BRPI0709246A2 - anticorpo terapêutico, composição farmacêutica, método de tratamento de um paciente humano acometido com uma doença relacionada com peptìdeo beta-amilóide, uso de um anticorpo terapêutico, e, anticorpo ou fragmento do mesmo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO TERAPêUTICO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODO DE TRATAMENTO DE UM PACIENTE HUMANO ACOMETIDO COM UMA DOENçA RELACIONADA COM PEPTIDEO BETA-AMILóIDE, USO DE UM ANTICORPO TERAPêUTICO, E, ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO Anticorpos que se ligam em peptídeo <225>-amilóide de humano,métodos de tratamento com citados anticorpos de doenças ou distúrbios caracterizadas(os) por níveis de <225>-amilóide ou depósitos de <225>-amilóide elevados, composições farmacêuticas compreendendo citados anticorpos e métodos de manufatura.

Description

ANTICORPO TERAPÊUTICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM PACIENTE HUMANO ACOMETIDO COM UMA DOENÇA RELACIONADA COM PEPTÍDEO BETA-AMILÓIDE, USO DE UM ANTICORPO TERAPÊUTICO, E, ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO"

Campo da invenção

A presente invenção refere-se aos anticorpos que se ligam em peptídeo β-amilóide e em particular em peptídeo β-amilóide de humano. A presente invenção também se refere aos métodos de tratamentos de doenças ou distúrbios caracterizadas(os) por níveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados, particularmente mal de Alzheimer, com os citados anticorpos, às composições farmacêuticas compreendendo citados anticorpos e aos métodos de manufatura. Outros aspectos da presente invenção serão evidentes a partir da descrição abaixo.

Fundamentos da invenção

Mal de Alzheimer (AD) é a causa mais comum de declínio cognitivo relacionado com a idade, afetando mais de 12 milhões de indivíduos em todo o mundo (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Suppl 1055-1057). Os estágios mais iniciais da doença são caracterizados por uma perda progressiva de memória com declínio cognitivo e déficits comportamentais e de linguagem associados. Nos estágios mais tardios da doença, os pacientes desenvolvem amnésia global e têm grandemente reduzida a função motora. Morte tipicamente ocorre 9 anos após a diagnose e é muitas vezes associada com outras condições, tipicamente pneumonia (Davis K.L. e Samules S.C. (1998) em Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J. e Coyle J.T. (McGraw-Hill, New York pp. 267-316)). Terapias correntes representam abordagens sintomáticas, focalizando sobre o alívio do enfraquecimento cognitivo e melhoria dos sintomas comportamentais associados com a etiologia da doença progressiva. Naprática estes tratamentos proporcionam apenas um benefício cognitivo de vida curta com o nível de enfraquecimento cognitivo relatado apenas em durar até 2 anos. É enorme o potencial para uma terapia modificadora de doença que torna mais lenta e possivelmente interrompe a progressão da doença. Tais abordagens proporcionariam melhorias radicais e prolongadas da qualidade de vida de pacientes e em uma maneira importante de suas carreiras bem como reduziriam os custos de assistência médica totais enormes desta doença.

Diagnose clínica de mal de Alzheimer é baseada em uma combinação de testes físicos e mentais que acarretam uma diagnose de mal de Alzheimer possível ou provável. Após a morte a doença é confirmada por indicações neurológicas caracterizadas no cérebro, que incluem a deposição de Αβ em placas parenquimais e vasos cerebrais, formação intraneuronal de feixes neurofibrilares, perda sináptica e perda de subpopulações neuronais em regiões específicas do cérebro (Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl 53: 141-145).

Uma pletora de evidência genética, histológica e funcional sugere que o peptídeo β-amilóide (Αβ) é a chave da progressão do mal de Alzheimer (Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81:741-766).

Αβ é conhecido em ser produzido através da clivagem da proteína precursora de beta-amilóide (também conhecida como APP) por uma enzima aspartil-protease conhecida como BACEl (também conhecida como β-secretase, Asp2 ou Memapsina-2) (De Strooper, B. e Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). Em adição à deposição parenquimal e vascular, tem sido postulado que formas oligoméricas solúveis de Αβ contribuem para o início de AD e podem afetar a função neuronal inicialmente por enfraquecimento da função sináptica (Lambert et. al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95: 64486453). Embora placas amilóides insolúveis sejam encontradas inicialmente em AD e em MCI, os níveis de agregados de Αβ solúveis (referidos como oligômeros ou ligantesdifusíveis derivados de Αβ (ADDLs)) também são aumentados nestes indivíduos, e níveis de Αβ solúvel correlacionam-se melhor com degeneração neurofibrilar, e a perda de marcadores sinápticos do que o fazem as placas amilóides (Naslund et. al. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19). O Αβ42 elevadamente amiloidogênico e as formas aminoterminalmente truncadas de Αβχ-42 são as espécies predominantes de Αβ encontradas em ambas as placas difusas e senis (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270:701β-7016). Os níveis relativos de Αβ42 parecem ser o regulador chave de agregação de Αβ em placas amilóides, de fato tem sido mostrado que Αβ42 agrega-se mais prontamente in vitro do que as outras formas de Αβ (Jarrett, JT (1993) Βίθϋ1ΐ6πιΐ8ΐι·γ.32:469β-4697) como tal Αβ42 tem sido implicado como a molécula iniciadora na patogênese de AD (Younkin SG5 (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289292). Embora Αβ42 seja um produto menor do metabolismo de APP, deslocamentos pequenos em sua produção estão associados com grandes efeitos sobre a deposição de Αβ portanto tem sido postulado que redução de apenas Αβ42 pode ser uma maneira eficaz de tratamento de AD (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). Em suporte disto, tem sido relatado que mutações em genes de presenilina e de proteína precursora de amilóide (APP) aumenta predominantemente os níveis de Αβ42 e portanto encurta o tempo para o início do mal de Alzheimer (AD) (Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3:67-99). Contudo deve ser notado que a velocidade de deposição também é dependente do catabolismo e da depuração de Αβ.

Modelos animais de deposição de amilóide têm sido geradospara sobreexpressar transgenes de humano mutantes em camundongos. Sobreexpressão em camundongos de transgenes de APP de humano únicos tipicamente desenvolve depósitos de β-amilóide semelhantes à placa cerebral de 12 semanas de idade (Games D. et al., (1995) Nature 373: 52β-527; HsiaoΚ. et al., (1996) Science 274: 99-102)), enquanto que camundongo trazendo ambos os transgenes de presenilina-1 (PS-I) e de APP de humano mutante tipicamente desenvolve depósitos de β-amilóide semelhantes a placa cerebral tão cedo quando 2 meses de idade (Kurt M.A. et al., (2001) Exp.Neurol. 171: 59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244.

Tem se tornado cada vez mais evidente que o transporte de Αβ exógeno entre o sistema nervoso central (CNS) e plasma desempenha um papel na regulação de níveis de amilóide do cérebro (Shibata, et al (2000) J Clin Invest 106: 1489-1499), com CSF Αβ sendo rapidamente transportado do CSF para plasma. Portanto vacinação ativa com peptídeos Αβ ou administração passiva de anticorpos Αβ específicos rapidamente se liga em Αβ periférico alterando o equilíbrio dinâmico entre o plasma, CSF e finalmente o CNS. De fato agora há uma pletora de estudos demonstrando que ambas estas abordagens podem abaixar os níveis de Αβ, reduzem a patologia de Αβ e proporcionam benefício cognitivo em vários modelos transgênicos de amiloidose. Estudos limitados também têm sido conduzidos em espécies superiores. Macacos vervet caribenhos (16-10 anos de idade) foram imunizados com peptídeo Αβ durante 10 meses. Níveis de Αβ40 foram elevados 2-5 vezes no plasma que alcançaram o pico em 25 Id enquanto que os níveis de Αβ40 e Αβ42 em CSF foram significativamente decrescidos em 100d e retornaram depois para a linha base. Esta redução em CSF foi acompanhada por uma redução significativa em carga de placa (Lemere, CA (2004) Am J Pathology 165: 28β-297). Aumentos similares em níveis de Αβ em plasma também foram detectados após imunização de macacos Rhesus velhos (15-20 anos de idade) (Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18: 44:46.

A primeira terapia imune tendo por alvo amilóide cerebral foi AN-1792 de Elan/Wyeth, uma vacina ativa. Este tratamento foi terminado após o desenvolvimento de sinais clínicos consistentes commeningoencefalite. Análises de subgrupo sugeriram que o tratamento tornou mais lento o declínio da função cognitiva (Nature Clin Pract Neurol (2005) 1:84-85). Análise após a morte dos pacientes também mostrou evidência de depuração de placa (Gilman S. et al, (2005) Neurology 64 (9) 155β-1562). Bapineuzumab (AAB-001, Elan/Wyeth),tem sido mostrado que uma terapia com MAb passiva melhora significativamente os escores de cognição em um estudo de segurança de fase I pequeno.

Outras doenças ou distúrbios caracterizadas(os) por níveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados incluem enfraquecimento cognitivo (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging "Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer1S disease: Prediction by plasma amyloid beta 42, mediai temporal Iobe atrophy and homocysteine" no prelo, e-publicado aos 19 de outubro de 2006), hemorragia cerebral hereditária com β-amiloidose do tipo holandês, angiopatia β-amilóide cerebral e vários tipos de demências degenerativas, tais como aquelas associadas com doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, degeneração basal cortical e tipo de corpo de Lewis difuso de mal de Alzheimer (Mollenhauer B (2007) J Neural Transm e-published 23 Feb 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5:655-60) e síndrome de Down (Mehta, PD (2007) J Neurol Sei. 254:22-7). Sumário da invenção

Em uma modalidade da presente invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou um fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-12 (SEQ ID No: 15) com constante de equilíbrio KD menor do que 100 pM mas não se liga em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44), ambas as determinações sendo feitas em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando peptídeo capturado sobre pastilha de estreptavidina.

Em outra modalidade da presente invenção é proporcionadoum anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-12 (SEQ ID No: 15) com constante de equilíbrio KD menor do que 100 pM e possui uma constante de equilíbrio KD para ligação em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44) que é 100 vezes maior do que aquela para peptídeo 1-12 (SEQ ID No: 15), ambas as determinações sendo feitas em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando peptídeo capturado sobre pastilha de estreptavidina.

Em outra modalidade da presente invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-12 (SEQ ID No: 15) com constante de equilíbrio KD menor do que 100 pM e possui uma constante de equilíbrio KD para ligação em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44) que é 10.000 vezes maior do que aquela para peptídeo 1-12 (SEQ ID No: 15), ambas as determinações sendo feitas em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando peptídeo capturado sobre pastilha de estreptavidina.

Em outro aspecto o ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando peptídeo capturado sobre pastilha de estreptavidina é o ensaio de ressonância de plasmon de superfície descrito no Exemplo abaixo. Em outro aspecto o ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando peptídeo capturado sobre pastilha de estreptavidina é o Método A(i) descrito sob SPR Biacore™ Analysis abaixo.

Em uma modalidade alternativa da presente invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-40 com constante de equilíbrio KD menor do que 10 nM mas não se liga em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44), ambas as determinações sendo feitas no ensaio de ressonância de plasmon de superfíciedescrito no Método B dos Exemplos abaixo.

Em outra modalidade alternativa da presente invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-40 com constante de equilíbrio KD menor do que 10 nM e possui uma constante de equilíbrio KD para ligação em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44) que é 100 vezes maior do que aquela para peptídeo 1-12 (SEQ ID No: 15), ambas as determinações sendo feitas no ensaio de ressonância de plasmon de superfície descrito no Método B dos Exemplos abaixo.

Em outra modalidade alternativa da presente invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico, que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-40 com constante de equilíbrio KD menor do que 10 nM e possui uma constante de equilíbrio KD para ligação em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44) que é 10.000 vezes maior do que aquela para peptídeo 1-12 (SEQ ID No: 15), ambas as determinações sendo feitas no ensaio de ressonância de plasmon de superfície descrito no Método B dos Exemplos abaixo.

Em uma modalidade da presente invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide e que compreende as seguintes CDRs:

CDRHl: DNGMA (SEQ ID No: 1)

CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID No:2)

CDRH3: GTWFAY (SEQ ID No:3)

dentro de uma região variável de cadeia pesada de humano originária da família de gene VH3 e:

CDRLl: RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID No:4)CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID No:5)

CDRL3: SQTRHVPYT (SEQ ID No:6)

dentro de uma região variável de cadeia leve de humano originária da seqüência de aminoácidos descrita em entrada CAA51135 de GenPept (SEQ 5 ID No:24).

Em todo este relatório descritivo, os termos "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" seguem o sistema de numeração de Kabat como descrito em Kabat et al.; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987. Portanto o seguinte define as CDRs de acordo com a invenção:

CDR: ResíduosCDRHl: 31-35BCDRH2: 50-65CDRH3: 95-102CDRL1: 24-34CDRL2: 50-56CDRL3: 89-97

A nomenclatura da família de gene VH3 e gene de imunoglobulina relacionado é descrita em Matsuda et al. (Journal of Experimental Medicine, 188:2151-2162, 1998) e Lefranc & Lefranc (The Immunoglobulin Factsbook. 2001. Academic Press: Londres).

Em uma modalidade particular, a região variável de cadeia pesada de humano origina-se de:

• Um gene V selecionado do subconjunto de membros de família VH3: νΗβ-48, νΗβ-21, VHp-11, νΗβ-7, νΗβ-13, νΗβ-74, νΗβ-64, Ηβ-23, νΗβ-38, νΗβ-53, νΗβ-66, νΗβ-20, νΗβ-9 & νΗβ-43

• Um gene V selecionado do subconjunto de membros de família VH3: νΗβ-48, νΗβ-21 & νΗβ-11

• O gene νΗβ-48ou um alelo do mesmo.

A seqüência em entrada M99675 de Genbank é um alelo do gene νΗβ-48. M99675 é uma seqüência de nucleotídeos de Genbank de um pedaço genômico de DNA incluindo os dois exons que constituem o gene de cadeia pesada de humano νΗβ-48 (SEQ ID No:22) e codificam a seqüência de aminoácidos de região variável dada em SEQ ID No:21. Em um aspecto particular a armação de cadeia pesada receptora de humano é derivada de M99675.

Com o propósito de construir uma região-V completa uma armação 4 tem que ser adicionada no gene-V M99675 codificado por linhagem germinativa. Seqüências de armação 4 adequadas incluem aquela codificada pelo minigene JH4 de humano (Kabat):

YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No:23) cujos quatro resíduos iniciais caem dentro da região CDR3 que é substituída pela CDR entrante do anticorpo doador.

A pessoa experiente reconhece que um gene J e um gene V de linhagem germinativa não incluem seqüência codificadora para a totalidade da CSR3 de cadeia pesada. Contudo, nos anticorpos da invenção, a seqüência de CDR3 é proporcionada pela imunoglobulina doadora. Conseqüentemente, a combinação de um gene Vh tal como νΗβ-48, um minigene JH tal como JH4, e um conjunto de CDRs de cadeia pesada, tais como SEQ ID No:l, SEQ ID No:2 e SEQ ID No:3 (montadas em uma maneira de modo a imitar uma região variável de cadeia pesada totalmente rearranjada, madura) é suficiente para definir uma região variável de cadeia pesada da invenção tal como aquelas representadas em SEQ ID No:26, 28, 30.

A região variável codificada por Genpept ID CAA51134 possui a seqüência de aminoácidos dada em SEQ ID No:24.

A seqüência de armação de região variável de cadeia leve conhecida por GenPept ID CAA51134 é a seqüência de aminoácidosdeduzida de uma região variável de cadeia leve totalmente rearranjada e é idêntica à outra seqüência de aminoácidos com as mesmas armações no banco de dados: número de acesso em Genpept de S40356, e é descrita em Klein, R., et al., Eur. J. Immunol. 23 (12), 3248-3262 (1993). A seqüência codificadora de DNA para CAA51134, acessível como número de acesso em Genbank de X72467, é dada como SEQ ID No: 25.

Em um aspecto particular da invenção a armação de cadeia pesada receptora de humano é derivada de M99675 e do minigene JH4 e a armação de cadeia leve receptora de humano é derivada de CAA51135, opcionalmente contendo um ou mais, tal como um a quatro, mais particularmente um a três, substituições de resíduos de aminoácido baseados nos resíduos correspondentes encontrados no domínio Vh doador possuindo a seqüência: SEQ ID No: 17 e domínio Vl possuindo a seqüência: SEQ ID No: 19 que mantém toda ou substancialmente toda a afinidade de ligação do anticorpo doador para o peptídeo β-amilóide.

Por substancialmente toda a afinidade de ligação quer-se das o significado de que o anticorpo terapêutico possui no máximo uma redução de dez vezes em afinidade de ligação comparado com o anticorpo doador.

Em um aspecto mais particular a armação de cadeia pesada receptora de humano derivada de M99675 e JH4 possui uma a quatro substituições de resíduo de aminoácido selecionadas das posições 24, 48, 93 e/ou 94 (numeração de Kabat).

Em um aspecto mais particular da invenção a armação de cadeia pesada receptora de humano derivada de M99675 e de JH4 compreende os seguintes resíduos (ou uma substituição conservativa dos mesmos): (i)

Posição Resíduo

93 V<table>table see original document page 12</column></row><table>

Em uma modalidade da invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico compreendendo uma cadeia Vh possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:26, 28 ou 30 e um domínio Vl possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:32.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico, cujo anticorpo compreende uma cadeia pesada possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:34, 36 ou 38 e uma cadeia leve possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:40.

Em outra modalidade da invenção é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo terapêutico de acordo com a invenção.

Em uma outra modalidade da invenção é proporcionado um método de tratamento de um paciente humano acometido com uma doença relacionada com peptídeo β-amilóide cujo método compreende a etapa de administrar ao citado paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo terapêutico de acordo com a invenção.Uso de um anticorpo terapêutico de acordo com a invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada com peptídeo β-amilóide também é proporcionado.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um processo para a manufatura de um anticorpo terapêutico de acordo com a invenção, cujo processo compreende expressar polinucleotídeo codificador de anticorpo em uma célula hospedeira.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico compreendendo uma cadeia Vh possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:26, 28 ou 30.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve de anticorpo terapêutico compreendendo um domínio Vl possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:32.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:34, 36 ou 38.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve de anticorpo terapêutico possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:40.

Em uma modalidade mais particular da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia pesada de anticorpo terapêutico, cujo polinucleotídeo compreende a seqüência mostrada em SEQ ID No:35, 37, 39 ou 42.

Em outra modalidade particular da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve de anticorpo terapêutico, cujo polinucleotídeo compreende a seqüência mostrada em SEQ ID No:41 ou 43.Em uma modalidade particular o anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento e/ou derivado do mesmo é essencialmente faltante das funções de a) ativação de complemento pela rota clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um anticorpo ou um fragmento do mesmo compreendendo um domínio Vh possuindo a seqüência: SEQ ID No: 17 e um domínio Vl possuindo a seqüência: SEQ ID No: 19.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia pesada de anticorpo ou um seu fragmento compreendendo um domínio Vh possuindo a seqüência SEQ ID No: 17, em particular o polinucleotídeo de SEQ ID No: 18.

Em outra modalidade da invenção é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve de anticorpo ou um seu fragmento compreendendo um domínio Vl possuindo a seqüência SEQ ID No: 19, em particular o polinucleotídeo de SEQ ID No:20. Descrição detalhada da invenção 1. Estruturas de anticorpo 1.1 Anticorpos intactos

Anticorpos intactos são normalmente glicoproteínas heteromultiméricas compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Além da IgM, anticorpos intactos são glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeia pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve é ligada em uma cadeia pesada por uma ligação covalente de dissulfeto enquanto que varia o número de ligações de dissulfeto entre as cadeias pesadas de isótopos de imunoglobulina diferentes. Cada cadeia pesada e leve também possui pontes de dissulfeto intracadeias. Cada cadeia pesada possui em uma extremidade um domínio variável (Vh) seguido por umnúmero de regiões constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável (Vl) e uma região constante em sua outra extremidade; a região constante da cadeia leve está alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. As cadeias leves dos anticorpos da maioria das espécies vertebradas podem ser designadas em dois tipos chamados de Kappa e Lambda baseado na seqüência de aminoácidos da região de cadeia pesada. Dependendo da seqüência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, anticorpos de humano podem ser designados para cinco classes diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, IgG e IgA podem ser adicionalmente divididas em subclasses, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgAl e IgA2. Variantes de espécie existem com camundongo e rato possuindo pelo menos IgG2a, IgG2b. O domínio variável do anticorpo confere especificidade de ligação ao anticorpo com certas regiões exibindo variabilidade particular chamada de regiões determinantes de complementaridade CDRs). As porções mais conservadas da região variável são chamadas de regiões de armação (FR). Os domínios variáveis das cadeias leve e pesada intactas compreendem, cada um, quatro FR conectadas por três CDRs. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas regiões FR e com as CDRs da outra cadeia contribuem para a formação do sítio de ligação em antígeno dos anticorpos. As regiões constantes não estão diretamente envolvidas na ligação do anticorpo no antígeno mas exibem várias funções efetoras tais como participação em citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose via ligação em receptor Fcy, taxa de depuração / meia-vida via receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento via o componente Clq da cascata de complemento. A região constante de IgG2 de humano é faltante da capacidade para ativar complemento pela rota clássica ou para mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpo. A região constante de IgG4 é faltante da capacidadepara ativar complemento pela rota clássica e medeia apenas fracamente citotoxicidade celular mediada por anticorpo. Anticorpos essencialmente faltantes destas funções efetoras podem ser chamados de anticorpos 'não-líticos'.

1.1.1 Anticorpos de humano

Anticorpos de humano podem ser produzidos por numerosos métodos conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte. Anticorpos de humano podem ser preparados pelo método de hibridoma usando linhagens celulares de mieloma de humano ou de mieloma de camundongo veja Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984) e Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker Inc, 1987). Métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fagos ou camundongos transgênicos ambos os quais utilizam repertórios de região V de humano (veja Winter G, (1994), Annu. Rev.Immunol 12,43β-455, Green LL (1999), J.Immunol. methods 231, 11 -23).

Várias cepas de camundongos transgênicos estão agora disponíveis nas quais seus Ioci de imunoglobulina de camundongo têm sido substituídos por segmentos de gene de imunoglobulina de humano (veja Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). Sob desafio de antígeno tais camundongos são capazes de produzir um repertório de anticorpos de humano dos quais anticorpos de interesse podem ser selecionados.

De nota particular é o sistema Trimera™ (veja Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161) onde linfócitos de humano são transplantados para dentro de camundongos irradiados, o Sistema de Anticorpo de Linfócito Selecionado (SLAM, veja Babcook et al, PNAS (1996) 93:7843-7848) onde linfócitos de humano (ou outra espécie) são eficazmente postos através um procedimento de geração de anticorpo in vitrode reunião massiva seguido por procedimento de seleção e diluição limitante, desenrolado e o Xenomouse II™ (Abgenix Inc). Uma abordagem alternativa está disponível na Morphotek Inc usando a tecnologia Morphodoma™.

Tecnologia de exibição de fago pode ser utilizada para produzir anticorpos de humano (e seus fragmentos), veja McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) e Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260. De acordo com esta técnica genes de domínio V de anticorpo são clonados em matriz em uma capa maior ou menor de gene de proteína de um bacteriófago filamentoso tal como Ml3 ou fd e exibido (normalmente com o auxílio de um fago auxiliador) como fragmentos de anticorpo funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam em seleção do gene codificador do anticorpo exibindo aquelas propriedades. A técnica de exibição de fago também pode ser usada para selecionar anticorpos específicos das bibliotecas feitas de células B de humano retiradas de indivíduos acometidos com uma doença ou um distúrbio descrita(o) acima ou alternativamente de doadores humanos não-imunizados (veja Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991). Onde um anticorpo de humano intacto é desejado compreendendo um domínio Fc é necessário reclonar o fragmento derivado exibido de fago em um vetor de expressão de mamífero compreendendo as regiões constantes desejadas e estabelecendo linhagens de célula expressando estáveis.

A técnica de maturação de afinidade (Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)) pode ser usada para melhorar a afinidade de ligação na qual a afinidade do anticorpo de humano primário é melhorada por substituição seqüencial das regiões V de cadeias LeH por variantes naturalmente ocorrentes e selecionando tendo por base as afinidades de ligação melhoradas. Variantes desta técnica tal como "impressão de epítopo" também estão disponíveis veja WO 93/06213. Veja também Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993).1.2 Anticorpos humanizados e quiméricos

O uso de anticorpos intactos de não-humano no tratamento de doenças ou distúrbios traz consigo os novos problemas bem estabelecidos de imunogenicidade potencial especialmente sob administração repetida do anticorpo isto é o sistema imune do paciente pode reconhecer o anticorpo intacto de não-humano como não-próprio e montar uma resposta neutralizadora. Em adição ao desenvolvimento de anticorpos totalmente de humano (veja acima) várias técnicas têm sido desenvolvidas no decorrer dos anos para suplantar estes problemas e geralmente envolvem redução da composição de seqüências de aminoácidos de não-humano em anticorpo terapêutico intacto ao mesmo tempo retendo a facilidade relativa na obtenção de anticorpos de não-humano de um animal imunizado e.g. camundongo, rato ou coelho. Amplamente duas abordagens têm sido usadas para alcançar isto. A primeira são anticorpos quiméricos, que geralmente compreendem um domínio variável de não-humano (e.g. roedor tal como camundongo) fusionado em uma região constante de humano. Devido ao fato de o sítio de ligação de antígeno de um anticorpo está localizado dentro das regiões variáveis o anticorpo quimérico retém sua afinidade de ligação pelo antígeno mas adquire as funções efetoras da região constante de humano e são portanto capazes de realizar funções efetoras tais como as supra citadas. Anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinante. DNA codificador de anticorpos (e.g. cDNA) é isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (e.g. pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar especificamente em genes codificadores de regiões variáveis de cadeias H e L do anticorpos da invenção, e.g. DNA de SEQ. ID.NO 18 e 20 descrito supra). Células de hibridoma servem como uma fonte típica para tal DNA. Uma vez isolado, o DNA é posto em vetores de expressão que são então transfectados para dentro de células hospedeiras tais como E. coli, células COS, células CHO, célulasPerC6 ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína imunoglobulina para obter a síntese do anticorpo. O DNA pode ser modificado usando a seqüência codificadora de cadeias L e H de humano como substituta das correspondentes regiões constantes H e L de não-humano (e.g. murino) veja e.g. Morrison; PNAS 81, 6851 (1984). Assim outra modalidade da invenção é proporcionar um anticorpo quimérico compreendendo um domínio Vh possuindo a seqüência: SEQ ID No: 17 e um domínio Vl possuindo a seqüência: SEQ ID No: 19 fusionada na seqüência constante de humano (que pode ser de um isótipo de IgG5 e.g. IgGl).

A segunda abordagem envolve a geração de anticorpos humanizados na qual o conteúdo de não-humano do anticorpo é reduzido pela humanização das regiões variáveis. Duas técnicas para humanização têm ganho popularidade. A primeira é humanização por grafitização de CDR. CDRs constroem alças próximas da terminação-N do anticorpo onde formam uma superfície montada em um andaime proporcionado pelas regiões de armação. Especificidade de ligação em antígeno do anticorpo é principalmente definida pela topografia e pelas características químicas de sua superfície de CDR. Estas características são por sua vez determinadas pela conformação das CDRs individuais, pela disposição relativa das CDRs, e pela natureza e disposição das cadeias laterais dos resíduos compreendendo as CDRs. Um grande decréscimo em imunogenicidade pode ser alcançado pela grafitização de apenas as CDRs de anticorpos de não-humano (e.g. murino) (anticorpos "doadores") em uma armação de humano adequada (armação "receptora") e regiões constantes (veja Jones et al (1986) Nature 321,522-525 e Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). Contudo, grafitização de CDR por si pode não resultar na retenção completa de propriedades de ligação em antígeno e é freqüentemente verificado que alguns resíduos de armação do anticorpo doador necessitam ser preservados (algumas vezes referidos como "retro-mutações") na moléculas humanizada se afinidade deligação em antígeno significativa for para ser recuperada (veja Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501502). Neste caso, regiões V de humano mostrando a homologia de seqüência mais alta (tipicamente 60% ou maior) para o anticorpo doador de não-humano podem ser escolhidas de um banco de dados com o propósito de proporcionar a armação de humano (FR). A seleção de FRs de humano pode ser feita quer dos anticorpos quer de humano individuais quer de consenso de humano. Onde necessário resíduos chave do anticorpo doador são substituídos na armação receptora de humano para preservar conformações de CDR. Modelagem por computador do anticorpo podem ajudar a identificar tais resíduos estruturalmente importantes, veja W099/48523.

Alternativamente, humanização pode ser realizada por um processo de "chapeamento". Uma análise estatística de regiões variáveis de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina de murino e de humano únicas revelou que os padrões precisos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos de humano e de murino, e a maioria das posições de superfície individual possui uma preferência forte por um número pequeno de resíduos diferentes (veja Padlan E.A. et al; (1991) Mol.Immunol.28, 489-498 e Pedersen J.T. et al (1994) J.Mol.Biol. 235; 959973). Portanto é possível reduzir a imunogenicidade de um Fv de não-humano pela substituição de resíduos expostos em suas regiões de armação que diferem daqueles normalmente encontrados em anticorpos de humano. Devido ao fato de a antigenicidade de proteína poder ser correlacionada com acessibilidade de superfície, substituição dos resíduos de superfície pode ser suficiente para tornar as regiões variáveis de camundongo "invisíveis" para o sistema imune de humano (veja também Mark G.E. et al (1994) em Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Veriag, pp 105-134). Este procedimento de humanização é referido como "chapeamento" porque apenas a superfície do anticorpo éalterada, os resíduos de suporte permanecem não-substituídos. Outras abordagens alternativas incluem aquela descrita em W004/006955 e o procedimento de Humaneering™ (Kalobios) que faz uso de sistemas de expressão bacteriana e produz anticorpos que estão próximos de linhagem germinativa de humano em seqüência (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, janeiro de 2007, San Diego5California).

Será evidente para aqueles pessoas experientes na arte que o termo "derivado" é intencionado para definir não apenas a fonte no sentido de ser a origem física do material mas também para definir material que é estruturalmente idêntico ao material mas não se origina da fonte de referência. Assim "resíduos encontrados no anticorpo doador" não necessariamente têm que ser purificados do anticorpo doador.

É bem reconhecido na arte que certas substituições de aminoácido são consideradas como sendo "conservativas". Aminoácidos são divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comum e substituições dentro de grupos que mantêm toda ou substancialmente toda a afinidade de ligação do anticorpo terapêutico da invenção são consideradas como substituições conservativas, veja a seguinte Tabela 1:

Tabela 1

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1.3 Anticorpos biespecíflcos

Um anticorpo biespecífico é um derivado de anticorpo possuindo especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos diferentes e também forma parte da invenção. Métodos de preparação de tais anticorpos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia L-cadeia H de imunoglobulina, onde as duas cadeias H possuem especificidades de ligação diferentes veja Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), W093/08829 e Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Por causa do agrupamento aleatório das cadeias HeL, uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes é produzida da qual apenas uma possui a especificidade de ligação desejada. Uma abordagem alternativa envolve fusão dos domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas para região constante de cadeia pesada compreendendo pelo menos parte da região de dobradiça, regiões CH2 e CH3. E preferido ter a região CHl contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. DNA codificador destas proteínas, e se desejada a cadeia L são inseridos em vetores de expressão separados e são então co-transfectados emum organismo hospedeiro adequado. E possível entretanto inserir as seqüências codificadoras par duas ou todas as três cadeias em um vetor de expressão. Em uma abordagem preferida, o anticorpo biespecífico é composto de uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias H-L, proporcionando uma segunda especificidade de ligação no outro braço, veja W094/04690. Veja também Suresh et al Methods in Enzymology 121,210, 1986.

Liberação de proteínas terapêuticas no cérebro tem sido impedida pela presença de barreira hematoencefálica (BBB). Onde é desejado liberar um anticorpo da invenção ou fragmento de anticorpo da invenção através da BBB várias estratégias têm sido propostas para intensificar tal liberação onde necessária.

Com o propósito de obter nutrientes e fatores requeridos do sangue, a BBB possui alguns receptores específicos, que transportam compostos do sangue circulante para o cérebro. Estudos têm indicado que compostos como insulina (veja Duffy KR et al (1989) Brain Res. 420:32-38), transferina (veja Fishman JB et al (1987) J.Neurosci 18:299-304) e fatores decrescimento 1 e 2 semelhantes à insulina (veja Pardridge WM (1986) Endocrine Rev.7:314-330 e Duffy KR et a/ (1986) Metabolism 37:136-140) atravessam a BBB via transcitose mediada por receptor. Receptores para estas moléculas assim proporcionam um meio potencial para anticorpos terapêuticos da invenção para acessarem o cérebro usando os assim denominados anticorpos "vetorados" (veja Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321). Por exemplo, tem sido mostrado que um anticorpo para receptor de transferina é dinamicamente transportado para dentro do parênquima cerebral (veja Friden PM et al.(1991) PNAS 88:4771-4775 e Friden PM et al (1993) Science 259:37β-377). Assim uma abordagem potencial é produzir um anticorpo biespecífico ou fragmento biespecífico como descrito supra no qual uma primeira especificidade é para e uma segunda especificidade é para um receptor de transporte localizado na BBB e.g. uma segunda especificidade para o receptor de transporte de transferrina.

1.4 Fragmentos de anticorpo

Em certas modalidades da invenção é proporcionado anticorpo terapêutico que é um fragmento de ligação em antígeno. Tais fragmentos podem ser fragmentos de ligação em antígeno funcionais de anticorpos intactos e/ou humanizados e/ou quiméricos tais como fragmentos Fab5 Fd, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv de anticorpos descritos acima. Fragmentos faltantes da região constante faltam da capacidade para ativar complemento pela rota clássica ou para mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Tradicionalmente tais fragmento são produzidos pela digestão proteolítica de anticorpos intactos por e.g. digestão por papaína (veja por exemplo, WO 94/29348) mas podem ser produzidos diretamente de células hospedeiras recombinantemente transformadas. Para a produção de ScFv, veja Bird et al;(1988) Science, 242, 42β-426. Em adição, fragmentos de anticorpo podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas de engenharia como descritas abaixo.Fragmentos Fv parecem ter energia de interação de suas duas cadeias mais baixa do que fragmentos Fab. Para estabilizar a associação dos domínios Vh e VL, têm sido ligados com peptídeos (Bird et al, (1988) Science 242, 42β-426, Huston at al, PNAS, 85, 5879-5883), pontes de dissulfeto (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) e mutações "knob in hole" (Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788). Fragmentos ScFv podem ser produzidos por métodos conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte veja Whitlow et al (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2, 97-105 e Huston et al (1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217. ScFv pode ser produzido em células bacterianas tal como E.Coli mas são mais tipicamente produzidos em células eucarióticas. Uma desvantagem de ScFv é a monovalência do produto, que impede uma atividade aumentada devido à ligação polivalente, e sua meia-vida curta. Tentativas para suplantar estes problemas incluem (ScFv1)2 bivalente produzido de ScFV contendo uma cisteína C-terminal adicional por copulação química (Adams at al. (1993) Can.Res 53, 4026-4034 e McCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314) ou por dimerização sítio-específica espontânea de ScFv contendo um resíduo de cisteína C-terminal não-pareado (veja Kipriyanov at al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204). Alternativamente, ScFv pode ser forçado para formar multímeros por encurtamento do linker de peptídeo para entre 3 e 12 resíduos para formar "diacorpos", veja Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448. Redução do linker ainda pode adicionalmente resultar em trímeros de ScFV ("triacorpos", veja Kortt et al.(1997) Protein Eng, 10, 42β-433) e tetrâmeros ("tetracorpos", ver Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). Construção de moléculas de ScFv bivalentes também pode ser realizada por fusão genética com motivos de dimerização de proteína para formar "minianticorpos" (veja Pack et al.(1992) Biochemistry 31, 1579-1584) e "minicorpos" (veja Hu et al (1996), Câncer Res. 56, 3055-3061). Séries de ScFv-Sc-Fv ((ScFV)2) também podem ser produzidas por ligação de duasunidades de ScFv por um terceiro linker peptídeo, veja Kurucz et al (1995) J.Immol.154, 4576-4582. Diacorpos biespeeíficos podem ser produzidos através de associação não-covalente de dois produtos de fusão de cadeia única consistindo de domínio Vh de um anticorpo conectado em um linker curto no domínio Vl de outro anticorpo, veja Kipriyanov et al (1998), IntJ.Can 77,763-772. A estabilidade de tais diacorpos biespecíficos pode ser aumentada pela introdução de pontes de dissulfeto ou mutações "knob in hole" como descrito supra ou pela formação de diacorpos de cadeia única (ScDb) nos quais dois fragmentos de ScFv híbridos são conectados através de um linker peptídeo veja Kontermann et al (1999) J.Immunol.Methods 226 179188. Moléculas biespecíficas tetravalentes são disponíveis por e.g. fusão de um fragmento ScFv no domínio CH3 de uma molécula IgG ou em um fragmento Fab através da região de dobradiça veja Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163. Alternativamente, moléculas biespecíficas tetravalentes têm sido criadas pela fusão de diacorpos de cadeia única biespecíficos (veja Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94. Moléculas biespecíficas tetravalentes menores também podem ser formadas pela dimerização de quer séries de ScFv-ScFv com um linker contendo um motivo de hélice-alça-hélice (minianticorpos DiBi5 veja Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49) quer uma molécula de cadeia única compreendendo quatro domínios variáveis de anticorpo (VH e VL) em uma orientação prevenindo pareamento intramolecular (diacorpo em série, veja Kipriyanov et al, (1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56). Fragmentos F(ab')2 biespecíficos podem ser criados pela copulação química de fragmentos Fab1 ou por heterodimerização através de zíperes de leucina (veja Shalaby et al, (1992) J.Exp.Med. 175, 217-225 e Kostelny et al (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553). Também estão disponíveis domínios isolados Vh e VL, veja US 6.248.516; US 6.291.158; US 6.172.197.

1.5 Anticorpos heteroconjugadosSão derivados anticorpos heteroconjugados que também formam uma modalidade da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos covalentemente ligados usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Veja US 4.676.980. 1.6 Outras modificações

Acredita-se que a interação entre a região Fc de um anticorpo e vários receptores Fc (FcyR) medeia as funções efetoras do anticorpo que incluem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fixação de complemento, fagocitose e meia-vida/depuração de anticorpo. Várias modificações na região Fc de anticorpos da invenção podem ser realizadas dependendo da propriedade efetora desejada. Em particular, regiões constantes de humano que essencialmente são faltantes de a) ativação de complemento pela rota clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo incluem a região constante de IgG4, a região constante de IgG2 e as regiões constantes de IgGl contendo mutações específicas contendo mutações específicas como por exemplo mutações em posições 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e/ou 322 descritas em EP0307434 (W08807089), EP 0629 240 (W09317105) e WO 2004/014953. Tem sido separadamente descrito que as mutações em resíduos 235 ou 237 dentro dodomínio CH2 da região constante de cadeia pesada (numeração de Kabat;sistema de índice EU) reduzem a ligação em FcyRI, FcyRII e ligação deFcyRIII e portanto reduzem a citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC) (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol.1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton 3Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;l-84; Morgan et al., Imunology 1995, 86;319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 1216112168). Ademais,alguns relatórios também têm descrito o envolvimento de alguns destesresíduos em recrutamento ou mediação de citotoxicidade dependente decomplemento (CDC) (Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell. Immunol. 2000;200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Resíduos 235 e 237 têm portanto sido mutados para resíduos de alanina (Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48; e W09958679) para reduzir os efeitos tanto mediados por complemento quanto mediados por FcyR. Anticorpos compreendendo estas regiões constantes podem ser chamados de anticorpos 'não-líticos'.

Pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor de salvamento no anticorpo para aumentar a meia-vida em soro veja US 5.739.277.

Há cinco receptores Fcy de humano correntemente reconhecidos, FcyR (I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e FcRn neonatal. Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604 demonstraram que um conjunto comum de resíduos de IgGl resíduos está envolvido em ligação de todos os FcyRs5 enquanto que FcyRII e FcyRIII utilizam sítios distintos fora deste conjunto comum. Um grupo de resíduos de IgGl reduziu a ligação em todos os FcyRs quando alterou para alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 e Pro-239. Todos estão no domínio IgG CH2 e agrupados próximos da junção de dobradiça CHl e CH2. Enquanto que FcyRI utiliza apenas o conjunto comum de resíduos de IgGl para ligação, FcyRII e FcyRIII interagem com resíduos distintos em adição ao conjunto comum. Alteração de alguns resíduos reduziu ligação apenas em FcyRII (e.g. Arg-292) ou FcyRIII (e.g. Glu-293). Algumas variantes mostraram ligação melhorada em FcyRII ou FcyRIII mas não afetou ligação em outro receptor (e.g. Ser-267Ala melhorou ligação em FcgRII mas ligação em FcyRIII não foi afetada). Outras variantes exibiram ligação melhorada em FcyRII ou FcyRIII com redução em ligação no outro receptor (e.g. Ser-298Ala melhorou ligação em FcyRIII e reduziu ligação em FcgRII). Para FcyRIIIa, as melhores variantes de IgGl de ligação haviam combinado substituições de alanina em Ser-298, Glu-333 e Lys-334. Acredita-se que o receptor FcRn neonatal está envolvido em proteção demoléculas de IgG da degradação e assim melhora a meia-vida em soro e a transcitose através de tecidos (veja Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57 e Ghetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766). Resíduos de IgGl de humano determinados em interagirem diretamente com FcRn de humano incluem Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435.

O anticorpo terapêutico da invenção pode incorporar qualquer uma das modificações de região constante acima.

Em uma modalidade particular, o anticorpo terapêutico é essencialmente faltante das funções de a) ativação de complemento pela rota clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Em uma modalidade mais particular a presente invenção proporciona anticorpos terapêuticos da invenção possuindo qualquer uma (ou mais) das mudanças de resíduo detalhadas acima para modificar a meia-vida/depuração e/ou as funções efetoras tais como ADCC e/ou citotoxicidade dependente de complemento e/ou Iise de complemento.

Em um outro aspecto da presente invenção o anticorpo terapêutico possui uma região constante de isótipo de IgGl de humano com substituições (ou outra disrupção) de alanina em posições 235 (e.g. L235A) e 237 (e.g. G237A) (numeração de acordo com o esquema EU mostrado em Kabat).

Outros derivados da invenção incluem variantes de glicosilação dos anticorpos da invenção. É sabido que glicosilação de anticorpos em posições conservadas em suas regiões constantes tem um efeito profundo sobre a função do anticorpo, particularmente o funcionamento efetor tal como aqueles acima, veja por exemplo, Boyd et al (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Variantes de glicosilação dos anticorpos terapêuticos da presente invenção nas quais um ou mais grupos carboidrato são adicionados, substituídos, deletados ou modificados são contempladas. Introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítiopotencial para ligação enzimática de grupos carboidrato e pode ser portanto usada para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 a sialiação terminal de uma imunoadesina TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilatção e/ou ressialilação usando beta-l,4-galactosil-transferase e/ou alfa-2,3-sialil-transferase. Acredita-se que o aumento da sialilação eleva a meia-vida da imunoglobulina. Anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos em natureza como uma mistura de glicoformas. Esta mistura é particularmente evidente quando anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente de mamífero. Uma variedade de métodos tem sido desenvolvida para manufatura de glicoformas definidas, veja Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al.(2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727. Assim a invenção refere-se à pluralidade de anticorpos terapêuticos (que podem ser do isótipo IgG, e.g. IgGl) como aqui descrito compreendendo um número definido (e.g. 7 ou menos, por exemplo 5 ou menos tal como duas ou uma única) glicoforma(s) de citados anticorpos.

Derivados de acordo com a invenção também incluem anticorpos terapêuticos da invenção copulados em um polímero não-proteináceo tal como poli(etileno-glicol) (PEG), poli(propileno-glicol) ou polioxialquileno. Conjugação de proteínas em PEG é uma técnica estabelecida para aumentar a meia-vida de proteínas, bem como reduzir antigenicidade e imunogenicidade de proteínas. O uso de PEGuilação com estilos (linear ou ramificado) e pesos moleculares diferentes tem sido investigado com anticorpos intactos bem como com fragmentos Fab', veja Koumenis I.L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95. Uma modalidade particular compreende um fragmento de ligação em antígeno da invenção sem as funções efetoras de a) ativação de complemento pela rota clássica; e b)mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo; (tal como um fragmento Fab ou um scFv) copulado em PEG. 2.

Métodos de produção

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos em organismos transgênicos tais como cabras (veja Pollock et al (1999), J.Immunol.Methods 231:147-157), galinhas (veja Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55), camundongos (veja Pollock et al ibid) ou plantas (veja Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), NatMed. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590). Anticorpos também podem ser produzidos por síntese química. Contudo, anticorpos da invenção são tipicamente produzidos usando tecnologia de cultura de célula recombinante bem conhecida por aqueles pessoas experientes na arte. Um polinucleotídeo codificado do anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável tal como um plasmídeo para propagação ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Um sistema de expressão útil é um sistema de glutamato sintetase (tal como vendido por Lonza Biologics), particularmente onde a célula hospedeira é CHO ou NSO (veja abaixo). Polinucleotídeo codificador de anticorpo é prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (e.g. sondas de oligonucleotídeo). Vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, minicromossomos dos quais plasmídeos são uma modalidade típica. Geralmente tais vetores adicionalmente incluem uma seqüência de sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e seqüências de terminação de transcrição operacionalmente ligados no polinucleotídeo de cadeia leve e/ou pesada de modo a facilitar a expressão. Polinucleotídeo codificador das cadeias leve e pesada pode ser inserido em vetores separados e introduzido (e.g. por transformação, transfecção, eletroporação ou transdução) na mesma célula hospedeira concorrentementeou seqüencialmente ou, se desejado ambas a cadeia leve e a cadeia pesada podem ser inseridas no mesmo vetor antes de tal introdução.

Será imediatamente evidente para aqueles pessoas experientes na arte que devido à redundância do código genético, também estão disponíveis polinucleotídeos alternativos àqueles aqui descritos que codificarão os polipeptídeos da invenção.

2.1 Seqüências de sinal

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos como uma proteína de fusão com uma seqüência de sinal heteróloga possuindo um sítio de clivagem específico na terminação N da proteína madura. A seqüência de sinal deve ser reconhecida e processada pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas, a seqüência de sinal pode ser líderes endotoxina II estável, fosfatase alcalina, ou penicilinase. Para secreção em levedura as seqüências de sinal podem ser uma líder invertase de levedura, uma líder fator α ou líderes fosfatase ácida veja e.g. W090/13646. Em sistemas de célula de mamífero, líderes secretórias virais tais como seqüências de sinal gD de herpes simples e de imunoglobulina nativa (tal como cadeia pesada de Ig de humano) estão disponíveis. Tipicamente a seqüência de sinal é ligada em matriz de leitura no polinucleotídeo codificador do anticorpo da invenção.

2.2 Origem de replicação

Origens de replicação são bem conhecidas na arte com pBR322 adequado para a maioria das bactérias gram-negativas, plasmídeo 2μ para a maioria das leveduras e várias origens virais tais como SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV para a maioria das células de mamífero. Geralmente a origem de complemento de replicação SV40 não é necessária para vetores de expressão de mamíferos integrados. Contudo a SV40 ori pode ser incluída porque contém o promotor precoce.

2.3 Marcador de seleçãoGenes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, e.g. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) deficiências auxotróficas de complemento ou nutrientes de fornecimento não disponíveis nos meios complexos ou (c) combinações de ambos. O esquema de seleção pode envolver parada do crescimento das células hospedeiras que não contêm vetor ou vetores. Células, que têm sido, com sucesso, transformadas com os genes codificadores de anticorpo terapêutico da presente invenção, sobrevivem à e.g. resistência à droga conferida pelo marcador de seleção co-liberado. Um exemplo é o sistema de seleção-DHFR no qual transformantes são gerados em cepas hospedeiras negativas para DHFR (eg veja Page e Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). Neste sistema o gene DHFR é co-liberado com seqüências de polinucleotídeo de anticorpo da invenção e células positivas para DHFR são então selecionadas por remoção de nucleosídeo. Se requerido, o inibidor de DHFR metotrexato é também empregado para selecionar os transformantes com amplificação de gene DHFR. Por ligação operacional do gene DHFR nas seqüências codificadoras de anticorpo da invenção ou seus derivados funcionais, a amplificação de gene DHFR resulta em amplificação concomitante das seqüências de anticorpo desejadas de interesse. Células CHO são uma linhagem celular particularmente útil para esta seleção de DHFR/metotrexato e métodos de amplificação e seleção de células hospedeiras usando o sistema DHFR estão bem estabelecidos na arte veja Kaufman R.J. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621, para revisão, veja Werner RG, Noe W, Kopp K5Schluter M, "Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 agosto. Um outro exemplo é o sistema de expressão de glutamato sintetase (Bebbington et al Biotechnology 1992 Vol 10 p. 169). Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl; veja Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979.2.4 Promotores

Promotores adequados para expressão de anticorpos da invenção são operacionalmente ligados em DNA/polinucleotídeo codificador do anticorpo. Promotores para hospedeiros procarióticos incluem promotor phoA, sistemas de promotor de Beta-Iactamase e lactose, promotores de fosfatase alcalina, triptofano e promotores híbridos tal como Tac. Promotores adequados para expressão em células de levedura incluem β-fosfoglicerato-cinase ou outras enzimas glicolíticas e.g. enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexocinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose-6-fosfato-isomerase, β-fosfoglicerato-mutase e glicocinase. Promotores de levedura induzíveis incluem álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, metalotioneína e enzimas responsáveis pelo metabolismo de nitrogênio ou pela utilização de maltose/galactose. Promoteres para expressão em sistemas de célula de mamífero incluem promotores de RNA polimerase II incluindo promotores virais tais como poliomavírus, vírus do epitelioma contagioso e adenovírus (e.g. adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus (em particular o promotor de gene precoce imediato), retrovírus, vírus da hepatite B, actina, promotor de sarcoma de rous (RSV) e vírus simiano precoce ou tardio 40 e promotores não-virais tal como EF-Ialfa (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322. A escolha do promotor pode ser baseada em compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão.

2.5 Elemento intensificador

Onde apropriado, e.g. para expressão em eucariotos superiores, elementos intensificadores adicionais podem ser incluídos em vez de ou também aqueles verificados encontrados nos promotores descritos acima. Seqüências de intensificador de mamífero adequadas incluem elementos intensificadores de globina, elastase, albumina, fetoproteína, metalotionina e insulina. Alternativamente, pode-se usar um elemento intensificador de umvírus de célula eucariótica tal como intensificador SV40, intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, intensificador de polioma, intensificador baculoviral ou locus IgG2a murino (veja W004/009823). Embora tais intensificadores estejam tipicamente localizados no vetor em um sítio a montante do promotor, também podem estar localizados alhures e.g. dentro da região não-traduzida ou a jusante do sinal de poliadenilação. A escolha e o posicionamento do intensificador podem ser baseados em compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão.

2.6 Poliadenilação/Terminação

Em sistemas eucarióticos, sinais de poliadenilação são operacionalmente ligados no polinucleotídeo codificador do anticorpo desta invenção. Tais sinais são tipicamente posicionados 3' da matriz de leitura aberta. Em sistemas de mamífero, sinais exemplares não-limitantes incluem aqueles derivados de hormônios de crescimento, fator-1-alfa de alongamento e genes virais (eg SV40) ou repetições terminais longas retrovirais. Em sistemas de levedura exemplos não-limitantes de sinais de poliadenilação/terminação incluem aqueles derivados dos genes de fosfoglicerato-cinase (PGK) e a álcool-desidrogenase 1 (ADH). Em sistema procariótico sinais de poliadenilação tipicamente não são requeridos e em vez deles é usual empregar seqüências de terminador mais curtas e mais definidas. A escolha de seqüências de poliadenilação / terminação pode ser baseada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão.

2.7 Outros métodos/elementos para rendimentos aumentados

Em adição a acima, outras características que podem ser empregadas para aumentar rendimentos incluem elementos remodeladores de cromatina, íntrons e modificação de códon específico de célula hospedeira. O uso de códon do anticorpo desta invenção pode ser modificado para acomodar distorções de códon da célula hospedeira tal como rendimento de produto e/ou transcrito aumentado (eg Hoekema A et al Mol Cell Biol 19877(8):2914-24). A escolha de códons pode ser baseada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão. 2.8 Células hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para vetores de expressão ou clonagem codificadores de anticorpos da invenção são células procarióticas, de levedura ou células eucarióticas superiores. Células procarióticas adequadas incluem eubactérias e.g. enterobacteriaceae tais como Escherichia e.g. E.Coli (por exemplo ATCC 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella e.g. Salmonella typhimurium, Serratia e.g. Serratia marcescans e Shigella bem como Bacilli tais como B.subtilis e B.Iicheniformis (veja DD 266 710), Pseudomonas tal como P.aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (e.g. ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), yarrowia (EP402, 226), Pichia Pastoris (EP183, 070, também são Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244, 234), Penicillin, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus tais como A.nidulans e A.niger também são contemplados.

Embora células hospedeiras procarióticas e de levedura sejam especificamente contempladas pela invenção, tipicamente contido, células hospedeiras da presente invenção são células de vertebrado. Células hospedeiras de vertebrado adequadas incluem células de mamífero tais como COS-I (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem de rim embriônico de humano 293,, PerC6 (Crucell), células renais de hamster bebê (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), células de ovário de hamster chinês CHO (e.g. CHO-Kl, ATCC NO: CCL 61, linhagem de célula DHFR minus CHO tal como DG44 (Urlaub et al, Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12 pp. 555-566), particularmente aquelas linhagens de célula CHO adaptadas para cultura emsuspensão, células sertoli de camundongo, células renais de macaco, células renais de macaco verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células renais caninas (ATCC CCL 34), células pulmonares de humano (ATCC CCL 75), células Hep G2 e de mieloma ou de linfoma e.g. NSO (veja US 5.807.715), Sp2/0, YO.

Assim em uma modalidade da invenção é proporcionada uma célula hospedeira estavelmente transformada compreendendo um vetor codificador de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo terapêutico como aqui descrito. Tipicamente tais células hospedeiras compreendem um primeiro vetor codificador da cadeia leve e um segundo vetor codificador da citada cadeia pesada.

Tais células hospedeiras também podem ser adicionalmente engenhadas ou adaptadas para modificar qualidade, função e/ou rendimento do anticorpo desta invenção. Exemplos não-limitantes incluem expressão de enzimas modificadoras específicas (eg glicosilação) e chaperonas dobradoras de proteína.

2.9 Métodos de cultura de célula

Células hospedeiras transformadas com vetores codificadores dos anticorpos terapêuticos da invenção pode ser cultivadas por qualquer método conhecido por aqueles pessoas experientes na arte. Células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos rotativos, frascos agitados, frascos rolados, reatores de onda (eg System 1000 de wavebiotech.com) ou sistemas de fibra oca mas é preferido para produção em escala grande que reatores de tanque agitado ou reatores de saco (eg Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA) sejam usados particularmente para culturas em suspensão. Tipicamente os tanques agitados são adaptados para aeração usando e.g. aspersores, defletores ou propulsores de cisalhamento baixo. Para colunas de borbulhadores e reatores de suspensão aérea aeração direta com bolhas de ar ou de oxigênio pode ser usada. Onde as células hospedeiras são cultivadas emum meio de cultura livre de soro este pode ser suplementado com um agente protetor de célula tal como pluronic F-68 para ajudar a prevenir dano celular como um resultado do processo de aeração. Dependendo das características da célula hospedeira, quer microssuportes podem ser usados como substratos de crescimento para ancoragem de linhagens de célula dependente quer as células podem ser adaptadas para cultura em suspensão (que é típico). A cultura das células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de vertebrado pode utilizar uma variedade de modos operacionais tais como processamento em batelada, batelada-alimentada, batelada repetida (veja Drapeau et al (1994) Cytotechnology 15: 103-109), processo em batelada estendida ou cultura em perfusão. Embora células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas possam ser cultivadas em meios contendo soro tais como meios compreendendo soro fetal bovino (FCS), é preferido que tais células hospedeiras sejam cultivadas em meios livres de soro tais como descritos em Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meios comercialmente disponíveis tais como ProCHO-CDM ou UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementados onde necessário com uma fonte de energia tal como glicose e fatores de crescimento sintéticos tal como insulina recombinante. A cultura livre de soro de células hospedeiras pode requerer que aquelas células sejam adaptadas para crescerem em condições livres de soro. Uma abordagem de adaptação é cultivar tais células hospedeiras em meios contendo soro e repetidamente trocar 80% do meio de cultura por meio livre de soro de modo que as células hospedeiras aprendam a se adaptar às condições livres de soro (veja e.g. Scharfenberg K et al (1995) em Animal Cell Technology: Deveio pMents Towards the 2 Ist Century (Beuvery E.C. et al. eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers).

Anticorpos da invenção secretados para dentro do meio podem ser recuperados e purificados do meio usando uma variedade de técnicas para proporcionar um grau de purificação adequado para o uso intencionado. Porexemplo o uso de anticorpos terapêuticos da invenção para o tratamento de pacientes humanos tipicamente exige pelo menos 95% de pureza como determinada por SDS-PAGE redutor, mais tipicamente 98% ou 99% de pureza, quando comparado com o meio de cultura compreendendo os anticorpos terapêuticos. Na primeira situação, fragmentos de célula do meio de cultura são tipicamente removidos usando centrifugação seguida por uma etapa de clarificação do sobrenadante usando e.g. microfiltração, ultrafiltração e/ou filtração profunda. Alternativamente, o anticorpo pode ser colhido pro microfiltração, ultrafiltração ou filtração profunda sem centrifugação anterior. Uma variedade de outras técnicas tais como diálise e eletroforese em gel e técnicas cromatográficas tais como hidróxi-apatita (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo um sistema de marcação de afinidade tal como poli-histidina) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, veja US 5.429.746) estão disponíveis. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção, após várias etapas de clarificação, são capturadas usando cromatografia de afinidade de Proteína A ou G seguida por outras etapas de cromatografia tais como cromatografia HA e/ou de troca iônica, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação por sulfato de amônio. Tipicamente, várias etapas de remoção de vírus também são empregadas (e.g. nanofiltração usando e.g. um filtro DV-20). Após estas várias etapas, uma preparação purificada (tipicamente monoclonal) compreendendo pelo menos 10 mg/ml ou mais e.g. 100 mg/ml ou mais de anticorpo da invenção é proporcionada e portanto forma uma modalidade da invenção. Concentração para 100 mg/ml ou maior pode ser gerada por ultracentrifugação. Adequadamente tais preparações estão substancialmente livres de formas agregadas de anticorpos da invenção.

Sistemas bacterianos são particularmente adequados para a expressão de fragmentos de anticorpo. Tais fragmentos estão localizados intracelularmente ou dentro do periplasma. Proteínas periplásmicas insolúveispodem ser extraídas e redobradas para formarem proteínas ativas de acordo com métodos conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte, veja Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 1β-20 e Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 27β-277.

3. Composições Farmacêuticas

Preparações purificadas de anticorpos da invenção (particularmente preparações monoclonais) como descritas supra, podem ser incorporadas em composições farmacêuticas para uso no tratamento de doenças ou distúrbios de humano tais como aquelas citadas acima. Tipicamente tais composições adicionalmente compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável (i.e. inerte) como conhecido e denominado pela prática farmacêutica aceitável, veja e.g. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed, (1980), Mack Publishing Co. Exemplos de tais veículos incluem veículo esterilizado tal como solução salina, solução de Ringer ou solução de dextrose, tamponada com tampões adequados tal como acetato de sódio tri-hidratado em um pH farmaceuticamente aceitável, tal como um pH dentro da faixa de 5 a 8. Composições farmacêuticas para injeção (e.g. por injeção intravenosa, intraperitoneal, intradermal, subcutânea, intramuscular ou intraportal) ou infusão contínua estão adequadamente livres de matéria particulada e podem compreender de 1 mg a 10 g de anticorpo terapêutico, tipicamente 5 mg a 1 g, mais especificamente 5 mg a 25 mg ou 50 mg de anticorpo. Métodos para a preparação de tais composições farmacêuticas são bem conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte. Em uma modalidade, composições farmacêuticas compreendem de 1 mg a 10 g de anticorpos terapêuticos da invenção em forma de dosagem unitária, opcionalmente juntamente com instruções para uso. Composições farmacêuticas da invenção podem ser liofilizadas (secas por congelamento) para reconstituição antes da administração de acordo com métodos bem conhecidos ou evidentes para aqueles pessoas experientes na arte. Onde modalidades da invençãocompreendem anticorpos com um isótipo IgGl, um agente quelante de íons de metal incluindo cobre, tal como citrato (e.g. citrato de sódio) ou EDTA ou histidina, pode ser adicionado na composição farmacêutica para reduzir o grau de degradação mediada por metal dos anticorpos deste isótipo, veja EP0612251. Composições farmacêuticas também podem compreender um agente de solubilização tal como uma base arginina, um agente detergente/anti-agregação tal como polissorbato 80, e um gás inerte tal como nitrogênio para substituir o oxigênio do espaço confinante.

Doses e regimes de tratamento efetivos para administração do anticorpo da invenção são geralmente determinados empiricamente e são dependentes de fatores tais como a idade, o peso e o estado de saúde do paciente e a doença ou o distúrbio a ser tratada(o). Tais fatores estão dentro do discernimento do médico atendente. Orientações na seleção de doses apropriadas podem ser encontradas em e.g. Smith et al (1977) "Antibodies in human diagnosis and therapy", Raven Press, New York mas em geral serão de 1 mg a 10 g. Em uma modalidade, o regime de dosagem para tratar um paciente humano é de 1 mg a 1 g de anticorpo terapêutico da invenção administrado subcutaneamente uma vez por semana ou a cada duas semanas, ou por infusão intravenosa a cada 1 ou 2 meses. Uma tal dosagem corresponde a 0,014-140 mg/kg, tal como 0,014-14 mg/kg. Composições da presente invenção também podem ser usadas profilaticamente.

4.Usos clínicos.

Será reconhecido que doenças caracterizadas por níveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados incluem mal de Alzheimer, enfraquecimento cognitivo suave, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com β-amiloidose do tipo holandês, angiopatia β-amilóide cerebral e vários tipos de demências degenerativas, tais como aquelas associadas com doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, degeneração basal cortical e tipo de corpo de Lewis difuso de mal de Alzheimer.Mais preferivelmente, a doença caracterizada por níveis de β-amilóide ou depósitos de β-amilóide elevados é mal de Alzheimer.

Embora a presente invenção tenha sido descrita principalmente em relação ao tratamento de distúrbios ou doenças de humano, a presente invenção também pode ter aplicações no tratamento de distúrbios ou doenças similares em mamíferos não-humanos.

Exemplos Métodos

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Geração de anticorpo monoclonal de camundongo 2E7

Anticorpo monoclonal de camundongo 2E7 foi gerado de uma imunização convencional de camundongos. Camundongos foram imunizados com β-amilóide 1-40 e 1-42 solúvel ou agregado formulado em adjuvante de Freund. Após reforço final sem adjuvante, esplenócitos foram fusionados com células de mieloma. Células fusionadas foram crescidas em placas de 96 cavidades das quais sobrenadantes de hibridoma foram selecionados para exemplos potenciais. Anticorpo 2E7 selecionado, que foi obtido da imunização com β-amilóide 1-40 solúvel, foi de isótipo IgG2a murino e teve atividade de ligação de beta-amilóide no ensaio de efluxo descrito abaixo e uma afinidade de 36,1 pM para beta-amilóide 1-40 quando medido por Biacore™ Método A(i) (Tabela 10A).

Mapeamento de epítopo de 2E7

Com o propósito de finamente mapear a ligação de anticorpo 2E7 no peptídeo β-amilóide, um conjunto de peptídeos (A) foi utilizado. Conjunto de peptídeos (A) consistiu de um conjunto de 31 peptídeos de recobrimento de 12-meros cobrindo a seqüência completa do peptídeo β-amilóide 1-42. Cada peptídeo seqüencial foi iniciado no aminoácido seqüencial dentro do peptídeo β-amilóide, assim deslocando a seqüência coberta entre peptídeos seqüenciais por um único aminoácido. Todos os peptídeos no conjunto (A) continham um linker C-terminal de 3 aminoácidos (glicina-serina-glicina) e um resíduo de lisina biotinilada terminal. Em adição, todos os peptídeos exceto o peptídeo Αβί DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina (SEQ ID No: 15) estavam N-terminalmente acetilados. Um segundo conjunto de peptídeos (conjunto B)) consistiu de deleções N-terminais de um aminoácido seqüenciais de um peptídeo contendo aminoácidos 1 a 10 da seqüência β-amilóide. Todos os peptídeos em conjunto (B) continham um linker C-terminal de 3 aminoácidos (glicina-serina-glicina) e um resíduo delisina biotinilada terminal, mas com resíduos adicionais de glicina e serina para substituir os aminoácidos β-amilóide deletados (Tabela 2). Assim todos os peptídeos em conjunto (B) são de mesmo comprimento. Tabela 2

Seqüências de peptídeos biotinilados (conjunto B) que continham fragmentos N-terminais truncados de β-amilóide DAEFRHDSGYGSGGSK-biotina (SEQ ID No:7) DAEFRHDSG-GSGSGSK-biotina (SEQ ID No:8) DAEFRHDS-GSGGSGGK-biotina (SEQ ID No:9) DAEFRHD-GSGGSGGSK-biotina (SEQ ID No:10) DAEFRH-GSGGSGGSGK-biotina (SEQ ID No: 11) DAEFR—GSGGSGGSGSK-biotina (SEQ ID No: 12) DAEF-GSGGSGGSGGSK-biotina (SEQ ID No: 13) DAE-GSGGSGGSGGSGK-biotina (SEQ ID No: 14) Monitoração da ligação de 2E7 em peptídeos derivados de β-amilóide usando biossensores ópticos

Placas de 96 cavidades revestidas com estreptavidina SRU Bind™ (SRU Biosystems) foram lavadas com PBS contendo 1% de DMSO para remover glicerol e conservante. Um volume de 5(^l/cavidade foi deixado equilibrar na temperatura ambiente para proporcionar uma linha base constante. Peptídeos biotinilados foram diluídos para aproximadamente O^g/ml em PBS contendo 1% de DMSO e 50μ1 de cada foram adicionados nas cavidades e incubados por aproximadamente 1 h. Cavidades replicadas foram preparadas usando setores diferentes da placa e pelo menos uma cavidade de controle de não-peptídeo foi usada em cada setor para subtrair referência dos dados. Após captura de peptídeo a placa foi lavada com PBS contendo 1% de DMSO, deixando 50μ1 de tampão fresco por cavidade para proporcionar uma linha base nova na leitora. Não foi visto decaimento de peptídeo da superfície. O tampão foi então substituído com 40μ1 detampão/cavidade contendo anticorpo de teste a 20-64 nM por 2 horas. Foi verificado que anticorpo 2E7 apenas se ligou no peptídeo incluindo aminoácidos 1-12 do peptídeo β-amilóide no conjunto de peptídeos (A) (peptídeo Αβί, SEQ ID No: 15). Este resultado implica que o ácido aspártico no resíduo 1 é crítico para ligação neste peptídeo.

Com o propósito de adicionalmente caracterizar o sítio de ligação de anticorpo 2E7, conjunto de peptídeos (B) foi utilizado. Usando metodologia de biossensor SRU BIND™ anticorpo 2E7 mostrou ligação desprezível nos peptídeos incluindo aminoácidos 1-3 e 1-4 de peptídeo β-amilóide (SEQ ID No: 14 e 13). Ligação em um peptídeo incluindo aminoácidos 1-7 do peptídeo β-amilóide (SEQ ID No: 10) foi comparável com o peptídeo incluindo aminoácidos 1-12 do peptídeo β-amilóide (do conjunto de peptídeos (A)). Ligação em peptídeos incluindo aminoácidos 1-5 ou 1-6 do peptídeo β-amilóide(SEQ ID No: 12 ou 11) foi observada, mas foi mais fraca (conforme medida por estabilidade após uma etapa de lavagem adicional) do que a ligação no peptídeo incluindo aminoácidos 1-7 do peptídeo β-amilóide (SEQ ID No: 10).

Assim tem sido mostrado que apenas resíduos 1-7 do peptídeo β-amilóide são requeridos para ligação total conforme medida usando esta metodologia.

Ensaio de ressonância de plasmon de superfície

Em adição aos experimentos descritos acima, o biossensor óptico Biacore 3000 foi usado para monitorar a ligação de anticorpo 2E7 nos peptídeos derivados de seqüência β-amilóide selecionados. Ligação foi medida por injeção de anticorpos de teste em até 64 nM por 5 minutos sobre peptídeos capturados sobre superfícies de pastilha de estreptavidina separadas (130-230 RU (unidades de ressonância)). Um tampão de corrida (HBS-EP) contendo HEPES O5OlM pH7,4, NaCl 0,15M, EDTA 3 mM e Surfactant P20™ 0,005% a 25°C foi usado em uma vazão de fluxo de 20 μΐ/min. Todasas corridas foram referidas duplamente contra uma superfície de estreptavidina em branco e injeções em branco. Análise foi realizada usandoBiacore analysis software BIAevaluation versão 4.1. Resultados dos peptídeos selecionados em conjunto (A) adicionalmente confirmaram os dados derivados de SRU BIND™ indicando a ligação de 2E7 apenas no peptídeo incluindo os aminoácidos 1-12 (SEQ ID No: 15) do peptídeo β-amilóide com uma constante de equilíbrio aparente KD de aproximadamente 50 pM. Sob as mesmas condições, 2E7 não se ligou no peptídeo contendo aminoácidos 2-13 do peptídeo β-amilóide.

Peptídeo Αβ2-13 AEFRHDSGYEVHGSGK-biotina (SEQ ID No:44)

Ao método e as condições experimentais usados permitiram a detecção de moléculas de afinidade alta mas também mais baixa - na mesma configuração experimental, em contraste com 2E7, foi mostrado que outro anticorpo reconhecendo um epítopo N-terminal do peptídeo β-amilóide se liga no peptídeo 2-13 (SEQ ID No:44) com uma KD aparente de 7 nM. 2E7 não se ligou em uma seleção de peptídeos no conjunto (A) das regiões do meio do peptídeo β-amilóide. Em um experimento separado o peptídeo β-amilóide 1-40 foi capturado via seu resíduo de ácido aspártico N-terminal que havia sido biotinilado. Este peptídeo foi capturado sobre uma pastilha revestida de estreptavidina Biacore™ como previamente descrito. Anticorpo 2E7 injetado a 66 nM por 1 minuto não pôde se ligar neste peptídeo. Portanto, é concluído que o sítio de ligação N-terminal previamente descrito foi mascarado pelo linker e método de captura, confirmando assim adicionalmente a terminação-N extrema como contendo o sítio de ligação central.

Ligação em proteína precursora de amilóide (APP) expressada por célula

β-Amilóide é composto de peptídeos formados por clivagem proteolítica de um tipo de proteína precursora de membrana chamada de proteína precursora de amilóide (APP). Como APP possui um domínio extracelular grande, ligação nesta proteína poderia potencialmente iniciar umareação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

Para caracterizar a ligação de anticorpo em APP de comprimento total de superfície de célula foi utilizado um ensaio baseado em FMAT™ ABI8200.

Transfecção de células HEK293T com APP DNA de tipo selvagem

Células HEK293T foram mantidas em meio DMEM F12 contendo 10 % (v/v) de FCS e Ix Glutamax. Células são semeadas em frascosde cultura de tecido de 75 cm e crescidas para confluência de 60-80% (18-24 h) antes da transfecção. Para transfecção, 9 μ§ de DNA, (quer de APP DNA de tipo selvagem (em vetor PCDNA3.1 (Invitrogen)), quer controles aqueles pessoas experientes na arte de vetor), são misturados com 0,3 ml de meio Opti-MEM™. 30μl de agente de transfecção Lipofectamine™ são misturados com 0,3ml de meio Opti-MEM™ e as duas misturas são reunidas. As misturas reunidas são incubadas na temperatura ambiente por 30 min antes da adição de mais 4,8 ml de meio Opti-MEM™. A mistura final é adicionada nas células (após a lavagem com meio OptiMEM™) por 5 h e 6 ml de soro de recém-nascido bovino 10 % (v/v) em DMEM são então adicionados. 48 Horas após a transfecção, sobrenadante é removido e a monocamada é lavada em versene, e então 3 ml de agente quelante Versene™ são adicionados em cada frasco, incubados pro 5 min a 37°C, e as células soltas são pelotizadas a 200 g por 5 min. A pelota de célula resultante é cuidadosamente ressuspensa em 1 ml de tampão de ensaio (2% de soro tratado com calor, 0,5% de BSA, 0,1% de NaN3 em PBS pH7,4, filtrado através de um filtro de 0,2μηι) para criar uma suspensão de célula única.

Ensaio baseado em FMAT™ ABI8200

Anticorpos de teste (IgG de camundongo 2E7, LN27 (Zymed) em domínio extracelular de APP como um controle positivo, e um anticorpo G210 que reconhece a forma x-40 do peptídeo β-amilóide como um controle negativo) foram diluídos para 10μg/ml em tampão de ensaio filtrado estéril(2% de soro tratado com calor, 0,5% de BSA5 0,1% de NaN3 em PBS pH7,2) em uma placa de polipropileno, e então mais seis diluições seriais 1:1 foram realizadas na placa. Tampão de ensaio apenas foi usado como um branco. 50μ1 de uma suspensão de células HEK293T transfectadas com APP DNA de tipo selvagem (Experimento 1: 10.000 células; Experimento 2: 20.000 células) foram adicionados em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades, nas quais 5 μl de cada uma das soluções de anticorpo foram adicionados em células em duplicata. 50 μΐ/cavidade de estoque de IgG anti-camundongo azul F-MAT™, (anticorpo é marcado usando kit de corante reativo monofuncional azul F-MAT™ de ABI, 4328408), diluído 1:500 (Experimento 1) e 1:1000 (Experimento 2) em tampão de ensaio, foi então adicionado em cada cavidade e a placa foi brevemente agitada e deixada sedimentar por 1 h. A placa foi então lida usando o sistema de detecção celular macroconfocal de fluorescência ABI 8200(Applied Biosystems).

Dados de contagens derivados foram então interpretados usando o programa de computador de planilha Excel™. Resumidamente, contagens de transfectado falso foram subtraídas das contagens de célula transfectada com APP de comprimento total para obter um sinal específico para cada anticorpo. Duas concentrações de anticorpo que estavam na parte linear da curva foram escolhidas (1,25 e 0,63μg/ml) e as contagens derivadas corrigidas de fundo nestas concentrações foram expressadas como a percentagem da ligação de anticorpo LN27, e tomadas na média sobre duas concentrações de anticorpo. Os dados resultantes são descritos em Tabela 3 (% de ligação de LN27 ±SE)

Assim, dentro deste sistema de ensaio, a ligação de 2E7 em APP de superfície celular é indistinguível daquela do anticorpo de controle negativo G210.

Tabela 3

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Ligação em peptídeo derivado de proteína precursora de amilóide

Os estudos de mapeamento de epítopo previamente descritos têm mostrado que o anticorpo 2E7 se liga na terminação-N extrema do peptídeo β-amilóide, com o resíduo de ácido aspártico na posição 1 sendo essencial para a ligação. Isto sugere que o anticorpo reconhece um 'neo' epítopo formado pela clivagem de APP no sítio de β-secretase. Esta observação sugeriria que o anticorpo 2E7 não deveria reconhecer seqüência de peptídeo de APP adjacente. Para testar esta hipótese foi sintetizado um peptídeo de APP (Peptídeo APPl5 SEQ ID No: 16) que incluía os resíduos 1-7 do peptídeo β-amilóide e os cinco aminoácidos derivados de APP adjacentes. Assim peptídeo APPl continha aminoácidos contíguos da posição 5 N-terminal ao sítio de clivagem BACE-I à posição 7 C-terminal ao sítio de clivagem BACE-I e foi N-terminalmente acetilado. A capacidade do anticorpo 2E7 em se ligar no peptídeo APPl derivado de APPe no peptídeo β-amilóide 1-12 (peptídeo Αβί) foi comparada usando a metodologia Biacore™ (como previamente descrito para mapeamento de epítopo). Anticorpo 2E7 mostrou ligação de afinidade alta para o peptídeo β-amilóide Αβ-l, que contém o epítopo básico 1-7. Contudo, nenhuma ligação foi observada no peptídeo APPl que também contém a seqüência 1-7 derivada de β-amilóide básico.

Peptídeo Αβί DAEFRHDSGYEVGSGK-biotina SEQ ID No: 15

APP1 AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-biotina SEQ ID No: 16

Uma combinação de ligação celular baseada em FMAT™ e mapeamento de peptídeo baseado em Biacore™ tem sido utilizada para mostrar que, nestes formatos, 2E7 não tem afinidade de ligação pela proteína APP de comprimento total. Dado que o resíduo de ácido aspártico na posição 1 do peptídeo β-amilóide é requerido para ligação, é concluído que 2E7 apenas reconhece a 'neo' terminação-N de β-amilóide e como conseqüêncianão deve se ligar em APP expressada em superfície de célula. Atividade biológica in vivo Modelo de efluxo de I125 β-amilóide

Numerosos estudos publicados têm mostrado que os anticorpos β-amilóide podem formar complexos com peptídeo β-amilóide na corrente sangüínea. É argumentado que este seqüestro de β-amilóide periférico permite efluxo adicional de amilóide de CNS para dentro da corrente sangüínea (DeMattos RB, PNAS (2001), 98(15); 8850-8855). Um modelo farmacodinâmico agudo foi desenvolvido para selecionar anticorpos para sua capacidade para complexar com peptídeo β-amilóide derivado de cérebro na corrente sangüínea.

Anestesia (isoflurano 4%) foi induzida em camundongos machos C57/BL6J e mantida (isoflurano 1,5%) em oxigênio 100%. Animais foram então posicionados em um andaime estereotáxico. Após incisão na linha do meio ao longo da sutura sagital um orifício foi perfurado através do crânio e uma cânula guia foi inserida no ventrículo cerebral lateral (coordenadas anterioposterior (AP) -0,5 mM, lateral (L) +0,7 mM, ventral (V) -2,5 mM). Outros dois orifícios foram perfurados através do crânio para dentro dos quais foram posicionados parafusos corticais. A cânula foi ancorada no lugar por gel de cianoacrilato e a incisão foi suturada ao redor da tampa de cabeça. Após a operação os camundongos receberam 0,3 ml de solução salina subcutaneamente e foram deixados em um ambiente quente para se recuperaram da anestesia. Com recuperação do reflexo direito, os camundongos foram alojados individualmente e receberam cuidado pós-operatório padrão de 5 dias. Não foram permitidos procedimentos por mais 5 dias ou até que peso corporal pós-operatório fosse readquirido. Após a recuperação, o posicionamento da cânula foi verificado por resposta de bebida de angiotensina II. Cada camundongo recebeu uma administração intracerebroventricular (ICV) (5μ1) de 100 ng de angiotensina II (AII)(composta em solução salina 0,9%). Após a administração de Ali, ingestão de água foi observada por 15 minutos. Os camundongos com uma resposta dipsogênica positiva à AII (bebida prolongada) foram incluídos nos estudos, que começaram não mais cedo do que cinco dias após a injeção de AIL

No dia de estudo os camundongos foram deixados 5-10 minutos em um ambiente quente para induzir vasodilatação, necessária para facilitar a injeção para dentro da veia da cauda. Anticorpo de teste (600μg) ou veículo PBS (volume de dose não maior do que 10 ml por kg de peso corporal) foi injetado via a veia da cauda e os camundongos foram retornados para as suas gaiolas individuais após a injeção. A exatamente uma hora após a injeção na veia da cauda, os camundongos foram lentamente injetados ICV(2μ1 por minuto) com 2 ng (1 μΟϊ) de I beta-amilóide 1-40 (Amersham Biosciences, UK) em um volume de dose de 5μ1. A exatamente quatro horas após a dose ICV, 50μ1 de sangue de tronco foram coletados e o nível de radioatividade foi medido em um contador de cintilação.

Camundongos que haviam sido injetados na veia da cauda com 2E7 (n=6 por grupo de tratamento) mostraram um aumento estatisticamente significativo no sinal radioativo (contagens por minuto — C PM) em 50μ1 de sangue de tronco comparado com o sinal de C PM detectado em camundongos injetados com veículo — (C PM — veículo: 1339,7 ± 496,2 vs. 2E7 4387,9 ± 980,3; ANOVA:F(2,13) = 4,97, p<0,05. Post-hoc LSD: p=0,01 2E7 vs. veículo [post-hoc Duncans: p=0,02 2E7 vs, veículo]).

Em dois outros estudos com 2E7 conduzidos com o protocolo idêntico, aumentos similares em efluxo de amilóide para dentro do sangue quando comparado com controles injetados com veículo foram observados (sangue C PM: Veículo 352 +/- 113 versus 2E7 2397 +/- 353, e Veículo 1281 +/- 312 versus 2E7 5291 +/- 885; ANOVA com teste de post-hoc LSD p<0,001 vs. veículo).

Modelos de abaixamento de Transgenic β-amilóide de CNS1. Carga de β-amilóide após dosagem de 4 semanas de camundongos TAST PM 4 de 2 meses de idade

Camundongos machos e fêmeas transgênicos TAST PM (mutante duplo APPswe χ PS1.M146V, Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136) envelhecidos entre 61 e 65 dias no início do estudo e foram individualmente alojados. Números iguais de camundongos foram designados para cada grupo de tratamento (N= 12 per grupo) e foram separados aleatoriamente por meio de sexo e idade. Grupos de tratamento compreenderam os seguintes: A: MOPC21 (anticorpo com especificidade desconhecida, Holton et al (1987) J.Immunol 139(9) 3041-3049, controle negativo), Β: 2E7 (anticorpo de teste). Todos os anticorpos foram dissolvidos em PBS e foram dosados pela rota intraperitoneal. Independente do peso do animal, 300μg de anticorpo foram administrados. Animais foram dosados duas vezes semanalmente por quatro semanas. Um dia após a dose final, os animais foram mortos por superdosagem com pentobarbital sódico. Cérebros foram dissecados e hemisseccionados. Amostras de cérebro hemisseccionado foram coletadas em tubos Eppendorf™ de 2 mL pré-pesados e rapidamente congelados. Amostras foram subseqüentemente descongeladas, repesadas, repesadas e 1 ml de guanidina HCl 5 M contendo tabletes de Complete protease inhibitor™ (Boehringer Mannheim) foi adicionado, antes de as amostras serem homogeneizadas e incubadas a 4°C por >90 min com agitação constante.

Amostras foram então diluídas 1 em 10 em tampão de ensaio (Tris HCl 50 mM, pH7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 0,05% + BSA 1%), agitadas e centrifugadas a 20.000G por 20 min a 4°C. O sobrenadante foi removido e adicionado como amostras em triplicata na placa de ensaio.

Os níveis de A640 e Al342 foram medidos usando um imunoensaio eletroquimioluminescente baseado em placa sensível (BioVeris™) empregando anticorpos β-amilóide específicos C-terminais(para Αβ40 ou Αβ42) marcados com marcador específico Oritag™ para facilitar detecção (BioVeris™) usados para captura quer de Αβ40 quer de Αβ42, juntamente com um anticorpo Αβ específico N-terminal biotinilado. Complexos de anticorpo-Αβ foram capturados com glóbulos revestidos de estreptavidina que se ligam em anticorpos biotinilados (Dynabeads™, Dynal) incubados durante a noite na temperatura ambiente com misturação vigorosa e ensaiados em um fotodetector BioVeris™ M8. Curvas padrão foram construídas usando peptídeos Αβ40 e Αβ42 de humano em tampão de ensaio contendo a concentração requerida de Guanidina HCl. Dados foram analisados usando programa de computado de análise estatística Excel Robosage™ e níveis de Αβ foram expressados como pMol/g de tecido.

Neste paradigma, tratamento com anticorpo 2E7 reduziu carga de CNS Αβ42 em 37% (p<0,001) e CNS Αβ40 em 23% (p<0,001).

Em estudos subseqüentes sob condições experimentais similares, anticorpo 2E7 reduziu carga de CNS Αβ42 em 38% (Estudo 1, machos apenas), 22% (Estudo 2, não-significativo) e 39% (Estudo 3, machos, p=0,001) e 13% (Estudo 3, fêmeas, não-significativo) quando comparado com animais tratados com PB S. Nestes estudos 2E7 também reduziram CNS Αβ40 em 18% (Estudo 3, machos, p=0,017) e ofereceram uma redução não-significativa em CNS Αβ40 em 25% (Estudo 1, machos apenas), <1% (Estudo 2) e um aumento não-significativo de 3% (Estudo 3, fêmeas) quando comparado com animais tratados com PBS.

2. Carga de β-amilóide após dosagem de 4 meses de camundongos TAST PM de 4 meses de idade.

Resumidamente, camundongos transgênicos TAST PM de 4 meses de idade foram dosados com 300 μg de anticorpo uma vez ou duas vezes por semana via uma rota intraperitonial (i.p.). Após 4 meses de dosagem os níveis de CNS β-amilóide foram medidos por ELISA e carga de placa foi medida por imuno-histoquímica. Entre as idades de 4 e 8 meses, acarga de CNS β-amilóide aumenta exponencialmente e conseqüentemente, patologia de placa se desenvolve rapidamente (Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136).

Camundongos foram envelhecidos entre 120 e 128 dias no início do estudo e foram individualmente alojados. Números similares de camundongos foram designados para cada grupo de tratamento (N=20 ou 21 por grupo) e foram separados aleatoriamente de acordo com o sexo e a idade. Grupos de tratamento compreenderam os seguintes: A: PBS (veículo) dosados duas vezes por semana, Β: 2E7 dosados uma vez por semana, C: 2E7 dosados duas vezes por semana, D: PBS dosados uma vez por semana. Uma dose de 300 microgramas (volume de 79 microlitros) de 2E7 foi administrada via a rota intraperitoneal. Animais tratados com veículo receberam o mesmo volume de PBS. Animais foram dosados por dezoito semanas. Camundongos TAST PM são propensos para sofrerem de convulsões espontâneas e como um resultado numerosos animais morreram durante o curso do estudo. Membros finais foram os seguintes A: 4 fêmeas, 9 machos; B: 5 fêmeas, 8 machos; C: 4 fêmeas, 9 machos; D: 2 fêmeas, 9 machos. Dois ou quatro dias após a dose final (números iguais por grupo) os animais foram mortos por superdosagem com pentobarbital sódico. Uma amostra da ponta da cauda de cada camundongo foi tirada para confirmação do genótipo. Cérebros foram dissecados e hemisseccionados. O hemisfério direito foi fixado por imersão em paraformaldeído 4% e processado para histologia. O hemisfério esquerdo foi coletado para dentro de tubos Eppendorf™ de 2 mL pré-pesados, congelado sobre gelo seco e armazenado a -80°C para análise subseqüente de conteúdo amilóide. Antes da análise, as amostras foram descongeladas, repesadas e 1 ml de guanidina HCl 5 contendo tabletes Complete protease inhibitor™ (Boehringer Mannheim) foi adicionado, antes de as amostras serem homogeneizadas e incubadas a 4°C por >90 min com agitação constante.Amostras foram então diluídas 1 em 10 em tampão de ensaio (Tris HCl 50 mM pH7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 0,05% + BSA 1%), agitadas e centrifugadas a 20.000G por 20 min a 4°C. Os sobrenadantes foram diluídos a mas 1:1000 e adicionados como amostras em triplicata na placa de ensaio.

Os níveis de Αβ40 e Αβ42 foram medidos como para o estudo de dosagem de 4 semanas.

Uma analise de variância foi usada com tratamento, sexo e horário de dosagem incluídos no modelo com efeitos fixos. Todas as interações entre os três fatores também foram incluídas. Não houve diferenças significativas entre os dois horários de dosagem (uma vez ou duas vezes por semana). Com este planejamento experimental, primeiro pôde ser avaliado se houve quaisquer diferenças significativas entre os horários de dosagem e segundo, como não houve quaisquer diferenças significativas, dados dos dois horários de dosagem puderam se combinados, aumentando assim o poder do experimento pela duplicação do número de camundongos na análise.

Neste paradigma, tratamento com anticorpo 2E7 reduziu carga de CNS Αβ42 em 22,5% (p=0,0152). Níveis de CNS Αβ40 também foram abaixados em 12,1%, mas este número não alcançou significância estatística (P=0,118).

Uma análise imuno-histoquímica complexa destas amostras foi realizada para definir a área de tecido cerebral mostrando patologia de placa. Seções foram retiradas do córtex no nível de caudado e do córtex em nível do hipocampo. Seções adjacentes foram coradas quer com um anticorpo específico para Αβ40 ou Αβ42 quer alternativamente com o colorante amilóide Vermelho Congo. Usando programa de computador de análise de imagem, a área da seção corada para placa foi expressada como uma percentagem da área de seção total.

Após fixação, os meio-cérebros imersos em PFA foramcoronalmente cortados em uma matriz cerebral em 6 seções de espessura de 2 mM. Estas seções de 2 mM serão referidas como as seções A a F, A sendo a mais rostral e F a mais caudal. Seções A, B&CeD, E&F foram posicionadas em cassetes de embebimento separados numerados para cada animal. Cassetes foram mantidos em PFA até prontos para processamento e embebimento.

Embebimento foi realizado em um processador de tecido Citadel™ 1000 (Shandon). Todos os tecidos receberam o seguinte regime de processamento:

IMS 70%—Ih

IMS 100% — 3 χ 1 h etanol 100%— 2 h

isobutil-álcool 100%; 1 χ 2 h; 1 χ 1,5 h

Histoclear™ — 2 χ 1,5 h

Cera de parafina — 2 χ 2 h

Na completitude do ciclo de processamento, as seções de tecido impregnadas com cera foram transferidas para armações de base cheios de parafina fundida e embebidos utilizando um sistema de embebimento de parafina Histocentre™ (Shandon). Tecido foi embebido de tal modo que seções A, B & C foram para uma armação; D, E & F foram para um segunda armação. Isto foi realizado para todos os conjuntos de seções ie. cada cérebro hemi-seccionado resultou em dois blocos de cera de três seções cada. Seções foram posicionadas em armações de tal modo que a superfície caudal de cada pedaço se tornasse a superfície de corte futura. Cuidado foi tomado para garantir que cada seção fosse empurrada bem para baixo dentro da armação de modo que microtomia de cada pudesse ocorrer em paralelo. O cassete de processamento perfurado foi então cuidadosamente posicionado sobre cada armação que foi então sobrerrevestido com uma cera fundida. Blocos embebidos foram então esfriados sobre a placa refrigerada até que pudessemser removidos dos armações. Blocos foram armazenados na temperatura ambiente até requeridos para microtomia. Blocos foram cortados aleatoriamente e seções de 5 micrômetros foram pairadas sobre lâminas revestidas de gelatina, pré-rotuladas (Superfrost™, Erie Scientific Company). Duas seções foram pairadas em cada lâmina. Sempre que possível, seções consecutivas foram montadas e lâminas foram numeradas consecutivamente de 1 a 25. Cinqüenta seções (25 lâminas) foram tiradas de cada bloco. Lâminas foram secas sobre uma placa quente e então armazenadas na temperatura ambiente até requeridas.

Imuno-histoquímica foi realizada sobre conjuntos de 30 lâminas. Sobre cada lâmina, a seção de topo foi marcada com um anticorpo A640 (G30, policlonal de coelho reconhecedor de x-40 β-amilóide), a seção inferior com o anticorpo A642, 20G10, anticorpo monoclonal reconhecedor de x-42 β-amilóide. Um mínimo de 5 seções por bloco foi marcado.

Marcação foi realizada como segue. Após remoção de cera através de Histoclear e álcoois graduados, seções foram imersas em ácido fórmico 85% por 8 minutos e então bloqueadas em peróxido de hidrogênio 0,3% por 30 minutos para bloquear peroxidases endógenas. Anticorpos G30 e 20G10 foram ambos aplicados durante a noite em diluições de 1:1000, seções sendo deixadas a 4°C. Revelação das seções foi com os respectivos secundários anti-coelho e anti-camundongo biotinilados. Revelação de cor foi realizada com um kit de coloração de tetracloridrato de diamino-benzidina (DABTM, Vector Labs). Seções foram brevemente contra-coradas com hematoxilina de Mayer antes de serem desidratadas, limpas e cobertas com lamínula.

Seções foram deixadas secar por pelo menos 48 horas antes da microscopia. Imagens foram capturadas em um microscópio Leica DMRB™ equipado com câmera digital. Imagens foram analisadas usando programa de computador Qwin™ (Leica) e os resultados foram apresentados como % daárea de seção que foi marcada pelo anticorpo Αβ.

Uma analise de variância foi usada com tratamento, sexo e horário de dosagem incluídos no modelo com efeitos fixos. Todas as interações entre os três fatores também foram incluídas. Não houve diferenças significativas entre os dois horários de dosagem (uma vez ou duas vezes por semana). Com este planejamento experimental, primeiro pôde ser avaliado se houve quaisquer diferenças significativas entre os horários de dosagem e segundo, como não houve quaisquer diferenças significativas, dados dos dois horários de dosagem puderam se combinados, aumentando assim o poder do experimento pela duplicação do número de camundongos na análise.

Neste paradigma, tratamento com anticorpo 2E7 reduziu patologia de placa conforme medido com um anticorpo reconhecedor de Αβ42. Patologia de placa foi reduzida em 27,1% (p=0,0026) no córtex no nível do hipocampo e em 43% (p<0,0001) no córtex no nível de caudado. Patologia de placa também foi reduzida quando medida com um anticorpo reconhecedor de Αβ40. Patologia de placa foi reduzida em 16,6% (p=0,0421) no contexto do córtex no nível do hipocampo e em 17,3% (p=0,0342) no córtex no nível do caudado.

Não foi observada evidência de micro-hemorragia (como determinada por Azul da Prússia de Peris) em qualquer um dos camundongos deste estudo tratados com veículo ou 2E7. Este método visualiza ferro férrico (ferro é um constituinte essencial da hemoglobina carreadora de oxigênio encontrada em células vermelhas) pela produção de um composto azul insolúvel. Todos os níveis de cérebro de todos os animais estavam limpos.

Modelos de cognição

Após a dosagem de 4 meses dos camundongos TAST PM de 4 meses de idade como descrito acima, estes camundongos foram testados em dois modelos de cognição: o ensaio de reconhecimento de objeto e o ensaio de condicionamento de medo.Ensaio de reconhecimento de objeto

O ensaio de reconhecimento de objeto explora a propensão natural do animal para explorar objetos novos e baseia-se na capacidade do animal para se lembrar de um objeto que havia sido explorado previamente (objeto familiar). Tem sido relatado que camundongos TAST PM de oito meses de idade demonstram um déficit na capacidade para distinguir entre objetos novos e familiares (Howlett et al., 2004) indicando desempenho cognitivo enfraquecido nestes animais. Neste estudo, contido, camundongos TAST PM de 8 meses de idade tratados com veículo falharam em demonstrar enfraquecimento cognitivo i.e. eles foram capazes de distinguir entre objetos novos e familiares. Não houve janela para investigar qualquer efeito terapêutico potencial resultante do tratamento com 2E7.

Ensaio de condicionamento de medo

O modelo de condicionamento de medo foi planejado para testar a capacidade do animal para correlacionar um estímulo doloroso prévio com um sinal contextual ou sugestivo e se lembrar disto quando apresentado ao mesmo contexto ou tom após demora de X h. Neste estudo camundongos TAST PM de 8 meses de idade tratados com 8 veículo (uma ou duas vezes por semana) exibiram um déficit em diferenciação contextual indicativo de enfraquecimento cognitivo nestes animais. Este déficit não foi afetado pelo tratamento com 2E7 quando administrado uma vez duas semanalmente. Dosagem de 4 meses de camundongos TAST PM de 6 meses de idade.

Este estudo envolveu a administração de 2E7 (300μg i.p. duas vezes por semana) a camundongos TAST PM por 4 meses, partindo da idade de 3 meses. Animais de controle receberam IgG2A em PBS. Como descrito acima, cérebros foram dissecados e hemi-seccionados. O hemisfério direito foi fixado por imersão em paraformaldeído 4% e processado por histologia. O hemisfério esquerdo foi coletado em tubos Eppendorf™ de 2 ml pré-pesados, congelado sobre gelo seco e armazenado a -80°C para análise subseqüente deconteúdo amilóide.

Uma análise preliminar de uma seção única de cada uma de seleção aleatória de amostras de cérebro (n=6 veículo, n=7 grupo tratado com 2E7) por IHC foi realizada usando o mesmo protocolo geral como acima. Análise estatística (teste-t de Student) mostrou que houve um decréscimo significativo em carga de placa Αβ42 em tálamo (71,9%, p=0,007) e em tálamo + córtex + hipocampo (54,1%, p=0,022) em camundongos dosados com 2E7 mas mudança não significativa em Αβ40.

Para medição bioquímica Αβ40 e Αβ42 de cérebro, amostras foram processadas e medidas como acima (fator de diluição 1:10,000). Αβ42 foi significativamente decrescido (p=0,01) em 29,9% em camundongos dosados com 2E7 (n=12 controle, n=16 tratado). Concentrações de Αβ40 também foram decrescidas (22,6%) mas esta diminuição falhou em alcançar significância estatística (p=0,052). Clonagem de regiões variáveis de hibridoma Seqüências de região variável

RNA total foi extraído de células de hibridoma 2E7 e seqüências de cDNA de domínio variável pesado e leve foram então geradas por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). O iniciador direto para RT-PCR foi uma mistura de iniciadores degenerados específicos para seqüências líderes de gene de imunoglobulina murino e o iniciador inverso foi específico para as regiões constantes de anticorpo, neste caso isótipo IgG2a murino para a cadeia pesada e kappa murino para a cadeia leve. Iniciadores foram planejados de acordo com a estratégia descrita por Jones e Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). RT-PCR foi realizada em duplicata para ambas as seqüências de região V para permitir verificação subseqüente das seqüências de região V corretas. Os produtos de região V gerados por RT-PCR foram clonados (Invitrogen TA Cloning Kit) e os dados de seqüência foram obtidos.Seqüência de aminoácidos 2E7 Vh (SEQ ID No: 17) evklvesggglvqpggslklscavsgftfsdngmawvroaprkgpewiafisnla

tvsa

Seqüência de 2E7 Vh DNA (SEQ ID No: 18)

gaggtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccc

tgaaactctcctgtgcagtctctggattcagtttcagtgacaacggaatggcgt

gggttcgacaggctccaaggaaggggcctgagtggatagcgttcattagtaat

ttggcatatagtatcgactacgcágacactgtgacgggccgattcaccatctct

agagataatgccaagaataccctgtacctggaaatgagcagtctgaggtctgag

gacacggccatgtactattgtgtaagcgggacctggtttgcttactggggccaa

gggactctggtcactgtctctgca 5 Seqüência de aminoácidos 2E7 Vl (SEQ ID No: 19)

DWLTQTPLSLPVSLGDQASISCRVSQSLLHSNGYTYLMWYLQ KPGQSPKLLi YKVS NRFSGVPPRFSGSGSGTDFTLKiSRVEAEPLGVYFCSQTRHVPYTFGGGTKLEiK

Seqüência de 2E7 Vl DNA ((SEQ ID No:20)

gatgttgtgctgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaa g cctccatctcttgcag agttagtc ag ag c cttttac acagtaatggatacacct atttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctaca aagttt ccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcag ggagagatttçacagtcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtt t atttctg ctctc aaactag acatgttccgtacacgttcggagg gggg acc aag ctggaaataaaa

Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão 10 sublinhadas nas seqüências de aminoácidos. Clonagem e expressão de quimera 2E7

Um anticorpo 2E7 quimérico (2E7c) consistindo das regiões V murinas parentais grafitizadas em IgGl de humano (Fc mutado (L235A, G237A)) para as regiões kappa C de humano de cadeia leve ou regiões de 15 cadeia pesada foi gerado com o objetivo de expressar material de anticorpo recombinante que pudesse ser usado para confirmar a clonagem correta de regiões V murinas funcionais. DNA codificador de regiões V de cadeias pesada e leve murinas de 2E7 e de seqüências de sinal murinas endógenas foi clonado em matriz nos vetores de expressão em mamífero RLD-bshe (para a 20 cadeia pesada) e RLN-bshe (para a cadeia leve) já contendo as regiões constantes de humano (IgGl Fc mutado (L235A, G237A) ou kappa C de humano, respectivamente).

Elementos de vetor de expressão RLD-bshe para expressão decadeia pesada:

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(posição dos elementos e tamanho total do vetor dados acima apenas são para propósitos de ilustração e dependerão do tamanho do inserto de cadeia de anticorpo)

Elementos de vetor de expressão RLN-bshe para expressão decadeia leve:

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(posição dos elementos e tamanho total do vetor dados acima apenas são para propósitos de ilustração e dependerão do tamanho do inserto de cadeia de anticorpo)

Clones com seqüências Vh e Vl corretamente clonadas foram identificadas e plasmídeos foram preparados para expressão em células CHO em cultura de suspensão. Anticorpo 2E7C expressado foi purificado do sobrenadante de cultura de célula por cromatografia de proteína A em um sistema FPLC, e então testado para ligação em Αβ por ELISA e SPR usando tecnologia Biacore™. Os resultados indicaram que as regiões V de camundongo de 2E7 corretas foram clonadas e expressadas, resultando em um anticorpo funcional com características similares às do anticorpo murino parental 2E7.Humanização de cadeia leve

Um seqüência receptora de humano com o Genpept ID CAA51135 (SEQ ID No:24) e número de acesso no Genbank de X72467, que tinha 77% de identidade em nível de aminoácido (incluindo CDRs) foi selecionada como a armação receptora. Construto Ll é um grafitizado de CDRs murinas do domínio 2E7 Vl neste armação receptora. Humanização de cadeia pesada

Seqüência de humano de número de acesso no Genbank de M99675 (SEQ ID No:21) um alelo do gene νΗβ-48 com 74% de identidade no nível de aminoácido (incluindo CDRs 1 e 2) à região pesada variável de camundongo de 2E7 foi selecionada como a armação receptora de cadeia pesada de humano junto com o minigene JH4. Três variantes de cadeia pesada variável humanizadas foram planejadas baseado na seqüência M99675 e em JH4. Hl é um grafitizado das CDRs murinas usando a definição de Kabat com as retro-mutações de armação adicionais em posições 93 e 94. H2 e H3 foram ambos derivados de Hl5 mas incorporaram uma mutação de armação adicional que foram diferentes em cada construto; (posições 24 e 48 respectivamente; veja Tabela 4).

Tabela 4

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Construção de DNA de cadeias pesada e leve humanizado

Regiões V humanizadas foram sintetizadas de novo por construção de oligos de recobrimento e amplificação por PCR. Sítios de restrição para clonagem em vetores de expressão de mamífero RLD-bshe e RLN-bshe e seqüências de sinal de imunoglobulina de humano derivadas das armações receptoras de humano escolhidos foram incluídos. Os DNAs codificadores de regiões V humanizadas (H1 (SEQ ID NO:27), H2 (SEQ IDΝΟ:29), Η3 (SEQ ID ΝΟ:31), Ll (SEQ ID ΝΟ:33)) juntos com as seqüências de sinal e sítios de restrição foram então clonados em matriz em vetores de expressão de mamífero: Hl5 H2 e H3 em RLD-bshe para gerar DNA codificador de três cadeias pesadas mutadas IgGl Fc de humano de comprimento total cada uma contendo mutações L235A e G237A, Hl de comprimento total (SEQ ID NO:35), H2 de comprimento total (SEQ ID NO:37) e H3 de comprimento total (SEQ ID NO:39); Ll foi clonado em matriz em RLN-bshe contendo o DNA codificador de região constante kappa de humano para gerar DNA codificador de uma cadeia leve kappa de humano de comprimento total (SEQ ID NO:41).

Exemplos representativos de expressão de combinações de anticorpos de cadeias leve e pesada humanizados

Células CHOKl foram transientemente transfectadas em estala pequena com todas as combinações de construtos de DNA de cadeias leve e pesada humanizadas: Ll+Hl, L1+H2, L1+H3 (SEQ ID Nos: 35 + 41, 37 + 41, 39 + 41) em placas de 6 cavidades. Células CHOKl passadas em DMEM F12, com soro fetal bovino IgG ultra baixo 5% e glutamina 2 mM foram crescidas para confluência em placas de 6 cavidades. As células confluentes foram transfectadas com um total de 7,5 μg de DNA: 30 μg de lipídeo Transfast (Promega) em meio Optimem Glutamax (Invitrogen). Células transfectadas foram incubadas a 37°C com CO2 5%. Em 72 horas sobrenadantes foram colhidos e ensaiados para concentração de anticorpo e então testados para ligação em Αβ de humano por ELISA. Ll humanizado combinado com as três cadeias pesadas humanizadas expressou todo o anticorpo completo que ligou em Αβ de humano.

Anticorpos humanizados também foram expressados em transfecções de célula CHOKl transiente de grande escala usando liberação lipossomal de DNA (eg TransFast (Promega)) e expressão em garrafas de cultura. Para otimização de níveis de expressão em transfecções transientesfoi usada uma razão de DNA de vetor de expressão de cadeia pesada para leve de 1:6. Material da transfecção transiente foi purificado usando colunas ProSepA ou FPLC com colunas ProSepA HiTrap.

Avaliação de variantes humanizadas de 2E7 HlLl, H2L1 e H3L1 em ELISA de ligação de β-amilóide

Variantes humanizadas 2E7 HlLl, H2L1 e H3L1 foram avaliadas para ligação em peptídeo Αβ (1-40) de humano biotinilado na terminação-C. O 2E7 quimérico foi usado como referência. Tabelas 5-7 mostram os resultados com várias bateladas de material purificado das transfecções transientes de escala grande.

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Estes resultados indicaram perfis de ligação de Αβ muito similares para cada uma das variantes humanizadas derivadas de 2E7. Comparação de valores de EC50 com 2E7c mostrou pouca perda de atividade de ligação de Αβ havia sido incorrida através do processo de humanização. Comparação de variantes humanizadas de 2E7 por ELISA de Competição

Anticorpos quimérico 2E7c e humanizados Hl LI, H2L1 e H3L1 foram avaliados para a sua capacidade para inibir a ligação entrepeptídeo Αβ de humano e 2E7 MAb de camundongo parental em um ELISA de competição.

Dois tipos de ELISA de competição foram estabelecidos com o propósito de comparar a atividade de ligação em Αβ das três variantes humanizadas comparadas com o anticorpo quimérico 2E7.

1) β-amilóide imobilizado, peptídeo Αβ (1-40) de humano biotinilado foi imobilizado através de Estreptavidina sobre placas de ELISA. Anticorpo 2E7 de camundongo foi adicionado em uma concentração constante juntamente com uma série de diluições de anticorpos variantes humanizados derivados de 2E7. 2E7 MAb de camundongo ligado foi então detectado com conjugado de IgG anti-camundongo.

Tabela 8 mostra resultados de dois ensaios.

Tabela 8

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2) β-amilóide em solução; uma concentração constante de β-amilóide foi pré-incubada com uma série de diluições de variantes de anticorpo 2E7 humanizado — a mistura incluindo amilóide livre e complexado foi adicionada por um tempo curto nas cavidades contendo 2E7 MAb de camundongo imobilizado. A quantidade de β-amilóide livre que ainda estava disponível para ligação no 2E7 MAb parental imobilizado foi então detectada. Tabela 9 mostra os resultados de dois ensaios.

Tabela 9

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Todas as variantes de anticorpo humanizadas inibiram aligação de 2E7 MAb de camundongo em β-amilóide com um perfil muito similar. Valores de IC50 gerados para variantes H2L1 e H3L1 foram consistentemente próximos daquele para quimera 2E7c (onde usado), que teve a atividade inibitória mais alta em ambos os ensaios. Contudo, variante HlLl mostrou uma atividade inibitória um pouco reduzida em ambos os ensaios, indicando uma possível afinidade por β-amilóide ligeiramente menor. SPR Biacore™ Analysis de 2E7, 2E7c, H1L1, H2L1, H3L1

Os parâmetros cinéticos de ligação de 2E7 MAb de camundongo recombinante, 2E7c quimérico e variantes humanizadas HlLl, H2L1 e H3L1 em peptídeo beta-amilóide (1-40) e (1-42) foram avaliados usando Biacore™ Analysis em um Biacore™ 3000. Dois formatos de ensaio diferentes foram utilizados. Método A

(i) Resumidamente, <20 unidades de ressonância de peptídeo beta-amilóide 1-40 (biotinilado na terminação-C) foram capturadas sobre pastilha de biossensor de estreptavidina (como usada para Tabela 10A). Os anticorpos foram diluídos em tampão HBS-EP e passados sobre a superfície de estreptavidina/beta-amilóide em concentrações variando de 0,001 nM - 8 nM (para Tabela 10A). Duas corridas separadas foram realizadas; cada corrida foi conduzida em uma nova superfície de estreptavidina/beta-amilóide. Corridas 1 e 2 foram essencialmente as mesmas embora houvesse algumas diferenças nos parâmetros usados; Corrida 1 foi realizada usando uma superfície de pastilha sobre a qual 16 RU's de beta-amilóide foram capturados, e concentrações de anticorpo de 0,001 nM - 8 nM foram utilizadas, um tempo de associação de 4 minutos e um tempo de dissociação de 20 minutos foram utilizados em uma vazão de fluxo de 50μ1 por minuto. Para Corrida 2, menos do que 0 RU's de beta-amilóide foram capturadas e concentrações de anticorpo de 0,003125 nM-8 nM foram usadas. A vazão de fluxo e tempos de associação foram iguais aos da Corrida 1, contudo o tempode dissociação foi reduzido para 15 minutos.

(ii) Beta amilóide (1-40) e (1-42) foram copulados em amina sobre superfícies diferentes de uma pastilha de biossensor CM5 em um nível de <20 unidades de ressonância (como usado em Tabela 10B). Os anticorpos foram diluídos em tampão HBS-EP e passados sobre a superfície de biossensor/beta-amilóide em concentrações variando de 1 nM-64 nM (como usadas em Tabela 10B). Método B

Na segunda situação o ensaio foi invertido, no qual anticorpos foram primeiro capturados para um nível de 1000-2500 unidades de ressonância sobre uma superfície de anticorpo policlonal IgG anti-camundongo (para 2E7 MAb de camundongo recombinante) ou uma superfície de proteína A (para H2L1 humanizado) de uma pastilha de biossensor CM5. Beta-amilóide (1-40) ou (1-42) recém-preparado foi diluído em tampão HBS-EP e passado sobre a superfície de anticorpo capturado em concentrações variando de 4-500 nM (Tabelas 10C e 10D).

Em ambos os métodos, regeneração foi via um pulso de H3PO4IOO mM, e para Tabela 10A dados também foram seguidos por um pulso de NaOH 50 mM. Foi mostrado que a superfície é estável e não é afetada pela regeneração. Todas as corridas foram duplamente referidas contra injeções em branco de tampão. Análise foi realizada usando o Biacore™ analysis software BIAevaluation version 4.1. Resultados

Método A(i) foi usado para classificar os anticorpos por dados de cinética de ligação em beta-amilóide. Os dados obtidos são mostrados em Tabela 10A. Isto mostra que o 2E7 Mab parental possui uma KD de 36,1 pM para beta-amilóide capturado por estreptavidina. O anticorpo de humano-camundongo quimérico mostrou uma KD ligeiramente reduzida de 45,8 pM e os construtos humanizados variam de 54 (H2L1) a 93,6 pM (H1 LI). Emconclusão isto demonstra que o procedimento de humanização havia sido muito bem sucedido e muito pouca afinidade havia sido perdida. As retro-mutações adicionais introduzidas para H2 e H3 tiveram um efeito pequeno mas benéfico, embora as distâncias entre construtos H2 e H3 estejam dentro dos desvios padrão para estes experimentos.

Tabela IOA

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Método A(ii) foi usado para confirmar que os dois resíduos de aminoácido adicionais na terminação-C de beta-amilóide (1-42) comparado com beta-amilóide (1-40) não alteraram significativamente as propriedades de ligação de 2E7 e H2L1. Os dados obtidos são mostrados em Tabela IOB e confirmaram isto.

Tabela 10B

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Método B foi usado para efeitos de avidez negativa potencialmente vistos no formato do primeiro ensaio. Efeitos de avidez, causados por ambos os domínios Fab de uma molécula de anticorpo única ligando ao mesmo tempo em duas moléculas beta-amilóide adjacentes sobre a superfície de biossensor (ou em formas multiméricas de beta-amilóide),aumentariam a afinidade aparente de ligação. Medições de afinidade usando Método B são mostradas em Tabela 10C.

Tabela IOC

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Evidência de que este ensaio proporcionou afinidades de ligação 1:1 verdadeiras foi obtida quando fragmentos de Fab de H2L1, obtidos por digestão com papaína, ligaram-se em beta-amilóide (1-40) capturado por estreptavidina por um método similar ao Método A(i) com uma KD estimada de 2,4 nM.

Método B também foi usado para confirmar que dois resíduos de aminoácido adicionais na terminação-C de beta-amilóide (1-42) comparado com beta-amilóide (1-40) não alterou significativamente as propriedades de ligação de um clone de seqüência idêntica ao 2E7 MAb de camundongo, chamado 2F11. Os dados obtidos são mostrados em Tabela 10D.

Tabela lOD

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Em um estudo similar ao estudo de mapeamento de epítopo sobre 2E7 usando o ensaio de ressonância de plasmon de superfície descrito acima, H2L1 comportou-se similarmente a 2E7 na ligação no peptídeo contendo aminoácidos 1-12 (A31, SEQ ID No: 15) do peptídeo β-amilóide e não no peptídeo contendo aminoácidos 2-13 do peptídeo β-amilóide (Αβ2-13, SEQ ID No:44).

Atividade de H2L1 no modelo de efluxo de I125 β-amilóide

Com o objetivo de funcionalmente comparar o H2L1 humanizado com o 2E7 monoclonal de camundongo parental, ambos foramtestados no mesmo dia no modelo de efluxo de I125 β-amilóide acima.

Ambos H2L1 e 2E7 significativamente aumentaram as contagens por minuto (C PM) em sangue comparado com controle veículo. C PM de radioatividade no sangue foi como segue (Veículo: 1940 ± 166; 2E7: 10065 ± 1386; H2L1: 10913 ± 1535). Estatística usada foi ANOVA com teste post-hoc LSD n=7 veículo, n=6 2E7, n=6 H2L1, (p<0,001 para cada composto de teste vs. veículo).

Estes dados proporcionam evidência adicional de que anticorpo H2L1 humanizado tem retido as propriedades funcionais mostradas com a molécula de 2E7 de camundongo.

Investigação da farmacocinética de H2L1 e 2E7

A meia-vida terminal de anticorpo de teste em camundongos foi investigada. O anticorpo de teste foi administrado por uma infusão intravenosa de 1 h a 4 camundongos para alcançar uma dose alvo de 400μg por camundongo. Amostras de sangue seriais foram tiradas até 5 dias após a dosagem (um camundongo do grupo 2E7 não completou o estudo e um do grupo H2L1 foi removido da análise subseqüente porque ficou evidente que a dose não havia sido administrada i.v.). Níveis de anticorpo foram medidos usando um ELISA de captura de β-amilóide.

Análise dos dados indica que o anticorpo humanizado H2L1 possui uma meia-vida terminal de cerca de 82 horas em camundongos (Tabela 11), que é comparável com aquela do anticorpo monoclonal de camundongo parental 2E7 (cerca de 75 horas).

Tabela 11

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Cmax Concentração máxima em plasma observada.Tmax Tempo de concentração máxima em plasma observada.

CLp Depuração de plasma total; Dose/AUQo-inf)·

tl/2 Meia- vida de fase terminal foi determinada como a razão de

ln2/z onde ζ é a constante de velocidade de fase terminal; calculada usando análise de regressão linear não-ponderada (após transformação log) sobre aqueles pares de concentração-tempo ocorrendo após o início visualmente avaliado da fase log-linear.

Vss Volume de distribuição no estado de equilíbrio; CLp χ MRTo-M-

Efeito de H2L1 sobre carga amilóide periférica em primatas não-humanos envelhecidos

Foi conduzido um estudo em macacos Cynomolgus envelhecidos (aproximadamente 15 anos de idade) para investigar a relação de resposta à exposição com respeito à formação e à depuração de complexo amilóide/H2Ll e aos efeitos subseqüentes sobre níveis de amilóide em CSF e em CNS. Amostras de sangue e de CSF lombar semanais (retiradas sob sedação com cetamina) foram coletadas 3 semanas antes da Ia dose de H2L1. Imediatamente após a amostragem na semana 3, animais receberam placebo (n=10), 0,1 mg/kg (n=5), lmg/kg (n=5) ou lOmg/kg (n=10) de H2L1 e então a cada 2 semanas por 12 semanas. Amostras de sangue para análise em plasma de H2L1 e de Αβ42 total foram tiradas semanalmente. Amostras de CSF para quantificação de Αβ40/42 foram coletadas a cada 2 semanas. Após a completitude do período de dosagem, os animais foram mortos para o propósito de quantificação de beta-amilóide cerebral por análises bioquímicas como descrito acima e para investigação de micro-hemorragia. No grupo de dosagem mais baixa (0,1 mg/kg), animais foram mortos em um modo escalonado para avaliar o efeito de curso de tempo potencial em níveis cerebrais como uma conseqüência da terminação da dosagem e por conseguinte a saturação do acúmulo de amilóide em plasma.

Este estudo foi provado pelo Institutional Animal Care andUse Co mMittee (IACUC) of MACCINE Pte Ltd, ou "Maccine" antes de iniciar a fase experimental. O número de protocolo de IACUC foi #08-2006. GSK tem realizado uma visita no sítio de Maccine e tem revisto seu processo de revisão ética e verificado que amostras de plasmas foram serialmente diluídas 1:10 a 1:50.000 e adicionadas em placas de ELISA revestidas com Αβ40. Curvas padrão foram criadas variando de 0-10μg/ml H2L1 em diluente. Após uma incubação durante a noite a 4°C H2L1 foi visualizado usando IgG anti-humano conjugada com peroxidase (Amersham — diluída 1:2.000 em diluente) e sistema de detecção de tetrametil-benzidina. Após administração de bolo iv única e repetida, níveis plásmicos de H2L1 pareceram aumentar em um modo dependente de dose. Não há evidência de não-linearidades severas na farmacocinética, indicando que para a maior parte do intervalo de dosagem, foram alcançadas concentrações molares em excesso de H2L1 no plasma comparadas com os níveis de amilóide livre.

Αβ42 total foi medido em plasma puro usando um kit Αβ1-42

ELISA comercialmente disponível (Innogenetics) de acordo com as instruções do fabricante, com curvas padrão variando de 500-7pg/ml criada no diluente do kit. Amostras e padrões são incubados durante a noite a 4°C antes do ensaio em duplicata de acordo com as instruções do kit. Deve ser notado que devido à interferência do anticorpo de detecção fornecido com o ensaio de Αβ42, este kit não pode ser usado para medir os níveis de Αβ42 livre mas mede o Αβ42 aparente 'total·. Houve um aumento dependente de dose e de concentração em Αβ42 (com níveis de platô de aproximadamente 300, 125 e 25 pg/ml detectados após 10, 1 ou 0,1 mg/kg de H2L1 respectivamente). Da análise, o aumento em "Αβ42 total" é provavelmente devido ao resultado de um efluxo significativo de amilóide de fora o acúmulo em plasma, que pareceu dependente das concentrações de H2L1 >1 \xgJmL, e não pareceu ser um resultado da falta de depuração do complexo. Isto foi evidenciado pela taxa de eliminação de Αβ42 total bem como da flutuaçãonos níveis totais sobre um intervalo de dosagem.

Até o presente apenas análise de plasma tem sido completada e totalmente analisada. Contudo análise preliminar indica que houve uma tendência na direção da redução em CSF e aumento no nível hipocampal de Αβ42 'total' (medico como geralmente descrito) após tratamento com 10mg/kg H2L1.

Em algumas seções do cérebro, áreas pequenas de micro-hemorragia foram detectadas como mostrado pelo método de coloração com Azul da Prússia, de Peris. Este método visualiza ferro férrico (ferro é um constituinte essencial da hemoglobina carreadora de oxigênio encontrada em células vermelhas) pela produção de um composto azul insolúvel. Contudo não houve diferença na incidência entre animais tratados com droga e com veículo.

Análises em macacos Cynomoloqus envelhecidos para placas de beta-amilóide no cérebro e para beta-amilóide total no plasma

Parâmetros de tecido e de fluido cerebroespinhal (CSF) de AD de humano têm sido exibidos nos macacos Cynomolgus. Tem sido mostrado que macaco Cynomolgus envelhecido possui evidência de deposição de amilóide. (Covance, "The cynomolgus monkey as a model for Alzheimer's disease", em: Buse E, Habermann G, Friderichs-Gromoll S, Kaspereit J, Nowak P e Niggemann K, editors. Pôster Presentation no 44a Annual Meeting of the Society of Toxicology, New Orleans, Louisiana, 6 a 10 de março de 2005). O potencial para H2L1 para gerar uma resposta inapropriada (tal como encefalite) em um cérebro envelhecido foi investigado em macacas ex-procriadoras de ca. 20 anos de idade. Em adição, segurança, micro-hemorragia relacionada com tratamento, neutralização/depuração de material de teste, hipersensibilidade, e doença complexa imune também foram investigadas após administração intravenosa por 8 semanas em intervalos de duas semanas. Em adição amostras de sangue e CNS foram analisadas paraníveis de Αβ40/42. Planejamento de estudo

Grupos de 5 (grupo 1), 9 (grupo 2) ou 10 (grupo 3) macacas Cynomolgus geriátricas receberam O (veículo), 50 ou 100 mg/kg/de dosagem diária de H2L1 em veículo (4 ml/kg) a cada duas semanas por 8 semanas intravenosamente por administração lenta de bolo. O veículo consistiu de acetato de sódio tri-hidratado 6,81 mg/mL, edetato de dissódio di-hidratado 0,0186 mg/mL, polissorbato 80 0,2 mg/mL, e base L-Arginina 10 mg/mL, o pH foi 5,5. Níveis de dose foram escolhidos para investigar níveis de dose que foram 5 e 10 vezes os níveis de dose clínicos intencionados.

As seguintes avaliações foram realizadas pré-dose, diariamente (sinais clínicos, peso corporal, consumo de alimento), semana 4 e na semana antes da necropsia: observações de animais em vida, peso corporal, temperatura corporal, hematologia, química clínica (incluindo análise de fluido cerebroespinhal [CSF]), análise de urina, e determinação de citocina em CSF. Após necropsia, pesos de órgãos, observações macroscópicas, e observações microscópicas do cérebro, da espinha dorsal cervical e de lesões grandes foram conduzidas em todos os animais. Avaliação toxicocinética foi conduzida após cada dosagem. Resultados

Não houve mortes não-programadas, e não houve sinais que indicassem uma influência do item de teste sobre a condição geral dos animais nas doses administradas. As únicas observações notáveis em patologia clínica (hematologia e química de soro) foram concluídas em estarem relacionadas com a idade e não com o artigo de teste.

Exposição sistêmica a H2L1 (conforme medida por AUCo-t, e Cmáx) aumentou aproximadamente em proporção à dose. Para ambos os grupos de dose, não houve mudança marcante (dobrada) em exposição sistêmica entre os períodos de amostragem de Ia dose e de 4a dose.Não houve sinais de reações inflamatórias no cérebro detectadas por análise de CSF, e não houve descobertas macroscópicas ou microscópicas em necropsia que sugerissem uma influência de um item de teste, especificamente nenhuma micro-hemorragia ou encefalite.

Este estudo foi conduzido em conformidade com as Good Laboratory Practice Regulations como descritas em German Chemical Law, anexos 1 e 2 até §19a Chemikalien Gesetz, Junho de 2002, os OECD Principies of Good Laboratory Practice (revisados em 1997, publicados em Janeiro de 1998) ENV/MC/CHEM (98) 17, o Consensus Document "The Application of the OECD Principies of GLP to the Organisation and Management of Multi-Site Studies" ENV/JM/MONO(2002)9. Estudos conduzidos de acordo com as regulações e os padrões acima foram considerados aceitáveis para as autoridades regulatórias da US FDA.

Análise de carga de placa no CNS

Os hemisférios cerebrais esquerdos dos macacos Cynomologus tratados com veículo do estudo acima foram analisados por imuno-histoquímica. Uma seção coronal, no nível do sulco temporal médio contendo porções do giro denteado e hipocampo, foi processada em cera como descrito acima. Para imuno-histoquímica, seções foram marcadas com um anticorpo pan-Αβ anticorpo (1E8, anticorpo monoclonal produzido contra Αβ 1β-27), ou com o anticorpo Αβ42, (20G10, anticorpo monoclonal reconhecedor de Αβ x-42), e marcação foi revelada como acima. Uma contagem visual do número de placas foi realizada para cada seção. Tecido de cinco macacos Cynomolgus tratados com veículo mostrou evidência de placas de Αβ parenquimal. Também houve evidência de Αβ intraneuronal e de Αβ marcado cerebrovascular.

Análise de complexos de beta amilóide/anticorpo em plasma

Análise bioquímica foi realizada em amostras de plasma de dois instantes de tempo diferentes (no final das semanas 4 e 8 após o início dadosagem) dos animais dosados com 50 mg/kg (n=9) ou 100 mg/kg (n=10) de H2L1, ou de controles dosados com veículo (n=5). Amostras em duplicada de ΙΟΟμΙ foram analisadas usando o kit de Αβ1-42 ELISA comercialmente disponível da Innogenetics, incubadas durante a noite a 4°C. Amostras de controle foram analisadas tanto puras quanto em diluição de 1:10 (usando o diluente fornecido), enquanto que amostras de animais dosados foram testadas puras e em diluição de 1:25. Valores de absorbância subseqüentes foram analisados, com valores de absorbância desconhecidos retro-calculados para valores de pg/ml usando curvas padrão, e então corrigidos para qualquer diluição de ensaio. Níveis de plasma total de Αβ42 derivados destas amostras são mostrados em Tabela 12 abaixo (números em pg/ml ± SE); todas as amostras dos animais tratados com H2L1 continham níveis significativamente mais altos de Αβ42 (ρ < 0,001 pelo teste-t de Student) do que em grupos de controle.

Tabela 12

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Dados relatados foram obtidos das amostras diluídas. Resultados das amostras puras não foram usados porque muitos pontos de dados foram quer maiores do que o padrão de topo, quer devido à limitação de volume de amostra, apenas ensaiados como um ponto único.

Processo de produção

Vetores de expressão codificadores de H2L1 e operativamente ligados em marcadores de seleção amplificáveis tais como DHFR ou glutamina sintetase podem ser usados para transfectar ou transduzir linhagens de célula CHO parentais apropriadas (eg CHODG44 ou CHOK 1) para produzir linhagens celulares engenhadas adequadas para a produção de anticorpo monoclonal em escala grande (para revisão veja Bebbington e Hentschel DNA Cloning Volume III; A practical approach (editado porGlover DM) (Oxford IRL Press, 1987). Com o propósito de aumentar osníveis de expressão a seqüência codificadora pode se códon-otimizada com oobjetivo de se evitarem os motivos de seqüência cis-atuante e os conteúdos deGC extremos (alto ou baixo). SEQ. ID Nos:42 e No:43 exemplificam uma talseqüência codificadora de cadeia leve Ll e de cadeia pesada H2. Produção emescala grande pode ser em biorreatores de tanque agitado usando meio livrede componente derivado de animal, seguido por purificação. Esta podecompreender clarificação da colheita, seguida por cromatografia de afinidadede Proteína-A, e purificação adicional usando operações unitárias decromatografia de troca iônica (e.g. catiônica) e modo misto (e.g. hidróxi-apatita cerâmica) Uma nanofiltração removedora de vírus é seguida por umaetapa de ultrafiltração/diafiltração final que permite formulação adequadapara a rota de administração intencionada.

Exemplo de formulação farmacêutica

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Seqüências de aminoácidos de regiões V de armações receptoras e variantes humanizadas

Região V de armação receptora de cadeia pesada M99675, seqüência de aminoácidos (SEQ ID No: 21)SSSSSTlYYADSVKGRFTlSRDNAKNStYLQMNSLRAEDTAVWCAR

DNA de região V de armação receptora de cadeia pesada M99675 (SEQ ID No: 22)gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccc tgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaact gggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggmcatacatt agtagt

agtagtagtaccatatactacgcagactctgtgaagggcggattcacoatctcc

agagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgag

gacacggctgtgtattactgtgcgagaga

Região V de armação receptora de cadeia leve CAA51135, seqüência de aminoácidos (SEQ ID No: 24)

q ivmtqsplslpvtpgepasiscrssqsll hsng yn vldwylqkpgqspqlll ylgs

nrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpwtfgqgtkveik DNA da região V da armação receptora de cadeia leve CAA51135, seqüência de aminoácidos (SEQ ID No.: 25

gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccg

gcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaac

tatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctgctgatctat

ttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatc

aggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttgggg

tttattactgcatgcaagctctacaaactccgtggacgttgggccaagggacca

aggtggaaatcaaa

Variante Hl de região V de cadeia pesada humanizada, seqüência de aminoácidos (SEQ ID No: 26)

evqivesggglvqpggslrlscaasgftfsdngmawvrqapgkglewvsfisnl aysidy adtvtgrftisrdn aknsl ylqmnslraedtavyycvsgtwfaywgqgtl vtvss

Seqüência codificadora de DNA de variante Hl de região V de cadeia pesada humanizada (SEQ ID No: 27)

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccc

tgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtgacaacggaatggcgt

gggtcggccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcattcattagtaat

ttggcatatagtatcgactacgcagacactgtgaçggggcgattcaccatctcc

agagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgag

gacacggctgtgtattactgtgtcagcgggacctggtttgcttactggggcca

gggcacactagtcacagtctcctca

Variante H2 de região V de cadeia pesada humanizada, seqüência de

aminoácidos (SEQ ID No: 28)

evqlvesggglvqpggslrlscavsg ftfs dng mawvrq apg kglewvsfisnl aysidyadtvtgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycvsgtwfaywgqgtl

vtvss

DNA de variante H2 de região V de cadeia pesada humanizada (SEQ ID No: 29)gggcacactagtcacagtctcctca

Variante H3 de região V de cadeia pesada humanizada, seqüência de aminoácidos (SEQ ID No: 30)

e vqlvesgggl vqpgg slrlsc aasgftfsdngmawvrqapekgle wis fisnla

vsidyadtvtgrftisronaknslylqmnslraedtavyycvsgtwfaywgqgtlv

tvss

DNA de variante H3 de região V de cadeia pesada humanizada (SEQ ID No: 31)

gaggtgcagctggtggagtgtgggggaggcttggtacagcctggggggtccc

tgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtgacaacggaatggcgt

gggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatctcattcattagtaat

ttggçatatagtatcgactacgcagacagtgtgaggggccgattcaccatctcc

agagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccõag

gacacggctgtgtattaçtgtgtcagcgggacctggtttgcttactggggcca

gggcacactagtcacagtgtcgtca

Variante Ll de região V de cadeia leve humanizada, seqüência de aminoácidos (SEQ ID No: 32)

dívmtqsplslpvtpgepasiscrvsqsllhsngytylhwylqkpgqspqlliykvs nrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycsqtrhvpytfgggtkveik

DNA de variante Ll de região V de cadeia leve humanizada (SEQ ID No: 33) gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccg gçctccatctcctgcagagttagtcagagccttttaçacagtaatggatacacc tatttacattggtacctggagaãgcoagggcagtctccacagctcctgatctat aaagtttccaaccgattttctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatca ggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtt tattactgctctcaaactagacatgttccgtacacgttcggcggagggaccaag gtggaaatcaaa

Seqüência de aminoácidos de cadeia pesada Hl madura (mutação dupla mutada Fc em negrito) (SEQ ID No: 34)

evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdngmawvrqapgkglewvsfisnl

aysidyadtvtgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycvsgtwfaywgqgtl

vtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnisgaltsgvh

tfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscoktht

cppcp apelagapsvflfppkpkdtlmísrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdg

vevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektssk

akgqprepqvytlppsrdeitknqvsltcivkgfypsdíavewesngqpennyktt

ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

DNA de comprimento total Hl (SEQ ID No: 35)gaggtgcagctggtggagtctgg

gggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctg

gattcacçttcagtgacaacggaatgg

cgtgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcattcattagt aatttggcatatagtatcgactacgca

gacactgtgacgggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaactcactg tatctgcaaatgaacagcctgagagc

cgaggacacggctgtgtattactgtgtcagcgggacctggtttgcttactggg gccagggcacactagtcacagtctcct

cagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagc acctctgggggcacagcggccctgggc

tgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacacctt

cccggctgtcctacagtcctcaggactotactccctcagcagcgtggtgaggg tgccctccagcagcttgggcacccaga

cctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaa gttgaggccaaatcttgtgacaaaact

cacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtctt cctcttccccccaaaacccmggacac

cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcc acgaagaccctgaggtcaagttcaact

ggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagga gcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc

agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg caaggtctccaacaaagccctcccagc

ccccatcgagaaaaccatotccaaagocaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatccqgggatg

agctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccca gcgacatcgccgtggagtgggagagc

aatgggcagccggagaacaagtacaagaccacgcctcccgtgctggactccga cggctccttcttcctctacagcaagct

caccgtgeâcmgagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtga

tgcatgaggctctgcacaaccactaca

cg c ag aagaecctctcgctgtctccgggtaaa

Seqüência de aminoácidos de cadeia pesada H2 madura (mutação dupla

mutada Fc em negrito) (SEQ ID No: 36) evqlvesggglvqpggslrlscavsgftfsdngmawvrqapgkglewvsfisnl

ppvldsdgsfflvsklwdksrwqqgnvf$csvmheal.hnhytqkslslspgk DNA de comprimento total H2 (SEQ ID No: 37)gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccc tgagactctcctgtgcagtctctggatt

CACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAATr

tggcatatagtatcgactacgcagacactgtgacgggccgattcaccatctcca gagacaatgccaagaactcactgtat

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtcag

cgggacctggtttgcttactggggcca

GGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC

ccctggcaccctcctccaagagcacct

ctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaacc ggtgacggtgtcgtggaactcaggcgcc

ctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactcta ctccctcagcagcgtggtgaccgtgcc

ctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagccca gcaacaccaaggtggacaagaaagttg

agcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaac tcgcgggggcaccgtcagtçttcctc

ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca tgcgtggtggtggacgtgagccacga

agaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggçgtggaggtgcataatg ccaagacaaagccgcgggaggagcagt

acaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactgg ctgaatggcaaggagtacaagtgcaag

gtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa gggcagccccgagaaccacaggtgta

cacçctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacct gçctggtcaaaggcttctatcccagcg

acatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaãcaactacaagac cacgcctccqgtgctggactccgacggc

tccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggg gaacgtcttctcatgctccgtgatgca

tgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggta

aa

Seqüência de aminoácidos de cadeia pesada H3 madura (mutação dupla mutada Fc em negrito) (SEQ ID No: 38)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLgWlSFlSNU YSlOYADTVTGRrriSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV^YYCVSGTWFAYWGOGTLV

tvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvht

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

cppcpapêlagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdg

VEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTiSK

akgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

DNA de comprimento total H3 (SEQ ID No: 39)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGOGT

gggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatctcattcattagtaat

ttggcatatagtatcgactacgcagacactgtgacgggccgattcaccatctcc

agagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgag

gacacggctgtgtattactgtgtcâgcgggacctggtttgcttactggggcca

gggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttcc

ccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctg

cctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcg

ccctgaccagcggcgtgcacaccttccçgggtgtcctacagtcctcaggactc

tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagac

ctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagt

tgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcçcaggacctga

actcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaagccaaggagaccc

tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac

gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataa

tgccaagacaaagccgcgggaggaggagtacaacagcacgtaccgtgtggtca

gcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgc

aaggtctccaacaaagcgctcçgagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcc

aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatga

gctgaçcaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccca

gcgacatcggcgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaa

GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC

tcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg

atgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctcgctgtctccg

ggtaaa

Seqüência de aminoácidos de cadeia leve madura (SEQ ID No: 40) DiVMTQSPLSLPVTPG EPASISCRVSQSLLH SNG YTYLH W YLQKPGQSPQLLi YKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKÍSRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVE1KR TVAAPSVF! FPPSDEQLKSGTAS WCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

DNA de comprimento total Ll (SEQ ID No: 41)

GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCG

GCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACC

TATTT ACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTAT

AAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA

ggcacagattttacactgaaaatcagcâgagtggaggctgaggatgttggggtt

tattactgctctcaaactagacatgttccgtacacgttcggcggagggaccaag

GTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT

gatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc

tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggacaacgccctccaatcggg

TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC

TCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

GCCTGCGMGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA

caggggagagtgt

DNA de cadeia pesada H2 otimizado (SEQ ID No: 42)gaggtgcagctggtggagtctggcggcggactggtgcagcctggcggcagcc

tgagactgagctgtgccgtgtccggcttcaccttcagcgacaacggcatggcc tgggtgaggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtccttcatcagca acctggcctacagcatcgactacgccgacaccgtgaccggcagattcagcatc

agccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagãtgaacagcctgagagc

cgaggacaccgccgtgtactactgtgtgagcggcacctggttcgcctactggg

gccagggcaccctggtgaccgtgtccagcgcoagcaccaagggccccagcgt

gttccccctggccccgagcagcaagagcaccagcggcggcacagcggccctg

ggctgcctggtgaaggactacttcgccgaaggggtgaccgtgtcctggaacag

cggagccgtgaçcagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagc

ggcctgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggga

cccagacctacatctgtaacgtgaaccacaagcccagcaagacgaaggtggac

aagaaggtggagcccaagagctgtgacaagacccacacctgccccccctgccc

tgcccçcgagctggccggagcgcccagcgtgttcctgttcccccccaagccta

aggacaccgtgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgtgtggtggtggat

gtgagccacgaggaccctgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtgga

ggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagoagtacaacagcacctacc

gggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaggâ

gtacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccctatcgagaaaaccat

cagcaaggccaagggccagcccagagagccccaggtgtacaccctgcgcgct

agcagagatgagctgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaaggg

cttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgag

aacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgatggcagcttcttcctg

tacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcag

ctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaagaggctga

gcctgtcccctggcaag

DNA de cadeia leve Ll otimizado (SEQ ID No: 43)

gacatcgtgatgacccagagccccctgagcctgcccgtgacccctogcga

gcccgccagcatcagctgtagagtgagccagagcgtgctgcacagcaacg

gctacacctacctgcactggtatctgcagaagcctggccagagccctgag

ctgctgatctacaaggtgtccaaccggttcagcggcgtch:ctgatagattc

agcggcaggggctccggcaccgacttcaccctgaagatcagcagagtgga

ggccgaggatgtgggcgtgtactactgctcccagaccagacacgtgcctt

acacctttggcggcggaacaaaggtggagatcaagcgtacggtggccgcc

cccagcgtgttcatcttcccccccagcgatgagcagctgaagagcggcac

cgccagcgtggtgtgtctgctgaacaacttctacccccgggaggccaagg

tgcagtggaaggtggacaatgccctgcagagcggcaacagccaggagag

cgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagçagcacgc

tgaccctgagca,aggccgacta€gagaagcacaaggtgtacgcctgtgag gtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaaccgggg

cgaotgc

Claims (20)

1. Anticorpo terapêutico que é um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide e que é caracterizado pelo fato de compreender as seguintes CDRs:CDRHl: DNGMA (SEQ ID No: 1)CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID No:2) CDRH3: GTWFAY (SEQ ID No:3)dentro de uma região variável de cadeia pesada de humano originária da família de gene VH3 e: CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLHISEQ ID No :4) CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID No:5) CDRL3: SQTRHVPYT (SEQ ID No:6)dentro de uma região variável de cadeia leve de humano originária da seqüência de aminoácidos descrita em GenPept entrada CAA51135 (SEQ ID No:24).

2. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de humano origina-se de:• Um gene V selecionado do subconjunto de membros de família VH3: VH3-48, VH3-21, VH3-11, VH3-7, VH3-13, VH3-74, VH3-64,VH3-23, VH3-38, VH3-53, VH3-66, VH3-20, VH3-9 & VH3-43• Um gene V selecionado do subconjunto de membros de família VH3: VH3-48, VH3-21 & VH3-11• O gene VH3-48 ou um seu alelo.

3. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a armação de cadeia pesada receptora de humano é derivado de M99675 (SEQ ID No:21) junto com uma armação 4.

4. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a seqüência da armação 4 é aquela codificada pelo minigene JH4 de humano (Kabat): YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No:23) cujos quatro resíduos iniciais que caem dentro da região CDR3 são substituídos pela CDR entrante do anticorpo doador.

5. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais substituições de resíduos de aminoácido baseados nos resíduos correspondentes encontrados no domínio Vh doador possuindo a seqüência: SEQ ID No: 17 e domínio Vl possuindo a seqüência: SEQ ID No: 19 que mantém toda ou substancialmente toda a afinidade de ligação do anticorpo doador para peptídeo β-amilóide.

6. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a armação de cadeia pesada receptora de humano derivado de M99675 e de JH4 contém quatro substituições de resíduo de aminoácido selecionadas de posições 24, 48, 93 e/ou 94 (numeração de Kabat).

7. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a armação de cadeia pesada receptora de humano compreende os seguintes resíduos (ou uma substituição conservativa dos mesmos):<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>

8. Anticorpo terapêutico, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia Vh possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:26 e um domínio Vl possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:32.

9. Anticorpo terapêutico, caracterizado pelo fato decompreender uma cadeia Vh possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No: 28 e um domínio Vl possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:32.

10. Anticorpo terapêutico, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia Vh possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:30 e um domínio Vl possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No:32.

11. Anticorpo terapêutico, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-12 (SEQ ID No: 15) com constante de equilíbrio KD menor do que 100 pM e possui uma constante de equilíbrio KD para ligação em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44) que é 100 vezes maior do que aquela para peptídeo 1-12 (SEQ ID No: 15), ambas as determinações sendo feitas em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando peptídeo capturado sobre pastilha de estreptavidina.

12. Anticorpo terapêutico, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo ou fragmento ligante em antígeno e/ou derivado do mesmo que se liga em peptídeo β-amilóide 1-40 com constante de equilíbrio KD menor do que 10 nM e possui uma constante de equilíbrio KD para ligação em peptídeo β-amilóide 2-13 (SEQ ID No:44) que é 100 vezes maior do que aquela para peptídeo 1-12 (SEQ ID No: 15), ambas as determinações sendo feitas noensaio de ressonância de plasmon de superfície descrito no Método B dos Exemplos.

13. Anticorpo terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser de isótipo IgGl.

14. Anticorpo terapêutico de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser essencialmente faltante das funções de a) ativação de complemento pela rota clássica; e b) mediação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

15. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que os resíduos 235 e 237 têm sido mutados para alanina.

16. Anticorpo terapêutico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada possuindo a seqüência descrita em SEQ ID No: 34, 36 ou 38 e uma cadeia leve possuindo a seqüência descrita em SEQID No:40.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um anticorpo terapêutico como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

18. Método de tratamento de um paciente humano acometido com uma doença relacionada com peptídeo β-amilóide cujo método é caracterizado pelofato de compreender a etapa de administrar ao citado paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo terapêutico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

19. Uso de um anticorpo terapêutico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de ummedicamento para o tratamento de uma doença relacionada com peptídeo β-amilóide.

20. Anticorpo ou Jfragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender um domínio Vh possuindo a seqüência: SEQID No: 17 e um domínio Vl possuindo a seqüência: SEQID No: 19.