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MX2011004017A - Conjugados de agonistas glp-1 y usos de los mismos. - Google Patents

Conjugados de agonistas glp-1 y usos de los mismos.

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Publication number
MX2011004017A
MX2011004017A MX2011004017A MX2011004017A MX2011004017A MX 2011004017 A MX2011004017 A MX 2011004017A MX 2011004017 A MX2011004017 A MX 2011004017A MX 2011004017 A MX2011004017 A MX 2011004017A MX 2011004017 A MX2011004017 A MX 2011004017A
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MX
Mexico
Prior art keywords
glp
compound
angiopep
gly
polypeptide
Prior art date
Application number
MX2011004017A
Other languages
English (en)
Inventor
Michel Demeule
Catherine Gagnon
Jean-Paul Castaigne
Betty Lawrence
Original Assignee
Angiochem Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Angiochem Inc filed Critical Angiochem Inc
Publication of MX2011004017A publication Critical patent/MX2011004017A/es

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Abstract

La presente invención presenta un compuesto teniendo la fórmula A-X-B, donde A es un ventor de péptido capaz de acrecentar el transporte del compuesto a través de la barrera hematoen-cefálica o hacia tipos de células particulares, X es un enlazador, y B es una agonista GLP-1 (v. gr., exendina-4 o un análogo de exendina-4). Los compuestos de la invención pueden usarse para tratar cualquier enfermedad donde actividad GLPL-1 incrementada se desea, por ejemplo, enfermedades metabólicas, tales como obesidad y diabetes.

Description

CONJUGADOS DE AGONISTAS GLP-1 Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La invención se refiere a compuestos incluyendo un agonista GLP-1 (v.gr., exendina-4), ligado a un vector de péptido y usos de los mismos. Tales usos incluyen el tratamiento, prevención, y reducción de trastornos metabólicos incluyendo diabetes y obesidad.
Conforme los niveles de glucosa sanguínea se elevan post-prandialmente, insulina es secretada y estimula células de los tejidos periféricos (músculos esqueléticos y grasa) para tomar activamente glucosa de la sangre como una fuente de energía. La pérdida de homeostasis de glucosa como resultado dé secreción o acción de insulina fallida típicamente resulta en trastornos metabólicos tales como diabetes, los cuales pueden ser co-disparados o exacerbados adicionalmente por obesidad. Debido a que estas condiciones son frecuentemente fatales, estrategias para restablecer eliminación adecuada de glucosa a partir del torrente sanguíneo se requieren.
Aunque la diabetes puede surgir secundaria a cualquier condición que ocasiona daño extenso al páncreas (v.gr., pancreatitis, tumores, administración de ciertos fármacos tales como corticoesteroides o pentamidina, sobrecarga de hierro (v.gr., hemocromatosis) , endocrinopatías adquiridas o genéticas, y excisión quirúrgica) , las formas mas comunes de diabetes típicamente surgen de trastornos primarios del sistema de señalización de insulina. Hay dos tipos principales de diabetes, a decir diabetes tipo 1 (también conocida como diabetes depen-diente de insulina (IDDM)) y diabetes tipo 2 (también conocida como diabetes independiente de insulina o no dependiente de insulina (NIDDM) ) , los cuales comparten complicaciones comunes a largo plazo a pesar de sus diferentes mecanismos patogénicos.
La diabetes tipo 1, la cual cuenta por aproximadamente 10% de todos los casos de diabetes primaria, es una enfermedad auto-inmune específica de órganos caracterizada por la destrucción extensa de las células beta productoras de insulina del páncreas. La reducción consecuente en la producción de insulina inevitablemente lleva a la desregulación del metabolismo de glucosa. Aunque la administración de insulina proporciona beneficios significativos a pacientes que sufren de esta condición, la media vida de suero corta de la insulina es un impedimento principal al mantenimiento de normoglicemia . Un tratamiento alternativo es el trasplante de islotes, pero esta estrategia ha sido asociada con éxito limitado.
Diabetes tipo 2, la cual afecta una proporción mayor de la población, se caracteriza por una desregulación en la secreción de insulina y/o una respuesta disminuida de tejidos periféricos a insulina, es decir, resistencia a insulina. Aunque la patogénesis de la diabetes tipo 2 permanece no clara, estudios epidemiológicos sugieren que esta forma de diabetes resulta a partir de una colección de múltiples defectos genéticos o polimorfismos, cada uno contribuyendo a sus propios riesgos de pre-disposición y modificados por factores ambientales, incluyendo peso en exceso, dieta, inactividad, fármacos, y consumo en exceso de alcohol. Aunque varios tratamientos terapéuticos están disponibles para la gestión de diabetes tipo 2, se asocian con varios efectos secundarios debilitantes. De manera acorde, pacientes diagnosticados con o en riesgo de tener diabetes tipo 2 son frecuentemente aconsejados a adoptar un estilo de vida mas sano, incluyendo pérdida de peso, cambio en dieta, ejercicio, y consumo moderado de alcohol. Tales cambios de estilo de vida, sin embargo, no son suficientes para invertir los daños vasculares y de órganos ocasionados por la diabetes.
Dado que las estrategias actualmente disponibles para la gestión de trastornos metabolicos tales como diabetes son sub-óptimas, hay una necesidad apremiante para tratamientos que sean mas efectivos y no se asocien con tales efectos secundarios debilitantes .
Compendio de la Invención Se han desarrollado compuestos que incluyen un agonista GLP-1 (v.gr., exendina-4) y un vector de péptido. Estos compuestos son útiles para tratar trastornos metabolicos tales como diabetes y obesidad. El vector de péptido es capaz de transportar al agonista GLP-1 ya sea a través de la barrera hematoencefálica (BBB) o hacia un tipo de célula particular (v.gr., hígado, pulmón, riñon, bazo, y músculo) . Debido a que los conjugados son dirigidos a través de la BBB o a tipos de células particulares, la eficacia terapéutica puede lograrse usando dosis menores o dosificaciones menos frecuentes según se compara con agonistas GLP-1 no conjugados, con ello reduciendo la severidad de o la incidencia de efectos secundarios y/o incrementando la eficacia. El conjugado también puede exhibir estabilidad incrementada, farmacocinética mejorada, o degradación reducida in vivo.
De manera acorde, en un primer aspecto la invención presenta un compuesto teniendo la fórmula: A-X-B donde A es un vector de péptido capaz de ser transportado a través de la barrera hematoencefálica (BBB) o hacia un tipo de célula particular (v.gr., hígado, pulmón, riñon, bazo, y músculo), X es un enlazador, y B es un agonista GLP-1 (v.gr., cualquiera descrito en la presente tal como un agonista de péptido) . El transporte a través de la BBB o hacia la célula se puede incrementar por al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 750%, 1,000%, 1,500%, 2,000%, 5,000%, o 10,000%. El compuesto puede ser sustancialmente puro. El compuesto se puede formular con un portador farmacéuticamente aceptable (v.gr., cualquiera descrito en la presente) .
En otro aspecto, la invención presenta métodos para hacer al compuesto A-X-B. En una forma de realización, el método incluye conjugar al vector de péptido (A) a un enlazador (X) , y conjugar al vector de péptido-enlazador (A-X) a un agonista GLP-1 (B) , con ello formando al compuesto A-X-B. En otra forma de realización, el método incluye conjugar al agonista GLP-1 (B) a un enlazador (X) , y conjugar al agonista GLP-l/enlazador (X-B) a un vector de péptido (A) , con ello formando el compuesto A-X-B. En otra forma de realización, el método incluye conjugar al vector de péptido (A) con un agonista GLP-1 (B) , en donde ya sea A o B opcionalmente incluyen un enlazador (X) , para formar al compuesto A-X-B.
En otro aspecto, la invención presenta una molécula de ácido nucleico que codifica al compuesto A-X-B, donde el compuesto es un polipéptido. La molécula de ácido nucleico puede enlazarse de manera operativa y puede ser parte de un vector de ácido nucleico. El vector puede estar en una célula, tal como una célula procariota (v.gr., célula bacteriana) o una célula eucariota (v.gr., célula de levadura o de mamífero, tal como una célula humana) .
En otro aspecto, la invención presenta métodos para hacer un compuesto de la fórmula A-X-B, donde A-X-B es un polipéptido. En una forma de realización, el método incluye expresar un vector de ácido nucleico del aspecto previo en una célula para producir al polipéptido; y purificar al polipéptido.
En otro aspecto, la invención presenta un método para tratar (v.gr., de manera profiláctica) a un sujeto teniendo un trastorno metabólico. El método incluye administrar un compuesto del primer aspecto en una cantidad suficiente para tratar al trastorno. El trastorno metabólico puede ser diabetes (v.gr., Tipo I o Tipo II), obesidad, diabetes como una consecuencia de obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, tolerancia a glucosa perjudicada (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, una enfermedad cardiovascular, o hipertensión.
En otro aspecto, la invención presenta un método para reducir el consumo de alimentos por, o reducir el peso corporal de, un sujeto. El método incluye administrar un compuesto del primer aspecto a un sujeto en una cantidad suficiente para reducir el consumo de alimentos o reducir el peso corporal. El sujeto puede tener sobrepeso, ser obeso, o bulímico.
En otro aspecto, la invención presenta un método para tratar (v.gr., profilácticamente) un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste en ansiedad, trastorno de movimiento, agresión, psicosis, ataques, ataques de pánico, histeria, trastornos de sueño, enfermedad de Alzheimer, y enfermedad de Parkinson. El método incluye administrar un compuesto del primer aspecto a un sujeto en una cantidad suficiente para tratar o prevenir al trastorno.
La invención también presenta un método para incrementar neurogénesis en un sujeto. El método incluye administrar un compuesto del primer aspecto a un sujeto. El sujeto puede desear, o puede estar en necesidad de neurogénesis . En ciertas formas de realización, el sujeto puede estar sufriendo de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ALS, apoplejía, ADD, y síndromes neuro-psiquiátricos . En otras formas de realización, el incremento en la neurogénesis puede mejorar el aprendizaje o acrecentar la neuro-protección .
En otro aspecto, la invención presenta un método para convertir células madre/progenitoras de hígado en células pancreáticas funcionales; prevenir deterioro de células beta y estimulación de proliferación de células beta; tratar obesidad; suprimir apetito e inducir saciedad; tratar síndrome de intestinos irritables; reducir la morbidez y/o mortalidad asociada con infarto de miocardio y apoplejía; tratar síndrome coronario agudo caracterizado por una ausencia de infarto de miocardio de ondas Q; atenuar cambios catabólicos post-quirúrgicos; tratar miocardio en hibernación o cardiomiopatía diabética; suprimir niveles sanguíneos de plasma de norepinefriña; incrementar la excreción urinaria de sodio, disminuir la concentración urinaria de potasio; tratar condiciones o trastornos asociados con hipervole-mia tóxica, v.gr., falla renal, falla congestiva del corazón, síndrome nefrótico, cirrosis, edema pulmonar, e hipertensión; inducir una respuesta inotrópica e incrementar la capacidad de contracción cardiaca; tratar síndrome de ovarios policísticos; tratar aflicción respiratoria; mejorar la nutrición mediante una ruta no alimentaria, es decir, mediante inyección o infusión intravenosa, sub-cutánea, intramuscular, peritoneal u otra; tratar nefropatia; tratar disfunción sistólica ventricular izquierda (v.gr., con fracción de eyección ventricular izquierda anormal); inhibir motilidad antro-duodenal (v.gr., para el tratamiento o prevención de trastornos gastrointestinales tales como diarrea, síndrome de evacuación post-operativa y síndrome de intestinos irritables, y como pre-medicación en procedimientos endoscópicos; tratar polineuropatía de enfermedad crítica (CIPN) y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS; modular niveles de triglicéridos y tratar dislipidemia; tratar lesión de tejidos de órganos ocasionada por reperfusión de flujo sanguíneo después de isquemia; o tratar síndrome de factor de riesgo de enfermedad coronaria del corazón (CHDRF) en un sujeto mediante administrar una cantidad efectiva de un agonista GLP-1.
En otro aspecto, la invención presenta un método para incrementar actividad de receptor de GLP-1 en un sujeto. El método incluye administrar un compuesto del primer aspecto a un sujeto en una cantidad suficiente para incrementar actividad del receptor de GLP-1. El método puede reducir los niveles de glucosa en un sujeto.
En cualquiera de los métodos que involucran la administración de un compuesto a un sujeto, la cantidad suficiente puede ser menor que 90%, 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o 0.1% de la cantidad requerida para una dosis equivalente del agonista GLP-1 cuando no se conjuga con el vector de péptido. La cantidad suficiente puede reducir efectos secundarios (v.gr., vómito, nausea, o diarrea) según se compara con administración de una cantidad efectiva del agonista GLP-1 cuando no se conjuga con el vector de péptido. El sujeto puede ser un mamífero tal como un humano.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el vector de péptido puede ser un polipéptido sustancialmente idéntico a cualquiera de las secuencias señaladas en la Tabla 1, o un fragmento del mismo. En ciertas formas de realización, el polipéptido de vector tiene una secuencia de una secuencia de Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), Angiopep-3 (SEQ ID NO: 107), Angiopep-4a (SEQ ID NO: 108), Angiopep-4b (SEQ ID NO: 109), Angiopep-5 (SEQ ID NO: 110), Angiopep-6 (SEQ ID NO: 111), o Angiopep-7 (SEQ ID NO:112)). El vector de péptido o conjugado puede transportarse de manera eficiente hacia un tipo de célula particular (v.gr., cualesquiera uno, dos, tres, cuatro, o cinco de hígado, pulmón, riñon, bazo, y músculo) o puede cruzar la BBB mamífera de manera eficiente (v.gr., (v.gr., Angiopep-1, -2, -3, -4a, -4b, -5, y -6) . En otra forma de realización, el vector de péptido o conjugado es capaz de ingresar un tipo de célula particular (v.gr., cualesquiera uno, dos, tres, cuatro, o cinco de hígado, pulmón, riñon, bazo, y músculo) pero no cruza la BBB de manera eficiente (v.gr., un conjugado incluyendo Angiopep-7) . El vector de péptido puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 35, 50, 75, 100, 200, o 500 aminoácidos. En ciertas formas de realización, el vector de péptido es de 10 a 50 aminoácidos de longitud. El polipéptido puede producirse por una tecnología genética recombinante o síntesis química.
Tabla 1: Polipéptidos Ejemplares SEQ ID NO: 1 T F V Y G G C R A K R N N F K S A E D 2 T F Q Y G G C M G N G N N F V T E K E 3 P F F Y G G C G G N R N N F D T E E Y 4 S F Y Y G G C L G N K N N Y L R E E E 5 T F F Y G G C R A K R N N F K R A K Y 6 T F F Y G G C R G K R N N F K R A K Y 7 T F F Y G G C R A K K N N Y K R A K Y 8 T F F Y G G C R G K K N N F K R A K Y 9 T F Q Y G G C R A K R N N F K R A K Y 10 T F Q Y G G C R G K K N N F K R A K Y 11 T F F Y G G C L G K R N N F K R A K Y 12 T F F Y G G S L G K R N N F K R A K Y 13 P F F Y G G C G G K K N N F K R A K Y 14 T F F Y G G C R G K G N N Y K R A K Y 15 P F F Y G G C R G K R N N F L R A K Y 16 T F F Y G G C R G K R N N F K R E K Y 17 P F F Y G G C R A K K N N F K R A K E 18 T F F Y G G C R G K R N N F K R A K D 19 T F F Y G G C R A K R N N F D R A K Y 20 T F F Y G G c R G K K N N F K R A E Y 21 P F F Y G G c G A N R N N F K R A K Y 22 T F F Y G G c G G K K N N F K T A K Y 23 T F F Y G G c R G N R N N F L R A K Y 24 T F F Y G G c R G N R N N F K T A K Y 25 T F F Y G G s R G N R N N F K T A K Y 26 T F F Y G G c L G N G N N F K R A K Y 27 T F F Y G G c L G N R N N F L R A K Y 28 T F F Y G G c L G N R N N F K T A K Y 29 T F F Y G G c R G N G N N F K S A K Y 30 T F F Y G G c R G K K N N F D R E K Y 31 T F F Y G G c R G K R N N F L R E K E 32 T F F Y G G c R G K G N N F D R A K Y 33 T F F Y G G s R G K G N N F D R A K Y 34 T F F Y G G c R G N G N N F V T A K Y 35 P F F Y G G c G G K G N N Y V T A K Y 36 T F F Y G G C L G K G N N F L T A K Y 37 S F F Y G G C L G N K N N F L T A K Y 38 ? F F Y G G C G G N K N N F V R E K Y 3 9 ? F F Y G G C M G N K N N F V R E K Y 4 0 ? F F Y G G S M G N K N N F V R E K Y 4 1 ? F F Y G G C L G N R N N Y V R E K Y 42 ? F F Y G G C L G N R N N F V R E K Y 4 3 ? F F Y G G C L G N K N N Y V R E K Y 44 ? F F Y G G C G G N G N N F L T A K Y 4 5 ? F F Y G G C R G N R N N F L T A E Y 4 6 ? F F Y G G C R G N G N N F K s A E Y 4 7 ? F F Y G G c L G N K N N F K T A E Y 4 8 ? F F Y G G c R G N R N N F K T E E Y 4 9 ? F F Y G G c R G K R N N F K T E E D 50 ? F F Y G G c G G N G N N F V R E K Y 51 S F F Y G G c M G N G N N F V R E K Y 52 ? F F Y G G c G G N G N N F L R E K Y 53 t F F Y G G c L G N G N N F V R E K Y 54 S F F Y G G c L G N G N N Y L R E K Y 55 t F F Y G G s L G N G N N F V R E K Y 56 t F F Y G G c R G N G N N F V T A E Y 57 t F F Y G G c L G K G N N F V S A E Y 58 t F F Y G G c L G N R N N F D R A E Y 59 t F F Y G G c L G N R N N F L R E E Y 60 t F F Y G G c L G N K N N Y L R E E Y 61 ? F F Y G G c G G N R N N Y L R E E Y 62 ? F F Y G G s G G N R N N Y L R E E Y 63 R ? D F C L E P P Y T G P C V A R I 64 A R I I R Y F Y N A K A G L C Q T F V G 65 Y G G c R A K R N N Y K S A E D C M R C G 66 ? D F c L E P P Y T G P C V A R I I R F Y 67 ? F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 68 ? F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 69 ? F Y Y G G c R G K R N N Y K T E E Y 7 0 ? F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y 7 1 C ? F F Y G c C R G K R N N F K T E E Y 72 t F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y c 73 C ? F F Y G s C R G K R N N F K T E E Y 74 t F F Y G G s R G K R N N F K T E E Y c 75 ? F F Y G G c R G K R N N F K T E E Y 7 6 t F F Y G G c R G K R N N F K T K E Y 77 t F F Y G G K R G K R N N F K T E E Y 78 t F F Y G G c R G K R N N F K T K R Y 7 9 t F F Y G G K R G K R N N F K T A E Y 80 t F F Y G G K R G K R N N F K T A G Y 8 1 t F F Y G G K R G K R N N F K R E K Y 82 t F F Y G G K R G K R N N F K R A K Y 83 t F F Y G G c L G N R N N F K T E E Y 84 t F F Y G C G R G K R N N F K T E E Y 85 t F F Y G G R C G K R N N F K T E E Y 86 T F F Y G G C L G N G N N F D T E E E 87 t F Q Y G G C R G K R N N F K T E E Y 88 Y N K E F G T F N T K G C E R G Y R F 89 R F K Y G G c L G N M N N F E T L E E 90 R F K Y G G C L G N K N N F L R L K Y 91 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y 92 K T K R K R K K Q R V K I A Y E E I F K N Y 93 K T K R K R K K Q R V K I A Y 94 R G G R L S Y S R R F S T S T G R 95 R R L S Y S R R R F 96 R Q I K I W F Q N R R M K W K K 97 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 98 M R P D F C L E P P Y T G P C V A R I I R Y F Y N A K A G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 99 T F F Y G G C R G K R N N F K T K E Y 100 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y 101 T F F Y G G C R A K R N N F K R A K Y 102 N A K A G L C Q T F V Y G G C L A K R N N F E S A E D C M R T C G G A 103 Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 104 G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A E 105 L C Q T F V Y G G C E A K R N N F K S A 107 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 108 R F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 109 R F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 110 R F F Y G G S R G K R N N F R T E E Y 111 T F F Y G G S R G K R N N F R T E E Y 112 T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y 113 C T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 114 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y C 115 C T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y 116 T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y C Los polipéptidos 5, 67, 76 y 91, incluyen las secuencias de las SEQ ID NOs: 5, 67, 76, y 91, respectivamente, y son amidados en la terminal C.
Los polipéptidos 107, 109, y 110 incluyen las secuencias de las SEQ ID NOs: 107, 109, y 110, respectivamente, y son acetilados en la terminal N.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el vector de péptido puede incluir una secuencia de aminoácidos teniendo la fórmula : XI-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-XI0-XI1-XI2-XI3-XI4-XI5-XI6-XI7- XI8-XI9 donde cada uno de X1-X19 (v.gr., X1-X6, X8, X9, X11-X14, y X16- X19) es, de manera independiente, cualquier aminoácido (v.gr., un aminoácido tal como aparece en la naturaleza tal como Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val) o ausente y por lo menos uno (v.gr., 2 o 3) de XI, X10, y X15 es arginina. En algunas formas de realización, X7 es Ser o Cys; o X10 y X15 cada uno de manera independiente es Arg o Lys. En algunas formas de realización, los residuos de XI a X19, inclusive, son sustancialmente idénticos a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs:l-105 y 107-116 (v.gr., Angiopep-1, Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7) . En algunas formas de realización, por lo menos uno (v.gr., 2, 3, 4, o 5) de los aminoácidos X1-X19 es Arg. En algunas formas de realización, el polipéptido tiene uno o mas residuos de cisteina adicionales en la terminal N del polipéptido, la terminal C del polipéptido, o ambas.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el agonista GLP-1 puede ser un agonista de péptido. El agonista GLP-1 puede ser GLP-1, exendina-4, exendina-3, o análogo o fragmento de los mismos (v.gr., cualquier análogo o fragmento descrito en la presente) . En formas de realización particulares, el agonista GLP-1 es un análogo de exendina-4 seleccionado a partir del grupo que consiste en [Lys39] exendina-4 y [Cys32] exendina- .
En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el vector de péptido o péptido de agonista GLP-1 es modificado (v.gr., como se describe en la presente). El polipéptido puede ser amidado, acetilado, o ambos. Tales modificaciones a polipéptidos pueden estar en la terminal amino o carboxi del polipéptido. El polipéptido también puede incluir peptidomiméticos (v.gr., aquellos descritos en la presente) de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. El polipéptido puede estar en una forma multimérica, por ejemplo, forma dimérica (v.gr., formarse por enlace de disulfuro a través de residuos de cisteina) .
En ciertas formas de realización, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la presente con por lo menos una sustitución (v. gr . , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 sustituciones), inserción o supresión de aminoácidos. El polipéptido puede contener, por ejemplo, 1 a 12, 1 a 10, 1 a 5, o 1 a 3 sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, 1 a 10 (v.gr., a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras. Por ejemplo, el polipéptido puede dar una arginina en una, dos, o tres de las posiciones correspondientes a las posiciones 1, 10 y 15 de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO:l, Angiopep-1, Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7. El agonista GLP-1 puede tener una sustitución o adición de cisteina o lisina en cualquier posición (v.gr., una sustitución de lisina en la posición terminal N o C, o una sustitución de cisteina en la posición correspondiente al aminoácido 32 de la secuencia de exendina-4).
En cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto puede excluir específicamente un polipéptido incluyendo o consistiendo de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-105 y 107-116 (v.gr., Angiopep-1, Angiopep-2, Angiopep-3, Angiopep-4a, Angiopep-4b, Angiopep-5, Angiopep-6, y Angiopep-7). En algunas formas de realización, los polipéptidos y conjugados de la invención excluyen los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 102, 103, 104, y 105.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el enlazador (X) puede ser cualquier enlazador conocido en la materia o descrito en la presente. En formas de realización particulares, el enlazador es un enlace covalente (v.gr., un enlace de péptido) , un agente enlazador químico (v.gr., aquellos descritos en la presente), un aminoácido o péptido (v.gr., 2, 3, 4, 5, 8, 10, o mas aminoácidos) . En ciertas formas de realización, el enlazador tiene la fórmula: donde n es un entero entre 2 y 15 (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15); y ya sea Y es un tiol sobre A y Z es una amina primaria sobre B o Y es un tiol sobre B y Z es una amina primaria sobre A.
Por "agonista GLP-1" se entiende cualquier compuesto capaz de activar un receptor de GLP-1 (v.gr., un receptor de GLP-1 mamífero o humano) . Agonistas pueden incluir péptidos o compuestos de moléculas pequeñas (v.gr., cualquiera de aquellos descritos en la presente) . Ensayos para determinar si un compuesto particular es un agonista GLP-1 se conocen en la materia y se describen en la presente.
Por "vector de péptido" se entiende un compuesto o molécula tal como un polipéptido o un mimético de polipéptido que puede transportarse hacia un tipo de célula particular (v.gr., hígado, pulmones, riñon, bazo, o músculo) o a través de la BBB. El vector puede unirse a (de manera covalente o no) o conjugarse a un agente (v.gr., un agonista GLP-1) y por ende puede ser capaz de transportar al agente hacia un tipo de célula particular o a través de la BBB. En ciertas formas de realización, el vector puede enlazarse a receptores presentes sobre células de cáncer o células endoteliales cerebrales y por ende ser transportado hacia la célula de cáncer o a través de la BBB por trasncitosis . El vector puede ser una molécula para la cual altos niveles de transporte trans-endotelial pueden obtenerse, sin afectar la integridad de la célula o BBB. El vector puede ser un polipéptido o un peptidomimético y puede ser según se presenta en la naturaleza o producido por síntesis química o tecnología genética recombinante .
Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipép-tido o ácido nucleico exhibiendo por lo menos 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% o aun 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia. Para polipéptidos, la longitud de secuencias de comparación generalmente será por lo menos 4 (v.gr., por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, o 100) aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de secuencias de comparación generalmente será por lo menos 60 nucleótidos, de preferencia por lo menos 90 nucleótidos, y mas preferentemente por lo menos 120 nucleótidos, o la longitud completa. Se entenderá en la presente que espacios pueden encontrarse entre los aminoácidos de análogos gue son idénticos o similares a aminoácidos del polipéptido original. Los espacios pueden incluir ningún aminoácido, uno o mas aminoácidos que no son idénticos o similares al polipéptido original. Análogos biológicamente activos de los vectores (polipéptidos) de la invención se abarcan con la presente. Identidad porcentual puede determinarse, por ejemplo, con un algoritmo n GAP, BESTFIT, o FASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics Emisión 7.0, usando pesos de espacio predeterminados.
Por "tratar" una enfermedad, trastorno, o condición en un sujeto se entiende reducir por lo menos un síntoma de la enfermedad, trastorno, o condición mediante administrar un agente terapéutico al sujeto.
Por "tratar profilácticamente" una enfermedad, trastorno, o condición en un sujeto se entiende reducir la frecuencia de ocurrencia de (v.gr., prevenir) una enfermedad, trastorno o condición o reducir la severidad de la enfermedad, trastorno, o condición mediante administrar un agente terapéutico al sujeto.
Un sujeto que está siendo tratado para un trastorno metabólico es uno a quien un médico practicante ha diagnosticado teniendo tal una condición. El diagnóstico puede ser llevado a cabo por cualquier medio adecuado, tal como aquellos descritos en la presente. Un sujeto en el cual el desarrollo de diabetes u obesidad está siendo prevenido puede o no haber recibido tal un diagnóstico. Un técnico en la materia entenderá que el sujeto de la invención puede haber sido sometido a pruebas estándar o puede haber sido identificado, sin examinación, como uno en alto riesgo debido a la presencia de uno o mas factores de riesgo, tales como historia familiar, obesidad, etnia particular (v.gr., africanos americanos o hispanoamericanos), diabetes gestacional o dar a luz a un bebé que pesa mas de nueve libras (4.082 kg) , hipertensión, teniendo una condición patológica predisponiendo a obesidad o diabetes, altos niveles sanguíneos de triglicéridos, altos niveles sanguíneos de colesterol, presencia de marcadores moleculares (v.gr., presencia de auto-anticuerpos), y edad (sobre 45 años de edad) . Un individuo es considerado obeso cuando su peso es 20% (25% en mujeres) o mas sobre el peso máximo deseable para esta estatura. Un adulto que tiene mas de 100 libras (45.36 kg) de sobrepeso, se considera estando mórbidamente obeso. La obesidad también se define como un índice de mas corporal (BMI) sobre 30 kg/m2.
Por un "trastorno metabólico" se entiende cualquier condición patológica resultante de una alteración en un metabolismo del sujeto. Tales trastornos incluyen aquellos resultando de una alteración en la homeostasis de glucosa resultando, por ejemplo, en hiperglicemia . De acuerdo con esta invención, una alteración en los niveles de glucosa es típicamente un incremento en los niveles de glucosa por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o aun 100% con relación a tales niveles en un individuo saludable. Trastornos metabólicos incluyen obesidad y diabetes (v.gr., diabetes tipo I, diabetes tipo II, MODY, y diabetes gestacional, saciedad, y deficiencias endocrinas del envejecimiento.
Por "reducir niveles de glucosa" se entiende reducir el nivel de glucosa por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% con relación a un control no tratado. Deseablemente, los niveles de glucosa se reducen a niveles normoglicémicos, es decir, entre 150 y 60 mg/dL, entre 140 y 70 mg/dL, entre 130 y 70 mg/dL, entre 125 y 80 mg/dL, y de preferencia entre 120 y 80 mg/dL. Tal reducción en los niveles de glucosa puede obtenerse mediante incrementar cualquiera de las actividades biológicas asociadas con la eliminación de glucosa de la sangre (v.gr., incrementar producción, secreción, o acción de insulina) .
Por "sujeto" se entiende un humano o animal no humano (v.gr., un mamífero).
Por "incrementar la actividad del receptor de GLP-1" se entiende incrementar el nivel de activación del receptor medido usando técnicas estándar (v.gr., activación de cA P) , por ejemplo, por al menos 20%, 50%, 75%, 100%, 200%, o 500% según se compara con un control no tratado.
Por "dosificación equivalente" se entiende la cantidad de un compuesto de la invención requerido para lograr la misma cantidad molar del agonista GLP-1 en el compuesto, según se compara con el agonista GLP-1 no conjugado. Por ejemplo, la dosificación equivalente de 1.0 yg de exendina-4 es alrededor de 1.6 yg del conjugado [Lys39-MHA] exendina-5/Angiopep-2-Cys-NH2 descrito en la presente.
Por un polipéptido el cual es "transportado de manera eficiente a través de la BBB" se entiende un polipéptido que es capaz de cruzar la BBB por lo menos tan eficientemente como Angiopep-6 (es decir, mas de 38.5% de aquel de Angiopep-1 (250 nM) en el ensayo de perfusión cerebral in situ descrito en la solicitud de patente US 11/807,597, solicitada el 29 de mayo de 2007, por ende incorporada por referencia) . De manera acorde, un polipéptido el cual "no se transporta de manera eficiente a través de la BBB" se transporta al cerebro a niveles mas bajos (v.gr., se transporta menos eficientemente que Angiopep-6) .
Por un polipéptido o compuesto el cual es "eficientemente transportado a un tipo de célula particular" se entiende que el polipéptido o compuesto es capaz de acumular (v.gr., ya sea debido a transporte incrementado hacia la célula, eflujo disminuido a partir de la célula, o una combinación de los mismos) en ese tipo de célula por lo menos 10% (v.gr., 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1,000%, 5,000% o 10,000%) mayor extensión que ya sea una sustancia de control, o, en el caso de un conjugado, según se compara con el agente no conjugado. Tales actividades son descritas en detalle en la solicitud de patente internacional WO 2007/009229, por ende incorporada por referencia.
Otras características y ventajas de la invención no serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una tabla y diagrama esquemático mostrando exendina-4 y los análogos de exendina-4 usados en experimentos descritos en la presente.
La figura 2 es un diagrama esquemático del esquema sintético usado para conjugar Cys-Angiopep-2, Angiopep-2-Cys-NH2, y Angiopep-1 a [Lys39-MHA] exendina-4.
La figura 3 es un diagrama esquemático del esquema sintético usado para conjugar [Cys32] exendina-4 a (ácido maleimido propiónico (MPA) ) -Angiopep-2, (ácido maleimido hexamoico (MHA) ) -Angiopep-2, y (ácido maleimido undecanoico (MUA) ) -Angiopep-2.
La figura 4 es una gráfica mostrando transporte de exendina-4 (izquierda) y exendina-4 /Angiopep-2 (terminal N, centro; terminal C, derecha) a través de la BBB. La cantidad total en el cerebro, junto con las cantidades en los capilares y la parénquima se muestran.
La figura 5 es una gráfica mostrando incremento en peso de ratones (ob/ob) después de administración de un control, exendina-4, o el conjugado [Lys39- HA] exendina-4 /Angiopep-2-Cys-NH2 (Exen-An2) . Tanto exendina-4 y Ex-An2 se observaron reduciendo ganancia de peso según se comparan con animales recibiendo el control .
La figura 6 es una gráfica mostrando consumo total de alimentos por ratones (ob/ob) , donde los ratones fueron administrados con un control, exendina-4, o Exen-An2. Tanto exendina-4 y Exen-An2 se observaron reduciendo consumo alimenticio según se compara con los animales recibiendo el control.
La figura 7 es una gráfica mostrando reducción en glicemia después de administración de dos dosis de exendina-4 (3 ug/kg y 30 yg/kg) y dosis equivalentes de Exen-An2 (4.8 pg/kg y 48 µg/kg) . Una reducción similar en glicemia a la dosis mas baja de Exen-An2, según se compara con la dosis mas alta de exendina-4, se observó. Durante este experimento, un ratón en el grupo de control murió en el día 12.
La figura 8A es un diagrama esquemático mostrando la estructura de un conjugado de dimero de Exendina-4-Angiopep-2 (Ex4 (Lys39 (MHA) ) -AN2-AN2) . El compuesto tiene la estructura HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPK (MHA) -TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC- (MPA) -TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH, donde MHA es ácido maleiraido hexanoico y MPA es ácido maleimido propiónico.
La figura 8B es una estructura esquemática de un Exendina-4-scramble-Angiopep-2 (Ex4 (Cys32 ) -ANS4 (N-Term) o Exen-S4) que se usó como un control. Este compuesto tiene la estructura HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPCSGAPPPS- (MHA) -GYKGERYRGFKETNFNTFS-OH, donde MHA es ácido maleimido hexanoico.
La figura 9 es una gráfica mostrando la habilidad de, de izquierda a derecha, Exendina-4; conjugados de Exendina-4-Angiopep-2 C3, C6, y Cll; Exen-S4; y Exendina-4 cuando se conjugan a una forma dimérica de Angiopep-2, para cruzar la BBB.
La figura 10 es una gráfica mostrando la habilidad de Exendina-4 y Exen-An2-An2 para reducir glicemia en ratones.
Descripción Detallada Se han desarrollado conjugados de agonista GLP-1/péptido teniendo una habilidad acrecentada para cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) o para ingresar a tipos de células particulares (v.gr., hígado, pulmón, riñon, bazo, y músculo) usando el agonista GLP-1 ejemplar exendina-4 y análogos de exendina-4. Los conjugados de péptido de la invención pueden incluir un agonista GLP-1 y un vector de péptido que acrecientan transporte a través de la BBB.
También se ha mostrado que dosis menores de los compuestos de la invención, según se comparan con agonistas GLP-1 no conjugados, son efectivas para tratar trastornos relacionados con GLP-1 incluyendo una reducción en glicemia. Mediante administrar dosis menores de los péptidos conjugados, efectos secundarios tales como vómito, nausea, y diarrea observados con los agonistas no conjugados pueden reducirse o eliminarse. Alternativamente, eficacia incrementada a dosis mayores puede obtenerse .
El agonista GLP-1 puede ser cualquier agonista GLP-1 conocido en la materia e incluyendo péptidos tales como aquellos descritos en la presente. Agonistas GLP-1 particulares incluyen exendina-4, GLP-1, y fragmentos de exendina-3, sustituciones (v.gr., sustituciones conservadoras o no conservadoras, o sustituciones de aminoácidos que no se presentan en la naturaleza) , y modificaciones químicas a las secuencias de aminoácidos (v.gr., aquellas descritas en la presente). Agonistas GLP-1 particulares se describen en detalle mas adelante.
Agonistas GLP-1 Los conjugados de la invención pueden incluir cualquier agonista GLP-1 conocido en la materia. Agonistas GLP-1 particulares incluyen GLP-1, exendina-4, y análogos de los mismos. Análogos ejemplares se describen mas adelante.
Exendina-4 y análogos de exendina-4 Exendina-4 y análogos de exendina-4 también pueden usarse en las composiciones, métodos, y kits de la invención. Los compuestos de la invención pueden incluir fragmentos de la secuencia de exendina-4. Exendina-4 tiene la secuencia His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser- Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 Análogos particulares de exendina-4 incluyen aquellos teniendo una sustitución de cisteina (v.gr., [Cys32] exendins-4 ) o una sustitución de lisina (v.gr., [Lys39] exendina- ) . Análogos de exendina también se describen en la patente US 7,157,555 e incluyen aquellos de la fórmula: X1-X2-X3-Gly-Thr-X4-X5-X6-X7-X8-Ser-Lys-Gln-X9-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-X10-Xu-X12-X13-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-X14-Ser-Ser-Gly-Ala-X15- donde Xj es His, Arg o Tyr; X2 es Ser, Gly, Ala o Thr; X3 es Asp o Glu; X4 es Phe, Tyr o Nal; X5 es Thr o Ser; X6 es Ser o Thr; X7 es Asp o Glu; X8 es Leu, lie, Val, pGly o Met; X9 es Leu, lie, pGly, Val o Met; X10 es Phe, Tyr, o Nal; Xn es lie, Val, Leu, pGly, t-BuG o Met; X12 es Glu o Asp; X13 es Trp, Phe, Tyr, o Nal; X14, X15, X16 y X17 son de manera independiente Pro, HPro, 3Hyp, 4Hyp, TPro, N-alquilglicina, N-alquil-pGly, o N-alquilalanina; X18 es Ser, Thr, o Tyr; y Z es -OH o -NH2 (v.gr., con la provisión de que el compuesto no sea exendina-3 o exendina-4.) Grupos N-alquilo preferidos para N-alquilglicina, N-alquil-pGly y N-alquilalanina incluye grupos alquilo menores (v.gr., alquilo Cj.g o alquilo C^) .
En ciertas formas de realización, X1 es His o Tyr (v.gr., His) . X2 puede ser Gly. X9 puede ser Leu, pGly, o Met. X13 puede ser Trp o Phe. X4 puede ser Phe o Nal; Xn puede ser lie o Val, y X14, X15, X16 y X17 pueden seleccionarse de manera independiente a partir de Pro, HPro, TPro, o N-alquilalanina (v.gr., donde N-alquilalanina tiene un grupo N-alquilo de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono) . En un aspecto, X15, X16 y X17 son el mismo residuo de aminoácidos. X18 puede ser Ser o Tyr (v.gr., Ser). Z puede ser -NH2.
En otras formas de realización, Xj es His o Tyr (v.gr., His) ; X2 es Gly; X4 es Phe o Nal; X9 es Leu, pGly, o Met; X10 es Phe o Nal; Xu es lie o Val; X14, X15, X16 y X17 son de manera independiente seleccionados a partir de Pro, HPro, TPro, o N-alquilalanina; y X18 es Ser o Tyr (v.gr., Ser). Z puede ser -NH2.
En otras formas de realización, X1 es His o Arg; X2 es Gly; X3 es Asp o Glu; X4 es Phe o naftilalanina; X5 es Thr o Ser; X6 es Ser o Thr; X7 es Asp o Glu; X8 es Leu o pGly; X9 es Leu o pGly; X10 es Phe o Nal; Xn es lie, Val, o t-butilglicina; X12 es Glu o Asp; X13 es Trp o Phe; X1A, X15, X16 y X17 son de manera independiente Pro, HPro, TPro, o N-metilalanina; X18 es Ser o Tyr; y Z es -OH o -NH2 (v.gr., donde el compuesto no es exendina-3 o exendina-4). Z puede ser -NH2.
En otra forma de realización, X9 es Leu, lie, Val, o pGly (v.gr., Leu o pGly) y X13 es Phe, Tyr, o Nal (v.gr., Phe o Nal) . Estos compuestos pueden exhibir duración ventajosa de acción y ser menos sujetos a degradación oxidativa, tanto in vitro o in vivo, asi como durante síntesis del compuesto.
Otros análogos de exendina también descritos en las patentes US 7,157,555 y 7,223,725, incluyen compuestos de la fórmula : X1-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-Xg-X9-X10-X11-X12- i3-Xi4-Xi5_Xi6-Xi7-Ala-X19-X2o'-X2i- donde X: es His, Arg, o Tyr; X2 es Ser, Gly, Ala, o Thr; X3 es Asp o Glu; X5 es Ala o Thr; X6 es Ala, Phe, Tyr, o Nal; X7 es Thr o Ser; X8 es Ala, Ser, o Thr; X9 es Asp o Glu; X10 es Ala, Leu, lie, Val, pGly, o Met; Xii es Ala o Ser; X12 es Ala o Lys; X13 es Ala o Gln; X14 es Ala, Leu, lie, pGly, Val, o Met; X15 es Ala o Glu; X16 es Ala o Glu; X17 es Ala o Glu; X19 es Ala o Val; X20 es Ala o Arg; X21 es Ala o Leu; X22 es Phe, Tyr, o Nal; X23 es lie, Val, Leu, pGly, t-BuG, o Met; X24 es Ala, Glu, o Asp; X25 es Ala, Trp, Phe, Tyr, o Nal; X26 es Ala o Leu; X27 es Ala o Lys; X28 es Ala o Asn; Z1 es -OH, -NH2, Gly-Z2, Gly-Gly-Z2, Gly-Gly-X31-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Z2, Gly- Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-Z2 o Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-X38-Z2; X31 , X36, X37 , y X38 son de manera independiente Pro, HPro, 3Hyp, 4Hyp, TPro, N-alquilglicina, N-alquil-pGly o N-alquilalanina; y Z2 es -OH o-NH2 (v.gr., provisto que no mas de tres de X5, X6, X7, Xg, Xg, XiQí Xll Xl2' Xl3' ^14 Xl5' ^16 ^17 / ^19 ^20 ^21' ^22 ' ^23 ' ^24 X25, X26, X27 y X28 sean Ala) . Grupos N-alquilo preferidos para N-alquilglicina, N-alquil-pGly y N-alquilalanina incluyen grupos alquilo menores de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono (v.gr., 1 a 4 átomos de carbono) .
En ciertas formas de realización, Xx es His o Tyr (v.gr., His) . X2 puede ser Gly. X14 puede ser Leu, pGly, o Met. X25 puede ser Trp o Phe. En algunas formas de realización, X6 es Phe o Nal, X22 es Phe o Nal, y X23 es lie o Val. X31, X36, X37, y X38 pueden seleccionarse de manera independiente a partir de Pro, HPro, TPro, y N-alquilalanina. En ciertas formas de realización, Z1 es -NH2 o Z2 es -NH2.
En otra forma de realización, Xi es His o Tyr (v.gr., His) ; X2 es Gly; X6 es Phe o Nal; X14 es Leu, pGly, o Met; X22 es Phe o Nal; X23 es lie o Val; X31 , X36, X37, y X38 son de manera independiente seleccionados a partir de Pro, HPro, TPro, o N-alquilalanina . En formas de realización particulares, Z-^ es -NH2.
En otra forma de realización, Xj es His o Arg; X2 es Gly o Ala; X3 es Asp o GIu; X5 es Ala o Thr; X6 es Ala, Phe, o naftilalanina; X7 es Thr o Ser; X8 es Ala, Ser, o Thr; X9 es Asp o Glu; X10 es Ala, Leu, o pGly; X es Ala o Ser; X12 es Ala o Lys; X13 es Ala o Gln; X14 es Ala, Leu, o pGly; X15 es Ala o Glu; X16 es Ala o Glu; X17 es Ala o Glu; X19 es Ala o Val; X20 es Ala o Arg; X21 es Ala o Leu; X22 es Phe o Nal; X23 es lie, Val o t-BuG; X24 es Ala, Glu o Asp; X25 es Ala, Trp o Phe; X26 es Ala o Leu; X27 es Ala o Lys; X28 es Ala o Asn; Z, es -OH, -NH2, Gly-Z2, Gly-Gly-Z2, Gly-Gly-X31-Z2, Gly-Gly X31-Ser-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala- X36-X37-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-X38-Z2; X31, X36, X37 y X38 siendo de manera independiente Pro HPro, TPro o N-metilalanina; y Z2 siendo - OH o -NH2 (v.gr., provisto que no mas de tres de X3, X5, X6, X8, X10, ^11' ^12' ^13' ^14 ^15' ^16' ^-19 X21 ' ^21/ ^24' ^25' ^26' ^27 Y ^28 sean Ala) .
En aun otra forma de realización, X14 es Leu, lie, Val, o pGly (v.gr., Leu o pGly) , y X25 es Phe, Tyr o Nal (v.gr., Phe o Nal) .
Análogos de exendina descritos en la patente US 7,220,721 incluyen compuestos de la fórmula: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X2o-X2i- X22-X23-X24—X25_X26—X27_X28~Z-L donde Xx es His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, o Norleu; X2 es Ser, Gly, Ala, o Thr; X3 es Ala, Asp, o Glu; X4 es Ala, Norval, Val, Norleu, o Gly; X5 es Ala o Thr; X6 es Phe, Tyr o Nal; X7 es Thr o Ser; X8 es Ala, Ser o Thr; X9 es Ala, Norval, Val, Norleu, Asp, o Glu; X10 es Ala, Leu, lie, Val, pGly, o Met; Xu es Ala o Ser; X12 es Ala o Lys; X13 es Ala o Gln; X14 es Ala, Leu, lie, pGly, Val, o Met; X15 es Ala o Glu; X16 es Ala o Glu; X17 es Ala o Glu; X19 es Ala o Val; X20 es Ala o Arg; X21 es Ala o Leu; X22 es Phe, Tyr, o Nal; X23 es lie, Val, Leu, pGly, t-BuG, o Met; X24 es Ala, Glu, o Asp; X25 es Ala, Trp, Phe, Tyr, o Nal; X26 es Ala o Leu; X27 es Ala o Lys; X28 es Ala o Asn; Z1 es -OH, -NH2, Gly-Z2, Gly-Gly-Z2, Gly-Gly-X31-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X13-Z2, Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-Z2, Gly-Gly X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-X31-Z2 o Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X35-X37-X38-X39-Z2 ; donde X31 , X35, X37, y X38 son de manera independiente Pro, HPro, 3Hyp, 4Hyp, TPro, N-alquilglicina, N-alquil-pGly, o N-alquilalanina; y Z2 es - OH o -NH2 (v.gr., provisto que no mas de tres de X3, X5, X5, X8, X10, Xn, X12, X13, X14, provisto también que, si Xj es His, Arg, o Tyr, entonces por lo menos uno de X3, X4 y X9 es Ala) .
Ejemplos particulares de análogos de exendina-4 incluyen exendina-4 ( 1-30) , exendina-4 ( 1-30) amida, exendina-4 ( 1-28) amida, [Leu14, Phe25] exendina-4 amida, [Leu14, Phe25] exendina-4(1-28) amida, y [Leu14, Ala22, Phe25] exendina-4 ( 1-28 ) amida.
La patente US 7,329,646 describe análogos de exendina-4 teniendo la fórmula general: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-X20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-X40 donde X14 es Arg, Leu, lie, o et; X20 es His, Arg, o Lys; X40 es Arg-OH, -OH, -NH2 o Lys-OH. En ciertas formas de realización, cuando X14 es Met y X20 es Arg, X40 no puede ser -NH2. Otros derivados de exendina-4 incluyen [ (Ile/Leu/Met) 14, (His/Lys)20, Arg40] exendina-4 ; [(no Lys/no Arg)12, (no Lys/no Arg)20, (no Lys/no Arg)27, Arg40] exendina- ; y [(no Lys/no Arg)20, Arg40] exendina-4. Análogos de exendina-4 particulares incluyen [Lys20, Arg40] exendina-4, [His20, Arg40] exendina-4 ; y [Leu14, Lys20, Arg40] exendina- .
La invención también puede usar formas truncadas de exendina-4 o cualquiera de los análogos de exendina descritos en la presente. Las formas truncadas pueden incluir supresiones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos a partir de la terminal N, a partir de la terminal C, o una combinación de los mismos. Fragmentos de exendina-4 particulares incluyen Exendina- ( 1-31 ) . Otros fragmentos de exendina-4 se describen en la publicación de solicitud de patente US 2007/0037747 y tienen la fórmula: His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-X20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-X30-Pro-X32 donde X6 es Phe o Tyr, X14 es Met, lie o Leu, X20 es Lys; X30 es Gly o está ausente; y X32 es Arg o está ausente.
GLP-1 y análogos de GLP-1 El agonista GLP-1 usado en las composiciones, métodos, y kits de la invención puede ser GLP-1 o un análogo de GLP-1. En ciertas formas de realización, el análogo de GLP-1 es un péptido, el cual puede ser truncado, puede tener una o mas sustituciones de la secuencia de tipo silvestre (v.gr., la secuencia de tipo silvestre humana), o puede tener otras modificaciones químicas. Agonistas GLP-1 también pueden ser compuestos no de péptido, por ejemplo, como se describe en la patente US 6,927,214. Análogos particulares incluyen LY548806, CJC-1131, y Liraglutide.
El análogo de GLP-1 puede ser la forma truncada de GLP- 1. El péptido GLP-1 puede truncarse por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, o mas residuos a partir de su terminal N, su terminal C, o una combinación de las mismas. En ciertas formas de realización, el análogo de GLP-1 truncado es el péptido humano GLP-1 (7-34) , GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), o GLP-1 (7-37) o las formas amidadas terminales C de los mismos.
En otras formas de realización de la invención, formas modificadas de péptidos GLP-1 truncados se usan. Análogos ejemplares se describen en la patente US 5,545,618 y tienen la secuencia de aminoácidos: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys- (Gly) - (Arg) - (Gly) donde (Gly) , (Arg) , y (Gly) están presentes o ausentes dependiendo de la longitud de cadena indicada, con por lo menos una modificación seleccionada a partir del grupo que consiste en (a) sustitución de un aminoácido neutro, Arg, o una forma D de Lys por Lys en la posición 26 y/o 34 y/o un aminoácido neutro, Lys, o una forma D de Arg por Arg en la posición 36; (b) sustitución de un aminoácido resistente a oxidación por Trp en la posición 31; (c) sustitución de acuerdo con por lo menos uno de: Tyr por Val en la posición 16; Lys por Ser en la posición 18; Asp por Glu en la posición 21; Ser por Gly en la posición 22; Arg por Gln en la posición 23; Arg por Ala en la posición 24; y Gln por Lys en la posición 26; (d) una sustitución comprendiendo por lo menos una de un aminoácido neutro pequeño alternativo por Ala en la posición 8; un aminoácido ácido o aminoácido neutro alternativo por Glu en la posición 9; un aminoácido neutro alternativo por Gly en la posición 10; y un aminoácido ácido alternativo por Asp en la posición 15; y (e) sustitución de un aminoácido neutro alternativo o el Asp o forma N-acilada o alquilatada de His por His en la posición 7. Con respecto a las modificaciones (a), (b) , (d) , y (e) , los aminoácidos sustituidos pueden estar en la forma D. Los aminoácidos sustituidos en la posición 7 también pueden ser los aminoácidos N-acilados o N-alquilatados . Análogos ejemplares de GLP-1 incluyen [ D-His7] GLP-1 ( 7-37 ) , [Tyr7] GLP-1 (7- 37), [N-acetil-His7] GLP-1 (7-37) , [N-isopropil-His7] GLP-1 ( 7-37 ) , [D-Ala8]GLP-l (7-37) , [D-Glu9] GLP-1 ( 7-37 ) , [Asp9] GLP-1 ( 7-37 ) , [D-Asp9]GLP-l (7-37) , [D-Phe10] GLP-1 ( 7-37 ) , [Ser22, Arg23, Arg24, Gln26] GLP-1 (7-37), y [Ser8,Gln9,Tyr16,Lys18,Asp21]GLP-l(7-37) .
Otros fragmentos de GLP-1 se describen en la patente US 5,574,008 y tienen la fórmula: F^-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X-Gly-Arg-R2 donde P^ es H2N; H2N-Ser; H2N-Val-Ser; H2N-Asp-Val-Ser; H2N-Ser-Asp-Val-Ser; H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser; H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser; H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser; H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser; H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser o H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser; X es Lys o Arg; y R2 es NH2, OH, Gly-NH2, o Gly-OH.
Otros análogos de GLP-1, descritos en la patente US 5,118,666, incluyen la secuencia His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X, donde X es Lys, Lys-Gly, o Lys-Gly-Arg.
Análogos de GLP-1 también incluyen péptidos de la fórmula: H2N-X-CO-R1, donde Rx es OH, OM, o -NR2R3; M es un catión farmacéuticamente aceptable o grupo alquilo ramificado o no ramificado inferior (v.gr., alquilo C1-6) ; R2 y R3 se seleccionan de manera independiente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y un grupo alquilo ramificado o no ramificado inferior (v.gr., alquilo C1-6) ; X es un péptido comprendiendo la secuencia His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg; NH2 es el grupo amina de la terminal amino de X; y CO es el grupo carbonilo de la terminal carboxi de X; sales de adición de ácido de los mismos; y los derivados protegidos o parcialmente protegidos de los mismos. Estos compuestos pueden tener actividad insulinotrópica excediendo aquella de GLP-1 (1-36) o GLP-1 (1-37).
Otros análogos de GLP-1 se describen en la patente US 5,981,488 y tienen la fórmula: Ri-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala- Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2 donde Rj es His, D-His, desamino-His, 2-amino-His, ß-hidroxi-His, homohistidina, a-fluorometil-His, o a-metil-His ; X es Met, Asp, Lys, Thr, Leu, Asn, Gln, Phe, Val, o Tyr; Y y Z son seleccionados de manera independiente a partir de Glu, Gln, Ala, Thr, Ser, y Gly; y R2 se selecciona a partir de NH2 y Gly-OH (v.gr., provisto que, si Ri es His, X es Val, Y es Glu, Z es Glu, entonces R2 es NH2) .
Otros análogos de GLP-1 se describen en la patente US 5,512,549 y tienen la fórmula: Rj-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (R2) -Gly-Arg-R3 donde Rx es 4-imidazopropionilo (desamino-histidilo) , 4-imidazoa-cetilo, o 4-imidazo-a, a-dimetil-acetilo; R2, el cual se enlaza a la cadena secundaria de Lys (v.gr., a través del grupo amino e) , es acilo no ramificado C6.10 o está ausente; R3 es Gly-OH o NH2; y Xaa es Lys o Arg.
Aun otros análogos de GLP-1 se describen en la patente US 7,084,243. En una forma de realización, el análogo GLP-1 tiene la fórmula: His-X8-Glu-Gly-Xu-X12-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-X23-X24-Ala-X26-X27-Phe-Ile-Ala-X31-Leu-X33-X3<1-X35-X36-R donde X8 es Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xn es Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys, o His; X12 es His, Trp, Phe, o Tyr; X15 es Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu, o Ala; X22 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys, o Cya; X23 es His, Asp, Lys, Glu, o Gln; X24 es Glu, His, Ala, o Lys; X26 es Asp, Lys, Glu, o His; X27 es Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, o Lys; X30 es Ala, Glu, Asp, Ser, o His; X33 es Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly, o Glu; X34 es Glu, Lys, o Asp; X35 es Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, o Glu; X36 es Arg, Glu, o His; R es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro, o Gly-Pro-NH2, o se suprime (v.gr., provisto que el polipeptido no tenga secuencia de GLP-1 (7-3 ) OH or GLP-1 (7-36) -NH2 y provisto que el polipeptido no sea Gly8-GLP-1 (7-37 ) OH, Gly8-GLP-1 (7-36) NH2, Val8-GLP-1 (7-37)OH, Val8-GLP-1 (7-36) NH2, Leu8-GLP-1 ( 7-37 ) OH, Leu8-GLP-1 (7-36)NH2, Ile8-GLP-1 ( 7-37 ) OH, Ile8-GLP-1 (7-36) NH2, Ser8-GLP-l(7-37)OH, Ser8-GLP-1 (7-36)NH2, Thr8-GLP-1 (7-37 ) OH, o Thr8-GLP-1 ( 7- 36) NH2, Alan-GLP-1 (7-37)OH, Alan-GLP-1 (7-36) NH2, Ala16-GLP-1 ( 7- 37) OH, Ala16-GLP-1 (7-36)NH2, Ala27-GLP-1 ( 7-37 ) OH, Ala27-GLP-1 (7- 36) NH2, Ala27-GLP-1 (7-37)OH, Ala27-GLP-1 (7-36) NH2, Ala33-GLP-1 ( 7- 37) OH, o Ala33-GLP-1 (7-36)NH2) .
En otra forma de realización, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos: His-X8-Glu-Gly-Thr-X12-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-X23- Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-Val-Lys-X35-Arg-R donde X8 es Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; X12 es His, Trp, Phe, o Tyr; X16 es Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu, o Ala; X22 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys, o Cya; X23 es His, Asp, Lys, Glu, o Gln; X26 es Asp, Lys, Glu, o His; X30 es Ala, Glu, Asp, Ser, o His; X35 es Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, o Glu; R es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro, Gly-Pro-NH2, o es suprimida, (v.gr., provisto que el polipéptido no tenga la secuencia de GLP-1 ( 7-37 ) OH o GLP-1 (7-36) -NH2 y provisto que el polipéptido no sea Gly8-GLP-1 ( -37 ) OH, Gly8-GLP-1 ( 7-36) NH2, Val8-GLP-1 (7-37)OH, Val8-GLP-1 (7-36) NH2, Leu8-GLP-1 (7-37 ) OH, Leu8-GLP-1(7-36)NH2, Ile8-GLP-1 (7-37)OH, Ile8-GLP-1 ( 7-36) NH2, Ser8-GLP-1 ( 7-37) OH, Ser8-GLP-1 (7-36) NH2, Thr8-GLP-1 ( 7-37 ) OH, Thr8-GLP-1 ( 7-36)NH2, Ala16-GLP(7-37)OH, o Ala16-GLP-1 (7-36) NH2) ) .
En otra forma de realización, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos: His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-X23-Ala-Ala-Lys-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R donde X8 es Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; X22 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys, o Cya; X23 es His, Asp, Lys, Glu, o Gln; X27 es Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, o Lys; X30 es Ala, Glu, Asp, Ser, o His; R es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro, o Gly-Pro-NH2, o es suprimida (v.gr., provisto que el polipéptido no tenga la secuencia de GLP-1(7-37) OH o GLP-1 (7-36) -NH2 y provisto que el polipéptido no sea GLP- 1(7-37) OH o GLP-I (7-36) H2 y provisto que el polipéptido no sea Gly8-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-GLP-1 ( 7-36) NH2, Val8-GLP-1 ( 7-37 ) OH, Val8-GLP-1 (7-36)NH2, Leu8-GLP-1 ( -37 ) OH, Leu8-GLP-1 ( 7-36) NH2, Ile8-GLP-1 (7-37)OH, Ile8-GLP-1 (7-36) NH2, Ser8-GLP-1 ( 7-37 ) OH, Ser8-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-GLP-1 (7-37)OH, Thr8-GLP-1 ( 7-36) NH2, Ala16-GLP-1 (7-37)OH, Ala16-GLP-1 (7-36) NH2, Glu27-GLP-1 ( 7-37 ) OH, o Glu27-GLP-1 ( 7-36) NH2) .
En otra forma de realización, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos: X7-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R donde X7 es L-His, D-His, desamino-His, 2-amino-His, ß-hidroxi-His, homo-His, a-fluorometil-His o a-metil-His; X8 es Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr (v.gr., Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr) ; X22 es Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys, o Cya, y R es -NH2 o Gly (OH) .
En otra forma de realización, el compuesto GLP-1 tiene un aminoácido diferente que alanina en la posición 8 y un aminoácido diferente que glicina en la posición 22. Ejemplos específicos de compuestos GLP-1 incluyen [Glu22] GLP-1 (7-37 ) OH, [Asp2]GLP-l (7-37)OH, [Arg22] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Lys22]GLP-l (7-37)OH, [Cya22]GLP-l (7-37)OH, [Val8, Glu22] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Val8, Asp22] GLP-1 (7-37)OH, [Val8, Arg22] GLP-1 (7-37)OH, [Val8, Lys22] GLP-1 (7-37)OH, [Val8, Cya22] GLP-1 (7-37 ) OH, [ G 1 y8 , G 1 u22 ] GL P - 1 ( 7 - 37 ) OH , [Gly8,Asp22]GLP-l(7-37)OH, [Gly8,Arg22]GLP-l(7-37)OH, [Gly8, Lys22] GLP-1 (7-37)OH, [Gly8, Cya22] GLP-1 (7-37)OH, [Glu22]GLP-1(7-36)NH2, [Asp22] GLP-1 (7-36) NH2, [Arg22] GLP-1 (7-36) NH2, [Lys22]GLP-1(7-36)NH2, [Cya22]GLP-l (7-36)NH2, [Val8, Glu22] GLP-1 ( 7-36) NH2, [Val8, Asp22] GLP-1 (7-36) NH2, [ Va l8 , Ar g22 ] GLP- 1 ( 7 - 36 ) NH2 , [Val8,Lys22] GLP-1 (7-36) NH2 [Val8, Cya22] GLP-1 (7-36) NH2 [Gly8,Glu2 ]GLP-l(7-36)NH2, [Gly8,Asp22]GLP-l(7-36)NH2, [Gly8,Arg2 ]GLP-l(7-36)NH2, [Gly8,Lys22]GLP-l(7-36)NH2 [Gly8, Cya22] GLP-1 (7-36) NH2, [Val8, Lys 3] GL P- 1 ( 7 - 37 ) OH , [Val8, Ala27] GLP-1 (7-37 ) OH, [ Va 18 , G 1 u30 ] GL P - 1 ( 7 - 37 ) OH , [Gly8,Glu30]GLP-l(7-37)OH, [Vals,His35]GLP-l(7-37)OH, [Val8, His37] GLP-1 (7-37) OH, [Val8, Glu22, Lys23] GLP-1 (7-37) OH, [Val8, Glu22,Glu2] GLP-1 (7-37)OH, [Val8, Glu22, Ala27] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Val8, Gly34, Lys35] GLP-1 (7-37) OH, [Val8, His37] GLP-1 (7-37 ) OH, [Gly8, His37] GLP-1 (7-37)OH.
Otros análogos de GLP-1 se describen en la patente US 7,101,843 e incluyen aquellos teniendo la fórmula: X7-X8-Glu-Gly-Thr-X12-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-Gln-Ala-X25-Lys-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-Lys-Gly-Arg-X37 en donde: X7 es L-His, D-His, desamino-His , 2-amino-His , ß-hidroxi-His, homohistidina, a-fluorometil-His, o -metil-His; X8 es Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; X12 es Phe, Trp, o Tyr; X16 es Val, Trp, lie, Leu, Phe, o Tyr; X18 es Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; X19 es Tyr, Trp, o Phe; X20 es Leu, Phe, Tyr, o Trp; X22 es Gly, Glu, Asp, o Lys; X25 es Ala, Val, lie, o Leu; X27 es Glu, lie, o Ala; X30 es Ala o Glu X33 es Val, o lie; y X37 es Gly, His, NH2, o está ausente (v.gr., provisto que el compuesto no tenga la secuencia GLP-1 (7-37 ) OH, GLP-1 (7-36) -NH2, [Gly8]GLP-l(7-37)OH, [Gly8]GLP-l (7-36)NH2, [Val8]GLP-l (7-37) OH, [Val8]GLP-1(7-36)NH2, [Leu8]GLP-l (7-37)OH, [Leu8] GLP-1 (7-36) NH2, [Ile8]GLP- l(7-37)OH, [Ile8]GLP-l (7-36)NH2, [Ser8] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Ser8]GLP- 1 (7-36) NH2, [Thr8 ] GLP-1 (7 -37) OH, [Thr B] GLP -1 (7--36) NH2 [ValE , Tyrl2 ] GLP-•1 (7 -37 ) OH, [Val8 , Tyrl2 ] GLP- 1 (7- 36) NH2 [Val8 , Tyrl6] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Val8 , Tyrl6] GLP--1 (7- 36) NH2 [Val1 Glu22] GLP- 1 ( 7 -37 ) OH, [ Val* , Glu22] GLP- 1 (7- 36 ) NH2 [Gly1 , Glu22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Gly! , Glu22] GLP- 1 (7- 36) H2 [Val1 Asp22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Valf ', Asp22] GLP- 1 (7- 36) H2 [Gly Asp22] GLP- 1 ( 7 -37 ) OH, [Gly{ , Asp22] GLP- 1 (7- 36) NH2 [Val !, Lys22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Val1 , Lys22] GLP- 1 (7- 36 ) NH2 [Gly1 , Lys22] GLP- 1 ( 7 -37 ) OH, [Gly* !, Lys22] GLP- 1 (7- 36) H2 [Leu Glu22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Leu1 !, Glu22] GLP- 1 (7- 36) H2 [ lie1 , Glu22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [lie1 , Glu22] GLP- 1 (7- 36 ) NH2 [Leu" , Asp22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Leu1 , Asp22] GLP- 1 (7- 36) NH2 [lie Asp22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [lie1 Asp22] GLP- 1 (7- 36 ) H2 [Leu1 , Lys22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Leu1 !, Lys22] GLP- 1 (7- 36 ) NH2 [ lie* , Lys22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [lie1 , Lys22] GLP- 1 (7- 36) H2 [ Ser' , Glu22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Ser1 , Glu22] GLP- 1 (7- 36) H2 [Thr1 , Glu22] GLP- 1 ( 7 -37 ) OH, [Thr1 , Glu22] GLP- 1 (7- 36) NH2 [Serf , Asp22 ] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Ser1 , Asp22] GLP- 1 (7- 36) H2 [Thr£ , Asp22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Thr1 , Asp22] GLP- 1 (7- 36 ) NH2 [Ser( ,Lys22] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [ Ser1 , Lys22] GLP- 1 (7- 36) H2 [Thr8, Lys22] GLP-1 (7-37)OH, [Thr8, Lys22] GLP-1 ( 7-36) NH2, [Glu22]GLP-l(7-37)OH, [Glu22]GLP-l (7-36)NH2, [Asp22] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Asp22]GLP-1(7-36)NH2, [Lys22] GLP-1 (7-37) OH, [Lys22] GLP-1 (7-36) NH2, [Val8, Ala27] GLP-1 (7-37)OH, [Val8, Glu22, Ala27] GLP-1 (7-37) OH, [Val8, Glu30] GLP- 1 (7-37)OH, [Val8,Glu30]GLP-l (7-36)NH2, [Gly8, Glu30] GLP-1 (7-37)OH, [Gly8 ', Glu30] GLP- 1 (7 -36) NH2, [Leu8 ', Glu30] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [LeuE 1 , Glu30 ] GLP- 1 (7 -36) NH2, [Ilef Glu30] GLP- 1 ( 7 -3 ) OH, [ Ile8 1 , Glu30 ] GLP- 1 (7 -36) NH2, [Ser8 Glu30] GLP- 1 ( 7 -37 ) OH, [ Ser8 Glu30] GLP- 1 (7 -36) NH2, [Thr8 ', Glu30] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Thr8 Glu30] GLP- 1 (7 -36) NH2, [Val8 ', His37] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Val6 ', His37] GLP- 1 (7 -36) NH2 , [Gly8 His37] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Gly8 His37] GLP- 1 (7 -36) H2 , [Leu8 1 , His37 ] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Leu8 1 , His37 ] GLP- 1 (7 -36 ) NH2 , [lie8 ', His37] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [ Ile8 His37] GLP- 1 (7 -36) NH2 , [Ser8 His37] GLP- 1 (7 -37 ) OH, [Ser8 His37] GLP- 1 (7 -36) NH2, [Thr8 1 , His37 ] GLP- 1 (7 -3 ) OH, [Thr8, His37] GLP-1 (7-36) NH2) .
Otros análogos de GLP-1 descritos en la patente US 7,101,843 tienen la fórmula: X7-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-Tyr-Leu-Glu-X22-Gln-Ala-X25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-X33-Lys-Gly-Arg-X37 en donde: X7 es L-His, D-His, desamino-His , 2-amino-His, ß-hidroxi-His, homohistidina, -f luorometil-His, o a-metil-His ; X8 es Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; X16 es Val, Phe, Tyr, o Trp; X18 es Ser, Tyr, Trp, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; X22 es Gly, Glu, Asp, o Lys; X25 es Ala, Val, lie, o Leu; X33 es Val o lie; y X37 es Gly, NH2, o está ausente (v.gr., provisto que el compuesto GLP-1 no tenga la secuencia de GLP-1 (7-37 ) OH, GLP-1 (7-36) -NH2, [Gly8]GLP-l (7-37)OH, [Gly8] GLP-1 (7-36) NH2, [Val8] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Val8]GLP-l (7-36)NH2, [Leu8]GLP-l (7-37)OH, [Leu8] GLP-1 (7-36) NH2, [Ile8]GLP-l (7-37)OH, [lie8] GLP-1 (7-36) NH2, [Ser8] GLP-1 (7-37) OH, [Ser8] GLP-1 (7-36) NH2, [Thr8] GLP-1 ( 7-37 ) OH, [Thr8]GLP-l (7-36)NH2, [Val8 , Tyrl6] GLP--1 (7-•37 ) OH, [Val8 , Tyrl6] GLP-¦1 (7-¦36) NH2, [Vals , Glu22 GLP- 1 (7- 37 ) OH, [Val8 ,Glu22] GLP- 1(7- 36) NH2, [Glyf ,Glu22 GLP- 1 (7- 37 ) OH, [Gly8 , Glu22] GLP- 1 (7- 36) NH2 , [Val£ , Asp22 GLP- 1 (7- 37 ) OH, [Val8 , Asp22 ] GLP- 1(7- 36) NH2, [GlyJ J, Asp22 ] GLP-¦1 (7--37 ) OH, [Val 3, Lys22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [ValE , Lys22 GLP- 1 (7- 36) H2 [Gly 8,Lys22 ] GLP -1(7 -37 ) OH, [GlyE , Lys22. GLP- 1 (7- 36) NH2, [Leu 8,Glu22 ] GLP -1(7 -37 ) OH, [LeuE , Giu22; GLP- 1 (7- 36) NH2, [lie 8, Glu22 ] GLP -1(7 -37 ) OH, [ Ile£ , Glu22; GLP- 1 (7- 36) NH2, [Leu 8, Asp22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [LeuE , Asp22 ; GLP- 1 (7- 36) NH2, [lie 8, Asp22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [ Ile8 , Asp22] GLP- 1 (7- 36) NH2, [Leu 8, Lys22 ] GLP -1(7 -37 ) OH, [Leu8 , Lys22] GLP- 1(7- 36) NH2, [lie 8,Lys22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [lie8 ,Lys22] GLP- 1 (7- 36 ) H2 , [Ser 8,Glu22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [Ser8 , Glu22] GLP- 1 (7- 36) NH2, [Thr 8,Glu22 ] GLP -1(7 -3 ) OH, [Thr8 , Glu22] GLP- 1 (7- 36) NH2 , [Ser 8, Asp22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [Ser8 Asp22] GLP- 1 (7- 36 ) NH2 , [Thr 8, Asp22 ] GLP -1 (7 -37 ) OH, [Thr8 , Asp22 ] GLP- 1 (7- 36) NH2, [Ser 8,Lys22 ] GLP -1(7 -37 ) OH, [Ser8 , Lys22] GLP- 1(7- 36) NH2, [Thr 8, Lys22 ] GLP -1(7 -3 ) OH, [Thrs, Lys22] GLP-1 (7-36)NH2, [Glu22]GLP-l (7-37)OH, [Glu22]GLP-l (7- 6) NH2, [Asp22]GLP-l (7-37)OH, [Asp22] GLP-1 ( 7-36) NH2, [Lys22] GLP-1 ( 7- 7) OH, [Lys22] GLP-1 (7-36) NH2) .
Análogos de GLP-1 también se describen en la patente US ,238,670 y tienen la estructura: donde cada uno de ??_9 es un residuo de aminoácidos qüe se presenta o no en la naturaleza; Y y Z son residuos de aminoácidos; y una de las sustituciones en los átomos de carbono a de Y y Z pueden ser cada una de manera independiente sustituidas con un grupo sustituyente primario seleccionado a partir del , grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilal-quilo, heterociclilalquilo, arilalquilo y heteroarilalquilo, heterociclilalquilo, dicho sustituyente primario opcionalmente siendo sustituido con un sustituyente secundario seleccionado a partir de un grupo cicloalquilo, heterociclilo, arilo, o heteroarilo; cualquiera de dichos sustituyentes primario o secundario puede además ser sustituido con uno o mas de grupo H, alquilo, cicloalquilo, arilalquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, alquenilo, alquinilo, halo, hidroxi, mercapto, nitro, ciano, amino, acilamino, azido, guanidino, amidino, carboxilo, carboxamido, carboxamido alquilo, formilo, acilo, carboxil alquilo, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, heteorariloxi, heterocicloxi, aciloxi, mercapto, mercapto alquilo, mercaptoari-lo, mercapto acilo, halo, ciano, nitro, azido, amino, guanidino alquilo, guanidino acilo, sulfónico, sulfonamido, alquil sulfonilo, aril sulfonilo o fosfónico; en donde, los sustituyen-tes primario o secundario pueden opcionalmente puentearse por enlaces covalentes para formar uno o mas sistemas cíclicos o heterocíclicos fusionados entre sí; donde, la otra sustitución en el carbono alfa de Y puede sustituirse con H, alquilo C^g, aminoalquilo, hidroxialquilo o carboxialquilo; donde la otra sustitución en el carbono alfa de Z puede sustituirse con hidrógeno, alquilo ( 12, aminoalquilo, hidroxialquilo, o carboxialquilo; A y B están opcionalmente presentes, donde A está presente y A es H, un aminoácido o péptido conteniendo de alrededor de 1-15 residuos de aminoácidos, un grupo R, un grupo R-C(O) (amida), un grupo carbamato RO-C(O), una urea R4R5N-C(0), un sulfonamido R-S02, o R4R5N-S02; donde R se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C^^, cicloalquilo C3.10, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, ariloxialquilo, heteroarilalqui-lo, y heteroariloxialquilo; R4 y R5 se seleccionan cada uno de manera independiente a partir del grupo que consiste en H, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterocililo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo,' arilalquilo, ariloxialquilo, heteroarilalquilo, y heeroariloxialquilo; donde el grupo amino a de X1 se sustituye con H o un grupo alquilo, dicho grupo alquilo puede opcionalmente formar un anillo con A; donde B está presente y B es OR^ NR:R2, o un aminoácido o péptido conteniendo de 1 a 15 residuos de aminoácidos (v.gr., 1 a 10 o 1 a 5) terminando en la terminal C como una carboxamida, carboxamida sustituida, un éster, un ácido carboxilico libre, o un amino-alcohol; donde Rx y R2 son elegidos de manera independiente a partir de H, alquilo C1-12, cicloalquilo C3_10, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterocicloalcoxi, arilo, heteroarilo, arilalqui-lo, ariloxialquilo, heteroarilalquilo o heteroariloxialquilo .
Sustituciones ejemplares sobre los átomos de carbono a de Y y Z incluyen heteroarilarilmetilo, arilheteroarilmetilo, y bifenilmetilo formando residuos de bifenilalanina, cualquiera de los cuales también es opcionalmente sustituido con uno o mas grupos hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilalquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, alquenilo, alquinilo, halo, hidroxi, mercapto, nitro, ciano, amino, acilamino, azido, guanidino, amidino, carboxilo, carboxamido, carboxamido alquilo, formilo, acilo, carboxil alquilo, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, heteroariloxi, heterocicloxi, aciloxi, mercapto, mercapto alquilo, mercapto arilo, mercapto acilo, halo, ciano, nitro, azido, amino, guanidino alquilo, guanidino acilo, sulfónico, sulfonamido, alquil sulfonilo, aril sulfonilo y fosfónico.
Otras formas de realización incluyen polipéptidos aislados donde la otra sustitución en el carbono a de Y se sustituye con H, metilo, o etilo; y donde la otra sustitución en el carbono a de Z se sustituye con H, metilo, o etilo.
Formas de realización adicionales incluyen polipéptidos aislados como se describe anteriormente donde Xx es un residuo de aminoácidos que se presentan o no en la naturaleza en los cuales una de las sustituciones en el carbono es un sustituyente primario seleccionado a partir del grupo que consiste en heterociclilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo y arilalqui-lo, dicho sustituyente primario opcionalmente siendo sustituido con sustituyente secundario seleccionado a partir de heteroarilo o heterociclilo; y en el cual la otra sustitución en el carbono a es H o alquilo; X2 es un residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual una de las sustituciones en el carbono a es un alquilo o cicloalquilo donde el grupo alquilo puede opcionalmente formar un anillo con el nitrógeno de X2; y donde la otra sustitución en el carbono OÍ es H o alquilo; X3 es un residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual una de las sustituciones en el carbono a es carboxial-quilo, bis-carboxialquilo, sulfonilalquilo, heteroalquilo, o mercaptoalquilo; y donde la otra sustitución en el carbono a es hidrógeno o alquilo; X4 es un residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual el carbono a no es sustituido, o en el cual una de las sustituciones en el carbono a es aminoalquilo, carboxialquilo, heteroarilalquilo, o heteroci-clilalquilo; X5 es un residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual una de las sustituciones en el carbono a. es un alquilo o hidroxialquilo, y en el cual la otra sustitución en el carbono a es hidrógeno o alquilo; X6 es el residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual una de la sustituciones en el carbono a es un grupo alquilo C^^, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilalqui-lo, heterociclilalquilo, arilalquilo, o heteroarilalquilo, y la otra sustitución en el carbono es H o alquilo; X7 es un residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual una de las sustituciones en el carbono es un grupo hidroxial-quilo; X8 es un residuo de aminoácidos que se presenta en la naturaleza en el cual una de las sustituciones en el carbono a es alquilo 01-12, hidroxialquilo, heteroarilalquilo, o carboxamidoal-quilo, y la otra sustitución en el carbono a es H o alquilo; X9 es un residuo de aminoácidos que se presenta o no en la naturaleza en el cual una de las sustituciones en el carbono a es carboxialquilo, bis-carboxialquilo, carboxiarilo, sulfonilalqui-lo, carboxilamidoalquilo, o heteroarilalquilo; y donde Z es H, un aminoácido o péptido conteniendo de alrededor de 1 a alrededor de 5 residuos de aminoácidos, un grupo R, un grupo amida R-C(O), un grupo carbamato RO-C(O), una urea R4R5N-C(0), un sulfonamido R-S02 o R4R5N-S02 .
En ciertas formas de realización, X: es His, D-His, N-Metil-His, D-N-Metil-His, 4-Tiazolil-Ala, o D-4-Tiazolil-Ala; X2 es Ala, D-Ala, Pro, Gly, D-Ser, D-Asn, Nma, D-Nma, 4-TioPro, 4-Hyp, L-2-Pip, L-2-Azt, Aib, S- o R-Iva y Acc3; X3 es Glu, N-Metil-Glu, Asp, D-Asp, His, Gla, Adp, Cys, o 4- Tiazolil-Ala ; X4 es Gly, His, Lys, o Asp; X5 es Thr, D-Thr, Nle, Met, Nva, o L-Aoc; X6 es Phe, Tyr, Tyr(Bzl), Tyr(3-N02), Nle, Trp, Phe(penta-fluoro) , D-Phe (penta-fluoro) , Phe (2-fluoro) , Phe (3-fluoro) , Phe (4-fluoro) , Phe (2, 3-di-fluoro) , Phe (3, 4-di-fluoro) , Phe (3,5-di-fluoro), Phe (2, 6-di-fluoro) , Phe (3, 4, 5- tri-fluoro) , Phe (2-iodo), Phe(2-0H), Phe(2-0Me), Phe(3-0Me), Phe ( 3-ciano) , Phe(2-cloro), Phe(2-NH2), Phe(3-NH2), Phe(4-NH2), Phe(4-N02), Phe(4-Me) , Phe(4-alil), Phe (n-butil ) , Phe (4-ciclohexil) , Phe(4-ciclohexiloxi) , Phe (4-feniloxi) , 2-Nal, 2-piridil-Ala, 4-tiazolil-Ala, 2-Thi, -Me-Phe, D-a-Me-Phe, -Et-Phe, D-a-Et-Phe, a-Me-Phe (2-fluoro) , D-a-Me-Phe (2-fluoro) , a-Me-Phe (2, 3-di-fluo'ro), D-a- e-Phe (2, 3-di-fluoro) , a-Me-Phe (2, 6-di-fluoro) , D-a-Me-Phe ( 2 , 6-di-fluoro) , a-Me-Phe (penta-fluoro) y D-a-Me-Phe (penta-fluoro) ; X7 es Thr, D-Thr, Ser, o hSer; X8 es Ser, hSer, His, Asn, o a-Me-Ser; y X9 es Asp, Glu, Gla, Adp, Asn, o His.
Formas de realización adicionales incluyen aquellas donde Y es Bip, D-Bip, L-Bip (2-Me) , D-Bip(2-Me), L-Bip (2 ' -Me) , L-Bip(2-Et), D-Bip(2-Et), L-Bip(3-Et), L- Bip(4-Et), L-Bip(2-n-propil), L-Bip (2-n-propil, -OMe) , L-Bip (2-n-propil, 2 ' -Me) , L-Bip(3-Me), L-Bip(4-Me), L-Bip (2 , 3-di-Me) , L-Bip (2, 4-di-Me) , L-Bip (2, 6-di-Me) , L-Bip (2, 4-di-Et) , L-Bip (2-Me, 2' -Me), L-Bip (2-Et, 2 '-Me), L- Bip (2-Et, 2 '-Et) , L-Bip (2-Me, -OMe) , L-Bip (2-Et, -OMe) , D-Bip (2-Et, -OMe) , L-Bip (3-OMe) , L-Bip ( 4-OMe) , L-Bip (2, 4, 6-tri-Me) , L-Bip (2, 3-di-OMe) , L-Bip (2, -di-OMe) , L-Bip (2 , 5-di-OMe) , L-Bip (3, 4-di-OMe) , L-Bip (2-Et, , 5-di-OMe) , L-Bip ( 3, 4-Metileno-di-oxi), L-Bip (2-Et, 4, 5-Metileno-di-oxi) , L-Bip (2-CH2OH, 4-OMe) , L-Bip(2-Ac), L-Bip (3-NH-Ac) , L-Bip (4-NH-Ac) , L-Bip ( 2 , 3-di-cloro) , L-Bip (2, -di-cloro) , L-Bip (2, 5-di-cloro) , L- Bip (3, -di-cloro) , L-Bip (4-fluoro) , L-Bip ( 3, -di-fluoro) , L-Bip (2 , 5-di-fluoro) , L-Bip (3-n-propil) , L-Bip (4-n-propil) , L-Bip (2-iso-propil ) , L-Bip (3-iso-propil), L-Bip (4-iso-propil) , L-Bip ( -ter-butil ) , L-Bip(3-fenil), L-Bip (2-cloro) , L-Bip (3-cloro) , L-Bip (2-fluoro) , L-Bip (3-fluoro), L-Bip (2-CF3) , L-Bip ( 3-CF3) , L-Bip (4-CF3) , L-Bip ( 3-N02) , L-Bip (3-OCF3) , L-Bip (4-OCF3) , L-Bip (2-OEt) , L-Bip (3-OEt) , L-Bip (4-OEt), L-Bip (4-S e) , L-Bip (2-OH) , L-Bip (3-OH), L-Bip(4-OH), L- Bip(2-CH2-COOH) , L-Bip (3-CH2-COOH) , L-Bip ( 4-CH2-COOH) , L-Bip (2-CH2-NH2) , L-Bip (3-CH2-NH2) , L-Bip ( 4-CH2-NH2) , L-Bip (2-CH2-OH) , L-Bip (3-CH2-OH), L-Bip (4-CH2-OH) , L-Phe [ 4- ( 1-propargil ) ] , L-Phe [4- (1-propenil)], L-Phe [4-n-butil] , L-Phe [4-ciclohexil] , Phe (4-feniloxi) , L-Phe (penta-fluoro) , L-2- ( 9 , 10-dihidrofenantrenil ) - Ala, 4- (2-benzo (b) furan) -Phe, 4- ( 4-Dibenzofuran) -Phe, 4-(4-fenoxatin) -Phe, 4- (2-Benzo (b) tiofeno) -Phe, 4- (3-tiofeno) -Phe, 4-(3-Quinolina) -Phe, 4- (2-naftil) -Phe, 4- ( 1-Naftil ) -Phe, 4-(4-(3,5-dimetilisoxazola) ) -Phe, 4- (2, 4-dimetoxipirimidina) -Phe, homoPhe, Tyr(Bzl), Phe (3, 4-di-cloro) , Phe(4-Iodo), 2-Naftil-Ala, L-a-Me- Bip, o D-a-Me-Bip; Z es L-Bip, D-Bip, L-Bip(2-Me), D-Bip(2-Me), L-Bip (2 * -Me) , L-Bip(2-Et), D-Bip(2-Et), L-Bip(3- Me), L-Bip(4-Me), L-Bip (3-OMe) , L-Bip (4-OMe) , L-Bip(4-Et), L-Bip(2-n-propil, 2 ' -Me) , L-Bip (2, 4-di-Me) , L-Bip (2-Me, 2 ' -Me) , L-Bip (2-Me, 4-OMe), L-Bip (2-Et, 4-OMe) , D-Bip (2-Et , 4-OMe) , L-Bip ( 2 , 6-di-Me) , L- Bip (2, 4, 6-tri-Me) , L-Bip (2, 3, 4, 5, -tetra-Me) , L-Bip (3, 4-di-OMe) , L-Bip (2, 5-di-OMe) , L-Bip (3 , 4-Metileno-di-oxi) , L-Bip ( 3-NH-Ac) , L-Bip (2-iso-propil) , L-Bip (4-iso-propil) , L-Bip (2-Fenil ) , L-Bip (4-Fenil) , L-Bip (2-fluoro) , L-Bip (4-CF3) , L-Bip (4-OCF3) , L-Bip (2-OEt), L-Bip (4-OEt) , L-Bip (4-SMe) , L-Bip (2-CH2-COOH) , D- Bip (2-CH2-COOH) , L-Bip (21 -CH2-COOH) , L-Bip (3-CH2-COOH) , L-Bip (4-CH2-COOH) , L-Bip (2-CH2-NH2) , L-Bip ( 3-CH2-NH2) , L- Bip (4-CH2-NH2) , L-Bip (2-CH2-OH) , L-Bip (3-CH2-OH) , L-Bip ( 4-CH2-OH) , L-Phe ( 3-Fenil ) , L-Phe [4-n-Butil] , L-Phe [4-ciclohexil] , Phe ( 4 -Feniloxi ) , L-Phe (penta-fluoro) , L-2- (9, 10-Dihidrofenantrenil ) -Ala, 4- (3-Pyridil) -Phe, 4- (2-Naftil) -Phe, 4- (1-naftil) -Phe, 2-naftil-Ala, 2-fluorenil-Ala, L-a-Me-Bip, D- -Me-Bip, L-Phe ( 4-N02) , o L-Phe(4-Iodo) ; A es H, acetilo, ß-Ala, Ahx, Gly, Asp, Glu, Phe, Lys, Nva, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, caprolactama, Bip, Ser(Bzl), 3-piridil-Ala, Phe(4-Me), Phe (penta-fluoro) , 4-metilbencilo, 4-fluorobencilo, n-propilo, n-hexilo, ciclohexilmetilo, 6-hidroxi-pentilo, 2-tienilmetilo, 3-tienilmetilo, penta-fluorobencilo, 2-naftilmetilo, 4-bifenilmetilo, 9-antracenilmetilo, bencilo, (S)-(2-amino-3-fenil ) propilo, metilo, 2-aminoetilo, o (S) -2-aminopro-pilo; y B es OH, NH2, Trp-NH2, 2-naftil-Ala-NH2, Phe(penta-fluoro) -NH2, Ser (Bzl) -NH2, Phe ( 4-N02) -NH2, 3-piridil-Ala-NH2, Nva-NH2, LyS-NH2, Asp-NH2, Ser-NH2, His-NH2, Tyr-NH2, Phe-NH2, L-Bip-NH2, D-Ser-NH2, Gly-OH, ß-Ala-OH, GABA-OH, o APA-OH.
En ciertas formas de realización, cuando A no está presente, y X1 es un grupo R, un grupo R-C(O) (amida), un grupo carbamato RO-C(O), una urea R4R5N-C(0), un sulfonamido R-S02, o un R4R5N-S02; en donde R es H, alquilo C^^, cicloalquilo C3.10, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, ariloxialquilo, heteroarilalquilo, heteroariloxialquilo, o heteroarilalcoxialquilo; y donde R4 y R5 son cada uno de manera independiente H, alquilo C1-12, cicloalquilo C3.10, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, ariloxialquilo, heteroarilalqui-lo, o heteroariloxialquilo .
En ciertas formas de realización, cuando B no está presente y Z es OF^, NR^ o un amino-alcohol; donde y R2 son de manera independiente H, alquilo C1_12, cicloalquilo C3.10, cicloalquilalquilo, heterociclo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, ariloxialquilo, heteroarilalquilo, o heteroariloxialquilo. En ciertas formas de realización, Xj (donde sea aplicable) , X2 y X3 son residuos de aminoácidos N-H o N-alquilata-dos (v.gr., N-metilados ) . El polipéptido puede ser un 10-mero o 15-mero y capaz de ligarse a y activar el receptor de GLP-1.
Abreviaciones Nal = naftilalanina pGly = pentilglicina t-BuG = t-butilglicina TPro = trioprolina HPro = homoprolina NmA = N-metilalanina Cya = ácido cisteico Thi = ß-2-Tienil-Ala hSer = homoserina Aib = ácido a-aminoisobutírico Bip = bifenilalanina Nle = norleucina Ahx = ácido 2-aminohexanoico Nva = norvalina Formas modificadas de análogos de GLP-1 Cualquiera de los péptidos análogos de GLP-1 descritos en la presente puede modificarse (v.gr., como se describe en la presente o se conoce en la materia) . Como se describe en la patente US 6,924,264, el polipéptido puede enlazarse a un polímero para incrementar su peso molecular. Polímeros ejemplares incluyen polímeros de. polietileno glicol, poli (aminoácidos ) , albúmina, gelatina, succinil-gelatina (hidroxipropil) -metacrila-mida, ácidos grasos, polisacáridos, lípido aminoácidos, y dextrano.
En un caso, el polipéptido se modifica por adición de albúmina (v.gr., albúmina humana), o un análogo o fragmento de la misma, o la porción Fe de una inmunoglobulina . Tal un enfoque se describe, por ejemplo, en la patente US 7,271,149.
En un ejemplo, el polipéptido se modifica por adición de un sustituyente lipófilo, como se describe en la publicación PCT WO 98/08871. El sustituyente lipófilo puede incluir un esqueleto de ciclopentanofenantreno parcialmente o completamente hidrogenado, un grupo alquilo de cadena recta o ramificada; el grupo acilo de un ácido graso de cadena recta o ramificado (v.gr., un grupo incluyendo CH3(CH2)nCO- o HOOC (CH2) mC0-, donde n o m es 4 a 38); un grupo acilo de un ácido , ?-dicarboxílico de alcano de cadena recta o ramificado; CH3 (CH2) p ( (CH2) qCOOH) CHNH-CO(CH2)2CO-, donde p y q son enteros y p+q es 8 a 33; CH3 (CH2) rCO-NHCH (COOH) (CH2) 2C0-, donde r es 10 a 24; CH3(CH2)sCO-NHCH ( (CH2) 2COOH) CO- , donde s es 8 a 24; COOH (CH2) tCO-, donde t es 8 a 24; -NHCH(COOH) (CH2) 4NH-CO (CH2) UCH3, donde u es 8 a 18; -NHCH(COOH) (CH2)4NH- COCH ( (CH2) 2COOH) NH-CO (CH2) WCH3, donde w es 10 a 16; - NHCH(COOH) (CH2) 4NH-CO (CH2) 2CH (COOH) NH-CO (CH2) XCH3, donde x es 10 a 16; o -NHCH(COOH) (CH2) 4NH-CO (CH2) 2CH (COOH) NHCO (CH2) yCH3, donde y es 1 a 22.
En otras formas de realización, el péptido GLP-1 se modifica por adición de un grupo químicamente reactivo tal como un grupo maleimida, como se describe en la patente US 6,593,295. Estos grupos pueden reaccionar con funcionalidades reactivas disponibles en componentes sanguíneos para formar enlaces covalentes y pueden extender la media vida in vivo terapéutica efectiva de los péptidos insulinotrópicos modificados. Para formar enlaces covalentes con el grupo funcional en una proteína, se puede usar como un grupo químicamente reactivo una amplia variedad de grupos carboxilo activos (v.gr., ésteres) donde la fracción hidroxilo es fisiológicamente aceptable en los niveles requeridos para modificar al péptido. Agentes particulares incluyen N-hidroxisuccinimida (NHS) , N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-NHS) , maleimida-benzoil-succinimida (MBS) , éster de gamma-maleimido-butiriloxi succinimida (GMBS) , ácido maleimido propiónico (MPA) , ácido maleimido hexanoico (MHA) , y ácido maleimido undecanoico (MUA) .
Aminas primarias son los objetivos principales para ésteres de NHS. Grupos a-amina accesibles presentes en las terminales N de proteínas y la e-amina de lisina reaccionan con ésteres de NHS. Un enlace de amida se forma cuando la reacción de conjugación de éster de NHS reacciona con aminas primarias liberando N-hidroxisuccinimida . Estos grupos reactivos conteniendo succinimida son referidos en la presente como grupos succini-midilo. En ciertas formas de realización de la invención, el grupo funcional sobre la proteína será un grupo tiol y el grupo químicamente reactivo será un grupo conteniendo maleimido tal como gamma-maleimido-butirilamida (GMBA o MPA) . Tales grupos conteniendo maleimida son referidos en la presente como grupos maleimido .
El grupo maleimido es mas selectivo para grupos sulfhidrilo en péptidos cuando el pH de la mezcla de reacción es 6.5-7.4. A pH 7.0, la tasa de reacción de grupos maleimido con sulfhidrilos (v.gr., grupos tiol sobre proteínas tales como albúmina de suero o IgG) es 1, 000 veces mas rápido que con aminas. Por ende, un eslabón de tioéter estable entre el grupo maleimido y el sulfhidrilo se forma, el cual no puede disociarse bajo condiciones fisiológicas.
Vectores de péptido Los compuestos de la invención pueden presentar cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente, por ejemplo, cualquiera de los péptidos descritos en la Tabla 1 (v.gr., Angiopep-1 o Angiopep-2), o un fragmento o análogo de los mismos. En ciertas formas de realización, el polipéptido puede tener por lo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o aun 100% de identidad con un polipéptido descrito en la presente. El polipéptido puede tener una o mas (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15) sustituciones con relación a una de la secuencias descritas en la presente. Otras modificaciones se describen en mayor detalle mas adelante.
La invención también presenta fragmentos de estos polipéptidos (v.gr., un fragmento funcional). En ciertas formas de realización, los fragmentos son capaces de ser eficientemente transportados a o acumularse en un tipo de célula particular (v.gr., hígado, ojo, pulmón, riñon, o bazo) o se transportan de manera eficiente a través de la BBB. Truncaciones del polipéptido pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o mas aminoácidos a partir de ya sea la terminal N del polipéptido, la terminal C del polipéptido, o una combinación de los mismos. Otros fragmentos incluyen secuencias donde porciones internas del polipéptido se suprimen.
Polipéptidos adicionales pueden identificarse mediante usar uno de los ensayos o métodos descritos en la presente. Por ejemplo, un polipéptido candidato puede producirse por síntesis de péptidos convencional, conjugarse con paclitaxel y administrarse a un animal de laboratorio. Un conjugado de polipéptido biológicamente activo puede identificarse, por ejemplo, con base en su habilidad para incrementar la supervivencia de un animal inyectado con células de tumor y tratado como el conjugado según se compara con un control el cual no ha sido tratado con un conjugado (v.gr., tratado con el agente no conjugado). Por ejemplo, un polipéptido biológicamente activo puede identificarse con base en su ubicación en la parénquima en un ensayo de perfusión cerebral in situ.
Ensayos para determinar la acumulación en otros tejidos pueden llevarse a cabo también. Conjugados marcados de un polipéptido pueden administrarse a un animal, y acumulación en diferentes órganos puede medirse. Por ejemplo, un polipéptido conjugado a un marcador detectable (v.gr., un marcador de espectroscopia de fluorescencia cercano a IR tal como Cy5.5) permite visualización in vivo. Tal un polipéptido puede ser administrado a un animal, y la presencia del polipéptido en un órgano puede detectarse, por ende permitiendo la determinación de la tasa y la cantidad de acumulación del polipéptido en el órgano deseado. En otras formas de realización, el polipéptido puede ser marcado con un isótopo radioactivo (v.gr., 125I) . El polipéptido entonces se administra a un animal. Después de un periodo de tiempo, el animal se sacrifica y los órganos se extraen. La cantidad de radioisótopo en cada órgano puede entonces medirse usando cualquier medio conocido en la materia. Mediante comparar la cantidad de un polipéptido candidato marcado en un órgano particular con relación a la cantidad de un polipéptido de control marcado, la habilidad del polipéptido candidato para obtener acceso y acumularse en un tejido particular puede evaluarse. Controles negativos apropiados incluyen cualquier péptido o polipéptido conocido por no ser transportado de manera eficiente hacia un tipo de célula particular (v.gr., un péptido relacionado a Angiopep que no cruza la BBB, o cualquier otro péptido) .
Secuencias adicionales se describen en la patente US 5,807,980 (v.gr., la SEQ ID NO:102 presente), 5,780,265 (v.gr., la SEQ ID NO.103), 5,118, 668 (v.gr., la SEQ ID NO:105). Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un análogo de aprotinina atgagccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag; SEQ ID NO: 6; no. de acceso Genbank X04666) . Otros ejemplos de análogos de aprotinina pueden encontrarse mediante llevar a cabo un BLAST de proteínas (Genbank: www.ncbi.nlm.nih.-gov/BLAST/) usando la secuencia de aprotinina sintética (o porción de la misma) divulgada en la solicitud internacional PCT/CA2004/000011. Análogos de aprotinina ejemplares se encuentran bajo los nos. de acceso CAA37967 (GI:58005) y 1405218C (GI.3604747) .
Polipéptidos modificados Los vectores de péptido y agonistas GLP-1 de péptido usados en la invención pueden tener una secuencia de aminoácidos modificada. En ciertas formas de realización, la modificación no destruye significativamente una actividad biológica deseada (v.gr., la capacidad para cruzar la BBB o actividad agonista GLP-1) . La modificación puede reducir (v.gr., por al menos 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, o 95%), puede no tener efecto, o puede incrementar (v.gr., por al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, o 1,000%) la actividad biológica del polipéptido original. El polipéptido modificado puede tener o puede optimizar una característica de un polipéptido, tal como estabilidad in vivo, biodisponibilidad, toxicidad, actividad inmunológica, identidad inmunológica, y propiedades de conjugación.
Modificaciones incluyen aquellas por procesos naturales, tales como procesamiento post-translacional, o por técnicas de modificación química conocidas en la materia. Modificaciones pueden ocurrir en cualquier punto en un polipéptido incluyendo al esqueleto de polipéptido, las cadenas secundarias de aminoácidos y las terminales amino o carboxi. El mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o variables grados en varios sitios en un polipéptido dado, y un polipéptido puede contener mas de un tipo de modificación. Polipéptidos pueden ramificarse como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Polipéptidos cíclicos, ramificados, y ramificados cíclicos pueden resultar de procesos naturales post-transla-ción o pueden hacerse de manera sintética. Otras modificaciones incluyen pegilación, acetilación, acilación, adición de grupo acetomidometilo (Acm) , ADP-ribosilación, alquilación, amidación, biotinilación, carbamoilación, carboxietilación, esterificación, unión covalente a fiavina, unión covalente a una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de fármaco, unión covalente de un marcador (v.gr., fluorescente o radioactivo) , unión covalente de un lipido o derivado de lipidos, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla GPI, hidroxila-ción, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por transferencia de ADN de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación .
Un polipéptido modificado de la invención puede además incluir inserción, supresión, o sustitución de aminoácidos, ya sea conservadora o no conservadora (v.gr., D-aminoácidos, desaminoácidos) en la secuencia de polipéptidos (v.gr., donde tales cambios no alteran sustancialmente la actividad biológica del polipéptido) . En particular, la adición de uno o mas residuos de cisteína a las terminales amino o carboxi de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente puede facilitar conjugación de estos polipéptidos mediante v.gr., enlace de disulfuro. Por ejemplo, Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), o Angiopep-7 (SEQ ID NO: 112) pueden modificarse para incluir un solo residuo de cisteina en la terminal amino (SEQ ID NOs : 71, 113, y 115, respectivamente) o un solo residuo de cisteina en la terminal carboxi (SEQ ID NOs: 72, 114, y 116, respectivamente) . Sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras (es decir, en donde un residuo se reemplaza por otro del mismo tipo general o grupo) o no conservadoras (es decir, donde un residuo se reemplaza por un aminoácido de otro tipo) . Además, un aminoácido no tal como se presenta en la naturaleza puede ser sustituido por un aminoácido tal como se presenta en la naturaleza (es decir, sustitución de aminoácido conservadora no tal como se presenta en la naturaleza o una sustitución de aminoácido no conservadora no tal como se presenta en la naturaleza) .
Polipéptidos hechos de manera sintética pueden incluir sustituciones de aminoácidos no codificados naturalmente por ADN (v.gr., aminoácido no tal como aparece en la naturaleza o no natural) . Ejemplos de aminoácidos no tal como aparecen en la naturaleza incluyen D-aminoácidos, un aminoácido teniendo un grupo acetilaminometilo unido a un átomo de azufre de una cisteina, un aminoácido pegilado, los aminoácidos omega de la fórmula NH2 (CH2) nC00H donde n es 2-6, aminoácidos no polares neutros, tales como sarcosina, t-butil alanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina, y norleucina. Fenilglicina puede sustituirse por Trp, Tyr, o Phe citrulina y sulfóxido de metionina son no polares neutros, ácido cisteico es ácido, y ornitina es básica. Prolina puede sustituirse con hidroxiprolina y retener las propiedades que confieren conformación.
Análogos pueden generarse por mutagénesis de sustitución y retener la actividad biológica del polipéptido original. Ejemplos de sustituciones identificadas como "sustituciones conservadoras" se muestran en la Tabla 2. Si tales sustituciones resultan en un cambio no deseado, entonces otro tipo de sustituciones, denominadas "sustituciones ejemplares" en la Tabla 3, o como se describe adicionalmente en la presente en referencia a clases de aminoácidos, se introducen y los productos se clasifican .
Modificaciones sustanciales en función o identidad inmunológica se logran mediante seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena secundaria. Residuos que aparecen en la naturaleza se dividen en grupos con base en propiedades de cadena secundaria comunes: (1) hidrófobos: norleucina, metionina (Met) , alanina (Ala) , valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (lie), histidina (His) , triptofano (Trp) , tirosina (Tyr) , fenilalanina (Phe) , (2) hidrófilos neutros : cisteina (Cys) , serina (Ser) , treonina (Thr) , (3) ácidos/cargados negativamente: ácido aspártico (Asp) , ácido glutámico (Glu) , (4) básicos: asparagina (Asn) , glutamina (Gln) , histidina (His) , lisina (Lys) , arginina (Arg) , (5) residuos que tienen influencia en orientación de cadena: glicina (Gly) , prolina (Pro), (6) aromáticos: triptofano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), histidina (His), (7) polares: Ser, Thr, Asn, Gln, (8) básicos cargados positivamente: Arg, Lys, His; y (9) cargados: Asp, Glu, Arg, Lys, His.
Otras sustituciones conservadoras de aminoácidos se listan en la Tabla 2.
Tabla 2 : Sustituciones de aminoácidos Derivados de polipéptido y peptidomimeticos Además de polipéptidos consistiendo de aminoácidos tales como aparecen en la naturaleza, peptidomiméticos o análogos de polipéptidos también son abarcados por la presente invención y pueden formar los vectores de péptido o agonistas GLP-1 usados en los compuestos de la invención. Análogos de polipéptido son comúnmente usados en la industria farmacéutica como fármacos no de péptido con propiedades análogas a aquellas del polipéptido de plantilla. Los compuestos no de péptido son denominados "miméti-cos de polipéptido" o peptidomiméticos (Fauchere et al., Infect. Immun. 54:283-287, 1986 y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229-1239, 1987). Miméticos de péptido que están relacionados estructuralmente a péptidos o polipéptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o acrecentado. Generalmente, peptidomi-métidos son estructuralmente similares al polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) tal como polipéptidos de ligadura a receptor que aparecen en la naturaleza, pero teniendo uno o mas enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por enlaces tales como -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -CH2SO-, CH(OH)CH2-, COCH2-, etc., por métodos bien conocidos en la materia (Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1(3) :267, 1983; Spatola et al. Life Sci. 38:1243-1249, 1986; Hudson et al.
Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979; y Weinstein. B., 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein eds, Marcel Dekker, New York) . Tales miméticos de polipéptido pueden tener ventajas significativas sobre polipéptidos tales como aparecen en la naturaleza incluyen-do producción mas económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas acrecentadas (v.gr., media vida, absorción, potencia, eficiencia), antigenicidad reducida y otras.
Aunque los vectores de péptido descritos en la presente pueden cruzar de manera eficiente la BBB o apuntar a tipos de células particulares (v.gr., aquellos descritos en la presente), su efectividad puede reducirse por la presencia de proteasas. De manera similar, la efectividad de agonistas GLP-1 usados en la invención pueden reducirse de manera similar. Proteasas de suero tienen requerimientos de sustrato específicos, incluyendo L-aminoácidos y enlaces de péptido para disociación. Mas aun, exopeptidasas , las cuales representan el componente mas prominente de la actividad de proteasa en suero, usualmente actúan sobre el primer enlace de péptido del polipéptido y requieren una terminal N libre (Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993). Los polipéptidos modificados retienen las características estructurales de los polipéptidos de L-aminoácido originales, pero son ventajosamente no fácilmente susceptibles a disociación por proteasa y/o exopeptidasas.
Sustitución sistemática de uno o mas aminoácidos de una secuencia de consenso con D-aminoácido del mismo tipo (v.gr., un enantiómero; D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar polipéptidos mas estables. Por ende, un derivado de polipéptido o peptidomimético de la presente invención puede ser polipéptidos todos L, todos D o mixtos D, L. La presencia de un D-aminoácido terminal N o terminal C incrementa la estabilidad in vivo de un polipéptido debido a que las peptidasas no pueden utilizar un D-aminoácido como un sustrato (Po ell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993). Polipéptidos inversos D son polipépti-dos conteniendo D-aminoácidos, arreglados en una secuencia en reversa con relación a un polipéptido conteniendo L-aminoácidos. Por ende, el residuo terminal C de un polipéptido de L-aminoácidos se vuelve terminal N para el polipéptido de D-aminoácidos, y asi sucesivamente. Polipéptidos inversos D retienen la misma conformación terciaria y por lo tanto la misma actividad, como los polipéptidos de L-aminoácidos, pero son mas estables a degradación enzimática in vitro e in vivo, y por ende tienen mayor eficacia terapéutica que el polipéptido original (Brady y Dodson, Nature 368:692-693, 1994; Jameson et al., Wa ure 368:744-746, 1994). Además de polipéptidos inversos D, polipéptidos restringidos comprendiendo una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse por métodos bien conocidos en la materia (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992). Por ejemplo, polipéptidos restringidos pueden generarse mediante añadir residuos de cisteina capaces de formar puentes de disulfuro y, por ende, resultando en un polipéptido cíclico. Polipéptidos cíclicos no tienen terminales N o C libres. De manera acorde, no son susceptibles a proteólisis por exopeptidasas, aunque son, por supuesto, susceptibles a endopeptidasas , las cuales no disocian en terminales de péptido. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos con D-aminoácidos terminales N o terminales C y de los polipéptidos cíclicos son usualmente idénticas a las secuencias de los polipéptidos a los cuales corresponden, excepto por la presencia de residuos de D-aminoácidos terminales N o terminales C, o su estructura circular, respectivamente.
Un derivado cíclico conteniendo un enlace de disulfuro intramolecular puede prepararse or síntesis en fase sólida convencional mientras se incorporan residuos de cisteína u homocisteína S-protegidos adecuados en las posiciones seleccionadas para ciclización tales como las terminales amino y cárboxi (Sah et al., J. Pharm. Pharmacol. 48:197, 1996). Siguiendo a terminación del ensamblaje de cadena, ciclización puede llevarse a cabo ya sea (1) por remoción selectiva del grupo S-protector con una oxidación sobre soporte consecuente de las correspondientes dos funciones-SH libres, para formar enlaces S-S, seguido por remoción convencional del producto a partir del soporte y procedimiento de purificación apropiado o (2) por remoción del polipéptido a partir del soporte junto con desprotección de cadena secundaria completa, seguida por oxidación de las funciones SH libres en solución acuosa altamente diluida.
El derivado cíclico conteniendo un enlace de amida intramolecular puede prepararse por síntesis de fase sólida convencional mientras se incorporan derivados de aminoácidos protegidos de cadena secundaria amino y carboxilo adecuados, en la posición seleccionada para ciclización. Los derivados cíclicos conteniendo enlaces alquilo -S- intramolecular puede prepararse por química en fase sólido convencional mientras se incorpora un residuo de aminoácidos con una cadena secundaria amino-protegida, y un residuo de cisteína u homocisteína S-protegido adecuado en la posición seleccionada para ciclización.
Otro enfoque efectivo para conferir resistencia a peptidasas actuando sobre los residuos terminal N o terminal C de un polipéptido es añadir grupos químicos en las terminales de polipéptido, tal que el polipéptido modificado no sea mas un sustrato para la peptidasa. Una tal modificación química es glicosilación de los polipéptidos en cualquiera o ambos términos. Ciertas modificaciones químicas, en particular glicosilación terminal N, se han mostrado incrementando la estabilidad de polipéptidos en suero humano (Po ell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993) . Otras modificaciones químicas que acrecientan estabilidad en suero incluyen, pero no se limitan a, la adición de un grupo alquilo terminal N, consistiendo de un alquilo inferior de uno a veinte carbonos, tal como un grupo acetilo, y/o la adición de una amida terminal C o grupo amida sustituido. En particular, la presente invención incluye polipéptidos modificados consistiendo de polipéptidos portando grupo acetilo terminal N y/o grupo amida terminal C.
También incluidos por la presente invención son otros tipos de derivados de polipéptido conteniendo fracciones químicas adicionales que normalmente no son parte del polipéptido, provisto que el derivado retenga la actividad funcional deseada del polipéptido. Ejemplos de tales derivados incluyen (1) derivados de N-acilo de la terminal amino o de otro grupo amino libre, donde el grupo acilo puede ser un grupo alcanoilo (v.gr., acetilo, hexanoilo, octanoilo) , un grupo aroilo (v.gr., benzoilo) o un grupo de bloqueo tal como F-moc ( fluorenilmetil-0-CO-) ; (2) ésteres de la terminal carboxi o de otro grupo carboxi o hidroxilo libre; (3) amida de la terminal carboxi o de otro grupo carboxilo libre producido por reacción con amoniaco o con una amina adecuada; (4) derivados fosforilados ; (5) derivados conjugados a un anticuerpo u otro ligando biológico y otros tipos de derivados.
Secuencias de polipéptidos mas largas que resultan de la adición de residuos de aminoácidos adicionales a los polipéptidos de la invención también se abarcan en la presente invención. Se esperaría que tales secuencias de polipéptidos mas largas tengan la misma actividad biológica y especificidad (v.gr., tropismo celular) como los polipéptidos descritos anteriormente. Aunque polipéptidos teniendo un número sustancial de aminoácidos adicionales no se excluyen, se reconoce que algunos polipéptidos largos pueden asumir una configuración que enmascara la secuencia efectiva, por ende previniendo ligadura a un objetivo (v.gr., un miembro de la familia de receptores LRP tal como LRP o LRP2) . Estos derivados podrían actuar como antagonistas competitivos. Por ende, aunque la presente invención abarca polipéptidos o derivados de los polipéptidos descritos en la presente teniendo una extensión, deseablemente la extensión no destruye la actividad de direccionamiento a células del polipép-tido o derivado.
Otros derivados incluidos en la presente invención son polipéptidos duales consistiendo de dos de los mismos, o dos polipéptidos diferentes de la presente invención enlazados de manera covalente entre sí ya sea directamente o a través de un separador, tal como por una extensión corta de residuos de alanina o por un sitio putativo para proteólisis (v.gr., por catepsina, ver v.gr., la patente US 5,126,249 y la patente europea 495 049) . Multímeros de los polipéptidos de la presente invención consisten de polímero de moléculas formadas a partir de los mismos o diferentes polipéptidos o derivados de los mismos.
La presente invención también presenta derivados de polipéptido que son proteínas quiméricas o de fusión conteniendo un polipéptido descrito en la presente, o fragmento del mismo, enlazado en su extremo terminal amino o carboxi, o ambos, a una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. Tal una proteína quimérica o de fusión puede producirse por expresión recombinante de un ácido nucleico codificando la proteína. Por ejemplo, una proteína quimérica o de fusión puede contener por lo menos 6 aminoácidos compartidos con uno de los polipéptidos descritos que deseablemente resulta en una proteína quimérica o de fusión que tiene una actividad funcional equivalente o mayor. Ensayos para identificar peptidomiméticos Como se describe anteriormente, compuestos no de peptidilo generados para replicar la geometría de esqueleto y despliegue de farmacóforos (peptidomiméticos) de los polipéptidos identificados por los métodos de la presente invención frecuentemente posee atributos de mayor estabilidad metabólica, mayor potencia, mayor duración de acción y mejor bio-disponibilidad .
Los compuestos peptidomimétidos de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca de combinación conocidos en la materia, incluyendo bibliotecas biológicas, bibliotecas en fase sólida o fase de solución paralelas dirigibles espacialmente, métodos de biblioteca sintética requiriendo desenvolvimiento, el método de biblioteca de "una perla-un compuesto", y métodos de biblioteca sintéticos usando selección de cromatografía por afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de polipéptido, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de polipépti-do, oligómero no de péptido o molécula pequeña (Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997). Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la materia, por ejemplo, en: DeWitt et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6909, 1993); Erb et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 -.11422, 1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994); Cho et al. {Science 261 : 1303, 1993); Carell et al. (Angew. Chem, Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994 e ibid 2061); y en Gallop et al. (Med. Chem. 37:1233, 1994). Bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (v.gr., Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992) o sobre perlas (Lam, Nature 354:82-84, 1991), hojuelas (Fodor, Nature 364:555-556, 1993), bacterias o esporas (patente US 5,223,409), plásmidos (Culi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:1865-1869, 1992) o sobre fago (Scott y Smith, Science 249:386-390, 1990), o luciferasa, y el marcador enzimático detectado por determinación de conversión de un sustrato apropiado a producto.
Una vez que un polipéptido de la presente invención se identifica, puede ser aislado y purificado por cualquier número de métodos estándar incluyendo, pero no limitado a, solubilidad diferencial (v.gr., precipitación), centrifugación, cromatografía (v.gr., afinidad, intercambio de iones, exclusión de tamaño, y similares) o por cualquier otra técnica estándar usada para la purificación de polipéptidos, peptidomimétidos o proteínas. Las propiedades funcionales de un polipéptido identificado de interés puede evaluarse usando cualquier ensayo funcional conocido en la materia. Deseablemente, ensayos para evaluar función de receptor corriente abajo en señalización intracelular se usan (v.gr., proliferación celular) .
Por ejemplo, los compuestos peptidomiméticos de la presente invención pueden obtenerse usando el siguiente proceso de tres fases: (1) explorar los polipéptidos de la presente invención para identificar regiones de estructura secundaria necesarias para apuntar a los tipos de células particulares descritos en la presente; (2) usar sustitutos de dipéptido restringidos en cuanto a conformación para refinar la geometría de esqueleto y proporcionar plataformas orgánicas correspondientes a estos sustitutos; y (3) usar las mejores plataformas orgánicas para desplegar farmacóforos orgánicos en bibliotecas de candidatos designados para imitar la actividad deseada del polipéptido nativo. En mas detalle las tres fases son como sigue. En la fase 1, los polipéptidos candidatos líderes son explorados y su estructura puenteada para identificar los requerimientos para su actividad. Una serie de análogos de polipéptido del original son sintetizados. En la fase 2, los mejores análogos de polipéptido son investigados usando los sustitutos de dipéptido restringidos en cuanto a conformación. Aminoácidos indolizidin-2-ona, indolizidin-9-ona y quinolizidinona (I2aa, I9aa y Qaa, respectivamente) se usan como plataformas para estudiar geometría de esqueleto de los mejores candidatos de polipéptido. Estas y plataformas relacionadas (revisadas en Halab et al., Biopolymers 55:101-122, 2000; y Hanessian et al. Tetrahedron 53:12789-12854, 1997) pueden introducirse en regiones específicas del polipéptido para orientar los farmacóforos en diferentes direcciones. Evaluación biológica de estos análogos identifican polipéptidos líderes mejorados que imitan los requerimientos geométricos para actividad. En la fase 3, las plataformas a partir de los polipéptidos líderes mas activos se usan para desplegar sustitutos orgánicos de los farmacóforos responsables para actividad del polipéptido nativo. Los farmacóforos y andamiajes se combinan en un formato de síntesis paralelo. Derivación de polipéptidos y las fases anteriores pueden lograrse por otros medios usando métodos conocidos en la materia.
Relaciones estructura función determinadas a partir de los polipéptidos, derivados de polipéptido, peptidomiméticos u otras moléculas pequeñas de la presente invención se pueden usar para refinar y preparar estructuras moleculares análogas teniendo propiedades similares o mejores. De manera acorde, los compuestos de la presente invención también incluyen moléculas que comparten la estructura, polaridad, características de carga y propiedades de cadena secundaria de los polipéptidos descritos en la presente .
En resumen, con base en la divulgación presente, los técnicos en la materia pueden desarrollar ensayos de clasificación de polipéptidos y peptidomimétidos que son útiles para identificar compuestos para dirigir un agente a tipos de células particulares (v.gr., aquellos descritos en la presente). Los ensayos de esta invención pueden desarrollarse para formatos de clasificación de bajo rendimiento, alto rendimiento, o rendimiento ultra-elevado. Ensayos de la presente invención incluyen ensayos que son receptivos a automatización.
Enlazadores El agonista GLP-1 puede enlazarse al péptido de vector ya sea directamente (v.gr., a través de un enlace covalente tal como un enlace de péptido) o puede enlazase a través de un enlazador. Enlazadores incluyen agentes enlazadores químicos (v.gr., enlazadores disociables) y péptidos.
En algunas formas de realización, el enlazador es un agente enlazador químico. El agonista GLP-1 y péptido de vector pueden conjugarse a través de grupos sulfhidrilo, grupos amino (aminas), y/o carbohidratos o cualquier otro grupo reactivo. Reticuladores homo-bifuncionales y hetero-bifuncionales (agentes de conjugación) están disponibles a partir de muchas fuentes comerciales. Regiones disponibles para reticulación pueden encontrarse en los polipéptidos de la presente invención. El reticulador puede comprender un brazo flexible, v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 átomos de carbono. Reticuladores ejemplares incluyen BS3 ( [Bis ( sulfosuccinimidil ) suberato] ; BS3 es un éster de N-hidroxisuccinimida homo-bifuncio-nal que apunta a aminas primarias accesibles) , NHS/EDC (N-hidroxisuccinimida y N-etil- (dimetilaminopropil) carbodiimida; NHS/EDC permite para la conjugación de grupos amina primarios con grupos carboxilo) , sulfo-EMCS ( [ácido N-e-maleimidocaproico] hidrazida; sulfo-EMCS son grupos reactivos hetero-bifuncionales (maleimida y NHS-éster) que son reactivos hacia grupos sulfhidrilo y amino) , hidrazida (la mayoría de las proteínas contienen carbohidratos expuestos e hidrazida es un reactivo útil para enlazar grupos carboxilo a aminas primarias) , y SATA (N-succinimidil-S-actiltioacetato; SATA es reactivo hacia aminas y añade grupos sulfhidrilo protegidos) .
Para formar enlaces covalentes, se puede usar como un grupo químicamente reactivo una amplia variedad de grupos carboxilo activos (v.gr., ésteres) donde la fracción hidroxilo es fisiológicamente aceptable en los niveles requeridos para modificar al péptido. Agentes particulares incluyen N-hidroxisuc-cinimida (NHS) , N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-NHS), maleimida-benzoil-succinimida (MBS) , éster de gamma-maleimido-butiriloxi succinimida (GMBS), ácido maleimido propiónico (MPA), ácido maleimido hexanoico (MHA) , y ácido maleimido undecanoico (MUA) .
Aminas primarias son los objetivos principales para ésteres NHS. Grupos -amina accesibles presentes en las terminales N de proteínas y la e-amina de lisina reacciona con ésteres NHS. Un enlace amida se forma cuando la reacción de conjugación de éster NHS reacciona con aminas primarias liberando N-hidroxi-succinimida. Esta succinimida conteniendo grupos reactivos están referidos en la presente como grupos succinimidilo . En ciertas formas de realización de la invención, el grupo funcional en la proteína será un grupo tiol y el grupo químicamente reactivo será un grupo conteniendo maleimido tal como gamma-maleimido-butirila-mida (GMBA o MPA) . Tales grupos conteniendo maleimida son referidos en la presente como grupos maleimido.
El grupo maleimido es mas selectivo para grupos sulfhidrilo en péptidos cuando el pH de la mezcla de reacción es 6.5-7.4. A pH 7.0, la tasa de reacción de grupos maleimido con sulfhidrilos (v.gr., grupos tiol en proteínas tales como albúmina de suero o IgG) es 1,000 veces mas rápido que con aminas. Por ende, un enlace de tioéter estable entre el grupo maleimido y el sulfhidrilo pueden formarse.
En otras formas de realización, el enlazador incluye por lo menos un aminoácido (v.gr., un péptido de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 40, o 50 aminoácidos) . En ciertas formas de realización, el enlazador es un solo aminoácido (v.gr., cualquier aminoácido como se presenta en la naturaleza tal como Cys) . En otras formas de realización, un péptido rico en glicina tal como un péptido teniendo la secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] n donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 se usa, como se describe en la patente US 7,271,149. En otras formas de realización, un enlazador de péptido rico en serina se usa, como se describe en la patente US 5,525,491. Enlazadores de péptido rico en serina incluyendo aquellos de la fórmula [X-X-X-X-Gly] y, donde hasta dos de las X son Thr, y el resto de las X son Ser, y y es 1 a 5 (v.gr., Ser-Ser-Ser-Ser-Gly, donde y es mayor que 1). En algunos casos, el enlazador es un solo aminoácido (v.gr., cualquier aminoácido, tal como Gly o Cys) .
Ejemplos de enlazadores adecuados son ácido succíriico, Lys, Glu, y Asp, o un dipéptido tal como Gly-Lys. Cuando el enlazador es ácido succínico, un grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del residuo de aminoácido, y el otro grupo carboxilo del mismo puede, por ejemplo, formar un enlace amida con un grupo amino del péptido o sustituyente . Cuando el enlazador es Lys, Glu, o Asp, el grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un aminoácido del residuo de aminoácidos, y el grupo amino del mismo puede, por ejemplo, formar un enlace amida con un grupo carboxilo del sustituyente. Cuando Lys se usa como el enlazador, un enlazador adicional puede insertarse entre el grupo e-amino de Lys y el sustituyente. En una forma de realización particular, el enlazador adicional es ácido succínico el cual, v.gr., forma un enlace amida con el grupo e-amino de Lys y con un grupo amino presente en el sustituyente. En una forma de realización, el enlazador adicional es Glu o Asp (v.gr., el cual forma un enlace amida con el grupo e-amino de Lys y otro enlace amida con un grupo carboxilo presente en el sustituyente) , esto es, el sustituyente es un residuo lisina Ne-acilado.
Ensayo de actividad de agonista GLP-1 Determinación de si un compuesto tiene actividad de agonista GLP-1 puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la materia. Producción de AMP cíclica (cAMP) a partir de células expresando un receptor de GLP-1 (v.gr., un receptor humano) puede medirse en la presencia y en la ausencia de un compuesto, donde un incremento en la producción de cAMP indica que el compuesto es un agonista GLP-1.
En un ejemplo descrito en la publicación de solicitud de patente US 2008/0207507, células de riñon de hámster bebé (BHK) expresando al receptor de GLP-1 humano clonado (BHK-467-12A) se hicieron crecer en medio DMEM con adición de 100 IU/ml de penicilina, 100 yg/ml de estreptomicina, suero de becerro fetal al 5%, y 0.5 mg/mL de Geneticin G-418 (Life Technologies). Las células se lavaron dos veces en solución salina regulada con fosfato y se cosecharon con Versene. Membranas de plasma se prepararon a partir de las células por homogeneización con un Ultraturrax en regulador 1 (HEPES-Na 20 mM, EDTA 10 inM, pH 7.4). El homogenado se centrifugó a 48,000*g por 15 minutos a 4°C. La pelotilla se suspendió por homogeneización en regulador 2 (HEPES-Na 20 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.4), entonces se centrifugó a 48,000*g por 15 minutos a 4°C. El procedimiento de lavado se repitió una vez mas. La pelotilla final se suspendió en regulador 2 y se usó de manera inmediata para ensayos o se almacenó a -80°C.
El ensayo de receptor funcional se llevó a cabo mediante medir cAMP como una respuesta a estimulación por el agente insulinotrópico. cAMP formado se cuantificó por el Kit cAMP AlphaScreen (Perkin Elmer Life Sciences) . Incubaciones se llevaron a cabo en placas de micro-titulación de 96 pozos de media área en un volumen total de 50 i de regulador 3 (Tris-HCl 50 mM, HEPES 5 mM, MgC12 10 mM, pH 7.4 ) y con las siguientes adiciones: ATP 1 mM, GTP 1 µ?, 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX) 0.5 mM, Tween-20 al 0.01%, BSA al 0.1%, 6 pg de preparación de membrana, 15 pg/ml de perlas aceptadoras, 20 µg/ml de perlas donadoras pre-incubadas con biotinil-cAMP 6 nM. Compuestos a ser probados para actividad de agonista se disolvieron y diluyeron en regulador 3. GTP se preparó de manera fresca para cada experimento. La placa se incubó en la oscuridad para agitación lenta por tres horas a temperatura ambiente seguido por contar en el instrumento Fusión (Perkin Elmer Life Sciences). Curvas de respuesta de concentración se trazaron para los compuestos individuales y valores EC50 se estimaron usando un modelo logistico de cuatro parámetros con Prism v 4.0 (GraphPad, Carlsbad, California) .
Aplicaciones terapéuticas Los compuestos de la invención pueden usarse en cualquier aplicación terapéutica donde una actividad de agonista GLP-1 en el cerebro, o en tejidos particulares, se desea. Actividad de agonista GLP-1 se asocia con estimulación de secreción de insulina (es decir, para actuar como una hormona incretina) y secreción de glucagón de inhibición, con ello contribuyendo para limitar excursiones de glucosa post-prandial . Agonistas GLP-1 pueden inhibir motilidad y secreción gastrointestinal, por ende actuando como una enterogastrona y parte del mecanismo de "freno ileal". GLP-1 también parece ser un regulador fisiológica de apetito y consumo alimenticio. Debido a estas acciones, GLP-1 y agonistas del receptor de GLP-1 pueden usarse para terapia de trastornos raetabólicos, como se revista en, v.gr., Kinzig et al., J. Neurosci. 23:6163-6170, 2003. Tales trastornos incluyen obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, IGT, dislipidemia diabética, hiperlipidemia, una enfermedad cardiovascular, e hipertensión.
GLP-1 también tiene efectos neurológicos incluyendo efectos sedantes o anti-anxioliticos , como se describe en la patente US 5,846,937. Por ende, agonistas GLP-1 pueden usarse en el tratamiento de ansiedad, agresión, psicosis, ataques, ataques de pánico, histeria, o trastornos del sueño. Agonistas GLP-1 también pueden usarse para tratar enfermedad de Alzheimer, como agonistas GLP-1 han sido mostrados protegiendo neuronas contra apóptosis inducida por péptido amiloide-ß y glutamato (Perry et al., Curr. Alzheimer Res. 2:377-85, 2005).
Otros usos terapéuticos para agonistas GLP-1 incluyen mejorar el aprendizaje, acrecentar neuro-protección, y aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central, v.gr., a través de modulación de neurogénesis, y v.gr., enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ALS, apoplejía, ADD, y síndromes neuropsiquiátricos (patente US 6,969,702 y solicitud de patente US 2002/0115605). Estimulación de neurogénesis usando agonistas GLP-1 ha sido descrita, por ejemplo, en Bertilsson et al., J. Neurosci. Res. 86:326-338, 2008.
Aun otros usos terapéuticos incluyen convertir células madre/progenitoras de hígado hacia células pancreáticas funcionales (publicación de solicitud de patente US 2005/0053588); prevenir deterioro de células beta (patentes US 7,259,233 y 6,549,832) y estimulación de proliferación de células beta (publicación de solicitud de patente US 2003/0224983); tratar obesidad (patente US 7,211,557); suprimir apetito e inducir saciedad (publicación de solicitud de patente US 2003/0232754); tratar síndrome de intestinos irritables (patente US 6,348,447); reducir la morbidez y/o mortalidad asociada con infarto de miocardio (patente US 6,747,006) y apoplejía (publicación PCT WO 00/16797); tratar síndrome coronario agudo caracterizado por una ausencia de infarto de miocardio de ondas Q (patente US 7,056,887); atenuar cambios catabólicos post-quirúrgicos (patente US 6,006,753); tratar miocardio en hibernación o cardiomiopatía diabética (patente US 6,894,024); suprimir niveles de plasma sanguíneos de norepinefriña (patente US 6,894,024); incrementar excreción de sodio urinario, disminuir concentración de potasio urinario (patente US 6,703,359); tratar condiciones o trastornos asociados con hipervolemia tóxica, v.gr., falla renal, falla congestiva del corazón, síndrome nefrótico, cirrosis, edema pulmonar, e hipertensión (patente US 6,703,359); inducir una respuesta inotrópica e incrementar contractilidad cardiaca (patente US 6,703,359); tratar síndrome de ovarios policísticos (patente US 7,105,489); tratar aflicción respiratoria (publicación de solicitud de patente US 2004/0235726) ; mejorar nutrición mediante una ruta no alimentaria, es decir, mediante inyección o infusión intravenosa, sub-cutánea, intramuscular, peritonéal, u otra (patente US 6,852,690); tratar nefropatía (publicación de solicitud de patente US 2004/0209803); tratar disfunción sistólica ventricular izquierda, v.gr., con fracción de eyección ventricular izquierda anormal (patente US 7,192,922); inhibir motilidad antro-duodenal, v.gr., para el tratamiento o prevención de trastornos gastrointestinales tales como diarrea, síndrome de evacuación post-operativa y síndrome de intestinos irritables, y como pre-medicación en procedimientos endoscópicos (patente US 6,579,851); tratar polineuropatía de enfermedad crítica (CIPN) y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) (publicación de solicitud de patente US 2003/0199445) ; modular niveles de triglicéridos y tratar dislipidemia (publicación de solicitud de patente US 2003/0036504 y 2003/0143183); tratar lesión de tejido de órganos ocasionada por reperfusión de flujo sanguíneo siguiendo a isquemia (patente US 6,284,725); tratar síndrome de factor de riesgo de enfermedad coronaria del corazón (CHDRF) (patente US 6,528,520); y otros.
Administración y dosificación La presente invención también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención. La composición puede formularse para uso en una variedad de sistemas de entrega de fármacos. Uno o mas excipientes o portadores fisiológicamente aceptables puede incluirse también en la composición para formulación apropiada. Formulaciones adecuadas para uso en la presente invención se encuentran en Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a. ed., 1985. Para una revisión breve de métodos para entrega de fármacos, ver, v.gr., Langer (Science 249:1527-1533, 1990).
Las composiciones farmacéuticas son pretendidas para administración parenteral, intranasal, tópica, oral, o local, tal como por medios transdérmicos, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas parenteralmente (v.gr., por inyección intravenosa, intramuscular, o sub-cutánea) , o por ingestión oral, o por aplicación tópica o inyección intra-articular en áreas afectadas por la condición vascular o de cáncer. Rutas de administración adicionales incluyen administración intravascular, intra-arterial, intratumoral , intraperitoneal , intraventricular, intraepidural, así como nasal, oftálmica, intrascleral, intraor-bital, rectal, tópica, o de inhalación de aerosol. Administración de liberación sostenida también se incluye específicamente en la invención, por medios tales como inyecciones de depósito o implantes o componentes erosibles. Por ende, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden los agentes anteriormente mencionados disueltos o suspendidos en un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso, v.gr., agua, agua regulada, solución salina, PBS, y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y regulación de pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. La invención también proporciona composiciones para entrega oral, las cuales pueden contener ingredientes inertes tales como aglutinantes o rellenos para la formulación de una tableta, una cápsula, y similares. Mas aun, esta invención proporciona composiciones para administración local que pueden contener ingredientes inertes tales como solventes y emulsionantes para la formulación de una crema, un ungüento, y similares.
Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales, o pueden filtrarse estériles. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para uso como son, o liofilizarse, la preparación liofilizada siendo combinada con un portador acuoso estéril previo a administración. El pH de las preparaciones típicamente estará entre 3 y 11, mas preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y lo mas preferible entre 7 y 8, tal como 7 a 7.5. Las composiciones resultantes en forma sólida pueden empacarse en múltiples unidades de una sola dosis, cada una conteniendo una cantidad fija del agente o agentes anteriormente mencionados, tal como en un empaque sellado de tabletas o cápsulas. La composición en forma sólida también puede empacarse en un recipiente para una cantidad flexible, tal como en un tubo que se puede apretar diseñado para crema o ungüento tópicamente aplicables.
Las composiciones conteniendo una cantidad efectiva pueden administrarse para tratamientos profilácticos o terapéuticos. En aplicaciones profilácticas, composiciones pueden administrarse a un sujeto con una pre-disposición clínicamente determinada o susceptibilidad incrementada a un trastorno metabólico o enfermedad neurologica. Composiciones de la invención se pueden administrar al paciente (v.gr., un humano) en una cantidad suficiente para retrasar, reducir, o de preferencia prevenir el establecimiento de la enfermedad clínica. En aplicaciones terapéuticas, composiciones son administradas a un sujeto (v.gr., un humano) que ya sufre de una enfermedad (v.gr., un trastorno metabólico tal como aquellos descritos en la presente, o una enfermedad neurologica) en una cantidad suficiente para curar o por lo menos parcialmente arrestar los síntomas de la condición y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr este propósito se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva", una cantidad de un compuesto suficiente para sustancialmente mejorar algunos síntomas asociados con una enfermedad o condición médica. Por ejemplo, en el tratamiento de un trastorno metabólico (v.gr., aquellos descritos en la presente) , un agente o compuesto que disminuye, previene, retrasa, suprime, o arresta cualquier síntoma de la enfermedad o condición sería terapéuticamente efectivo. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente o compuesto no se requiere para curar una enfermedad o condición sino proporcionará un tratamiento para una enfermedad o condición tal que el establecimiento de la enfermedad o condición se retrase, obstruya, o prevenga, o los síntomas de la enfermedad o condición se retrase, obstruyan, o prevengan, o los síntomas de la enfermedad o condición sean mejorados, o el término de la enfermedad o condición se cambie o, por ejemplo, sea menos severo o la recuperación se acelere en un individuo .
Exendina-4 típicamente se toma dos veces al día a ya sea 5 yg o 10 g por dosis para tratamiento de diabetes. Los compuestos de la invención se pueden administrar en dosis equivalentes de como se especifica para exendina-4, pueden administrarse en dosis equivalentes mas altas (v.gr., dosis 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1,000% mayores), o pueden administrarse en dosis equivalentes menores (v.gr., 90%, 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, o 0.1% de la dosis equivalente). Cantidades efectivas para este uso pueden depender de la severidad de la enfermedad o condición y el peso y estado general del paciente pero generalmente varían de alrededor de 0.05 g a alrededor de 1,000 \iq (v.gr., 0.5-100 \iq) de una cantidad equivalente de agente o agentes de exendina-4 por dosis por paciente. Regímenes adecuados para administración inicial y administraciones potenciadoras se tipifican por una administración inicial seguida por dosis repetidas a uno o mas intervalos horarios, diarios, semanales, o mensuales por una administración subsecuente. La cantidad efectiva total de un agente presente en las composiciones de la invención puede administrarse a un mamífero como una sola dosis, ya sea como un bolo o por infusión sobre un periodo de tiempo relativamente corto, o puede administrarse usando un protocolo de tratamiento fraccionado, en el cual múltiples dosis son administradas sobre un periodo de tiempo mas prolongado (v.gr., una dosis cada 4-6, 8-12, 14-16, o 18-24 horas, o cada 2-4 días, 1-2 semanas, una vez al mes) . Alternativamente, infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones terapéuticamente efectivas en la sangre se contempla.
La cantidad terapéuticamente efectiva de uno o mas agentes presentes dentro de las composiciones de la invención y usada en los métodos de esta invención aplicada a mamíferos (v.gr., humanos) puede determinarse por el técnico en la materia con consideración de diferencias individuales en edad, peso, y la condición del mamífero. Debido a que ciertos compuestos de la invención exhiben una habilidad acrecentada para cruzar la BBB, la dosificación de los compuestos de la invención puede ser mas baja que (v.gr., menor que o igual a alrededor de 90%, 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% o 0.1% de) la dosis equivalente requerida para un efecto terapéutico del agonista GLP-1 no conjugado. Los agentes de la invención se administran a un sujeto (v.gr., un mamífero, tal como un humano) en una cantidad efectiva, que es una cantidad que produce un resultado deseable en un sujeto tratado (v.gr., reducción en glicemia, ganancia de peso reducida, pérdida de peso incrementada, y consumo de alimentos reducido) . Cantidades terapéuticamente efectivas también pueden determinarse empíricamente por los técnicos en la materia.
El paciente también puede recibir un agente en el rango de alrededor de 0.05 a 1,000 µg de dosis equivalente según se compara con exendina-4 por dosis una o mas veces por semana (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, o 7 o mas veces por semana), 0.1 a 2,500 (v.gr., 2,000, 1,500, 1,000, 500, 100, 10, 1, 0.5, o 0.1) g de dosis por semana. Un paciente también puede recibir un agente de la composición en el rango de 0.1 a 3,000 pg por dosis una vez cada dos a tres semanas.
Administraciones sencillas o múltiples de las composiciones de la invención comprendiendo una cantidad efectiva pueden llevarse a cabo con niveles y patrón de dosis siendo seleccionados por el médico tratante. La dosis y el programa de administración pueden determinarse y ajustarse con base en la severidad de la enfermedad o condición en el paciente, la cual se puede monitorizar durante el curso de tratamiento de acuerdo con los métodos comúnmente practicados por clínicos o aquellos descritos en la presente.
Los compuestos de la presente invención pueden usarse en combinación con ya sea métodos de tratamiento o terapia convencionales o pueden usarse por separado de métodos de tratamiento o terapia convencionales.
Cuando los compuestos de esta invención son administrados en terapias de combinación con otros agentes, pueden administrarse secuencialmente o concurrentemente a un individuo. Alternativamente, composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden estar comprendidas por una combinación de un compuesto de la presente invención en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, como se describe en la presente, y otro agente terapéutico o profiláctico conocido en la materia .
Ejemplo 1 Sintetizar conjugados de agonista GLP-l-Angiopep Los conjugados GLP-1 ejemplares, exendina-4-cysAn2 terminal N, y Exendina-4-cysAn2 terminal C, y conjugados Angiopep-l/Exendina-4 se hicieron mediante conjugar [Lys (ácido maleimido hexanoico) 39] exendina-4 al sulfuro en cys-An2 (SEQ ID NO: 113), en An2-cys (SEQ ID NO: 114), o en Angiopep-1 (SÉQ ID NO: 67) en regulador PBS lx por 1 hora. Esto resultó en producción de conjugados de exendina- /Angiopep, como se muestra en la figura 2.
Un segundo conjunto de conjugados de exendina-4 /Angiopep se hizo mediante hacer reaccionar Angiopep-2 teniendo ácido maleimido propiónico ( PA) , ácido maleimido hexanoico (MHA) , o ácido maleimido undecanoico (MUA) ligados a su terminal N con [Cys32 ] Exendina-4 para formar un conjugado, como se muestra en la figura 3.
Ejemplo 2 Captación cerebral de los conjugados de exend±na-4/Ang±opep-2 in situ Para medir la captación cerebral de los conjugados de exendina-4 /Angiopep-2 , se usó un ensayo de perfusión in situ. El ensayo, el cual se describe en la publicación de solicitud de patente US 2006/0189515, se lleva a cabo como sigue. La captación de la exendina-4 marcada y los conjugados de exendina-4 /Angiopep-2 se midió usando el método de perfusión cerebral in situ adaptado en el laboratorio para el estudio de captación de fármaco en el cerebro de ratón (Dagenais et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:381-6, 2000; Cisternino et al., Pharm. Res. 18, 183-190, 2001) . Brevemente, la arteria carótida común derecha de ratones anestesiados con cetamina/xilazina (140/8 mg/kg i.p.) se expuso y se ligó en el nivel de la bifurcación de la carótida común, rostral a la arteria occipital. La carótida común entonces se cateterizó rostralmente con entubado de polietileno relleno con heparina (25 U/ml) y se montó sobre una aguja calibre 26. La jeringa conteniendo al fluido de perfusión ( [1 5I] -proteínas o [125I] -péptidos en Krebs/regulador de bicarbonato a pH 7.4, gasificado con 95% de 02 y 5% de C02) se colocó en una bomba de infusión (bomba Harvard PHD 2000; Harvard Apparatus) y se conectó al catéter. Previo a la perfusión, la contribución del flujo sanguíneo contra-lateral se eliminó mediante cortar los ventrículos del corazón. El cerebro se perfundió por 5 minutos a una tasa de flujo de 1.15 ml/min. Después de perfusión de moléculas radiomarcadas , el cerebro se perfundió adicionalmente por 60 s con regulador Krebs, para lavar [125I] -proteínas en exceso. Los ratones entonces fueron decapitados para terminar la perfusión y el hemisferio derecho se aisló en hiero antes de someterse a agotamiento capilar. Alícuotas de homogenados, sobrenadantes, pelotillas, y perfundidos se tomaron para medir sus contenidos y evaluar el volumen de distribución aparente.
A partir de estos experimentos, la distribución cerebral de ambos conjugados de Exendina-4/Angiopep-2 se incrementó 15-50 veces sobre aquella de exendina-4 no conjugada.
La distribución cerebral de exendina-4 se observó a 0.2 ml/100 g/2 min, mientras que el conjugado modificado en su terminal N se observó a 3 ml/100 g/2 min, y el conjugado modificado en su terminal C se observó a 10 ml/100 g/2 min. Los resultados se muestran en la figura 4.
Ejemplo 3 Tratamiento de ratones obesos con conjugados de exendina-4/Angiopep-2 Ratones obesos (ratones ob/ob) fueron administrados con el conjugado [Lys39-MHA] exendina-4 /Angiopep-2-Cys-NH2 (Exen-An2) .
Estudio in vivo para determinar la eficacia de conjugado de Exendina-4-Angiopep-2 Grupos Dosis Dosis Dosis ratones/grupo QlDx 28 dias (pg/kg) (nmol/kg) (pg/ratón) (pg de cantidad total) Control 0 0 0 5 0 Exendina-4 3 0.72 0.18 5 20.16 30 7.2 1.8 5 201.6 Exen-An2 4.8 0.72 0.288 5 32.256 48 7.2 2.88 5 322.56 Una dosis de 1.6 g/kg de Exen-An2 es equivalente a 1 Ug/kg de dosis de exendina-4. El peso corporal de cada ratón se midió diariamente. El consumo alimenticio se estimó con base en los valores medios para cada grupo, y glicemia se midió una hora después de tratamiento. Después de 10 dias de tratamiento, la ganancia de peso corporal y el consumo alimenticio de ratones tratados a las dosis mayores de ya sea exendina-4 o el conjugado son mejores que el control (figura 5) . El consumo alimenticio también se redujo en los ratones recibiendo las dosis mayores de ya sea exendina-4 o el conjugado (figura 6) según se compara con el control.
Mediciones de glicemia mostraron que la dosis menor del conjugado tuvo el mismo efecto como las dosis mayores de ya sea exendina-4 o Exen-An2 (figura 7) . Por ende, un efecto similar de 1/10 de la dosis sobre glicemia se observa usando al conjugado, según se compara con exendina-4.
Ejemplo 4 Generación de un conjugado de Exendina-4-dimero de Angiope -2 Usando la química de conjugación descrita en la presente o química similar, una Exendina-4-dímero de Angiopep-2 se generó teniendo la estructura mostrada en la figura 8A. Brevemente, el grupo amina en la lisina terminal C de [Lys39] Exendina-4 se conjugó a un dímero de Angiopep-2 a través de un enlazador de MHA en la treonina terminal N del primer péptido de Angiopep-2. Un enlazador de N-succinimidil-S-acetil-propionato (SATP) se unió a un péptido de Angiopep-2-Cys en su terminal N. A través de esta cisteína, el péptido de Angiopep-2-Cys se conjugó a un segundo péptido de Angiopep-2, el cual había sido modificado para contener un enlazador de MPA. El dímero se enlazó a la [Lys39] Exendina-4 a través de un enlazador de MHA. Una molécula de control (Exen-S4) también se generó usando una forma revuelta de Angiopep-2 conjugada en su terminal N a la cisteína de [Cys32] Exendina-4 a través de un enlazador de MHA (figura 8B) . Estos conjugados se prepararon como sales de trifluoroacetato (TFA) .
Ejemplo 5 Caracterización de un conjugado de exendina-4-dímero de Angiopep-2 La captación cerebral del agonista GLP-1 ejemplar, exendina-4, se midió in situ cuando no se conjuga, se conjuga a un solo Angiopep-2, se conjuga a un Angiopep-2 revuelto (S4), o se conjuga a una forma dimérica de Angiopep-2. Los experimentos se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 2 anterior.
A partir de estos resultados, se observó que la conjugación del análogo de exendina-4 a la forma dimérica de Angiopep-2 resulta en un conjugado con una habilidad sorprendentemente mayor para cruzar la BBB según se compara con ya sea la exendina-4 no conjugada o la exendina-4 conjugada a un solo Angiopep-2 (figura 9) .
También se probó la habilidad del conjugado de dimero de exendina-4-Angiopep-2 para reducir glicemia en ratones DIO. Ratones fueron inyectados con un bolo conteniendo un control, exendina-4, o el conjugado de exendina-4-dimero de Angiopep-2. Ratones recibiendo ya sea exendina-4 o el conjugado exhibieron glicemia reducida según se comparan con ratones recibiendo al control (figura 10) .
Ejemplo 6 Caracterización de un conjugado de exendina-4-dimero de Angiopep-2 Captación cerebral del agonista GLP-1 ejemplar, exendina-4, se midió in situ cuando se no se conjuga, se conjuga a un solo Angiopep-2, se conjuga a S4 o se conjuga a una forma dimérica de Angiopep-2. Los experimentos se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 2 anterior.
A partir de estos resultados, se observó que conjugación del análogo de exendina-4 a la forma dimérica de Angiopep-2 resulta en un conjugado con una habilidad sorprendentemente mayor para cruzar la BBB según se compara con ya sea la exendina-4 no conjugada o a la exendina-4 conjugada con un solo Angiopep-2 (figura 8 ) .
También se probó la habilidad del conjugado de exendina-4-dímero de Angiopep-2 para reducir glicemia en ratones DIO. Ratones fueron inyectados con un bolo conteniendo control, exendina-4, o el conjugado de exendina-4-dímero de Angiopep-2. Ratones recibiendo ya sea exendina-4 o el conjugado exhibieron glicemia reducida según se comparan con ratones recibiendo el control (figura 9) .
Otras formas de realización Todas las patentes, solicitudes de patente, incluyendo la solicitud provisional US 61/105,618, solicitada el 15 de octubre de 2008, y publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada patente, solicitud de patente, o publicación independiente se indicara específicamente e individualmente para incorporarse por referencia.

Claims (38)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto teniendo la fórmula A-X-B donde A es un péptido capaz de cruzar la barrera hematoencefáli-ca; X es un enlazador; y B es un agonista GLP-1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde A comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 1-105, 107-111, 113, y 114.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde A es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 70% idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), cys-Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113), y Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114) .
4. El compuesto de la reivindicación 3, en donde dicha identidad de secuencias es por lo menos 90%.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67) , Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), cys-Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113), y Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114) .
6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde dicho polipéptido consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), cys-Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113), y Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114) .
7.. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde A es un polipéptido dimérico.
8. El compuesto de la reivindicación 7, en donde A es un dimero de Angiopep-2.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en donde dicho compuesto comprende la estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. El compuesto de la reivindicación 1, en donde B comprende un polipéptido.
11. El compuesto de la reivindicación 10, en donde B comprende exendina-4, o un análogo o fragmento de la misma teniendo actividad agonista GLP-1.
12. El compuesto de la reivindicación 10, en donde B es exendina-4, [Lys39] exendina-4 , o [Cys32] exendina-4.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en donde A comprende Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97), cys-Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113), o Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114) .
14. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde X tiene la fórmula: en donde n es un entero entre 2 y 15; y ya sea Y es un tiol sobre A y Z es una amina primaria sobre B o Y es un tiol sobre B y Z es una amina primaria sobre A.
15. El compuesto de la reivindicación 14, en donde n es 3, 6, u 11.
16. El compuesto de la reivindicación 15, en donde A es cys-Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113), Angiopep-2-cys-NH2 (SEQ ID NO: 114) y B es [Lys39] exendina-4 , y Y es el grupo tiol sobre la cisteina de A, y Z es la e-amina de Lys39 de B.
17. El compuesto de la reivindicación 1, en donde B es un polipéptido y X es un enlace de péptido.
18. El compuesto de la reivindicación 1, en donde B es un polipéptido, X es por lo menos un aminoácido, y A y B son cada uno enlazado de manera covalente a X por un enlace de péptido.
19. Una molécula de ácido nucleico que codifica al compuesto de la reivindicación 17 o 18.
20. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19, en donde dicho ácido nucleico se enlaza operativamente a un promotor.
21. Un método para hacer un compuesto de la reivindicación 17 o 18, dicho método comprendiendo expresar un polipépti-do codificado por el vector de la reivindicación 20 en una célula, y purificar dicho polipéptido.
22. Un método para hacer un compuesto de la reivindicación 17 o 18, dicho método comprendiendo sintetizar dicho compuesto sobre soporte sólido.
23. Un método para tratar a un sujeto teniendo un trastorno metabólico, dicho método comprendiendo administrar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en una cantidad suficiente para tratar dicho trastorno.
24. El método de la reivindicación 23, en donde dicha cantidad suficiente es menor que 50% de la cantidad requerida para una dosis equivalente del agonista GLP-1 cuando no se conjuga al vector de péptido.
25. El método de la reivindicación 23, en donde dicha cantidad es menor que 15%.
26. El método de la reivindicación 23, en donde dicho trastorno metabólico es diabetes, obesidad, diabetes como consecuencia de obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertri-gliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, tolerancia a glucosa perjudicada (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipide-mia, una enfermedad cardiovascular, o hipertensión.
27. El método de la reivindicación 23, en donde dicho trastorno es diabetes.
28. El método de la reivindicación 27, en donde dicho trastorno es diabetes tipo II.
29. El método de la reivindicación 23, en donde dicho trastorno es obesidad.
30. Un método para reducir el consumo de alimentos por, o reducir el peso corporal de, un sujeto, dicho método comprendiendo administrar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un sujeto en una cantidad suficiente para reducir el consumo de alimentos o reducir el peso corporal.
31. El método de la reivindicación 30, en donde dicho sujeto tiene sobrepeso o está obeso.
32. El método de la reivindicación 30, en donde dicho sujeto es bulimico.
33. Un método para tratar o prevenir un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste en ansiedad, trastorno de movimiento, agresión, psicosis, ataques, ataques de pánico, histeria, trastornos de sueño, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, dicho método comprendiendo administrar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un sujeto en una cantidad suficiente para tratar o prevenir dicho trastorno.
34. Un método para incrementar neurogénesis en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a dicho sujeto.
35. El método de la reivindicación 34, en donde dicho sujeto está sufriendo de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ALS, apoplejía, ADD, o un síndrome neuro-psiquiátrico .
36. El método de la reivindicación 34, en donde dicho incremento en neurogénesis mejora el aprendizaje o acrecienta neuro-protección en dicho sujeto.
37. Un método para convertir células madre/progenitoras de hígado en células pancreáticas funcionales; prevenir deterioro de células beta y estimulación de proliferación de células beta; tratar obesidad; suprimir apetito e inducir saciedad; tratar síndrome de intestinos irritables; reducir la morbidez y/o mortalidad asociada con infarto de miocardio y apoplejía; tratar síndrome coronario agudo caracterizado por una ausencia de infarto de miocardio de ondas Q; atenuar cambios catabólicos post-quirúrgicos; tratar miocardio en hibernación o cardiomiopatía diabética; suprimir niveles de plasma sanguíneo de norepinefriña; incrementar excreción urinaria de sodio, disminuir concentración urinaria de potasio; tratar condiciones o trastorno asociados con hipervolemia tóxica, v.gr., falla renal, falla congestiva del corazón, síndrome nefrótico, cirrosis, edema pulmonar, e hipertensión; inducir una respuesta inotrópica e incrementar la contractilidad cardiaca; tratar síndrome de ovarios policísticos ; tratar aflicción respiratoria; mejorar nutrición mediante una ruta no alimentaria, es decir, mediante inyección o infusión intravenosa, sub-cutánea, intramuscular, peritoneal, u otra; tratar nefropatia; tratar disfunción sistólica ventricular izquierda (v.gr., con fracción de eyección ventricular izquierda anormal); inhibir motilidad antro-duodenal (v.gr., para el tratamiento o prevención de trastornos gastrointestinales tales como diarrea, síndrome de evacuación post-operativo y síndrome de intestinos irritables, y como pre-medicamento en procedimientos endoscópicos ) ; tratar polineuropa-tía de enfermedad crítica (CIPN) y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) ; modular niveles de triglicéridos y tratar dislipidemia; tratar lesión de tejido de órganos ocasionada por reperfusión de flujo sanguíneo después de isquemia; o tratar síndrome de factor de riesgo de enfermedad coronaria del corazón (CHDRF) en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar una cantidad efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a dicho sujeto.
38. Un método para incrementar actividad del receptor de GLP-1 en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar a un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un sujeto en una cantidad suficiente para incrementar actividad de receptor de GLP-1.
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