DE3803021A1

DE3803021A1 - Atp-derivate

Info

Publication number: DE3803021A1
Application number: DE19883803021
Authority: DE
Inventors: Reinhard Dr Geiger; Werner Dr Miska
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-02-02
Filing date: 1988-02-02
Publication date: 1989-08-10

Description

Die Erfindung betrifft ATP-Derivate, ihre Verwendung zum Nachweis von Enzymen oder zur Bestimmung von Enzymaktivi täten und diese Derivate enthaltende Zusammensetzungen.

Bei den herkömmlichen analytischen Bestimmungen von Enzym aktivitäten, beispielsweise in biologischem Material, bedient man sich fluorogener oder chomogener Substrate, aus denen dann mit Hilfe der Enzyme eine "austretende Gruppe" freigesetzt werden kann.

Bei dieser austretenden Gruppe kann es sich beispiels weise um Farbstoffe handeln. Die bei dieser "Indikator reaktion" entstehenden Farbstoffe sind der Fotometrie zugänglich. Daher ist es möglich, ihre Konzentration zu bestimmen und aus den gewonnenen Daten Rückschlüsse auf die enzymatische Aktivität zu ziehen; "Methods of Enzy matic Analysis", Verlag Chemie, Vol. 1-11, Weinheim, Bergstraße (1984), Hrsg. H. U. Bergmeyer.

Mit den bisher bekannten Substraten können Enzym-Konzentra tionen bis ca. 5 ng pro Test gemessen werden. Es handelt sich hier um die enzymatische Aktivität (U). Aus der spezifischen Aktivität (U/mg) kann auf die Menge an Enzym geschlossen werden.

Die enzymatische Aktivität (U) ist definiert als µmol/min.; meist bei 25°C gemessen. Diese enzymatische Aktivitäten, die auch katalytische Aktivität genannt wird, wird in SI- einheiten in Katal (kat=mol/s) angegeben. Die katalytische Konzentration (katalytische Aktivität pro Volumen) wird in kat/l angegeben.

Erfindungsgemäß werden Derivate des Adenosin-5′-triphosphats (ATP) bereitgestellt, mit denen Enzyme wesentlich empfind licher detektiert werden können als mit den eingangs genann ten analytischen Bestimmungsmethoden. Die Enzyme setzen aus den erfindungsgemäßen Derivaten "reines" ATP frei, das mit der Biolumineszenz-Reaktion detektiert wird.

ATP ist für die Biolumineszenz-Reaktion von essentieller Bedeutung. Bei dieser Biolumineszenz-Reaktion wird ATP mit D-Luciferin oder mit D-Aminoluciferin und mit dem Enzym Luci ferase des Leuchtkäfers Photinus pyralis oder des Leucht käfers Photinus plathiophthalamus oder mit der Luciferase anderer Spezies oder mit chemisch oder genetisch modifi zierten Luciferasen in Gegenwart von MgCl₂ umgesetzt. Diese Biolumineszenz-Reaktion unter Verwendung von D- Luciferin ist im nachstehend gezeigten Schema erläutert.

Bei dieser unter Verbrauch von ATP ablaufenden Reaktion werden Photonen emittiert; und zwar bei der Umsetzung mit Enzym des Leuchtkäfers Photinus pyralis bei 605 nm und bei der Umsetzung mit dem Enzym des Leuchtkäfers Photinus plathiophthalamus bei 549 bzw. 570 nm oder bei der dem eingesetzten Luciferin/Luciferase-System ent sprechenden Wellenlänge. Das emittierte Licht bestimmt man dann luminometrisch.

Für weitere Einzelheiten wird auf folgende Literatur stellen verwiesen:
"Luminometry" von K. Wulff in "Methods of Enzymatic Analysis", Vol. 1 (Hrsg. H. U. Bergmeyer), Seiten 340-368, Verlag Chemie, Weinheim, Bergstraße (1983) und Journal of the American Chemical Society 88, 2015-2018 (1966) von E. H. White et al.

Eine Änderung der ATP-Konzentration bedingt bei der oben beschriebenen Biolumineszenz-Reaktion eine Änderung der Lichtfreisetzung. Somit kann die ATP-Konzentration über die Zahl der gemessenen Lichtimpulse ermittelt werden.

Gegenstand der Erfindung sind die im Anspruch 1 beschrie benen ATP-Derivate. Diese erfindungsgemäßen ATP-Derivate werden von hydrolytischen Enzymen wie Phosphatasen, Sul fatasen und Esterasen gspalten. Dabei wird ATP freigesetzt, welches mit Luciferin oder Aminoluciferin, Magnesium-Ionen und Luciferase entsprechend der oben beschriebenen Bio lumineszenz-Reaktion zur Freisetzung von Photonen führt. Die dabei ausgesandte Lichtmenge ist abhängig von der Menge an freigesetztem ATP und ist somit ein Maß für die enzyma tische Aktivität der hydrolytischen Enzyme.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen ATP-Derivate ist es möglich, Enzyme noch in geringsten Mengen nachzuweisen. So können von dem Enzym alkalische Phosphatase mit Hilfe der erfin dungsgemäßen Verbindung 3′-Phospho-Adenosin-5′-triphosphat noch 100 fg detektiert werden.

Mit den erfindungsgemäßen ATP-Derivaten können Phosphatasen (saure, neutrale und alkalische), Sulfatasen und Esterasen von den verschiedensten Spezies und unterschiedlichen Orga nen und Geweben sehr empfindlich nachgewiesen werden.

Diese erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Immuno assays, Histoimmunlumineszenz-Verfahren, bei Protein- Blotting, DNA-Hybridisierung und RNA-Hybridisierung einge setzt werden. Dazu wird das hydrolytisch wirksame Enzym an Antigen/Antikörper oder Ligand/Rezeptor gekoppelt. Man inkubiert das Enzym-Konjugat mit dem entsprechenden Anti körper/Antigen oder Rezeptor/Ligand, entfernt überschüssi ges Enzym-Konjugat und detektiert das gebundene Konjugat mit dem entsprechenden ATP-Derivat.

Ebenso können diese erfindungsgemäßen ATP-Derivate bei der Messung von Marker-Genen in transfektierten Zellen (d. h. Messung von Enzymen, die nach erfolgter Transfektion (Über tragung von Fremd-DNA/RNA in einen Organismus/Virus) mit dem entsprechenden Marker-Gen vom Gen exprimiert werden) angewandt werden.

Zur Durchführung der oben beschriebenen Biolumineszenz- Reaktion und somit zur Durchführung eines luminometrischen Tests verwendet man einen "Biolumineszenz-Cocktail" fol gender Zusammensetzung:

30 mmol/l HEPES (N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N′-2-ethansulfonsäure)
6 mmol/l Magnesiumchlorid
0,3 mmol/l Luciferin bzw. Aminoluciferin
0,5 mmol/l EDTA
80 µmol/l DTT (Dithiothreitol)
2,5 µg/ml Luciferase (des Leuchtkäfers Photinus pyralis oder plathiophthalamus oder einer anderen Spezies)

Gesamtvolumen: 0,4 ml; pH 7,75

Obige Biolumineszenz-Reaktion sowie obiger luminometrischer Test sind nachfolgend an Hand des Nachweises der enzymatischen Aktivität am Beispiel der alkalischen Phosphatase aus Rinder Intestinal Mucosa erläutert:
0,95 ml einer 1 mmol/l Lösung von Adenosin-5′-triphosphat- 3′-phosphat in 0,05 mol/l Diethanolamin-Puffer mit 0,5 mmol/l Magnesiumchlorid pH 9,5 versetzt man mit 0,05 ml der zu testenden Lösung und inkubiert 30 min bei 25°C. Anschlie ßend entnimmt man 0,1 ml und gibt zu 0,4 ml des oben be schriebenen Biolumineszenz-Cocktails. Anschließend be stimmt man die Lichtimpulse in einem Lumineszenz-Meßgerät.

Beispsiele Beispiel 1 Herstellung von Adenosin-5′-triphosphat-3′-phosphat

51 mg (0,1 mmol) ATP und 350 mg Magnesiumoxid suspendiert man in 3 ml Wasser und kühlt auf 0°C. Anschließend tropft man 45 mg (0,3 mmol) Phosphoroxychlorid in 1 ml Tetrachlor kohlenstoff zu. Nach 1 h bei Raumtemperatur filtriert man die Suspension, neutralisiert mit Essigsäure und engt im Vakuum ein. Den Rückstand nimmt man in wenig Wasser auf und reinigt mittels HPLC (MG: 587,16).

Elementaranalyse:
berechnet:
C 20,46; H 2,92; N 11,93; P 21,00%;
gefunden:
C 20,34; H 2,78; N 12,07; P 21,84%.

Beispiel 2 Herstellung von Adenosin-5′-triphosphat-2′-phosphat

Man suspendiert 26 mg (0,05 mmol) ATP und 350 mg Magnesium oxid in 3 ml Wasser und kühlt auf 0°C. Anschließend tropft man 45 m (0,3 mol) Phosphoroxychlorid in 1 ml Tetrachlor kohlenstoff zu. Man filtriert die Suspension nach 2 h bei 0°C, neutralisiert mit Essigsäure und engt im Vakuum ein. Den Rückstand nimmt man in wenig Wasser auf und reinigt mittels HPLC (MG: 587,16).

Beispiel 3 Herstellung von Adenosin-5′-triphosphat-2′-sulfat

Man löst 35,5 g (0,07 mmol) ATP in 1 ml Pyridin, gibt 16 mg (0,1 mmol) SO₃/Pyridin-Komplex zu und inkubiert unter Stickstoff 2 h bei Raumtemperatur. Anschließend engt man die Lösung in einem Rotations-Verdampfer im Ölpumpen vakuum ein, nimmt in wenig Wasser auf und reinigt mittels HPLC (MG: 587,24).

Elementaranalyse:
berechnet:
C 20,45; H 2,74; N 11,93; P 15,82; S 5,46%;
gefunden:
C 21,06; H 2,68; N 12,40; P 15,70; S 5,22%.

Beispiel 4 Herstellung von Adenosin-5′-triphosphat-3′-sulfat

Man löst 35,5 g (0,07 mmol) ATP in 1 ml Pyridin, gibt 16 mg (0,1 mmol) SO₃/Pyridin-Komplex zu und inkubiert unter Stickstoff 2 h bei 50°C. Anschließend engt man die Lösung im Rotations-Verdampfer im Ölpumpenvakuum ein, nimmt in wenig Wasser auf und reinigt mittels HPLC (MG: 587,24).

HPLC-System für die Reinigung:
Säule RP-18 (5 um)
Lösung A: 0,02 mol/l Natriumphosphat ph 6,5+1% Methanol
Lösung B: Methanol
Gradient: 2,5 min A; in 4,5 min von 100% A auf 10% A
Detektion bei 254 nm.

Claims

1. ATP-Derivate der allgemeinen Formel I worin R¹ und R² unabhängig voneinander für -PO₄H₂,-OH, -SO₄H oder -O-Acetyl stehen, mit der Maßgabe, daß nicht beide Reste R¹ und R² gleichzeitig für -OH stehen können.

2. ATP-Derivate nach Anspruch 1 der Formel I, worin R¹ oder R² für -OH steht.

3. ATP-Derivate nach Anspruch 1, nämlich:
Adenosin-5′-triphosphat-3′-phosphat,
Adenosin-5′-triphosphat-2′-phosphat,
Adenosin-5′-triphosphat-2′-sulfat und
Adenosin-5′-triphosphat-3′-sulfat.

4. Verwendungen der ATP-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 3 zum Nachweis von Enzymen oder zur Bestimmung von Enzymaktivitäten.

5. Zusammensetzungen zum Nachweis von Enzymen oder zur Bestimmung von Enzymaktivitäten, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein ATP-Derivat nach den Ansprüchen 1 bis 3 enthalten.