y Sensen (Ed.) Essentials of Genomics and Bioinformatics (“Lo esencial en genómica y bioinformática”), John Wiley & Sons, Inc. (2002) se proporcionan detalles adicionales en relación con el marcado de ácidos nucleicos y el análisis de secuencias.

Se encuentran disponibles una amplia gama de enlazadores para enlazar los marcadores a los ácidos nucleicos que será evidente para los expertos en la técnica. Un enlazador posee generalmente una estructura que es adecuada desde un punto de vista estérico y electrónico para incorporarse a un ácido nucleico. Opcionalmente, los enlazadores incluyen, por ejemplo, una fracción éter, tioéter, carboxamida, sulfonamida, urea, uretano, hidracina u otras. A modo de mayor ejemplificación, los enlazadores incluyen generalmente entre aproximadamente uno y aproximadamente 25 átomos no hidrógeno seleccionados entre, por ejemplo, C, N, O, P, Si, S, etc., y comprenden esencialmente cualquier combinación de, por ejemplo, éter, tioéter, amina, éster, carboxamida, sulfonamida, enlaces hidracida y enlaces aromáticos o heteroaromáticos. En algunas realizaciones, por ejemplo, el enlazador contiene una combinación de enlaces carbono-carbono sencillos y enlaces carboxamida o tioéter. Aunque opcionalmente se utilizan segmentos lineales más largos de enlazadores, el segmento lineal más largo contiene típicamente entre aproximadamente tres y aproximadamente 15 átomos no hidrógeno, incluyendo uno o más heteroátomos.

Como ejemplos no limitantes de fracciones enlazadoras se incluyen grupos (por ejemplo funcionalizados) o no substituidos, tales como los enlazadores imidazol/biotina, grupos polimetileno, grupos arileno, grupos alquilarileno, grupos arilenalquilo, grupos ariltio, grupos amido alquilo, grupos alquinilalquilo, grupos alquenil alquilo, grupos alquilo, grupos alcoxi, grupos tio, grupos amino alquilo, fosfatos derivados con morfolina, ácidos péptido nucleicos (por ejemplo N-(2-aminoetil)glicina, etc.), y similares. En, por ejemplo, la Patente U.S. nº 6.339.392 concedida a Haugland y otros, la patente U.S. nº 5.047.519 concedida a Hobbs, Jr. y otros, la patente U.S. nº 4.711.958 concedida a Iizuka y otros, la patente U.S. nº 5.175.269 concedida a Stavrianopoulos, la patente U.S. nº 4.711.955 concedida a Ward y otros, la patente U.S. nº 5,241,060 concedida a Engelhardt y otros, la Patente U.S. nº 5.328.824 concedida a Ward y otros, y la Publicación de patente U.S. nº 2002/0151711 por Khan y otros se describen con mayor detalle algunos de estos enlazadores. Se proporcionan datos adicionales relativos a enlazadores y al marcado de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques (“Técnicas de bioconjugación”), Elsevier Science (1996). En algunas realizaciones, los enlazadores adecuados contienen fracciones fotoescindibles, como fracciones 2-nitrobencilo, fracciones 2-nitrobencilo alfa-sustituidas (por ejemplo, fracciones 1-(2-nitrofenil)etilo), fracciones 3,5-dimetoxibencilo ,ácido tiohidroxámico, fracciones 7-nitroindolina, fracciones 9-fenilxantilo, fracciones benzoina , fracciones hidroxifenacilo , fracciones NHS-ASA , y similares. Los enlazadores se describen de forma más pormenorizada en, por ejemplo, la publicación de Patente U.S. nº 2003/0099972 concedida a Olejnik y otros. En algunas realizaciones, los enlazadores incluyen metales tales como átomos de platino. Estos enlazadores se describen con mayor detalle, por ejemplo, en la Patente U.S. nº 5.714.327 concedida a Houthoff y otros. Existen diversos enlazadores de diversas longitudes disponibles comercialmente de varios suministradores incluyendo, por ejemplo, Qiagen - Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA, EE.UU.), BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA, EE.UU.), and Molecular Bio-Sciences (Boulder, CO, EE.UU.).

VII. MEZCLAS DE REACCION

Se dan a conocer varias mezclas de reacción diferentes que pueden ser utilizadas en una amplia diversidad de aplicaciones, particularmente cuando es deseable la retirada de nucleótidos extremos en 2’ de los ácidos nucleicos, polimerizar nucleótidos, y/o amplificar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, por ejemplo, las mezclas de reacción se utilizan en la realización de ensayos de amplificación/detección homogéneos (por ejemplo, monitorización con PCR en tiempo real), o en la detección de mutaciones o el genotipado de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, se agrupan varios cebadores y/o sondas en mezclas de reacción para su utilización en aplicaciones que incluyen formatos múltiples. Muchas de estas aplicaciones se describen con mayor detalle más adelante o se referencian de otro modo en la presente invención.

Además de los oligonucleótidos bloqueados descritos en la presente invención, las mezclas de reacción también incluyen generalmente diversos reactivos útiles para, por ejemplo, la retirada de nucléotidos en 2’ de estos oligonucleótidos (por ejemplo, para producir oligonucleótidos extensibles o activados), la polimerización de nucleótidos, las reacciones de amplificación/detección de ácidos nucleicos (por ejemplo, monitorización con PCR en tiempo real o ensayos nucleasa-5’), y similares. Como tipos ejemplares de estos otros reactivos se incluyen, por ejemplo los ácidos nucleicos molde o diana (obtenidos o derivados, por ejemplo, esencialmente de cualquier fuente), el pirofosfato, modificadores de la emisión de luz biocatalizadores (por ejemplo, ADN polimerasas, etc.), tampones, sales, amplicones, glicerol, iones metal (por ejemplo Mg+2, etc.), dimetil sulfóxido (DMSO), poli rA (por ejemplo, como portador de ácidos nucleicos para dianas con un número bajo de copias), uracil N-glicosilasa (UNG) (por ejemplo, para proteger contra la contaminación residual). En algunas aplicaciones de cinética basadas en PCR, las mezclas de reacción también incluyen sondas que facilitan la detección de productos de amplificación. Como ejemplos de sondas utilizadas en estos procesos se incluyen, por ejemplo, sondas de hibridación, sondas nucleasa-5’ y/o sondas en horquilla. Más adelante se describen en mayor detalle la amplificación y detección de ácidos nucleicos, así como otros métodos.

Tal como se comenta en la presente invención, se utilizan en las mezclas de reacción dadas a conocer, diversos modificadores de la emisión de luz. Típicamente, los modificadores de la emisión de luz son compuestos de unión a ácidos nucleicos solubles capaces de modificar la emisión de luz desde oligonucléotidos marcados, tales como cebadores, sondas nucleasa-5’, sondas de hibridación, sondas en horquilla o similares, para, por ejemplo, reducir la emisión de luz basal o residual desde estos ácidos nucleicos marcados, entre otras aplicaciones. En algunas realizaciones, por ejemplo, estos modificadores de la emisión de luz incluyen diversos colorantes diazina y tiazina. Como colorantes diazina ejemplares que pueden ser utilizados como modificadores de la emisión de luz se incluyen, por ejemplo, los colorantes azocarmina (por ejemplo, la azocarmina A, azocarmina B (C28H17N3O9S3Na2), azocarmina G (C28H18N3O6S2Na), etc.), colorante fenazina, colorantes oxazina (por ejemplo, Celestina blue (C17H18ClN3O4), etc.), cloruro de dietilsafraninazodimetilanilina (es decir, Janus Green B o Diazina Green 5 (C30H31N6Cl)), y similares. Para una mayor ejemplificación, se incluyen como colorantes tiazina que pueden ser utilizados como modificadores de la emisión de luz, por ejemplo, al azul de metileno (C16H18ClN3S), el verde de metileno (C16H17ClN4O2S), tionina (C12H10ClN3S), sim-dimetiltionina, toluidina, azul O (C15H16N3SCl), azul de metileno nuevo (C18H22ClN3S), violeta de metileno bemthsen, azur A (C14H14ClN3S), azur B (C15H16ClN3S), azur C (C13H12ClN3S), y similares. También se describen modificadores de la emisión de la luz en, por ejemplo, la solicitud de patente U.S. nº 2007/0020664, titulada "LIGHT EMISSION MODIFIERS AND THEIR USES IN NUCLEIC ACID DETECTION, AMPLIFICATION AND ANALYSIS," (“Modificadores de la emisión de luz y sus usos en la detección, amplificación y análisis de ácidos nucleicos”) depositada el 23 de junio de 2006 por Gupta y otros.

Las mezclas de reacción generalmente se producen mediante la combinación de los nucléotidos, cebadores y/o sondas seleccionados, tal como se ha descrito previamente, con cantidades de otros reactivos que son suficientes para llevar a cabo la aplicación concreta seleccionada. Las cantidades de reactivos suficientes para llevar a cabo cada una de las aplicaciones será evidente a los expertos en la técnica según el método seleccionado. A modo de ejemplo, sin embargo, en estas mezclas de reacción los ácidos nucleicos cebadores y los nucleótidos extensibles (por ejemplo, cuatro dNTPs (dGTP, dCTP, dATP, dTTP)) están típicamente presentes todos ellos en un gran exceso molar. Además, cualquiera de los cuatro NTPs extensibles puede utilizarse con algunas enzimas descritas en la presente invención. Los nucleótidos extensibles y/o extremos están disponibles fácilmente en diversos suministradores comerciales incluyendo, por ejemplo, Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN, EE.UU.), Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, EE.UU.), y Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.).

Los oligonucleótidos bloqueados descritos en la presente invención son típicamente no extensibles por al menos un biocatalizador seleccionado entre, por ejemplo, una ADN polimerasa G46E E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6 , una polimerasa 'ZO5R (en la que R se refiere a una mutación E678G), una ADN polimerasa E615G Taq , una polimerasa Thermus flavus, una polimerasa TMA25, una polimerasa E678G TMA-25, una polimerasa TMA-30, una polimerasa E678G TMA-30, una ADN polimerasa Tth, una polimerasa Thermus especie SPS-17, una polimerasa E615G Taq, una polimerasa Thermus ZO5R (en la que R se refiere a una mutación E678G), una ADN polimerasa T7, una ADN polimerasa Kornberg I, una ADN polimerasa Klenow, una ADN polimerasa Taq, una ADN polimerasa Microcócica, una ADN polimerasa alfa, una transcriptasa inversa, una transcriptasa inversa AMV, una transcriptasa inversa M-MuLV, una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una ARN polimerasa de E. coli, una ARN polimerasa SP6 , una ARN polimerasa T3, una ADN polimerasa T4, una ARN polimerasa T7, una ARN polimerasa II, una transferasa terminal, un polinucleótido fosforolasa, una ADN polimerasa que incorpora ribonucleótidos, y similares. Además, muchos de estos biocatalizadores incluyen actividad fosforólisis y por consiguiente, pueden catalizar la retirada de nucleótidos de ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos extremos en 2’ de oligonucleótidos bloqueados en algunas realizaciones). Las secuencia de algunos de estos biocatalizadores está disponible públicamente de diversas fuentes, incluyendo por ejemplo, GenBank® y similares.

Tal como se ha mencionado más arriba, en algunas realizaciones, el enzima está modificado. Como ejemplos de enzimas modificados se incluyen, por ejemplo, una ADN polimerasa G46E E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, una ADN polimerasa E615G Taq, y similares. Estos enzimas modificados contienen típicamente mutaciones que incrementan la incorporación de ribonucleótidos, que incrementan la incorporación de análogos de ribonucleótidos modificados en 2’ (por ejemplo, nucleótidos extremos en 2’), y/o reducen o retiran la actividad exonucleasa 5’-3’, por ejemplo en comparación con un enzima que carece de una o más de estas mutaciones. También se proporcionan detalles adicionales relativos a biocatalizadores útiles en, por ejemplo, Solicitud de patente U.S. nº 2009/0148891, titulada "MUTANT DNA POLYMERASES AND RELATED METHODS", “ADN polimerasas mutadas y métodos relacionados”) depositada el 18 de octubre de 2006 por Bauer y otros, Patente U.S. nº 5.939.292, titulada "THERMOSTABLE DNA POLYMERASES HAVING REDUCED DISCRIMINATION AGAINST RIBONTPS," (“ADN polimerasas termoestables que poseen una discriminación reducida frente riboNTPs”) publicada el 17 de agosto de 1999 concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 4.889.818, titulada "PURIFIED TERMOSTABLE ENZYME," (“Enzima termoestable modificado”) publicada el 26 de diciembre de 1989 concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 5.374.553, titulada "DNA ENCODING A THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA," (“ADN que codifica un enzima polimerasa de ácido nucleico termoestable de Thermotoga Maritima”) publicada el 20 de diciembre de 1994, concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 5.420.029, titulada "MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA," (“Enzima polimerasa de ácido nucleico termoestable mutada de Thermotoga Maritima”) publicada el 30 de mayo de 1995, concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 5.455.170, titulada "MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05," (“Enzima polimerasa de ácido nucleico termoestable mutada de la especie Thermus Z05”) publicada el 3 de octubre de 1995, concedida a Abramson y otros, Patente

U.S.

nº 5.466.591, titulada "5’ TO3’ EXONUCLEASE MUTATIONS OF THERMOSTABLE DNA POLYMERASES," (“Mutaciones de la exonucleasa 5’ a 3’ de las ADN polimerasas termoestables”), publicada el 14 de noviembre de 1995, concedida a Abramson y otros, Patente U.S. nº 5.618.711, titulada "RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FOR THERMUS THERMOPHILUS DNA POLYMERASE," (“Vectores de expresión recombinante y métodos de purificación de la ADN polimerasa de Thermus Thermophilus”) publicada el 8 de abril de 1997, concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 5.624.833, titulada "PURIFIED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA" (“Enzima polimerasa de ácido nucleico termoestable purificado de Thermotoga Maritima") publicada el 29 1997, concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 5.674.738, titulada "DNA ENCODING TERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05," (“ADN que codifica un enzima polimerasa de ácido nucleico termoestable purificada de la especie Thermus Z05") publicada el 7 de octubre de 1997, concedida a Abramson y otros, Patente

U.S.

nº 5.789.224, titulada "RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FOR THERMUS THERMOPHILUS DNA POLYMERASE," (“Vectores de expresión recombinante y métodos de purificación de la ADN polimerasa de Thermus Thermophilus”) publicada el 4 de agosto de, 1998 concedida a Gelfand y otros, Patente U.S. nº 5.795.762, titulada "5’ TO 3’ EXONUCLEASE MUTATIONS OF THERMOSTABLE DNA POLYMERASES” (“Mutaciones de la exonucleasa 5’ a 3’ de las ADN polimerasas termoestables” publicada el 18 de agosto de 1998, concedida a Abramson y otros, Publicación de solicitud de patente U.S. nº US 2002/0012970, titulada "HIGH TEMPERATURE REVERSE TRANSCRIPTION USING MUTANT DNA POLYMERASES," (“Transcripción inversa a alta temperatura utilizando ADN polimerasas mutadas”) publicada el 31 de enero de 2002 por Smith y otros, Publicación de solicitud de patente U.S. nº 2004/0005599, ahora Patente U.S. nº 7.148.049, titulada "THERMOSTABLE OR THERMOACTIVE DNA POLYMERASE MOLECULES WITH ATTENUATED 3’-5’ EXONUCLEASE ACTIVITY" (“ Moléculas ADN polimerasa termoestables o termoactivas con actividad exonucleasa 3’-5’ atenuada”) publicada el 12 de diciembre de 2006, concedida a Schoenbrunner y otros.

La producción de enzimas modificados con, por ejemplo, un incremento de la eficiencia de incorporación de nucleótidos extremos en 2’ o en otras propiedades deseadas puede conseguirse mediante diversos procesos incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis de sitio dirigido, modificación química etc. Más específicamente, la mutagénesis de sitio dirigido se consigue generalmente mediante una mutagénesis específica de sitio dirigida por cebadores. Esta técnica se lleva a cabo típicamente utilizando un oligonucleótido cebador sintético complementario al ADN de fago de una cadena que se desea mutar con la excepción de un desapareamiento limitado que representa la mutación deseada. Brevemente, el oligonucleótido sintético se utiliza como cebador para dirigir la síntesis de la cadena complementaria del plásmido o fago, y el ADN de doble cadena resultante se transforma en una bacteria huésped que contiene el fago. La bacteria resultante puede utilizarse para realizar, por ejemplo, el análisis de secuencia del ADN o como sonda de hibridación para identificar aquellas placas que contienen la secuencia del gen mutado deseada. Para una mayor ejemplificación, también pueden utilizarse muchas otras estrategias para modificar ácidos nucleicos, tales como los métodos de “PCR recombinante”.

En la puesta en práctica de aspectos de la presente invención (por ejemplo en la producción de enzimas modificados, la realización de las reacciones de amplificación etc.), se utilizan opcionalmente diversas técnicas de biología molecular y de ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas y se describen respectivamente, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (“Protocolos actuales de biología molecular”), Volúmenes I, II y III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook y otros, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (“Clonación molecular: Un manual de laboratorio”) , 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Guía de técnicas de clonación molecular. Métodos en enzimología”) volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger), DNA Clowning: A Practical Approach (Clonación de ADN: Un enfoque práctico”) Volúmenes I y II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (“Síntesis de oligonucleótidos”), 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (“Hibridación de ácidos nucleicos”), 1985, (Hames y Higgins); Transcription and Translation (“Transcripción y traducción”), 1984 (Hames y Higgins eds.); Animal Cell Culture (“Cultivo de células animales”), 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes (“Enzimas y células inmovilizadas”), 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning (“Una guía práctica de clonación molecular”) series, Methods in Enzymology (“Métodos en enzimilogía”), (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (“Vectores de transferencia génica para células de mamífero”), 1987 (J. H. Miller y M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); y Methods in Enzymology (Métodos en enzimología”) Vol. 154 y Vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds.,respectivamente)

VIII. METODOS BASADOS EN LA PAP

La presente invención también da a conocer métodos para la utilización de los oligonucleótidos bloqueados descritos en la misma. En algunas realizaciones, por ejemplo, estos oligonucleótidos se utilizan para realizar ensayos en los que se detectan ácidos nucleicos diana, por ejemplo, para proporcionar información diagnóstica, genética u otra de individuos de los que se derivan dichas dianas. Estos aspectos también se muestran en los ejemplos aportados más adelante.

Los oligonucleótidos descritos en la presente invención opcionalmente se utilizan o se adaptan para ser utilizados en esencialmente cualquier aplicación que suponga la retirada de nucleótidos extremos en 2’ de estos ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante el proceso de la pirofosforólisis. Como ejemplos de tipos de aplicaciones relativas a ácidos nucleicos se incluyen el análisis de la estructura y conformación de ácidos nucleicos, los ensayos de PCR en tiempo real, y la detección de SNPs (Myakishev y otros (2001) "High-throughput SNP genotyping by allelespecific PCR with universal energy-transfer-labeled primers," (“Genotipado de SNPs de alto rendimiento mediante PCR específica de alelo con cebadores marcados mediante transferencia de energía universal”) Genome Res 11:163-169, Lee y otros (1999) "Seven-color, homogeneous detection of six PCR products," (“Detección homogénea en siete colores de seis productos de PCR”). Biotechniques 27:342-349, Thelwell y otros (2000) "Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection," (“Modo de acción y aplicación de los cebadores Scorpion en la detección de mutaciones”) Nucleic Acids Res 28:3752-3761, Whitcombe y otros (1999) "Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence," (“Detección de productos de PCR utilizando fluorescencia y amplicones de auto-cebado”) Nat Biotechnol 17:804-807, Heid y otros (1996) "Real time quantitative PCR," (PCR cuantitativa en tiempo real”) Genome Res 6:986-994, Nazarenko y otros (1997) "A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer," (“Un formato de tubo cerrado para la amplificación y detección de ADN basada en la transferencia de energía) Nucleic Acids Res 25:2516-2521); la detección de la hibridación de ácidos nucleicos (Parkhurst y otros (1995) "Kinetic studies by fluorescence resonance energy transfer employing a double-labeled oligonucleotide: hybridization to the oligonucleotide complement and to single-stranded DNA," (“Estudios cinéticos mediante transferencia de energía resonante utilizando un oligonucleótido con doble marcado: hibridación al complemento oligonucleótido y al ADN de cadena única”). Biochemistry 34:285-292, Tyagi y otros (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization," (“Balizas moleculares: sondas que emiten fluorescencia al hibridarse”), Nat Biotechnol 14:303-308, Tyagi y otros (1998) "Multicolor molecular beacons for allele discrimination," (“Balizas moleculares multicolores para la discriminación de alelos”), Nat Biotechnol 16:49-53, Sixou y otros (1994) "Intracellular oligonucleotide hybridization detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET)," (“Hibridación de oligonucleótidos intracelulares detectada mediante transferencia de energía resonante fluorescente (FRET)”), Nucleic Acids Res 22:662-668, y Cardullo y otros (1988) "Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer," (“Detección de la hibridación de ácidos nucleicos mediante transferencia de energía resonante fluorescente no radiactiva”), Proc Natl Acad Sci EE.UU. 85:8790-8794); los ensayos de extensión de cebadores para la detección de mutaciones (Chen y otros (1997) "Fluorescence energy transfer detection as a homogeneous DNA diagnostic method," (“Detección de la transferencia de energía fluorescente como un método de diagnóstico de ADN homogéneo”), Proc Natl Acad Sci EE.UU. 94:10756-10761); y la secuenciación automatizada del ADN (Woolley y otros (1995) "Ultra-high-speed DNA sequencing using capillary electrophoresis chips," (“Secuenciación ultrarrápida de ADN utilizando chips de electroforesis capilar”), Anal Chem 67:3676-3680, Hung y otros (1998) "Comparison of fluorescence energy transfer primers with different donor-acceptor dye combinations," (“Comparación de cebadores de transferencia de energía fluorescente con diferentes combinaciones de colorantes dador-aceptor”), Anal Biochem 255:32-38, y Ju y otros (1995) "Fluorescence energy transfer dyelabeled primers for DNA sequencing and analysis," (“Cebadores marcados con colorantes de transferencia de energía fluorescente para el análisis y secuenciación del ADN”), Proc Natl Acad Sci EE.UU. 92:4347-4351). También se describen aspectos relativos a la PAP, que pueden adaptarse para se utilizados con los oligonucleótidos descritos en la presente invención en, por ejemplo, la Patente U.S. nº 7.033.763, titulada "PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATED POLYMERIZATION (PAP)" (“Polimerización activada por pirofosforólisis (PAP)”) publicada el 25 de abril de 2006, concedida a Liu y otros, la Patente U.S.. nº 6.534.269, titulada "PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATED POLYMERIZATION (PAP): APPLICATION TO ALLELE-SPECIFIC AMPLIFICATION AND NUCLEIC ACID SEQUENCE DETERMINATION" (“Polimerización activada por pirofosforólisis (PAP): aplicación a la amplificación específica de alelo y la determinación de la secuencia de ácidos nucleicos”) publicada el 18 de marzo de 2003 concedida a Liu y otros, Patente U.S. nº 7,238,480, titulada "PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATED POLYMERIZATION (PAP)" (“Polimerización activada por pirofosforólisis (PAP)”) publicada el 3 de julio de 2007 concedida a Liu y otros.

Para una mayor ejemplificación, como ejemplos de tipos generales de tecnologías de análisis que pueden utilizarse

o adaptarse para ser utilizadas para analizar ácidos nucleicos diana de o a partir de, por ejemplo, mezclas de reacción, se incluyen diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos. Una característica común entre los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos es que típicamente están diseñados para amplificar secuencias de ácidos nucleicos específicas del organismo que se está detectando. Los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos poseen una mayor sensibilidad que otras estrategias de análisis de ácidos nucleicos. Esta sensibilidad, que mejora aún más con la utilización de los oligonucleótidos descritos en la presente invención, es atribuible típicamente a su capacidad para producir una señal positiva a partir de poco material como una sola copia del ácido nucleico diana. Los métodos de amplificación que opcionalmente se utilizan o adaptan para ser utilizados en la detección de ácidos nucleicos incluye, por ejemplo, diversos métodos de amplificación mediados por polimerasas, ligasas o transcriptasas inversas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), y/o la PCR de transcripción inversa (RT-PCR). Pueden hallarse detalles adicionales respecto a la utilización de estos y otros métodos de amplificación y de diversas estrategias de preparación de muestras para estos ensayos en cualquiera de diversos textos estándar, incluyendo, por ejemplo, Berger, Sambrook, Ausubel 1 y 2, e Innis, citados más arriba.

Los diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos comerciales que pueden opcionalmente adaptarse para ser utilizados con los reactivos y métodos de la presente invención difieren en general en sus métodos de amplificación y sus secuencias de ácidos nucleicos diana. Como ejemplos de estos ensayos comerciales se incluyen ensayos de sondas de hibridación (por ejemplo, utilizando el sistema LightCycler® y los ensayos AMPLICOR® y COBAS AMPLICOR® (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE.UU.), que utilizan reacciones en cadena de la polimerasa (PCR); el ensayo LCx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EE.UU.), que utiliza reacciones en cadena de la ligasa (LCR); el ensayo BDProbeTec™ ET (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, N.J., EE.UU.), que utiliza la amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA); y el ensayo APTIMA™ (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA, EE.UU.), que utiliza la amplificación mediada por transcripción (TMA). La amplificación y detección de ácidos nucleicos se describe más adelante en mayor detalle.

En algunas realizaciones se utilizan, por ejemplo, sondas nucleasa-5’ en diversas reacciones de la nucleasa-5’. Existen diversos ensayos de la nucleasa-5’ bien conocidos por los expertos en la técnica. También se describen ejemplos de dichas reacciones en, por ejemplo la Patente U.S.. nº 6.214.979, titulada "HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM," publicada el 10 de abril de 2001, concedida a Gelfand y otros, la Patente U.S.. nº 5.804.375, titulada "REACTION MIXTURES FOR DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACIDS," (“Mezclas de reacción para la detección de ácidos nucleicos diana”) publicada el 8 de septiembre de 1998 concedida a Gelfand y otros, la Patente U.S.. nº 5.487.972, titulada "NUCLEIC ACID DETECTION BY THE 5’-3’ EXONUCLEASE ACTIVITY OF POLYMERASES ACTING ON ADJACENTLY HYBRIDIZED OLIGONUCLEOTIDES," (“Detección de ácidos nucleicos mediante la actividad exonucleasa 5’-3’ de polimerasas que actúan en oligonucleótidos hibridados adyacentemente”), publicada el 30 de enero de 1996, concedida a Gelfand y otros, y la Patente U.S.. nº 5.210.015, titulada "HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE," (“Sistema de ensayo homogéneo utilizando la actividad nucleasa de una polimerasa de ácidos nucleicos”) publicada el 11 de mayo de 1993, concedida a Gelfand y otros.

Brevemente, a modo de ejemplo, en una reacción de la nucleasa-5’, un ácido nucleico diana se pone en contacto con un cebador y una sonda (por ejemplo una sonda nucleasa-5’) bajo condiciones en las que el cebador y la sonda se hibridan a una cadena del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana, el cebador y la sonda también se ponen en contacto con una polimerasa de ácidos nucleicos que posee actividad nucleasa 5’ a 3’. Las polimerasas de ácidos nucleicos que poseen actividad nucleasa 5’ a 3’ pueden escindir la sonda hibridada al ácido nucleico diana por debajo del cebador. El extremo 3’ del cebador proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa. La polimerasa unida escinde fragmentos de la sonda al hallar el extremo 5’ de la misma.

El cebador y la sonda pueden diseñarse de manera que se hibriden en estrecha proximidad en el ácido nucleico de manera que la unión de la polimerasa de ácidos nucleicos al extremo 3’ del cebador la pone en contacto con el extremo 5’ de la sonda en ausencia de extensión del cebador. El término “escisión independiente de la polimerización” se refiere a este proceso. De forma alternativa, si el cebador y la sonda se hibridan en regiones más distantes del ácido nucleico diana, típicamente se produce polimerización antes de que la polimerasa de ácidos nucleicos encuentre el extremo 5’ de la sonda. A medida que continúa la polimerización, la polimerasa escinde progresivamente fragmentos desde el extremo 5’ de la sonda. Esta escisión continúa hasta que el resto de la sonda queda desestabilizado hasta un grado en el que se disocia de la molécula molde. El término “escisión dependiente de la polimerización” se refiere a este proceso.

Una ventaja de la escisión independiente de la polimerización reside en la eliminación de la necesidad de amplificación del ácido nucleico. Siempre y cuando el cebador y la sonda estén unidos al ácido nucleico de forma adyacente, pueden producirse ciclos secuenciales de hibridación y escisión de fragmentos de la sonda. Por lo tanto, puede generarse una cantidad suficiente de fragmentos, haciendo posible la detección en ausencia de polimerización.

En ambos procesos, se utiliza una muestra que se cree que contiene el ácido nucleico diana. En primer lugar, si es necesario, puede transcribirse inversamente el ácido nucleico diana contenido en la muestra en ADNc y a continuación desnaturalizarse, utilizando cualquier método de desnaturalización adecuado, incluyendo métodos físicos, químicos o enzimáticos, conocidos por los expertos en la técnica. Una estrategia física ejemplar para realizar la separación de cadenas es el calentamiento del ácido nucleico hasta que está completamente (>99%) desnaturalizado. La desnaturalización por calentamiento incluye típicamente temperaturas entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 105ºC (típicamente entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 98ºC, y más típicamente entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 95ºC), durante períodos de tiempo entre aproximadamente 1 segundo y aproximadamente 10 minutos (por ejemplo, entre pocos segundos y aproximadamente 1 minuto). Como alternativa a la desnaturalización, el ácido nucleico puede estar en la muestra en forma de ácido nucleico de una sola cadena, como por ejemplo cuando la muestra comprende virus ARN o ADN de cadena única.

La cadena de ácido nucleico diana desnaturalizado se incuba típicamente con un cebador y una sonda bajo condiciones de hibridación que permiten que la sonda y el cebador se unan a la cadena de ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, pueden utilizarse dos cebadores para amplificar el ácido nucleico. Los dos cebadores se seleccionan típicamente de manera que sus posiciones relativas a lo largo del ácido nucleico diana son tales que el producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando el producto de extensión se separa de su molde (complemento), sirve de molde para la extensión del otro cebador dando lugar a una cadena replicada de una longitud definida.

Dado que las cadenas complementarias son típicamente más largas que cualquiera de las sondas o cebadores, las cadenas poseen más puntos de contacto y por lo tanto poseen una mayor posibilidad de unirse entre sí en un período determinado de tiempo. Por consiguiente, se utiliza típicamente un exceso molar elevado de sonda y cebador para favorecer que el cebador y la sonda se hibriden por encima de la rehibridación de la cadena molde. En formatos multiplex, se utilizan típicamente múltiples sondas en un solo recipiente de reacción para detectar múltiples ácidos nucleicos diana, simultáneamente.

Los cebadores son en general de una longitud y complementariedad suficientes para unirse selectivamente a ácidos nucleicos diana bajo condiciones seleccionadas permitiendo que se produzca la escisión independiente de la polimerización o la escisión dependiente de la polimerización. La longitud y composición exactas del cebador dependerán de diversos factores, incluyendo la temperatura de la reacción de hibridación, el origen y composición del cebador, la proximidad del sitio de hibridación de la sonda al sitio de hibridación del cebador, y la relación entre las concentraciones de cebador y sonda. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador incluye típicamente aproximadamente entre 15 y 30 nucleótidos, aunque puede contener un número mayor

o menor de nucleótidos.

La sonda se hibrida generalmente a su ácido nucleico diana complementario antes de que la polimerasa de ácidos nucleicos encuentre aquella región del ácido nucleico diana, permitiendo así que la actividad nucleasa 5’ a 3’ del enzima escinda los fragmentos de la sonda. Para incrementar la posibilidad de que la sonda se hibride al ácido nucleico diana antes de que la polimerasa alcance esta región de hibridación, pueden utilizarse diversas técnicas. Por ejemplo, cebadores más cortos requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el ácido nucleico. Por lo tanto, puede diseñarse la sonda de manera que sea más larga que el cebador de manera que la sonda se hibride preferentemente al ácido nucleico diana a temperaturas más altas en comparación con la hibridación del cebador. Para una mayor ejemplificación, la composición de nucleótidos de la sonda puede seleccionarse para que posea un mayor contenido de G/C, y por consiguiente, una mayor estabilidad térmica que el cebador. Opcionalmente, pueden incorporarse nucleótidos modificados en cebadores o sondas para que tengan mayor o menor estabilidad térmica en comparación con los cebadores o sondas que poseen solamente nucleótidos no modificados. Más arriba se han descrito con mayor detalle nucleótidos modificados ejemplares. También pueden variarse los parámetros de termociclado para sacar partido de la estabilidad térmica diferencial entre la sonda y el cebador. Por ejemplo, siguiendo una etapa de desnaturalización por termociclado, puede introducirse una temperatura intermedia que permita que se una la sonda pero no el cebador. A continuación, puede reducirse aún más la temperatura para permitir la hibridación del cebador. Para favorecer preferentemente la unión de la sonda al cebador, también puede utilizarse un mayor exceso molar de concentración de sonda respecto al cebador. Dichas concentraciones de sonda se hallan típicamente en un rango entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20 veces superior a la concentración correspondiente de cebador, que generalmente está entre aproximadamente 0,5 y 5 x 10-7 M.

La extensión dependiente de molde de los cebadores está generalmente catalizada por un biocatalizador (por ejemplo una polimerasa) en presencia de cantidades adecuadas de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) o análogos en una mezcla de reacción que también incluye sales, cationes metal y tampones adecuados. Las mezclas de reacción se han descrito en mayor detalle más arriba. Son biocatalizadores adecuados los enzimas que se sabe que catalizan la síntesis de ADN dependiente de cebadores y moldes y poseen actividad nucleasa 5’ a 3’. Como ADN polimerasas de este tipo se incluyen la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa Tth, la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, la ADN polimerasa Taq, la ADN polimerasa Thermus sp. ZO5, la ADN polimerasa de Thermatoga maritima, la ADN polimerasa de Thermatoga neopolitana, y la ADN polimerasa de Thermosipho africanus, así como otros mencionados en la presente invención o conocidos de otro modo por los expertos en la técnica. Las condiciones de reacción para la catalización de la síntesis de ADN con estas ADN polimerasas, son bien conocidas en esta técnica. Típicamente, el biocatalizador escinde eficientemente la sonda y libera fragmentos marcados de manera que se genera directa o indirectamente una señal detectable.

Los productos de la síntesis son generalmente moléculas dúplex que incluyen cadenas molde y las cadenas de extensión de los cebadores. Los subproductos de esta síntesis son fragmentos de sonda, que pueden incluir una mezcla de mononucleótidos, dinucleótidos y nucleótidos más grandes. Los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación de sondas y cebadores, y extensión de cebadores y escisión de sondas dan lugar a la acumulación exponencial de la región definida por los cebadores y la acumulación exponencial de fragmentos marcados. Se realizan los ciclos suficientes para conseguir una cantidad detectable de fragmentos de sonda, que es generalmente varios órdenes de magnitud superior a la señal de fondo.

En algunas realizaciones, las reacciones de PCR se realizan como un proceso automatizado, que utiliza un enzima termoestable. En este proceso la mezcla de reacción se cicla a través de una etapa de desnaturalización, una etapa de hibridación de sondas y cebadores, y una etapa de síntesis en la cual se producen la escisión y el desplazamiento concurrentemente con la extensión del molde dependiente del cebador. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente invención se realizan utilizando un sistema. Dichos sistemas se describen en mayor detalle más adelante. Opcionalmente, pueden utilizarse cicladores térmicos, tales como los disponibles comercialmente en por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.), que están diseñados para ser utilizados con enzimas termoestables.

Las polimerasas termoestables se utilizan típicamente en procesos automatizados que efectúan la desnaturalización de productos de extensión de doble cadena mediante su exposición a temperaturas elevadas (por ejemplo, aproximadamente 95ºC) durante el ciclo de PCR. Por ejemplo, en la Patente U.S. nº 4.889.818, titulada "PURIFIED THERMOSTABLE ENZYME," (“Enzima termoestable purificado”) publicado el 26 de diciembre de 1989 concedida a Gelfand y otros, da a conocer un enzima termoestable representativo aislado de Thermus aquaticus. Como polimerasas termoestables representativas adicionales se incluyen, por ejemplo, las polimerasas extraídas de las bacterias termoestables Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (que posee una temperatura óptima algo menor que las otras mencionadas) Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga maritima, Thermatoga neopolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus littoralis, y Methanothermus fervidus.

La hibridación de sondas a los ácidos nucleicos diana puede conseguirse seleccionando unas condiciones de hibridación adecuadas. La estabilidad del híbrido sonda: ácido nucleico diana se selecciona típicamente para que sea compatible con las condiciones de ensayo y lavado de manera que solamente se formen híbridos detectables y estables entre las sondas y los ácidos nucleicos. La manipulación de uno o más de los diferentes parámetros de ensayo determina la sensibilidad y especificidad exactas de un ensayo de hibridación concreto.

Más específicamente, la hibridación entre bases complementarias de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, APN o combinaciones de los mismos), se produce bajo una amplia variedad de condiciones que varían en temperatura, concentración de sales, fuerza electrostática, y composición de los tampones. Se describen ejemplos de estas condiciones y métodos para aplicarlas en, por ejemplo, Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes (“Hibridación con sondas de ácidos nucleicos”), Vol. 24, Elsevier Science (1993), y Hames y Higgins, ver más arriba. La hibridación tiene lugar generalmente entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 70ºC, durante períodos entre aproximadamente un minuto y aproximadamente una hora, dependiendo de la naturaleza de la secuencia a hibridar y su longitud. Sin embargo, se reconoce que pueden producirse hibridaciones en segundos o en horas, dependiendo de las condiciones de la reacción. A modo de ejemplo, las condiciones típicas de reacción de hibridación para una mezcla de 20-meros es llevar la mezcla a una temperatura de 68ºC, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente (22ºC) durante cinco minutos o a temperaturas muy bajas tales como 2ºC. La hibridación entre los ácidos nucleicos puede facilitarse utilizando tampones tales como Tris-EDTA (TE), Tris-HCl y HEPES, soluciones salinas (por ejemplo, NaCl, KCl, MgCl2), u otras soluciones acuosas, reactivos y productos químicos. Como ejemplos de estos reactivos se incluyen proteínas de unión de una cadena tales como la proteína Rec A, la proteína del gen 32 del fago T4, proteína de una cadena de E. coli y proteínas de unión a las ranuras de los ácidos nucleicos mayores o menores. Otros ejemplos de dichos reactivos y productos químicos incluyen iones divalentes, iones polivalentes y substancias intercaladoras tales como el bromuro de etidio, actinomicina D, psoraleno y angelicina.

Esencialmente en la presente invención puede utilizarse cualquier método disponible para detectar ácidos nucleicos diana. Las estrategias habituales incluyen la detección de la amplificación en tiempo real con sondas nucleasa-5’, sondas de hibridación o sondas en horquilla (por ejemplo, balizas moleculares), la detección de marcadores incorporados en los cebadores de amplificación o en los mismos ácidos nucleicos amplificados, por ejemplo tras la separación electroforética de los productos de la amplificación de los marcadores no incorporados, los ensayos basados en la hibridación (por ejemplo, ensayos basados en matrices), y/o la detección de reactivos secundarios que se unen a los ácidos nucleicos. Estas estrategias generales también se describen en, por ejemplo Sambrook y Ausubel 1 y 2, citados más arriba.

Las sondas en horquilla, tales como las balizas moleculares, son oligonucleótidos diseñados para la detección y cuantificación en tiempo real de ácidos nucleicos diana. Los extremos 5’ y 3’ de las sondas en horquilla comprenden en general las fracciones de marcado, que confieren a la sonda la propiedad de ser detectable. En una realización ejemplar, uno de los extremos se une a una fracción reportera (por ejemplo, un colorante fluorescente) y el otro extremo se une a una fracción silenciadora capaz de silenciar la emisión fluorescente de la fracción reportera. Cuando la sonda en horquilla se encuentra libre en solución, es decir, no está hibridada a un segundo ácido nucleico, el tallo de la sonda está estabilizado por el apareamiento de bases complementarias. Este apareamiento auto-complementario da lugar a la estructura en “bucle de horquilla” de la sonda en la cual las fracciones reportera y silenciadora están próximas entre sí. En esta conformación, la fracción silenciadora silencia la fracción reportera. El bucle de una sonda en horquilla comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia a detectar en al ácido nucleico diana, de manera que la hibridación del bucle a su secuencia complementaria en la diana fuerza la disociación del tallo, distanciando de este modo las fracciones reportera y silenciadora entre sí. Ello deja de silenciar la fracción reportera, provocando un incremento de la fluorescencia proveniente de la sonda en horquilla.

Los detalles referentes a los métodos estándar de construcción y utilización de sondas en horquilla son generalmente conocidos por los expertos en la técnica y también se describen en, por ejemplo, Leone y otros (1995) "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA," (“Las balizas moleculares combinadas con la amplificación por NASBA permiten la detección homogénea en tiempo real de ARN”), Nucleic Acids Res. 26:2150-2155, Kostrikis y otros (1998) "Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles" (“Balizas moleculares: genotipado espectral de alelos humanos”), Science 279:1228-1229, Fang y otros (1999) "Designing a novel molecular beacon for surface-immobilized DNA hybridization studies" (“Diseño de una baliza molecular novedosa para estudios de hibridación de ADN inmovilizado en superficie”), J. Am. Chem. Soc. 121:2921-2922, y Marras y otros (1999) "Multiplex detection of single-nucleotide variation using molecular beacons" (“Detección multiplex de variaciones de un solo nucleótido utilizando balizas moleculares”), Genet. Anal. Biomol. Eng. 14:151-156. Diversos suministradores comerciales producen sondas en horquilla estándar y personalizadas que pueden adaptarse para ser utilizadas en los métodos descritos en la presente invención, incluyendo Oswel Research Products Ltd. (Reino UNido), Research Genetics (división de Invitrogen, Huntsville, AL, EE.UU.), y Midland Certified Reagent Company (Midland, TX, EE.UU.). También se encuentran disponibles comercialmente diversos kits que utilizan sondas en horquilla, tales como Sentinel™ Molecular Beacon Allelic Discrimination Kits de Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.) y diversos kits de Eurogentec SA (Bélgica) e Isogen Bioscience BV (Holanda). Estos Kits son también adaptados opcionalmente para su utilización en los métodos que se describen.

Las sondas de hibridación generalmente funcionan en pares y pueden utilizarse para efectuar diversos tipos de de detección de ácidos nucleicos diana en tiempo real, incluyendo la cuantificación, detección de mutaciones, multiplexado por temperatura de fusión (Tm) y multiplexado por color. En, por ejemplo, Brega y otros (2004) "Realtime PCR for dihydrofolate reductase gene single-nucleotide polymorphisms in Plasmodium vivax isolates," (“ PCR en tiempo real de polimorfismos de un solo nucleótido del gen de la dihidrofolato reductasa en aislados de Plasmodium vivax”) Antimicrob Agents Chemother. 48(7):2581-2587, Perelle y otros (2004) "A LightCycler real-time PCR hybridization probe assay for detecting food-borne thermophilic Campylobacter," (“Ensayo de sondas de hibridación de PCR en tiempo real LightCycler para detectar Campylobacter termofílico presente en alimentos”) Mol Cell Probes. 18(5):321-327, y Whiley y otros (2003) "Detection of Neisseria Meningitidis in clinical samples by a duplex real-time PCR targeting the porA and ctrA genes," (“Detección de Neisseria Meningitidis en muestras clínicas mediante una PCR en tiempo real dúplex dirigida a los genes porA y ctrA”) Mol Diagn. 7(3-4):141-145, también se describen aspectos de ciertos ensayos con sondas de hibridación.

Los ensayos con sondas de hibridación incluyen de forma típica la hibridación de un par de sondas marcadas con un ácido nucleico diana o molde con suficiente proximidad entre ellas para que se produzca transferencia de energía entre las fracciones marcadoras. Más específicamente, una sonda de hibridación (“sonda dadora”) del par incluye generalmente al menos una fracción dadora, mientras que la otra sonda de hibridación (“sonda aceptadora”) del par generalmente incluye al menos una fracción aceptadora (por ejemplo, LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, JA-270, CY5, o CY5.5). La fluorescencia emitida por las fracciones aceptadoras de las sondas de hibridación puede detectarse utilizando diversos métodos conocidos, incluyendo los utilizados en el sistema LightCycler® system (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE.UU.).

En otras realizaciones ejemplares de la utilización de los oligonucleótidos descritos en la presente invención, se utilizan cebadores marcados para realizar la detección de ácidos nucleicos diana en tiempo real. Las estrategias basadas en cebadores para la detección de ácidos nucleicos en tiempo real que pueden adaptarse para ser utilizadas con los oligonucleótidos descritos en la presente invención se describen también en, por ejemplo, Huang y otros (2004) "Realtime quantitative assay of telomerase activity using the duplex scorpion primer," “Ensayo cuantitativo en tiempo real de la actividad telomerasa utilizando un cebador Scorpion dúplex”) Biotechnol Lett. 26(11):891-895, Asselbergs y otros (2003) "Rapid detection of apoptosis through real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction measurement of the small cytoplasmic RNA Y1," (“Detección rápida de la apoptosis mediante la determinación por reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa en tiempo real del ARN pequeño Y1 citoplasmático”) Anal Biochem. 318(2):221-229, y Nuovo y otros (1999) "In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers," (“Amplificación in situ utilizando cebadores marcados con transferencia de energía universal”) J Histochem Cytochem. 47(3):273-280.

IX. SISTEMAS

También se dan a conocer sistemas que pueden utilizarse para realizar muchos ensayos diferentes. Los sistemas incluyen uno o más oligonucleótidos que contienen nucleótidos extremos en 2’. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos se disponen en soportes sólidos, mientras que en otras, se proporcionan en uno o más contenedores, por ejemplo, para ensayos realizados en solución. En algunas realizaciones, los sistemas también incluyen al menos un detector o componente de detección (por ejemplo, un espectrómetro) configurado para detectar señales detectables producidas en el contenedor o en el soporte. Además, los sistemas también incluyen opcionalmente al menos un modulador térmico (por ejemplo, un dispositivo de ciclado térmico) conectado operativamente a los contenedores o soportes sólidos para modular la temperatura en los contenedores o en los soportes sólidos, y/o al menos un componente de transferencia de fluidos (por ejemplo, una pipeta automática) que transfiere fluidos a y/o desde los contenedores o soportes sólidos, por ejemplo, para realizar uno o más ensayos de proximidad en los contenedores o en los soportes sólidos.

Los detectores están típicamente estructurados para detectar señales detectables producidas, por ejemplo, en o en proximidad a otro componente de un sistema de ensayo determinado (por ejemplo, en un contenedor y/o un soporte sólido). Los detectores de señal adecuados que se utilizan opcionalmente, o se adaptan para ser utilizados, en la presente invención detectan, por ejemplo, fluorescencia, fosforescencia, radioactividad, absorbancia, índice de refracción, luminiscencia o masa. Los detectores opcionalmente controlan una o varias señales por encima y/o por debajo de la ejecución de, por ejemplo, una etapa determinada del ensayo. Por ejemplo, los detectores controlan opcionalmente una serie de señales ópticas, que corresponden en posición a los resultados “en tiempo real”. Como ejemplos de detectores o sensores se incluyen los tubos fotomultiplicadores, las matrices CCD, los sensores ópticos, los sensores de temperatura, los sensores de presión, los sensores de pH, los sensores de conductividad o los detectores de barrido. De forma más específica, se incluyen como detectores ejemplares que se utilizan opcionalmente para ejecutar los métodos de la presente invención, por ejemplo, los detectores de dispersión de la luz resonante, los espectroscopios de emisión, los espectroscopios de fluorescencia, los espectroscopios de fosforescencia, los espectroscopios de luminiscencia, los espectrofotómetros y los fotómetros. También se describen detectores en, por ejemplo, Skoog y otros, Principles of Instrumental Analysis (“Principios de análisis instrumental”), 5ª Ed., Harcourt Brace College Publishers (1998), Currell, Analytical Instrumentation: Performance Characteristics and Quality (“Instrumentación analítica: Características de rendimiento y calidad”), John Wiley & Sons, Inc. (2000), Sharma y otros, Introduction to Fluorescence Spectroscopy (“Introducción a la espectroscopía de fluorescencia”), John Wiley & Sons, Inc. (1999), Valeur, Molecular Fluorescence: Principle and Applications (“Fluorescencia molecular: Principios y aplicaciones”), John Wiley & Sons, Inc. (2002), y Gore, Spectrophotometry and Spectrofluorimetry: A Practical Approach (“Espectrofotometría y espectrofluorimetría: Un enfoque práctico”), 2ª Ed., Oxford University Press (2000).

Los sistemas dados a conocer también incluyen típicamente controladores que están conectados operativamente a uno o más componentes (por ejemplo, detectores, moduladores térmicos, y/o componentes de transferencia de fluidos) del sistema para controlar el funcionamiento de los componentes. Más específicamente, los controladores se incluyen generalmente como componentes separados o formando parte de un sistema integrado que se utilizan, por ejemplo, para recibir datos desde los detectores, para ejecutar y/o regular la temperatura en los controladores, para ejecutar y/o regular el flujo de fluido hacia o desde los contenedores seleccionados. Los controladores y/u otros componentes del sistema opcionalmente se acoplan a un procesador programado, ordenador, dispositivo digital, aplicación informática u otro dispositivo lógico (que incluye, por ejemplo, un convertidor de analógico a digital o de digital a analógico) adecuado, que funciona dando instrucciones de funcionamiento de estos instrumentos, según instrucciones pre-programadas o introducidas por el usuario, recibir datos e información de estos instrumentos, e interpretar, manipular y notificar esta información al usuario. Los controladores adecuados son generalmente conocidos en la técnica y están disponibles por varios distribuidores comerciales.

Cualquier controlador u ordenador incluye opcionalmente un monitor, que habitualmente es una pantalla tipo tubo de rayos catódicos (“CRT”), una pantalla plana (por ejemplo, una pantalla de cristal líquido de matriz activa o una pantalla de cristal líquido) u otros. El circuito del ordenador se sitúa habitualmente en una caja, que incluye numerosos chips de circuitos integrados, tales como un microprocesador, una memoria, circuitos de interfaz, y otros. La caja también incluye opcionalmente una unidad de disco duro, una unidad de disquete, una unidad extraíble de alta capacidad tal como un CD-ROM gravable y otros elementos periféricos comunes. Los dispositivos de entrada, tales como un teclado o un ratón proporcionan opcionalmente entradas del usuario. Estos componentes se muestran en mayor detalle más adelante.

El ordenador incluye típicamente un software adecuado para recibir instrucciones del usuario, ya sea en forma de entrada por parte del usuario de un grupo de campos de parámetros, por ejemplo, en una GUI, o en forma de instrucciones pre-programadas, por ejemplo pre-programación de una serie de operaciones específicas diferentes. A continuación, el software convierte estas instrucciones al lenguaje adecuado para instruir la operación de uno o más controladores para llevar a cabo la operación deseada. A continuación, el ordenador recibe datos de, por ejemplo, los sensores/detectores incluidos en el sistema, e interpreta los datos y o bien los proporciona en un formato comprensible para el usuario o los utiliza para iniciar instrucciones de controlador adicionales, de acuerdo con la programación, como por ejemplo, controlar los reguladores del flujo de fluidos en respuesta a los datos de peso del fluido recibido de balanzas de peso.

La figura 4 es un esquema que muestra un sistema representativo que incluye un dispositivo lógico en el cual se incluyen diversos aspectos de la presente invención. Como entenderán los usuarios de la técnica de las enseñanzas aportadas por la presente invención, la misma está implementada opcionalmente en el hardware y/o software. En algunas realizaciones, diferentes aspectos de la invención se implementan ya sea en la lógica del lado del cliente o en la lógica del lado del servidor. Como se entenderá en la técnica, la presente invención o componentes de la misma pueden incluirse en un componente de un programa multimedia (por ejemplo, un componente multimedia fijo) que contiene instrucciones lógicas y/o datos que, cuando se introducen en un dispositivo informático configurado de forma adecuada, hace que el dispositivo actúe tal como se desea. Como se entenderá en la técnica, un multimedia fijo que contiene instrucciones lógicas puede ser entregado a un espectador para cargarlo en el ordenador del espectador o puede residir en un servidor remoto al que el espectador accede mediante un medio de comunicación para descargar el componente del programa.

De forma más específica, la figura 4 muestra esquemáticamente un ordenador 400 al cual se conectan operativamente un detector 402 (por ejemplo un espectrómetro tal como un espectrofluorómetro), un componente de transferencia de fluidos 404 y un modulador térmico 408. Opcionalmente, uno o más de estos componentes se conectan operativamente al ordenador 400 a través de un servidor (no mostrado en la figura 4). Durante el funcionamiento, el componente de transferencia de fluidos 404 típicamente transfiere las mezclas de reacción o componentes de las mismas a un contenedor de múltiples pocillos 406. La inducción térmica (por ejemplo el ciclado térmico) se realiza típicamente por el modulador térmico 408, el cual se comunica térmicamente con el contenedor de múltiples pocillos 406. El detector 402 típicamente detecta señales detectables (por ejemplo emisiones fluorescentes) producidas antes, durante y/o después de que se lleve a cabo en el sistema un ensayo de proximidad determinado. Será evidente para los expertos en la técnica que uno o más componentes del sistema mostrado esquemáticamente en la figura 4 opcionalmente se fabrican integrados (por ejemplo, en la misma carcasa).

X. EJEMPLOS

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritas aquí son solamente a efectos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada. También se entiende que los ejemplos y realizaciones aquí descritos sugerirán a los expertos en la técnica diversas modificaciones o cambios.

EJEMPLO I: SINTESIS DE OLIGONUCLEÓTIDOS BLOQUEADOS

Se sintetizaron oligonucleótidos bloqueados 2’-O-PO3 (figura 5) en un sintetizador automatizado Applied Biosystems 394 utilizando la química de la 1-cianoetilfosforamidita (figura 6). El soporte sólido utilizado en la síntesis de estos oligonucleótidos fue el CPG 3’fosfato (de Glen Research, # 20-2900-41), que facilitó la introducción de un grupo fosfato en el extremo 3’ del oligonucleótido. En el primer ciclo de síntesis se utilizó el ribonucleótido-2’-Ofosforamidita (figura 7, en la que B = Bases; Adenosina (parte # ANP-5681), Citidina (ANP-5682), Guanosina (ANP5683) y Uridina (ANP-5684)) obtenida de ChemGenes, para acoplarla con el soporte sólido. En el segundo ciclo de la síntesis y en los siguientes, se utilizaron desoxinucleósido fosforamiditas estándar. Tras la síntesis, los oligonucleótidos se escindieron del soporte sólido y se desprotegieron con hidróxido de amonio concentrado a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas. A continuación, se eliminó el hidróxido de amonio mediante cromatografía de exclusión por tamaño (columna NAP-10; elución con agua estéril). A continuación, se purificaron los oligonucleótidos mediante HPLC de fase inversa (columna PRP-1, tampón acetato de amonio de trietil – tampón de acetonitrilo). Se concentraron los oligonucleótidos purificados y, a continuación, se trataron con fluoruro potásico para retirar la protección de sililo del grupo hidroxilo-3’ en el extremo 3’ del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se purificaron, además, mediante RP-HPLC (columna Xterra SB-18), La pureza e identidad de estos oligonucleótidos se confirmó mediante HPLC de intercambio iónico (Dionex, pH 8,0 a 60 °C) y análisis LC-MS.

EJEMPLO II: TITULACIONES DE LOS MOLDES DE ADN VIH

Las titulaciones de moldes PAP relacionadas con el de ADN de VIH se realizaron con y sin presencia de ADN genómico. La figura 8 es una fotografía de un gel que muestra la detección de los productos del PCR bajo las diversas condiciones de reacción utilizadas en este análisis. Estos datos muestran, por ejemplo, la mejoría en la

especificidad y sensibilidad de la amplificación que puede conseguirse utilizando los cebadores bloqueados

descritos en la presente invención respecto a reacciones que no utilizan estos cebadores. De forma más específica, las reacciones se realizaron utilizando un Sistema de Detección de Secuencia Sistema de Detección de Secuencia ABI 5700con el siguiente perfil de temperatura:

50°C 2 minutos 93°C 1 minuto 93°C, 15 segundos -

52°C, 4 minutos x 4 ciclos 90°C, 15 segundos -

55°C, 4 minutos x 56 ciclos Las siguientes condiciones de reacción fueron comunes a todas las reacciones:

Componentes de la mezcla maestra

Concentración

Tricina (pH 80)

100mM

dATP

200μM

dCTP

200μM

dGTP

200μM

dTTP

30μM

dUTP

300μM

Cebador 3 o cebador 1

200nM

Cebador 4 o cebador 2

200nM

KOAc

110mM

SYBR Green I

0,2X

NaPPi

225μM

Mg(OAc)2

2,5mM

Tampón de almacenamiento Tth (0,2% Tween)

6% v/v

ADN polimerasa GLQDSE CS5

10nM

A saber que "ADN polimerasa GLQDSE CS5” se refiere a la ADN polimerasa G46E L329A Q601R D640G S671F E678G CS5. A saber, además, que el “tampón de almacenamiento Tth” incluía Tween 20 0,2%, Tris 20mM, pH 8,0, EDTA 0,1mM, KCl 100mM, DTT 1mM y glicerol al 50% v/v. Además, cada volumen de reacción fue llevado a 50 !l de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).

10 Los diversos componentes de la reacción incluyeron los siguientes cebadores no bloqueados (ver, las reacciones

denominadas “cebadores no bloqueados” en la figura 8): cebador 1 5’-TGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAATGT-3’ (identificador de secuencia nº: 1) cebador 2 5’-CTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCATGT-3’ (identificador de secuencia nº: 2)

15 y los siguientes cebadores bloqueados (ver las reacciones denominadas "Cebadores bloqueados" en la figura 8): cebador 3 5’-TGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAATGU*-3’ (identificador de secuencia nº: 3) cebador 4 5’-CTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCATGU*-3’ (identificador de secuencia nº: 4)

en los que U* se refiere a un 2’-fosfato-U (es decir, un nucleótido extremo en 2’ que comprende un grupo fosfato en la posición 2’). Las reacciones también incluyeron (ver, las reacciones denominadas “25 ng de ADN genómico” en la figura 8) o carecía de (ver, las reacciones denominadas “Diana limpia” en la figura 8) 25ng de ADN genómico humano añadidos a las mezclas. Como se muestra adicionalmente en la figura 8, las reacciones también incluyeron

5 105, 104, 103, 102 o 101 copias de ADN de plásmido alineado, que incluía el ácido nucleico diana, diluido en 11l de Diluyente de Muestras de VIH (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, Poli A 20 1g/mL y NaN3 0,09%) o 1 1l de Diluyente de Muestras de VIH en reacciones “Neg”. Los pares de cebadores indicados amplificaron un producto de 170 pares de bases a partir del ADN de plásmido.

EJEMPLO III: AMPLIFICACIÓN DEL MOLDE PLASMÍDICO K-RAS MUTADO EN UN FONDO DE MOLDE 10 PLASMÍDICO K-RAS DE TIPO SALVAJE

Se realizaron amplificaciones que incluían varios números de copias de molde plásmido K-Ras mutado en un fondo de molde plásmídico K-RAS de tipo salvaje comparando cebadores bloqueados y no bloqueados. La figura 9 es un gráfico que muestra los valores del ciclo umbral (CT) (eje y) observados para varios números de copias de molde plásmídico K-Ras mutado (eje x) utilizados en estas reacciones. La figura 9 muestra además, por ejemplo, la mejoría 15 en la discriminación que puede conseguirse utilizando los cebadores bloqueados descritos en la presente invención.

Las reacciones se realizaron utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI 5700 con el siguiente perfil de temperatura:

50°C 2 minutos

20 93°C 1 minuto

Las siguientes condiciones de reacción fueron comunes a todas las reacciones:

92°C, 15 segundos -65°C, 2 minutos x 60 ciclos

Componentes de la mezcla maestra

concentración

Tricina (pH 8,0)

100 mM

dATP

200 μM

dCTP

200 μM

dGTP

200 μM

dTTP

30 μM

dUTP

300 μM

Cebador 9

200 nM

Cebador 10

200 nM

SYBR Green I

0,1 X

NaPPi

225 μM

Mg(OAc)2

2,5 mM

Ung

2 U

Tampón de almacenamiento Tth (0,2% Tween)

6% v/v

ADN plasmídico de tipo salvaje K-Ras alineado

106 copias

Se debe observar que “ADN polimerasa GDSE CS5” se refiere a ADN polimerasa G46E D640 S671F E678G CS5. A

25 saber que el “tampón de almacenamiento Tth” incluía Tween 20 0,2%, Tris 20mM, pH 8,0, EDTA 0,1mM, KCl 100mM, DTT 1mM y glicerol al 50% v/v. Además, cada volumen de reacción fue llevado a 50 μl con agua tratada con DEPC.

Los variados componentes de la reacción incluyen los siguientes cebadores no bloqueados: 30 cebador 5 5’- AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’ (identificador de secuencia nº: 5)

cebador 6 5’- GTTGGATCATATTCGTCCACAA-3’ (identificador de secuencia nº: 6)

35 y los siguientes cebadores bloqueados (ver las reacciones denominadas " bloqueadas" en la figura 9):

cebador 7 5’- AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC*-3’ (identificador de secuencia nº: 7)

cebador 8 5’- GTTGGATCATATTCGTCCACAA*-3’ (identificador de secuencia nº: 8)

en los que C* se refiere a un 2’-fosfato-C y A* se refiere a 2’-fosfato-A (es decir, nucleótidos extremos en 2’ que comprenden un grupo fosfato en la posición 2’. Además, 106, 105, 104, 103, 102, 101 ó 0 copias (reacciones NTC) (10e6c, 10e5c, 10e4c, 10e3c, 10e2c, 10e1c y NTC, respectivamente, en la figura 9) de ADN plásmido K-Ras

5 mutante linealizado se añadieron a las reacciones. Las subsecuencias relevantes del ADN plásmido mutante fueron perfectamente adaptadas tanto a conjuntos de cebadores bloqueados como no bloqueados. Además, el ADN plásmido K-Ras mutante fue diluido en 1 !l de Diluyente de Muestras de VIH (véase más arriba) o 1 !l Diluyente de Muestras de VIH (véase más arriba) en reacciones "NTC". Además, 106 copias de ADN plásmido K-Ras de tipo salvaje linealizado se encontraban presentes en todas las reacciones. El ADN plásmido K-Ras de tipo salvaje fue

10 idéntico en su secuencia al ADN plásmido mutante excepto en que crea un desacoplamiento C:C con la base de extremo 3' (dC) en los cebadores 5 y 7. Los dos pares de cebadores bloqueados y no bloqueados crearon amplicón de 92 pares de bases en la matriz de plásmido mutante linealizado.

EJEMPLO IV: AMPLIFICACIÓN DE LA MATRIZ DE PLASMÍDICO K-RAS CON VARIAS ENZIMAS A 15 DIFERENTES CONCENTRACIONES

Se realizaron amplificaciones con matriz de plásmido R-Kas con diferentes enzimas para diferentes concentraciones. La figura 10 es un gráfico que muestra los valores del ciclo umbral (CT) (eje y) observados para las diferentes enzimas y concentraciones (eje x) utilizadas en estas reacciones. Las reacciones se realizaron utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI 5700 con el siguiente perfil de temperatura:

20 50°C 2 minutos

93°C 1 minuto

Las siguientes condiciones de reacción fueron comunes a todas las reacciones: Se debe observar que el “tampon de almacenamiento Tth” incluía Tween 20 0,2%, Tris 20mM, pH 8,0, EDTA 0,1mM, KCl 100mM, DTT 1mM y glicerol al 50% v/v. Además, los componentes de la reacción incluían los siguientes cebadores bloqueados:

92°C, 15 segundos -65°C, 2 minutos x 60 ciclos

Componentes de la mezcla maestra

Concentración

Tricina (pH 8,0)

100 mM

dATP

200 μM

dCTP

200 μM

dGTP

200 μM

dTTP

30 μM

dUTP

300 μM

Cebador 9

200 nM

Cebador 10

200 nM

SYBR Green I

0,1 X

NaPPi

225 μM

Mg(OAc)2

2,5 mM

Ung

2 U

Tampón de almacenamiento Tth (0,2% Tween)

6% v/v

ADN plasmídico de tipo salvaje K-Ras linealizado

104 copias

Cebador 9 5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGU*-3’ (identificador de secuencia nº: 9)

5 Cebador 10 5’-GTTGGATCATATTCGTCCACAA*-3’ (identificador de secuencia nº: 8)

en los que U* se refiere a un 2’-fosfato-U y A* se refiere a un 2’-fosfato-A (es decir nucleótidos extremos en 2’ que comprenden un grupo fosfato en posición 2’). Los pares de cebadores generaron un amplicón de 92 pares de bases en el molde plasmídico de K-Ras alineado. Además, cada volumen de reacción se llevó hasta los 50 1l con agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).

10 Se optimizaron las concentraciones de polimerasa y KOAc para cada polimerasa individual como sigue:

Polimerasa

Concentración de polimerasa (nM) KOAc (mM)

GLQDSE

5, 10, 15, 20, 30 o 40nM 110

GLDSE

5, 10, 15, 20, 30 o 40nM 25

GLE

5, 10, 15, 20, 30 o 40nM 25

A saber, que "GLQDSE" (identificador de secuencia nº: 22) se refiere a una ADN polimerasa G46E L329A Q601 R D640G S671 F E678G CS5, "GLDSE" (identificador de secuencia nº: 23) se refiere a una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671 F E678G CS5, y "GLE" se refiere a una ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5.

15 EJEMPLO V: COMPARACIONES DE ENZIMAS VINCULADAS A LA PAP

Se comparó la capacidad de llevar a cabo la polimerización activada por pirofosforólisis (“PAP”) de la ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5 y la ADN polimerasa G46E L329A D640 S671 F E678G CS5. El tampón de reacción contenía Tricina pH 8,0 100 mM, KOAc 0 mM (ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5) o 50 mM (ADN polimerasa G46E L329A D640 S671F E678G CS5), glicerol 10% v/v, UNG 0,04 U/1l, Mg(OAc)2 4 mM, SYBR Green 20 I 0,2X, tampón de almacenamiento de enzimas (glicerol 50% v/v, KCl 100 mM, Tris pH 8,0 20 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tween 20 0,5%) al 2.5% v/v, 0,2 mM de dATP, dCTP y dGTP, y 0,4 mM de dUTP y pirofosfato100 1M. Se titularon de forma cruzada el molde M13 (nº de acceso GenBank X02513) y el enzima. Las concentraciones de M13 utilizadas fueron 0, 104, 105 y 106 copias por 20 1l de reacción. Las concentraciones de enzima utilizadas fueron

2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 35 nM y 50 nM. Las reacciones ser realizaron por triplicado en un

25 termociclador de 384 pocillos, utilizando los siguientes parámetros de ciclado: 50ºC durante 2 minutos; 90ºC durante 1 minutos; a continuación 46 ciclos de: 90ºC durante 15 segundos seguido de una temperatura de extensión de 62ºC durante 60 segundos.

Las secuencias de cebadores utilizadas fueron 5’-CGCCTGGTCTGTACACCGTTXA-3’ (cebador 11, identificador de secuencia nº: 10) y 5’-GGAACGAGGGTAGCAACGGCTACE-3’ (cebador 12, identificador de secuencia nº: 11), 30 siendo X = 2’-amino-C y E = 2’-PO4-A (es decir un nucleótido extremo en 2’). Estos cebadores, añadidos a la mezcla de reacción a una concentración de 0,1 !M cada uno, dieron lugar a un producto de 348 bp a partir del molde M 13. Para servir como cebador, el cebador 12 debe ser activado mediante la retirada pirofosforolítica del residuo terminal.

Se analizaron los datos de fluorescencia para determinar los valores codo (es decir, C(t) (emergencia de fluorescencia por encima de la línea base). Los valores C(t) de la ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5 se

35 muestran en la figura 11. Los valores C(t) para ADN polimerasa G46E L329A D640G S671 F E678G CS5 se muestran en la figura 12.

EJEMPLO VI: TRANSCRIPCION INVERSA (RT) DE ARN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC) A ADNc COMPARANDO CEBADORES BLOQUEADOS Y NO BLOQUEADOS

Se comparó la extensión de un cebador RT de VHC no bloqueado con la extensión de un cebador bloqueado sobre

40 un molde de ARN de VHC en reacciones de transcripción inversa. Estas comparaciones de RT se realizaron utilizando diversas polimerasas. La figura 13 es un gráfico que muestra los valores del ciclo umbral (Ct) (eje y) observados para varios enzimas (eje x) utilizados en estas reacciones en las que se midió el ADNc utilizando una PCR en tiempo real utilizando sondas nucleasa-5’.

Las siguientes condiciones de reacción fueron comunes a todas las reacciones:

Tricina (pH 8,0)

100 mM

KOAc

100 mM

DMSO

4% (v/v)

Cebador 1 o 2

200 nM

dATP

200 μM

dCTP

200 μM

dGTP

200 μM

dTTP

30 μM

dUTP

300 μM

UNG

0,2 unidades

Cebador 10

200 nM

Mg(OAc)2

1 mM

NaPPi

175 μM

Los diversos componentes de la reacción incluyeron los siguientes cebadores 3’-OH no bloqueados (ver, las reacciones denominadas “Cebador 3’-OH (no bloqueado)” en la figura 13): Cebador 1 5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA-3’ (identificador de secuencia nº: 12) 5 y el cebador bloqueado siguiente (ver las reacciones denominadas “2’ PO4 (bloqueado)” en la figura 13):

Cebador 2 5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA*-3’ (identificador de secuencia nº: 13) siendo A* un nucleótido 2’-fosfato-A o un nucleótido 2’-monofosfato-3’-hidroxil adenosina (es decir, un nucleótido extremo en 2’ que comprende un grupo fosfato en posición 2’).

Además, se compararon las siguientes condiciones de polimerasa en las reacciones de ADNc (ver, figura 13):

10 ADN polimerasa ZO5 (13 nM) ADN polimerasa GLQDSE CS5 (100 nM) combinada con ADN polimerasa GLQDS CS5 (25 nM) ADN polimerasa GLQDSE CS5 (50 nM) combinada con ADN polimerasa GLQDS CS5 (50 nM) siendo "ADN polimerasa GLQDSE CS5" (identificador de secuencia nº: 22) se refiere a la ADN polimerasa G46E

L329A Q601 R D640G S671 F E678G CS5 y " ADN polimerasa GLQDS CS5 " (identificador de secuencia nº: 24) se 15 refiere a la ADN polimerasa G46E L329A Q601R D640G S671F CS5. Además, cada reacción se llevó hasta los 20

!l con agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC). Las reacciones de RT se incubaron a 60 ºC durante 60 minutos en un ABI 9600 Thermal Cycler. Tras la incubación de RT, las reacciones de RT se diluyeron 100 veces en agua tratada con DEPC. Se confirmó la presencia de productos ADNc y se cuantificó por reacciones HCV PCR en tiempo real basadas en sondas de nucleasa-5’. Estas

20 reacciones se realizaron utilizando un ABI Prism 7700 Sequence Detector con el siguiente perfil de temperatura: 50°C 2 minutos 95°C, 15 segundos - 60°C, 1 minuto x 50 ciclos

EJEMPLO VII: PAP BIDIRECCIONAL PARA LA DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN BRAF

La figura 14 muestra unas curvas de crecimiento PCR de las amplificaciones del oncogén BRAF generadas al realizar una PAP bidireccional. El eje x muestra la fluorescencia acumulada normalizada y el eje y muestra ciclos de amplificación PCR PAP. De forma más específica, estos datos se produjeron cuando se realizó la amplificación específica de mutación de la mutación T- A responsable del cambio en codón V599E del oncogén BRAF (ver Brose

5 y otros (2002) Cancer Res 62:6997-7000) utilizando los cebadores extremos en 2’ que se superponen en su nucleótido terminal 3’ en la posición precisa de la mutación. Cuando se hicieron reaccionar los cebadores específicos de la secuencia de tipo salvaje con la diana de tipo salvaje o la diana mutada, solamente se detectó la diana de tipo salvaje. Por el contrario, cuando se hicieron reaccionar los cebadores específicos de la secuencia de tipo salvaje con la diana de tipo salvaje o la diana mutada, solamente se detectó la diana mutada.

10 Las siguientes condiciones de reacción fueron comunes a todas las reacciones:

Componente

Concentración

Tricina pH 8,0

100mM

KOAc

100 mM

Glicerol

3,5% (v/v)

Cebador F5W o F5M

200nM

Cebador R5W o R5M

200nM

dATP

200μM

dCTP

200μM

dGTP

200μM

dTTP

30μM

dUTP

300μM

UNG

1 unidad

PPi

175uM

GLQDSE (identificador de secuencia nº: 22)

15 nM

SYBR I/carboxirodamina

1/100.000 (0,1x)

Mg(OAc)2

3,0 mM

siendo "GLQDSE" al ADN polimerasa G46E L329A Q601R D640G S671F E678G CS5. Los diversos componentes de la reacción incluyeron los siguientes cebadores BRAF de tipo salvaje (etiquetados “F5W/R5W” en la figura 14): 15 F5W 5’-AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGU*-3’ (identificador de secuencia nº: 14) R5W 5’-GGACCCACTCCATCGAGATTTCA*-3’ (identificador de secuencia nº: 15)

y los siguientes cebadores BRAF mutados ((etiquetados “F5M/R5M” en la figura 14: F5M 5’-AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA*-3’ (identificador de secuencia nº: 16) R5M 5’-GGACCCACTCCATCGAGATTTCU*-3’ (identificador de secuencia nº: 17)

20 siendo A* un nucleótido 2’-fosfato-A o un nucleótido 2’-monofosfato-3’-hidroxil adenosina y U* un nucleótido 2’fosfato-U o un nucleótido 2’-monofosfato-3’-hidroxil uridina (es decir, nucleótidos extremos en 2’ que comprenden un grupo fosfato en posición 2’).

Además, cada reacción se llevó hasta los 50 !l con agua tratada DEPC. Las reacciones salvajes (etiquetadas como “WT” en la figura 14) contenían ADN plasmídico alineado de la secuencia BRAF de tipo salvaje y las reacciones salvajes (etiquetadas como “MT” en la figura 14) contenían ADN plasmídico alineado de la secuencia BRAF mutada. Las reacciones negativas (etiquetadas “NEG” en la figura 14) contenía Diluyente de Muestras VIH (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, Poly A 20 !g/mL y NaN3 0,09%) sin ADN.

Las combinaciones de cebadores en la PCR produjeron un amplicón de 50 bp. Además, las reacciones se realizaron 5 utilizando un Detector de Secuencias ABI Prism 7700 con el siguiente perfil de temperatura:

50°C 1 minuto

93ºC 1 minuto

90ºC 15 segundos

60°C, 150 segundos - x 60 ciclos

10 EJEMPLO VIII: DETECCIÓN DE PRODUCTOS LIBERADOS POR PAP FLUORESCENTES

Este ejemplo profético muestra un protocolo de control en tiempo real que incluye la activación mediante PAP en el cual el cebador bloqueado conlleva la producción de una señal detectable en el momento que el cebador es activado y extendido.

Construcción de un cebador oligonucleótido con doble marcado terminado en 3’

15 El siguiente cebador QX es un oligonucleótido de ADN que incluye una molécula colorante silenciadora, Black Hole Quenched® (BHQ) (Biosearch Technologies, Inc.) unida al nucleótido número trece (A) a partir del extremo 3’.

Un oligonucleótido cebador QX se mezcla en solución con un oligonucleótido complementario R1 (ver, más adelante) de manera que forman un dúplex híbrido. Este dúplex se mezcla además con los reactivos de la tabla IV incluida más adelante entre los que se incluyen en particular una desoxirriboadenina tetrafosfato marcada con 20 fluoresceína (es decir un extremo en 2’ marcado con fluoresceína) y una ADN polimerasa capaz de incorporar dicho tetrafosfato marcado. Ver las Solicitudes de patente U.S. números 10/879,494, titulada "Synthesis and compositions of 2’-terminator nucleotides" (“Síntesis y composiciones de nucleótidos extremos en 2’”), depositada el 28 de junio de 2004 y 10/879,493, titulada "2’-terminator nucleotide-related methods and systems," (“Métodos y sistemas relativos a nucleótidos extremos en 2’”) depositada el 28 de junio de 2004. La incubación de la mezcla a una temperatura de 60

25 ºC durante, por ejemplo, una hora puede provocar que la secuencia QX se extienda un nucleótido de forma dirigida por el molde, dando lugar a que al menos una parte de los oligonucleótidos QX se extiendan por su extremo 3’ con nucleótidos desoxirriboadenina 2’-fosfato marcados con fluoresceína, representados más adelante como QXFAM.

Tabla IV

Componente de la mezcla

Concentración

Tricina pH 8,3

50mM

KOAc

100mM

Glicerol

8% (v/v)

Cebador QX

10μM

Oligonucleótido R1

15μM

Fluoresceína dA4P

15μM

ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5

50nM

Mg(OAc)2

2,5mM

Los cebadores QXFAM elongados se purifican a partir de la mezcla anterior utilizando diversos métodos de

30 purificación conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo de uno de dichos métodos capaces de purificar el cebador QXFAM de la mezcla en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los parámetros de purificación mediante HPLC se seleccionan de manera que la preparación del cebador QXFAM está substancialmente libre de cebador QX no extendido y de adeninas tetrafosfato marcadas con fluoresceína. Se conoce la HPLC dual (HPLC de fase inversa y de intercambio iónico) como método de purificación de dichas moléculas.

Una vez purificadas, las moléculas como el cebador QXFAM que contienen una molécula silenciadora BHQ y una molécula fluoresceína en el mismo oligonucleótido muestran en general una señal fluoresceína suprimida debido a la absorbancia de energía por la molécula BHQ2 "silenciadora”.

Opcionalmente, el cebador QXFAM se sintetiza químicamente tal como se describe en la presente invención.

5 Las secuencias mencionadas en este ejemplo son como sigue: Cebador QX 5’-GCAAGCACCCTATCAQGGCAGTACCACA-3’ (identificador de secuencia nº: 18 (en el que Q representa la presencia de una molécula de BHQ) R1 3’-PCGTTCGTGGGATAGTCCGTCATGGTGTT-5’ (identificador de secuencia nº: 19) (en el que P representa 3’fosfato)

10 Cebador QXFAM 5’-GCAAGCACCCTATCAQGGCAGTACCACAF-3’ (identificador de secuencia nº: 20)

(en el que Q representa la presencia de una molécula de BHQ y F representa una adenina fosfato en 2’ marcada con fluoresceína) Cebador HC2 5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCTTA-3’ (identificador de secuencia nº: 21)

Utilización del cebador en PCR

15 El cebador QXFAM descrito se combina con los reactivos de la tabla V.

Tabla V

Componente

Concentración

Tricina pH 8,0

100mM

KOAc

100mM

Glicerol

3,5% (v/v)

DMSO

5% (v/v)

Cebador QXFAM

150nM

Cebador HC2

150nM

dATP

200μM

dCTP

200μM

dGTP

200μM

dTTP

30μM

dUTP

300μM

UNG

1 unidad

PPi

175!M

GLQDSE 15 nM

15 nM

PPi

175μM

Secuencia diana

106 copias

Mg(OAc)2

3,0mM

Además, cada reacción se llevó hasta los 50 !l con agua tratada con DEPC. Algunas reacciones contienen una secuencia diana que sirve como substrato para la amplificación PCR, mientras que otras no contienen diana. Por

ejemplo, la diana puede se una secuencia de ADN idéntica a la región 5’UTR del genoma del VHC. Las combinaciones de estos cebadores en la PCR se espera que produzcan un amplicón de aproximadamente 244 bp.

Las reacciones se realizaron utilizando un Detector de Secuencias ABI Prism 7700 con el siguiente perfil de temperatura:

50°C 1 minuto

93ºC 1 minuto

90ºC 15 segundos

60°C, 150‘’ -x 60 ciclos

10 Para que una PCR como ésta progrese, es necesaria la activación mediante PAP del cebador QXFAM terminado con fluoresceína, que daría lugar a la liberación de la molécula de desoxiadenina tetrafosfato marcada con fluoresceína. Dicha liberación se espera que de lugar a un incremento de la señal fluorescente a una longitud de onda de 520 nm aproximadamente. Con el control de la señal a una longitud de onda de aproximadamente 520 nm a medida que progresa la PCR, se espera observar un aumento de la fluorescencia en aquellas reacciones que contienen un ácido

15 nucleico diana mientras que no se observaría incremento de la fluorescencia en las reacciones que no poseen diana.

Mientras que la invención anterior se ha descrito en detalle a efectos de claridad y comprensión, será evidente para los expertos en la técnica a partir de la lectura de esta memoria que pueden realizarse diversas modificaciones en la forma y el detalle sin apartarse del verdadero alcance de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos

20 descritos más arriba pueden utilizarse en combinaciones diversas.

Todas las secuencias de cebadores o nucleótidos y todas las secuencias de aminoácidos mencionadas son secuencias artificiales.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para retirar un nucleótido extremo en 2’ de un oligonucleótido que comprende:

   incubar al menos un ácido nucleico diana con:

   pirofosfato

   5 al menos un primer biocatalizador que comprende una actividad de pirofosforólisis, y

   al menos un oligonucleótido que comprende un nucleótido extremo en 2’, siendo dicho oligonucleótido al menos parcialmente complementario a al menos una primera subsecuencia del ácido nucleico diana,

   bajo condiciones en las que el primer biocatalizador retira al menos el nucleótido extremo en 2’ del oligonucleótido produciendo un nucleótido extremo en 2’ retirado y un oligonucleótido acortado, retirando de

   10 este modo el nucleótido del oligonucleótido
2. 2. Método, según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende el nucleótido extremo en 2’ en el extremo 3’ del oligonucleótido.
3. 3. Método, según la reivindicación 1, en el que el nucleótido extremo en 2’ es no extensible por uno o más biocatalizadores que incorporan de nucleótidos del grupo formado por: una ADN polimerasa G46E E678G 15 CS5, una ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, una ADN polimerasa G46E L329A D640G S671 F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, una polimerasa 'ZO5R, una ADN polimerasa E615G Taq, una polimerasa Thermus flavus, una polimerasa TMA-25, una polimerasa E678G TMA-25, una polimerasa TMA-30, una polimerasa E678G TMA-30, una ADN polimerasa Tth, una polimerasa de la especie Thermus species SPS-17,una polimerasa 20 E615G Taq, una polimerasa Thermus ZO5R, una ADN polimerasa T7, una ADN polimerasa Kornberg I, una ADN polimerasa Klenow, una ADN polimerasa Taq, una ADN polimerasa microcócica, una ADN polimerasa alfa, una transcriptasa inversa, una transcriptasa inversa AMV, una transcriptasa inversa M-MuLV, una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una ARN polimerasa de E. coli, una ARN polimerasa SP6, una ARN polimerasa T3, una ADN polimerasa T4, una ARN polimerasa T7, una ARN polimerasa II,

   25 una transferasa terminal, una polinucleótido fosforilasa, una ADN polimerasa incorporadora de análogos de nucleótidos y una ADN polimerasa incorporadora de nucleótidos.
4. 4. Método, según la reivindicación 1, en el que el primer biocatalizador comprende una actividad incorporadora de nucleótidos extremos en 2’, y en el que el método comprende incubar el ácido nucleico diana con el primer biocatalizador, el oligonucleótido acortado y al menos un nucleótido adicional bajo

   30 condiciones en las que el primer biocatalizador incorpora el nucleótido adicional en el extremo del oligonucleótido acortado dando lugar a un oligonucleótido extendido; o en el que el método comprende incubar el ácido nucleico diana con al menos un segundo biocatalizador que comprende una actividad incorporadora de nucleótidos, el oligonucleótido acortado, y al menos un nucleótido adicional bajo condiciones en las que el segundo biocatalizador incorpora el nucleótido adicional en el extremo del

   35 oligonucleótido acortado dando lugar a un oligonucleótido extendido.

5. 5.

   Método, según la reivindicación 4, en el que el primer y/o el segundo biocatalizador comprende un enzima seleccionado del grupo formado por; una polimerasa y una transcriptasa inversa.

6. 6.

   Método, según la reivindicación 1, en el que el nucleótido extremo en 2’ comprende la fórmula:

   40

   en la que

   Z es O o CH2;

   B es al

   menos un anillo homocíclico, al menos un anillo heterocíclico, al menos un grupo arilo o

   combinaciones de los mismos;

   BG es un grupo bloqueador;

   45

   R1 es OH;

   y, - - - - - representa un enlace sencillo o doble; y en el que BG se selecciona del grupo formado por: CN, NO2, un grupo fosfato, un grupo aldehído y

   combinaciones de los mismos.
7. 7. Método, según la reivindicación 6, en el que el BG comprende un grupo fosfato que comprende la fórmula:

   o,

   en las que Q es O, S o NH; X es H, OH, CH3, BH3, F, o SeH; y Z es O, S o Se; o

   15 en la que

   Q es O, S o NH;

   X es H, OH o NH;

   Z es O, S o Se; y

   R es un grupo alquilo, un grupo alquenilo o un grupo alquinilo; o 20

   en la que Q es O, S o NH; X es H, OH o NH; Z es O, S o Se; L es -CONH(CH2)nNH-, -CO(CH2)nNH-, o -CONH(CH2CH2O)nCH2CH2NH-; n es un número entero mayor a 0; y, R es NH2, SH, COOH, una fracción silenciadora, una fracción reportera, biotina o una fracción de afinidad.