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CN105274169A - 2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合 - Google Patents

2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合 Download PDF

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CN105274169A
CN105274169A CN201510684383.3A CN201510684383A CN105274169A CN 105274169 A CN105274169 A CN 105274169A CN 201510684383 A CN201510684383 A CN 201510684383A CN 105274169 A CN105274169 A CN 105274169A
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CN
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nucleic acid
oligonucleotide
polysaccharase
nucleotide
primer
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Application number
CN201510684383.3A
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D.H.格尔范德
K.A.鲍尔
A.P.古普塔
V.博德普迪
J.尼米克
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Abstract

本发明涉及2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合。本发明提供了包含含有2’-终止子核苷酸的封闭的寡核苷酸的反应混合物。当通过例如焦磷酸解作用从寡核苷酸去除2’-终止子核苷酸时，封闭的寡核苷酸是可延伸的。所述反应混合物可以用于各种核酸聚合和/或扩增测定，以及许多其它应用。除了反应混合物以外，本发明也提供了有关的方法和反应混合物。

Description

2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合
本申请是国际申请日为2007年10月17日的国际申请PCT/EP2007/008997进入中国、申请号为200780038651.8的题为“2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明总的来说涉及核酸化学和分子生物学。更具体地，本发明涉及包含2’-终止子的核酸聚合和扩增。
背景技术
焦磷酸解作用激活的聚合(PAP)是一个包含焦磷酸解作用介导的与靶或模板核酸杂交的焦磷酸解作用可激活的引物的激活，和随后延伸激活的引物的过程。焦磷酸解作用可激活的引物一般包括终止子核苷酸，例如在它们的3’-末端的双脱氧核苷酸(ddNMPs)。这些终止子核苷酸通常必须通过消耗焦磷酸的焦磷酸解作用反应从这样的杂交的、封闭的引物酶促地去除，以生成激活的引物，以使得进行引物延伸。由于引物激活一般需要完全匹配的引物和靶核酸，所以这些反应通常生成有限的(如果存在的话)非特异性产物，这归因于例如引物二聚体形成或其它错误引发假象。PAP的示例性应用包括，提供扩增核酸的替代方法(例如，作为罕见的等位基因检测方法的部分，体细胞突变检测测定等)，以及其它用途。
如上面指出的，某些现有的PAP有关的方法使用ddNMP-终止的引物和有效的掺入ddNMP的热稳定的DNA聚合酶(例如，在“螺旋O”中含有“F至Y”突变的突变酶)，以在引物与模板结合/退火后在有焦磷酸(PPi)存在下，实现具有3-末端ddNMP部分的引物的焦磷酸解作用。这些方法通常具有各种缺点。例如，这些技术一般使用非常低的、限制浓度的dNTPs，这降低(减慢)延伸速率(每秒聚合的核苷酸的数目)。更具体地，当3’-末端ddNMP在这些反应中作为ddNTP释放时，非常低浓度的dNTPs(即，“库大小(poolsize)”)增加在全长引物延伸(有效的PCR所需)之前重新掺入不断增加浓度的ddNTPs的可能性(源自连续轮次的PAP)。该重新掺入通常是不希望的，这需要额外的PAP来去除掺入的ddNMP，且进一步促成不完全引物延伸和损害每个循环中全长引物延伸产物的效率。此外，许多这样的现有PAP方法能产生仅非常短的扩增子，例如，在有些情况下，甚至比引物二聚体更短。因而，这些以前的方法的PCR循环效率通常会受损，从而一般需要许多循环来检测低丰度的靶。
从前面可知，显然希望其它的PAP有关的方法。本发明提供了使用2’-终止子核苷酸的PAP有关的方法，以及在完全阅读下面的公开内容后将显而易见的许多其它特征。
发明内容
本发明涉及核酸聚合和扩增。在某些实施方案中，例如，本文提供的PAP有关的方法包含焦磷酸解作用和聚合的连续偶联。这些方法可以用于，例如，SNP分析和罕见体细胞突变检测，以及许多其它应用。除了PAP有关的方法以外，本发明也提供了有关的反应混合物和系统。
为了说明，本文所述的方法和其它方面增强了寡核苷酸介导的合成反应的一般特异性。例如，类似于其它“热启动”方法(例如，可逆的、化学修饰的酶、适体或抗体介导的“热启动”)，减少或消除了“零循环延伸”(PCR前)。与这些其它的方法不同，在各个和每个新的寡核苷酸介导的合成步骤中实现了引物激活。这提高反应的总特异性，从而使不希望的副产物的产生最小化。因此，提高了低拷贝和甚至单个拷贝序列的检测。另外，通过减少或消除非预期的且不希望的非特异性合成产物(例如，在PCR情况下的引物二聚体)的产生，也提高了在多重(其中扩增几个或许多不同的靶)扩增反应中的性能。
在一个方面，本发明提供了反应混合物，其包括至少一种包含2’-终止子核苷酸(例如，在3’-末端)的寡核苷酸(例如，引物核酸、探针核酸等)。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含式：
其中Z是O或CH2；B是至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基或其组合；BG是封闭基团；R1是H、OH、亲水基或疏水基；X是核苷酸或核苷酸类似物；n是大于0的整数；且，代表单键或双键。任选地，所述寡核苷酸包含至少一种标记。在某些实施方案中，所述寡核苷酸中的至少一个核苷酸位置对应着靶核酸中的多态核苷酸位置。在这些实施方案的一些中，例如，2’-终止子核苷酸对应着靶核酸中的多态核苷酸位置。
反应混合物一般包括根据其中使用所述反应混合物的特定应用的其它试剂。在有些实施方案中，例如，其它试剂选自，例如，包含核苷酸去除活性(例如，焦磷酸解作用活性和/或核酸酶活性)的第一种生物催化剂，包含核苷酸掺入活性的第二种生物催化剂，至少包含与寡核苷酸至少部分互补的子序列的靶核酸、扩增子、引物核酸、探针核酸(例如，杂交探针、5’-核酸酶探针、发夹探针等)、其它核苷酸(例如，可延伸的核苷酸、终止子核苷酸、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸等)、其它寡核苷酸(例如，引物核酸、探针核酸等)、可溶的光发射改性剂、助溶剂、嵌入剂、临床样品、样品、缓冲剂、盐、金属离子、焦磷酸、甘油、二甲基亚砜、聚rA(polyrA)等。在有些实施方案中，靶核酸、扩增子、引物核酸、探针核酸、其它核苷酸和/或其它寡核苷酸包含至少一种标记。在某些实施方案中，缓冲剂包含浓度为至少90mM(例如，约95mM、约100mM、约105mM等)的N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸。
在有些实施方案中，第一种生物催化剂包含核苷酸掺入活性(即，除了核苷酸去除活性以外)。第一种和/或第二种生物催化剂的核苷酸掺入活性一般包含聚合酶活性和/或连接酶活性。任选地，第一种和/或第二种生物催化剂包含核酸酶活性。为了进一步说明，第一种和/或第二种生物催化剂任选包含选自下述的酶：例如，聚合酶、末端转移酶、反转录酶、多核苷酸磷酸化酶、连接酶、脱嘌呤嘧啶内切核酸酶和端粒末端转移酶。在某些实施方案中，第一种和/或第二种生物催化剂包含在选自下述的氨基酸位置包括一个或多个突变的CS5DNA聚合酶：G46、L329、Q601、D640、I669、S671和E678。在这些实施方案的一些中，例如，所述突变包含G46E突变、L329A突变、Q601R突变、D640G突变、I669F突变、S671F突变和/或E678G突变。
在本文所述的寡核苷酸中使用的2’-终止子核苷酸包括各种实施方案。在有些实施方案中，例如，2’-终止子核苷酸包含2’-单磷酸-3’-羟基核苷。为了进一步说明，在某些实施方案中，2’-终止子核苷酸包含式：
其中R1是H、OH、亲水基或疏水基；B是至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基或其组合；BG是封闭基团；Z是O或CH2；且代表单键或双键。此外，2’-终止子核苷酸一般不可被一种或多种选自下述的核苷酸掺入生物催化剂延伸：例如，G46EE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，G46EE678GCS6DNA聚合酶，ΔZO5R聚合酶，E615GTaqDNA聚合酶，黄栖热菌(Thermusflavus)聚合酶，TMA-25聚合酶，E678GTMA-25聚合酶，TMA-30聚合酶，E678GTMA-30聚合酶，TthDNA聚合酶，栖热菌属(Thermus)物种SPS-17聚合酶，E615GTaq聚合酶，栖热菌属ZO5R聚合酶，T7DNA聚合酶，KornbergDNA聚合酶I，克列诺(Klenow)DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶，微球菌DNA聚合酶，αDNA聚合酶，反转录酶，AMV反转录酶，M-MuLV反转录酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶，T3RNA聚合酶，T4DNA聚合酶，T7RNA聚合酶，RNA聚合酶II，末端转移酶，多核苷酸磷酸化酶，掺入核糖核苷酸类似物的DNA聚合酶，掺入核糖核苷酸的DNA聚合酶等。
在另一个方面，本发明提供了从寡核苷酸去除核苷酸的方法。该方法包括，与下述物质一起温育至少一种靶核酸：至少包含核苷酸去除活性(例如，焦磷酸解作用活性和/或核酸酶活性)的第一种生物催化剂，和至少一种包含2’-终止子核苷酸(例如，在3’-末端)的寡核苷酸(例如，引物核酸、探针核酸等)，该寡核苷酸与靶核酸的至少第一个子序列至少部分地互补，所述温育在第一种生物催化剂从寡核苷酸去除至少2’-终止子核苷酸以生成去除的2’-终止子核苷酸和缩短的寡核苷酸的条件下进行，从而从寡核苷酸去除核苷酸。在有些实施方案中，该方法包括，与第一种生物催化剂、寡核苷酸和焦磷酸一起温育靶核酸，将所述焦磷酸加入去除的2’-终止子核苷酸。
在有些示例性的实施方案中，靶核酸包含至少一个多态核苷酸位置，且该方法包含检测2’-终止子核苷酸从寡核苷酸的去除，该去除与包含至少一个对应着多态核苷酸位置的核苷酸位置的寡核苷酸相关。在这些实施方案中，2’-终止子核苷酸一般对应着多态核苷酸位置。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一种标记，且该方法包含，检测从标记发出的可检测信号。在这些实施方案的一些中，所述标记包含供体部分和/或受体部分，且可检测的信号包含光发射，且该方法包含，与第一种生物催化剂、寡核苷酸和至少一种可溶的光发射改性剂一起温育靶核酸，和检测来自供体部分和/或受体部分的光发射。任选地，2’-终止子核苷酸包含供体部分和/或受体部分。
为了进一步说明，在某些实施方案中，第一种生物催化剂包含核苷酸掺入活性(即，除了核苷酸去除活性以外)，且该方法包含，与第一种生物催化剂、缩短的寡核苷酸和至少一种其它核苷酸一起温育靶核酸，所述温育在第一种生物催化剂将其它核苷酸掺入缩短的寡核苷酸的末端以生成延长的寡核苷酸的条件下进行。任选地，该方法包含，与至少包含核苷酸掺入活性的第二种生物催化剂、缩短的寡核苷酸和至少一种其它核苷酸一起温育靶核酸，所述温育在第二种生物催化剂将其它核苷酸掺入缩短的寡核苷酸的末端以生成延长的寡核苷酸的条件下进行。为了说明，核苷酸掺入活性一般包括聚合酶活性和/或连接酶活性。第一种和/或第二种生物催化剂一般包含选自下述的酶：例如，聚合酶、末端转移酶、反转录酶、多核苷酸磷酸化酶、连接酶、脱嘌呤嘧啶内切核酸酶、端粒末端转移酶等。
在某些实施方案中，第一种和/或第二种生物催化剂包含在选自下述的氨基酸位置包含一个或多个突变的CS5DNA聚合酶：例如，G46、L329、Q601、D640、I669、S671和E678。在这些实施方案的一些中，所述突变包含G46E突变、L329A突变、Q601R突变、D640G突变、I669F突变、S671F突变和/或E678G突变。
在有些实施方案中，当寡核苷酸和靶核酸杂交以形成杂交的核酸时，所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸延伸超过靶核酸的末端。在有些实施方案中，至少一种其它寡核苷酸包含其它核苷酸。所述其它核苷酸包含可延伸的核苷酸和/或终止子核苷酸。在某些实施方案中，所述其它核苷酸包含至少一种标记，且该方法包含，检测从标记发出的可检测信号。例如，所述标记任选包含供体部分和/或受体部分，且可检测的信号包含光发射，且该方法包含，与至少一种可溶的光发射改性剂一起温育靶核酸，和检测来自标记的光发射。
为了进一步说明，该方法任选包括，与包含至少一种标记的至少一种探针核酸一起温育靶核酸，该探针核酸与靶核酸的至少第二个子序列至少部分地互补，和，检测探针核酸或其片段的从标记发出的可检测信号。在有些实施方案中，所述可检测的信号包含光发射，且该方法另外包含，与至少一种可溶的光发射改性剂一起温育靶核酸，和检测来自标记的光发射。例如，探针核酸任选包含5’-核酸酶探针，且第一种和/或第二种生物催化剂在5’至3’方向延伸缩短的寡核苷酸，且包含5’至3’外切核酸酶活性。任选地，探针核酸包含杂交探针和/或发夹探针。
在某些实施方案中，所述靶核酸包含至少一个多态核苷酸位置，且该方法包含检测缩短的寡核苷酸的延伸，该延伸与包含至少一个对应着多态核苷酸位置的核苷酸位置的延伸的寡核苷酸相关。在这些实施方案的一些中，2’-终止子核苷酸对应着多态核苷酸位置。
在另一个方面，本发明提供了一种系统，它包括(a)至少一个容器或支持物，其包含含有2’-终止子核苷酸的寡核苷酸。该系统也包括下述的至少一种：(b)至少一个调热器，其配置用于与容器或支持物热连通，以调节容器中或支持物上的温度；(c)至少一个流体转移组件，其将流体转入和/或转出容器或支持物；和，(d)至少一个检测器，其配置用于检测在容器中或在支持物上生成的可检测信号。在有些实施方案中，该系统包括至少一个控制器，其可操作地连接至：调热器，以实现容器中或支持物上的温度调节；流体转移组件，以实现流体转入和/或转出容器或支持物；和/或检测器，以实现在容器中或在支持物上生成的可检测信号的检测。
附图说明
图1示意描述了根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性(SNP)检测测定。
图2A-D示意解释了示例性的2’-终止子核苷酸。
图3A和B示意显示了2’-终止子核苷酸的一些实施方案。
图4是显示代表性系统的结构图。
图5示意解释了根据本发明的一个实施方案的封闭的寡核苷酸。
图6示意显示了根据本发明的一个实施方案的封闭的寡核苷酸的固相合成途径。
图7示意描述了3′-O-TBDMS-2′-O-亚磷酰胺。
图8是凝胶照片，其显示了包含PAP有关的HIVDNA模板滴定的分析对PCR产物的检测。
图9的图显示了对于在包含封闭的或未封闭的引物的扩增中使用的各种突变K-Ras质粒模板拷贝数观察到的阈循环(CT)值。
图10的图显示了对于在包含K-Ras质粒模板的扩增中使用的各种酶和酶浓度观察到的阈循环(CT)值。
图11的条线图显示了酶浓度对使用G46EL329AE678G(GLE)CS5DNA聚合酶的焦磷酸解作用激活的聚合(PAP)反应的阈循环(Ct)值的作用。y-轴代表Ct值，而x-轴代表酶浓度(nM)。图所附的图例显示了与图中的每个迹线相对应的模板核酸的拷贝数无模板核酸的拷贝(无模板)，1e4个拷贝的模板核酸(1E4/rxn)，1e5个拷贝的模板核酸(1E5/rxn)，和1e6个拷贝的模板核酸(1E6/rxn))。
图12的条线图显示了酶浓度对使用G46EL329AD640GS671FE678G(GLDSE)CS5DNA聚合酶的焦磷酸解作用激活的聚合(PAP)反应的阈循环(Ct)值的作用。y-轴代表Ct值，而x-轴代表酶浓度(nM)。图所附的图例显示了与图中的每个迹线相对应的模板核酸的拷贝数(无模板核酸的拷贝(无模板)，1e4个拷贝的模板核酸(1E4/rxn)，1e5个拷贝的模板核酸(1E5/rxn)，和1e6个拷贝的模板核酸(1E6/rxn))。
图13的条线图显示了HCVRNA上的PAP反转录反应的数据，其中使用对HCVcDNA特异性的定量PCR测定测量cDNA反应的产物。y-轴代表Ct值，而x-轴代表在反应中使用的酶单位。如指出的，在这些反应中使用的酶是ZO5DNA聚合酶(ZO5)，或G46EL329AQ601RD640GS671FE678G(GLQDSE)和G46EL329AQ601RD640GS671F(GLQDS)CS5DNA聚合酶的掺合物。
图14显示了当进行双向PAP时产生的BRAF癌基因扩增的PCR生长曲线。x-轴显示了标准化的、累积的荧光，且y-轴显示了PAPPCR扩增循环。
具体实施方式
I.定义
在详述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定方法、反应混合物或系统，它们可以变动。如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”也包括复数形式，除非上下文另有清楚说明。也应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且无意进行限制。此外，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。在描述和要求保护本发明时，根据下述的定义使用下面的术语和其语法变体。
“2’-终止子核苷酸”是指包含在核苷酸糖部分的2’-位置的封闭基团(BG)的核苷酸类似物。“封闭基团”是指一般阻止核酸延伸的化学基团或部分(即，2’-终止子核苷酸一般不可被一种或多种核苷酸掺入生物催化剂延伸)。也就是说，一旦2’-终止子核苷酸掺入核酸(例如在核酸的3’-末端)，该封闭基团就阻止选自下述的至少一种核苷酸掺入生物催化剂对核酸的进一步延伸：例如，G46EE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，G46EE678GCS6DNA聚合酶，ΔZO5R聚合酶，E615GTaqDNA聚合酶，黄栖热菌聚合酶，TMA-25聚合酶，TMA-30聚合酶，TthDNA聚合酶，栖热菌属物种SPS-17聚合酶，E615GTaq聚合酶，栖热菌属ZO5R聚合酶，T7DNA聚合酶，KornbergDNA聚合酶I，克列诺DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶，微球菌DNA聚合酶，αDNA聚合酶，反转录酶，AMV反转录酶，M-MuLV反转录酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，大肠杆菌RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶，T3RNA聚合酶，T4DNA聚合酶，T7RNA聚合酶，RNA聚合酶II，末端转移酶，多核苷酸磷酸化酶，掺入核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物的DNA聚合酶等。示例性的封闭基团是磷酸基。本文也描述了其它代表性封闭基团。示例性的2’-终止子核苷酸包括2’-单磷酸-3’-羟基-5’-三磷酸核苷和2’-单磷酸-3’-羟基-5’-二磷酸核苷。在本文和例如Bodepudi等人在2004年6月28日提交的标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOF2′-TERMINATORNUCLEOTIDES”的美国专利申请号10/879,494和Gelfand等人在2004年6月28日提交的标题为“2′-TERMINATORNUCLEOTIDE-RELATEDMETHODSANDSYSTEMS”的10/879,493中也另外描述了其它2’-终止子核苷酸。
“5’-核酸酶探针”是指在被切割后能生成可检测的信号变化的标记的寡核苷酸。为了说明，在某些实施方案中，5’-核酸酶探针包含2个标记部分，且在一个标记被切割或以其他方式与寡核苷酸分离后发射出增加强度的辐射。在这些实施方案的一些中，例如，用5’末端猝灭剂部分和在探针3’末端的报道部分标记5’-核酸酶探针。在某些实施方案中，在不同于这些末端位置或除这些末端位置以外的一个或多个位置标记5’-核酸酶探针。当探针是完整的时，一般在标记部分之间发生能量转移，从而使得猝灭剂部分至少部分地猝灭从受体部分发射的荧光。在聚合酶链反应的延伸步骤中，例如，通过例如Taq聚合酶或另一种具有该活性的聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割结合到模板核酸上的5’-核酸酶探针，从而使得从受体部分发射的荧光不再被猝灭。为了进一步说明，在某些实施方案中，5’-核酸酶探针包括自互补区域，从而使得探针能在选择的条件下形成发夹结构。在这些实施方案中，5’-核酸酶探针在本文中也称作“发夹探针”。可以适用于本文所述方法的示例性的5’-核酸酶探针也描述在，例如，1993年5月11日授权给Gelfand等人的标题为“HOMOGENEOUSASSAYSYSTEMUSINGTHENUCLEASEACTIVITYOFANUCLEICACIDPOLYMERASE”的美国专利号5,210,015，1999年11月30日授权给Higuchi的标题为“HOMOGENEOUSMETHODSFORNUCLEICACIDAMPLIFICATIONANDDETECTION”的美国专利号5,994,056，和2001年1月9日授权给Higuchi的标题为“METHODSANDDEVICESFORHEMOGENEOUSNUCLEICACIDAMPLIFICATIONANDDETECTOR”的美国专利号6,171,785。
“受体部分”或“受体”是指能接受或吸收从能量源转移的能量的部分。在有些实施方案中，受体部分在吸收足够量的转移的能量后也能发射能量(例如，光、热等)。在这些实施方案中，受体也称作“报道部分”或“报道分子”。示例性的受体部分包括、但不限于，各种荧光团，例如-Red610(LC-Red610)、LC-Red640、LC-Red670、LC-Red705、JA-270、CY5、CY5.5以及其他。
“醇基”是指包含至少一个羟基的有机基团。
“醛基”是指包含式CHO的有机基团。
“链烯基”是指包含一个或多个碳-碳双键的线性的、分支的或环状的不饱和烃部分。示例性的链烯基包括乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1，1-二甲基-2-丙烯基、1，2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-3-丁烯基、1，2-二甲基-2-丁烯基、1，2-二甲基-3-丁烯基、1，3-二甲基-2-丁烯基、1，3-二甲基-3-丁烯基、2，2-二甲基-3-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-3-丁烯基、3，3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1，1，2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-2-丙烯基等。链烯基一般包含约1-20个碳原子，更一般包含约2-15个碳原子。链烯基可以为取代的或未取代的。
“烯基胺基”是指包含至少一个链烯基的氨基。
“烷氧基”是指包含氧原子的烷基，且包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、庚氧基、辛氧基等。
“烷基”是指线性的、分支的或环状的饱和烃部分，且包括所有位置异构体，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基、正己基、环己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基等。烷基一般包含约1-20个碳原子，且更一般包含约2-15个碳原子。烷基可以为取代的或未取代的。
“烷基胺基”是指包含至少一个烷基的氨基。
“炔基”是指包含一个或多个碳-碳三键的线性的、分支的或环状的不饱和烃部分。代表性炔基包括，例如，2-丙炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、1，1-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、2-甲基-4-戊炔基、3-甲基-4-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、1，1-二甲基-2-丁炔基、1，1-二甲基-3-丁炔基、1，2-二甲基-3-丁炔基、2，2-二甲基-3-丁炔基、3，3-二甲基-1-丁炔基、1-乙基-2-丁炔基、1-乙基-3-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基1-乙基-1-甲基-2-丙炔基等。炔基一般包含约1-20个碳原子，且更一般包含约2-15个碳原子。炔基可以为取代的或未取代的。
“炔基胺基”是指包含至少一个炔基的氨基。
“扩增子”是指通过拷贝或转录另一个分子产生的分子，例如，如在转录、克隆和/或聚合酶链反应(“PCR”)(例如，链置换PCR扩增(SDA)、双链体PCR扩增等)或其它核酸扩增技术中发生的。通常，扩增子是选择的核酸(例如，模板或靶核酸)的拷贝，或与其互补。
术语“扩增”在核酸上下文中是指生成多个多核苷酸拷贝或多核苷酸的部分，一般从小量多核苷酸(例如，单个多核苷酸分子)开始，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)过程中从靶或模板DNA分子的一个或少数拷贝产生多个DNA拷贝，是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用RT-PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子，是扩增的一种形式。此外，在转录过程中从单个DNA分子产生多个RNA分子，也是扩增的一种形式。
“芳基”是指源自芳族化合物的原子或部分的取代基。示例性的芳基包括，例如，苯基、苄基、甲苯基、甲苄基等。芳基任选包括多个芳环(例如，二苯基等)。另外，芳基可以为取代的或未取代的。
“芳氧基”是指包含氧原子的芳基，且包括，例如，苯氧基、氯苯氧基、甲基苯氧基、甲氧基苯氧基、丁基苯氧基、戊基苯氧基、苄氧基等。
“生物催化剂”是指起降低生物系统(例如，体外生物系统，体内生物系统等)中包含其它化合物或“底物”的化学反应的活化能的作用的催化剂。生物催化剂可以具有一种或多种催化活性，例如核苷酸去除活性(例如，焦磷酸解作用活性、核酸酶活性(例如，内切核酸酶和/或外切核酸酶活性)等)和/或核苷酸掺入活性(例如，聚合酶活性、连接酶活性、反转录酶活性等)。
“互补体”在核酸上下文中是指可以与至少一个核酸子序列在反向平行结合中组合或杂交的核酸或其区段。反向平行结合可以是分子内的，例如，以核酸内的发夹环形式，或分子间的，例如当两个或更多个单链核酸彼此杂交时。在本文提及的核酸中可以包括在天然核酸中不常见的某些碱基，且其包括，例如，次黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤及其它。互补性不需要完全；例如稳定的双链体或三链体可以含有错配的碱基对或不配对的碱基。也就是说，当核酸仅仅是“部分互补的”时，反向平行结合(无论分子内的还是分子间的)可以在某些条件下发生。通过经验地考虑许多变量，例如互补区的长度、互补区的碱基组分和序列、离子强度、解链温度(Tm)和错配碱基的发生率，核酸化学领域的技术人员可以确定例如双链体或三链体稳定性。
术语“羧酸基团”是指包含式COOH的有机基团。
术语“与......有关”是指在两个或更多个事物之间确立关联。在某些实施方案中，例如，给定反应中引物延伸的检测表明该靶核酸具有特定多态性。
术语“与......相对应”是指与核酸中指定的核苷酸位置或核苷酸序列相同或互补。本领域技术人员根据该术语使用的上下文将明白该术语的准确应用。
“供体部分”是指能向一个或多个受体部分转移、发射或贡献一种或多种形式的激发能的部分。
“酯基团”是指包含通式RCOOR′的一类有机化合物，其中R和R′独立地选自：烷基、链烯基、炔基、芳基或其组合。
“醚基团”是指包含2个附着到一个氧原子上的碳原子的线性的、分支的或环状的部分。示例性的醚基团包括，例如，甲氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基乙基等。
“可延伸的核苷酸”是指，一旦该可延伸的核苷酸掺入核苷酸聚合物中，就可以添加或共价结合至少一个其它核苷酸的核苷酸，例如，在生物催化剂催化的反应中。可延伸的核苷酸的实例包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。一般通过在可延伸的核苷酸的糖部分的3’-位置添加另一个核苷酸来延伸可延伸的核苷酸。
术语“延伸”在核酸的上下文中是指向给定核酸添加或以其他方式掺入一个或多个核苷酸的过程。
“延伸的寡核苷酸”是指已经添加或以其他方式掺入(例如，共价结合)一个或多个额外核苷酸的寡核苷酸(例如，引物核酸)。
“卤基团”是指包含卤素原子的基团，例如F、Cl、Br或I。
“发夹探针”是指寡核苷酸，其可以用于实现靶核酸检测，且包括至少一个自互补区域，从而使得该探针能在选择的条件下形成发夹或环结构。一般，发夹探针包括一个或多个标记部分。在一个示例性的实施方案中，猝灭剂部分和报道部分在发夹探针中彼此相对放置，从而使得当该探针处于发夹构象时，猝灭剂部分至少部分地猝灭从报道部分的光发射。相反，当在这些实施方案中的探针不是处于发夹构象时(例如，当探针与靶核酸杂交时)，从受体报道部分发射的光通常是可检测的。在这些实施方案的一些中，发夹探针也称作分子信标。在某些实施方案中，发夹探针也可以起5’-核酸酶探针或杂交探针的功能。
“杂环”是指饱和的、不饱和的或芳族的单环或双环，且其包含一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂环可以通过任意杂原子或碳原子附着到本发明核苷酸的糖部分或其类似物。示例性的杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)、吡咯烷基、哌啶基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基(tetrahydropyrimidinyl)、四氢苯硫基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢噻喃基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并苯硫基、吡咯基、吲哚基、异氮茚基、氮杂吲哚基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、苯并唑基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、2，3-二氮杂萘基、喹唑啉基等。
“同素环”是指饱和的或不饱和的(但是非芳族的)碳环，例如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环己烯等。
“杂交探针”是指包含至少一个可以用于实现靶核酸检测的标记部分的寡核苷酸。在有些实施方案中，杂交探针成对起作用。在这些实施方案的一些中，例如，一对中的第一个杂交探针在它的3′-末端处或附近包括至少一个供体部分，同时该对中的第二个杂交探针在它的5′-末端处或附近包括至少一个受体部分(例如，LC-Red610、LC-Red640、LC-Red670、LC-Red705、JA-270、CY5或CY5.5)。探针一般这样设计，从而当两个探针与靶或模板核酸杂交时(例如，在PCR过程中)，第一个杂交探针结合于第二个杂交探针的5′-末端侧或上游，且对于供体和受体部分之间发生能量转移而言足够近，从而生成可检测的信号。一般，第二个杂交探针也在它的3′-末端包括磷酸或其它基团，以防止在PCR过程中的探针延伸。
在一个多核苷酸与另一个多核苷酸(一般反向平行多核苷酸)的碱基配对相互作用中的核酸“杂交”或“退火”，导致形成双链体或其它高级结构，其一般称作杂交复合物。反向平行多核苷酸之间的主要相互作用一般是碱基特异性的，例如，A/T和G/C，通过Watson/Crick和/或Hoogsteen-型相互作用。不要求2个多核苷酸在它们的全长具有100％互补性来实现杂交。在有些方面，杂交复合物可以从分子间相互作用形成，或者，可以从分子内相互作用形成。杂交因为多种充分表征的力而发生，包括氢键合、溶剂排斥和碱基堆积。关于核酸杂交的详尽指导可以参见，Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryand MolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，partI，chapter2，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays，”Elsevier(1993)。
“标记”是指附着(共价地或非共价地)或能附着分子的部分，该部分提供或能提供关于分子的信息(例如，关于分子的描述性的、鉴别性的等信息)。示例性的标记包括供体部分、受体部分、荧光标记、非荧光标记、比色标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修改基团、抗体、抗原、生物素、半抗原和酶(包括，例如，过氧化物酶、磷酸酶等)。
“光发射改性剂”是指这样的物质，其非共价地结合混合物中的核酸，且当该物质接近辐射源时，它改变来自与核酸结合的辐射源的可检测的辐射发射。在有些实施方案中，例如，当光发射改性剂接触那些寡核苷酸时，本文所述的某些光发射改性剂减少或猝灭来自包含至少一个发光部分(例如，5’-核酸酶探针等)的寡核苷酸的否则会发射的光的发射(例如，基线光发射)。光发射改性剂一般是可溶的，且在这些实施方案中也称作“可溶的猝灭剂”或“可溶的光发射改性剂”。另外，光发射改性剂修改来自给定寡核苷酸的光发射的程度一般与该寡核苷酸的长度成比例。例如，如果在5’-核酸酶反应中切割寡核苷酸，特定光发射改性剂通常将修改来自该寡核苷酸的标记片段的光发射至比来自完整寡核苷酸的更低的程度。示例性的光发射改性剂包括各种二嗪和噻嗪染料，它们在本文中和在例如Gupta等人于2006年6月23日提交的标题为“LIGHTEMISSIONMODIFIERSANDTHEIRUSESINNUCLEICACIDDETECTION，AMPLIFICATIONANDANALYSIS”的美国专利申请号11/474,062中进一步描述。
“混合物”是指2种或更多种不同组分的组合。“反应混合物”是指包含可以参与和/或促进给定反应或测定的分子的混合物。为了说明，扩增反应混合物通常包括含有进行扩增反应必需的试剂的溶液，且一般含有在适当缓冲液中的引物、生物催化剂(例如，核酸聚合酶、连接酶等)、dNTPs和二价金属阳离子。反应混合物被称为是完整的(如果它含有进行反应必需的所有试剂的话)和不完整的(如果它仅含有必需试剂的子集的话)。本领域技术人员将理解，反应组分常规地作为分开的溶液来储存，各自含有总组分的子集，这是为了方便、储存稳定性或允许依赖于应用调节组分浓度，以及在反应之前组合反应组分，以生成完整的反应混合物。此外，本领域技术人员将理解，反应组分为了商业化而分开包装，且有用的商业试剂盒可以含有反应或测定组分的任意子集，它们包括本发明的生物分子。
“部分”或“基团”是指某物(例如分子)被分成或可以分成的部分之一(例如，官能团、取代基等)。例如，在某些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包括至少一个供体部分和/或至少一个受体部分。
术语“突变”是指，与相对于未改变的或天然形式的核酸或编码的蛋白产物，已经改变了它的核酸序列的核酸或已经改变了它的氨基酸序列的核酸编码的蛋白产物。这样的改变包括，例如，点突变或取代、缺失和插入。
“不可延伸的”核苷酸是指，在掺入核酸后阻止例如通过至少一种生物催化剂对核酸的进一步延伸的核苷酸。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指可以与核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物相对应的聚合物。这包括核苷酸(例如RNA和DNA)的聚合物，以及其修饰形式，肽核酸(PNAs)、锁定核酸(LNATM)等。在某些实施方案中，核酸可以是包含多个单体类型(例如，RNA和DNA亚基)的聚合物。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体区段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针、引物等。核酸可以是例如单链的、双链的、三链的等，且不限于任意特定长度。除非另有说明，除明确指出的任意序列外，特定核酸序列任选还包含或编码互补序列。
核酸不限于具有天然存在的多核苷酸序列或结构、天然存在的主链和/或天然存在的核苷酸间键的分子。例如，该定义中也包括含有一个或多个碳环糖的核酸(Jenkins等人(1995)Chem.Soc.Rev.pp169-176)。为了进一步说明，尽管核酸将通常含有磷酸二酯键，但在有些情况下，包括具有替代主链的核酸类似物。这些包括，但不限于，磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron49(10)：1925和其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35：3800；Sprinzl等人(1977)Eur.J. Biochem.81：579；Letsinger等人(1986)Nucl.AcidsRes.14：3487；Sawai等人(1984)Chem.Lett.805；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem. Soc.110：4470；和Pauwels等人(1986)ChemicaScripta26：1419)，硫 代磷酸酯(Mag等人(1991)NucleicAcidsRes.19：1437和美国专利号5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321)，O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)键(Eckstein，OligonucleotidesandAnalogues：APracticalApproach，OxfordUniversityPress(1992))，和肽核酸主链和键(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等人(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature365：566；和Carlsson等人(1996)Nature380：207)。其它类似物核酸包括具有带正电荷的主链(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad. Sci.USA92：6097)、非离子性主链(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English30：423；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等人(1994)Nucleoside&Nucleotide13：1597；Chapters2和3，ASCSymposiumSeries580，“CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch”，Ed.Y.S.Sanghvi和P.DanCook；Mesmaeker等人(1994)Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4：395；Jeffs等人(1994)J. BiomolecularNMR34：17；TetrahedronLett.37：743(1996))和非核糖主链的那些，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506,和Chapters6and7，ASCSymposiumSeries580，CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch，Ed.Y.S.Sanghvi和P.DanCook中所述的那些。几种核酸类似物也描述在，例如，Rawls，C&ENewsJun.2，1997page35。可以修饰核糖-磷酸主链，以促进其它部分(例如标记部分)的添加，或改变这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了在核酸中一般见到的天然存在的杂环碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外，核酸类似物也包括具有非天然存在的杂环或其它修饰的碱基的那些。为了说明，任选包括在核苷酸中使用的用作解链温度(Tm)改性剂的某些碱基。例如，其中的有些包括7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等)、吡唑[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等。参见，例如，于1999年11月23日授权给Seela的美国专利号5,990,303，其标题为“SYNTHESISOF7-DEAZA-2’-DEOXYGUANOSINENUCLEOTIDES”。其它代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。许多非天然存在的碱基也描述在，例如，Seela等人(1991)Helv.Chim.Acta74：1790，Grein等人(1994)Bioorg.Med. Chem.Lett.4：971-976，和Seela等人(1999)Helv.Chim.Acta82：1640。
修饰的碱基和核苷酸的其它实例也描述在，例如，于1996年1月16日授权给Froehler等人的美国专利号5,484,908，其标题为“OLIGONUCLEOTIDESCONTAINING5-PROPYNYLPYRIMIDINES”，于1997年7月8日授权给Froehler等人的美国专利号5,645,985，其标题为“ENHANCEDTRIPLE-HELIXANDDOUBLE-HELIXFORMATIONWITHOLIGOMERSCONTAININGMODIFIEDPYRIMIDINES”，于1998年11月3日授权给Froehler等人的美国专利号5,830,653，其标题为“METHODSOFUSINGOLIGOMERSCONTAININGMODIFIEDPYRIMIDINES”，于2003年10月28日授权给Kochkine等人的美国专利号6,639,059，其标题为“SYNTHESISOF[2.2.1]BICYCLONUCLEOSIDES”，于2001年10月16日授权给Skouv的美国专利号6,303,315，其标题为“ONESTEPSAMPLEPREPARATIONANDDETECTIONOFNUCLEICACIDSINCOMPLEXBIOLOGICALSAMPLES”，和于2003年5月15日公开的Kochkine等人的美国专利申请公开号2003/0092905，其标题为“SYNTHESISOF[2.2.1]BICYCLONUCLEOSIDES”。
“核苷”是指包含共价连接到糖部分(例如，核糖糖等)、糖部分衍生物或糖部分功能等价物(例如，类似物，例如碳环)上的碱基或碱性基的核酸组分(例如，其包含至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基等)。例如，当核苷包含糖部分时，碱基一般连接到该糖部分的1’-位置。如上所述，碱基可以是天然存在的(例如，嘌呤碱基，例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，嘧啶碱基，例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))或非天然存在的(例如，7-脱氮嘌呤碱基、吡唑[3，4-d]嘧啶碱基、丙炔基-dN碱基等)。示例性的核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷、碳环核苷等。
“核苷酸”是指核苷的酯，例如，核苷的磷酸酯。为了说明，核苷酸可以包含共价连接到核苷糖部分的5’位置上的1、2、3或更多个磷酸基。
“核苷酸掺入生物催化剂”是指催化核苷酸向核酸中的掺入的催化剂。核苷酸掺入生物催化剂一般是酶。“酶”是基于蛋白和/或基于核酸的催化剂，其作用是降低包含其它化合物或“底物”的化学反应的活化能。“核苷酸掺入酶”是指催化核苷酸向核酸中的掺入的酶，例如，在核酸扩增过程等过程中。示例性的核苷酸掺入酶包括，例如，聚合酶、末端转移酶、反转录酶、端粒末端转移酶、多核苷酸磷酸化酶等。“热稳定的酶”是指对热稳定的、耐热的、且当经受升高的温度进行选定的时间段时保留足够的催化活性的酶。例如，当经受升高的温度进行实现双链核酸变性所必需的时间时，热稳定的聚合酶保留足以实现后续的引物延伸反应的活性。核酸变性所必需的加热条件是本领域技术人员众所周知的，且示例在1987年7月28日授权给Mullis的标题为“PROCESSFORAMPLIFYINGNUCLEICACIDSEQUENCES”的美国专利号4,683,202和1987年7月28日授权给Mullis等人的标题为“PROCESSFORAMPLIFYING，DETECTING，AND/OR-CLONINGNUCLEICACIDSEQUENCES”的美国专利号4,683,195中，也参见美国专利号4,965,188。为了进一步说明，“热稳定的聚合酶”是指适用于循环变温反应例如聚合酶链反应(“PCR”)的酶。对于热稳定的聚合酶，酶活性是指以正确方式催化核苷酸的组合，以形成与模板核酸互补的引物延伸产物。
“寡核苷酸”是指包含至少2个核酸单体单元(例如，核苷酸)、一般超过3个单体单元且更一般大于10个单体单元的核酸。寡核苷酸的精确大小通常依赖于多种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。一般，核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物相连，包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等，包括结合的平衡离子，例如，H+、NH4 +、Na+等，如果这样的平衡离子存在的话。任选地通过任意合适的方法制备寡核苷酸，包括、但不限于，分离现有的或天然的序列、DNA复制或扩增、反转录、克隆和限制酶切消化适当序列，或通过下述方法直接化学合成，例如Narang等人(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯方法；Brown等人(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981)TetrahedronLett.22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；Matteucci等人(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191的三酯方法；自动化合成方法；或于1984年7月3日授权给Caruthers等人的标题为“PROCESSFORPREPARINGPOLYNUCLEOTIDES”的美国专利号4,458,066的固体支持物方法，或本领域技术人员已知的其它方法。
“多态性”或“多态核苷酸位置”是指可能具有多种基因型之一的一个或多个核酸位点。多态性可以是本领域技术人员已知的任意多态性，包括可能的突变、插入或缺失。多态性可以是在核酸的一个位点或在核酸的多个位点。为了本发明的目的，“多态性”可以是指在一个核酸位点的多态性，或多位点多态性的一个特定位点。在某些实施方案中，不需要多态性是本领域技术人员熟知的或已知的。多态性可以仅仅是对照核酸和靶核酸之间的任意差异。
“引物核酸”或“引物”是可以与靶或模板核酸杂交且允许在适当反应条件下使用例如核苷酸掺入生物催化剂(例如聚合酶)延伸或延长链的核酸。引物核酸一般是天然的或合成的寡核苷酸(例如，单链寡脱氧核糖核苷酸)。尽管任选地使用其它引物核酸长度，但它们一般包含长度为约8至约100个核苷酸的杂交区域。短引物核酸通常需要更冷的温度，以与模板核酸形成足够稳定的杂种复合物。与模板核酸的子序列至少部分互补的引物核酸一般足以与模板杂交，用于使延伸发生。如果需要，可以通过掺入标记来标记引物核酸，所述标记可通过例如，光谱的、光化学的、生化的、免疫化学的、化学的或其它技术来检测。为了说明，有用的标记包括供体部分、受体部分、猝灭剂部分、放射性同位素、电子致密剂、酶(常用于进行ELISAs)、生物素或可得到其抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。许多这样的和其它的标记在本文中予以进一步描述，和/或另外是本领域已知的。本领域技术人员将认识到，在某些实施方案中，引物核酸也可以用作探针核酸。
术语“探针核酸”或“探针”是指在合适条件下能选择性地与靶或模板核酸杂交的标记的或未标记的寡核苷酸。一般，探针与核酸样品中包含的特定靶序列充分互补，以在选定的杂交条件(例如，但不限于，严格杂交条件)下与靶序列形成稳定的杂交双链体。在充分严格的杂交条件下使用探针进行的杂交测定，允许选择性地检测特定靶序列。术语“杂交区”是指与靶序列精确地或基本上互补并因而能与其杂交的核酸区域。关于用于辨别序列中的单核苷酸差异的杂交测定，杂交区的长度一般是约8至约100个核苷酸。尽管杂交区通常是指整个寡核苷酸，但探针可以包括额外的核苷酸序列，其作用是例如作为接头结合位点，以提供将探针序列附着到固体支持物上的位点。本发明的探针通常包含在含有一个或多个标记(例如，供体部分、受体部分和/或猝灭剂部分)的核酸中，例如5’-核酸酶探针、杂交探针、荧光共振能量转移(FRET)探针、发夹探针或分子信标，其也可以用于检测探针和样品中的靶核酸之间的杂交。在有些实施方案中，探针的杂交区与靶序列完全互补。但是，一般而言，不需要完全互补(即，核酸可以彼此部分互补)；稳定的杂交复合物可以含有错配的碱基或不配对的碱基。可能需要修改严格条件，以允许稳定杂交复合物中具有一个或多个碱基对错配或不配对的碱基。Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratory Manual，3rdEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(2001)提供了适当修改的指南。靶/探针杂交复合物的稳定性依赖于许多变量，包括寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、温度和离子条件。本领域技术人员将认识到，一般而言，给定探针的精确互补体类似地用作探针。本领域技术人员也将认识到，在某些实施方案中，探针核酸也可以用作引物核酸。
术语“焦磷酸解作用”是指在有焦磷酸(PPi)存在下从核酸去除一个或多个核苷酸，以产生一个或多个核苷三磷酸。
“猝灭剂部分”或“猝灭剂”是指能减少来自来源的可检测的辐射(例如，荧光或发光辐射)发射的部分，所述来源否则已经发射该辐射。猝灭剂一般使从来源发射的可检测辐射减少至少50％、一般至少80％、且更一般至少90％。某些猝灭剂可以以对于该猝灭剂特有的信号重新发射从例如荧光染料吸收的能量，且因而猝灭剂也可以是受体部分。该现象通常称作荧光共振能量转移或FRET。或者，猝灭剂可以以光以外的形式(例如热)散逸从荧光染料吸收的能量。在FRET应用中常用的分子包括，例如，荧光素、FAM、JOE、罗丹明、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL和EDANS。荧光染料是受体还是猝灭剂通过它的激发和发射光谱、以及它配对的荧光染料来限定。例如，FAM被488nm波长的光最有效地激发，且发射500至650nm光谱的光，最大发射为525nm。FAM是适合与例如最大激发为514nm的TAMRA猝灭剂一起使用的供体部分。散逸从荧光染料吸收的能量的示例性的非荧光的或黑暗猝灭剂包括BiosearchTechnologies，Inc.(Novato，CA，USA)销售的BlackHole猝灭剂TM。BlackHole猝灭剂TM是包含至少3个自由基的结构，所述自由基选自取代的或未取代的芳基或杂芳基化合物或其组合，其中至少2个残基通过环外重氮键连接(参见，例如，Cook等人的在2001年11月15日公开的国际公开号WO01/86001，其标题为“DARKQUENCHERSFORDONOR-ACCEPTORENERGYTRANSFER”)。在例如于2002年10月15日授权给Horn等人的标题为“OLIGONUCLEOTIDEPROBESBEARINGQUENCHABLEFLUORESCENTLABELS，ANDMETHODSOFUSETHEREOF”的美国专利号6,465,175中，也提供了示例性的猝灭剂。
生物聚合物的“序列”是指生物聚合物中单体单元(例如，核苷酸等)的次序和同一性。核酸的序列(例如，碱基序列)一般以5’至3’方向阅读。
“甲硅烷基”是指包括通式SiRR1R2的一类化合物，其中R、R1和R2独立地是H、烷基、链烯基、炔基、芳基或这些基团的组合。
“子序列”是指整个生物聚合物序列(例如核酸序列)的任意部分。
“系统”在分析仪器上下文中是指对象和/或设备的组，其形成执行所需目的的网络。
“靶”是指要扩增、检测和/或以其他方式分析的生物分子(例如，核酸等)或其部分。
“终止子核苷酸”是指在掺入核酸后基本上阻止例如通过至少一种核苷酸掺入生物催化剂对核酸的进一步延伸的核苷酸。
“硫醚基团”是指包含2个附着到单个硫原子上的碳原子的线性的、分支的或环状部分，且包括例如，甲硫基甲基、甲硫基乙基、甲硫基丙基等。
II.简介
本发明涉及寡核苷酸的各种应用，所述寡核苷酸包括一般在它们的3’-末端的2’-终止子核苷酸且因此被封闭。也就是说，2’-终止子核苷酸通常阻止本文提及的一种或多种生物催化剂的延伸。但是，这些封闭的寡核苷酸通常是“可激活的”，因为如果去除2’-终止子核苷酸，那么它们可以被延伸。在有些实施方案中，例如，本文所述的寡核苷酸通过焦磷酸解作用而激活，后者仅仅是核酸聚合的逆反应。更具体地，在有焦磷酸存在下，2’-终止子核苷酸可以从双链体核酸去除，以生成核苷三磷酸和3’-末端缩短的寡核苷酸，后者可以在聚合反应中延伸。在PAP有关的应用中焦磷酸解作用和聚合的连续偶联，通常提供与缺乏焦磷酸解作用激活的过程相比提高的特异性，因为在PAP条件下非特异性扩增需要错配焦磷酸解作用和生物催化剂的错掺，后者是罕见的事件。此外，无论引物是在溶液中还是与对应的模板核酸退火时，本文所述的某些酶促生物催化剂的校正3’-5’外切核酸酶活性都令人惊奇地没有从本文所述的引物去除封闭基团(即，激活引物)。因此，与使用缺乏校正活性的酶的各种现有PAP有关的方法相比，这些酶的校正活性一般提供更高的引物延伸产物的保真合成。如在该公开内容中所例证的，本文所述的封闭的寡核苷酸可以用于基本上任意的聚合或扩增过程中，包括SNP分析和罕见体细胞突变检测，以及对于本领域技术人员将显而易见的许多其它应用。
如上所述，本文所述PAP有关的方法(例如，包含核糖核苷酸掺入热活性的和/或热稳定的DNA聚合酶)通常相对于现有方法提高寡核苷酸介导的合成反应的特异性。此外，相对较高的、且非动力学限制的dNTPs和NTPs浓度通常是允许的。与许多以前的PAP有关的方法不同，通过不使酶对底物“饥饿”，这一般导致更快的延伸速率。另外，这通常也意味着，焦磷酸解作用释放的2’-终止子三磷酸的重新掺入的可能性低得多。此外，本文提及的酶对于dNTPs(和NTPs)一般具有快速的延伸速率。这缩短了必需的延伸时间，增加了全长引物延伸的效率，并增加了这些方法的PCR效率。关于这些酶的细节也描述在，例如，Bauer等人于2006年10月18日提交的美国专利申请号60/852882，其标题为“MUTANTDNAPOLYMERASESANDRELATEDMETHODS”。此外，本文提及的封闭的引物可以经济地且容易地制备。具体地，这些封闭的寡核苷酸的合成也描述在，例如，Bodepudi等人于2004年6月29日提交的国际申请号WO2005/026184，其标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOFNUCLEICACIDSCOMPRISING2’TERMINATORNUCLEOSIDES”。
为了进一步说明，图1示意解释了示例性的单核苷酸多态性(SNP)检测测定。如反应A所示，引物核酸100与模板核酸102杂交。引物100被封闭，因为它在它的3’末端包括2’-终止子核苷酸(T*)。另外，引物100的2’-终止子核苷酸的位置对应着模板102中的多态位置，且在所示的情况下，与该位置的核苷酸(A)互补。在有焦磷酸(PPi)和具有焦磷酸解作用活性的生物催化剂存在下，进行焦磷酸解作用反应，从而去除2’-终止子核苷酸，以由此激活引物100。如进一步显示的，然后在聚合反应中在有生物催化剂(例如，核酸聚合酶等)和dNTPs(或dNTPs和NTPs(即，核糖核苷酸)的混合物)存在下延伸激活的引物100，以生成延伸的引物104，这与在多态位置处具有等位基因A的模板102相关。使用基本上任意可得到的检测技术，包括使用5’-核酸酶探针、发夹探针、杂交探针、质谱分析法等，可以检测延伸的引物104。为了进一步说明，在某些实施方案中，T*用报道部分标记。在这些实施方案的一些中，引物100中离报道部分足够近的另一个位置用猝灭剂部分标记，以猝灭从报道部分发射的光。在这些实施方案中，如果焦磷酸解作用进行(例如，如图1的反应A所示)，则随着T*从引物100去除和与猝灭剂部分充分分开，从报道部分发射的光将是可检测的。与反应A形成对比，反应B中引物100的2’-终止子核苷酸不与模板核酸106中的多态位置处的核苷酸(G)互补。作为该错配的结果，甚至在有生物催化剂和PPi存在下也仅发生少许(如果有的话)焦磷酸解作用或聚合，且因此仅发生少许(如果有的话)引物延伸。该PAP有关的过程的许多其它变化也可以与本文所述的焦磷酸解作用可激活的寡核苷酸一起使用。下面另外描述了它们的有些其它的代表性的解释。
除了各种方法以外，本发明也提供了包含焦磷酸解作用可激活的寡核苷酸的反应混合物和有关的系统。下面(包括在实施例中)描述了本发明的这些和许多其它特征。
III.2’-终止子核苷酸
本发明涉及包含寡核苷酸的应用的方法、反应混合物、系统和其它方面，所述寡核苷酸包含2’-终止子核苷酸(即，2’-终止子封闭的寡核苷酸)。下面进一步描述了寡核苷酸合成和有关的核酸合成试剂。为了说明，在本发明的各种实施方案中使用的核苷酸一般包括在完整糖环的3’-位置的羟基和在糖部分的2’-位置的封闭基团(例如，带负电荷的封闭基团、庞大的封闭基团等)。本文所述的某些生物催化剂包含以模板指导的方式用这些2’-终止子核苷酸延伸引物核酸的能力。在2’-终止子核苷酸掺入引物核酸的3’-末端后，一般致使该核酸不可被生物催化剂延伸。另外，有些生物催化剂包括从寡核苷酸去除2’-终止子核苷酸的能力，例如，通过焦磷酸解作用。关于2’-终止子核苷酸、2’-终止子封闭的寡核苷酸、合成和/或有关的生物催化剂的其它细节，也描述在，例如，Bauer等人于2006年10月18日提交的美国专利申请号60/852882，其标题为“MUTANTDNAPOLYMERASESANDRELATEDMETHODS”，Bodepudi等人于2004年6月29日提交的国际申请号WO2005/026184，其标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOFNUCLEICACIDSCOMPRISING2’-TERMINATORNUCLEOSIDES”，Gelfand等人于2004年6月28日提交的美国专利申请号10/879,493，其标题为“2’-TERMINATORNUCLEOTIDE-RELATEDMETHODSANDSYSTEMS”，和Bodepudi等人于2004年6月28日提交的美国专利申请号10/879,494，其标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOF2′-TERMINATORNUCLEOTIDES”。
在本发明的方法和其它方面中使用的2’-终止子核苷酸通常包括式：
其中R1是H、OH、亲水基或疏水基；B是至少一个同素环、至少一个杂环(有或没有环外杂原子)、至少一个芳基或其组合；BG是封闭基团；Z是O或CH2；且代表单键或双键。在有些实施方案中，标记这些核苷和核苷酸。此外，这些2’-终止子核苷酸一般包含1、2、3或更多个附着在5’位置的磷酸基。在一个实施方案中，例如，2’-终止子核苷酸包含2’-单磷酸-3’-羟基-5’-三磷酸核苷。
图2A-D示意解释了2’-终止子核苷酸的某些实施方案。具体地，图2A示意显示了腺苷四磷酸终止子核苷酸，图2B示意描述了鸟苷四磷酸止子核苷酸，图2C示意解释了尿苷四磷酸终止子核苷酸，和图2D示意显示了胞苷四磷酸终止子核苷酸。
A.碱基
在2’-终止子核苷或核苷酸的糖部分的1’位置，任选包含可以通过例如氢键或碱基堆积机理与另一个核酸碱基配对的基本上任意的杂环或芳基(即，作为碱基或B基团)。因此，本文没有尝试描述所有可能使用的基团。但是，为了解释目的，下面提供了某些代表性B基团。在有些实施方案中，例如，B包含式：
其中X1和X2独立地选自CR8和N；R2是H、OH或NR4R5；R3是H、OH或NR6R7；R4、R5、R6和R7独立地选自H、烷基、链烯基、苄基、芳基、芳氧基及其组合；且R8是H、卤基团、烷基、链烯基、炔基、烷基胺基、烯基胺基、炔基胺基、烷基醇基、链烯基醇基、炔基醇基、未取代的聚乙二醇或取代的聚乙二醇。
在其它实施方案中，B包含式：
其中X1和X2独立地选自CH和N；R2是O或S；R3是H、OH或NR4R5；且R4和R5独立地选自H、烷基、链烯基、苄基、芳基及其组合。
在有些实施方案中，B包含式：
其中R2是H、OH或NR4R5；R3是H、OH或NR6R7；且R4、R5、R6和R7独立地选自H、烷基、链烯基、炔基、苄基、芳基及其组合。
在有些实施方案中，B包含式：
其中X是CH或N；R2和R3独立地选自H、OH和NHR4；R4是H、烷基、链烯基、苄基、芳基或其组合；且，R5是OH、NH2、SH、卤基团、醚基团、硫醚基团、烷基、链烯基、炔基、烷基胺基、烯基胺基、炔基胺基或其组合。
在其它实施方案中，B包含式：
其中X是CH或N；R2是O或S；R3是H、OH或NHR4；R4是H、烷基、链烯基、苄基、芳基或其组合；且R5是OH、NH2、SH、卤基团、醚基团、硫醚基团、烷基、链烯基、炔基、烷基胺基、烯基胺基、炔基胺基或其组合。
在某些实施方案中，B包含式：
其中X1和X2独立地选自CH和N；R2选自H、烷基、链烯基、苄基、芳基、芳氧基或其组合；且R3是O或S。
在其它实施方案中，B包含式：
其中R2和R3独立地选自O和S；且R4和R5独立地选自H、NH2、SH、OH、烷基、链烯基、炔基、苄基、芳基、芳氧基、烷氧基、卤基团及其组合。
在有些实施方案中，B包含式：
其中R2和R3独立地选自O和S；且R4是H、NH2、SH、OH、烷基、链烯基、苄基、芳基、芳氧基、烷氧基、卤基团或其组合。
在其它实施方案中，B包含式：
其中R2和R3独立地选自O和S。
在有些实施方案中，B包含式：
其中R2和R3独立地选自O和S，且R4是H、烷基、链烯基或炔基。
在其它实施方案中，B包含式：
其中R2是O或S；R3和R4独立地选自H、NH2、SH、OH、COOH、COOCH3、COOCH2CH3、CHO、NO2、CN、烷基、链烯基、炔基、苄基、芳基、芳氧基、烷氧基、卤基团及其组合；且R5是烷基、链烯基、芳基、苄基或其组合。
B.封闭基团
在糖部分的2’位置使用的封闭基团(BG)也包括各种实施方案。在有些实施方案中，例如，BG是带负电荷的基团和/或庞大的基团。为了进一步说明，BG任选地选自，例如，CN、NO2、N3、卤基团、醚基团、烷基醚基团、芳基醚基团、醛基团、羧酸基团、酯基团、氨基、OCH3、OCH2COOH、O-甲硅烷基醚基团、酮基团、O-内酯基团、O-烷基、O-环烷基、O-链烯基、O-炔基、氨基甲酸酯基、亚氨基、酰胺基及其组合。更具体地，BG任选地包含式：
在其它实施方案中，BG包含式：
其中Q是O、S或NH；X是H、OH、CH3、BH3、F或SeH；且Z是O、S或Se。图2B示意描述了一个核苷酸，其包含具有该式的封闭基团。为了进一步说明，BG任选地包含式：
其中Q是O、S或NH；X是O、S或NH；Z是O、S或Se；且R是烷基、链烯基或炔基。图2A示意描述了一个2’-终止子核苷酸，其包含具有该式的封闭基团。在另一个示例性的实施方案，BG包含式：
其中Q是O、S或NH；X是O、S或NH；Z是O、S或Se；L是-CONH(CH2)nNH-、-CO(CH2)nNH-或-CONH(CH2CH2O)nCH2CH2NH-；n是大于0的整数；且R是NH2、SH、COOH、猝灭剂部分、报道部分、生物素或亲和部分。
IV.2’-终止子核苷和核苷酸的合成
可以使用各种方法，合成在如本文所述使用的寡核苷酸中包含的2’-终止子核苷和核苷酸。例如，一种生产标记的、不可延伸的核苷酸的方法包括，将至少一个磷酸基团附着到核苷(例如，核糖核苷，碳环核苷等)的糖部分的5’-位置，和将至少一个封闭基团附着到该核苷的糖部分的2’-位置。在该方法中使用的核苷中任选包含的示例性的封闭基团和碱基如本文所述。该方法也包括，将至少一种标记附着到核苷的糖部分、封闭基团和/或碱基。合适的标记在下面进一步描述。
为了进一步说明，一种生产任选使用的2’-单磷酸核苷的方法包括，在有效生成2’-单磷酸核苷的条件下，使包含下式的核苷酸与三偏磷酸三钠(NaPO3)3反应：
其中P是至少一个磷酸基；n是大于0的整数；R1是H、OH、亲水基或疏水基；B是至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基或其组合；Z是O或CH2；且代表单键或双键。在某些实施方案中，例如，该核苷酸包含2个磷酸基，而在其它实施方案中，该核苷酸包含3个磷酸基或更多个基团。生产核苷酸的有效条件通常包括，在碱性pH溶液中进行反应。例如，一般在大于约8.0的pH、更一般大于约10.0的pH、且更一般大于约12.0(例如，约12.5、13.0、13.5或14.0)的pH进行合成。各种碱性化合物都可以用于调节反应混合物的pH，包括，例如，KOH和NaOH以及本领域广泛知晓的许多其它的。核苷酸一般是限制性试剂。尽管任选地使用其它温度条件，但这些合成反应通常在室温或接近室温(即，约20℃至约30℃，例如，在约23℃、24℃、25℃、26℃等)进行。另外，通常允许这些反应进行至少约4小时，一般至少约6小时，且甚至更一般至少约16小时。
另外，也可以使用各种区域专一性的或至少区域选择性的合成途径，从而使得产物纯化通常最小化，如果没有完全免除的话。这些合成途径一般包括，使用在糖部分的3’-位置的各种保护基(例如，TBDMS、SiR、TOM、BOC等)。2’-终止子核苷酸的合成，包括区域专一性的合成途径，也描述在，例如，Bodepudi等人于2004年6月28日提交的美国专利申请号10/879,494，其标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOF2′-TERMINATORNUCLEOTIDES”。
可以适用于本发明的合成规程的各种合成技术是普遍已知的，且描述在，例如，March，AdvancedOrganicChemistry：Reactions， Mechanisms，andStructure，4thEd.，JohnWiley&Sons，Inc.(1992)，和Carey和Sundberg，AdvancedOrganicChemistryPartA：Structureand Mechanism，4thEd.，PlenumPress(2000)。在本发明的核苷酸的合成中有用的化学原料和其它反应组分可以从各种商业供应商容易地得到，包括，例如，Sigma-Aldrich，Inc.(StLouis，MO)。
V.包含2’-终止子核苷的封闭的核酸的合成
使用各种类型的核酸合成试剂，可以实现包含2’-终止子核苷的封闭的寡核苷酸的合成。为了说明，可以酶促地(例如，使用核苷酸掺入生物催化剂(例如，DNA聚合酶，连接酶等))或通过化学合成(例如，使用亚磷酰胺方法或亚磷酸三酯方法)(Herdewijn，Oligonucleotide Synthesis：MethodsandApplications，HumanaPress(2005)，Gait(Ed.)，OligonucleotideSynthesis，OxfordUniversityPress(1984)，Vorbruggen等人，HandbookofNucleosideSynthesis，JohnWiley&Sons，Inc.(2001)，和Hermanson，BioconjugateTechniques，ElsevierScience(1996))来合成寡核苷酸。使用例如标记的核苷三磷酸单体(例如，标记的可延伸的核苷酸，标记的2’-终止子核苷酸等)，可以在酶促合成过程中引入标记，或使用标记的非核苷酸或核苷酸亚磷酰胺，可以在化学合成过程中引入标记，或可以在合成后引入标记。2’-终止子封闭的寡核苷酸的合成也描述在，例如，Bodepudi等人于2004年6月29日提交的国际申请号WO2005/026184，其标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOFNUCLEICACIDSCOMPRISING2’-TERMINATORNUCLEOSIDES”。封闭的寡核苷酸的合成也在下面的实施例中进一步描述。
酶促合成标记的寡核苷酸的示例性的程序包括，使模板或靶核酸变性，和将一对引物与模板退火。在有些实施方案中，将脱氧核苷三磷酸(例如，dGTP、dATP、dCTP和dTTP)的混合物加入反应混合物，其中所述脱氧核苷酸之一的至少部分如本文所述进行标记。接着，通常在使酶具有活性的条件下，将核苷酸掺入催化剂例如DNA聚合酶加入反应混合物。通过在聚合酶链合成过程中掺入标记的脱氧核苷酸，形成标记的寡核苷酸。在该方法中使用的DNA聚合酶通常是热稳定的，且反应温度一般在变性和延伸温度之间循环，以通过PCR合成靶核酸的标记的互补链(Edwards等人(Eds.)，Real-TimePCR：An EssentialGuide，HorizonScientificPress(2004)，Innis等人(Eds.)，PCR Strategies，ElsevierScience&TechnologyBooks(1995)，和Innis等人(Eds.)，PCRProtocols，AcademicPress(1990)。此后，使用本领域技术人员已知的各种纯化技术，将所需扩增子与反应混合物的其它组分分离。然后可以在2’-终止子核苷酸掺入个别扩增子链的3’末端的条件下，使扩增子变性并与模板核酸退火，以生成所需的封闭的寡核苷酸。或者，可以将包含2’-终止子核苷的寡核苷酸(酶促地或化学地合成)连接至扩增子链，以生成所需的封闭的寡核苷酸。本领域技术人员将明白合成封闭的寡核苷酸的这些酶促方法的其它变体。
尽管也任选地使用其它方法，但通常使用亚磷酰胺方法，生产使用化学合成制备的封闭的寡核苷酸。基于亚磷酰胺的合成通常用附着到固体支持物上的增长的寡核苷酸链来进行，从而可以通过过滤容易地去除液相中的多余试剂。这使得在循环之间不需要其它纯化步骤。
为了简单描述示例性的使用亚磷酰胺方法的固相寡核苷酸合成循环，一般最初用酸(例如，三氯乙酸)处理包含受保护的核苷酸单体的固体支持物，以去除5′-羟基保护基，释放出用于后续偶联反应的羟基。然后通常通过向反应物中同时加入受保护的亚磷酰胺核苷单体和弱酸(例如，四唑)，形成激活的中间体。弱酸使亚磷酰胺的氮质子化，从而形成反应性中间体。核苷向增长的核酸链的添加通常在30秒内完成。此后，一般进行加帽步骤，以终止没有添加核苷的任意寡核苷酸链。可以用例如乙酸酐、1-甲基咪唑等来进行加帽。然后通过氧化，将核苷酸间键从亚磷酸酯转变成更稳定的磷酸三酯，其中使用例如碘作为氧化剂，且使用水作为氧供体。氧化后，一般用质子酸(proticacid)(例如，三氯乙酸或二氯乙酸)去除羟基保护基，且重复该循环至链延长结束。合成后，通常使用碱例如氢氧化铵或叔丁基胺，从固体支持物切割下合成的寡核苷酸。切割反应也去除任意磷酸酯保护基(例如，氰乙基)。最后，通过在升高的温度(例如，最高达约55℃)、在碱性条件下处理寡核苷酸溶液，去除碱基的环外胺上的保护基和一个或多个标记部分上的羟基保护基。
用于通过亚磷酰胺方法形成寡核苷酸的化学描述，也提供在，例如，于1984年7月3日授权给Caruthers等人的美国专利号4,458,066，其标题为“PROCESSFORPREPARINGPOLYNUCLEOTIDES”，和于1983年11月15日授权给Caruthers等人的美国专利号4,415,732，其标题为“PHOSPHORAMIDITECOMPOUNDSANDPROCESSES”。
可以根据需要标记任意的亚磷酰胺核苷单体。在某些实施方案中，如果要标记寡核苷酸的5′-末端，可以在最后的缩合步骤中使用标记的无核苷酸的亚磷酰胺。如果要标记寡核苷酸的内部位置，则可以在任意缩合步骤过程中使用标记的核苷酸亚磷酰胺。另外，在合成后，也可以在相当大数目的位置标记寡核苷酸(Eckstein等人(Eds.)，OligonucleotidesandAnalogues：APracticalApproach，OxfordUniversityPress(1992)，Chu等人(1983)“Derivatizationofunprotectedpolynucleotides，”NucleicAcidsRes.11(18)：6513-6529，和于1992年6月2日授权给Smith等人的美国专利号5,118,800，其标题为“Oligonucleotidespossessingaprimaryaminogroupintheterminalnucleotide”)。为了进一步说明，也可以在它们的磷酸二酯主链上(Eckstein等人(1992)，同上)或在3′-末端处(Nelson等人(1992)“Oligonucleotidelabelingmethods.3.Directlabelingofoligonucleotidesemployinganovel，non-nucleosidic，2-aminobutyl-1，3-propanediolbackbone”NucleicAcidsRes.20(23)：6253-6259，于1995年3月28日授权给Nelson的美国专利号5,401,837，其标题为“Methodforlabelingthe3′terminusofasyntheticoligonucleotideusingauniquemultifunctionalcontrolledporeglass(MF-CPG)reagentinsolidphaseoligonucleotidesynthesis”，和于1992年8月25日授权给Nelson的美国专利号5,141,813，其标题为“Multifunctionalcontrolledporeglassreagentforsolidphaseoligonucleotidesynthesis”)标记寡核苷酸。
在某些实施方案中，在本文所述的封闭的寡核苷酸中包含修饰的核苷酸。为了说明，将修饰的核苷酸置换引入寡核苷酸序列，可以例如根据需要改变寡核苷酸的解链温度。在有些实施方案中，这可以产生相对于对应的未修饰的寡核苷酸更高的灵敏度，甚至在靶核酸和特定寡核苷酸之间的序列中有一个或多个错配存在的情况下。可以置换或添加到寡核苷酸中的示例性的修饰的核苷酸包括，例如，C5-乙基-dC、C5-甲基-dC、C5-乙基-dU、2，6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-0-甲基Ribo-U、2′-0-甲基Ribo-C，8-氮杂-dA，8-氮杂-dG，7-脱氮-dA，7-脱氮-dG、N4-乙基-dC和N6-甲基-dA。为了进一步说明，修饰的寡核苷酸的其它实例包括具有一个或多个LNATM单体的那些。诸如这些的核苷酸类似物也描述在，例如，于2003年10月28日授权给Kochkine等人的美国专利号6,639,059，其标题为“SYNTHESISOF[2.2.1]BICYCLONUCLEOSIDES”，于2001年10月16日授权给Skouv的美国专利号6,303,315，其标题为“ONESTEPSAMPLEPREPARATIONANDDETECTIONOFNUCLEICACIDSINCOMPLEXBIOLOGICALSAMPLES”，和于2003年5月15日公开的Kochkine等人的美国专利申请公开号2003/0092905，其标题为“SYNTHESISOF[2.2.1]BICYCLONUCLEOSIDES”。包含LNATM单体的寡核苷酸可以从例如ExiqonA/S(DK)商业化地得到。在本文中、包括在上面提供的定义中提及了其它寡核苷酸修饰。
使用本领域技术人员已知的基本上任意的方法，可以设计如本文所述使用的寡核苷酸(例如，引物、探针等)。为了说明，任选地适用于设计寡核苷酸的技术的实例描述在，例如，Chen等人(2003)“PrimerDesignAssistant(PDA)：aweb-basedprimerdesigntool”NucleicAcids Res.31(13)：3751-3754，Miura等人(2005)“AnovelstrategytodesignhighlyspecificPCRprimersbasedonthestabilityanduniquenessof3′-endsubsequences”Bioinformatics21(24)：4363-4370，Hyyro等人(2005)“Genome-wideselectionofuniqueandvalidoligonucleotides”NucleicAcidsRes.33(13)：e115，和Weckx等人(2005)“SNPbox：amodularsoftwarepackageforlarge-scaleprimerdesign”Bioinformatics21(3)：385-387。
VI.标记
任选地标记本文所述的寡核苷酸(例如，引物、探针等)，例如，以方便随后的检测。在有些实施方案中，在合成寡核苷酸之前，标记核酸合成试剂(例如，2’-终止子核苷酸的亚磷酰胺前体，其它核苷酸的亚磷酰胺前体等)。例如，将标记任选地附着到例如2’-终止子核苷酸或其它核苷酸的同素环、杂环或芳基上(例如，通过嘧啶的C5、胞苷的N4、嘌呤的N7、腺苷的N6、嘌呤的C8或本领域已知的另一个附着位点)，例如，通过酰胺、酯、硫酯、醚、硫醚、碳-碳或其它类型的共价键。另外，或者可选择的，将标记附着到2’-终止子核苷酸或其它核苷酸(例如，dNTP等)的糖部分(例如，核糖糖等)或其类似物(例如，碳环等)，和/或2’-终止子核苷酸或其它核苷酸的磷酸基，例如通过共价键，该键是酰胺、酯、硫酯、醚、硫醚、碳-碳或其它键。一般在标记和核苷酸的亲电子基团和亲核基团之间的反应中形成共价键。在某些实施方案中，使标记和核苷酸彼此直接缀合(例如，通过单、双、三或芳族碳-碳键，或通过碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、亚磷-氧键、亚磷-氮键等)。任选地，接头将标记附着到2’-终止子核苷酸或其它核苷酸上。可以使用许多种接头，或可以将其适应以用于缀合标记和核苷酸。在本文中提及了这样的接头的某些非限制性的解释。
基本上任意的标记任选地用于标记在本文所述的寡核苷酸中使用的核苷酸和核苷。在有些实施方案中，例如，标记包含荧光染料(例如，罗丹明染料(例如，R6G、R110、TAMRA、ROX等)，荧光素染料(例如，JOE、VIC、TET、HEX、FAM等)，卤荧光素(halofluorescein)染料，花菁染料(例如，CY3、CY3.5、CY5、CY5.5等)，染料(例如，FL、530/550、TR、TMR等)，ALEXA染料(例如，488、532、546、568、594、555、653、647、660、680等)，二氯罗丹明染料，能量转移染料(例如，BIGDYETMv1染料、BIGDYETMv2染料、BIGDYETMv3染料等)，萤光(Lucifer)染料(例如，萤光黄等)，CASCADEOregonGreen等。关于荧光染料的其它细节提供在，例如，Haugland，MolecularProbesHandbookofFluorescentProbes andResearchProducts，NinthEd.(2003)和其更新。荧光染料通常可以从各个商业供应商容易地得到，包括，例如，MolecularProbes，Inc.(Eugene，OR，USA)，AmershamBiosciencesCorp.(Piscataway，NJ，USA)，AppliedBiosystems(FosterCity，CA，USA)等。其它标记包括，例如，生物素，弱荧光标记(Yin等人(2003)ApplEnvironMicrobiol.69(7)：3938，Babendure等人(2003)Anal.Biochem.317(1)：1，和Jankowiak等人(2003)ChemResToxicol.16(3)：304)，非荧光标记，比色标记，化学发光标记(Wilson等人(2003)Analyst.128(5)：480和Roda等人(2003)Luminescence18(2)：72)，Raman标记，电化学标记，生物发光标记(Kitayama等人(2003)PhotochemPhotobiol.77(3)：333，Arakawa等人(2003)Anal.Biochem.314(2)：206，和Maeda(2003)J.Pharm.Biomed. Anal.30(6)：1725)，非荧光供体部分(如描述在，例如，Will等人的2007年4月12日公开的国际申请号WO2007/039301，其标题为“NON-FLUORESCENTENERGYTRANSFER”)，和α-甲基-PEG标记试剂(如描述在，例如，Bodepudi等人的2003年11月21日提交的美国专利申请号10/719,257，其标题为“DETECTABLELABELEDNUCLEOSIDEANALOGSANDMETHODSOFUSETHEREOF”)。
在某些实施方案中，标记包含放射性同位素，例如3H、14C、22Na、32P、33P、35S、42K、45Ca、59Fe、125I、203Hg等。为了进一步例证，所述标记也任选地包括至少一个质量修改基团。例如，质量修改基团任选地选自，例如，氘、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3和硫代磷酸酯基团，其中X是O、NH、NY、S、NHC(S)、OCO(CH)nCOO、NHCO(CH2)nCOO、OSO2O、OCO(CH2)n、NHC(S)NH、OCO(CH2)nS、OCO(CH2)S、NC4O2H2S、OPO(O-烷基)或OP(O-烷基)；n是1-20的整数，包含1和20；且，Y是H、氘、烷基、烷氧基、芳基、聚甲醛基团、单烷基化的聚甲醛基团、聚乙烯亚胺基团、聚酰胺基、聚酯基团、烷基化的甲硅烷基、杂寡物(heterooligo)、聚氨基酸、杂寡物/聚氨基酸基团或聚乙二醇基团。关于核酸标记和序列分析的其它细节，提供在，例如，Sterky等人(2000)“Sequenceanalysisofgenesandgenomes”J.Biotech.76(2000)：1，Sensen(Ed.)Biotechnology，Volume5B， GenomicsandBioinformatics，JohnWiley&Sons，Inc.(2001)，和Sensen(Ed.)EssentialsofGenomicsandBioinformatics，JohnWiley&Sons，Inc.(2002)。
多种接头可用于将标记连接到核酸上，且其将是本领域技术人员熟知的。接头通常具有在空间方面和电子方面适合掺入核酸的结构。接头任选地包括，例如，醚、硫醚、羧酰胺、磺酰胺、脲、氨基甲酸乙酯、肼或其它部分。为了进一步说明，接头通常包括约1至约25个选自例如C、N、O、P、Si、S等的非氢原子，且包含下述键的基本上任意的组合：例如，醚、硫醚、胺、酯、羧酰胺、磺酰胺、酰肼键和芳族或杂芳族键。在有些实施方案中，例如，接头包含单个碳-碳键和羧酰胺或硫醚键的组合。尽管任选地使用接头的更长的线性区段，但最长的线性区段一般含有约3至约15个非氢原子，包括1个或多个杂原子。
接头部分的非限制性实例包括取代的(例如，官能化的)或未取代的基团，例如咪唑/生物素接头、聚亚甲基基团、亚芳基基团、烷基亚芳基基团、亚芳基烷基、芳硫基团、酰胺烷基、炔基烷基、链烯基烷基、烷基、烷氧基、硫基团、氨基烷基、吗啉衍生的磷酸酯、肽核酸(例如，N-(2-氨基乙基)甘氨酸等)等。这些和其它的接头的某些进一步描述在，例如，Haugland等人的美国专利号6,339,392，Hobbs，Jr.等人的美国专利号5,047,519，Iizuka等人的美国专利号4,711,958，Stavrianopoulos的美国专利号5,175,269，Ward等人的美国专利号4,711,955，Engelhardt等人的美国专利号5,241,060，Ward等人的美国专利号5,328,824，和Khan等人的美国专利公开号2002/0151711。关于核酸标记和接头的其它细节提供在，例如，Hermanson，BioconjugateTechniques，ElsevierScience(1996)。在某些实施方案中，合适的接头包含光可切割的部分，例如2-硝基苄基部分、α-取代的2-硝基苄基部分(例如，1-(2-硝基苯基)乙基部分)、3，5-二甲氧基苄基部分、硫代异羟肟酸、7-硝基二氢吲哚部分、9-苯基呫吨基部分、苯偶姻部分、羟基苯甲酰甲基部分、NHS-ASA部分等。光可切割的接头进一步描述在，例如，Olejnik等人的美国专利公开号2003/0099972。在有些实施方案中，接头包括金属，例如铂原子。这些进一步描述在，例如，Houthoff等人的美国专利号5,714,327。许多不同长度的接头可以从各个供应商商业地得到，包括，例如，Qiagen-OperonTechnologies，Inc.(Alameda，CA，USA)，BDBiosciencesClontech(PaloAlto，CA，USA)，和MolecularBioSciences(Boulder，CO，USA)。
VII.反应混合物
本发明也提供了许多不同的反应混合物，它们可以用于多种应用，具体地，希望从核酸去除2’-终止子核苷酸、聚合核苷酸和/或扩增核酸的场合。在有些实施方案中，例如，反应混合物用于进行均质扩增/检测测定(例如，实时PCR监控)或检测突变或对核酸基因型分型。在某些实施方案中，将多个引物和/或探针一起汇集在用于涉及多种形式的应用的反应混合物中。在下面进一步描述了许多这样的应用，或在本文中以其他方式提及。
除了本文所述的封闭的寡核苷酸以外，反应混合物也通常包括用于进行下述的各种试剂：例如，从这些寡核苷酸去除2’-核苷酸(例如，生成激活的或可延伸的寡核苷酸)，核苷酸聚合，核酸扩增和检测反应(例如，实时PCR监控或5’-核酸酶测定)等。这些其它试剂的示例性类型包括，例如，模板或靶核酸(例如，从基本上任意的来源获得或衍生)、焦磷酸、光发射改性剂、生物催化剂(例如，DNA聚合酶等)、缓冲剂、盐、扩增子、甘油、金属离子(例如，Mg+2等)、二甲基亚砜(DMSO)、聚rA(例如，作为低拷贝数靶的载体核酸)、尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)(例如，以保护免受遗留污染)。在有些动力学的PCR有关的用于中，反应混合物也包括促进扩增产物的检测的探针。在这些方法中使用的探针的实例包括，例如，杂交探针、5’-核酸酶探针和/或发夹探针。下面也进一步描述了核酸扩增和检测以及其它方法。
如本文提及的，在某些实施方案中，将各种光发射改性剂用于本发明的反应混合物中。一般，光发射改性剂是可溶的核酸结合化合物，其能修饰从标记的寡核苷酸(例如引物、5’-核酸酶探针、杂交探针、发夹探针等)的光发射，以例如，降低来自这些标记的核酸的基线或残余光发射，以及其它应用。在有些实施方案中，例如，这些光发射改性剂包括各种二嗪和噻嗪染料。可以用作光发射改性剂的示例性的二嗪染料包括，例如，偶氮胭脂红染料(例如，偶氮胭脂红A、偶氮胭脂红B(C28H17N3O9S3Na2)、偶氮胭脂红G(C28H18N3O6S2Na)等)、吩嗪染料、嗪染料(例如，天青石蓝(Celestineblue)(C17H18ClN3O4)等)、氯化二乙基藏红偶氮二甲基苯胺(diethylsafraninazodimethylanilinechloride)(即，詹纳斯绿B或二嗪绿5(C30H31N6Cl))等。为了进一步说明，可以用作光发射改性剂的示例性的噻嗪染料包括，例如，亚甲蓝(C16H18ClN3S)、亚甲绿(C16H17ClN4O2S)、硫素(C12H10ClN3S)、均二甲基硫素、甲苯胺蓝O(C15H16N3SCl)、新亚甲蓝(C18H22ClN3S)、亚甲紫bernthsen、天青A(C14H14ClN3S)、天青B(C15H16ClN3S)、天青C(C13H12CIN3S)等。光发射改性剂也描述在，例如，Gupta等人于2006年6月23日提交的的美国专利申请号11/474,062，其标题为“LIGHTEMISSIONMODIFIERSANDTHEIRUSESINNUCLEICACIDDETECTION，AMPLIFICATIONANDANALYSIS”。
通常通过将如上所述的选定的核苷酸、引物和/或探针与足以进行选择的特定应用的量的其它试剂组合，生产反应混合物。本领域技术人员考虑到要进行的选择的方法，将明白在给定反应混合物中包含的试剂的量。但是，为了说明，引物核酸和可延伸的核苷酸(例如，4种dNTPs(dGTP、dCTP、dATP、dTTP))各自一般以大摩尔过量存在于这些反应混合物中。另外，4种可延伸的NTPs中的任一种都可以与本文所述的某些酶一起使用。合适的可延伸的和/或终止子核苷酸可以容易地从许多不同的商业供应商得到，包括，例如，RocheDiagnosticsCorporation(Indianapolis，IN，USA)，AmershamBiosciencesCorp.(Piscataway，NJ，USA)，和AppliedBiosystems(FosterCity，CA，USA)。
本文所述的封闭的寡核苷酸一般不可被至少一种选自下述的生物催化剂延伸：例如，G46EE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，G46EE678GCS6DNA聚合酶，ΔZO5R聚合酶(其中R是指E678G突变)，E615GTaqDNA聚合酶，黄栖热菌聚合酶，TMA-25聚合酶，E678GTMA-25聚合酶，TMA-30聚合酶，E678GTMA-30聚合酶，TthDNA聚合酶，栖热菌属物种SPS-17聚合酶，E615GTaq聚合酶，栖热菌属ZO5R聚合酶(其中R是指E678G突变)，T7DNA聚合酶，KornbergDNA聚合酶I，克列诺DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶，微球菌DNA聚合酶，αDNA聚合酶，反转录酶，AMV反转录酶，M-MuLV反转录酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，大肠杆菌RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶，T3RNA聚合酶，T4DNA聚合酶，T7RNA聚合酶，RNA聚合酶II，末端转移酶，多核苷酸磷酸化酶，掺入核糖核苷酸的DNA聚合酶等。此外，这些生物催化剂的许多包括焦磷酸解作用活性，且因此可以催化核苷酸从核酸的去除(例如，在某些实施方案中，从封闭的寡核苷酸去除2’-终止子核苷酸)。这些生物催化剂的某些的序列可以公开地从各种来源得到，包括，例如，等。
如上所述，在有些实施方案中，修饰酶。示例性的修饰的酶包括，例如，G46EE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，G46EE678GCS6DNA聚合酶，E615GTaqDNA聚合酶等。这些修饰的酶一般包含增强核糖核苷酸的掺入、增强核糖核苷酸的2’-修饰的类似物(例如，2’-终止子核苷酸)的掺入和/或减少或消除5’-3’外切核酸酶活性(例如，相对于缺乏这些突变的一个或多个的酶)的突变。关于有用的生物催化剂的其它细节也提供在，例如，Bauer等人于2006年10月18日提交的美国专利申请号60/852882，其标题为“MUTANTDNAPOLYMERASESANDRELATEDMETHODS”，于1999年8月17日授权给Gelfand等人的美国专利号5,939,292，其标题为“THERMOSTABLEDNAPOLYMERASESHAVINGREDUCEDDISCRIMINATIONAGAINSTRIBO-NTPS”，于1989年12月26日授权给Gelfand等人的美国专利号4,889,818，其标题为“PURIFIEDTHERMOSTABLEENZYME”，于1994年12月20日授权给Gelfand等人的美国专利号5,374,553，其标题为“DNAENCODINGATHERMOSTABLENUCLEICACIDPOLYMERASEENZYMEFROMTHERMOTOGAMARITIMA”，于1995年5月30日授权给Gelfand等人的美国专利号5,420,029，其标题为“MUTATEDTHERMOSTABLENUCLEICACIDPOLYMERASEENZYMEFROMTHERMOTOGAMARITIMA”，于1995年10月3日授权给Abramson等人的美国专利号5,455,170，其标题为“MUTATEDTHERMOSTABLENUCLEICACIDPOLYMERASEENZYMEFROMTHERMUSSPECIESZ05”，于1995年11月14日授权给Abramson等人的美国专利号5,466,591，其标题为“5′TO3′EXONUCLEASEMUTATIONSOFTHERMOSTABLEDNAPOLYMERASES”，于1997年4月8日授权给Gelfand等人的美国专利号5,618,711，其标题为“RECOMBINANTEXPRESSIONVECTORSANDPURIFICATIONMETHODSFORTHERMUSTHERMOPHILUSDNAPOLYMERASE”，于1997年4月29日授权给Gelfand等人的美国专利号5,624,833，其标题为“PURIFIEDTHERMOSTABLENUCLEICACIDPOLYMERASEENZYMEFROMTHERMOTOGAMARITIMA”，于1997年10月7日授权给Abramson等人的美国专利号5,674,738，其标题为“DNAENCODINGTHERMOSTABLENUCLEICACIDPOLYMERASEENZYMEFROMTHERMUSSPECIESZ05”，于1998年8月4日授权给Gelfand等人的美国专利号5,789,224，其标题为“RECOMBINANTEXPRESSIONVECTORSANDPURIFICATIONMETHODSFORTHERMUSTHERMOPHILUSDNAPOLYMERASE”，于1998年8月18日授权给Abramson等人的美国专利号5,795,762，其标题为“5′TO3′EXONUCLEASEMUTATIONSOFTHERMOSTABLEDNAPOLYMERASES”，于2002年1月31日公开的Smith等人的美国专利申请公开号US2002/0012970，其标题为“HIGHTEMPERATUREREVERSETRANSCRIPTIONUSINGMUTANTDNAPOLYMERASES”，于2004年1月8日公开的Schoenbrunner等人的美国专利申请公开号US2004/0005599，其标题为“THERMOSTABLEORTHERMOACTIVEDNAPOLYMERASEMOLECULESWITHATTENUATED3′-5′EXONUCLEASEACTIVITY”，和于2003年3月26提交的美国专利申请号10/401,403。
通过包括例如位点定向诱变、化学修饰等的各种方法，可以实现修饰的酶的生产，所述酶具有例如增强的掺入2’-终止子核苷酸的效率或其它所需的性质。更具体地，通常通过位点特异性的引物指导的诱变，实现位点定向诱变。该技术一般使用与要诱变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物来进行，只是有限的错配代表所需的突变。简而言之，将合成的寡核苷酸用作引物来指导与质粒或噬菌体互补的链的合成，并将得到的双链DNA转化进噬菌体支持性宿主细菌。通过例如DNA序列分析或探针杂交，可以测定得到的细菌，以鉴别携带所需的突变基因序列的那些噬斑。为了进一步说明，也可以使用许多修饰核酸的其它方法，例如“重组PCR”方法。
在本发明的实践方面(例如，生产修饰的酶、进行扩增反应等)，任选地使用许多分子生物学和重组DNA的常规技术。这些技术是众所周知的，且解释在，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，VolumesI，II，和III，1997(F.M.Ausubeled.)；Sambrook等人，2001，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ThirdEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.；Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(Berger)，DNACloning：A PracticalApproach，VolumesI和II，1985(D.N.Glovered.)；OligonucleotideSynthesis，1984(M.L.Gaited.)；NucleicAcid Hybridization，1985，(Hames和Higgins)；TranscriptionandTranslation，1984(Hames和Higgins编.)；AnimalCellCulture，1986(R.I.Freshneyed.)；ImmobilizedCellsandEnzymes，1986(IRLPress)；Perbal，1984，A PracticalGuidetoMolecularCloning；theseries，Methodsin Enzymology(AcademicPress，Inc.)；GeneTransferVectorsfor MammalianCells，1987(J.H.Miller和M.P.Calos编.，ColdSpringHarborLaboratory)；和MethodsinEnzymologyVol.154和Vol.155(分别由Wu和Grossman，和Wu编)。
VIII.PAP有关的方法
本发明也提供了使用本文所述的封闭的寡核苷酸的方法。在有些实施方案中，例如，这些寡核苷酸用于进行测定，包含靶核酸的检测，例如，以提供关于这些靶所来源的受试者的诊断、遗传或其它信息。在下面提供的实施例中也解释了这些方面。
本文所述的寡核苷酸任选地用于或进行适应以用于基本上任意的应用，包括从这些核酸去除2’-终止子核苷酸，例如，通过焦磷酸解作用过程。核酸有关的应用类型的实例包括，核酸结构和构象的分析，实时PCR测定，和SNP检测(Myakishev等人(2001)“High-throughputSNPgenotypingbyallele-specificPCRwithuniversalenergy-transfer-labeledprimers，”GenomeRes11：163-169，Lee等人(1999)“Seven-color，homogeneousdetectionofsixPCRproducts，”Biotechniques27：342-349，Thelwell等人(2000)“ModeofactionandapplicationofScorpionprimerstomutationdetection，”NucleicAcidsRes28：3752-3761，Whitcombe等人(1999)“DetectionofPCRproductsusingself-probingampliconsandfluorescence，”NatBiotechnol17：804-807，Heid等人(1996)“RealtimequantitativePCR，”GenomeRes6：986-994，Nazarenko等人(1997)“AclosedtubeformatforamplificationanddetectionofDNAbasedonenergytransfer，”Nucleic AcidsRes25：2516-2521)；核酸杂交的检测(Parkhurst等人(1995)“Kineticstudiesbyfluorescenceresonanceenergytransferemployingadouble-labeledoligonucleotide：hybridizationtotheoligonucleotidecomplementandtosingle-strandedDNA，”Biochemistry34：285-292，Tyagi等人(1996)“Molecularbeacons：probesthatfluoresceuponhybridization，”NatBiotechnol14：303-308，Tyagi等人(1998)“Multicolormolecularbeaconsforallelediscrimination，”NatBiotechnol16：49-53，Sixou等人(1994)“Intracellularoligonucleotidehybridizationdetectedbyfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)，”Nucleic AcidsRes22：662-668，和Cardullo等人(1988)“Detectionofnucleicacidhybridizationbynonradiativefluorescenceresonanceenergytransfer，”ProcNatlAcadSciUSA85：8790-8794)；用于检测突变的引物延伸测定(Chen等人(1997)“FluorescenceenergytransferdetectionasahomogeneousDNAdiagnosticmethod，”ProcNatlAcadSciUSA94：10756-10761)；和自动化DNA测序(Woolley等人(1995)“Ultra-high-speedDNAsequencingusingcapillaryelectrophoresischips，”AnalChem67：3676-3680，Hung等人(1998)“Comparisonoffluorescenceenergytransferprimerswithdifferentdonor-acceptordyecombinations，”AnalBiochem255：32-38，和Ju等人(1995)“Fluorescenceenergytransferdye-labeledprimersforDNAsequencingandanalysis，”ProcNatlAcadSciUSA92：4347-4351)。可以进行适应以与本文所述的寡核苷酸一起使用的与PAP有关的方面，也描述在，例如，于2006年4月25日授权给Liu等人的美国专利号7,033,763，其标题为“PYROPHOSPHOROLYSISACTIVATEDPOLYMERIZATION(PAP)”，于2003年3月18日授权给Liu等人的美国专利号6,534,269，其标题为“PYROPHOSPHOROLYSISACTIVATEDPOLYMERIZATION(PAP)：APPLICATIONTOALLELE-SPECIFICAMPLIFICATIONANDNUCLEICACIDSEQUENCEDETERMINATION”，Liu等人于2004年3月12日提交的美国专利申请号10/798,844，其标题为“PYROPHOSPHOROLYSISACTIVATEDPOLYMERIZATION(PAP)”。
为了进一步说明，可以使用或进行适应以用于分析例如本发明反应混合物中的靶核酸或来自该混合物的靶核酸的通常类型的核酸分析技术的实例包括各种核酸扩增测定。核酸扩增测定的共同特征是，它们一般设计用于扩增待测生物特异性的核酸序列。核酸扩增测试通常具有比其它核酸分析方法更高的灵敏度。使用本文所述寡核苷酸进一步提高的灵敏度一般可归因于它们的从小至单个靶核酸拷贝生成阳性信号的能力。任选地用于或进行适应以检测靶核酸的扩增方法包括，例如，各种聚合酶、连接酶或反转录酶介导的扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)和/或反转录PCR(RT-PCR)。关于这些和其它扩增方法和各种方法用于这些测定的样品制备的用途的其它细节，可以参见众多标准的教科书中的任一种，包括，例如，Berger，Sambrook，Ausubel1和2，和Innis，它们在上面提及。
任选地改进行适应以与本发明的试剂和方法一起使用的各种商业的核酸扩增测定通常差别在于它们的扩增方法和它们的靶核酸序列。这些商业测试的实例包括杂交探针测定(例如，使用系统)和和COBAS测定(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN，USA)，它们使用聚合酶链反应(PCR)；测试(AbbottLaboratories，AbbottPark，IL，USA)，它使用连接酶链反应(LCR)；BDProbeTecTMET测试(Becton，DickinsonandCompany，FranklinLakes，N.J.，USA)，它使用链置换扩增(SDA)；和APTIMATM测定(Gen-Probe，Inc.，SanDiego，CA，USA)，它使用转录介导的扩增(TMA)。在下面进一步描述核酸扩增和检测。
在某些实施方案中，例如，将5’-核酸酶探针用于各种5’-核酸酶反应。许多5’-核酸酶测定是本领域技术人员众所周知的。这些反应的实例也描述在，例如，于2001年4月10日授权给Gelfand等人的美国专利号6,214,979，其标题为“HOMOGENEOUSASSAYSYSTEM”，于1998年9月8日授权给Gelfand等人的美国专利号5,804,375，其标题为“REACTIONMIXTURESFORDETECTIONOFTARGETNUCLEICACIDS”，于1996年1月30日授权给Gelfand等人的美国专利号5,487,972，其标题为“NUCLEICACIDDETECTIONBYTHE5’-3’EXONUCLEASEACTIVITYOFPOLYMERASESACTINGONADJACENTLYHYBRIDIZEDOLIGONUCLEOTIDES”，和于1993年5月11日授权给Gelfand等人的美国专利号5,210,015，其标题为“HOMOGENEOUSASSAYSYSTEMUSINGTHENUCLEASEACTIVITYOFANUCLEICACIDPOLYMERASE”。
为了简要解释，在5’-核酸酶反应中，在引物和探针与靶核酸链杂交的条件下，使靶核酸接触引物和探针(例如，5’-核酸酶探针)。也使靶核酸、引物和探针接触具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶。具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶可以切割与在引物下游的靶核酸杂交的探针。引物的3’末端提供了聚合酶的起始结合位点。在遇到探针的5’末端后，结合的聚合酶从探针切割片段。
可以将引物和探针这样设计，从而它们在靶核酸上非常接近的位置退火，致使在没有引物延伸的情况下，核酸聚合酶与引物的3’末端的结合使它与探针的5’末端接触。术语“独立于聚合的切割”是指该过程。或者，如果引物和探针在靶核酸上远远隔开的区域退火，那么一般在核酸聚合酶遇到探针的5’末端之前发生聚合。随着聚合继续进行，聚合酶逐渐从探针的5’末端切割片段。该切割继续至剩余的探针已经被去稳定化至它从模板分子分离的程度。术语“依赖于聚合的切割”是指该过程。
独立于聚合的切割的一个优点在于，不需要扩增核酸。倘若引物和探针邻近地结合核酸，就可以发生探针退火和片段切割的按序循环。因而，可以产生足够量的片段，从而使得在没有聚合的情况下的检测是可能的。
在任一种过程中，提供被认为含有靶核酸的样品。在样品中包含的靶核酸可以首先反转录成cDNA(如果必要的话)，然后变性，其中使用任意合适的变性方法，包括物理的、化学的、或酶促的方法，它们是本领域技术人员已知的。示例性的实现链分离的物理方法包含，加热核酸直至它完全(＞99％)变性。一般的热变性包含从约85℃至约105℃的温度(一般从约85℃至约98℃、且更一般从约85℃至约95℃)，时间段是约1秒至约10分钟(例如，几秒至约1分钟)。作为变性的替代方案，核酸可以以单链形式存在于样品中，例如当样品包含单链RNA或DNA病毒时。
一般在允许引物和探针结合靶核酸链的杂交条件下，使变性的靶核酸链与引物和探针一起温育。在有些实施方案中，2种引物可以用于扩增靶核酸。一般选择这2种引物，从而使得它们沿着靶核酸的相对位置是这样的，以致于当延伸产物与它的模板(互补体)分离时，从一种引物合成的延伸产物用作另一种引物的延伸的模板，以产生确定长度的复制链。
因为互补链一般比探针或引物长，所以该链具有更多个接触点，且因而在给定的时间段内具有更大的机会彼此结合。因此，一般利用高摩尔过量的探针和引物以偏好引物和探针退火胜过模板链重退火。在多重形式中，多个探针一般用于单个反应容器中，以同时检测多种靶核酸。
引物通常具有足够的长度和互补性，从而使得它们在允许进行独立于聚合的切割或依赖于聚合的切割的选定条件下选择性地结合靶核酸。引物的确切长度和组成将依赖于多种因素，包括退火反应的温度、引物的来源和组成、探针退火位点与引物退火位点的邻近、和引物：探针浓度比。例如，依赖于靶序列的复杂性，引物一般包括约15-30个核苷酸，尽管它可以含有更多或更少的核苷酸。
通常在核酸聚合酶遇到靶核酸区域之前，探针与它的互补靶核酸退火，因而允许该酶的5’至3’核酸酶活性从探针切割片段。为了增加在聚合酶达到该杂交区域之前探针将与靶核酸退火的可能性，可以使用多种技术。例如，短引物通常需要更冷的温度来与核酸形成足够稳定的杂种复合物。因此，可以将探针设计成比引物长，从而使得相对于引物退火，探针在更高的温度优先与靶核酸退火。为了进一步说明，可以选择探针的核苷酸组成，以使它具有比引物更高的G/C含量和结果更高的热稳定性。任选地，可以将修饰的核苷酸掺入引物或探针，以实现与仅具有未修饰的核苷酸的引物或探针相比更大的或更小的热稳定性。示例性的修饰的核苷酸在上面进一步所述。也可以改变热循环参数，以利用探针和引物的差异热稳定性。例如，在热循环变性步骤后，可以引入允许探针结合、但是不允许引物结合的中间温度。此后，可以进一步降低温度，以允许引物退火。为了在引物之前优先偏好探针的结合，也可以使用高摩尔过量的探针：引物浓度。这样的探针浓度一般为各个引物浓度(通常是约0.5-5x10-7M)的约2至约20倍。
在也包含适当的盐、金属阳离子和缓冲剂的反应混合物中存在足够量的4种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或类似物的情况下，通常由生物催化剂(例如，聚合酶)催化依赖于模板的引物延伸。反应混合物如上面进一步所述。合适的生物催化剂是已知催化依赖于引物和模板的DNA合成且具有5’至3’核酸酶活性的酶。这类的示例性的DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶I、TthDNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、栖热菌属物种ZO5DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermatogamaritima)DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermatoganeopolitana)DNA聚合酶和非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)DNA聚合酶以及本文提及的或本领域技术人员另外已知的其它酶。这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件是本领域众所周知的。一般，生物催化剂有效地切割探针并释放出标记的片段，从而直接或间接产生可检测的信号。
合成的产物通常是包含模板链和引物延伸链的双链体分子。该合成的副产物是探针片段，它们可以包括单、二和更大的核苷酸片段的混合物。变性、探针和引物退火、和引物延伸和探针切割的重复循环，导致引物限定的区域的指数积累和标记的片段的指数产生。运行足够的循环，以达到可检测量的探针片段，这通常比背景信号大几个数量级。
在某些实施方案中，PCR反应作为自动化过程来进行，其利用热稳定的酶。在该过程中，反应混合物经过变性步骤、探针和引物退火步骤和合成步骤循环，其中切割和置换与依赖于引物的模板延伸同时发生。在有些实施方案中，使用系统进行本文所述的方法。这样的系统在下面更详细地描述。任选地，可以使用热循环仪，例如可从例如AppliedBiosystems(FosterCity，CA，USA)商业得到的那些，它们设计用于与热稳定的酶一起使用。
热稳定的聚合酶一般用于自动化过程中，所述过程通过在PCR循环过程中将双链延伸产物暴露于升高的温度(例如，约95℃)，实现它们的变性。例如，于1989年12月26日授权给Gelfand等人的标题为“PURIFIEDTHERMOSTABLEENZYME”的美国专利号4,889,818公开了一种从水生栖热菌(Thermusaquaticus)分离的代表性热稳定的酶。其它代表性的热稳定的聚合酶包括，例如，从下述热稳定的细菌提取的聚合酶：黄栖热菌、红栖热菌(Thermusruber)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(它比列出的其它细菌具有稍微更低的最适温度)、乳栖热菌(Thermuslacteus)、红色栖热菌(Thermusrubens)、海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌、非洲栖热腔菌、Thermococcuslittoralis和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermusfervidus)。
通过选择适当的杂交条件，可以实现探针与靶核酸的杂交。一般选择探针：靶核酸杂种的稳定性与测定和洗涤条件相容，从而使得稳定的、可检测的杂种仅在探针和靶核酸之间形成。一个或多个不同的测定参数的操纵，决定特定杂交测定的精确灵敏度和特异性。
更具体地，在不同温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成的多种条件下，发生核酸(例如，DNA、RNA、PNA或其组合)的互补碱基之间的杂交。这些条件的实例和应用它们的方法描述在，例如，Tijssen，HybridizationwithNucleicAcidProbes，Vol.24，ElsevierScience(1993)，和Hames和Higgins，同上。杂交通常发生在约0℃至约70℃，进行约1分钟至约1小时的时间段，这依赖于要杂交的序列的性质和它的长度。但是，认识到杂交可以在数秒或数小时内发生，这依赖于反应条件。为了说明，2种20聚体的混合物的一般杂交条件是，使混合物达到68℃，然后冷却至室温(22℃)，进行5分钟，或在非常低的温度例如2℃。使用缓冲剂例如Tris-EDTA(TE)、Tris-HCl和HEPES、盐溶液(例如NaCl、KCl、MgCl2)或其它水溶液、试剂和化学药品，可以促进核酸之间的杂交。这些试剂的实例包括单链结合蛋白例如RecA蛋白、T4基因32蛋白、大肠杆菌单链结合蛋白和大或小核酸沟结合蛋白。这种试剂和化学药品的其它实例包括二价离子、多价离子和嵌入物质，例如溴化乙锭、放线菌素D、补骨脂素和当归根素。
基本上任意的可用于检测靶核酸的方法都可以用于本发明中。常见的方法包括，使用5’-核酸酶探针、杂交探针或发夹探针(例如，分子信标)的实时扩增检测，掺入扩增引物或扩增的核酸本身中的标记的检测，例如，在电泳分离扩增产物和未掺入的标记后，基于杂交的测定(例如，基于阵列的测定)，和/或结合核酸的第二试剂的检测。这些通常的方法也描述在，例如，Sambrook和Ausubel1和2，同上。
发夹探针，例如分子信标，是用于实时检测和定量靶核酸的寡核苷酸。发夹探针的5’和3’末端通常包含标记部分，其赋予探针可检测的性质。在示例性的实施方案中，末端之一附着到报道部分(例如，荧光染料)上，且另一个末端附着到能猝灭从报道部分发射的荧光的猝灭剂部分上。当发夹探针在溶液中游离存在时，即，不与第二核酸杂交，探针的茎通过互补碱基配对来稳定化。该自身互补配对导致产生探针的“发夹环”结构，其中报道部分和猝灭剂部分彼此邻近。在该构象中，猝灭剂部分猝灭报道部分。发夹探针的环一般包含与靶核酸中的待测序列互补的序列，以致于环与靶中的它的互补序列的杂交强迫茎解离，从而使报道部分和猝灭剂部分彼此远离。这不猝灭报道部分，从而造成来自发夹探针的荧光的增加。
关于制备和使用发夹探针的标准方法的细节，是本领域技术人员普遍已知的，且也描述在，例如，Leone等人(1995)“MolecularbeaconprobescombinedwithamplificationbyNASBAenablehomogenousreal-timedetectionofRNA，”NucleicAcidsRes.26：2150-2155，Kostrikis等人(1998)“Molecularbeacons：spectralgenotypingofhumanalleles”Science279：1228-1229，Fang等人(1999)“Designinganovelmolecularbeaconforsurface-immobilizedDNAhybridizationstudies”J.Am.Chem.Soc.121：2921-2922，和Marras等人(1999)“Multiplexdetectionofsingle-nucleotidevariationusingmolecularbeacons”Genet.Anal.Biomol.Eng.14：151-156。多个商业供应商生产可进行适应以用于本文所述方法的标准的和定制的发夹探针，包括OswelResearchProductsLtd.(UK)，ResearchGenetics(adivisionofInvitrogen，Huntsville，AL，USA)，和theMidlandCertifiedReagentCompany(Midland，TX，USA)。许多利用发夹探针的试剂盒也是商业上可得到的，例如来自Stratagene(LaJolla，CA，USA)的SentinelTMMolecularBeaconAllelicDiscrimination试剂盒，和来自EurogentecSA(比利时)和IsogenBioscienceBV(荷兰)的各种试剂盒。这些试剂盒也任选地进行适应以用于本文所述的方法中。
杂交探针通常成对地发挥作用，且可以用于实现各种类型的实时靶核酸检测，包括定量、突变检测、解链温度(Tm)多重化、和颜色多重化。某些杂交探针测定的方面也描述在，例如，Brega等人(2004)“Real-timePCRfordihydrofolatereductasegenesingle-nucleotidepolymorphismsinPlasmodiumvivaxisolates”AntimicrobAgents Chemother.48(7)：2581-2587，Perelle等人(2004)“ALightCyclerreal-timePCRhybridizationprobeassayfordetectingfood-bornethermophilicCampylobacter”MolCellProbes.18(5)：321-327，和Whiley等人(2003)“DetectionofNeisseriaMeningitidisinclinicalsamplesbyaduplexreal-timePCRtargetingtheporAandctrAgenes”MolDiagn.7(3-4)：141-145。
杂交探针测定一般包括，使一对标记的探针与靶或模板核酸杂交，它们彼此足够近，以在标记部分之间发生能量转移。更具体地，该对的一个杂交探针(“供体探针”)通常包括至少一个供体部分，而该对的另一个杂交探针(“受体探针”)包括至少一个受体部分(例如，LC-Red610、LC-Red640、LC-Red670、LC-Red705、JA-270、CY5或CY5.5)。使用各种已知的方法，包括使用系统(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN，USA)的那些，可以检测杂交探针的受体部分发射的荧光。
在使用本文所述的寡核苷酸的其它解释性实施方案中，使用标记的引物来实现实时靶核酸检测。可以进行适应以与本文所述的寡核苷酸一起使用的基于引物的实时靶核酸检测的方法也描述在，例如，Huang等人(2004)“Real-timequantitativeassayoftelomeraseactivityusingtheduplexscorpionprimer，”BiotechnolLett.26(11)：891-895，Asselbergs等人(2003)“Rapiddetectionofapoptosisthroughreal-timereversetranscriptasepolymerasechainreactionmeasurementofthesmallcytoplasmicRNAY1，”AnalBiochem.318(2)：221-229，和Nuovo等人(1999)“Insituamplificationusinguniversalenergytransfer-labeledprimers，”JHistochemCytochem.47(3)：273-280。
IX.系统
本发明也提供了可以用于进行许多不同测定的系统。该系统包括一个或多个含有2’-终止子核苷酸的寡核苷酸。在某些实施方案中，将寡核苷酸排列在固体支持物上，而在其它实施方案中，它们提供在一个或多个容器中，例如，用于在溶液中进行的测定。在某些实施方案中，该系统也包括至少一个检测器或检测组件(例如，分光计)，所述检测器或检测组件被配置用于检测在容器中或在支持物上生成的可检测信号。另外，该系统也任选地包括：至少一个可操作地连接到容器或固体支持物上以调节容器中或固体支持物上的温度的调热器(例如，热循环装置)，和/或至少一个将流体转入和/或转出容器或固体支持物的流体转移组件(例如，自动移液器)，例如，用于进行容器中或固体支持物上的一种或多种邻近测定。
一般将检测器构造成检测生成的可检测信号，例如，在给定的测定系统的另一个组件中或在其附近(例如，在容器中和/或在固体支持物上)生成的。在此任选地使用或进行适应以使用的合适的信号检测器检测例如荧光、磷光、放射性、吸光度、折射率、发光或质量。检测器任选地监控来自在进行例如给定测定步骤上游和/或下游的一个或多个信号。例如，检测器任选地监控多个光学信号，它们的位置对应着“实时”结果。检测器或传感器的实例包括光电倍增管、CCD阵列、光学传感器、温度传感器、压力传感器、pH传感器、电导传感器或扫描检测器。任选地用于进行本发明方法的更特异性的示例性的检测器包括，例如，共振光散射检测器、发射分光镜、荧光分光镜、磷光分光镜、发光分光镜、分光光度计和光度计。检测器也描述在，例如，Skoog等人，PrinciplesofInstrumentalAnalysis，5thEd.，HarcourtBraceCollegePublishers(1998)，Currell，AnalyticalInstrumentation：Performance CharacteristicsandQuality，JohnWiley&Sons，Inc.(2000)，Sharma等人，IntroductiontoFluorescenceSpectroscopy，JohnWiley&Sons，Inc.(1999)，Valeur，MolecularFluorescence：Principles和Applications，JohnWiley&Sons，Inc.(2002)，和Gore，SpectrophotometryandSpectrofluorimetry：A PracticalApproach，2ndEd.，OxfordUniversityPress(2000)。
本发明的系统一般也包括控制器，其可操作地连接至该系统的一个或多个组件(例如，检测器、调热器和/或流体转移组件)，以控制组件的运行。更具体地，控制器通常作为使用的分开的或集成的系统组件包括进来，例如，以接受来自检测器的数据，影响和/或调节容器的温度，影响和/或调节流向或来自选定的容器的流体。控制器和/或其它系统组件任选地偶联至适当程序化的处理器、计算机、数字设备、信息器具或其它逻辑设备(例如，根据需要包括模拟转数字或数字转模拟转换器)，其功能是指导这些仪器根据预编程的或用户输入的指令运行，接收来自这些仪器的数据和信息，和解释、处理和报道该信息给用户。合适的控制器是本领域普遍已知的，且可从多种商业来源得到。
任意控制器或计算机任选地包括监视器，它经常是阴极射线管(“CRT”)显示器，平板显示器(例如，有源矩阵液晶显示器或液晶显示器)等。计算机电路经常放置在盒子中，它包括许多集成电路芯片，例如微处理器、存储器、接口电路等。所述盒子也任选地包括硬盘驱动器、软盘驱动器、高容量可移动驱动器例如可写CD-ROM和其它普通外围元件。输入设备例如键盘或鼠标任选地提供给用户输入。下面进一步解释了这些组件。
计算机一般包括接收用户指令的适当软件，所述指令是用户向一组参数组中(例如，在GUI中)的输入值形式，或预编程的指令形式，例如，为许多不同的特定操作预编程。软件然后将这些指令转化成适当语言，用于指导一个或多个控制器的操作，以实现所需的操作。计算机然后接收来自例如在系统中包含的传感器/检测器的数据，并解释数据，以用户可理解的格式提供，或根据程序使用该数据启动另外的控制器指令，例如响应于从重量天平接收的流体重量数据来控制流体流动调节器。
图4是显示包括逻辑设备的代表性系统的示意图，其中可以具体表达本发明的各个方面。如本领域操作人员从本文提供的教导将理解的，本发明任选地在硬件和/或软件中实现。在有些实施方案中，本发明的不同方面以客户端逻辑或服务器端逻辑实现。如本领域将理解的，本发明或其组件可以在含有逻辑指令和/或数据的介质程序组件(例如，固定化的介质组件)中实现，所述逻辑指令和/或数据当装载进适当配制的计算设备中时，导致该装置按照需要执行。如本领域也将理解的，含有逻辑指令的固定化介质可以递送给固定化介质上的观察器(viewer)，以物理地装载进观察器的计算机，或含有逻辑指令的固定化介质可以存在于远程服务器上，观察器通过通信介质可以访问所述远程服务器，以下载程序组件。
更具体地，图4示意解释了计算机400，检测器402(例如，分光计，例如荧光分光光度计)、流体转移组件404和调热器408可操作地与它相连。任选地，这些组件的一个或多个通过服务器(在图4中未显示)可操作地连接至计算机400。在操作过程中，流体转移组件404一般将反应混合物或其组分转移至多孔容器406。热调控(例如，热循环)一般由调热器408来实现，后者与多孔容器406热连通。检测器402一般检测在系统中进行给定的邻近测定之前、过程中和/或之后生成的可检测信号(例如，荧光发射)。本领域技术人员将明白，在图4中示意描述的系统的一个或多个组件任选地彼此制作成集成的(例如，在相同外壳中)。
X.实施例
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，且无意限制要求保护的发明的范围。还应当理解，将使得本领域技术人员想到参考本文所述的实施例和实施方案后作出各种修改或变化，且它们包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
实施例I：封闭的寡核苷酸的合成
使用标准的β-氰乙基亚磷酰胺化学(图6)，在自动化的AppliedBiosystems394合成仪上合成2’-O-PO3封闭的寡核苷酸(图5)。在这些寡核苷酸的合成中使用的固体支持物是3’-磷酸CPG(来自GlenResearch，#20-2900-41)，它促进磷酸基在寡核苷酸的3’-末端的导入。在合成的第一个循环中，使用购自ChemGenes的核糖核苷-2’-O-亚磷酰胺(图7，其中B＝碱基；腺苷(part#ANP-5681)、胞苷(ANP-5682)、鸟苷(ANP-5683)和尿苷(ANP-5684))来与固体支持物偶联。在合成的第二个循环中和以后，使用标准的脱氧核苷亚磷酰胺。合成后，从固体支持物切割寡核苷酸，并在室温用浓氢氧化铵脱保护24至48小时。然后通过大小排阻层析(NAP-10柱；用无菌水洗脱)去除氢氧化铵。然后通过反相HPLC(PRP-1柱，乙酸三乙铵-乙腈缓冲液)，纯化寡核苷酸。浓缩纯化的寡核苷酸，且然后用氟化钾处理，以去除在寡核苷酸3’-末端的3’-羟基的甲硅烷基保护。通过RP-HPLC(XterraSB-18柱)进一步纯化寡核苷酸。通过离子交换HPLC(Dionex，pH8.0，在60℃)和LC-MS分析，证实这些寡核苷酸的纯度和同一性。
实施例II：HIVDNA模板滴定
在有和没有基因组DNA存在下，进行PAP有关的HIVDNA模板滴定。图8是凝胶照片，其显示了在该分析中使用的不同反应条件下PCR产物的检测。该数据解释了例如使用本文所述的封闭的引物可以实现的相对于不使用那些引物的反应提高的扩增特异性和灵敏度。
更具体地，使用ABI5700序列检测系统进行反应，使用下述温度概况：
50℃2分钟
93℃1分钟
93℃，15秒→52℃，4分钟x4个循环
90℃，15秒→55℃，4分钟x56个循环
下述反应条件是所有反应共有的：
主混合物组分 浓度
两性离子缓冲剂(pH 8.0) 100mM
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 30μM
dUTP 300μM
引物3或引物1 200nM
引物4或引物2 200nM
KOAc 110mM
SYBR绿I 0.2X
NaPPi 225μM
Mg(OAc)2 2.5mM
Tth储存缓冲液(0.2％吐温) 6％v/v
GLQDSE CS5 DNA聚合酶 10nM
注：“GLQDSECS5DNA聚合酶”是指G46EL329AQ601RD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶。另注：“Tth储存缓冲液”包括0.2％吐温20，20mMTrispH8.0，0.1mMEDTA，100mMKCl，1mMDTT，和50％v/v甘油。另外，用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水将每个反应体积调至50μl。
不同的反应组分包括下述未封闭的引物(参见，图8中“未封闭的引物”表示的反应)：
引物1
5’-TGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAATGT-3’(SEQIDNO：1)
引物2
5’-CTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCATGT-3’(SEQIDNO：2)
和下述封闭的引物(参见，图8中“封闭的引物”表示的反应)：
引物3
5’-TGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAATGU*-3’(SEQIDNO：3)
引物4
5’-CTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCATGU*-3’(SEQIDNO：4)
其中U*是指2’-磷酸-U(即，包含在2’位置的磷酸基的2’-终止子核苷酸)。反应物也包括(参见，图8中“25ng基因组DNA”表示的反应)或缺乏(参见，图8中“清洁靶”表示的反应)25ng加入混合物中的人基因组DNA。如图8进一步所示的，反应物也包括105、104、103、102或101个拷贝的线性化的质粒DNA，其包括在1μlHIV样品稀释剂(10mMTris，0.1mMEDTA，20μg/mL聚腺苷酸(PolyA)，和0.09％NaN3)中稀释的靶核酸，或在“Neg”反应中的1μlHIV样品稀释剂。指示的引物对从质粒DNA扩增170碱基对产物。
实施例III：在野生型K-Ras质粒模板背景下扩增突变K-Ras质粒 模板
在野生型K-Ras质粒模板背景下进行包含各种拷贝数的突变K-Ras质粒模板的扩增，并对比封闭的和未封闭的引物。图9的图显示了对于在这些反应中使用的各种突变K-Ras质粒模板拷贝数(x-轴)观察到的阈循环(CT)值(y-轴)。图9另外说明，例如，使用本文所述的封闭的引物，可以实现提高的辨别。
使用ABI5700序列检测系统进行反应，使用下述温度概况：
50℃2分钟
93℃1分钟
92℃，15秒→65℃，2分钟x60个循环
下述反应条件是所有反应共有的：
主混合物组分 浓度
两性离子缓冲剂(pH 8.0) 100mM
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 30μM
dUTP 300μM
引物7或引物5 200nM
引物8或引物6 200nM
SYBR绿I 0.1X
NaPPi 225μM
Mg(OAc)2 2.5mM
Ung 2U
Tth储存缓冲液(0.2％吐温) 6％v/v
GDSE CS5 DNA聚合酶 5nM
线性化的野生型质粒DNA 106个拷贝
注：“GDSECS5DNA聚合酶”是指G46ED640GS671FE678GCS5DNA聚合酶。另注：“Tth储存缓冲液”包括0.2％吐温20，20mMTrispH8.0，0.1mMEDTA，100mMKCl，1mMDTT，和50％v/v甘油。另外，用DEPC处理过的水将每个反应体积调至50μl。
不同的反应组分包括下述未封闭的引物(参见，图9中“未封闭的”表示的反应)：
引物5
5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’(SEQIDNO：5)
引物6
5’-GTTGGATCATATTCGTCCACAA-3’(SEQIDNO：6)
和下述封闭的引物(参见，图9中“封闭的”表示的反应)：
引物7
5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTC*-3’(SEQIDNO：7)
引物8
5’-GTTGGATCATATTCGTCCACAA*-3’(SEQIDNO：8)
其中C*是指2’-磷酸-C，且A*是指2’-磷酸-A(即，包含在2’位置的磷酸基的2’-终止子核苷酸)。另外，将106、105、104、103、102、101或0个拷贝(NTC反应)(在图9中，分别是10e6c、10e5c、10e4c、10e3c、10e2c、10e1c和NTC)的线性化的突变K-Ras质粒DNA加入反应。突变质粒DNA的相关子序列与封闭的和未封闭的引物组完美匹配。此外，在1μlHIV样品稀释剂(参见，上面)或在“NTC”反应中的1μlHIV样品稀释剂(参见上面)中稀释突变K-Ras质粒DNA。另外，106个拷贝的线性化的野生型K-Ras质粒DNA存在于所有反应中。野生型K-Ras质粒DNA的序列与突变质粒DNA相同，例外是，它与引物5和7中的最后3’碱基(dC)产生C：C错配。封闭的和未封闭的引物对在突变线性化的质粒模板上产生92碱基对扩增子。
实施例IV：用不同浓度的各种酶扩增K-Ras质粒模板
用不同浓度的各种酶进行包含K-Ras质粒模板的扩增。图10的图显示了对于在这些反应中使用的各种酶和浓度(x-轴)观察到的阈循环(CT)值(y-轴)。使用ABI5700序列检测系统进行反应，使用下述温度概况：
50℃2分钟
93℃1分钟
92℃，15秒→60℃，2分钟x60个循环
下述反应条件是所有反应共有的：
主混合物组分 浓度
两性离子缓冲剂(pH 8.0) 100mM
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 30μM
dUTP 300μM
引物9 200nM
引物10 200nM
SYBR绿I 0.1X
NaPPi 225μM
Mg(OAc)2 2.5mM
Ung 2U
Tth储存缓冲液(0.2％吐温) 6％v/v
线性化的K-Ras质粒DNA 104个拷贝
注：“Tth储存缓冲液”包括0.2％吐温20，20mMTrispH8.0，0.1mMEDTA，100mMKCl，1mMDTT，和50％v/v甘油。另外，反应组分包括下述封闭的引物：
引物9
5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGU*-3’(SEQIDNO：9)
引物10
5’-GTTGGATCATATTCGTCCACAA*-3’(SEQIDNO：8)
其中U*是指2’-磷酸-U和A*是指2’-磷酸-A(即，包含在2’位置的磷酸基的2’-终止子核苷酸)。引物对在线性化的K-Ras质粒模板上形成92碱基对扩增子。另外，用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水将每个反应体积调至50μl。
为下述的每种个别的聚合酶最优化聚合酶浓度和KOAc浓度：
聚合酶 聚合酶浓度(nM) KOAc(mM)
GLQDSE 5、10、15、20、30或40nM 110
GLDSE 5、10、15、20、30或40nM 25
GLE 5、10、15、20、30或40nM 25
注：“GLQDSE”是指G46EL329AQ601RD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，“GLDSE”是指G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，和“GLE”是指G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶。
实施例V：PAP有关的酶对比
对比了G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶和G46EL329AD640S671FE678GCS5DNA聚合酶进行焦磷酸解作用激活的聚合(“PAP”)的能力。反应缓冲液包含100mM两性离子缓冲剂pH8.0，0mM(G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶)或50mM(G46EL329AD640S671FE678GCS5DNA聚合酶)KOAc，10％v/v甘油，0.04U/μlUNG，4mMMg(OAc)2，0.2XSYBR绿I，2.5％v/v酶储存缓冲液(50％v/v甘油，100mMKCl，20mMTrispH8.0，0.1mMEDTA，1mMDTT，0.5％吐温20)，各0.2mM的dATP、dCTP和dGTP，和0.4mMdUTP，和100μM焦磷酸。交叉滴定M13模板(GenBank登记号X02513)和酶。使用的M13浓度是0、104、105和106个拷贝/20μl反应物。使用的酶浓度是2.5nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、35nM和50nM。使用下述循环参数，在384孔热循环仪中一式三份地建立反应：50℃2分钟；90℃1分钟；然后46个循环：90℃15秒，随后为在62℃的延伸温度60秒。
使用的引物序列是5’-CGCCTGGTCTGTACACCGTTXA-3’(引物11，SEQIDNO：10)和5’-GGAACGAGGGTAGCAACGGCTACE-3’(引物12，SEQIDNO：11)，其中X＝2’-氨基-C，且E＝2’-PO4-A(即，2’-终止子核苷酸)。这些引物各自在0.1μM加入反应混合物，从M13模板导致产生348bp产物。为了用作引物，必须通过末端残基的焦磷酸解作用去除来激活引物12。
分析荧光数据来测定弯值(elbowvalue)(即，C(t)(超过基线突出的荧光))。在图11中显示了G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶的C(t)值。在图12中显示了G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶的C(t)值。
实施例VI：对比未封闭的和封闭的RT引物的丙型肝炎病毒(HCV) RNA到cDNA的反转录(RT)
在反转录反应中在HCVRNA模板上对比未封闭的HCVRT引物的延伸和封闭的引物的延伸。使用各种聚合酶进行这些RT对比。为了说明，图13的图显示了对于在这些反应中使用的各种酶(x-轴)观察到的阈循环(Ct)值(y-轴)，其中使用包含5’-核酸酶探针的实时PCR测量cDNA。
下述反应条件是所有RT反应共有的：
RT混合物组分 浓度
两性离子缓冲剂pH 8.0 100mM
KOAc 100mM
DMSO 4％(v/v)
引物1或2 200nM
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 30μM
dUTP 300μM
UNG 0.2单位
Mn(OAc)2 1mM
PPi 175uM
不同的反应组分包括下述的3’-OH未封闭的引物(参见，图13中“3’OH引物(未封闭的)”表示的反应)：
引物1
5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA-3’(SEQIDNO：12)
和下述封闭的引物(参见，图13中“2’PO4(封闭的)”表示的反应)：
引物2
5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA*-3’(SEQIDNO：13)
其中A*是指2’-磷酸-A或2’-单磷酸-3’-羟基腺苷核苷酸(即，包含在2’位置的磷酸基的2’终止子核苷酸)。此外，在cDNA反应中对比了下述聚合酶条件(参见，图13)：
ZO5DNA聚合酶(13nM)
GLQDSECS5DNA聚合酶(100nM)与GLQDSCS5DNA聚合酶(25nM)组合
GLQDSECS5DNA聚合酶(50nM)与GLQDSCS5DNA聚合酶(50nM组合
其中“GLQDSECS5DNA聚合酶”是指G46EL329AQ601RD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，且“GLQDSCS5DNA聚合酶”是指G46EL329AQ601RD640GS671FCS5DNA聚合酶。另外，用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水将每个反应物调至20μl。
在ABI9600热循环仪中在60℃温育RT反应物60分钟。RT温育后，在DEPC处理过的水中稀释RT反应物100倍。通过基于5’核酸酶探针的实时HCVPCR反应，证实cDNA的存在和定量，所述实时HCVPCR反应设计用于特异性地测量RT反应的HCVcDNA产物。使用ABIPrism7700序列检测器进行这些反应，使用下述温度概况：
50℃2分钟
95℃15秒→60℃1分钟x50个循环。
实施例VII：用于BRAF突变检测的双向PAP
图14显示了当进行双向PAP时产生的BRAF癌基因扩增的PCR生长曲线。x-轴显示了标准化的累积荧光，且y-轴显示了PAPPCR扩增的循环。更具体地，当使用在它们的3’-末端核苷酸在精确的突变位置重叠的2’-终止子封闭的引物进行BRAF癌基因(参见，Brose等人(2002)CancerRes62：6997-7000)中负责V599E密码子变化的T→A突变的突变特异性的扩增时，生成这些数据。当使对野生型序列特异性的引物与野生型靶或突变靶反应时，仅检测到野生型靶。相反，当使对突变序列特异性的引物与野生型靶或突变靶反应时，仅检测到突变靶。
下述反应条件是所有RT反应共有的：
组分 浓度
两性离子缓冲剂pH 8.0 100mM
KOAc 100mM
甘油 3.5％v/v
引物F5W或F5M 200nM
引物R5W或R5M 200nM
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 30μM
dUTP 300μM
UNG 1单位
PPi 175uM
GLQDSE 15nM
SYBR I/羧基罗丹明 1/100,000(0.1x)
Mg(OAc)2 3.0mM
其中“GLQDSE”是指G46EL329AQ601RD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶。
不同的反应组分包括下述野生型BRAF引物(在图14标有“F5W/R5W”)：
F5W5’-AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGU*-3’(SEQIDNO：14)
R5W5’-GGACCCACTCCATCGAGATTTCA*-3’(SEQIDNO：15)
和下述突变BRAF引物(在图14标有“F5M/R5M”)：
F5M5’-AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA*-3’(SEQIDNO：16)
R5M5’-GGACCCACTCCATCGAGATTTCU*-3’(SEQIDNO：17)
其中A*是指2’-磷酸-A或2’-单磷酸-3’-羟基腺苷核苷酸，且U*是2’-磷酸-U或2’-单磷酸-3’-羟基尿苷核苷酸(即，包含在2’位置的磷酸基的2’终止子核苷酸)。
另外，用DEPC处理过的水将每个反应物调至50μl。野生型反应物(在图14标有“WT”)含有BRAF野生型序列的线性化的DNA质粒，且突变型反应物(在图14标有“MT”)含有BRAF突变序列的线性化的DNA质粒。阴性反应(在图14标有“NEG”)含有HIV样品稀释剂(10mMTris，0.1mMEDTA，20μg/mL聚腺苷酸，和0.09％NaN3)，不含有DNA。PCR中的引物组合产生50bp扩增子。此外，使用ABIPrism7700序列检测器进行反应，使用下述温度概况：
实施例VIII：荧光PAP释放产物的检测
该预示性的实施例解释了包含PAP激活的实时监控规程，其中随着引物被激活和延伸，封闭的引物导致可检测信号的生成。
3’末端的、双标记的寡核苷酸引物的构建：
下面的引物QX是DNA寡核苷酸，其包含猝灭染料分子，附着到离3’末端第13个核苷酸(A)的BlackHole(BHQ)(BiosearchTechnologies，Inc.)。
在溶液中混合QX的寡核苷酸引物和互补寡核苷酸R1(参见下面)，从而使它们形成杂种双链体。该双链体进一步与下面提供的表IV中的试剂混合，其中特别包括荧光素-标记的脱氧核糖腺嘌呤四磷酸酯(即，荧光素-标记的2’-终止子核苷酸)和能掺入这种标记的四磷酸酯的DNA聚合酶。参见，于2004年6月28日提交的美国专利申请号10/879,494，其标题为“SYNTHESISANDCOMPOSITIONSOF2′-TERMINATORNUCLEOTIDES”，和于2004年6月28日提交的10/879,493，其标题为“2’-TERMINATORNUCLEOTIDE-RELATEDMETHODSANDSYSTEMS”。在60℃的温度温育混合物例如1小时，可造成序列QX的3’末端以模板指导的方式延伸1个核苷酸，从而导致至少部分QX寡核苷酸在它们的3’末端被荧光素-标记的脱氧核糖腺嘌呤2’-磷酸核苷酸延伸，下面表示为引物QXFAM。
表IV
混合物组分 浓度
两性离子缓冲剂pH 8.3 50mM
KOAc 100mM
甘油 8％(w/v)
引物QX 10μM
寡核苷酸R1 15μM
荧光素dA4P 15μM
G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶 50nM
Mg(OAc)2 2.5mM
使用任意数目的本领域技术人员已知的纯化方法，从上面的混合物中纯化新延长的引物QXFAM。能从混合物中纯化引物QXFAM的这样的方法的实例是高效液相层析(HPLC)。HPLC纯化参数这样进行选择，从而使得引物QXFAM制剂基本上不含有未延伸的引物QX和荧光素-标记的腺嘌呤四磷酸酯。双HPLC(反相和阴离子交换HPLC)是已知的纯化这种分子的方法。
一旦纯化，分子例如含有BHQ猝灭分子和在相同寡核苷酸上的荧光素分子的引物QXFAM通常就表现出受阻抑的荧光素信号，这是由于BHQ2“猝灭剂”分子的能量吸收。
任选地，如本文所述化学地合成引物QXFAM。
在该实施例中提及的序列如下：
引物QX
5’-GCAAGCACCCTATCAQGGCAGTACCACA-3’(SEQIDNO：18
(其中Q代表存在BHQ分子)
R13’-PCGTTCGTGGGATAGTCCGTCATGGTGTT-5’(SEQIDNO：19)
(其中P代表3’磷酸)
引物QXFAM
5’-GCAAGCACCCTATCAQGGCAGTACCACAF-3’(SEQIDNO：20)
(其中Q代表存在BHQ分子，且F代表荧光素-标记的2’磷酸腺嘌呤)
引物HC2
5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCTTA-3’(SEQIDNO：21)
引物在PCR中的应用。
如上所述的引物QXFAM与表V中的试剂相组合。
表V
组分 浓度
两性离子缓冲剂pH 8.0 100mM
KOAc 100mM
甘油 3.5％(v/v)
DMSO 5％(v/v)
引物QXFAM 150nM
引物HC2 150nM
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 30μM
dUTP 300μM
UNG 1单位
PPi 175μM
GLQDSE 15nM
靶序列 106个拷贝
Mg(OAc)2 3.0mM
另外，用DEPC处理过的水将每个反应物调至50μl。有些反应物含有用作PCR扩增的底物的靶序列，而其它反应物不含有靶。例如，所述靶可以是与HCV基因组的5’UTR区域相同的DNA序列。预期PCR中这些引物的组合生成约244bp扩增子。
使用ABIPrism7700序列检测器进行反应，使用下述温度概况：
为了进行这样的PCR，需要荧光素-终止的引物QXFAM的PAP激活，且其导致荧光素-标记的脱氧腺嘌呤四磷酸酯分子的去除。预见到这种释放导致在约520nm波长的荧光信号的增加。随着PCR进展监控在约520nm波长的信号，人们可以预见观察到含有靶核酸的那些反应物中荧光的增加，而没有观察到不含有靶的反应物中荧光的增加。
尽管为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述发明，但本领域技术人员在阅读本公开内容后将明白，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可以作出在形式和细节方面的各种变化。例如，上述的所有技术和装置可以以各种组合使用。
提及的所有引物或核苷酸序列和所有氨基酸序列都是人工序列。

Claims (7)

1.从寡核苷酸去除2’-终止子核苷酸的方法，该方法包含：
与下述物质一起温育至少一种靶核酸：
焦磷酸；
至少包含焦磷酸解作用活性的第一种生物催化剂，和
至少一种包含2’-终止子核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸与靶核酸的至少第一个子序列至少部分地互补，
所述温育在第一种生物催化剂从寡核苷酸去除至少2’-终止子核苷酸以生成去除的2’-终止子核苷酸和缩短的寡核苷酸的条件下进行，从而从寡核苷酸去除核苷酸，
其中所述第一种生物催化剂具有校正3’-5’外切核酸酶活性。
2.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含在寡核苷酸的3’-末端的2’-终止子核苷酸。
3.权利要求1的方法，其中所述2’-终止子核苷酸不可被一种或多种选自下述的核苷酸掺入生物催化剂延伸：G46EE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶，G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶，G46EE678GCS6DNA聚合酶，ΔZO5R聚合酶，E615GTaqDNA聚合酶，黄栖热菌(Thermusflavus)聚合酶，TMA-25聚合酶，E678GTMA-25聚合酶，TMA-30聚合酶，E678GTMA-30聚合酶，TthDNA聚合酶，栖热菌属(Thermus)物种SPS-17聚合酶，E615GTaq聚合酶，栖热菌属ZO5R聚合酶，T7DNA聚合酶，KornbergDNA聚合酶I，克列诺DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶，微球菌DNA聚合酶，αDNA聚合酶，反转录酶，AMV反转录酶，M-MuLV反转录酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶，T3RNA聚合酶，T4DNA聚合酶，T7RNA聚合酶，RNA聚合酶II，末端转移酶，多核苷酸磷酸化酶，掺入核糖核苷酸类似物的DNA聚合酶，和掺入核糖核苷酸的DNA聚合酶。
4.权利要求1的方法，其中所述第一种生物催化剂包含核苷酸掺入活性，且其中所述方法包含，与第一种生物催化剂、缩短的寡核苷酸和至少一种其它核苷酸一起温育靶核酸，所述温育在第一种生物催化剂将其它核苷酸掺入缩短的寡核苷酸的末端以生成延长的寡核苷酸的条件下进行；或者其中所述方法包含，与至少包含核苷酸掺入活性的第二种生物催化剂、缩短的寡核苷酸和至少一种其它核苷酸一起温育靶核酸，所述温育在第二种生物催化剂将其它核苷酸掺入缩短的寡核苷酸的末端以生成延长的寡核苷酸的条件下进行。
5.权利要求4的方法，其中所述第一种和/或第二种生物催化剂包含选自下述的酶：聚合酶和反转录酶。
6.权利要求1的方法，其中所述2’-终止子核苷酸包含式：
其中
Z是O或CH2；
B是至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基或其组合；
BG是封闭基团；
R1是OH；
且，
代表单键或双键；且
其中BG选自：CN、NO2、磷酸基团、醛基团及其组合。
7.权利要求6的方法，其中BG包含磷酸基团，所述磷酸基团包含式：
或
其中
Q是O、S或NH；
X是H、OH、CH3、BH3、F或SeH；且，
Z是O、S或Se；
或
其中
Q是O、S或NH；
X是O、S或NH；
Z是O、S或Se；且，
R是烷基、链烯基或炔基；或
其中
Q是O、S或NH；
X是O、S或NH；
Z是O、S或Se；
L是-CONH(CH2)nNH-、-CO(CH2)nNH-或-CONH(CH2CH2O)nCH2CH2NH-；
n是大于0的整数；且，
R是NH2、SH、COOH、猝灭剂部分、报道部分、生物素或亲和部分。
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