ES2338179T3 - Anticuerpos contra el peptido beta-amiloide. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena VH que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 26 y un dominio VL que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 32.

Description

Anticuerpos contra el péptido \beta-amiloide.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen al péptido \beta-amiloide y, en particular, al péptido \beta-amiloide humano. La presente invención también se refiere a procedimientos para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por una elevación de los niveles de \beta-amiloide o de los depósitos de \beta-amiloide, particularmente la enfermedad de Alzheimer, con dichos anticuerpos, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y a procedimientos para su fabricación. Otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras la descripción que se presenta más adelante.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común del deterioro cognitivo relacionado con la edad, que afecta a más de 12 millones de individuos en todo el mundo (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Supl. 1055-1057). Las primeras fases de la enfermedad se caracterizan por una pérdida progresiva de memoria con un deterioro cognitivo asociado y déficits del lenguaje y del comportamiento. En las últimas fases de la enfermedad, los pacientes desarrollan amnesia global y tienen la función motora muy reducida. La muerte se produce típicamente 9 años después del diagnóstico y a menudo está asociada con otras afecciones, típicamente neumonía (Davis K.L. y Samules S.C. (1998) en Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S. J. y Coyle J. T. (McGraw-Hill, Nueva York, páginas 267-316)). Las terapias actuales representan estrategias sintomáticas que se centran en el alivio del deterioro cognitivo y en la mejora de los síntomas conductuales asociados con la etiología de la enfermedad en progreso. En la práctica, estos tratamientos sólo proporcionan un efecto beneficioso sobre la cognición de corta duración, notificándose una duración del nivel de deterioro cognitivo conseguido de tan sólo hasta 2 años. El potencial de una terapia para modificar la enfermedad que ralentice y posiblemente detenga la progresión de la enfermedad es enorme. Tales estrategias proporcionarían mejoras radicales y sostenidas en la calidad de vida de los pacientes y en sus cuidadores, lo cual es muy importante, además de reducir los enormes costes sanitarios globales de esta enfermedad.

El diagnóstico clínico de la enfermedad de Alzheimer se basa en una combinación de ensayos físicos y mentales que conducen al diagnóstico de una enfermedad de Alzheimer posible o probable. Después de la muerte, la enfermedad se confirma por signos neurológicos bien caracterizados en el cerebro, que incluyen la deposición de A\beta en placas parenquimatosas y vasos cerebrales, la formación intraneuronal de ovillos neurofibrilares, pérdida sináptica y pérdida de subpoblaciones neuronales en regiones específicas del cerebro (Terry, RD (1991) J Neural Trans Supl. 53: 141-145).

Una gran cantidad de pruebas genéticas, histológicas y funcionales sugieren que el péptido \beta-amiloide (A\beta) es clave en la progresión de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766).

Se sabe que A\beta se produce por medio de la escisión de la proteína precursora de beta amiloide (también conocida como APP) por una enzima aspartil proteasa conocida como BACE1 (también conocida como \beta-secretasa, Asp2 o Memapsina-2) (De Strooper, B. y Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). Se ha postulado que además de la deposición parenquimática y vascular, ciertas formas oligoméricas solubles de A\beta contribuyen a la aparición de EA y pueden afectar a la función neuronal inicialmente perjudicando a la función sináptica (Lambert y col. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, EE.UU. 95: 6448-6453). Aunque se encuentran placas amiloides insolubles en las primeras fases de EA y de MCI, en estos individuos también están aumentados los niveles de agregados de A\beta soluble (que reciben el nombre de oligómeros o ligandos difundibles derivados de A\beta (ADDL) y los niveles de A\beta soluble se correlacionan mejor con la degeneración neurofibrilar y la pérdida de marcadores sinápticos que las placas de amiloide (Naslund y col. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19). El A\beta42 altamente amiloidogénico y las formas truncadas en el extremo amino A\betax-42 son las especies predominantes de A\beta encontradas tanto en placas difusas como en placas seniles (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270: 7013-7016). Los niveles relativos de A\beta42 parecen ser el regulador clave de la agregación de A\beta en placas amiloides, de hecho se ha demostrado que A\beta42 forma agregados más rápidamente que otras formas de A\beta in vitro (Jarrett, JT (1993) Biochemistry. 32: 4693-4697) y A\beta42 como tal se ha implicado como molécula iniciadora en la patogénesis de la EA (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (París). 92: 289-292). Aunque A\beta42 es un producto minoritario del metabolismo de APP, los pequeños cambios en su producción están asociados con grandes efectos sobre la deposición de A\beta, por lo tanto se ha postulado que la reducción de A\beta42 solo puede ser una forma eficaz de tratar la EA (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (París). 92: 289-292). Confirmando esta teoría, se ha informado que ciertas mutaciones en los genes de la proteína precursora de amiloide (APP) y de la presenilina aumentan predominantemente los niveles relativos de A\beta42 y, por lo tanto, acortan el tiempo hasta la aparición de la enfermedad de Alzheimer (EA) (Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3: 67-99). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la velocidad de deposición también depende del catabolismo y eliminación de A\beta.

Se han generado modelos animales de la deposición de amiloides por sobreexpresión de transgenes humanos mutantes en ratones. Los ratones que sobreexpresan transgenes de APP humanos individuales típicamente desarrollan depósitos de \beta-amiloide del tipo de placas cerebrales desde los 12 meses de edad (Games D. y col., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. y col., (1996) Science 274: 99-102)), mientras que los ratones que llevan transgenes tanto de APP humana mutante como de presenilina-1 (PS-1) típicamente desarrollan depósitos de \beta-amiloide del tipo de placas cerebrales tan pronto como a los 2 meses de edad (Kurt M.A. y col., (2001) Exp. Neurol. 171: 59-71; McGowan E. y col., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244).

Se ha hecho cada vez más evidente que el transporte de A\beta exógeno entre el sistema nervioso central (SNC) y el plasma juega un papel en la regulación de los niveles de amiloide cerebrales (Shibata, y col. (2000) J Clin Invest 106: 1489-1499), transportándose el A\beta del LCR rápidamente desde el LCR hasta el plasma. Por lo tanto, tras la vacunación activa con péptidos A\beta o la administración pasiva de anticuerpos específicos contra A\beta, los anticuerpos se unen rápidamente al A\beta periférico alterando el equilibrio dinámico entre el plasma, el LCR y finalmente el SNC. De hecho, ahora hay una gran cantidad de estudios que han demostrado que estas dos estrategias pueden reducir los niveles de A\beta, reducir la patología producida por A\beta y proporcionar beneficios cognitivos en diversos modelos transgénicos de amiloidosis. También se han realizado estudios limitados en especies superiores. Se inmunizaron monos verdes caribeños (de 16-10 años de edad) con péptido A\beta durante 10 meses. Los niveles de A\beta40 se elevaron 2-5 veces en el plasma, alcanzando un máximo en 251 días, mientras que los niveles en el LCR de A\beta40 y A\beta42 se redujeron significativamente en 100 días y volvieron al nivel inicial a partir de entonces. Esta reducción en el LCR estuvo acompañada de una reducción significativa en la carga de placas (Lemere, CA (2004) Am J Pathology 165: 283-297). También se detectaron aumentos similares en los niveles plasmáticos de A\beta después de la inmunización de monos Rhesus de edad avanzada (de 15-20 años de edad) (Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18: 44:46).

La primera terapia inmune dirigida a los amiloides cerebrales fue AN-1792 de Elan/Wyeth, una vacuna activa. Este tratamiento se terminó después del desarrollo de signos clínicos coherentes con una meningoencefalitis. Los análisis de subgrupos sugirieron que el tratamiento ralentizaba el deterioro de la función cognitiva (Nature Clin Pract Neurol (2005) 1: 84-85). El análisis post-mortem de los pacientes también mostró pruebas de eliminación de placas (Gilman S. y col., (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562). Se ha demostrado que Bapineuzumab (AAB-001, Elan/Wyeth), una terapia pasiva de MAb, mejora significativamente las puntuaciones de cognición en un pequeño estudio de seguridad de fase I.

Otras enfermedades o trastornos caracterizados por una elevación de los niveles de \beta-amiloide o los depósitos de \beta-amiloide incluyen el deterioro cognitivo leve (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging "Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer's disease: Prediction by plasma amyloid beta 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine" en prensa, e-publicado el 19 de octubre de 2006), la hemorragia cerebral hereditaria con \beta-amiloidosis de tipo Dutch, la angiopatía \beta-amiloide cerebral y diversos tipos de demencias degenerativas tales como las asociadas con la enfermedad de Parkinson, la parálisis supranuclear progresiva, la degeneración basal cortical y la enfermedad de Alzheimer del tipo cuerpos de Lewy difusos (Mollenhauer B (2007) J Neural Transm e-publicado el 23 de febrero de 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5: 655-60) y síndrome de Down (Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254: 22-7).

Sumario de la invención

En una realización de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena V_{H} que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 26, 28 ó 30 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 32.

En otra realización de la invención de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico, anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 34, 36 ó 38 y una cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 40.

En otra realización de la invención de la invención se proporciona una composición farmacéutica.

En otra realización de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la invención.

También se proporciona un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con el péptido \beta-amiloide.

En otra realización de la invención, se proporciona un procedimiento para la fabricación de un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho procedimiento expresar un polinucleótido que codifica el anticuerpo en una célula huésped.

En otra realización de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo terapéutico que comprende una cadena V_{H} que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 26, 28 ó 30.

En otra realización de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo terapéutico que comprende un dominio V_{L} que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 32.

En otra realización de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica a una cadena pesada de anticuerpo terapéutico que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº:34, 36 ó 38.

En otra realización de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo terapéutico que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 40.

En una realización más particular de la invención se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo terapéutico, comprendiendo dicho polinucleótido la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 35, 37, 39 ó 42.

En otra realización más particular de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo terapéutico, comprendiendo dicho polinucleótido la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 41 ó 43.

En una realización particular, el anticuerpo terapéutico que es un anticuerpo o fragmento y/o derivado del mismo esencialmente carece de las funciones de a) activación del complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.

En otra realización de la invención, se proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un dominio V_{H} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 17 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 19.

En otra realización de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un dominio V_{H} que tiene la secuencia SEC ID Nº: 17, en particular el polinucleótido de la SEC ID Nº: 18.

En otra realización de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende un dominio V_{L} que tiene la secuencia SEC ID Nº: 19, en particular el polinucleótido de la SEC ID Nº: 20.

Las realizaciones preferidas de la invención se describen más adelante o se definen en las sub-reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención 1. Estructuras de Anticuerpo 1.1 Anticuerpos Intactos

Los anticuerpos intactos normalmente son glicoproteínas heteromultiméricas que comprenden al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Aparte de IgM, los anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 KDa, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina varía. Cada cadena pesada y ligera también tiene enlaces disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de varias regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V_{L}) y una región constante en su otro extremo; la región constante de la cadena ligera está alineada con la primera región constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpos de la mayoría de las especies de vertebrados pueden asignarse a uno de dos tipos denominados Kappa y Lambda basándose en la secuencia de aminoácidos de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos humanos pueden asignarse a cinco clases diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA pueden subdividirse adicionalmente en las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgA1 e IgA2. Existen variantes de especie, teniendo el ratón y la rata al menos IgG2a, IgG2b. El dominio variable del anticuerpo confiere especificidad de unión al anticuerpo, representando ciertas regiones una variabilidad particular y denominándose regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las partes más conservadas de la región variable se denominan regiones flanqueantes (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera intactas comprende cuatro FR conectadas por tres CDR. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas por las regiones FR y con las CDR de la otra cadena contribuyen a la formación de los sitios de unión a antígeno de los anticuerpos. Las regiones constantes no están implicadas directamente en la unión del anticuerpo al antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras tales como la participación en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis a través de la unión al receptor Fc\gamma, la semivida/velocidad de eliminación a través del receptor neonatal de Fc (FcRn) y la citotoxicidad dependiente del complemento a través del componente C1q de la cascada del complemento. La región constante de IgG2 humana carece de la capacidad de activar el complemento por la ruta clásica o de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La región constante de IgG4 carece de la capacidad de activar el complemento por la ruta clásica y media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos sólo débilmente. Los anticuerpos que carecen esencialmente de estas funciones efectoras pueden denominarse anticuerpos "no líticos".

1.1.1 Anticuerpos humanos

Los anticuerpos humanos pueden producirse por varios procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos humanos pueden obtenerse por el procedimiento de hibridoma usando líneas celulares de mieloma humano o heteromieloma de ratón-humano, véase Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) y Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Los procedimientos alternativos incluyen el uso de bibliotecas de fagos o ratones transgénicos utilizando en ambos casos repertorios de regiones V humanas (véase Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12,433- 455, Green LL (1999), J. Immunol. methods 231, 11-23).

Actualmente se dispone de varias cepas de ratones transgénicos donde sus loci de inmunoglobulina de ratón se han reemplazado con segmentos de genes de inmunoglobulina humana (véase Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). Tras la exposición a antígenos, estos ratones pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos a partir de los cuales pueden seleccionarse los anticuerpos de interés.

Debe indicarse particularmente el sistema Trimera^{TM} (véase Eren R y col., (1998) Immunology 93: 154-161) en el que se trasplantan linfocitos humanos en ratones sometidos a radiación, el Sistema de Anticuerpos de Linfocitos Seleccionados (SLAM, véase Babcook y col., PNAS (1996) 93: 7843-7848) en el que se pasan eficazmente linfocitos humanos (o de otras especies) a través de un procedimiento de generación masiva de anticuerpos reunidos in vitro seguido de un procedimiento simplificado de dilución limitante y selección y el Xenomouse II^{TM} (Abgenix Inc). En Morphotek Inc está disponible una estrategia alternativa que usa la tecnología Morphodoma^{TM}.

La tecnología de presentación de fagos puede usarse para producir anticuerpos humanos (y fragmentos de los mismos), véase McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) y Griffiths EA y col. (1994) EMBO 13: 3245-3260. De acuerdo con esta técnica, se clonan genes del dominio V de anticuerpos en fase en un gen de la proteína principal o minoritaria de la cubierta de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd y se presentan (normalmente con la ayuda de un fago auxiliar) como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo tienen como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. La técnica de presentación en fagos puede usarse para seleccionar anticuerpos con especificidad de antígeno a partir de bibliotecas realizadas a partir de células B humanas tomadas de individuos que padecen una enfermedad o trastorno descrito anteriormente o, como alternativa, a partir de donantes humanos no inmunizados (véase Marks; J. Mol. Bio. 222,581- 597, 1991). Cuando se desea un anticuerpo humano intacto que comprende un dominio Fc, es necesario volver a clonar el fragmento derivado presentado en el fago en un vector de expresión de mamífero que comprende las regiones constantes deseadas y establecer líneas celulares de expresión estable.

Puede usarse la técnica de maduración por afinidad (Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)) para mejorar la afinidad de unión, donde la afinidad del anticuerpo humano primario se mejora reemplazando secuencialmente las regiones V de cadena H y L por variantes de origen natural y seleccionando basándose en las afinidades de unión mejoradas. Ahora también se dispone de variantes de esta técnica tales como "impronta de epítope", véase el documento WO 93/06213. Véase también Waterhouse; Nucl. Acids Res 21, 2265-2266 (1993).

1.2 Anticuerpos Quiméricos y Humanizados

El uso de anticuerpos no humanos intactos en el tratamiento de enfermedades o trastornos humanos lleva asociados los nuevos problemas bien establecidos de inmunogenicidad potencial, especialmente tras la administración repetida del anticuerpo, es decir, el sistema inmune del paciente puede reconocer el anticuerpo intacto no humano como extraño y crear una respuesta neutralizadora. Además de desarrollar anticuerpos totalmente humanos (véase anteriormente), se han desarrollado varias técnicas a lo largo de los años para solucionar estos problemas y generalmente implican la reducción de la composición de secuencias de aminoácidos no humanas en el anticuerpo terapéutico intacto mientras se mantiene la facilidad relativa para obtener anticuerpos no humanos a partir de un animal inmunizado por ejemplo, un ratón, rata o conejo. En general, se han usado dos estrategias para conseguir esto. La primera son anticuerpos quiméricos, que generalmente comprenden un dominio variable no humano (por ejemplo, de roedor, tal como ratón) fusionado a una región constante humana. Como el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo está localizado dentro de las regiones variables, el anticuerpo quimérico mantiene su afinidad de unión por el antígeno, pero adquiere las funciones efectoras de la región constante humana y, por lo tanto, puede realizar funciones efectoras tales como las descritas anteriormente. Los anticuerpos quiméricos típicamente se producen usando procedimientos de ADN recombinante. Se aísla el ADN que codifica los anticuerpos (por ejemplo, ADNc) y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican las regiones variables de cadena H y L del anticuerpo de la invención, por ejemplo, ADN de las SEC ID Nº 18 y 20 descritas anteriormente). Las células de hibridoma sirven como fuente típica de este ADN. Una vez aislado, el ADN se pone en vectores de expresión que después se utilizan para transfectar células huésped tales como E. coli, células COS, células CHO, células PerC6 o células de mieloma que no producen de otra forma inmunoglobulinas, para obtener la síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse sustituyendo las regiones constantes H y L no humanas (murinas) por la secuencia codificante de las cadenas L y H humanas correspondientes, véase, por ejemplo, Morrison; PNAS 81, 6851 (1984). De esta manera, en otra realización de la invención, se proporciona un anticuerpo quimérico que comprende un dominio V_{H} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 17 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 19 fusionados a una región constante humana (que puede ser de isotipo IgG, por ejemplo, IgG1).

La segunda estrategia implica la generación de anticuerpos humanizados en los que el contenido no humano del anticuerpo se ha reducido humanizando las regiones variables. Han conseguido popularidad dos técnicas para la humanización. La primera es la humanización por injerto de CDR. Las CDR forman bucles próximos al extremo N del anticuerpo, donde forman una superficie montada en un soporte proporcionado por las regiones flanqueantes. La especificidad de unión a antígeno del anticuerpo se define principalmente por la topografía y por las características químicas de su superficie de CDR. Estas características a su vez se determinan por la conformación de las CDR individuales, por la disposición relativa de las CDR y por la naturaleza y disposición de las cadenas laterales de los restos que comprenden las CDR. Puede conseguirse una gran disminución de la inmunogenicidad injertando sólo las CDR de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) (anticuerpos "donadores") en regiones flanqueantes ("región flanqueante aceptora") y contantes humanas adecuadas (véase Jones y col. (1986) Nature 321,522-525 y Verhoeyen M y col. (1988) Science 239, 1534-1536). Sin embargo, el injerto de CDR per se puede no producir la retención completa de las propiedades de unión al antígeno y a menudo se observa que es necesario conservar algunos restos flanqueantes del anticuerpo donador (lo cual recibe el nombre en algunas ocasiones de "retromutaciones") en la molécula humanizada si se desea recuperar una afinidad de unión al antígeno significativa (véase Queen C y col. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M y col. (1991) Nature 351, 501-502). En este caso, las regiones V humanas que muestran la mayor homología de secuencia (típicamente del 60% o superior) con el anticuerpo donador no humano pueden elegirse de una base de datos para proporcionar la región flanqueante (FR) humana. La selección de FR humanas puede realizarse a partir de anticuerpos humanos individuales o anticuerpos consenso humanos. Cuando sea necesario, en la región flanqueante aceptora humana se ponen como sustituyentes los restos clave del anticuerpo donador para conservar las conformaciones de CDR. Puede usarse la creación de modelos del anticuerpo por ordenador para ayudar a identificar estos restos estructuralmente importantes, véase el documento WO99/48523.

Como alternativa, la humanización puede conseguirse por un procedimiento de "modificación superficial" ("veneering"). Un análisis estadístico de regiones variables características de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana y murina reveló que los patrones precisos de restos expuestos son diferentes en los anticuerpos humanos y murinos, y la mayoría de las posiciones superficiales individuales tienen una fuerte preferencia por un pequeño número de restos diferentes (véase Padlan E.A. y col.; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 y Pedersen J.T. y col. (1994) J. Mol., 235; 959-973). Por lo tanto, es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano reemplazando restos expuestos en sus regiones flanqueantes que difieren de los que se encuentran normalmente en los anticuerpos humanos. Como la antigenicidad de las proteínas puede correlacionarse con la accesibilidad de la superficie, el reemplazo de restos de la superficie puede ser suficiente para hacer que la región variable de ratón sea "invisible" al sistema inmune humano (véase también Mark G.E. y col. (1994) en Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, páginas 105-134). Este procedimiento de humanización se denomina "modificación superficial" porque sólo se altera la superficie del anticuerpo, los restos de soporte permanecen sin cambios. Otras estrategias alternativas incluyen la indicada en el documento W004/006955 y el procedimiento de Humaneering^{TM} (Kalobios) que hace uso de sistemas de expresión bacterianos y produce anticuerpos próximos a la línea germinal humana en secuencia (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics enero de 2007, San Diego, California).

Los expertos en la materia apreciarán que el término "derivado" pretende definir no sólo la fuente en el sentido de ser el origen físico del material, sino también definir un material que es estructuralmente idéntico al material pero que no procede de la fuente de referencia. De esta manera, los "restos encontrados en el anticuerpo donador" no necesitan haberse purificado obligatoriamente a partir del anticuerpo donador.

En la técnica está bien reconocido que ciertas sustituciones de aminoácidos se consideran "conservativas". Los aminoácidos se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral y las sustituciones dentro de grupos que mantienen toda o sustancialmente toda la afinidad de unión del anticuerpo terapéutico de la invención se consideran sustituciones conservativas, véase la siguiente Tabla 1:

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TABLA 1

1

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1.3 Anticuerpos biespecíficos

Un anticuerpo biespecífico es un derivado de anticuerpo que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopes diferentes y también forma parte de la invención. Los procedimientos de fabricación de estos anticuerpos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena H-cadena L de inmunoglobulina, donde las dos cadenas H tienen diferentes especificidades de unión, véase Millstein y col., Nature 305 537-539 (1983), el documento W093/08829 y Traunecker y col. EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas H y L, se produce una mezcla potencial de diez estructuras de anticuerpo diferentes de las cuales sólo una tiene la especificidad de unión deseada. Una estrategia alternativa implica la fusión de los dominios variables con las especificidades de unión deseadas para la región constante de cadena pesada que comprende al menos parte de la región de bisagra, y las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la región CH1 que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. El ADN que codifica estas fusiones, y si se desea la cadena L, se insertan en vectores de expresión distintos y después de utilizan para cotransfectar un organismo huésped adecuado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas en un vector de expresión. En una estrategia preferida, el anticuerpo biespecífico se compone de una cadena H con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadenas H-L, que proporcionan una segunda especificidad de unión en el otro brazo, véase el documento W094/04690. Véase también Suresh y col. Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

La administración de proteínas terapéuticas en el cerebro se ha visto obstaculizada por la presencia de la barrea hematoencefálica (BBB). Cuando se desea administrar un anticuerpo de la invención o un fragmento de anticuerpo de la invención a través de la BBB, se han propuesto varias estrategias para mejorar dicha administración en caso necesario.

Para obtener los nutrientes y factores necesarios a partir de la sangre, la BBB posee algunos receptores específicos que transportan compuestos desde la sangre circulante al cerebro. Ciertos estudios han indicado que algunos compuestos tales como la insulina (véase Duffy K. R. y col. (1989) Brain Res. 420:32-38), la transferrina (véase Fishman J. B. y col. (1987) J. Neurosci 18:299-304) y los factores de crecimiento semejantes a la insulina 1 y 2 (véase Pardridge WM (1986) Endocrine Rev.7: 314-330 y Duffy K. R. y col. (1986) Metabolism 37:136-140) atraviesan la BBB por medio de transcitosis mediada por receptor. De esta manera, los receptores para estas moléculas proporcionan un medio potencial para que los anticuerpos de la invención accedan al cerebro usando los denominados anticuerpos "vectorizados" (véase Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36: 299-321). Por ejemplo, se ha demostrado que un anticuerpo contra el receptor de transferrina se transporta dinámicamente al parénquima cerebral (véase Friden PM y col. (1991) PNAS 88: 4771-4775 y Friden PM y col. (1993) Science 259: 373-377). De esta manera, una estrategia potencial es producir un anticuerpo específico o un fragmento biespecífico tal como se ha descrito anteriormente, donde una primera especificidad es hacia y una segunda especificidad es hacia un receptor de transporte localizado en la BBB, por ejemplo, una segunda especificidad hacia el receptor de transporte de transferrina.

1.4 Fragmentos de Anticuerpo

En ciertas realizaciones de la invención, se proporciona un anticuerpo terapéutico que es un fragmento de unión a antígeno. Tales fragmentos pueden ser fragmentos de unión a antígeno funcionales de anticuerpos intactos y/o humanizados y/o quiméricos tales como fragmentos Fab, Fd, Fab', F(ab')_{2}, Fv, ScFv de los anticuerpos descritos anteriormente. Los fragmentos que carecen de la región constante carecen de la capacidad de activar el complemento por la ruta clásica o mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Tradicionalmente, tales fragmentos se producen por la digestión proteolítica de anticuerpos intactos, por ejemplo, por digestión con papaína (véase, por ejemplo, el documento WO 94/29348) pero pueden producirse directamente a partir de células huésped transformadas de manera recombinante. Para la producción de ScFv, véase Bird y col.; (1988) Science, 242, 423-426. Además, pueden producirse fragmentos de anticuerpo usando una diversidad de técnicas de ingeniería genética como las descritas más adelante.

Los fragmentos Fv parecen tener menos energía de interacción de sus dos cadenas que los fragmentos Fab. Para establecer la asociación de los dominios V_{H} y V_{L}, se han asociado con péptidos (Bird y col., (1988) Science 242, 423-426, Huston y col., PNAS, 85, 5879-5883), puntes disulfuro (Glockshuber y col., (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) y mutaciones de acoplamiento ("knob in hole") (Zhu y col. (1997), Protein Sci., 6, 781-788). Los fragmentos ScFv pueden producirse por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, véase Whitlow y col. (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 y Huston y col. (1993) Int. Rev. Immunol 10, 195-217. Los fragmentos ScFv pueden producirse en células bacterianas tales como E. coli, pero más típicamente se producen en células eucariotas. Un inconveniente de ScFv es la monovalencia del producto, que impide el aumento de avidez debido a la unión polivalente, y su corta semivida. Los intentos de solucionar estos problemas incluyen (ScFv')_{2} bivalente producido a partir de ScFV que contiene una cisteína C-terminal adicional por acoplamiento químico (Adams y col. (1993) Can. Res 53, 4026-4034 y McCartney y col. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) o por dimerización espontánea con especificidad de sitio de ScFv que contiene un resto de cisteína C-terminal no emparejado (véase Kipriyanov y col. (1995) Cell. Biophys 26, 187-204). Como alternativa, puede forzarse a ScFv a formar multímeros por acortamiento del engarce peptídico a una longitud comprendida entre 3 y 12 restos para formar "diacuerpos", véase Holliger y col. PNAS (1993), 90, 6444-6448. La reducción del engarce adicionalmente puede producir trímeros de ScFV ("triacuerpos", véase Kortt y col. (1997) Protein Eng, 10, 423-433) y tetrámetros ("tetracuerpos", véase Le Gall y col. (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). La construcción de moléculas de ScFV bivalentes también puede conseguirse por fusión genética con motivos de dimerización de proteínas para formar "minianticuerpos" (véase Pack y col. (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) y "minicuerpos" (véase Hu y col. (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061). También pueden producirse tándems ScFv-Sc-Fv ((ScFV)_{2}) uniendo dos unidades de ScFv por un tercer engarce peptídico, véase Kurucz y col. (1995) J. Immol. 154, 4576-4582. Los diacuerpos biespecíficos pueden producirse por medio de la asociación no covalente de dos productos de fusión de hélice única constituidos por un dominio V_{H} de un anticuerpo conectado por un engarce corto al dominio V_{L} de otro anticuerpo, véase Kipriyanov y col. (1998), Int. J. Can 77,763-772. La estabilidad de tales diacuerpos biespecíficos puede mejorarse por medio de la introducción de puentes disulfuro o mutaciones de acoplamiento ("knob in hole") como se ha descrito anteriormente o por la formación de diacuerpos de hélice única (ScDb) donde dos fragmentos de ScFv híbridos se conectan a través de un engarce peptídico, véase Kontermann y col. (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188. Se dispone de moléculas tetravalentes biespecíficas, por ejemplo, fusionando un fragmento ScFv al dominio CH3 de una molécula de IgG o a un fragmento Fab a través de la región de bisagra, véase Coloma y col. (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163. Como alternativa, se han creado moléculas tetravalentes biespecíficas por la fusión de diacuerpos de hélice única biespecíficos (véase Alt y col., (1999) FEBS Lett 454, 90-94). También pueden formarse moléculas biespecíficas tetravalentes por la dimerización de tándems ScFv-ScFv con un engarce que contiene un motivo de hélice-bucle-hélice (minianticuerpos DiBi, véase Muller y col. (1998) FEBS Lett 432, 45-49) o una molécula de hélice única que comprende cuatro dominios variables de anticuerpo (V_{H} y V_{L}) en una orientación que evita el emparejamiento intramolecular (diacuerpo en tándem, véase Kipriyanov y col., (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56). Los fragmentos F(ab')2 biespecíficos pueden crearse por acoplamiento químico de fragmentos Fab' o por heterodimerización a través de cremalleras de leucina (véase Shalaby y col., (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 y Kostelny y col. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553). También se dispone de dominios aislados de V_{H} y V_{L}, véanse los documentos US 6.248.516; US 6.291.158; y US 6.172.197.

1.5 Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados son derivados que también constituyen una realización de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente formados usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Véase el documento US 4.676.980.

1.6 Otras Modificaciones

Se cree que la interacción entre la región Fc de un anticuerpo y diversos receptores de Fc (Fc\gammaR) media las funciones efectoras del anticuerpo, que incluyen la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fijación del complemento, la fagocitosis y la semivida/eliminación del anticuerpo. Pueden realizarse diversas modificaciones en la región Fc de los anticuerpos de la invención dependiendo de la función efectora deseada. En particular, las regiones constantes humanas que carecen esencialmente de las funciones de a) activación del complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, incluyen la región constante de IgG4, la región constante de IgG2 y regiones constantes de IgG1 que contienen mutaciones específicas tales como, por ejemplo, mutaciones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y/o 322 descritas en los documentos EP0307434 (W08807089), EP 0629 240 (W09317105) y WO 2004/014953. Se han descrito por separado mutaciones en los restos 235 ó 237 dentro del dominio CH2 de la región constante de cadena pesada (numeración de Kabat; sistema EU Index) para reducir la unión a Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII y, por lo tanto, reducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Duncan y col. Nature 1988, 332; 563-564; Lund y col. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel y col. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton y Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan y col., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh y col., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Además, algunos informes también han descrito la implicación de algunos de estos restos en el reclutamiento o mediación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Morgan y col., 1995; Xu y col., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh y col., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Por lo tanto, los restos 235 y 237 se han mutado a restos de alanina (Brett y col. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew y col. Immunology 1995, 85; 41-48; y documento W09958679) para reducir tanto los efectos mediados por el complemento como los efectos mediados por Fc\gammaR. Los anticuerpos que comprenden estas regiones constantes pueden denominarse anticuerpos "no líticos".

Se puede incorporar un epítope de unión al receptor de recuperación en el anticuerpo para aumentar la semivida en suero, véase el documento US 5.739.277.

Actualmente hay cinco receptores Fc\gamma humanos reconocidos, Fc\gammaR (I), Fc\gammaRIIa, Fc\gammaRIIb, Fc\gammaRIIIa y FcRn neonatal. Shields y col., (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604 demostraron que una serie común de restos de IgG1 está implicada en la unión a todos los Fc\gammaR, mientras que Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII utilizan sitios distintos fuera de esta serie común. Un grupo de restos de IgG1 redujo la unión a todos los Fc\gammaR cuando se cambiaron por alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 y Pro-239. Todos están en el dominio CH2 de IgG y están agrupados cerca de la bisagra que une CH1 y CH2. Aunque Fc\gammaRI utiliza sólo la serie común de restos de IgG1 para la unión, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII interaccionan con restos distintos además de la serie común. La alteración de algunos restos sólo redujo la unión a Fc\gammaRII (por ejemplo Arg-292) o Fc\gammaRIII (por ejemplo, Glu-293). Algunas variantes mostraron una unión mejorada a Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII, pero no afectaron a la unión al otro receptor (por ejemplo, Ser-267Ala mejoraron la unión a Fc\gammaRII pero la unión a Fc\gammaRIII no se vio afectada). Otras variantes presentaron mejor unión a Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII con reducción en la unión al otro receptor (por ejemplo, Ser-298Ala mejoró la unión a Fc\gammaRIII y redujo la unión a Fc\gammaRII). En el caso de Fc\gammaRIIIa, las mejores variantes de unión de IgG1 tenían sustituciones combinadas de alanina en Ser-298, Glu-333 y Lys-334. Se cree que el receptor FcRn neonatal está implicado en la protección de moléculas de IgG de la degradación y, de esta manera, en el aumento de la semivida en suero y la transcitosis a través de tejidos (véase Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 y Ghetie y col. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Los restos de IgG1 humana que según se ha determinado interaccionan directamente con FcRn humano incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435.

El anticuerpo terapéutico de la invención puede incorporar cualquiera de las modificaciones de la región constante indicadas anteriormente.

En una realización particular, el anticuerpo terapéutico carece esencialmente de las funciones de a) activación del complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. En una realización más particular, la presente invención proporciona anticuerpos terapéuticos de la invención que tienen uno (o más) de los cambios de restos indicados con detalle anteriormente para modificar la semivida/eliminación y/o funciones efectoras tales como ADCC y/o citotoxicidad dependiente del complemento y/o lisis del complemento.

En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo terapéutico tiene una región constante de IgG1 de isotipo humano con sustituciones de alanina (u otras alteraciones) en las posiciones 235 (por ejemplo, L235A) y 237 (por ejemplo, G237A) (numeración de acuerdo con el esquema EU indicado en Kabat.

Otros derivados de la invención incluyen variantes de glicosilación de los anticuerpos de la invención. Se sabe que la glicosilación de anticuerpos en posiciones conservadas en sus regiones constantes tiene un profundo efecto sobre la función de los anticuerpos, particularmente las funciones efectoras tales como las descritas anteriormente, véase, por ejemplo, Boyd y col. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Se contemplan variantes de glicosilación de los anticuerpos terapéuticos de la presente invención en las que se añaden, sustituyen, suprimen o modifican uno o más restos de carbohidrato. La introducción de un motivo de asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina crea un sitio potencial para la unión enzimática de restos de carbohidrato y, por lo tanto, puede usarse para manipular la glicosilación de un anticuerpo. En Raju y col. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876, la sialilación terminal de una inmunoadhesina TNFR-IgG se aumentó a través de un procedimiento de regalactosilación y/o resialilación usando beta-1,4-galactosiltransferasa y/o alfa-2,3-sialiltransferasa. Se cree que el aumento de la sialilación terminal aumenta la semivida de la inmunoglobulina. Los anticuerpos, de la misma manera que la mayoría de las glicoproteínas, típicamente se producen en la naturaleza como una mezcla de glicoformas. Esta mezcla es particularmente evidente cuando los anticuerpos se producen en células eucariotas, particularmente de mamífero. Se han creado varios procedimientos para fabricar glicoformas definidas, véase Zhang y col. Science (2004), 303, 371, Sears y col., Science, (2001) 291, 2344, Wacker y col. (2002) Science, 298 1790, Davis y col. (2002) Chem. Rev. 102, 579, Hang y col. (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. De esta manera, la invención se refiere a una pluralidad de anticuerpos terapéuticos (que pueden ser de isotipo de IgG, por ejemplo IgG1) como se describen en este documento que comprenden un número definido (por ejemplo, 7 o menos, por ejemplo 5 o menos, tal como dos o una única) de glicoforma o glicoformas de dichos anticuerpos.

Los derivados de acuerdo con la invención también incluyen anticuerpos terapéuticos de la invención acoplados a un polímero no proteico tal como polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquileno. La conjugación de proteínas a PEG es una técnica establecida para aumentar la semivida de las proteínas, así como para reducir la antigenicidad y la inmunogenicidad de las proteínas. Se ha investigado el uso de la PEGilación con diferentes pesos moleculares y estilos (lineal o ramificado) con anticuerpos intactos así como con fragmentos Fab', véase Koumenis I.L. y col. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95. Una realización particular comprende un fragmento de unión a antígeno de la invención sin las funciones efectoras de a) activación del complemento por la ruta clásica; y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; (tal como un fragmento Fab o un scFv) acoplado a PEG.

2. Procedimientos de Producción

Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse en organismos transgénicos tales como cabras (véase Pollock y col. (1999), J. Immunol. Methods 231:147- 157), pollos (véase Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55), ratones (véase Pollock y col. ibid) o plantas (véase Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606, Baez J y col., BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E y col.; (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590). También pueden producirse anticuerpos por síntesis química. Sin embargo, los anticuerpos de la invención se producen típicamente usando la tecnología de cultivo de células recombinantes bien conocida para los expertos en la materia. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo se aísla y se inserta en un vector replicable tal como un plásmido para la propagación adicional o expresión en una célula huésped. Un sistema de expresión útil es un sistema de glutamato sintetasa (tal como el comercializado por Lonza Biologics), particularmente cuando la célula huésped es CHO o NS0 (véase más adelante). El polinucleótido que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas oligonucleotídicas). Los vectores que pueden usarse incluyen plásmidos, virus, fagos, transposones y minicromosomas, siendo una realización típica los plásmidos. Generalmente, estos vectores incluyen además una secuencia señal, origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de la transcripción unidas operativamente al polinucleótido de cadena ligera y/o pesada para facilitar la expresión. El polinucleótido que codifica las cadenas ligera y pesada puede insertarse en vectores separados e introducirse (por ejemplo, por transformación, transfección, electroporación o transducción) en la misma célula huésped al mismo tiempo o secuencialmente o, si se desea tanto la cadena pesada como la cadena ligera pueden insertarse en el mismo vector antes de dicha
introducción.

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Inmediatamente será evidente para los expertos en la materia que debido a la redundancia del código genético, también están disponibles polinucleótidos alternativos a los descritos en este documento que codifican los polipéptidos de la invención.

2.1 Secuencias señal

Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse como una proteína de fusión con una secuencia señal heteróloga que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura. La secuencia señal debe reconocerse y procesarse por la célula huésped. Para células huésped procariotas, la secuencia señal puede ser una fosfatasa alcalina, penicilinasa o secuencias líder de enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levadura, las secuencias señal pueden ser un líder de invertasa de levadura, el líder del factor o líderes de fosfatasa ácida, véase, por ejemplo, el documento W090/13646. En sistemas celulares de mamífero, se dispone de líderes de secreción virales tales como la secuencia señal de gD del virus herpes simplex y secuencias señal de inmunoglobulinas nativas (tales como cadena pesada de Ig humana). Típicamente, la secuencia señal está unida en la misma fase de lectura al polinucleótido que codifica el anticuerpo de la invención.

2.2 Origen de replicación

Los orígenes de replicación son bien conocidos en la técnica, siendo el de pBR322 adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas, el del plásmido 2 \mu para la mayoría de las levaduras y diversos orígenes virales tales como el de SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV para la mayoría de las células de mamíferos. Generalmente, para vectores de expresión de mamífero integrados no se necesita el componente del origen de replicación de SV40. Sin embargo, el ori de SV40 puede incluirse, ya que contiene el promotor temprano.

2.3 Marcador de selección

Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina o (b) complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes no disponibles en los medios complejos o (c) combinaciones de las dos. El esquema de selección puede implicar detener el crecimiento de las células huésped que no contienen el vector o los vectores. Las células que se han transformado satisfactoriamente con los genes que codifican el anticuerpo terapéutico de la presente invención sobreviven debido a, por ejemplo, resistencia a fármacos conferida por el marcador de selección administrado conjuntamente. Un ejemplo es el sistema de selección de DHFR en el que los transformantes se generan en cepas de huésped negativas para DHFR (por ejemplo, véase Page y Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). En este sistema, el gen de DHFR se administra conjuntamente con las secuencias del polinucleótido anticuerpo de la invención y las células positivas para DHFR después se seleccionan por retirada de nucleósidos del medio. Si es necesario, también se emplea el inhibidor de DHFR metotrexato para seleccionar los transformantes con amplificación del gen de la DHFR. Por medio de la unión operativa del gen de DHFR a las secuencias codificantes de anticuerpos de la invención o derivados funcionales de las mismas, la amplificación del gen de la DHFR produce la amplificación concomitante de las secuencias de anticuerpo deseadas de interés. Las células CHO son una línea celular particularmente útil para esta selección con DHFR/metotrexato y en la técnica están bien establecidos procedimientos de amplificación y selección de células huésped usando el sistema DHFR, véase Kaufman R.J. y col. J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, como revisión, véase Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter M,"Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8): 870-80, agosto de 1998. Otro ejemplo es el sistema de expresión de glutamato sintetasa (Bebbington y col. Biotechnology 1992 Vol 10 p169). Un gen de selección adecuado para uso en levaduras es el gen trp1; véase Stinchcomb y col. Nature 282, 38, 1979.

2.4 Promotores

Los promotores adecuados para la expresión de anticuerpos de la invención se unen operativamente al ADN/
polinucleótido que codifica el anticuerpo. Los promotores para hospedadores procariotas incluyen el promotor de phoA, los sistemas promotores de Beta-lactamasa y de lactosa, fosfatasa alcalina, triptófano y promotores híbridos tales como Tac. Los promotores adecuados para la expresión en células de levadura incluyen los de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, por ejemplo, enolasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa 6 fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucoquinasa. Los promotores de levadura inducibles incluyen los de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o de la utilización de maltosa/galactosa. Los promotores para la expresión en sistemas celulares de mamífero incluyen promotores de la ARN polimerasa II incluyendo promotores virales tales como el promotor de polioma, virus de la viruela de las aves de corral y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular el promotor del gen temprano inmediato), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor temprano o tardío del virus de simio 40 y promotores no virales tales como EF-1alfa (Mizushima y Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17): 5322). La elección del promotor puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

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2.5 Elemento potenciador

Cuando sea apropiado, por ejemplo, para la expresión en eucariotas superiores, pueden incluirse elementos potenciadores adicionales en lugar de o además de los que se encuentran localizados en los promotores descritos anteriormente. Las secuencias potenciadoras de mamífero adecuadas incluyen elementos potenciadores de globina, elastasa, albúmina, fetoproteína, metalotioneína e insulina. Como alternativa, se puede usar un elemento potenciador de un virus de célula eucariota tal como el potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, potenciador de polioma, potenciador de baculovirus o locus IgG2a murino (véase el documento W004/009823). Aunque estos potenciadores típicamente se localizan en el vector en un sitio cadena arriba del promotor, también pueden localizarse en otros sitios, por ejemplo, dentro de la región no traducida o cadena abajo de la señal de poliadenilación. La elección y posicionamiento del potenciador pueden basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

2.6 Poliadenilación/Terminación

En sistemas eucariotas, hay señales de poliadenilación unidas operativamente al polinucleótido que codifica el anticuerpo de esta invención. Tales señales típicamente se ponen en posición 3' de la fase de lectura abierta. En sistemas de mamífero, las señales ejemplares no limitantes incluyen las procedentes de hormonas de crecimiento, factor de elongación-1 alfa y genes virales (por ejemplo de SV40) o repeticiones terminales largas retrovirales. En sistemas de levadura, los ejemplos no limitantes de señales de poliadenilación/terminación incluyen las derivadas de los genes de la fosfoglicerato quinasa (PGK) y la alcohol deshidrogenasa 1 (ADH). En un sistema procariota típicamente no se requieren las señales de poliadenilación y en su lugar es habitual emplear secuencias terminadoras más cortas y más definidas. La elección de las secuencias de poliadenilación/terminación puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

2.7 Otros procedimientos/elementos para mejorar el rendimiento

Además de lo anterior, otras características que pueden emplearse para mejorar los rendimientos incluyen elementos de remodelación de cromatina, intrones y modificación de codones específicos para la célula huésped. El uso de codones del anticuerpo de esta invención puede modificarse para adaptar la desviación de codones de la célula huésped, tal como para aumentar la transcripción y/o el rendimiento de producto (por ejemplo Hoekema A y col. Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24). La elección de los codones puede basarse en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

2.8 Células huésped

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de los vectores que codifican los anticuerpos de la invención son células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacterias, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli (por ejemplo ATCC 31.446; 31.537; 27.325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (véase el documento DD 266 710), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Entre las células huésped de levadura, también se contemplan Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, ATCC 16.045; 12.424; 24178; 56.500), Yarrowia (documento EP402. 226), Pichia Pastoris (documento EP183. 070, véase también Peng y col. J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (documento EP244. 234), Penicillin, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Aunque la invención contempla específicamente células huésped procariotas y de levadura, sin embargo, típicamente, las células huésped de la presente invención son células de vertebrados. Las células huésped de vertebrados adecuadas incluyen células de mamífero tales como COS-1 (ATCC Nº CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), línea de riñón embrionario humano 293, PerC6 (Crucell), células renales de cría de hámster (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC Nº: CRL 10314), 293 (ATCC Nº CRL 1573), células de ovario de hámster chino CHO (por ejemplo, CHO-K1, ATCC Nº CCL 61, una línea celular CHO DHFR-negativa tal como DG44 (Urlaub y col., Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12 páginas 555-566), particularmente las líneas de células CHO adaptadas para cultivo en suspensión, células de sertoli de ratón, células de riñón de mono, células renales de mono verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células de riñón canino (ATCC CCL 34), células de pulmón humano (ATCC CCL 75), células Hep G2 y células de mieloma o linfoma, por ejemplo, NS0 (véase el documento US 5.807.715), Sp2/0 e Y0.

De esta manera, en una realización de la invención, se proporciona una célula huésped transformada de manera estable que comprende un vector que codifica una cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo terapéutico como se ha descrito en este documento. Típicamente, tales células huésped comprenden un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica dicha cadena pesada.

Tales células huésped también pueden modificarse adicionalmente por ingeniería genética o adaptarse para modificar la calidad, función y/o rendimiento del anticuerpo de esta invención. Los ejemplos no limitantes incluyen la expresión de enzimas específicas de modificación (por ejemplo, glicosilación) y chaperonas de plegamiento de proteínas.

2.9 Procedimientos de Cultivo Celular

Las células huésped transformadas con vectores que codifican los anticuerpos terapéuticos de la invención pueden cultivarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Las células huésped pueden cultivarse en matraces rotativos, matraces de agitación, matraces cilíndricos, reactores de agitación por ondas (por ejemplo, System 1000 de wavebiotech.com) o sistemas de fibras huecas, pero para la producción a gran escala se prefiere usar reactores de depósito agitado o reactores de bolsa (por ejemplo, Wave Biotech, Somerset, Nueva Jersey EE.UU.) particularmente para cultivos en suspensión. Típicamente, los depósitos agitados están adaptados para la aireación usando, por ejemplo, rociadores, compuertas o propulsores de bajo cizallamiento. En el caso de las columnas de burbujeo y reactores de agitación por inyección de aire puede usarse la aireación directa con burbujas de aire u oxígeno. Cuando las células huésped se cultivan en un medio de cultivo sin suero, éste puede complementarse con un agente protector de células tal como pluronic F-68 ara ayudar a prevenir las lesiones celulares como resultado del procedimiento de aireación. Dependiendo de las características de la célula huésped, pueden usarse microsoportes como sustratos de crecimiento para líneas celulares dependientes de anclaje o las células pueden adaptarse a cultivos en suspensión (lo cual es típico). El cultivo de las células huésped, particularmente células huésped de vertebrados, puede utilizar una diversidad de modos de operación tales como un procesamiento discontinuo, semicontinuo o discontinuo repetido (véase Drapeau y col. (1994) cytotechnology 15: 103-109), un procedimiento discontinuo prolongado o un cultivo de perfusión. Aunque las células huésped de mamífero transformadas de manera recombinante pueden cultivarse en medios que contienen suero tales como medios que comprenden suero fetal bovino (FCS), se prefiere cultivar estas células en medios sin suero tales como los descritos en Keen y col. (1995) Cytotechnology 17:153-163, o medios disponibles en el mercado tales como ProCHO-CDM o UltraCHO^{TM} (Cambrex NJ, EE.UU.), complementado cuando es necesario con una fuente de energía tal como glucosa y factores de crecimiento sintéticos tales como insulina recombinante. El cultivo sin suero de las células huésped puede requerir que esas células se adapten al crecimiento en condiciones sin suero. Una estrategia de adaptación es cultivar dichas células huésped en medio que contiene suero y cambiar de manera repetida 80% del medio de cultivo por el medio sin suero de manera que las células huésped aprendan a adaptarse a las condiciones sin suero (véase, por ejemplo, Scharfenberg K y col. (1995) en Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. y col. eds), páginas 619-623, Kluwer Academic publishers).

Los anticuerpos de la invención secretados en el medio pueden recuperarse y purificarse a partir del medio usando una diversidad de técnicas para proporcionar un grado de purificación adecuado para el uso para el que están destinados. Por ejemplo, el uso de anticuerpos terapéuticos de la invención para el tratamiento de pacientes humanos típicamente exige una pureza de al menos el 95% determinada por SDS-PAGE reductora, más típicamente una pureza del 98% o el 99%, en comparación con el medio de cultivo que comprende los anticuerpos terapéuticos. En el primer caso, los desechos celulares del medio de cultivo típicamente se retiran usando centrifugación seguido de una etapa de aclarado del sobrenadante usando, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración y/o filtración en profundidad. Como alternativa, el anticuerpo puede recogerse por microfiltración, ultrafiltración o filtración en profundidad sin centrifugación previa. Se dispone de una diversidad de técnicas distintas tales como diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como cromatografía en hidroxiapatita (HA), cromatografía de afinidad (que implica opcionalmente un sistema de señalización de afinidad tal como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, véase el documento US 5.429.746). En una realización, los anticuerpos de la invención, después de diversas etapas de aclarado, se capturan usando cromatografía de afinidad de Proteína A o G seguido de etapas de cromatografía adicionales tales como cromatografía de intercambio iónico y/o HA, intercambio aniónico o catiónico, cromatografía por exclusión de tamaño y precipitación con sulfato de amonio. Típicamente, también se emplean diversas etapas de eliminación de virus (por ejemplo, nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro DV-20). Después de estas diversas etapas, se proporciona una preparación purificada (típicamente monoclonal) que comprende al menos 10 mg/ml o más, por ejemplo 100 mg/ml o más del anticuerpo de la invención y, por lo tanto, constituye una realización de la invención. Puede generarse una concentración de 100 mg/ml o superior por ultracentrifugación. Convenientemente, estas preparaciones carecen sustancialmente de formas agregadas de anticuerpos de la invención.

Los sistemas bacterianos son particularmente adecuados para la expresión de fragmentos de anticuerpo. Estos fragmentos se localizan dentro de la célula o dentro del periplasma. Las proteínas periplásmicas insolubles pueden extraerse y replegarse para formar proteínas activas de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia, véase Sanchez y col. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 y Cupit PM y col. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277.

3. Composiciones farmacéuticas

Las preparaciones purificadas de anticuerpos de la invención (particularmente anticuerpos monoclonales) descritas anteriormente, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos humanos tales como los indicados anteriormente. Típicamente, estas composiciones además comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable (es decir, inerte) conocido y requerido por la práctica farmacéutica aceptable, véase, por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16ª ed, (1980), Mack Publishing Co. Los ejemplos de estos vehículos incluyen vehículos esterilizados tales como solución salina, solución de Ringer o solución de dextrosa, tamponados con tampones adecuados tales como acetato sódico trihidrato a un pH farmacéuticamente aceptable, tal como un pH dentro de un intervalo de 5 a 8. Las composiciones farmacéuticas para inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraportal) o infusión continua convenientemente carecen de materia en partículas visibles y pueden comprender de 1 mg a 10 g de anticuerpo terapéutico, típicamente de 5 mg a 1 g, más específicamente de 5 mg a 25 mg o 50 mg de anticuerpo. Los procedimientos para la preparación de estas composiciones farmacéuticas son bien conocidos para los expertos en la materia. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden de 1 mg a 10 g de los anticuerpos terapéuticos de la invención en forma de dosificación unitaria, opcionalmente junto con instrucciones de uso. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden liofilizarse (secarse por congelación) para reconstituirse antes de la administración de acuerdo con procedimientos bien conocidos o evidentes para los expertos en la materia. Cuando las realizaciones de la invención comprenden anticuerpos de la invención con un isotipo IgG1, a la composición farmacéutica se le puede añadir un quelante de iones metálicos incluyendo cobre, tal como citrato (por ejemplo, citrato sódico) o EDTA o histidina, para reducir el grado de degradación mediada por metal de anticuerpos de este isotipo, véase el documento EP0612251. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender un solubilizante tal como una base de arginina, un agente detergente/anti-agregación tal como polisorbato 80 y un gas inerte tal como nitrógeno para reemplazar el oxígeno del espacio superior del vial.

Las dosis eficaces y los regímenes de tratamiento para administrar el anticuerpo de la invención generalmente se determinan empíricamente y dependen de factores tales como la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y la enfermedad o trastorno a tratar. Estos factores están dentro del ámbito del médico a cargo del caso. Puede encontrarse una guía para la selección de las dosis apropiadas, por ejemplo, en Smith y col. (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, Nueva York, pero en general será de 1 mg a 10 g. En una realización, el régimen de dosificación para el tratamiento de un paciente humano es de 1 mg a 1 g del anticuerpo terapéutico de la invención administrado por vía subcutánea una vez a la semana o cada dos semanas, o por infusión intravenosa cada 1 ó 2 meses. Esta dosificación corresponde a 0,014-140 mg/kg, tal como 0,014-14 mg/kg. Las composiciones de la presente invención también pueden usarse profilácticamente.

4. Usos clínicos

Se apreciará que las enfermedades caracterizadas por una elevación de los niveles de \beta-amiloide o por depósitos de \beta-amiloide incluyen la enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con \beta-amiloidosis de tipo Dutch, angiopatía \beta-amiloide cerebral y diversos tipos de demencias degenerativas tales como las asociadas con la enfermedad de Parkinson, parálisis supranuclear progresiva, degeneración basal cortical y enfermedad de Alzheimer del tipo de cuerpos de Lewy difusos.

Más preferiblemente, la enfermedad caracterizada por una elevación de los niveles de \beta-amiloide o depósitos de \beta-amiloide es la enfermedad de Alzheimer.

Aunque la presente invención se ha descrito principalmente en relación al tratamiento de enfermedades o trastornos humanos, también puede tener aplicaciones en el tratamiento de enfermedades o trastornos similares en mamíferos no humanos.

Ejemplos Procedimientos

Biacore^{TM}/Biacore 3000

un dispositivo que permite medir las cinéticas a tiempo real de interacciones moleculares usando SPR

SPR

(resonancia de plasmón superficial) - fenómeno físico empleado por los instrumentos Biacore^{TM} para medir los cambios de masa en un chip de detección

CM5

chip de detección Biacore^{TM} con una superficie de propósitos generales recubierta con una matriz de dextrano carboximetilada

ELISA

ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

SRU

Tecnología de biosensor SRU BIND^{TM} que permite controlar las intreracciones bioquímicas sin marcador

Integra CL1000

Mini-biorreactores vendidos por IBS Integra Biosciences

FMAT

Tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (Applied Biosystems)

ABi8200

Sistema de detección celular confocal macro de fluorescencia de Applied Biosystems 8200 para FMAT

FPLC

Cromatografía líquida de proteína rápida

ProSepA HiTrap

Columnas de Proteína A para FPLC vendidas por GE Healthcare

Materiales

DMSO

dimetilsulfóxido

HEPES

N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfónico)

EDTA

ácido etilendiaminatetraacético

Tris HCl

- hidrocloruro de tris-(hidroximetil)aminometano

NaCl

- cloruro sódico

Tween-20

- monolaurato de polioxietilenosorbitano

BSA

- albúmina de suero bovino

PBS

- solución salina tamponada con fosfato

PFA

- paraformaldehído

IMS

- licor metilado industrial

DAB

- 3,3'diaminobencidina

DMEM

medio de Eagle modificado por Dulbecco

FCS

suero bovino fetal

Opti-MEM

medio basado en el medio de Eagle modificado de Invitrogen/Gibco

Lipofectamine

agente de transfección de células basado en lípidos catiónicos vendido por Invitrogen/Gibco

Transfast

agente de transfección liposomal vendido por Promega

Versene

agente quelante de iones metálicos (ácido etilendiaminatetraacético)

Glutamax

forma estable de glutamina añadida al medio de cultivo (complemento dipeptídico L-Ananil-L-Glutamina)

Histoclear

agente de aclaramiento de tejidos

tampón HBS-EP

Tampón Biacore^{TM} para propósitos generales que contiene HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,005%

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Generación de anticuerpo monoclonal de ratón 2E7

El anticuerpo monoclonal de ratón 2E7 se generó a partir de una inmunización convencional de ratones. Se inmunizaron ratones con \beta-amiloide 1-40 y 1-42 soluble o agregado, formulado en adyuvante de Freund. Después del refuerzo final sin adyuvante, los esplenocitos se fusionaron con células de mieloma. Las células fusionadas se dejaron crecer en placas de 96 pocillos, en las que los sobrenadantes de los hibridomas se sometieron a una investigación para encontrar posibles indicios. El anticuerpo seleccionado 2E7, que se obtuvo por inmunización con \beta-amiloide 1-40 soluble, era de isotipo IgG2a murino y tenía actividad de unión a beta-amiloide en el ensayo de salida descrito más adelante y una afinidad de 36,1 pM para el beta-amiloide 1-40 medida por Biacore^{TM}, Procedimiento A(i) (Tabla 10A).

Mapeo de Epítopes de 2E7

Para mapear finalmente la unión del anticuerpo 2E7 al péptido \beta-amiloide, se utilizó una serie de péptidos (A). La serie de péptidos (A) consistía en una serie de 31 péptidos solapantes de 12 aminoácidos que cubrían la secuencia completa del péptido \beta-amiloide 1-42. Cada péptido secuencial se inició en el aminoácido secuencial dentro del péptido \beta-amiloide, cambiando de esta manera la secuencia cubierta entre péptidos secuenciales por un solo aminoácido. Todos los péptidos de la serie (A) contenían un engarce C-terminal de 3 aminoácidos (glicina-serina-glicina) y un resto de lisina biotinilado terminal. Además, todos los péptidos excepto el péptido A\beta1 DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina (SEC ID Nº: 15) estaban acetilados en el extremo N. Una segunda serie de péptidos (serie (B)) consistía en deleciones secuenciales C-terminales de un aminoácido de un péptido que contenía los aminoácidos 1 a 10 de la secuencia de \beta-amiloide. Todos los péptidos de la serie (B) contenían un engarce C-terminal de 3 aminoácidos (glicina-serina-glicina) y un resto de lisina biotinilado terminal, pero con restos adicionales de glicina y serina para reemplazar los aminoácidos de \beta-amiloide delecionados (Tabla 2). De esta manera, todos los péptidos de la serie (B) tienen la misma longitud.

TABLA 2 Secuencias de péptidos biotinilados (serie (B) que contenían fragmentos N-terminales truncados de \beta-amiloide

DAEFRHDSGYGSGGSK-biotina

(SEC ID Nº: 7)

DAEFRHDSG- -GSGSGSK-biotina

(SEC ID Nº: 8)

DAEFRHDS- -GSGGSGGK-biotina

(SEC ID Nº: 9)

DAEFRHD- -GSGGSGGSK-biotina

(SEC ID Nº: 10)

DAEFRH- -GSGGSGGSGK-biotina

(SEC ID Nº: 11)

DAEFR- -GSGGSGGSGSK-biotina

(SEC ID Nº: 12)

DAEF- -GSGGSGGSGGSK-biotina

(SEC ID Nº: 13)

DAE- -GSGGSGGSGGSGK-biotina

(SEC ID Nº: 14)

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Control de la unión de 2E7 a péptidos derivados de \beta-amiloide usando Biosensores Ópticos

Se lavaron placas revestidas con estreptavidina SRU Bind^{TM} de 96 pocillos (SRU Biosystems) con PBS que contenía DMSO al 1% para retirar el glicerol y el conservante. Se dejó un volumen de 50 \mul/pocillo a temperatura ambiente para proporcionar un valor basal constante. Los péptidos biotinilados se diluyeron a aproximadamente 0,3 \mug/ml en PBS que contenía DMSO al 1%, se añadieron 50 \mul de cada uno a los pocillos y se incubaron durante aproximadamente 1 h. Se prepararon pocillos por duplicado usando diferentes sectores de la placa y se usó al menos un pocillo de control sin péptido en cada sector para restar la referencia de los datos. Después de la captura de los péptidos, la placa se lavó con PBS que contenía DMSO al 1%, dejando 50 \mul de tampón reciente por pocillo para proporcionar un nuevo valor basal en el lector. No se observó ninguna descomposición del péptido de la superficie. El tampón después se reemplazó con 40 \mul/pocillo de tampón que contenía anticuerpo de ensayo a una concentración 20-64 nM durante 2 horas. Se descubrió que el anticuerpo 2E7 sólo se unía al péptido que incluía los aminoácidos 1-12 del péptido \beta-amiloide en la serie de péptido (A) (péptido A\beta1, SEC ID Nº: 15). Este resultado implica que el ácido aspártico en el resto 1 es crítico para la unión a este péptido.

Para caracterizar adicionalmente el sitio de unión del anticuerpo 2E7, se utilizó la serie de péptidos (B). Usando la metodología del biosensor SRU BIND^{TM}, el anticuerpo 2E7 mostró una unión insignificante a los péptidos que incluían los aminoácidos 1-3 y 1-4 del péptido \beta-amiloide (SEC ID Nº: 14 y 13). La unión a un péptido que incluía los aminoácidos 1-7 del péptido \beta-amiloide (SEC ID Nº: 10) fue comparable a la del péptido que incluía los aminoácidos 1-12 del péptido \beta-amiloide (de la serie de péptidos (A)). Se observó la unión a péptidos que incluían los aminoácidos 1-5 ó 1-6 del péptido \beta-amiloide (SEC ID Nº: 12 u 11), pero fue más débil (medido por la estabilidad después de una etapa de lavado adicional) que la unión al péptido que incluía los aminoácidos 1-7 del péptido \beta-amiloide (SEC ID Nº: 10).

De esta manera, se ha demostrado que sólo se requieren los restos 1-7 del péptido \beta-amiloide para la unión total, medido usando esta metodología.

Ensayo de Resonancia de Plasmón Superficial

Además de los experimentos descritos anteriormente, se usó el biosensor óptico Biacore^{TM} 3000 para controlar la unión del anticuerpo 2E7 a péptidos derivados de la secuencia de \beta- amiloide seleccionados. La unión se midió inyectando anticuerpos de ensayo a una concentración de hasta 64 nM durante 5 minutos sobre los péptidos capturados en distintas superficies de chips de estreptavidina (130-230 RU (unidades de resonancia)). Se usó un tampón de procesamiento (HBS-EP) que contenía HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y Surfactante P20^{TM} al 0,005% a 25ºC a un caudal de 20 \mul/min. Todos los ensayos utilizaron una doble referencia frente a una superficie blanco de estreptavidina e inyecciones blanco. El análisis se realizó usando el software de análisis Biacore^{TM} BIAevaluation^{TM} versión 4.1. Los resultados de los péptidos seleccionados de la serie (A) confirmaron adicionalmente los datos obtenidos con SRU BIND^{TM} indicando que 2E7 se unía únicamente al péptido que incluía los aminoácidos 1-12 (SEC ID Nº: 15) del péptido \beta-amiloide con una constante de equilibrio aparente KD de aproximadamente 50 pM. En las mismas condiciones, 2E7 no se unía al péptido que incluía los aminoácidos 2-13 del péptido \beta-amiloide.

Péptido A\beta2-13

AEFRHDSGYEVHGSGK-biotina

(SEC ID Nº: 44)

El procedimiento experimental y las condiciones usadas permitieron la detección de moléculas de alta afinidad, pero también de menor afinidad - en el mismo sistema experimental, a diferencia de lo que ocurría con 2E7, se demostró que otro anticuerpo que reconocía un epítope N-terminal del péptido \beta-amiloide se unía al péptido 2-13 (SEC ID Nº: 44) con una KD aparente de 7 nM. 2E7 no se unía a una selección de péptidos de la serie (A) procedentes de regiones intermedias del péptido \beta-amiloide. En otro experimento, el péptido \beta-amiloide 1-40 se capturó a través de su resto de ácido aspártico N-terminal que se había biotinilado. Este péptido se capturó en un chip recubierto con estreptavidina Biacore^{TM} como se ha descrito previamente. El anticuerpo 2E7 inyectado a una concentración 66 nM durante 1 minuto no pudo unirse a este péptido. Por lo tanto, se concluye que el sitio de unión N-terminal descrito previamente se enmascaraba por el engarzador y el procedimiento de captura, confirmando adicionalmente que el extremo N contiene el sitio de unión al núcleo.

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Unión de la Proteína Precursora de Amiloide (APP) Expresada en Células

El \beta-amiloide está compuesto por péptidos formados por la escisión proteolítica de una proteína precursora transmembrana de tipo I denominada proteína precursora de amiloide (APP). Como APP tiene un dominio extracelular grande, la unión a esta proteína podría iniciar una reacción de citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC).

Para caracterizar la unión de un anticuerpo a la APP de longitud completa de la superficie celular, se utilizó un ensayo FMAT^{TM} basado en ABI8200.

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Transfección de células HEK293T con ADN de APP de tipo silvestre

Se mantienen células HEK293T en medio DMEM F12 que contiene FCS al 10% (v/v) y 1x Glutamax. Las células se siembran en matraces de cultivo de tejidos de 75 cm^{2} y se dejan crecer hasta una confluencia de 60-80% (18-24 h) antes de la transfección. Para la transfección, se mezclan 9 \mug de ADN (ADN de APP de tipo silvestre (en el vector PCDNA3.1 (Invitrogen)), o vector sólo en los controles) con 0,3 ml de medio Opti-MEM^{TM}. Se mezclan 30 \mul de agente de transfección Lipofectamine^{TM} con 0,3 ml de medio Opti-MEM^{TM} y se reúnen las dos mezclas. Las mezclas reunidas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la adición de 4,8 ml más de medio Opti-MEM^{TM}. La mezcla final se añade a las células después de lavar con medio Opti-MEM^{TM}) durante 5 h y después se añaden 6 ml de suero de ternero recién nacido al 10% (v/v) en DMEM. 48 horas después de la transfección, se retira el sobrenadante, la monocapa se lava en Versene y después se añaden 3 ml de agente quelante Versene^{TM} a cada matraz, se incuban durante 5 minutos a 37ºC, y las células separadas se centrifugan a 200 g durante 5 minutos. El sedimento celular resultante se resuspende suavemente en 1 ml de tampón de ensayo (suero tratado con calor al 2%, BSA al 0,5%, NaN al 0,1% en PBS pH 7,4, filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum) para crear una suspensión de una sola célula.

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Ensayo basado en ABI8200 FMAT^{TM}

Se diluyeron anticuerpos de ensayo (2E7, IgG de ratón LN27 (Zymed) contra el dominio extracelular de APP como control positivo, y un anticuerpo G210 que reconoce la forma x-40 del péptido \beta-amiloide como control negativo) a 10 \mug/ml en tampón de ensayo filtrado de forma estéril (suero tratado con calor al 2%, BSA al 0,5%, NaN al 0,1% en PBS pH 7,2) en una placa de polipropileno, y después se realizaron seis diluciones adicionales seriadas 1:1 en la placa. Como blanco se usó únicamente tampón de ensayo. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos se le añadieron 50 \mul de una suspensión de células HEK293T transfectadas con ADN de APP de tipo silvestre (Experimento 1: 10.000 células; Experimento 2: 20.000 células), y se añadieron 5 \mul de cada una de las soluciones de anticuerpo a pocillos para obtener un duplicado. Después se añadieron a cada pocillo 50 \mul/pocillo de solución madre de IgG anti-ratón F-MAT^{TM} azul, (el anticuerpo se marca usando el colorante reactivo monofuncional azul F-MAT^{TM} de ABI, 4328408), diluido 1:500 (Experimento 1) y 1:1000 (Experimento 2) en tampón de ensayo, y la placa se agitó brevemente y se dejó sedimentar durante 1 hora. La placa después se leyó usando el sistema de detección celular confocal macro de fluorescencia ABI 8200 (Applied Biosystems).

Los datos de recuentos obtenidos después se interpretaron usando el software de la hoja de cálculo Excel^{TM}. En resumen, los recuentos de las células transfectadas de forma simulada se restaron de los recuentos de células transfectadas con APP de longitud completa para obtener una señal específica para cada anticuerpo. Se eligieron dos concentraciones de anticuerpo que estaban en la parte lineal de la curva (1,25 y 0,63 \mug/ml), los recuentos obtenidos corregidos con respecto al efecto de fondo a esas concentraciones se expresaron como el porcentaje de unión al anticuerpo LN27, y se calculó la media de los datos obtenidos a las dos concentraciones de anticuerpo. Los datos resultantes se describen en la Tabla 3 (% de unión a LN27 \pmSE)

De esta manera, dentro de este sistema de ensayo, la unión de 2E7 a APP de la superficie celular no se puede distinguir de la del anticuerpo de control negativo G210.

TABLA 3

2

Unión al Péptido Derivado de la Proteína Precursora de Amiloide

Los estudios de mapeo de epítopes descritos anteriormente han demostrado que el anticuerpo 2E7 se une al extremo N del péptido \beta-amiloide, siendo esencial el resto de ácido aspártico en la posición 1 para la unión. Esto sugiere que el anticuerpo reconoce un epítope "neo" formado por la escisión de APP en el sitio de la \beta-secretasa. Esta observación sugeriría que el anticuerpo 2E7 no debe reconocer la secuencia del péptido APP adyacente. Para ensayar esta hipótesis, se sintetizó un péptido APP (Péptido APP1, SEC ID Nº: 16) que incluía los restos 1-7 del péptido \beta-amiloide y los cinco aminoácidos derivados de APP adyacentes. De esta manera, el péptido APP1 contenía aminoácidos contiguos desde la posición 5 N-terminal en el sitio de escisión BACE-1 a la posición 7 C-terminal en el sitio de escisión BACE-1 y estaba acetilado N-terminalmente. La capacidad del anticuerpo 2E7 para unirse al péptido derivado de APP APP1 y el péptido \beta-amiloide 1-12 (péptido A\beta1) se comparó usando la metodología Biacore^{TM} (como se ha descrito previamente para el mapeo de epítopes). El anticuerpo 2E7 mostró una alta afinidad de unión al péptido \beta-amiloide A\beta-1, que contiene el epítope básico 1-7. Sin embargo, no se observó ninguna unión al péptido APP1 que también contiene la secuencia 1-7 derivada del \beta-amiloide básico.

Péptido A\beta1	DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina	SEC ID Nº: 15
APP1	AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-biotina	SEC ID Nº: 16

Se ha utilizado una combinación de unión celular basada en FMAT^{TM} y mapeo de péptidos basado en Biacore^{TM} para demostrar que, en estos formatos, 2E7 no tiene afinidad de unión por la proteína APP de longitud completa. Dado que el resto de ácido aspártico en la posición 1 del péptido \beta-amiloide es necesario para la unión, se concluye que 2E7 sólo reconoce el extremo N "neo" del péptido \beta-amiloide y, por lo tanto, no debe unirse a la APP expresada en la superficie celular.

Actividad Biológica In Vivo Modelo de Salida de I^{125} \beta-Amiloide

Varios estudios publicados han demostrado que los anticuerpos contra \beta-amiloide pueden formar complejos con el péptido \beta-amiloide en la corriente sanguínea. Se indica que esta formación de complejos de \beta-amiloide periférico facilita además la salida de amiloide del SNC a la corriente sanguínea (DeMattos RB, PNAS (2001), 98(15); 8850-8855). Se creó un modelo farmacodinámico agudo para seleccionar anticuerpos con respecto a su capacidad de formar complejos con péptido \beta-amiloide derivado de cerebro en la corriente sanguínea.

Se indujo anestesia (isoflurano al 4%) en ratones C57/BL6J macho y se mantuvieron (isoflurano al 1,5%) en oxígeno al 100%. Después, los animales se pusieron en un marco estereotáxico. Después de una incisión en la línea media a lo largo de la sutura sagital, se perforó un orificio a través del cráneo y se insertó una cánula guía en el ventrículo cerebral lateral (coordenadas anterioposterior (AP) -0,5 mm, lateral (L) +0,7 mm, ventral (V) -2,5 mm). Se perforaron dos orificios más a través del cráneo en los que se pusieron tornillos corticales. La cánula se ancló en su sitio por medio de gel de cianoacrilato y la incisión se suturó alrededor de la tapa de gel de cianoacrilato. Después de la operación, los ratones recibieron 0,3 ml de solución salina por vía subcutánea y se pusieron en un medio caliente para que se recuperaran de la anestesia. Tras la recuperación del reflejo de enderezamiento, los ratones se encerraron individualmente y recibieron cuidados convencionales durante los 5 días siguientes a la operación. No se permitieron procedimientos durante los 5 días posteriores o hasta que se recuperó el peso previo a la operación. Después de la recuperación, se verificó la colocación de la cánula por la respuesta de ingestión de líquido a la angiotensina II. Cada ratón recibió una administración intracerebroventricular (ICV) (5 \mul) de 100 ng de angiotensina II (AII) (reconstituida en solución salina al 0,9%). Después de la administración de AII, se observó la ingesta de agua durante 15 minutos. En los estudios se incluyeron ratones con una respuesta dipsogénica positiva a la AII (ingestión de líquido sostenida), que comenzó no antes de cinco días desde la inyección de AII.

En el día del estudio, los ratones se pusieron durante 5-10 minutos en un medio caliente para inducir la vasodilatación, necesaria para facilitar la inyección en la vena de la cola. Se inyectó anticuerpo de ensayo (600 \mug) o vehículo de PBS (con un volumen de dosificación no superior a 10 ml por kg de peso corporal) a través de la vena de la cola y los ratones se devolvieron a sus jaulas individuales después de la inyección. Exactamente una hora después de la inyección en la vena de la cola, en los ratones se inyectó ICV lentamente (2 \mul por minuto) con 2 ng (1 \muCi) de I^{125} beta-amiloide 1-40 (Amersham Biosciences, UK) en un volumen de dosificación de 5 \mul. Exactamente cuatro horas después de la dosis ICV, se recogieron 50 \mul de sangre del tronco y se midió el nivel de radiactividad en un contador de escintilación.

Los ratones que habían recibido inyecciones de 2E7 en la vena de la cola (n = 6 por grupo de tratamiento) mostraron un aumento estadísticamente significativo en la señal radiactiva (cuenta por minuto - CPM) en 50 \mul de sangre del tronco en comparación con la señal de CPM detectada en los ratones inyectados con vehículo (CPM - vehículo: 1339,7 \pm 496,2 frente a 2E7 4387,9 \pm 980,3; ANOVA:F(2,13) = 4,97, p<0,05. Post-hoc LSD: p = 0,01 2E7 frente a vehículo [post-hoc Duncans: p = 0,02 2E7 frente a vehículo]).

En dos estudios adicionales con 2E7 realizados con un protocolo idéntico, se observaron aumentos similares en la salida de amiloide al interior de la sangre en comparación con los controles que habían recibido inyecciones de vehículo (CPM sangre: Vehículo 352 +/- 113 frente a 2E7 2397 +/- 353, y Vehículo 1281 +/- 312 frente a 2E7 5291 +/- 885; ANOVA con ensayo post-hoc LSD p<0,001 frente a vehículo).

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Modelos Transgénicos de Reducción de \beta-Amiloide del SNC 1. Carga de \beta-Amiloide después de una dosificación de 4 semanas en ratones TASTPM de 2 meses de edad

Se encerraron individualmente ratones transgénicos TASTPM macho y hembra (APPswe x PS1.M146V doble-mutantes, Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136) con edades comprendidas entre 61 y 65 días al inicio del estudio. Se asignaron números iguales de ratones a cada grupo de tratamiento (N = 12 por grupo) y se distribuyeron aleatoriamente de acuerdo con el sexo y la edad. Los grupos de tratamiento comprendían lo siguiente: A: MOPC21 (anticuerpo con especificidad desconocida, Holton y col (1987) J. Immunol 139(9) 3041-3049, control negativo), B: 2E7 (anticuerpo de ensayo). Todos los anticuerpos se disolvieron en PBS y se administraron por vía intraperitoneal. Independientemente del peso del animal, se administraron 300 \mug de anticuerpo. Los animales recibieron la dosificación dos veces por semana durante cuatro semanas. Un día después de la dosificación final, los animales se sacrificaron por una sobredosis con pentobarbital sódico. Los cerebros se diseccionaron y se hemiseccionaron. Se recogieron muestras de cerebro hemiseccionado en tubos eppendorf^{TM} de 2 ml pesados previamente y se congelaron inmediatamente. Posteriormente, las muestras se descongelaron, se volvieron a pesar y se añadió 1 ml de guanidina HCl 5 M que contenía comprimidos de Complete protease inhibitor^{TM} (Boehringer Mannheim), antes de homogeneizar las muestras y de incubarlas a 4ºC durante un periodo >90 min con agitación constante.

Después, las muestras se diluyeron 1 a 10 en tampón de ensayo (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05% + BSA al 1%), se sometieron a agitación vorticial y se centrifugaron a 20.000 G durante 20 min a 4ºC. El sobrenadante se retiró y se añadió como muestras por triplicado a la placa de ensayo.

Los niveles de A\beta40 y A\beta42 se midieron usando el inmunoensayo electroquimioluminiscente basado en placas sensibles (BioVeris^{TM}) empleando anticuerpos contra \beta-amiloide específicos del extremo C (contra A\beta40 o A\beta42) marcados con el marcador específico Oritag^{TM} para facilitar la detección (BioVeris^{TM}) usados para capturar A\beta40 o A\beta42, junto con un anticuerpo contra A\beta específico por el extremo N biotinilado. Se capturaron complejos de anticuerpo-A\beta con perlas revestidas con estreptavidina que se unen a los anticuerpos biotinilados (Dynabeads^{TM}, Dynal) incubadas durante una noche a temperatura ambiente con mezcla vigorosa y se ensayaron en un fotodetector BioVeris^{TM} M8. Se construyeron curvas patrón usando péptidos A\beta40 y A\beta42 humanos en tampón de ensayo que contenía la concentración requerida de Guanidina HCl. Los datos se analizaron usando un software de análisis estadístico Excel Robosage^{TM} y los niveles de A\beta se expresaron como pmol/g de tejido.

En este paradigma, el tratamiento con anticuerpo 2E7 redujo la carga de A\beta42 del SNC en el 37% (p<0,001) y la carga de A\beta40 del SNC en el 23% (p<0,001).

En los estudios posteriores en condiciones experimentales similares, el anticuerpo 2E7 redujo la carga de A\beta42 del SNC en el 38% (Estudio 1, sólo machos), el 22% (Estudio 2, no significativo) y el 39% (Estudio 3, machos, p = 0,001) y el 13% (Estudio 3, hembras, no significativo) en comparación con los animales tratados con PBS. En estos estudios, 2E7 también redujo la carga de A\beta40 del SNC en el 18% (Estudio 3, machos, p = 0,017) y ofreció una reducción no significativa en A\beta40 del SNC en el 25% (Estudio 1, sólo machos), <1% (Estudio 2) y un aumento no significativo del 3% (Estudio 3, hembras) en comparación con los animales tratados con PBS.

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2. Carga de \beta-Amiloide después de una dosificación de 4 meses en ratones TASTPM de 4 meses de edad

En resumen, a ratones transgénicos TASTPM de 4 meses de edad se les administraron 300 \mug de anticuerpo una o dos veces por semana a través de la vía intraperitoneal (i.p.). Después de 4 meses de dosificación, se midieron los niveles de \beta-amiloide del SNC por ELISA y se midió la carga de placas por inmunohistoquímica. Entre las edades de 4 y 8 meses, la carga de \beta-amiloide del SNC aumenta exponencialmente y por consiguiente, se desarrolla rápidamente la patología de las placas (Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136).

Se encerraron individualmente ratones con edades comprendidas entre 120 y 128 días al inicio del estudio. Se asignaron números similares de ratones a cada grupo de tratamiento (N=20 ó 21 por grupo) y se distribuyeron aleatoriamente de acuerdo con el sexo y la edad. Los grupos de tratamiento comprendían lo siguiente: A: PBS (vehículo) administrado dos veces por semana, B: 2E7 administrado una vez por semana, C: 2E7 administrado dos veces por semana, D: PBS administrado una vez por semana. Se administró una dosis de 300 microgramos (un volumen de 79 microlitros) de 2E7 por vía intraperitoneal. Los animales tratados con vehículo recibieron el mismo volumen de PBS. Se administró la dosificación a los animales durante dieciocho semanas. Los ratones TASTPM pueden sufrir ataques espontáneos y como resultado varios animales murieron durante el transcurso del estudio. Los números finales fueron los siguientes A: 4 hembras, 9 machos; B: 5 hembras, 8 machos; C: 4 hembras, 9 machos; D: 2 hembras, 9 machos. Dos o cuatro días después de la dosificación final (números iguales por grupo) los animales se sacrificaron por sobredosis con pentobarbital sódico. Se tomó una muestra de la punta de la cola de cada ratón para confirmar el genotipo. Los cerebros se diseccionaron y hemiseccionaron. El hemisferio derecho se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4% y se procesó para un análisis histológico. El hemisferio izquierdo se recogió en tubos eppendorf^{TM} de 2 ml pesados previamente, se congeló en hielo seco y se almacenó a -80ºC para un análisis posterior del contenido de amiloide. Antes del análisis, se descongelaron muestras, se volvieron a pesar y se añadió 1 ml de guanidina HCl 5 M que contenía comprimidos de Complete protease inhibitor^{TM} (Boehringer Mannheim), antes de homogeneizar las muestras y de incubarlas a 4ºC durante un periodo >90 min con agitación constante.

Después, las muestras se diluyeron 1 a 10 en tampón de ensayo (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05% + BSA al 1%), se sometieron a agitación vorticial y se centrifugaron a 20.000 G durante 20 min a 4ºC. Los sobrenadantes se diluyeron adicionalmente 1:1000 y se añadieron como muestras por triplicado a la placa de
ensayo.

Los niveles de A\beta40 y A\beta42 se midieron de la misma manera que en el estudio de dosificación de 4 semanas.

Se usó un análisis de varianza utilizando como efectos fijados el tratamiento, el sexo y el programa de dosificación incluido en el modelo. También se incluyeron todas las interacciones entre los tres factores. No hubo diferencias significativas entre los dos programas de dosificación (una o dos veces por semana). Con este diseño experimental, en primer lugar pudo evaluarse si había alguna diferencia significativa entre los programas de dosificación y, en segundo lugar, como no había ninguna de estas diferencias significativas, los datos de los dos programas de dosificación pudieron combinarse, aumentando de esta manera la potencia del experimento al duplicar el número de ratones en el análisis.

En este paradigma, el tratamiento con anticuerpo 2E7 redujo la carga de A\beta42 del SNC en el 22,5% (p = 0,0152). Los niveles de A\beta40 del SNC también se redujeron en el 12,1%, pero esta cifra no alcanzó significado estadístico (p = 0,118).

Se realizó un análisis inmunohistoquímico complejo de estas muestras para definir el área de tejido cerebral que mostraba patología de placas. Se tomaron secciones de la corteza al nivel del núcleo caudado y de la corteza al nivel del hipocampo. Se tiñeron las secciones adyacentes con un anticuerpo específico para A\beta40 o A\beta42 o, como alternativa, con el tinte de amiloide Rojo Congo. Usando un software de análisis de imágenes, el área de la sección teñida para las placas se expresó como un porcentaje del área de la sección total.

Después de la fijación, se cortaron en corona mitades de los cerebros sumergidas en PFA en una matriz cerebral en secciones de 6 x 2 mm de espesor. Estas secciones de 2 mm se denominarán secciones A a F, siendo A la más rostral y F la más caudal. Las secciones A, B y C y D, E y F se pusieron en cassettes de inclusión separados numerados para cada animal. Los cassettes se mantuvieron en PFA hasta que estuvieron listos para el procesamiento y la inclusión.

La inclusión se realizó en un procesador de tejidos Citadel^{TM} 1000 (Shandon). Todos los tejidos recibieron el siguiente régimen de procesamiento:

IMS al 70% - 1 h

IMS al 100% - 3 x 1 h

etanol al 100% - 2 h

alcohol isobutílico al 100%; 1 x 2 h; 1 x 1,5 h

Histoclear^{TM} - 2 x 1,5 h

Cera de parafina - 2 x 2 h

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Después de finalizar el ciclo de procesamiento, las secciones de tejido incluidas en cera se transfirieron a moldes de base rellenos de cera de parafina fundida y se incluyeron utilizando un sistema de inclusión de parafina Histocentre^{TM} (Shandon). El tejido se incluyó de tal forma que las secciones A, B y C entraron en un molde; y las secciones D, E y F en un segundo molde. Esto se hizo para todas las series de secciones, es decir, cada cerebro hemiseccionado dio como resultado dos bloques de cera de tres secciones cada uno. Las secciones se pusieron en los moldes de tal forma que la superficie caudal de cada pieza se convirtiera en la superficie de corte futura. Se tuvo cuidado de asegurarse de que cada sección estaba bien apretada en el molde de forma que cada corte de microtomo se realizara en paralelo. Después, el cassette de procesamiento perforado se puso cuidadosamente en cada molde, que posteriormente se llenó con cera fundida. Los bloques incluidos después se enfriaron en la placa refrigerada hasta que pudieron extraerse de los moldes. Los bloques se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se requirieron para realizar los cortes con el microtomo. Los bloques se cortaron aleatoriamente y se pusieron secciones de 5 micrómetros sobre portaobjetos recubiertos con gelatina marcados previamente (Superfrost^{TM}, Erie Scientific Company). Se aplicaron dos secciones en cada portaobjetos. Siempre que fue posible, se montaron secciones consecutivas y los portaobjetos se numeraron consecutivamente del 1 al 25. Se tomaron cincuenta secciones (25 portaobjetos) de cada bloque. Los portaobjetos se secaron en una placa caliente y después se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se utilizaron.

El análisis inmunohistoquímico se realizó en series de 30 portaobjetos. En cada portaobjetos, la sección superior se marcó con un anticuerpo A\beta40 (G30, policlonal de conejo que reconoce x-40 \beta-amiloide), la sección inferior con el anticuerpo A\beta42, 20G10, anticuerpo monoclonal que reconoce x-42 \beta-amiloide. Se marcó un mínimo de 5 secciones por anticuerpo y por bloque.

El marcaje se realizó como se indica a continuación. Después de retirar la cera por medio de Histoclear y alcoholes graduados, las secciones se sumergieron en ácido fórmico al 85% durante 8 minutos y después se bloquearon en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 30 minutos para bloquear las peroxidasas endógenas. Se aplicaron anticuerpos G30 y 20G10 durante una noche a diluciones 1:1000, dejándose las secciones a 4ºC. El revelado de las secciones se realizó con los anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón biotinilados respectivos. El desarrollo de color se realizó con un kit de tinción de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB^{TM}, Vector Labs). Las secciones se tiñeron brevemente con un tinte de contraste de hematoxilina de Mayer antes de hidratarse, aclararse y taparse con un cubreobjetos.

Las secciones se dejaron secar durante al menos 48 horas antes de observarse al microscopio. Las imágenes se capturaron en un microscopio Leica DMRB^{TM} equipado con una cámara digital. Las imágenes se analizaron usando el software Qwin^{TM} (Leica) y los resultados se presentaron como porcentaje del área de sección que estaba marcada por el anticuerpo contra A\beta.

Se usó un análisis de varianza con tratamiento, sexo y programa de dosificación incluido en el modelo como efectos fijados. También se incluyeron todas las interacciones entre los tres factores. No hubo diferencias significativas entre los dos programas de dosificación (una o dos veces por semana). Con este diseño experimental, en primer lugar se pudo evaluar si había alguna diferencia significativa entre los programas de dosificación y, en segundo lugar, como no había ninguna diferencia significativa, los datos de los dos programas de dosificación pudieron combinarse, aumentando de esta manera la potencia del experimento al duplicar el número de ratones en el análisis.

En este paradigma, el tratamiento con anticuerpo 2E7 redujo la patología de las placas como se mide con un anticuerpo que reconoce A\beta42. La patología de las placas se redujo en el 27,1% (p = 0,0026) en la corteza al nivel del hipocampo y el 43% (p <0,0001) en la corteza al nivel del núcleo caudado. La patología de placas también se redujo cuando se midió con un anticuerpo que reconocía a A\beta40. La patología de placas se redujo en el 16,6% (p = 0,0421) en la corteza al nivel del hipocampo y el 17,3% (p = 0,0342) en la corteza al nivel del caudado.

No se observó ningún indicio de microhemorragia (determinada por Azul de Perls Prussian) en ningún ratón en este estudio tratado con vehículo o 2E7. Este procedimiento visualiza el hierro férrico (el hierro es un constituyente esencial de la hemoglobina que lleva el oxígeno presente en los glóbulos rojos) produciendo un compuesto azul insoluble. Todos los niveles de cerebro de todos los animales eran transparentes.

Modelos de cognición

Después de la dosificación durante 4 meses de ratones TASTPM de 4 meses de edad como se ha descrito anteriormente, estos ratones se sometieron a un ensayo en dos modelos de cognición: el ensayo de reconocimiento de objetos y el ensayo de acondicionamiento al miedo.

Ensayo de reconocimiento de objetos

El ensayo de reconocimiento de objetos aprovecha la tendencia natural de los animales a explorar nuevos objetos y se basa en la capacidad de los animales de reconocer un objeto que han explorado previamente (objeto conocido). Se ha notificado que los ratones TASTPM de ocho meses de edad muestran una deficiencia en la capacidad de distinguir entre objetos nuevos y conocidos (Howlett y col., 2004), lo que indica un rendimiento cognitivo alterado en estos animales. Sin embargo, en este estudio, los ratones TASTPM de 8 meses de edad tratados con vehículo no mostraron un deterioro cognitivo, es decir, pudieron distinguir entre objetos nuevos y conocidos. Por lo tanto, no hubo posibilidad de investigar ningún efecto terapéutico potencial resultante del tratamiento con 2E7.

Ensayo de acondicionamiento al miedo

El modelo de acondicionamiento al miedo se diseñó para ensayar la capacidad de los animales de correlacionar un estímulo doloroso previo con una señal contextual o de entrada y reconocerla cuando se presenta con el mismo contexto o señal después de un retraso de x horas. En este estudio, los ratones TASTPM de 8 meses de edad tratados con vehículo (una o dos veces por semana) mostraron una deficiencia en la diferenciación contextual indicativa de un deterioro cognitivo en estos animales. Esta deficiencia no se vio afectada por el tratamiento con 2E7 cuando se administró una o dos veces por semana.

Dosificación durante 4 meses en ratones TASTPM de 6 meses de edad

Este estudio implicó la administración de 2E7 (300 \mug i.p. dos veces por semana) a ratones TASTPM durante 4 meses, empezando a los 3 meses de edad. Los animales de control recibieron IgG2A en PBS. Como se ha descrito anteriormente, los cerebros se diseccionaron y hemiseccionaron. El hemisferio derecho se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4% y se procesó para la histología. El hemisferio izquierdo se recogió en tubos eppendorf^{TM} de 2 ml pesados previamente, se congeló en hielo seco y se almacenó a -80ºC para el análisis posterior del contenido de amiloide.

Se realizó un análisis preliminar de una sola sección de cada muestra de una selección aleatoria de muestras de cerebro (n = 6 vehículo, n = 7 grupo tratado con 2E7) por IHC usando el mismo protocolo general que se ha indicado anteriormente. El análisis estadístico (ensayo t de Student) demuestra que hubo una reducción significativa en la carga de placas de A\beta42 en el tálamo (71,9%, p = 0,007) y en el tálamo + corteza + hipocampo (54,1%, p = 0,022) en ratones que recibieron 2E7 pero sin cambios significativos en A\beta40.

Para la medición bioquímica de A\beta40 y A\beta42 en cerebro, las muestras se procesaron y se midieron como se ha indicado anteriormente (factor de dilución 1:10.000). A\beta42 se redujo significativamente (p = 0,01) en el 29,9% en los ratones que recibieron la dosificación de 2E7 (n = 12 control, n = 16 tratados). Las concentraciones de A\beta40 también se redujeron (22,6%), pero esta reducción no pudo alcanzar un significado estadístico (p = 0,052).

Clonación de Regiones Variables de Hibridoma Secuencias de Región Variable

Se extrajo el ARN total a partir de células de hibridoma 2E7 y después se generaron secuencias de ADNc del dominio variable de las cadenas pesada y ligera por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). El cebador directo para la RT-PCR fue una mezcla de cebadores degenerados específicos para secuencias líder del gen de inmunoglobulina murina y el cebador inverso fue específico para las regiones constantes del anticuerpo, en este caso IgG2a de isotipo murino para la cadena pesada y kappa murina para la cadena ligera. Los cebadores se diseñaron de acuerdo con la estrategia descrita por Jones y Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). La RT-PCR se realizó por duplicado para las dos secuencias de la región V para permitir la verificación posterior de las secuencias de la región V correctas. Los productos de la región V generados por RT-PCR se clonaron (Invitrogen TA Cloning Kit) y se obtuvieron los datos de secuencia.

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Secuencia de Aminoácidos de V_{H} de 2E7 (SEC ID Nº: 17)

100

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Secuencia de ADN de V_{H} de 2E7 (SEC ID Nº: 18)

4

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Secuencia de Aminoácidos de V_{L} de 2E7 (SEC ID Nº: 19)

5

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Secuencia de ADN de V_{L} de 2E7 ((SEC ID Nº: 20)

6

En las secuencias de aminoácidos están subrayadas las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR).

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Clonación y Expresión de las Quimeras de 2E7

Se generó un anticuerpo 2E7 quimérico (2E7c) que contenía las regiones V murinas parentales injertadas en la IgG1 humana (Fc mutado (L235A, G237A)) para la cadena pesada o regiones C kappa humanas para la cadena ligera para expresar material de anticuerpo recombinante que pudiera usarse para confirmar la clonación correcta de regiones V murinas funcionales. Se clonó ADN que codificaba regiones V de cadena ligera y de cadena pesada murinas de 2E7 y secuencias señal murinas endógenas en fase en los vectores de expresión de mamífero RLD-bshe (para la cadena pesada) y RLN-bshe (para la cadena ligera) que ya contenían regiones constantes humanas (Fc de IgG1 mutado (L235A, G237A) o C kappa humana, respectivamente).

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Elementos del vector de expresión RLD-bshe para la expresión de la cadena pesada:

7

(la posición de los elementos y el tamaño total del vector indicado anteriormente sólo tienen fines ilustrativos y dependerán del tamaño del inserto de la cadena de anticuerpo)

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Elementos del vector de expresión RLN-bshe para la expresión de la cadena ligera:

8

(la posición de los elementos y el tamaño total del vector indicado anteriormente sólo tienen fines ilustrativos y dependerán del tamaño del inserto de la cadena de anticuerpo)

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Se identificaron clones con las secuencias V_{H} y V_{L} clonadas correctamente y se prepararon plásmidos para la expresión en células CHO de cultivo en suspensión. El anticuerpo 2E7c expresado se purificó a partir del sobrenadante de cultivo celular por cromatografía de proteína A en un sistema FPLC, y después se ensayó la unión a A\beta por ELISA y SPR usando la tecnología Biacore^{TM}. Los resultados indicaron que se habían clonado y expresado las regiones V de ratón de 2E7 correctas, dando como resultado un anticuerpo funcional con características similares a las del anticuerpo 2E7 murino parental.

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Humanización de Cadena Ligera

Se seleccionó una secuencia aceptora humana con el Genpept ID CAA51135 (SEC ID Nº: 24) y el Nº de acceso del Genbank X72467, que tenía una identidad del 77% a nivel de los aminoácidos (incluyendo las CDR) como región flanqueante aceptora. La construcción L1 es un injerto de las CDR murinas del dominio VL de 2E7 en esta región flanqueante aceptora.

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Humanización de Cadena Pesada

Se seleccionó la secuencia humana con el Nº de acceso del Genbank M99675 (SEC ID Nº: 21), un alelo del gen VH3-48 con una identidad del 74% a nivel de aminoácidos (incluyendo las CDR 1 y 2) con la región pesada variable de ratón de 2E7 como región flanqueante aceptora de cadena pesada humana junto con el minigen JH4 humano. Se diseñaron tres variantes de cadena pesada variable humanizada basándose en la secuencia de M99675 y JH4. H1 es un injerto de las CDR murinas usando la definición de Kabat con dos retromutaciones adicionales en la región flanqueante en las posiciones 93 y 94. H2 y H3 procedían de H1, pero incorporaron una mutación de región flanqueante adicional que era diferente en cada construcción; (posiciones 24 y 48 respectivamente; véase la Tabla 4).

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TABLA 4

9

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Construcción de ADN de Cadena Ligera y Pesada Humanizada

Se sintetizaron regiones V humanizadas de novo por acumulación de oligos solapantes y amplificación por PCR. Se incluyeron sitios de restricción para clonación en vectores de expresión de mamífero RLD-bshe y RLN-bshe y secuencias señal de inmunoglobulina humana derivadas de las regiones flanqueantes aceptoras humana elegidas. Después, se clonaron los ADN que codificaban las regiones V humanizadas (H1 (SEC ID Nº: 27), H2 (SEC ID Nº: 29), H3 (SEC ID Nº: 31), L1 (SEC ID Nº: 33)) junto con secuencias señal y sitios de restricción en fase en vectores de expresión de mamífero: H1, H2 y H3 en RLD-bshe para generar ADN que codificaba tres cadenas pesadas mutadas de Fc de IgG1 humana de longitud completa conteniendo cada una mutaciones L235A y G237A, H1 de longitud completa (SEC ID Nº: 35), H2 de longitud completa (SEC ID Nº: 37) y H3 de longitud completa (SEC ID Nº: 39); L1 se clonó en fase en RLN-bshe que contenía el ADN que codificaba la región constante kappa humana para generar ADN que codificaba una cadena ligera kappa humana de longitud completa (SEC ID Nº: 41).

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Ejemplos Representativos de Expresión de Combinaciones de Anticuerpo de Cadena Ligera y Pesada Humanizadas

Se transfectaron de forma transitoria células CHOK1 a pequeña escala con todas las combinaciones de construcciones de ADN de cadena ligera y pesada humanizada: L1+H1, L1+H2, L1+H3 (SEC ID Nº: 35 + 41, 37 + 41, 39 + 41) en placas de 6 pocillos. Se cultivaron hasta la confluencia células CHOK1 sometidas a pases en DMEM F12, con 5% de suero bovino fetal con un contenido de IgG ultra-bajo y glutamina 2 mM en placas de 6 pocillos. Las células confluentes se transfectaron con un total de 7,5 \mug de DNA: 30 \mug de lípido Transfast (Promega) en medio Optimem Glutamax (Invitrogen). Las células transfectadas se incubaron a 37ºC con 5% de CO_{2}. A las 72 horas, se recogieron los sobrenadantes y se ensayó la concentración de anticuerpo y después se ensayó la unión a A\beta humano por ELISA. La región L1 humanizada combinada con las tres cadenas pesadas humanizadas expresaron el anticuerpo completo que se unía a A\beta humano.

También se expresaron anticuerpos humanizados en transfecciones de células CHOK1 transitorias a gran escala usando la administración liposomal de ADN (por ejemplo, TransFast (Promega)) y expresión en frascos de cultivo. Para la optimización de los niveles de expresión en transfecciones transitorias, se usó una relación de ADN de vector de expresión entre cadena pesada y cadena ligera de 1:6. El material de la transfección transitoria se purificó usando columnas ProSepA o FPLC con columnas ProSepA HiTrap.

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Evaluación de Variantes Humanizadas de 2E7 H1L1, H2L1 y H3 L1 en ELISA de Unión a \beta-Amiloide

Se evaluaron variantes humanizadas H1L1, H2L1 y H3L1 de 2E7 con respecto a la unión al péptido A\beta humano (1-40) biotinilado en el extremo C. El 2E7 quimérico se usó como referencia. Las Tablas 5-7 muestran los resultados con diversos lotes de material purificado a partir de las transfecciones transitorias a gran escala.

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TABLA 5

10

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TABLA 6

11

TABLA 7

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Estos resultados indicaron perfiles de unión a A\beta muy similares para cada una de las variantes humanizadas derivadas de 2E7. La comparación de los valores de CE50 con el 2E7c mostró una pequeña pérdida de actividad de unión a A\beta que se había producido a lo largo del proceso de humanización.

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Comparación de Variantes Humanizadas de 2E7 por ELISA competitivo

Se evaluaron anticuerpos quiméricos y humanizados de 2E7c H1L1, H2L1 y H3L1 con respecto a su capacidad de inhibir la unión entre el péptido A\beta humano y el MAb 2E7 de ratón parental en un ELISA competitivo.

Se establecieron dos tipos de ELISA competitivo para comparar la actividad de unión a A\beta de las tres variantes humanizadas en comparación con el anticuerpo quimérico 2E7.

1) \beta-amiloide inmovilizado; Se inmovilizó péptido A\beta (1-40) humano biotinilado a través de estreptavidina en placas ELISA. Se añadió anticuerpo 2E7 de ratón a una concentración constante junto con una serie de dilución de anticuerpos variantes humanizados derivados de 2E7. Después se detectó el MAb 2E7 de ratón unido con conjugado de IgG anti-ratón. La Tabla 8 muestra los resultados de los dos ensayos.

TABLA 8

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2) \beta-amiloide en solución; se preincubó una concentración constante de \beta-amiloide con una serie de dilución de variantes de anticuerpo 2E7 humanizado - se añadió la mezcla que incluía amiloide complejado y libre durante un corto periodo de tiempo a pocillos que contenían MAb 2E7 de ratón inmovilizado. Después se detectó la cantidad de \beta-amiloide libre que aún estaba disponible para la unión al MAb 2E7 parental inmovilizado. La Tabla 9 muestra los resultados de los dos ensayos.

TABLA 9

14

Todas las variantes de anticuerpo humanizado inhibían la unión del MAb 2E7 de ratón al \beta-amiloide con un perfil muy similar. Los valores de CI_{50} generados para las variantes H2L1 y H3L1 fueron consistentemente próximos a los de la quimera 2E7c (cuando se usó), que tenía la mayor actividad inhibidora en los dos ensayos. Sin embargo, la variante H1L1 mostró una actividad inhibidora algo reducida en los dos ensayos, indicando una posible afinidad ligeramente menor para el \beta-amiloide.

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Análisis SPR Biacore^{TM} de 2E7, 2E7c, H1L1, H2L1, H3L1

Se evaluaron los parámetros cinéticos del MAb 2E7 de ratón recombinante, 2E7c quimérico y las variantes humanizadas H1L1, H2L1 y H3L1 que se unen al péptido beta-amiloide humano (1-40) y (1-42) usando el análisis Biacore^{TM} en un Biacore^{TM} 3000. Se usaron dos formatos de ensayo diferentes.

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Procedimiento A

(i) En resumen, se capturaron <20 unidades de resonancia del péptido beta-amiloide 1-40 (biotinilado en el extremo C) en un chip biosensor de estreptavidina (como el usado para la Tabla 10A).

Los anticuerpos se diluyeron en tampón HBS-EP y se pasaron sobre la superficie de estreptavidina/beta-amiloide a concentraciones que variaban de 0,001 nM-8 nM (para la Tabla 10A). Se realizaron dos procesos separados; cada proceso se realizó en una nueva superficie de estreptavidina/beta-amiloide. Los procesos 1 y 2 fueron esencialmente iguales aunque hubo algunas diferencias en los parámetros usados; el proceso 1 se realizó usando una superficie de chip en la que se capturaron 16 Unidades de resonancia de beta-amiloide, y se usaron concentraciones de anticuerpo de 0,001 nM-8 nM, un tiempo de asociación de 4 minutos y un tiempo de disociación de 20 minutos a un caudal de 50 \mul por minuto. Para el proceso 2, se capturaron menos de 10 RU de beta-amiloide y se usaron concentraciones de anticuerpo de 0,003125 nM-8 nM. El caudal y los tiempos de asociación fueron iguales a los del proceso 1, sin embargo el tiempo de disociación se redujo a 15 minutos.

(ii) Los beta-amiloides (1-40) y (1-42) se acoplaron a amina en diferentes superficies de un chip biosensor CM5 a un nivel de <20 unidades de resonancia (como se usa para la Tabla 10B).

Los anticuerpos se diluyeron en tampón HBS-EP y se pasaron sobre la superficie de biosensor/beta-amiloide a concentraciones que variaban de 1 nM-64 nM (como se usa para la Tabla 10B).

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Procedimiento B

En el segundo caso se invirtió el ensayo, ya que primero se capturaron los anticuerpos a un nivel de 1000-2500 unidades de resonancia en una superficie de anticuerpo policlonal de IgG anti-ratón (para el MAb 2E7 de ratón recombinante) o una superficie con proteína A (para H2L1 humanizado) de un chip biosensor CM5. El beta-amiloide (1-40) o (1-42) recién preparado se diluyó en tampón HBS-EP y se pasó sobre la superficie con anticuerpo capturado a concentraciones que variaban de 4-500 nM (Tabla 10C y 10D).

En los dos procedimientos, la regeneración se realizó por un pulso de H_{3}PO_{4} 100 mM y para la Tabla 10A los datos también se siguieron por un pulso de NaOH 50 mM. Se demostró que la superficie era estable y no se veía afectada por la regeneración. Todos los procesos utilizaron dobles referencias contra inyecciones blanco de tampón. El análisis se realizó usando el software de análisis Biacore^{TM} BIAevaluation versión 4.1.

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Resultados

Se usó el procedimiento A(i) para clasificar los anticuerpos por los datos cinéticos de unión al beta-amiloide. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 10A. Esto demuestra que el Mab 2E7 parental tiene una KD de 36,1 pM para el beta-amiloide capturado por estreptavidina. El anticuerpo de ratón-humano quimérico mostró una KD ligeramente reducida de 45,8 pM y las construcciones humanizadas varían de 54 (H2L1) a 93,6 pM (H1L1). En conclusión, esto demuestra que el procedimiento de humanización había sido muy satisfactorio y se había perdido muy poca afinidad. Las retromutaciones adicionales introducidas para H2 y H3 tenían un efecto pequeño pero beneficioso, aunque las diferencias entre las construcciones de H2 y H3 están dentro de las desviaciones típicas para estos experimentos.

TABLA 10A

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El procedimiento A(ii) se usó para confirmar que los dos restos aminoacídicos adicionales en el extremo C del beta-amiloide (1-42) en comparación con el beta-amiloide (1-40) no alteraban significativamente las propiedades de unión de 2E7 y H2L1. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 10B y confirmaron esto.

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TABLA 10B

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El procedimiento B se usó para negar los efectos de avidez que podían verse en el primer formato de ensayo. Los efectos de avidez, producidos por los dos dominios Fab de una sola molécula de anticuerpo que se une al mismo tiempo a dos moléculas de beta-amiloide adyacentes en la superficie del biosensor (o en formas multiméricas de beta-amiloide) aumentarían la afinidad aparente de la unión. Las mediciones de afinidad obtenidas usando el procedimiento B se muestran en la Tabla 10C.

TABLA 10C

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La prueba de que este ensayo proporcionó afinidades de unión 1:1 verdaderas se obtuvo cuando fragmentos Fab de H2L1, obtenidos por digestión con papaína, se unieron al beta-amiloide (1-40) capturado con estreptavidina por un procedimiento similar al procedimiento A(i) con una KD estimada de 2,4 nM.

El procedimiento B también se usó para confirmar que los dos restos aminoacídicos adicionales en el extremo C del beta-amiloide (1-42) en comparación con el beta-amiloide (1-40) no alteraban significativamente las propiedades de unión de un clon de secuencia idéntica al MAb 2E7 de ratón, denominado 2F11. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 10D.

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TABLA 10D

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En un estudio similar al estudio de mapeo de epítopes en 2E7 usando el Ensayo de Resonancia de Plasmón Superficial descrito anteriormente, H2L1 se comportó de forma similar al 2E7 en la unión al péptido que incluía los aminoácidos 1-12 (A\beta1, SEC ID Nº: 15) del péptido \beta-amiloide y no al péptido que incluía los aminoácidos 2-13 del péptido \beta-amiloide (A\beta2-13, SEC ID Nº: 44).

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Actividad de H2L1 en el Modelo de Salida de I^{125} \beta-Amiloide

Para comparar funcionalmente el H2L1 humanizado con el 2E7 monoclonal de ratón parental, los dos se ensayaron el mismo día en el modelo de salida de I^{125} \beta-amiloide descrito anteriormente.

Tanto H2L1 como 2E7 aumentaron significativamente las cuentas por minuto (CPM) en sangre en comparación con un control de vehículo. El recuento de CPM de radiactividad en sangre fue el siguiente (Vehículo: 1940\pm166; 2E7 10065\pm1386; H2L1 10913\pm1535). Los parámetros estadísticos usados fueron ANOVA con ensayo post-hoc LSD. n = 7 vehículo, n = 6 2E7, n = 6 H2L1, (p <0,001 para cada compuesto de ensayo frente a vehículo).

Estos datos proporcionan pruebas adicionales de que el anticuerpo H2L1 humanizado ha retenido las propiedades funcionales mostradas con la molécula 2E7 de ratón.

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Investigación de la Farmacocinética de H2L1 y 2E7

Se investigó la semivida terminal del anticuerpo de ensayo en ratones. El anticuerpo de ensayo se administró por una infusión intravenosa de 1 h a 4 ratones para conseguir una dosis diana de 400 \mug por ratón. Se tomaron muestras de sangre seriadas a partir de cada ratón hasta 5 días después de la dosificación (un ratón del grupo de 2E7 no completó el estudio y uno del grupo de H2L1 se retiró del análisis posterior porque se hizo evidente que la dosis no se había administrado i.v.). Los niveles de anticuerpo se midieron usando un ELISA de captura de \beta-amiloide.

El análisis de los datos indica que el anticuerpo H2L1 humanizado tiene una semivida terminal de aproximadamente 82 horas en ratones (Tabla 11), que es comparable a la del anticuerpo monoclonal de ratón parental 2E7 (aproximadamente 75 horas).

TABLA 11

19

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\quad

# mediana e intervalo

Cmáx

Concentración máxima en plasma observada.

Tmáx

Tiempo transcurrido hasta la concentración máxima en plasma observada

CLp

Aclaramiento total en plasma; Dosis/AUC_{(0-inf)}.

t^{1/2}

La semivida de fase terminal se determinó como la relación de ln2/z donde z es la constante de la velocidad en fase terminal; calculada usando un análisis de regresión lineal no ponderado (después de la transformación logarítmica) de los pares de concentración-tiempo que se produjeron después del inicio evaluado visualmente de la fase terminal de log-lineal.

Vss

Volumen de distribución en estado estacionario; CLp x MRT_{0-inf}.

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Efecto de H2L1 sobre la carga de amiloide periférica en primates no humanos de edad avanzada

Se realizó un estudio en monos Cynomolgus de edad avanzada (de aproximadamente 15 años) para investigar la relación de exposición-respuesta con respecto a la formación de complejos de amiloide/H2L1 y el aclaramiento y los posteriores efectos sobre los niveles de amiloide del CSF y el SNC. Se recogieron muestras de sangre y de CSF lumbar (tomadas con sedación con ketamina) semanalmente, 3 semanas antes de administrar la 1ª dosis de H2L1. Inmediatamente después del muestreo en la semana 3, los animales recibieron placebo (n = 10), 0,1 mg/kg (n = 5), 1 mg/kg (n = 5) o 10 mg/kg (n = 10) de H2L1 y después cada 2 semanas durante un periodo de 12 semanas. Se tomaron semanalmente muestras de sangre para realizar el análisis en plasma de H2L1 y A\beta_{42} total. Se recogieron muestras de CSF para la cuantificación de A\beta_{40/42} cada 2 semanas. Después de terminar el periodo de dosificación, los animales se sacrificaron para cuantificar en el cerebro el beta-amiloide por análisis bioquímico como se ha descrito anteriormente y para investigar las micro hemorragias. En el grupo de menor dosificación (0,1 mg/kg), los animales se sacrificaron de forma escalonada para evaluar el posible efecto del transcurso del tiempo en los niveles cerebrales como consecuencia de la terminación de la dosificación y, por lo tanto, la saturación de las reservas plasmáticas de amiloide.

Este estudio se aprobó por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de MACCINE Pte Ltd, o "Maccine" antes de iniciar la fase experimental. El número de protocolo de IACUC fue nº 08-2006. GSK ha realizado una visita al centro de Maccine y ha revisado su proceso ético y lo ha considerado aceptable.

Las muestras de plasma se diluyeron en serie 1:10 a 1:50000 y se añadieron a A\beta_{40} aplicado como un recubrimiento en placas ELISA. Se crearon curvas patrón que variaban de 0-10 \mug/ml de H2L1 en diluyente. Después de una incubación de una noche a 4ºC, H2L1 se visualizó usando IgG anti-humana-peroxidasa de rábano picante (Amersham - diluido 1:2000 en diluyente) y un sistema de detección de tetrametilbencideno. Después de una administración iv en bolo individual y repetida, los niveles plasmáticos de H2L1 parecían aumentar de una manera dependiente de la dosis. No hubo indicios de ausencia de linealidad severa en la farmacocinética, lo que indica que para la mayor parte del intervalo de dosificación, se consiguieron concentraciones molares en exceso de H2L1 en el plasma en comparación con los niveles de amiloide libre.

La A\beta_{42} total se midió en plasma puro usando un kit ELISA A\beta 1-42 disponible en el mercado (Innogenetics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, variando las curvas patrón de 500-7 pg/ml creado en el diluyente del kit. Las muestras y los patrones se incuban durante una noche a 4ºC antes del ensayo por duplicado de acuerdo con las instrucciones del kit. Debe indicarse que debido a la interferencia del anticuerpo de detección suministrado con el ensayo de A\beta_{42}, este kit no puede usarse para medir los niveles de A\beta_{42} libre, sino que mide el A\beta_{42} "total" aparente. Hubo un aumento dependiente de la concentración y de la dosis en A\beta_{42} (niveles mantenidos de aproximadamente 300, 125 y 25 pg/ml detectados después de 10, 1 ó 0,1 mg/kg de H2L1 respectivamente).

Por los datos del análisis, es probable que el aumento en el "A\beta_{42} total" se deba al resultado de una salida significativa de amiloide del exterior de las reservas plasmáticas, que parecía dependiente de las concentraciones de H2L1 >1 \mug/ml, y no parecían ser el resultado de la ausencia de aclaramiento del complejo. Esto fue evidente por la velocidad de eliminación del A\beta_{42} total así como la fluctuación en los niveles totales en un intervalo de dosificación.

Hasta la fecha sólo se han completado y analizado totalmente los análisis en plasma. Sin embargo, los análisis preliminares indican que había una tendencia hacia la reducción en el CSF y hacia el aumento en el hipocampo del nivel de A\beta42 "total" (medido como se ha descrito anteriormente en general) después del tratamiento con 10 mg/kg de H2L1.

En algunas secciones cerebrales, se detectaron pequeñas áreas de microhemorragia como se muestra por el procedimiento de tinción con Azul de Perls Prussian. Este procedimiento visualiza el hierro férrico (el hierro es un constituyente esencial de la hemoglobina que lleva el oxígeno presente en los glóbulos rojos) produciendo un compuesto azul insoluble. Sin embargo, no hubo ninguna diferencia en la incidencia entre los animales tratados con vehículo y los tratados con fármaco.

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Análisis en Macacos Cynomolgus de edad avanzada de placas de beta amiloide en el cerebro y del beta amiloide total en el plasma

En monos cynomolgus se han presentado parámetros en líquido cefalorraquídeo (CSF) y en tejidos de la AD humana. Se ha demostrado que el mono cynomolgus de edad avanzada tiene indicios de deposición de amiloides. (Covance, The cynomolgus monkey as a model for Alzheimer's disease. En: Buse E, Habermann G, Friderichs-Gromoll S, Kaspereit J, Nowak P y Niggemann K, editores. Poster Presentation at the 44th Annual Meeting of the Society of Toxicology, New Orleans, Louisiana, del 6 al 10 de marzo de 2005). La posibilidad de que H2L1 induzca una respuesta inapropiada (tal como encefalitis) en un cerebro envejecido se investigó en monos hembra que habían tenido crías previamente de edad avanzada, de aproximadamente 20 años. Además, también se investigó la seguridad, las micro hemorragias relacionadas con el tratamiento, la neutralización/aclaramiento del material de ensayo, la hipersensibilidad y la enfermedad por complejos inmunes después de la administración intravenosa durante 8 semanas en intervalos de dos semanas. Además, se analizaron los niveles de A\beta_{40/42} en muestras del SNC y de sangre.

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Diseño del Estudio

A grupos de 5 (grupo 1), 9 (grupo 2) o 10 (grupo 3) monos cynomolgus hembra geriátricos se les administraron 0 (vehículo), 50 ó 100 mg/kg/dosificación al día de H2L1 en vehículo (4 ml/kg) una semana sí y otra no durante un periodo de 8 semanas, por vía intravenosa, por medio de una administración en embolada lenta. El vehículo consistía en acetato sódico trihidrato a 6,81 mg/ml, edetato disódico dihidrato a 0,0186 mg/ml, polisorbato 80 a 0,2 mg/ml y base L-Arginina a 10 mg/ml, y el pH fue de 5,5. Los niveles de dosificación se eligieron para investigar niveles de dosificación que eran 5 y 10 veces los niveles de dosificación clínica deseada.

Las siguientes evaluaciones se realizaron antes de la dosificación, diariamente (signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos), en la semana 4 y en la semana previa a la necropsia: observaciones en el animal vivo, peso corporal, temperatura corporal, hematología, química clínica (incluyendo el análisis del líquido cefalorraquídeo [CSF]), urianálisis y determinación de citoquinas en CSF. Después de la necropsia, se determinaron los pesos de los órganos, observaciones macroscópicas y observaciones microscópicas del cerebro, médula espinal cervical y lesiones generales en todos los animales. Después de cada dosificación se realizó una evaluación toxicocinética.

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Resultados

No hubo muertes no programadas, y no se produjeron signos que indicaran una influencia del artículo de ensayo sobre el estado general de los animales a las dosis administradas. Las únicas observaciones destacadas en la patología clínica (hematología y química del suero), según se concluyó, estaban relacionadas con la edad y no con el artículo de ensayo.

La exposición sistémica a H2L1 (medida por AUC_{0-\tau} y C_{máx}) aumentó aproximadamente en proporción a la dosis. Para los dos grupos de dosificación, no hubo un cambio marcado (\geq2 veces) en la exposición sistémica entre la 1ª dosis y la 4ª dosis de los periodos de muestreo.

No se detectó ningún signo de reacciones inflamatorias en el cerebro detectadas por análisis del CSF, y no hubo ningún hallazgo macroscópico o microscópico en la necropsia que sugiriera la influencia del artículo de ensayo, específicamente no se produjeron microhemorragias ni encefalitis.

Este estudio se realizó de acuerdo con las regulaciones de la Buena Práctica de Laboratorio como se indica en la Ley Alemana sobre Productos Químicos, anexo 1 y 2 en el artículo 19a Chemikalien Gesetz, junio de 2002, los Principios de OECD de la Buena Práctica de Laboratorio (revisado en 1997, expedido en enero de 1998) ENV/MC/CHEM (98) 17 y el Documento Consenso "The Application of the OECD Principles of GLP to the Organisation and Management of Multi-Site Studies" ENV/JM/MONO(2002)9. Los estudios realizados de acuerdo con las regulaciones y normas anteriores se consideraron aceptables para las autoridades reguladoras de la FDA de Estados Unidos.

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Análisis de la Carga de Placas en el SNC

Los hemisferios cerebrales izquierdos de los macacos cynomolgus tratados con vehículo del estudio anterior se analizaron por inmunohistoquímica. Una sección en corona, a nivel del surco temporal medio que contenía partes del giro dentado y del hipocampo se procesó en cera como se ha descrito anteriormente. Para la inmunohistoquímica, las secciones se marcaron con un anticuerpo pan-A\beta (1E8, anticuerpo monoclonal inducido contra A\beta 13-27) o con el anticuerpo A\beta42 (20G10, anticuerpo monoclonal que reconoce a A\beta x-42) y el marcaje se realizó como se ha indicado anteriormente. Para cada sección se realizó un recuento visual del número de placas. Los tejidos de los cinco monos cynomolgus tratados con vehículo mostraron indicios de placas de A\beta parenquimáticas. También hubo indicios de A\beta marcado cerebrovascular y A\beta intraneuronal.

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Análisis de complejos de beta amiloide/anticuerpo en plasma

Se realizó un análisis bioquímico en muestras plasmáticas a partir de dos momentos (al final de las semanas 4 y 8 después de iniciar la dosificación) de animales que recibieron 50 mg/kg (n = 9) o 100 mg/kg (n = 10) de H2L1 o controles que recibieron vehículo (n = 5). Se analizaron muestras duplicadas de 100 \mul usando el kit ELISA de A\beta 1-42 Innogenetics disponible en el mercado, incubadas durante una noche a 4ºC. Las muestras de control se analizaron tanto puras como a una dilución 1:10 (usando el diluyente suministrado), mientras que las muestras de los animales que recibieron la dosificación se ensayaron puras y a 1:25. Se analizaron los valores de absorbancia posteriores, deduciéndose los valores de absorbancia desconocidos en pg/ml usando curvas patrón, y después se corrigieron para cualquier dilución del ensayo. Los niveles plasmáticos totales de A\beta42 obtenidos a partir de estas muestras se proporcionan en la Tabla 12 que se presenta más adelante (las cifras están en pg/ml \pm SE); todas las muestras de los animales tratados con H2L1 contenían niveles significativamente mayores de A\beta42 (p <0,001 por ensayo t de student) que en los grupos de control.

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TABLA 12

20

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Los datos presentados se obtuvieron a partir de muestras no diluidas. Los resultados de las muestras puras no se usaron, ya que muchos puntos de datos eran mayores que el patrón superior o debido a la limitación del volumen de la muestra, sólo se ensayaron como un solo punto.

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Proceso de producción

Pueden usarse vectores de expresión que codifican H2L1 y unirse operativamente a marcadores de selección amplificables tales como la DHFR o la glutamina sintetasa para transfectar o transducir líneas de células CHO parentales apropiadas (por ejemplo, CHODG44 o CHOK 1) para producir líneas celulares modificadas por ingeniería genética adecuadas para la producción de anticuerpos monoclonales a gran escala (como revisión, véase Bebbington and Hentschel DNA Cloning Volume III; A practical approach (editado por Glover DM) (Oxford IRL press, 1987). Para aumentar los niveles de expresión, la secuencia codificante puede optimizarse con respecto a sus codones para evitar motivos de secuencia de actuación cis y contenidos extremos de GC (altos o bajos). Las SEC. ID Nº: 42 y Nº: 43 ilustran esta secuencia codificante para la cadena pesada H2 y la cadena ligera L1. La producción a gran escala puede realizarse en biorreactores de depósito de agitación usando medio sin componentes de origen animal, seguido de purificación. Esto puede comprender la clarificación del material recogido, seguido de cromatografía de afinidad en proteína A, y la purificación adicional usando intercambio iónico (por ejemplo, catiónico) y operaciones en unidades de cromatografía de modo mixto (por ejemplo, hidroxiapatita cerámica). La nanofiltración para la eliminación de virus se continúa por una etapa de ultrafiltración/diafiltración final que permite una formulación adecuada para la vía de administración deseada.

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Ejemplo de Formulación farmacéutica

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Secuencias de Aminoácidos de regiones V Flanqueantes Aceptoras y Variantes Humanizadas

Región V flanqueante aceptora de cadena pesada de M99675, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 21)

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ADN de región V flanqueante aceptora de cadena pesada de M99675 (SEC ID Nº: 22)

24

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Secuencia de aminoácidos de región V flanqueante aceptora de cadena ligera de CAA51135 (SEC ID Nº: 24)

25

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ADN de región V flanqueante aceptora de cadena ligera de CAA51135 (SEC ID Nº: 25)

26

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Variante H1 de región V de cadena pesada humanizada, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 26)

27

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Secuencia codificante de ADN de variante H1 de región V de cadena pesada humanizada (SEC ID Nº: 27)

28

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Variante H2 de región V de cadena pesada humanizada, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 28)

29

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ADN de variante H2 de región V de cadena pesada humanizada (SEC ID Nº: 29)

30

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Variante H3 de región V de cadena pesada humanizada, secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 30)

31

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ADN de variante H3 de región V de cadena pesada humanizada (SEC ID Nº: 31)

32

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Secuencia de aminoácidos de variante L1 de región V de cadena ligera humanizada (SEC ID Nº: 32)

34

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ADN de variante L1 de región V de cadena ligera humanizada (SEC ID Nº: 33)

35

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Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de H1 madura (Fc mutado, mutación doble en negrita) (SEC ID Nº: 34)

36

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ADN de longitud completa de H1 (SEC ID Nº: 35)

37

\newpage

Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de H2 madura (Fc mutado, doble mutación en negrita) (SEC ID Nº: 36)

39

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ADN de longitud completa de H2 (SEC ID Nº: 37)

41

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42

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Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de H3 madura (Fc mutado, mutación doble en negrita) (SEC ID Nº: 38)

43

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ADN de longitud completa de H3 (SEC ID Nº: 39)

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Secuencia de aminoácidos de cadena ligera madura (SEC ID Nº: 40)

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ADN de longitud completa de L1 (SEC ID Nº: 41)

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ADN de cadena pesada de H2 optimizada (SEC ID Nº: 42)

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49

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ADN de cadena ligera L1 optimizada (SEC ID Nº: 43)

50

Claims (14)

1. Un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena V_{H} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 26 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 32.

2. Un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena V_{H} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 28 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 32.

3. Un anticuerpo terapéutico que comprende una cadena V_{H} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 30 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 32.

4. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que es del isotipo IgG1.

5. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que carece de las funciones de a) activación del complemento por la ruta clásica y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.

6. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que los restos 235 y 237 se han mutado a alanina.

7. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende una cadena pesada que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 34, 36 ó 38 y una cadena ligera que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 40.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo terapéutico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.

9. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar en el tratamiento de una enfermedad relacionada con el péptido \beta-amiloide.

10. Un anticuerpo terapéutico de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad relacionada con el péptido \beta-amiloide es la enfermedad de Alzheimer.

11. Un anticuerpo o fragmento de este que comprende un dominio V_{H} que tiene la secuencia SEC ID Nº:17 y un dominio V_{L} que tiene la secuencia SEC ID Nº: 19.

12. Un polinucleótido que codifica una cadena pesada del anticuerpo terapéutico, en el que el polinucleótido comprende la secuencia indicada en las SEC ID Nº: 35, 37, 39 ó 42.

13. Un polinucleótido que codifica una cadena ligera del anticuerpo terapéutico, en el que el polinucleótido comprende la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 41 ó 43.

14. Un procedimiento para preparar un anticuerpo terapéutico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento comprende la expresión de un polinucleótido que codifica dicho anticuerpo en una célula huésped.