DE69329254T2

DE69329254T2 - Fluorogene und chromogene Betalactamase-Substrate

Info

Publication number: DE69329254T2
Application number: DE69329254T
Authority: DE
Inventors: Randal A. Hoke; Elmo O Millner; Patrick D. Mize; Michael J. Quante; Daniel L. Woodward
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1992-01-30
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 2001-01-18
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: EP0553741A3; EP0553741B1; US5514561A; EP0553741A2; US5516902A; DE69329254D1; CA2087694C; US5338843A; CA2087694A1; US5583217A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Synthese von chromogenen und fluorogenen Substraten für β-Lactamase und ihre Verwendung beim Untersuchender Anwesenheit von β-Lactamase in einer Probe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die β-Lactamasen sind eine Gruppe von Enzymen, die von bestimmten Bakterien erzeugt werden und Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika verleihen. Eine solche Resistenz hat Auswirkungen bei der Therapie von bakteriellen Infektionen mit β-Lactam-Antibiotika, da die bakterielle Resistenz gegen das Antibiotikum groß genug sein kann, um ein Scheitern der Therapie zu bewirken. Es ist daher wünschenswert, genaue und sensible Untersuchungen der Anwesenheit von β-Lactamasen zur Verfügung zu haben, um eine geeignete antibiotische Therapie für einen Patienten auszuwählen und Patienten, die eine β-Lactam- Therapie erhalten, auf das Auftreten bakterieller Resistenz infolge einer β-Lactamasen- Erzeugung hin zu überwachen.
β-Lactamasen verleihen die Resistenz durch eine Hydrolyse des β-Lactam-Rings des Antibiotikums. Die Ringhydrolyse führt zu einer Inaktivierung des β-Lactam-Antibiotikums. Es wird angenommen, dass eine enzymatische Hydrolyse durch den Angriff eines Serinhydroxyls an der aktiven Stelle des Enzyms eingeleitet wird, der den β-Lactam-Ring öffnet und ein Acyl-Enzym-Intermediat erzeugt. Das Acyl-Intermediat kann auf jedem von zwei Wegen, abhängig von der Stabilität und dem sterischen Volumen der austretenden. Gruppe, gespalten werden. Die zwei Wege einer Spaltung des Acyl-Intermediats werden in Fig. 1 veranschaulicht. Wenn die austretende Gruppe, X-Y, nicht abgespalten werden kann oder nur sehr langsam abgespalten wird, verläuft die Spaltung des Acyl-Enzym-Intermediats nach Weg A, bei dem die austretende Gruppe, X-Y, abgespalten wird, nachdem das Enzym deacyliert ist. Dies führt zu einem hohen Umsatz von Enzymsubstrat (d. h. des Antibiotikums) und ist daher für die Entwicklung eines empfindlichen Detektiersystems für β-Lactamasen erwünscht.
Wenn die austretende Gruppe rasch abgespalten wird, verläuft die Spaltung des Acyl- Enzym-Intermediats nach Weg B, bei dem die Abspaltung erfolgt, bevor das Enzym deacyliert ist. Damit wird ein stabileres Acyl-Enzym-Intermediat erzeugt, das langsam hydrolysiert, um freies Enzym zu regenerieren. Eine Inkubation von β-Lactamase mit Substraten dieses Typs führt zu einem anfänglichen Hochschnellen der Enzymaktivität, gefolgt von einer beinahe vollständigen Inaktivierung der β-Lactamase.
Das Abspalten der austretenden Gruppe muss nicht ausschließlich auf nur einem dieser alternativen Wege erfolgen. Es wird allgemein angenommen, dass β-Lactamase- Substrate, die eine 3'-austretende Gruppe aufweisen, nach beiden Wegen in variablem Ausmaß hydrolysiert werden.
Die Forschung auf dem Gebiet des Synthetisierens von Substraten für β-Lactamase hat sich primär auf das Entwickeln von Verbindungen konzentriert, die nach Weg B hydrolysiert werden (Fig. 1), der zu einer Enzyminaktivierung führt. Die meisten bekannten chromogenen Substrate für β-Lactamase sind durch eine Veränderung von Cephalosporinen synthetisiert worden und weisen eine 3'-austretende Gruppe auf, die während der Hydrolyse des Lactam-Rings abgespalten wird. Diese Verbindungen neigen dazu, die Enzymaktivität zu hemmen oder das Enzym zu deaktivieren und es daher den β-Lactam-Antibiotika zu ermöglichen, das Wachstum der Bakterien hemmen. Allerdings weisen solche Substrate bei einer Verwendung in Untersuchungen auf β-Lactamase hin den Nachteil einer geringeren Sensibilität im Vergleich zu Substraten wie z. B. den hier geoffenbarten auf.
Ohne an irgendeinen speziellen Reaktionsmechanismus gebunden sein zu wollen, glauben die Anmelder, dass die β-Lactamase-Substrate der vorliegenden Erfindung primär nach dem ersten Weg hydrolysiert werden, da die austretenden Gruppen relativ groß sind und langsam abgespalten werden würden. Gespalten sind die austretenden Gruppen fluoreszierend, sichtbar oder dazu imstande, bei einer Untersuchung eine visuell detektierbare Farbe zu erzeugen. Diese Verbindungen bieten daher im Vergleich zu herkömmlichen Reagenzien eine verbesserte Untersuchungssensibilität und können darüber hinaus mittels fluorometrischer und spektrophotometrischer Detektoren detektiert werden, die in klinischen Laboratorien üblicherweise zur Verfügung stehen. Insbesondere stellen die erfindungsgemäßen fluorogenen Substrate eine Verbesserung gegenüber β-Lactamase- Substraten im Stand der Technik dar, und zwar dahin gehend, dass sie in einem Wellenlängenbereich fluoreszieren, der unter Einsatz solcher automatisierter Fluoreszenz- Detektiersysteme detektiert werden kann, wodurch Untersuchungen unter Verwendung solcher Substrate praktischer und wirtschaftlicher werden, wenn eine große Anzahl an Tests durchzuführen ist, beispielsweise in einem klinischen Laboratorium. Die erfindungsgemäßen Substrate, die nach einer Spaltung imstande sind, visuell detektierbare Farben zu erzeugen, bieten im Vergleich zu vorbekannten β-Lactamase-Substraten dahin gehend einen Vorteil, dass die austretende Gruppe weiter umgesetzt werden kann, um einen unlöslichen Farbstoff zu erzeugen, der auf einer festen Oberfläche (z. B. einer Membran), wo er leicht sichtbar gemacht werden kann, ausgefällt werden kann.
Substrate für β-Lactamase, die vor einer Spaltung des β-Lactam-Rings nicht fluoreszierend und nach einer Spaltung fluoreszierend sind, sind im US-Patent Nr. 4,965,193 an Chen und im US-Patent Nr. 4,740,459 an Chen et al. beschrieben. Die geoffenbarten Substrate sind β-Lactam-Antibiotika mit einer Acyl-Seitenkette, die eine α-Aminogruppe und eine α-Phenylgruppe oder deren Derivate enthält. In Gegenwart von β-Lactamase wird die Amidbindung gespalten, und die resultierende Offener-Ring-Verbindung fluoresziert. Im US-Patent Nr. 4,965,193 ist ferner geoffenbart, dass die Fluoreszenz mittels eines Fluoreszenzentwicklers verbessert werden kann, der aus einem schwachen Oxidationsmittel und Formaldehyd besteht. Diese Verbindungen unterscheiden sich von den erfindungsgemäßen Verbindungen dadurch, dass das Antibiotikum selbst fluoreszierend wird, wenn der β-Lactam-Ring geöffnet ist, wohingegen die erfindungsgemäßen fluorogenen Verbindungen eine austretende Gruppe freigeben, welche fluoresziert. Die erfindungsgemäßen Substrate sind daher bei Fluoreszenz-Untersuchungen von Nutzen, unabhängig von der Struktur der Acyl-Seitenkette. Darüber hinaus erfordern die erfindungsgemäßen fluorogenen Substrate keine chemische Behandlung nach der Spaltung und sind daher in der Lage, kinetische Informationen zu liefern.
Chromogene ausfallende Substrate für β-Lactamase sind im US-Patent Nr. 4,978,613 an Bieniarz et al. geoffenbart. Diese Substrate umfassen eine Komponente R&sub2;, die durch eine Thioesterbindung an eine β-Lactam-Verbindung gebunden ist. Diese Komponente bildet zusammen mit dem Schwefelatom, an das sie gebunden ist, eine schwefelhaltige austretende Gruppe S-R&sub2;, deren konjugierte Säure einen pKa unter 8 aufweist. Die austretende Gruppe wird nach einer Aufspaltung des β-Lactam-Rings durch β-Lactamase abgespalten und reagiert mit einem Tetrazoliumsalz, um einen farbigen Niederschlag ohne weitere Spaltung von S-R&sub2; zu bilden. Die chromogenen Substrate nach Bieniarz et al. sind daher auf Chromogene beschränkt, die ein Schwefelatom zur Bildung der Thioether- oder Thioesterbindung mit der β-Lactam-Verbindung aufweisen. Im Gegensatz dazu enthalten die β-Lactamase-Substrate der vorliegenden Erfindung Carbamat-, Carbonat-, Thiocarbamat- oder Thiocarbonat-Bindungen und können daher unter Verwendung nicht schwefelhaltiger Chromogene synthetisiert werden.
Das US-Patent Nr. 3,355,452 und das US-Patent Nr. 3,484,437 an Urech et al. offenbaren 7-Aminocephalosporansäure-Derivate, die durch eine Reaktion von Desacetyl-7- aminocephalosporansäure mit einem Isocyanester synthetisiert werden. Diese halbsynthetischen Antibiotika umfassen allerdings keine chromogene oder fluoreszierende austretende Gruppe und sind gegenüber einer Spaltung durch Penicillinasen und Cephalosporinasen beständig. Sie sind daher als Substrate zur Verwendung in Untersuchungen auf β-Lactamase wie z. B. den jetzt beschriebenen nicht geeignet.
Die EP-A-0034759 beschreibt chromogene Cephalosporin-Derivate zur Verwendung bei einer Detektion von β-Lactamase und β-Lactamase-Inhibitoren.
Die FR-A-2 155 655 beschreibt chromophore Cephalosporine, die als reaktive Mittel in der Pathologie, Biochemie und analytischen Chemie von Nutzen sind.
Die EP-A-0018001 beschreibt ebenfalls chromophore Cephalosporine zur Detektion von β-Lactamasen.
Die WO-A-89/03889 beschreibt eine Untersuchung auf β-Lactamase aus mikrobiellen Quellen, bei der ein β-Lactam-Ring-enthaltendes Substrat verwendet wird, dessen Amidbindung in Gegenwart von β-Lactamase hydrolysiert wird. Das Substrat weist eine Acyl-Seitenkette auf, die eine Alpha-Aminogruppe und eine Alpha-Phenylgruppe enthält. Eine Fluoreszenz wird erzeugt, wenn das Substrat durch β-Lactamase hydrolysiert wird.
Die EP-A-0265185 beschreibt Cephalosporin-Derivate, die hervorragende antibakterielle Eigenschaften und eine verbesserte Stabilität gegenüber β-Lactamase- Enzymen aufweisen.
In "Unlisted Drugs", Jahrgang 29, Nr. 1, Januar 1977, Seite 10 ist die Verwendung von Verbindung 1 als Substrat in einer Fluoreszenz-Untersuchung von β-Lactamase beschrieben.
In "Chemical Abstracts", Band 116(17), Seite 443, Abstract Nr. 181001h sind Cephalosporin-Senf Promedikamente beschrieben, die auf eine stellenspezifische Weise durch monoklonale Antikörper-β-Lactamase-Konjugate aktiviert werden, welche auf an Tumorzellenoberflächen vorhandene Antigene angesetzt sind.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt rasche kolorimetrische und fluorogene Verfahren zur Detektion von β-Lactamase sowie chromogene und fluorogene Substrate zur Verwendung in solchen Verfahren zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen chromogenen Substrate können entweder unmittelbar nach einer Hydrolyse durch β-Lactamase eine visuell detektierbare Farbe erzeugen, oder die Hydrolyse kann an eine zweite Reaktion gekoppelt sein, bei der ein farbiges Produkt gebildet wird. Die erfindungsgemäßen Substrate weisen die folgende allgemeine Struktur auf:
wobei die Verbindung (I) im Wesentlichen farblos oder im Wesentlichen nicht fluoreszierend ist. X ist eine funktionelle Gruppe von Atomen, die entweder allein oder gemeinsam mit Y elektronegativ ist, so dass sich X-Y als austretende Gruppe verhält. Y ist eine Komponente, die nach der Freigabe aus der X-Y-austretenden Gruppe fluoreszierend, sichtbar oder imstande ist, ein visuell detektierbares farbiges Produkt zu erzeugen. In Anspruch 1 ist angegeben, welche Gruppen erfindungsgemäß jeweils als Gruppe X und Gruppe Y ausgewählt werden können. Vorzugsweise bildet die X-Komponente eine Carbamat-, Carbonat-, Thiocarbamat- oder Thiocarbonat-Bindung zwischen dem Cephamringsystem und der austretenden Gruppe, die nach einer Hydrolyse des Lactam- Rings durch β-Lactamase freigesetzt wird. Z ist jede der dieser Position im bekannten Cepham-Typ von β-Lactam-Antibiotika zugeordneten Komponenten. M kann Wasserstoff, ein Metallkation oder ein organisches Kation sein.
Die freigesetzte X-Y-Komponente erfährt eine weitere Spaltung in X und Y. Je nach der Struktur der austretenden Gruppe kann X beispielsweise CO&sub2;, CSO oder CS&sub2; sein. Y erzeugt - direkt oder durch eine Reaktion mit zusätzlichen Reagenzien - ein visuell detektierbares farbiges Produkt oder Fluoreszenz. Das verallgemeinerte Reaktionsschema für die Spaltung des β-Lactam-Rings und die Abspaltung von X-Y ist in Fig. 2 veranschaulicht.
Wo Y mit zusätzlichen Reagenzien reagiert, um eine Farbe zu erzeugen, können die zusätzlichen Reagenzien beispielsweise Diazoniumsalze, Oxidationsmittel (wie z. B. atmosphärischen Sauerstoff) und Ladungsübertragungs- oder freie Radikal-Initiatoren umfassen.
Die erfindungsgemäßen β-Lactamase-Substrate werden durch Umsetzen des Desacetylcepham-Antibiotikums mit dem Isocyanat oder Isothiocyanat von Y in Gegenwart organischer Lösungsmittel wie z. B. Dimethylformamid und Gewinnen des Produkts durch Ausfällung, Kristallisation oder Chromatographie synthetisiert.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist eine Abbildung des Mechanismus der Hydrolyse des β-Lactam-Rings durch β-Lactamase, wobei die zwei Wege dargestellt sind, nach denen das Acyl-Enzym- Intermediat gespalten werden kann.
Fig. 2 ist eine Abbildung des Mechanismus der Spaltung der erfindungsgemäßen β- Lactamase-Substrate durch β-Lactamase, wobei die Abspaltung der X-Y-austretenden Gruppe und die darauf folgende weitere Spaltung von X-Y in X und Y dargestellt werden.
Fig. 3 ist eine Abbildung der Verfahren zur Synthese von Cephalothinaminoindolcarbamat, Cefotaximaminoindolcarbamat, Cephalothinaminomethylcumarincarbamat und Cefotaximaminomethylcumarincarbamat.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die chromogenen und fluorogenen β-Lactamase-Substrate der vorliegenden Erfindung sind Derivate des Cepham-Typs von β-Lactam-Antibiotika und weisen die folgende allgemeine Struktur auf:
wobei die Verbindung (I) im Wesentlichen farblos oder im Wesentlichen nicht fluoreszierend ist, Z jede der Gruppen ist, die in dieser Position im bekannten Cepham-Typ von β-Lactam-Antibiotika zu finden sind, M ein Metall, ein organisches Kation oder Wasserstoff ist, und X-Y eine wie in Anspruch 1 definierte Komponente ist, die eine austretende Gruppe bildet, die abgespalten wird, wenn der β-Lactam-Ring durch β- Lactamase gespalten wird.
Z kann irgendeine der Seitengruppen sein, die in dieser Position im Cepham-Typ von β-Lactam-Antibiotika zu finden sind, und wird je nach dem Antibiotikum, das zum Derivatisieren ausgewählt ist, variieren. Beispiele sind die Cephalosporine und ihre Derivate. Cepham-Strukturen, einschließlich der charakteristischen Z-Seitengruppen, sind in der AHFS Drug Information 91, Gerald K. McEvoy (Hrsg.), veröffentlicht von der American Society of Hospital Pharmacists, zu finden. Vorzugsweise ist Z
M wird ebenfalls variieren, und zwar je nach dem Salz des β-Lactam-Antibiotikums, das zum Derivatisieren ausgewählt ist, und kann ein Metall, ein organisches Kation oder Wasserstoff sein. Vorzugsweise ist M Wasserstoff oder ein Natrium- oder Kaliumion.
Y ist eine wie in Anspruch 1 definierte Komponente, die im Wesentlichen nicht fluoreszierend, farblos oder nicht chromogen ist, wenn sie an das β-Lactamase-Substrat gebunden ist. Die Abspaltung der Gruppe X-Y vom Substrat als Ergebnis einer Spaltung des β-Lactam-Rings durch β-Lactamase und die weitere spontane Spaltung von X-Y in X + Y ermöglichen es Y, zu fluoreszieren oder ein sichtbares farbiges Produkt zu erzeugen. Y ist ausgewählt aus:
oder
N-Methylindoxyl.
Vorzugsweise ist Y Aminomethylcumarin (AMC), Aminoindol oder Indoxyl.
X ist eine Gruppe von Atomen, die allein oder in Verbindung mit Y elektronegativ ist, so dass sich X-Y als austretende Gruppe verhält, die abgespalten wird, wenn der β- Lactam-Ring durch β-Lactamase gespalten wird.
X ist eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus:
oder
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen β-Lactamase-Substrate, wobei Y einen reaktionsfähigen Stickstoff enthält, wird das Desacetylcepham-Antibiotikum mit dem Isocyanat oder Isothiocyanat von Y in Gegenwart organischer Lösungsmittel wie z. B. Dimethylformamid umgesetzt und das Produkt durch Ausfällung oder Kristallisation gewonnen. Bevorzugte β-Lactamase-Substrate werden durch eine Reaktion von Desacetylcephalothin oder Desacetylcefotaxim mit 3-Aminoindolisocyanat oder 7-Isocyano- 4-methylcumann synthetisiert, um die jeweiligen Aminoindolcarbamate und AMC- Carbamate zu erzeugen. Diese Reaktionsschemata sind in Fig. 3 veranschaulicht. Cephalothinindoxylcarbonat-Substrate werden durch eine Umsetzung von Desacetylcephalothin mit Indoxyl-3-chlorcarbonat synthetisiert.
Mehrere Verfahren zur Herstellung von C-10-Desacetylcephamen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Synthesen sind im Stand der Technik bekannt. (JACS 107, 4766 (1985); Biochem J. 81, 591 (1961)) Vorzugsweise werden die C-10-Desacetylcephame durch eine Abänderung der von Mobashery und Johnston geoffenbarten Verfahren (Tet. Lett. 27 (29), 3333-3336 (1986)) synthetisiert. Kurz gesagt wird im Rahmen dieses Verfahrens das Acetylcepham in die Gegenwart von Acetylesterase gebracht und der pH geregelt, insbesondere zwischen pH 4,5 und 7,5, und dann nach einer gewissen Zeit, wenn sich der pH stabilisiert hat, die Enzym-Acetylcepham-Mischung bei 4ºC über Nacht gelagert.
Wenn X-Y eine austretende Gruppe ist, die eine Y-Komponente wie z. B. Aminoindol oder Indoxyl enthält, kann eine kolorimetrische Untersuchung auf β-Lactamase durchgeführt werden, indem die Erzeugung von Aminoindol oder Indoxyl aus der Spaltung von X-Y an Reaktionen mit zusätzlichen Reagenzien gekoppelt wird, um ein visuell detektierbares farbiges Produkt zu erzeugen. Die zusätzlichen Reagenzien können beispielsweise Diazoniumsalze, Oxidationsmittel oder Ladungsübertragungs- und freie Radikal-Initiatoren sein, wie z. B. Echtrot-TR-Salz, Echt-BB-Salz, Echtrotviolettsalz, molekularer Sauerstoff, Nitroblautetrazolium oder andere Echtrot- oder Echtblausalze oder andere Tetrazoliumverbindungen. Die Farbe des Produkts wird vom ausgewählten Reagens und seiner Konzentration abhängen. Vorzugsweise wird bei einer Hydrolyse des β-Lactam- Rings des chromogenen Substrats 3-Aminoindol, ein ausfällender Farbstoffmarker, freigesetzt, und die Reaktion wird an ein Diazonlumreagens oder Nitroblautetrazolium (NBT) gekoppelt. Die Farbe des Niederschlags hängt vom verwendeten Diazoniumsalz ab.
Die erfindungsgemäßen Substrate reagieren mit β-Lactamase in Gegenwart der Diazonium-Kopplungsreagenzien ohne wesentliche Inaktivierung des Enzyms, wenn die Konzentration des Diazoniumsalzes gleich oder unter etwa 1 mM ist. Vorzugsweise wird zur Durchführung der Untersuchung das β-Lactamase-Substrat in DMSO oder Methanol aufgelöst und in einem Phosphatpuffet mit pH 7,2 auf eine Konzentration von etwa 1-5 mM verdünnt. Die Kopplungsreagenzien werden in ähnlicher Weise aufgelöst. Abänderungen und Variationen solcher β-Lactamase-Untersuchungen bewegen sich innerhalb der gewöhnlichen Fähigkeiten auf diesem Gebiet und sind ebenfalls für eine Verwendung mit den hier geoffenbarten β-Lactamase-Substraten geeignet. Während solche chromogenen Untersuchungen in einer Lösung durchgeführt werden können, wird es bevorzugt, dass die Untersuchung auf einer Membran oder einem Filter wie z. B. Nitrocellulose, welche das chromogene Substrat enthalten, durchgeführt wird. Der Filter wird nach der Spaltung des Substrats mit β-Lactamase mit dem Diazoniumsalz behandelt. Die Membran erleichtert die Ablagerung des farbigen Niederschlags mit Blick auf das Sichtbarmachen. Solche Membranuntersuchungen weisen auch den Vorteil auf, für eine Verwendung bei einem Abheben von Bakterienkolonien zum Untersuchen der Anwesenheit von β-Lactamase adaptierbar zu sein.
Die farbigen Produkte, die durch in Gegenwart von gesättigten Diazoniumsalzlösungen oder von NBT in Wasser mit β-Lactamase umgesetzte Cefotaximaminoindolcarbamat-Substrate erzeugt werden, sind im Allgemeinen beispielsweise folgende:

Kopplungsreagenzien Produktfarbe

Echtrot-TR-Salz Rote Lösung
Echtblau-BB-Salz Blaue Lösung/Niederschlag
Echtrotviolett-LB-Salz Orange Lösung/Niederschlag
2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazonium-Cl Grüne Lösung/Niederschlag
Nitroblautetrazolium Dunkler Niederschlag
Ähnlich dazu, wenn X-Y Indoxyl enthält, dimerisiert freigesetztes Indoxyl und wird von molekularem Sauerstoff oxidiert, wodurch ein unlöslicher Indigofarbstoff erzeugt wird, der bei der Untersuchung sichtbar ist oder der mittels eines Spektrophotometers detektiert werden kann.
Wenn Y eine fluoreszierende Gruppe ist, ermöglichen es die Abspaltung von X-Y vom Substrat und seine weitere Spaltung in X + Y, dass Y in Gegenwart von Licht geeigneter Wellenlänge fluoresziert. Y kann ausgewählt werden, um bei jeder Wellenlänge zu fluoreszieren, die für eine spezielle Untersuchung geeignet ist; allerdings wird eine Y- Komponente bevorzugt, die bei 365/440 nm (z. B. eine Umbelliferon oder Aminomethylcumann enthaltende) oder 570/590 nm (z. B. eine Resorufin enthaltende) anregt/fluoresziert. Die Untersuchung auf β-Lactamase kann dann durch Anregen der fluoreszierenden Komponente und Detektieren der emittierten Fluoreszenz entweder manuell oder unter Verwendung eines automatisierten Systems durchgeführt werden. Vorzugsweise wird eine automatisierte Detektion verwendet, um das Lesen der Untersuchungsergebnisse und das Bewältigen von Mehrfach-Untersuchungen zu erleichtern.
Die hier dargelegten Zusammensetzungen und Verfahren stellen bestimmte Ausführungen der erfindungsgemäßen Prinzipien dar. Verständlicherweise kann die vorliegende Erfindung auf zahlreiche alternative Arten ausgeführt werden und können solche alternativen Ausführungen von den Fachleuten mit bloßem Routinekönnen und ohne vom Gedanken und Umfang der Erfindung abzugehen konzipiert werden. Konkrete Ausführungen zur Veranschaulichung werden in den folgenden Beispielen dargelegt, dürfen aber nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung gemäß Definition in den angeschlossenen Ansprüchen betrachtet werden.
Bei den folgenden Beispielen wurde teilweise von Orangenschalen gereinigte Acetylesterase (Essigsäurehydrolase) von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) in 2,5M Ammoniumsulfat, enthaltend 0,1M Natriumoxalat, geliefert. Die Lösung enthielt 10,3 Einheiten Acetylesterase pro mg und 25 Einheiten Pectinesterase pro mg Protein. Cephalothinnatriumsalz wurde von Sigma Chemical Co. geliefert. Cefotaximnatriumsalz wurde von CALBIOCHEM (La Jolla, CA) geliefert. 20%iges Phosgen in Toluol wurde von Fluka Chemical Corp (St. Louis, MO) geliefert. Benzol wurde von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) geliefert. Umkehrphasen-Silicagel wurde von J.T. Baker Inc. (Phillipsburg, NJ) geliefert. Nitrocefin wurde von Becton Dickinson Microbiology Systems (Cockeysville, MD) geliefert. Alle anderen Chemikalien und Reagenzien wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) geliefert. Handelsübliche Materialien und Reagenzien wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
Die IR-Spektrometrie wurde mit einem Perkin-Elmer 283B-Spektrometer, Perkin- Elmer Corp. (Norwalk, CT), durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit einem Thomas Hoover-Schmelzpunktbestimmungsapparat mit Kapillaren (Philadelphia, PA) erhalten und sind nicht korrigiert. Die NMR-Spektren wurden auf einem IBM-Bruker WP-2005Y (200 mHz) (Billerica, MA) erhalten. Die chemische Verschiebungen werden in ppm bezüglich Tetramethylsilan angegeben. Die Elementaranalysen wurden von Galbraith Laboratories Inc. (Knoxville, TN) durchgeführt. Die HPLC-Analyse wurde unter Verwendung eines Waters- HPLC-Systems bestimmt, das Dual-510-Pumpen, WISP 710B- oder U6K-Injektoren, einen Waters-990-MS-Photodiodenanaydetektor oder einen Modell 441-Absorbanzdetektor sowie ein Waters-860-Datensystem einsetzt. Eine Brownlee Spheir-5 RP-18-220 · 4,6 mm-Säule wurde verwendet. Das Lösungsmittelsystem war 60% Lösungsmittel A und 40% Lösungsmittel B, wobei isokratischer Fluss bei 0,5 ml/min verwendet wurde. Das Lösungsmittel A enthielt 95% Wasser, 5% Acetonitril und 0,2% Trifluoressigsäure. Das Lösungsmittel B enthielt 95% Acetonitril, 5% Wasser und 0,2% Trifluoressigsäure.

BEISPIEL 1

SYNTHESE VON REAGENZIEN

A. DESACETYLCEPHALOTHIN

Ein 125 ml-Erlenmeyerkolben, ausgestattet mit einem magnetischen Rührwerk, wurde mit 2,0 g (4,78 mmol) Cephalothinnatriumsalz befällt, und 75 ml Wasser wurden bei 37ºC in einem isothermen Wasserbad inkubiert. Der pH wurde mittels 0,2 N NaOH auf 6,6 eingestellt. Unter konstantem Rühren wurde Acetylesterase (1000 Einheiten) in 10 ml Wasser aufgelöst und in einer Portion der Cephalothinnatriumsalzlösung zugegeben. Der pH nahm sofort ab und wurde während des gesamten Reaktionsverlaufs unter Verwendung von 0,2 N NaOH zwischen 6,7 und 6,4 gehalten. Nach etwa 3 Stunden änderte sich der pH der Lösung viel langsamer. Die HPLC-Analyse zeigte an, dass lediglich eine kleine Menge Cephalothin zurückblieb. Das Reaktionsgemisch wurde bei 4ºC drei Tage lang gelagert, wobei die HPLC zu dieser Zeit ein Fehlen von Ausgangsmaterial anzeigte. Nach einer Lyophilisation wurde das Reinprodukt durch Umkehrphasen-Säulenchromatographie (Methanol/Wasser) isoliert.
Produktanalyse: NMR (d&sub6;DMSO) Carbonylkohlenstoffe: 169,8, 165,1, 163,0 ppm. Vinyl- und aromatische Kohlenstoffe: 137,2, 132,1, 126,5, 126,1, 124,6, 121,9 ppm. Alle anderen Kohlenstoffe: 61,8, 58,3, 56,8, 38,7, 26,4 ppm. HPLC-Retentionszeit: Desacetylcephalothin - 7,10 min. Cephalothin - 8,6 min. Umkehrphasen-TL(Dünnschicht)C 6 : 4 Methanol: Wasser; Rf Desacetylcephalothin - 0,914.

B. DESACETYLCEFOTAXIM

Das Desacetylcefotaxim wurde auf eine ähnliche Weise wie oben beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Reaktion nach 1,5 h abgeschlossen war. Nach der Lyophilisation wurde das Reinprodukt durch Umkehrphasen-Säulenchromatographie (Methanol/Wasser) erhalten.
Produktanalyse: NMR (d&sub6;DMSO) Carbonylkohlenstoffe: 170,0, 166,6, 163,3, 162,9 ppm. Aromatische und Vinyl-Kohlenstoffe: 149,8, 143,0, 131,8, 121,4, 109,9 ppm. Alle anderen Kohlenstoffe: 73,3, 62,8, 61,4, 61,0, 59,1 ppm. HPLC-Retentionszeit: Desacetylcefotaxim - 6,30 min. Cefotaxim - 7,30 min. Umkehrphasen-TLC-Lösungsmittel 6 : 4 Methanol : Wasser Rf = 0,933.

C. INDOL-3-HYDRAZID

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Kondensator mit Argonauslass, Zugabetrichter und Argoneinlass, wurde 2 h lang bei 132ºC ofengetrocknet und anschließend während einer Reinigung mit Argon wärmegetrocknet. Der Apparat wurde auf Raumtemperatur unter Argon abkühlen gelassen und anschließend mittels einer ofengetrockneten Spritze mit 500 ml Benzol befüllt, gefolgt von 3,0 g Indol-3-carbonsäure (18,6 mmol). Der Feststoff war bei Raumtemperatur unlöslich. 5,5 ml Thionylchlorid wurden langsam über den Zugabetrichter zugegeben (74, 4 mmol, 4,0 eq). Die resultierende Lösung wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt, zu welcher Zeit sich der gesamte Feststoff aufgelöst hatte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt, und 4,6 ml wasserfreies Hydrazin (148,8 mmol, 8 eq.) wurden zugegeben. Es bildete sich sofort ein Niederschlag, der filtriert und unter reduziertem Druck über Nacht getrocknet wurde. Das reine Hydrazid wurde durch Normalphasen-Säulenchromatographie erhalten; wobei ein Gemisch aus 9 : 1 Methylenchlorid : Methanol (77% Ausbeute) eingesetzt wurde.
Produktanalyse: NMR (d&sub6;DMSO) Carbonylkohlenstoff 165,1 ppm. Aromatische und Vinyl-Kohlenstoffe 135,9, 127,0, 126,1, 121,7, 120,8, 120,2, 111,7, 108,9 ppm. Elementaranalyse (C&sub9;H&sub9;N&sub3;O); berechnet: C 61,71, H 5,14, N 24,00. Gefunden: C 61,51, H 5,03, N 24,23. Normalphasen-TLC 95 : 5 Methylenchlorid : Methanol Rf = 0,45.

D. INDOL-3-AZID

Ein Rundkolben, ausgestattet mit einem magnetischen Rührwerk, wurde mit 400 mg Indol-3-hydrazid (2,3 mmol) und 50 ml einer 50%igen wässerigen Eisessig-Lösung befüllt. Nach einem 15-minütigen Rühren wurde die Lösung filtriert. Die Überschicht wurde in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt, und 0,5 g Natriumnitrat, aufgelöst in 1 ml Wasser, wurden zugesetzt. Es bildete sich sofort ein Niederschlag. Die Reaktion wurde 2 h lang gerührt, wobei die Temperatur wieder Umgebungstemperatur erreichen gelassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und der Niederschlag wurde mit kaltem Wasser (3 · 5 ml) und Methanol (3 · 5 ml) gewaschen. Das Produkt wurde unter reduziertem Druck über Nacht gelagert.
Produktanalyse: Rohausbeute 82%. NMR (d&sub6;DMSO) Carbonylkohlenstoff 167,1 ppm. Aromatische und Vinyl-Kohlenstoffe 138,2, 135,0, 125,3, 124,6, 123,4, 121,2, 113,8, 108,9 ppm. IR N&sub3; 2160, CO 1680, NH-Indolring 3250 cmi. Elementaranalyse (C&sub9;H&sub5;N4O) berechnet: C 58,06, H 3,22, N 30,10. Gefunden: C 58,19, H 3,04, N 30,17. Umkehrphasen- TLC 95 : 5 Methylenchlorid : Methanol Rf = 0,714.

E. INDOL-3-ISOCYANAT

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Zugabetrichter, einem Kondensator mit Argonauslass und einem Argoneinlass, wurde 2 h lang ofengetrocknet und anschließend während einer Reinigung mit Argon wärmegetrocknet und auf Umgebungstemperatur abgekühlt, während die Reinigung mit Argon fortgesetzt wurde. Der Apparat wurde mit 350 mg Indol-3-azid (1,9 mmol) und 40 ml wasserfreiem Toluol befüllt und unter Rückfluss erhitzt, bis die TLC-Analyse zeigte, dass das Indol-3-azid vollständig verbraucht war (etwa 3 h). Das Toluol wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei ein Feststoff resultierte.
Dieser Feststoff wurde unter reduziertem Druck über Nacht gelagert, um Spuren von Toluol zu entfernen. Das Produkt wurden mit bekannten Proben verglichen, und es wurden keine weiteren Versuche unternommen, das Produkt zu reinigen.
Produktanalyse: IR NCO 2300 cm&supmin;¹, NH-Indol 3400 cm&supmin;¹. Umkehrphasen-TLC 95 : 5 Methylenchlorid : Methanol Rf = 0,786. Schmelzpunkt 52-54ºC.

F. 7-ISOCYANO-4-METHYLCUMARIN

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Argoneinlass, einem Zugabetrichter mit Gummiseptum und einem an einem Natriumhydroxid-Wäscher angebrachten Trockeneiskondensator, wurde während einer 10-minütigen Reinigung mit Argon wärmegetrocknet und auf Umgebungstemperatur unter Argon abgekühlt. Der Apparat wurde mit 2,0 g 7-Amino-4-methylcumann (11, 4 mmol), 100 ml p-Dioxan mittels einer ofengetrockneten Spritze befüllt, gefolgt von 15 ml 20%igem Phosgen in Toluol (28,95 mmol). Das Gemisch wurde 2 h lang stark unter Rückfluss erhitzt, 15 ml 20%iges Phosgen in Toluol wurden zugesetzt, es wurde weitere 6 h unter Rückfluss erhitzt und auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Das Trockeneis wurde über Nacht unter einem Argon- Strom, der das überschüssige Phosgen aus dem System beseitigte, verdunsten gelassen. Das Toluol und das p-Dioxan wurden unter reduziertem Druck bei 40ºC entfernt, wobei sich ein gelber Feststoff ergab. Das Reinprodukt wurde durch Zugabe von 100 ml Chloroform und 15-minütiges Rühren zum Auflösen des Isocyanats erhalten. Es folgten eine Filtration (zur Entfernung von AMC HCl) und die Entfernung von Lösungsmittel unter reduziertem Druck. Der Feststoff wurde unter reduziertem Druck über Nacht gelagert.
Produktanalyse: IR NCO-Peak bei 2280 cm.

BEISPIEL 2

SYNTHESE VON CEPHALOTHINAMINOINDOLCARBAMAT

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Argoneinlass, einem Argonauslass und einem Gummiseptum, wurde über Nacht ofengetrocknet und dann 30 Minuten lang mit Argon gereinigt. Der Apparat wurde mit 1 g Desacetylcephalothin (2,66 mmol - hergestellt nach Beispiel 1A), aufgelöst in 20 ml DMF, gefolgt von 0,46 g Indol-3-isocyanat (3,19 mmol, 1,2 eq - hergestellt nach Beispiel 1E), aufgelöst in der Mindestmenge DMF, befüllt. Das resultierende Gemisch wurde bei 28ºC über Nacht gerührt. Das Reinprodukt wurde durch Kristallisation aus dem Reaktionsgemisch durch Zugabe von Ethylacetat erhalten.
Produktanalyse: NMR (d&sub6;DMSO) Carbonylkohlenstoffe 170,4, 170,0, 164,2, 163,0 ppm. Aromatische und Vinyl-Kohlenstoffe 138,6, 136,6, 135,1, 128,6, 127,0; 126,8, 125,4, 125,2, 122,0, 120,1, 1 18,6, 113,4, 111,8, 101,5 ppm. Alle anderen Kohlenstoffe 65,2, 58,5, 57,8, 45,8, 26,6 ppm. Elementaranalyse C&sub2;&sub3;H&sub2;ON&sub4;O&sub6;S&sub2; C 53,91, H 3,91, N 10,94. Gefunden C 53,85, H 4,07, N 10,79. Umkehrphasen-TLC-Lösungsmittel 6 : 4 Methanol : Wasser Rf = 0,575.

BEISPIEL 3

SYNTHESE VON CEFOTAXIM-AMC-CARBAMAT

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Argoneinlass, einem Argonauslass und einem Gummiseptum, wurde 2 h lang ofengetrocknet und dann 30 Minuten lang mit Argon gereinigt. Der Apparat wurde mit 500 mg Desacetylcefotaxim (1,15 mmol - hergestellt wie in Beispiel 1B), aufgelöst in 17 ml wasserfreiem Dimethylformamid, gefolgt von 462 mg 4-Methyl-7-isocyanocumann (2,30 mmol - hergestellt wie in Beispiel 1F), aufgelöst in 10 ml Dimethylformamid, befüllt. Die Reaktion wurde bei 30ºC 48 h lang gerührt, zu welcher Zeit die TLC anzeigte, dass das gesamte Ausgangsdesacetylcefotaxim vollständig reagiert hatte. Das Produkt wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Zugabe von etwa 50 ml 20% Aceton/80% Ethylacetat ausgefällt. Der Feststoff wurde durch Filtration unter Argon isoliert und mit 3 · 5 ml 20% Aceton/80% Ethylacetat gewaschen. Der Feststoff wurde unter reduziertem Druck über Nacht gelagert.
Produktanalyse: Elementaranalyse C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub2;N&sub6;O&sub9;S&sub2; : C 48,86, H 3,58, N 13,68. Gefunden C 50,01, H 3,48, N 13,62. Umkehrphasen-TLC 6 : 4 Methanol/Wasser Rf = 0,694. NMR (d&sub6;DMSO) 6 Carbonylkohlenstoffe 172,0, 171,0, 166,0, 164,2, 154,3; 13 aromatische oder Vinyl-Kohlenstoffe 154,6, 154,0, 138,7, 135,3, 126,6, 126,2, 126,1, 124,9, 114,0, 112,1, 109,3, 107,3, 98,1; 6 andere Kohlenstoffe 64,6, 58,7, 56,6, 36,7, 21,3, 17,3 ppm.

BEISPIEL 4

SYNTHESE VON CEPHALOTHIN-AMC-CARBAMAT

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Argoneinlass, einem Argonauslass und einem Gummiseptum, wurde 2 h lang ofengetrocknet und dann 30 Minuten lang mit Argon gereinigt. Dieser Apparat wurde mit 500 mg Desacetylcephalothin (1,33 mmol - hergestellt nach Beispiel 1A), aufgelöst in 17 ml wasserfreiem Dimethylformamid, gefolgt von 400 mg 4-Methyl-7-isocyanocumarin (1,99 mmol - hergestellt nach Beispiel 1F), aufgelöst in 10 ml Dimethylformamid, befällt. Die Reaktion wurde bei 30ºC 48 h lang gerührt, zu welcher Zeit die TLC anzeigte, dass das gesamte Ausgangsdesacetylcephalothin vollständig reagiert hatte. Das Produkt wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Zugabe von etwa 50 ml 20% Aceton/80% Ethylacetat ausgefällt. Der Feststoff wurde durch Filtration unter Argon isoliert und mit 3 · 5 ml 20% Aceton/80% Ethylacetat gewaschen. Der Feststoff wurde unter reduziertem Druck über Nacht gelagert.
Produktanalyse: Elementaranalyse C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub1;N&sub3;O&sub8;S&sub2; : C 54,05, H 3,78, N 7,57. Gefunden C 54,09, H 3,07, N 7,64. Umkehrphasen-TLC-Lösungsmittel 6 : 4 Methanol : Wasser Rf = 0,657. NMR (d&sub6;DMSO) 5 Carbonylkohlenstoffe 168,7, 165,7, 163,0, 162,3, 161,0 ppm; 14 aromatische Kohlenstoffe 148,3, 143,0, 127,0, I 18,7, 118,3, 117,7, 116,7, 114,7, 114,0, 111,3, 109,0, 108,5, 108,0, 98,3 ppm; 6 andere Kohlenstoffe 62,7, 62,0, 61,7, 58,0, 17,7 ppm.

BEISPIEL 5

SYNTHESE VON CEFOTAXIMINDOLCARBAMAT

Ein Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einem Argoneinlass, einem Argonauslass und einem Gummiseptum, wurde 2 h lang ofengetrocknet und dann 30 Minuten lang mit Argon gereinigt. Dieser Apparat wurde mit 500 mg Desacetylcefotaxim (1,15 mmol - hergestellt nach Beispiel 1B), aufgelöst in 17 ml wasserfreiem Dimethylformamid, gefolgt von 0,22 g Indol-3-isocyanat (1,3 eq., 1,49 mmol - hergestellt nach Beispiel 1E), aufgelöst in 10 ml Dimethylformamid, befüllt. Die Reaktion wurde bei 30ºC 48 h lang gerührt, zu welcher Zeit die TLC anzeigte, dass das gesamte Ausgangsdesacetylcefotaxim vollständig reagiert hatte. Das Produkt wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Zugabe von etwa 50 ml Ethylacetat ausgefällt. Der Feststoff wurde durch Filtration unter Argon isoliert und mit 3 · 5 ml kaltem Ethylacetat gewaschen. Der Feststoff wurde unter reduziertem Druck über Nacht gelagert.
Produktanalyse: NMR (d&sub6;DMSO) Carbonylkohlenstoffe 174,3, 169,8, 167,2, 164,2, 164,0 ppm. Aromatische und Vinyl-Kohlenstoffe 150,0, 143,3, 136,3, 131,6, 128,2, 125,0, 121,6, 120,8, 120,1, 119,0, 111,1, 110,0, 101,2 ppm. Alle anderen Kohlenstoffe 73,7, 64,0, 62,1, 61,9, 58,5 ppm. Elementaranalyse C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub1;N&sub7;O&sub7;S&sub2; : C 48, 34, H 3,68, N 17,16. Gefunden C 48,08, H 3,62, N 17,05. Umkehrphasen-TLC-Lösungsmittel 6 : 4 Methanol : Wasser Rt = 0,840.
Cephalothinindolcarbamat wurde unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens synthetisiert, wobei Desacetylcefotaxim durch Desacetylcephalothin ersetzt wurde.

BEISPIEL 6

KINETISCHE GESCHWINDIGKEITSBESTIMMUNGEN

Die fluorogenen β-Lactamase-Substrate der Erfindung wurden auf ihre Tauglichkeit hin getestet, von β-Lactamase unter Freisetzung der fluoreszierenden Komponente hydrolysiert zu werden. Die Hydrolysekinetik wurde mit der Hydrolysekinetik von Nitrocefin verglichen. Die zwei getesteten fluorogenen Substrate wurden unter Einsatz dreier mutierter β-Lactamasen hydrolysiert, die in Cepham-resistenten Bakterien gefunden wurden, um die Hydrolysegeschwindigkeit mit dem Wildtyp-Enzym, TEM-1, zu vergleichen (Ambler. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 289: 321 (1980); Sougakoff et al. Reviews of Infectious Diseases 10: 879 (1988)).
Die Nitrocefin-Kinetik wurde unter Einsatz eines Hewlett-Packard 854A- Spektrophotometers mit Chem Station-Programmierung, Hewlett-Packard Company Scientific Instruments Division (Palo Alto, CA), bestimmt. Die Daten wurden an eine nicht gewichtete Michaelis-Menten-Gleichung angepasst, und zwar unter Verwendung des nichtlinearen Datenregressionspakets ENZFITTER (Elsevier-BIOSOFT, Cambridge, Vereinigtes Königreich). Der für alle Verdünnungen verwendete Puffer war 9 : 1 (50 mM Phosphatpuffer pH 7,2 : DMSO), bezeichnet als Puffer A. Die Hydrolysegeschwindigkeit für Nitrocefin wurde in einem Bereich von 504-514 nm während 300 s bestimmt. Kontrolldurchgänge wurden durchgeführt und für jede angegebene Konzentration gemittelt. Eine Nitrocefin-Vorratslösung, die 10,1 mg, aufgelöst in 1 ml DMSO und mit Puffer A auf 15 ml verdünnt, enthielt, wurde für diese Durchgänge verwendet. Die Geschwindigkeiten wurden unter Verwendung von 1 - 0,004 ml Nitrocefinlösung bestimmt, die mit Puffer A auf insgesamt 1 ml verdünnt worden war. Versuche zur Geschwindigkeitsbestimmung wurden durchgeführt, indem 9 unterschiedliche Konzentrationen der Nitrocefinlösung und eine 1 : 25- Verdünnung jedes Enzyms in Puffer A verwendet wurden.
Die Fluoreszenz-Kinetik wurde auf einem Perkin-Elmer LS-5-Fluoreszenz- Spektrometer, Perkin-Elmer Corp. (Norwalk, CT), für eine Dauer von 300 s bestimmt. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden auf 365 und 440 nm, mit einem Spalt von 10 bzw. 3 nm, eingestellt. Der Puffer A wurde für sämtliche Verdünnungen eingesetzt. Kontrollen wurden für jede angegebene Geschwindigkeit durchgeführt. Die Geschwindigkeiten wurden unter Verwendung der folgenden Lösungen bestimmt: a) 10,8 mg Cephalothin-AMC-Carbamat, aufgelöst in 1 ml DMSO, verdünnt auf 15 ml mit Puffer A, und b) 11,9 mg Cefotaxim-AMC-Carbamat, aufgelöst in 1 ml DMSO, verdünnt auf 15 ml mit Puffer A. Für jeden Versuch wurde 0,1 ml Substratlösung mit Puffer A auf 3 ml verdünnt. Dieser wurden 0,03 ml enzymhaltiger Lösung zugesetzt (25 : 1-Verdünnung des Enzyms in Puffer A). Die Fluoreszenz wurde während 300 s gelesen. Die Geschwindigkeiten wurden für beide Substrate bei dieser Konzentration für alle getesteten Enzyme bestimmt.
Es zeigte sich, dass beide Produkte eine fluorometrische Antwort auf die Spaltung des β-Lactamrings mit β-Lactamase hin erzeugten. Die erhaltenen kinetischen Daten zeigten, dass das Cephalothin-AMC-Carbamat-Substrat vom Wildtyp und allen mutierten Enzymen schneller als das Cefotaxim-AMC-Carbamat gespalten wurde. Cephalothin-AMC-Carbamat wurde am schnellsten vom 237 (SER) -mutierten Enzym gespalten, dicht gefolgt vom Wildtyp-Enzym. Das 104 (LYS) -mutierte Enzym spaltete dieses Substrat mit etwa der halben Geschwindigkeit des 237 (SER) -Enzyms. Das 238 (SER) -mutierte Enzym spaltete das Substrat am langsamsten.
Das Cefotaxim-AMC-Carbamat-Substrat wurde am langsamsten von der Wildtyp-β- Lactamase gespalten. Im Vergleich dazu bewirkte das 237 (SER) -mutierte Enzym einen 60%igen Anstieg der Hydrolysegeschwindigkeit. Die 238 (SER) und 104 (LYS) -Mutationen bewirkten einen mehr als 100%igen Anstieg der Geschwindigkeit der Hydrolyse dieses Substrats.
Die Hydrolysegeschwindigkeiten für Nitrocefin mit jedem der β-Lactamase-Enzyme wurden auch erhalten. Durch den 237 (SER) -Mutanten wurde Nitrocefin am schnellsten hydrolysiert, gefolgt vom Wildtyp und dann den 104 (LYS) und 238 (SER) -Mutanten.

BEISPIEL 7

SPALTUNG VON CHROMOGENEN SUBSTRATEN

Die Spaltung des β-Lactamrings von Cefotaximindolcarbamat oder Cephalothinindolcarbamat erzeugt eine Kaskade an Elektronenwanderung, wodurch 3- Aminoindol freigesetzt wird. Die Zugabe verschiedener Diazoniumsalze zum Reaktionsgemisch nach der Spaltung mit β-Lactamase erzeugte einen farbigen Niederschlag.
Die β-Lactamase-Substrate wurden auf eine Nitrocellulosemembran absorbiert und dazu verwendet, die Anwesenheit des Enzyms zu detektieren. Eine Lösung des Enzyms wurde zugegeben, und nach einer kurzen Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine das Diazoniumsalz enthaltende Lösung zugesetzt. Einfarbiges Produkt wurde erzeugt, das auf der Membran ausgefällt wurde.
Dieses Filterversuchsformat kann für eine Verwendung beim Filterabhebversuch adaptiert werden, der im Stand der Technik zum Untersuchen von Bakterienkolonien auf die Anwesenheit von β-Lactamase hin bekannt ist. Bei einem solchen Versuch kann eine das erfindungsgemäße chromogene β-Lactamase-Substrat enthaltende Membran dazu verwendet werden, Bakterienkolonien zum Untersuchen abzuheben. Nach einer Inkubation auf der Membran zeigt die Zugabe einer Lösung eines Diazoniumsalzes mit darauf folgender Ausfällung eines farbigen Produkts auf der Membran die Anwesenheit von β-Lactamase in der Bakterienkolonie an.

Claims

1. Fluorogene oder chromogene Verbindung mit der folgenden Struktur

worin

X

ist;

Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

oder N-Methylindoxyl;

Z irgendeine der dieser Position im Cepham-Typ von β-Lactam-Antibiotika zugeordneten Komponenten ist; und

M Wasserstoff, ein Metallkation oder ein organisches Kation ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der in Anspruch 1 angegebenen Struktur, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Umsetzen eines Desacetylcepham-Antibiotikums mit dem Isocyanat oder Isothiocyanat von Y in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels; und

b) Gewinnen der Verbindung.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin ein Desacetylcepham-Antibiotikum, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desacetylcephalothin und Desacetylcefotaxim, mit dem Isocyanat von Y umgesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wohn ein Isocyanat von Y, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Indol-3-isocyanat und 7-Isocyano-4-methylcumarin, mit dem Desacetylcepham-Antibiotikum umgesetzt wird.

5. Verfahren zur Untersuchung der Anwesenheit von β-Lactamase in einer Probe, umfassend die Schritte des:

a) Kontaktierens der Probe mit einer fluorogenen Verbindung nach Anspruch 1 und

b) Bestimmens der Menge an erzeugter Fluoreszenz.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Probe mit einer fluorogenen Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cephalothinaminomethylcumarincarbamat und Cefotaximaminomethylcumarincarbamat, in Kontakt gebracht wird.

7. Verfahren zur Untersuchung der Anwesenheit von β-Lactamase in einer Probe, umfassend die Schritte des:

a) Kontaktierens der Probe mit einer chromogenen Verbindung nach Anspruch 1 und

b) Nachweisens der Produktion eines farbigen Produkts.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Probe mit einer chromogenen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cephalothinaminoindolcarbamat und Cefotaximaminoindolcarbamat, in Kontakt gebracht wird.

9. Vorrichtung zur Durchführung einer Untersuchung auf β-Lactamase, umfassend eine Membran mit einer daran absorbierten Verbindung nach Anspruch 1.

10. Verfahren zur Untersuchung auf β-Lactamase, umfassend:

a) das Abheben von Bakterienkolonien unter Verwendung einer Membran mit einer daran absorbierten chromogenen Verbindung nach Anspruch 1;

b) das Inkubieren der Bakterienkolonien auf der Membran;

c) das Hinzufügen einer Lösung eines Diazoniumsalzes zur Membran und

d) das Nachweisen der Ausfällung eines farbigen Produkts auf der Membran.