KR101629365B1

KR101629365B1 - 항원 결합성 단백질

Info

Publication number: KR101629365B1
Application number: KR1020107015248A
Authority: KR
Inventors: 필리페 마르크 루이즈 알라드; 조나단 헨리 엘리스; 수잔나 카렌 포드; 볼커 게르마슈에브스키; 알랜 피터 루이즈; 피터 에르네스트 소덴; 파멜라 조안 토마스; 트레보 안토니 케네쓰 왓탐; 이안 리차드 캣치폴; 제랄드 웨인 고우프
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2007-12-11
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2016-06-14
Anticipated expiration: 2028-12-09
Also published as: CR11561A; US20090162358A1; EA022913B1; KR20150100964A; CA2707859A1; TWI388334B; AU2008334637B2; IL206188A0; CN101970484B; US8921523B2; KR20100099277A; JP2014177462A; WO2009074583A1; US20110014182A1; CN101970484A; CL2008003655A1; MX2010006422A; EP2222705B1; PE20091449A1; NZ586003A

Abstract

본 발명은 β-아밀로이드 펩티드, 특히 사람 β-아밀로이드 펩티드와 결합하는 항원 결합성 단백질; 상기 항원 결합성 단백질을 사용하여, 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 특히 알츠하이머병, 그리고 연령 관련 황반변성 및 녹내장형 질병 및 β-아밀로이드 의존성 백내장 형성을 포함하는 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 눈 또는 시신경에 영향을 미치는 질병 또는 장애를 치료하는 방법; 상기 항원 결합성 단백질을 포함하는 약제 조성물; 및 제조 방법에 관한 것이다.

Description

항원 결합성 단백질{ANTIGEN BINDING PROTEINS}

발명의 분야

본 발명은 β-아밀로이드 펩티드, 특히 사람 β-아밀로이드 펩티드와 결합하는, 항체를 포함하는 항원 결합성 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, β-아밀로이드 펩티드, 특히 사람 β-아밀로이드 펩티드와 결합하는 항원 결합성 단백질을 사용하여, 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 특히 알츠하이머병, 그리고 연령 관련 황반변성, 녹내장형(glaucoma type) 질병 및 β-아밀로이드 의존성 백내장 형성을 포함하는 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 눈 또는 시신경에 영향을 미치는 질병 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태들은 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.

발명의 배경

알츠하이머병(AD)은 연령 관련 인식력 감퇴의 가장 일반적인 원인이며, 전세계적으로 천이백만명이 넘는 사람들이 이 병을 앓고 있다 (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Suppl 1055-1057). 알츠하이머병의 초기 단계는 인식력 감퇴와 언어 및 행동 결함을 동반하는 진행성 기억 상실을 특징으로 한다. 상기 질병의 후기 단계에서, 환자들은 전기억상실증(global amnesia)을 나타내고, 운동 기능이 크게 감소된다. 전형적으로 사망은 진단된 지 9년 후에 발생하고, 종종 다른 질환, 전형적으로 폐렴을 동반한다 (Davis K.L. and Samules S.C. (1998) in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J. and Coyle J.T. (McGraw-Hill, New Yorkpp267-316)). 현재의 치료법은 대증 요법(symptomatic approach)이며, 이는 인지력 손상을 완화시키고 질병 진행과 관련된 행동 증상을 개선시키는 것에 초점을 맞추고 있다. 실제로, 이러한 치료법은 단지 일시적인 인식력 개선을 제공하는데, 인식력 손상 수준은 단지 2년 이하로 지속하는 것으로 보고되어 있다. 질병의 진행을 늦추고 가능하게는 정지시키는 질병 조절 요법(disease-modifying therapy)에 대한 잠재성은 매우 크다. 이러한 방법은 환자의 삶의 질 그리고 중요하는 보호자의 삶의 질에 대해 근본적이고 지속적인 개선을 제공할 뿐만 아니라 알츠하이머병의 막대한 전체 건강관리 비용을 감소시킬 것이다.

현재 알츠하이머병의 임상적 진단은 있음직하거나 있을법한 알츠하이머병의 진단으로 이어지는 신체적 그리고 정신적 시험의 조합을 기초로 하지만, 진단용 바이오마커와 이미징(imaging)이 연구중이다 (Sonnen et al. (2007) Expert Rev Neurotherapeutics 7(8): 1021-1028; Lockhart et al (2007) Brain 130: 2607-2615). 부검시에, 상기 질병은, 실질 플라크(parenchymal plaque)와 뇌혈관에서의 Aβ의 침착, 뉴런내에서의 신경섬유 덩어리의 형성, 시냅스 소실 및 특정 뇌 영역에서의 뉴런 아집단(neuronal subpopulation)의 소실을 포함하는, 뇌에서의 잘 특성화된 신경학적 특징에 의해 확인된다 (Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl 53: 141-145).

다수의 유전학적, 조직학적 및 기능상의 증거는 β-아밀로이드 펩티드(Aβ)가 알츠하이머병의 진행에 핵심적임을 시사하고 있지만 (Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766), 사후 검사시 관찰된 실제의 Aβ 침착물이 인식력 감퇴의 진정한 원인인 지의 여부가 최근들어 덜 명확해졌다 (Ferreira ST (2007) Life 59(4-5): 332-345). Aβ는 β-아밀로이드 전구체 단백질 (APP로도 알려져 있음)이 BACE1 (β-세크레타아제, Asp2 또는 Memapsin-2로도 알려져 있음)로서 알려져 있는 아스파르틸 프로테아제 효소에 의해 분해됨으로써 생성되는 것으로 알려져 있다 (De Strooper, B. and Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). 가용성 올리고머 형태의 Aβ는, 실질 및 혈관 침착에 더하여, AD의 발병에 기여하는 것으로 가정되었는데, 상기 Aβ는 시냅스 기능을 손상시킴으로써 뉴런 기능에 먼저 영향을 미칠 수 있다 (Lambert et. al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95 : 6448-6453; Kayed et al (2003) Science 300:486-489; Cheng et al (2007) J Biol Chem 282(33):23818-23828; Ferreira et al (2007) Life 59:332-345). 불용성 아밀로이드 플라크가 AD 및 경증 인지력 손상(mild cognitive impairment, MCI)의 초기에 발견되지만, 가용성 Aβ 응집체 (때때로 올리고머 또는 Aβ 유래된 확산성 리간드(ADDL)로 일컬어짐)의 수준은 이러한 환자에서 또한 증가하고, 가용성 Aβ 수준은 아밀로이드 플라크의 경우 보다 신경섬유 변성 및 시냅스 마커의 소실과 더 잘 상호관련된다 (Naslund et. al. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19). 또한, 이러한 올리고머는 피브릴(fibril)을 형성하는 경로상의 전구체를 나타낼 수 있고, 이의 제거 또는 중화는 독성 효과 및 피브릴 형성을 방지할 수 있다 (Ferreira ST (2007) Life 59(4-5): 332-345; Gong Y (2003) PNAS 100:10417-10422). 이러한 결과에도 불구하고, 고도로 아밀로이드를 생성하는 Aβ42 및 아미노-말단 트렁케이션된(truncated) 형태인 Aβx-42는 미만성(diffuse) 및 노인성(senile) 플라크 둘 모두에서 발견되는 Aβ의 주된 종(species)이고 (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016), Aβ42의 상대적 수준은 AD에 대한 바이오마커일 뿐만 아니라 Aβ를 아밀로이드 플라크로 응집시키는 핵심 조절인자인 것으로 여겨진다. Aβ42는 시험관내에서 다른 Aβ 형태 보다 용이하게 응집되는 것으로 밝혀졌고 (Jarrett, JT (1993) Biochemistry.32: 4693-4697), 이에 따라 Aβ42는 AD의 발병기전에서 개시 분자로서 관련되었다 (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). Aβ42는 통상적으로 APP 대사의 중요치 않은 생성물이지만, 이의 생성에 있어서의 작은 변화가 Aβ 침착에 대한 커다란 효과와 관련되며, 이로써 Aβ42만을 감소시키는 것이 AD를 치료하는 효과적인 방법일 수 있는 것으로 가정되었다 (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292; Levites et al (2007) J Clin Invest. 116(1):193-201). 이를 뒷받침하는 것으로, 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 프레세닐린(presenilin) 유전자에서의 돌연변이가 Aβ42의 상대적 수준을 현저히 증가시킴으로써 알츠하이머병(AD)이 발병하기까지의 시간을 단축시키는 것을 보고되었다 (Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:67-99). 그러나, 아밀로이드 침착률이 전체 아밀로이드 수준, 이화작용(catabolism), 및 AD에서 발견되는 바와 같이 연령과 증가된 아밀로이드 수준에 의해 부정적으로 영향을 받는 것으로 밝혀진 CNS로부터의 Aβ 제거 효율에 또한 의존적이라는 것이 강조되어야 한다 (Deane et al (2005) J Neurosci 25(50):11495-11503; Wang et al (2006) Drug Discovery Today 11(19/20): 931-938). 이와 관련하여, 중추신경계(CNS)와 혈장 간의 Aβ의 수송이 뇌 아밀로이드 수준을 조절하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 더욱더 명백해졌는데 (Shibata, et al (2000) J Clin Invest 106 : 1489-1499), Aβ는 LRP-1과 같은 수송 메커니즘에 의해 CNS로부터 혈장으로 신속히 수송되고, Aβ는 RAGE에 결합함으로써 혈장으로부터 CNS로 신속히 이송된다 (Zlokovic BV (2004) J Neurochem 89: 807-811). 따라서, Aβ 펩티드를 사용한 능동 백신접종, 또는 말초 Aβ와 결합함으로써 혈장, CSF 및 CNS 간의 동적 평형을 변화시키는 특정 Aβ 항체의 수동 투여가 개발되고 있는 중이다. 실제로, 이러한 방법들 둘 모두가 Aβ 수준을 낮추고, Aβ 병상(pathology)을 감소시키고, 일부 경우에는 아밀로이드증의 다양한 트랜스제닉 모델(transgenic model)에서 인식력 개선을 제공한다는 것을 입증하는 다수의 실험이 존재한다 (Lemere, CA (2004) Am J Pathology 165: 283-297 Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18 : 44:46).

마우스에서 돌연변이 사람 트랜스진((mutant human transgene)을 과발현시킴으로써 아밀로이드 침착의 동물 모델이 생성되었다. 사람 APP 트랜스진만을 과발현하는 마우스는 전형적으로 12개월령째부터 뇌 플라크-유사(cerebral plaque-like) β-아밀로이드 침착물을 발생시키는 반면 (Games D. et al., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99-102), 돌연변이 사람 APP 및 프레세닐린-1(PS-1) 트랜스진 둘 모두를 함유하는 마우스는 전형적으로 2개월령이라는 이른 시기에 뇌 플라크-유사 β-아밀로이드 침착물을 발생시킨다 (Kurt M.A. et al., (2001) Exp.Neurol. 171: 59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244). 사용된 다양한 트랜스제닉 마우스 모델에서의 이러한 상당한 생물학적 차이는 다양한 방법들의 약리학 및 효율을 비교하는 것을 어렵게 하였다. β-아밀로이드와 이의 다양한 형태들을 표적화하는 면역요법들이 실제로 어떻게 효과를 발휘하는 지에 대해 당 분야에서는 실질적인 합의가 이루어져 있지 않다. 다양한 결합 특성을 지닌 다양한 항체들이 상기 동물 모델에서 가변적인 결과를 지닐 가능성이 크다. 또한, 항체들이 복합 메커니즘에 의해 작용할 수 있고, 공지된 다양한 작용 방식이 상호 배타적이지 않다는 것이 타당한 것으로 여겨진다 (Levites et al (2007) J Clin Invest. 116(1):193-201).

임상에서 뇌 아밀로이드를 표적화하는 최초의 면역 요법제는 능동 백신인 엘란/와이어쓰(Elan/Wyeth)의 AN-1792 이었다. 상기 치료제는 수막뇌염과 일치하는 임상적 징후의 발생 이후에 사용중단(terminated)되었다. 하위집단(subgroup) 분석은 상기 치료제가 인식 기능의 감퇴를 늦추었음을 시사하였다 (Nature Clin Pract Neurol (2005) 1:84-85). 또한, 환자들의 사후 분석은 플라크-제거의 증거를 나타내었다 (Gilman S. et al, (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562).

수동 모노클로날 항체인 바피네우주맙(bapineuzumab) (AAB-001, Elan/Wyeth)이 개발되고 있는 중이다.

증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 다른 질병 또는 장애는 경증 인지력 손상 (Kelley BJ (2007) Neurologic Clinics 25 (3), 577-609), 네덜란드형(Dutch type)의 β-아밀로이드증 관련 유전성 뇌출혈, 뇌 β-아밀로이드 혈관병증 및 다양한 유형의 퇴행성 치매, 예를 들어 파킨슨병, 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질 기저 변성(degeneration) 및 알츠하이머병의 미만성 루이 보디형(diffuse Lewis body type)과 관련된 퇴행성 치매 (Mollenhauer B (2007) J Neural Transm e-published 23 Feb 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5:655-60), 다운증후군 (Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254:22-7), 연령 관련 황반 변성(AMD) (Johnson LV et al (2002) PNAS USA 99: 11830-11835 Anderson DH et al (2004) Exp Eye Res 78: 243-256), "녹내장형" 질병 (Guo L et al (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:13444-13449) 및 Aβ 의존성 백내장 형성 (Goldstein LE et al (2003) Lancet 361:1258-1265 Li G et al (2003) Mol Vision 9: 179-183)을 포함한다.

연령 관련 황반 변성(AMD)은 선진국에서 실명의 주된 원인이다. AMD의 2가지 주요 임상적 형태가 존재한다. 위축성 (건성) AMD는 망막 색소 상피(RPE)와 신경망막의 퇴행을 특징으로 한다. 위축성 AMD의 초기 단계는 RPE 세포층 아래에서의 드루젠(drusen)의 형성과 관련된다. 초기 위축성 AMD는, RPE가 완전히 퇴행하여 뚜렷히 구분되는 RPE 위축 구역을 황반 영역에서 형성하는 말기 질병인 "지도형 위축(geographic atrophy)"으로 진행할 수 있다. 이러한 형태의 질병의 경우, RPE의 퇴행은 황반 간상체(rod)와 추상체(cone)의 2차 사멸을 야기하고, 이 경우 심각한 연령 관련 시력 상실이 초래된다. 일정 비율의 AMD 환자들에서는 그러한 질병의 상이한 형태 또는 또 다른 합병증으로서 간주될 수 있는 질병이 발생한다. AMD 환자들의 약 10 내지 20%에서 맥락막 혈관신생(CNV)이 발생한다. 이렇게 된 경우의 상기 질병의 형태는 "습성(wet) AMD"로서 공지되어 있고, 이는 일부의 가장 심각한 시력 상실과 관련될 수 있다. 습성 AMD의 경우, 신생 맥락막 혈관은 부르크막(Bruch's membrane)의 파괴를 통해 성장하고, RPE 및 신경망막내로 들어가 그 아래에서 증식한다. 전형적인 경우에 있어서, 위축성 AMD가 눈에서 발생한 다음 습성 형태가 발생하지만, 드물게는 신생혈관성 형태가 위축성 형태의 사전 발생없이 발생할 수 있다. 둘 모두의 질병 형태에 있어서, 시력 상실은 광수용체 세포의 사멸로 인해 일어나지만, 습성 AMD의 경우에는 CNV 동안 형성된 누출 혈관(leaky vessel)으로부터의 내부 출혈이 또한 시력 상실을 야기한다. AMD에 대한 요법과 관련하여, 습성 AMD의 일부 양상을 다루기 위한 신규한 치료제를 개발하는 데에 있어서 약간의 진보가 있었는데, 특히 VEGF(혈관 내피 성장 인자) 또는 VEGF 수용체 신호전달 경로를 억제하는 다양한 분자에 의해 CNV로부터의 누출 혈관 출혈을 감소시키는 것이 있다. 그러나, 일반적인 바로 그 위축성 형태의 AMD을 치료하거나 초기 건성 AMD가 지도형 위축 또는 습성 AMD로 진행하지 않게 하는 결정적인 치료 수단은 현재 존재하지 않는다 (Petrukhin K (2007) Expert Opin Ther Targets 11: 625-639).

RPE에서 Aβ의 생성을 일으키는 정확한 메커니즘과 Aβ가 AMD에 작용하여 영향을 미치는 정확한 메커니즘(들)이 완전하게 이해되어 있지 않지만, 증거에 따르면, Aβ와 결합하여 잠재적으로 이를 중화시키거나 단순히 Aβ를 제거하는 약물에 의해 Aβ가 제거되는 경우, AMD에서 드루젠을 제거하고, AMD에서 보체 활성화를 감소시키고, RPE 위축을 감소시키고, 잠재적으로 RPE에서 VEGF 발현이 유도되는 것 그리고 VEGF가 고수준으로 드루젠 주변에 국부화(localisation)되는 것을 감소시키기 위한 가능한 경로를 제공할 수 있다는 것이 암시된다. 따라서, 이러한 요법은 AMD로 인한 시력의 상실 그리고 AMD가 지도형 위축 및/또는 삼출성 AMD로 진행하는 것을 예방하거나, 지연시키거나, 약화시키거나, 반전시키는 수단을 제공할 수 있다. 이는 RPE의 주위 환경에서의 Aβ 함유 드루젠 및/또는 국부적 Aβ의 수준을 감소시킴으로써 AMD의 초기 및 후기 단계 둘 모두를 간섭하고 시력 상실을 야기하는 근원적인 세포 저하를 치료할 수 있다.

최근 간행된 일부 데이터는 AMD의 발생에서 보체 단백질과 아미로이드 베타의 상호작용에 대한 실마리를 제공하였다 (Wang, J. et al., (2008) J. Immunol. 181: 16651-6). 아밀로이드 베타는, 인자 H와 함께 보체 단백질 C3를 C3b 형태에서 이의 비활성 형태인 iC3b로 분해시키는 것을 담당하는 보조인자인 보체 인자 I에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Wang, J. et al., 2008). 아밀로이드 베타가 망막하(sub-retinal) 조직에서의 저등급(low-grade) 만성 염증을 초래하는 보체 인자 I의 기능을 차단함에 의해 드루젠내에서 보체 시스템을 활성화시킨다는 가설을 뒷받침하기 위해 최근 간행된 시험관내 연구로부터의 결과가 제안되었고, 이에 따라 AMD의 발생과 관련된 인자들 중 4가지인 염증, 보체 활성화, 아밀로이드 베타 침착 및 드루젠을 결부시켰다 (Wang, J. et al., 2008). 보체 인자 I에 결합하는 것에 대해 보체 인자 H와 잠재적으로 경합함으로써 또 다른 보체 경로를 활성화시키는 데에 있어서의 아밀로이드 베타의 효과에 대한 이러한 직접적인 증거는 과거에 공지된 바가 없었다 (Wang, J. et al., 2008).

"녹내장형 질병"은 눈의 시신경을 손상시켜서 실명을 초래할 수 있는 질병군에 대해 사용되는 용어이다. 상기 질병은 전세계적으로 실명의 주된 원인으로서 궁극적으로는 안내압(IOP) 증가와 시력 명료도(visual acuity) 감소에 의해 야기된다. IOP와 이것이 어떻게 망막 신경절 세포(RGC)의 아폽토시스를 일으키는 지의 관련성은 잘 이해되어 있지 않다. 높은 IOP는 단독으로 아폽토시스틀 유도할 수 있지만 (Cordeiro M F et al (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13352-13356 Quigley H A et al (1995) Invest Ophtalmol Visual Sci 36:774-786), 그 자체가 시각 뉴런의 세포 사멸의 유일한 원인이 아니다. 또한, 안압 강하제 처리에 따른 IOP의 정상화 후에도 시력이 계속 악화될 수 있는 것으로 관찰되었다 (Oliver JE et al (2002) Am J Ophthamol 133:764-772).

최근에 β-아밀로이드의 잠재적인 세포독성 효과를 녹내장에서의 RGC의 아폽토시스와 결부시키는 보고서가 발표되었다 (McKinnon SJ et al (2002) Invest Ophtamol Visual Sci 43:1077-1087). 동물 녹내장 모델에서, 카스파아제-3 프로테아제가 RGC에서 활성화되어 카스파아제-3에 의한 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적인 프로세싱을 초래함으로써 β-아밀로이드를 포함하는 APP의 잠재적으로 독성인 단편을 생성시킨다는 것이 입증되었다 (McKinnon et al (2002); Cheung ZH et al(2004) Mol Cell Neurosci 25:383-393). 다른 세포들 중에서, RGC가 APP를 발현하는 것으로 밝혀졌고, 따라서 이것이 타당한 β-아밀로이드 공급원인 것으로 여겨진다. 증가된 APP 수준과 증가된 β-아밀로이드 수준 둘 모두가 카스파아제-3를 활성화시키는 것과 관련되었지만, 이는 주로 시험관내 시스템에서 관찰되었다. RGC내의 APP 수준이 또한 녹내장에서 증가함으로써 포지티브 피드백 메커니즘으로 더욱 많은 β-아밀로이드의 생성에 기여하는 지의 여부는 명확하지 않다. 보다 최근에는, 래트 녹내장 모델에서 β-아밀로이드와 RGC의 아폽토시스의 관련성이 제안되었다 (Guo et al (2007)). β-아밀로이드 또는 β-아밀로이드 생산을 표적화하는 수 가지 약물이 시험되었고, 생체내에서 망막 신경절 세포 사멸의 감소를 나타내었으며, 3가지 치료제 모두가 함께 사용된 경우 가능한 약간의 향상 효과가 있었다. 최대 효과는 3가지 약물 모두가 함께 사용된 경우 관찰되는 효과와 거의 필적하는 항-β-아밀로이드 항체를 사용함으로써 관찰되었다.

RGC에서 β-아밀로이드의 생산을 일으키는 정확한 메커니즘 및 IOP와의 관련성이 완전히 이해되어 있지 않지만, 증거에 따르면, β-아밀로이드와 결합하여 잠재적으로 이를 중화시키거나 단순히 β-아밀로이드를 제거하는 약물에 의해 β-아밀로이드가 제거되는 경우, 녹내장에서 RGC 아폽토시스를 예방하기 위한 가능한 경로를 제공하며 이에 따라 녹내장에서 시력 상실을 지연시키거나, 약화시키거나, 반전시키는 수단을 제공할 수 있다는 것이 암시된다. 이는 RGC 및 주위 환경에서 β-아밀로이드의 수준을 감소시킴으로써 시력 상실을 야기하는 근원적인 세포 저하를 해결할 수 있다.

β-아밀로이드는 그 밖의 안구 질병에서 역할을 할 수 있고, 특히 AD 환자에서 관찰되는 핵상(supra-nuclear) 백내장의 형성과 관련되었으며, Aβ 생성 및 프로세싱 경로의 성분들은 수정체내에 존재한다 (Goldstein LE, et al., (2003); Li G, et al., (2003)). 따라서, AMD와 녹내장형 질병에서의 개입(intervention)을 위해 설명된 치료 방법은 Aβ 의존성 백내장 형성의 예방에 적용될 수 있다.

WO 2008/110885는 아밀로이드-β 펩티드에 대해 유도된 억제제를 사용하여 안과적 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 25-34를 포함하는 것으로 여겨지는 Aβ1-40상의 에피토프에 결합하는 항체 6G가 개시되어 있다.

발명의 개요

본 발명의 한 가지 양태에서, β-아밀로이드의 잔기 28-35를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식하는 치료용 항원 결합성 단백질이 제공된다.

특정 구체예에서, 치료용 항원 결합성 단백질은 β-아밀로이드의 잔기 28-34를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식한다.

더욱 특정한 구체예에서, 치료용 항원 결합성 단백질은 β-아밀로이드의 잔기 28-33을 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, β-아밀로이드의 잔기 28-35의 영역내에 존재하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식하는 치료용 항원 결합성 단백질이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, β-아밀로이드의 잔기 28-33, 28-34 또는 28-35로 구성된 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식하는 치료용 항원 결합성 단백질이 제공된다.

본 발명의 구체예에서, 결합을 위해 β-아밀로이드의 잔기 32-33을 필요로 하는 치료용 항원 결합성 단백질이 제공된다.

본 발명의 구체예에서, 치료용 항원 결합성 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합성 단편 및/또는 유도체이다.

본 발명의 구체예에서, β-아밀로이드 펩티드와 결합하며 하기 CDR을 포함하는, 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합성 단편 및/또는 유도체인 치료용 항원 결합성 단백질이 제공된다:

본 발명의 또 다른 구체예에서, β-아밀로이드 펩티드와 특이적으로 결합하며 상기 제시된 서열의 변이체인 CDR을 포함하는 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합성 단편이 제공된다.

CDR 변이체는, 그러한 CDR의 1개 내지 수 개의 아미노산의 결실 또는 치환에 의하거나, 1개 내지 수 개의 아미노산의 그러한 CDR로의 부가 또는 삽입에 의하거나, 이들의 조합에 의한, 그러한 CDR 아미노산 서열의 부분적 변화를 포함한다. 상기 CDR 변이체는 그러한 CDR의 아미노산 서열에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 함유할 수 있다. 상기 CDR 변이체는 그러한 CDR의 아미노산 서열에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있다. 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환일 수 있는데, 예를 들어 하나의 소수성 아미노산이 또 다른 소수성 아미노산으로 치환되는 것이다. 예를 들어, 류신은 발린 또는 이소류신으로 치환될 수 있다.

변이형 CDR을 포함하는 항원 결합성 단백질들은 상기 논의된 CDR을 포함하는 것들과 동일하거나 유사한 기능적 특성을 지닐 것이다. 따라서, 변이형 CDR을 포함하는 항원 결합성 단백질은 본원에 기재된 CDR과 동일하거나 유사한 결합 친화성을 나타내며 동일한 표적 단백질 또는 에피토프와 결합할 것이다.

예시적인 항체는 6F6 뮤린 모노클로날 항체이다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 상기 확인된 6F6의 CDR을 포함하는 사람화(humanized) 또는 키메라 항체가 제공된다. 예를 들어, 키메라 항체는 6F6 뮤린 항체의 가변 영역, 즉, SEQ ID No:19 (V_H) 및 SEQ ID No:21 (V_L)을 포함할 수 있다. 뮤린 6F6을 기반으로 하는 사람화 항체의 예는 SEQ ID No:27을 지닌 중쇄와 SEQ ID No:28을 지닌 경쇄를 포함하는 항체이다.

본 명세서 전반에 걸쳐서, 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"은 문헌 [Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987]에 제시된 Kabat 번호매김 시스템을 따른다. 따라서, 하기와 같이 본 발명에 따른 CDR이 규정된다:

CDR: 잔기

CDRH1: 31-35

CDRH2: 50-65

CDRH3: 95-97

CDRL1: 24-34

CDRL2: 50-56

CDRL3: 89-97

IGHV1-24 (SEQ ID No:13)는 V_H CDR을 그래프팅(grafting)하기 위한 적절한 억셉터(acceptor) 프레임워크인 사람 생식선 서열이다. 특정한 양태에서, 사람 억셉터 중쇄 프레임워크는 IGHV1-24로부터 유래된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 사람 억셉터 프레임워크는 전장에 걸쳐서 (CDR 서열은 제외됨) 뮤린 6F6 중쇄 가변 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 지닌 사람 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

아미노산 및 핵산 서열의 경우, "동일한" 또는 "서열 동일성"이란 용어는 적절한 삽입 또는 결실과 관련하여 최적으로 정렬되고 비교된 경우 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열 간의 동일성 정도를 나타낸다. 또한, DNA 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 그 가닥의 상보가닥에 하이브리드화되는 경우 상당한 동일성이 존재한다. 2개 서열 간의 동일성 퍼센트는, 그러한 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 개수 및 각각의 갭의 렝쓰(length)를 고려한, 상기 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 개수의 함수 (즉, % 동일성 = 동일한 위치 개수/전체 위치 개수 X 100)이다. 서열들의 비교 및 2개 서열 간의 동일성 퍼센트의 측정은 하기 설명된 수학적 알고리듬을 사용하여 달성될 수 있다.

2개의 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 퍼센트는, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 웨이트(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 렝쓰 웨이트(length weight)를 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는, PAM120 웨이트 잔기 표, 12의 갭 렝쓰 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하는, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)으로 통합된 이. 메어어스(E. Meyers)와 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리듬 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 또한 측정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 웨이트 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 렝쓰 웨이트를 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램으로 통합된 니들만(Needleman)과 분쉬(Wunsch) (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리듬을 사용하여 측정될 수 있다.

예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 기재된 기준 폴리뉴클레오티드 서열과 동일할 수 있고, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 상기 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있는데, 예를 들어 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 트랜지션(transition)과 트랜스버젼(transversion)을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변화는 상기 기준 서열의 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 산재되거나 상기 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로 상기 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 뉴클레오티드 변화의 개수는, 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 뉴클레오티드 개수와 각각의 동일성 퍼센트의 퍼센트 수치 (100으로 나눈 값)를 곱한 후, 상기 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 상기 전체 핵산 개수에서 이러한 적(積)을 뺌으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다:

n _n≤x _n - (x _n·y)

상기 식에서, n _n은 뉴클레오티드 변화의 개수이고, x _n는 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 뉴클레오티드 개수이고, y는, 50%인 경우 0.50이고, 60%인 경우 0.60이고, 70%인 경우 0.70이고, 75%인 경우 0.75이고, 80%인 경우 0.80이고, 85%인 경우 0.85이고, 90%인 경우 0.90이고, 95%인 경우 0.95이고, 98%인 경우 0.98이고, 99%인 경우 0.99이고, 100%인 경우 1.00이다. ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이며, x _n과 y의 임의의 정수 이외의 적(積)은 x _n로부터의 뺄셈 전에 우수리를 잘라서 최근접 정수가 되게 한다.

유사하게는, 폴리펩티드 서열은 본원에 기재된 폴리펩티드 기준 서열과 동일할 수 있고, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 상기 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있는데, 동일성 %는 100% 미만, 예를 들어 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다. 이러한 변화는 하나 이상의 아미노산 결실, 보존적 치환과 비보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변화는 상기 기준 서열의 아미노산 사이에 개별적으로 산재되거나 상기 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로 상기 기준 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 아미노산 변화의 개수는, 본원에 기재된 폴리펩티드 기준 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 서열의 전체 아미노산 개수와 각각의 동일성 퍼센트의 퍼센트 수치 (100으로 나눈 값)를 곱한 후, 상기 폴리펩티드 기준 서열의 상기 전체 아미노산 개수에서 이러한 적(積)을 뺌으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다:

n _a≤x _a - (x _a·y)

상기 식에서, n _a은 아미노산 변화의 개수이고, x _a는 폴리펩티드 서열의 전체 아미노산 개수이고, y는, 50%인 경우 0.50이고, 60%인 경우 0.60이고, 70%인 경우 0.70이고, 75%인 경우 0.75이고, 80%인 경우 0.80이고, 85%인 경우 0.85이고, 90%인 경우 0.90이고, 95%인 경우 0.95이고, 98%인 경우 0.98이고, 99%인 경우 0.99이고, 100%인 경우 1.00이다. ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이며, x _a와 y의 임의의 정수 이외의 적(積)은 x _a로부터의 뺄셈 전에 우수리를 잘라서 최근접 정수가 되게 한다.

% 동일성은 서열의 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.

완전한 V-영역을 구성하기 위해, 프레임워크 4가 생식선 엔코딩된 V-유전자 IGHV1-24에 부가되어야 한다. 적절한 프레임워크 4 서열은 사람 JH4 minigene (Kabat)에 의해 엔코딩된 하기 서열을 포함한다:

YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No:15)

생식선 V 유전자와 J 유전자가 중쇄 CDR3 전체에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다는 것이 당업자에 의해 인식되어 있다. 그러나, 본 발명의 항체의 경우, 전체 중쇄 CDR3가 도너(donor) 면역글로불린에 의해 제공된다. 따라서, IGHV1-24와 같은 VH 유전자, JH4와 같은 JH minigene, 그리고 SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 및 SEQ ID No:3과 같은 일련의 중쇄 CDR을 조합 (완전 재배열된 성숙한 중쇄 가변 영역을 의태(mimic)하는 방식으로 어셈블링됨)하는 것이 본 발명의 중쇄 가변 영역을 형성하기에 충분하다.

IGKV2-28 (SEQ ID No:16)은 V_L CDR을 그래프팅하기 위한 적절한 억셉터 프레임워크이다. 특정한 양태에서, 사람 억셉터 경쇄 프레임워크는 IGKV2-28로부터 유래된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 사람 억셉터 프레임워크는 전장에 걸쳐서 (CDR 서열은 제외됨) 뮤린 6F6 경쇄 가변 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 지닌 사람 경쇄 가변 영역을 포함한다.

완전한 V-영역을 구성하기 위해, 프레임워크 4가 생식선 엔코딩된 V-유전자 IGKV2-28에 부가되어야 한다. 적절한 프레임워크 4 서열은 사람 JK-1 minigene (Kabat)에 의해 엔코딩된 하기 서열을 포함한다:

WTFGQGTKVEIK (SEQ ID No:18)

생식선 V 유전자와 J 유전자가 경쇄 CDR3 전체에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다는 것이 당업자에 의해 인식되어 있다. 그러나, 본 발명의 항체의 경우, 전체 CDR3 서열이 도너 면역글로불린에 의해 제공된다. JK-1 minigene 잔기들 중 처음 2개의 잔기가 CDR3 영역에 포함된다. JK-1 minigene의 경우, 상기 2개의 잔기는 경쇄 CDRL3 (SEQ ID No:6)의 마지막 2개의 잔기와 동일하다. 따라서, IGKV2-28와 같은 V_L 유전자, JK-1과 같은 FR4, 그리고 SEQ ID No:4, SEQ ID No:5 및 SEQ ID No:6과 같은 일련의 경쇄 CDR을 조합 (완전 재배열된 성숙한 경쇄 가변 영역을 의태하는 방식으로 어셈블링됨)하는 것이 본 발명의 경쇄 가변 영역을 형성하기에 충분하다.

본 발명의 특정 구체예에서, 사람 억셉터 중쇄 프레임워크는 IGHV1-24와 JH4 minigene으로부터 유래되고, 사람 억셉터 경쇄 프레임워크는 서열 SEQ ID No:19를 지닌 도너 V_H 도메인 및 β-아밀로이드 펩티드에 대한 도너 항체의 결합 친화성을 전부 보유하거나 실질적으로 전부 보유하는 서열 SEQ ID No:21을 지닌 V_L 도메인에서 발견되는 상응하는 잔기들을 기준으로 하여 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환을 함유하거나 함유하지 않는 IGKV2-28과 JK-1 minigene으로부터 유래된다. "결합 친화성의 실질적으로 전부"라 함은 치료용 항체가 도너 항체와 비교하여 결합 친화성이 5배 이하, 더욱 특히 2배 감소됨을 의미한다.

본 발명의 더욱 특정한 구체예에서, IGHV1-24와 JH4로부터 유래된 사람 억셉터 중쇄 프레임워크는 하기 잔기들로부터 선택된 하나 이상, 예를 들어 1개 내지 15개, 더욱 특히 2개 내지 15개의 아미노산 잔기 치환 (또는 이들의 보존적 치환)을 지닌다:

더욱 특정한 구체예에서, IGHV1-24와 JH4로부터 유래된 사람 억셉터 중쇄 프레임워크는 하기 잔기들 (또는 이들의 보존적 치환체)를 포함한다:

본 발명의 더욱 특정한 구체예에서, IGKV2-28과 JK-1로부터 유래된 사람 억셉터 경쇄 프레임워크는 하기 잔기들로부터 선택된 하나 이상, 예를 들어 1개 내지 4개, 더욱 특히 2개의 아미노산 잔기 치환 (또는 이들의 보존적 치환)을 지닌다:

본 발명의 더욱 특정한 구체예에서, IGKV2-28과 JK-1로부터 유래된 사람 억셉터 경쇄 프레임워크는 하기 잔기들 (또는 이들의 보존적 치환체)를 포함한다:

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:24에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:26에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:24에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:26에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:59에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:67에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:61에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:67에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:63에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:67에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:65에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:67에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:59에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:69에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:61에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:69에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:63에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:69에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:65에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:69에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:59에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:71에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:61에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:71에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:63에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:71에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:65에 제시된 서열을 지닌 V_H 도메인과 SEQ ID No:71에 제시된 서열을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

항체 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:24, 59, 61, 63 또는 65 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 지닐 수 있다. 항체 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:26, 67, 69 또는 71 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 지닐 수 있다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:27에 제시된 서열을 지닌 중쇄를 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:28에 제시된 서열을 지닌 경쇄를 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, SEQ ID No:27에 제시된 서열을 지닌 중쇄와 SEQ ID No:28에 제시된 서열을 지닌 경쇄를 포함하는 치료용 항체가 제공된다.

중쇄 가변 영역들 중 어느 영역이든 적절한 사람 불변 영역과 조합될 수 있다. 경쇄 가변 영역들 중 어느 영역이든 적절한 불변 영역과 조합될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 치료용 항원 결합성 단백질은, 전형적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 기능 a) 및 항체 의존성 세포독성을 매개하는 기능 b)이 본질적으로 결여된, 항체 또는 이의 단편 및/또는 유도체이다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 치료용 항원 결합성 단백질 또는 치료용 항체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 치료용 항원 결합성 단백질 또는 치료용 항체를, β-아밀로이드 펩티드 관련 질병에 걸린 사람 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 구체예에서, β-아밀로이드 펩티드 관련 질병은 알츠하이머병이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, β-아밀로이드 펩티드 관련 질병은 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 눈 또는 시신경에 영향을 미치는 질병이다. 상세하게는, β-아밀로이드 펩티드 관련 질병은 연령 관련 황반 변성(AMD), 녹내장 또는 β-아밀로이드 의존성 백내장 형성이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 치료용 항원 결합성 단백질은 다음과 같은 보체 경로의 억제제와 함께 투여되는데, 상기 보체 경로는 특히 예를 들어 보체 대체 경로(alternative complement pathway)이지만 다른 항-보체 방법이 제외되는 것은 아니다: 보체 인자(complement factor) H(CFH) 또는 이의 단편, 가용성 보체 수용체 1(sCR1) 또는 이의 단편, 가용성 막 보조인자(co-factor) 단백질(MCP) 및 이의 단편, 가용성 붕괴 촉진 인자(decay accelerating factor, DAF) 및 이의 단편. 이와 관련하여, 보체 경로 억제제는 보체 경로, 특히 보체 대체 경로의 활성을 네거티브하게 조절하는 역할을 분자이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 치료용 항원 결합성 단백질은 다음과 같은 보체 경로 활성화제의 억제제와 병용하여 투여되는데, 그러한 억제제는 특히 예를 들어 보체 대체 경로 활성화제의 억제제이지만 다른 억제 방법 또는 다른 보체 경로 표적이 제외되는 것은 아니다: 보체 인자 D(CFD) 또는 보체 인자 B(CFB) 활성을 중화시키는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 도메인 항체. 또한, 보체 성분 C3의 13-잔기 펩티드 억제제인 콤프스타틴(compstatin)과 항-C5a 보체 성분 항체인 펙셀리주맙(pexelizumab)이 본 발명과 관련하여 보체 경로 활성화제의 억제제인 것으로 간주된다. 일반적으로, 보체 경로 활성화제의 억제제는, 보체 경로, 특히 보체 대체 경로의 활성을 네거티브하게 조절하는 효과를 발휘하도록 소정의 보체 활성화제의 생물학적 활성을 어느 정도 억제하거나 길항하는 작용제이다.

보체 표적화 치료 방법은 최근 재검토되었고 (Ricklin, D & Lambris, J. (2007) Nature Biotechnology 25:1265-75, 전문이 본원에 참조로 포함됨), 상기 문헌에 기재된 모든 항-보체 경로 방법들은 치료 방법을 제공하기 위해 잠재적으로 항-아밀로이드 베타 항체와 병용하여 사용될 수 있다. 고려되는 항-보체 방법은, (i) 프로테아제 억제제, 예를 들어 보체 인자 D 억제제, (ii) 가용성 보체 조절제, 예를 들어 트렁케이션된 가용성 보체 수용체 1, (iii) 치료용 항체, 예를 들어 보체 인자 D 또는 B에 대한 치료용 항체, (iv) 보체 성분 억제제, 예를 들어 C5 억제제, 및 (v) 수용체 길항제, 예를 들어 소분자(small molecule) C5a 수용체 길항제를 포함한다.

보체 경로 억제제, 또는 보체 경로 활성화제의 억제제는, 본 발명의 치료용 항원 결합성 단백질과 동시에 투여될 수 있거나, 순차적으로, 개별적으로 또는 간격을 두고 투여될 수 있다.

또한, 본원에 규정된 치료용 항원 결합성 단백질과 보체 경로 억제제 또는 보체 경로 활성화제의 억제제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.

또한, β-아밀로이드 펩티드 관련 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 치료용 항원 결합성 단백질 또는 치료용 항체의 용도가 제공된다.

또한, 상기 기재된 β-아밀로이드의 잔기 28-35를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프와 같은 β-아밀로이드에 대해 제 1 특이성을 지니고 보체 경로의 활성화제에 대해 제 2 특이성을 지닌 이중특이적(bispecific) 항체 또는 이의 이중특이적 단편이 제공된다.

또한, β-아밀로이드 펩티드 관련 질병을 치료하는 데에 사용되는, 본 발명의 항원 결합성 단백질, 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 이중특이적 항체 또는 이의 이중특이적 단편이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열 SEQ ID No:19을 지닌 뮤린 V_H 도메인과 서열 SEQ ID No:21을 지닌 뮤린 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열 SEQ ID No:19, 특히 SEQ ID No:20의 폴리뉴클레오티드를 지닌 V_H 도메인을 포함하는, 항체 중쇄 또는 이의 단편을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열 SEQ ID No:21, 특히 SEQ ID No:22의 폴리뉴클레오티드를 지닌 V_L 도메인을 포함하는, 항체 경쇄 또는 이의 단편을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 양태에 있어서, ELISA 검정에서 β-아밀로이드에 결합하는 데에 있어서, SEQ ID No:27에 제시된 서열을 지닌 중쇄와 SEQ ID No:28에 제시된 서열을 지닌 경쇄를 포함하는 항체와 경합하는 항원 결합성 단백질이 제공된다.

당업자는 항원 결합성 단백질 (항원 결합성 단백질 A)이 SEQ ID No:27에 제시된 서열을 지닌 중쇄와 SEQ ID No:28에 제시된 서열을 지닌 경쇄를 포함하는, 특이적 결합 부위 (β-아밀로이드)에 대한 항체 (항체 B)와 경합하기 위해서는 항원 결합성 단백질 A가 상기 검정에서 효과를 나타내기에 충분한 양으로 존재해야 함을 인식하고 있다. 특정 구체예에서, 항원 결합성 단백질 A와 항체 B는 등몰량으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합성 단백질 A의 존재는 ELISA 검정에서 항체 B가 β-아밀로이드에 결합하는 것을 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, β-아밀로이드는 ELISA 검정에서 면역검정 플레이트에 결합되어 있다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합성 단백질 A는 항체 B가 플레이트에 결합된 β-아밀로이드에 결합하는 것을 감소시키지만, β-아밀로이드에 특이적이지 않은 대조표준은 그렇게 하지 못한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 항원 결합성 단백질은 각각 SEQ ID No:27 및 SEQ ID No:28의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 치료용 항체인데, 이러한 항체는 β-아밀로이드와 결합한다. 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 β-아밀로이드의 잔기 28-35를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정한 경우 β-아밀로이드의 잔기 24-35 (SEQ ID No:10) 또는 28-39 (SEQ ID No:11)를 포함하는 C-말단 바이오티닐화된(biotinylated) β-아밀로이드 펩티드에 결합하는 항원 결합성 단백질이 제공되는데, 이러한 펩티드는 스트렙타비딘 센서 칩(streptavidin sensor chip)에 결합되어 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, β-아밀로이드에 특이적으로 결합하며, 결합을 위해 β-아밀로이드의 28-35 영역에 있는 하나 이상의 잔기를 필요로 하는, 항원 결합성 단백질, 상세하게는 모노클로날항체 또는 이의 단편이 제공된다. 바람직한 구체예에서, 상기 항원 결합성 단백질은, 결합을 위해, β-아밀로이드의 28-35 영역에 있는 상기 하나 이상의 잔기에 대해 하나 이상의 플랭킹(flanking) 잔기 또는 구조적으로 인접한(structurally neighbouring) 잔기를 추가로 필요로 한다. 따라서, 상기 항원 결합성 단백질은 별도로 β-아밀로이드의 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35, 및 플랭킹 또는 구조적으로 인접한 잔기들로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 잔기를 필요로 할 수 있다.

당업자는, 예를 들어 ELISA 검정에서 알라닌 대체 스캐닝(alanine replacement scanning)을 이용하여, 이러한 항원 결합성 단백질을 용이하게 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 항원 결합성 단백질이 결합을 위해 β-아밀로이드의 28-35 영역에 있는 잔기, 또는 플랭킹 또는 구조적으로 인접한 잔기를 필요로 하는 지의 여부는 β-아밀로이드의 상기 잔기를 알라닌으로 치환하고 이렇게 알라닌 치환된 β-아밀로이드 펩티드에 대한 상기 항원 결합성 단백질의 결합 친화도를 야생형 β-아밀로이드에 대한 상기 항원 결합성 단백질의 결합 친화도와 비교함으로써 결정될 수 있다. β-아밀로이드의 28-35 영역에 있는 잔기가 필요한 지의 여부는 야생형 β-아밀로이드 펩티드와 비교하여 알라닌 치환된 β-아밀로이드 펩티드에 대한 항원 결합성 단백질의 결합 친화도가 감소하는 것에 의해 결정되는데, 상기 감소는 Biacore 또는 ELISA 친화도 측정법에 의해 측정한 경우 1배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상 또는 5배 이상이다.

또한, 이와 관련하여 구조적으로 인접한 잔기는, 3차원 공간에서 해당 잔기와 매우 근접한 위치에 있으며 상기 항원 결합성 단백질에 결합되어 있는 잔기이다. 당업자는 항원 에피토프가 선형 또는 비선형 펩티드 서열일 수 있음을 인식하고 있다. 비선형 펩티드 서열인 경우, 잔기들은 펩티드의 사슬의 다양한 영역들로부터 유래되지만, 이러한 잔기들은 항원의 3차원 구조에서 매우 근접한 위치에 존재할 수 있다. 이러한 구조적으로 인접한 잔기들은 컴퓨터 모델링 프로그램을 통해 결정되거나, X선 결정학과 같은 당 분야에 공지된 방법들을 통해 수득된 3차원 구조에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 숙주 세포에서 본 발명에 따른 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함하여 상기 항체를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID No:24에 제시된 서열을 지닌 V_H 사슬을 포함하는 치료용 항체 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID No:26에 제시된 서열을 지닌 V_L 사슬을 포함하는 치료용 항체 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID No:27에 제시된 서열을 지닌 치료용 항체 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID No:28에 제시된 서열을 지닌 치료용 항체 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 더욱 특정한 양태에서, SEQ ID No:29에 제시된 서열을 포함하는, 치료용 항체 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 더욱 특정한 구체예에서, SEQ ID No:30에 제시된 서열을 포함하는, 치료용 항체 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 6F6 항체 또는 6E10 (사람 Aβ 1-16에 대해 특이적인 항체; 시판 시약, Eurogentec) 및 5G5 (Aβ1-42에 대해 특이적인 항체; 인하우스(in house) 시약)를 사용한, 다양한 형태의 베타 아밀로이드의 웨스턴 블롯 검출을 도시한다.

도 2는 평균±평균의 표준 오차로서 표현된 피질 플라크 면적 %로 표현된 17mg/kg 또는 33mg/kg 6F6에 의한 처리 후의 트랜스제닉 hAPP 마우스 뇌의 피질 및 해마 절편내의 플라크 로드(load)를 도시하는 막대 도표이다.

도 3은 평균±평균의 표준 오차로서 표현된 mm² 당 플라크 개수로 표현된 17mg/kg 또는 33mg/kg 6F6에 의한 처리 후의 트랜스제닉 hAPP 마우스 뇌의 피질 및 해마 절편내의 플라크 로드를 도시하는 막대 도표이다.

도 4는 노화된(aged) CFH -/- 마우스의 망막에서의 아밀로이드 베타의 검출을 도시한다.

도 5는 노화된 CFH -/- 마우스의 망막에서의 아밀로이드 베타에 대한 6F6의 교차반응성을 도시한다.

발명의 상세한 설명

1. 항원 결합성 단백질

본원에 사용된 "항원 결합성 단백질"이란 용어는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 구조물(construct), 예를 들어 도메인, 상세하게는 하기 추가로 논의되는 바와 같이 β-아밀로이드에 결합할 수 있는 것들을 지칭한다.

1.1 무손상 항체

본 발명의 항원 결합성 단백질은 "무손상 항체"일 수 있다. 본 발명의 항원 결합성 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합성 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체를 포함한다. 일반적으로, 무손상 항체는 적어도 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 이종다합체성(heteromultimeric) 당단백질이다. IgM 뿐만 아니라, 무손상 항체는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150KDa의 헤테로사합체성 당단백질이다. 전형적으로, 각각의 경쇄는 1개의 이황화물 공유 결합에 의해 중쇄에 결합되지만, 다양한 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 간의 이황화물 결합의 개수는 달라진다. 또한, 각각의 중쇄와 경쇄는 쇄내(intrachain) 이황화물 다리를 지닌다. 각각의 중쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인(V_H)를 지니고 이어서 다수의 불변 영역들을 지닌다. 각각의 경쇄는 가변 도메인(V_L)과 불변 영역을 이의 다른쪽 단부에 지니는데, 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 첫 번째 불변 영역과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 대부분의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(Kappa)와 람다(Lambda)라 일컬어지는 2개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 사람 항체는 이의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 상이한 부류로 지정될 수 있다. IgG와 IgA는 각각 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4과 IgA1 및 IgA2으로 추가로 세분될 수 있다. 마우스와 래트 간에 적어도 IgG2a, IgG2b를 지닌 종 변이체가 존재한다. 항체의 가변 도메인은 항체에 결합 특이성을 부여하는데, 이는 상보성 결정 영역(CDR)이라 일컬어지는 특정 가변성을 나타내는 어떤 영역들을 지닌다. 가변 영역의 보다 보존되는 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 일컬어진다. 무손상 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접한 상태로 함께 유지되고, 나머지 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합성 부위의 형성에 기여한다. 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는 데에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타내는데, 예를 들어 항체 의존성 세포매개성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), Fcγ 수용체와의 결합에 의한 식세포작용(phagocytosis), 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의한 반감기/제거율 및 보체 캐스케이드(cascade)의 C1q 성분에 의한 보체 의존성 세포독성에 참여한다. 사람 IgG2 불변 영역은 전형적 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력 또는 항체 의존성 세포독성을 매개하는 능력을 본질적으로 결여하는 것으로 보고되었다. IgG4 불변 영역은 전형적 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력을 결여하는 것으로 보고되었고, 항체 의존성 세포독성을 약한 정도로만 매개한다. 이러한 이펙터 기능이 본질적으로 결여된 항체는 "비용해성(non-lytic)" 항체로 명명될 수 있다.

1.1.1 사람 항체

본 발명의 항원 결합성 단백질은 사람 항체일 수 있다. 사람 항체는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 사람 항체는 사람 골수종 또는 마우스-사람 이종골수종(heteromyeloma) 세포주를 사용하는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다 (참조: Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984) 및 Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). 대안적 방법들은 파아지 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스를 사용하는 것을 포함하는데, 이 둘 모두는 사람 V 영역 레퍼토리(repertory)를 이용한다 (참조: Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23).

마우스 면역글로불린 유전자좌가 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트로 대체된 수 가지의 트랜스제닉 마우스 계통(strain)이 현재 이용가능하다 (참조: Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). 항원 공격(challenge)시에, 이러한 마우스는 사람 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있고, 이러한 레퍼토리로부터 관심있는 항체가 선택될 수 있다.

특히 주목되는 것으로는, 방사선조사된(irradiated) 마우스내로 사람 림프구가 이식된 트리메라(Trimera^TM) 시스템 (참조: Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161), 대량의 풀링된(pooled) 시험관내 항체 생성 과정에 이은 디컨볼루티드(deconvulated) 제한 희석과 선별 과정을 통해 사람 (또는 다른 종) 림프구가 효과적으로 배치되는 셀렉티드 림포싸이트 안티바디 시스템(Selected Lymphocyte Antibody System, SLAM; 참조: Babcook et al, PNAS (1996) 93:7843-7848) 및 제노마우스(Xenomouse) II (Abgenix Inc)가 있다. 또 다른 방법은 모르포도마(Morphodoma^TM) 기술을 사용하는 Morphotek Inc로부터 이용가능하다.

사람 항체 (및 이의 단편)를 생성시키기 위해 파아지 디스플레이 기술이 이용될 수 있다 (참조: McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) and Griffiths AD et al(1994) EMBO 13:3245-3260). 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파아지의 주(major) 또는 부(minor) 외피 단백질 유전자내로 인프레임(in frame) 클로닝되어 파아지 입자의 표면상에 작용성 항체 단편으로서 디스플레이된다 (일반적으로 헬퍼 파아지의 도움을 받음). 항체의 작용 특성을 기초로 한 선별법은 그러한 특성을 나타내는 항체를 엔코딩하는 유전자가 선별되게 한다. 상기 기재된 질병 또는 장애을 앓는 사람으로부터 수득되거나 면역되지 않은 사람 도너로부터 수득된 사람 B 세포로부터 제조된 라이브러리로부터 항원 특이적 항체를 선별하기 위해 파아지 디스플레이 기술이 이용될 수 있다 (참조: Marks; J.Mol.Biol. 222,581-597, 1991). Fc 도메인을 포함하는 무손상 사람 항체가 요망되는 경우, 요망되는 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 벡터내로 파아지 디스플레이 유래 단편을 리클로닝(recloning)하여 안정적인 발현 세포주를 확립할 필요가 있다.

결합 친화도를 개선시키기 위해 친화도 성숙(affinity maturation) 기술이 이용될 수 있다. 이는 예를 들어 H 및 L 쇄 V 영역을 천연 변이체로 순차적으로 대체하고 개선된 결합 친화도를 기초로 하여 선별함으로써 달성될 수 있다 (Marks Bio/technol 10,779-783 (1992). "에피토프 임프린팅(epitope imprinting)"과 같은 이러한 기술의 변형법이 또한 이용가능하다 (WO 93/06213, Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993)). 보다 최근에는, 예를 들어 오류 유발(error prone) RNA 레플리카아제(replicase)를 사용함에 의한 V 영역 또는 CDR의 무작위 돌연변이에 이은 리보솜 디스플레이 선별 기술에 의한 이러한 라이브러리로부터의 선별에 의해 친화도 성숙된 항체가 수득되었다 (Kopsidas G BMC Biotechnology. 7:18, 2007).

1.1.2 키메라 및 사람화 항체

본 발명의 항원 결합성 단백질은 "키메라" 또는 "사람화" 항체일 수 있다. 사람 질병 또는 장애의 치료에서 무손상 비-사람(non-human) 항체를 사용하는 것은 특히 그러한 항체의 반복 투여시에 발생하는 지금은 잘 규명되어 있는 문제인 잠재적 면역원성 문제를 안고 있는데, 즉, 환자의 면역계는 무손상 비-사람 항체를 비-자기(non-self)로서 인식하여 중화 반응을 개시시킬 수 있다. 완전한 사람 항체를 개발하는 것 (상기 참조)에 더하여, 상기 문제를 극복하기 위해 수 년에 걸쳐 다양한 기술들이 개발되었는데, 이러한 기술들은 대체로 치료용 무손상 항체에서 비-사람 아미노산 서열의 조성을 감소시키며 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 면역된 동물로부터 비-사람 항체를 수득하는 데에 있어서의 상대적 용이성을 유지하는 것을 포함한다. 이를 달성하기 위해 넓게는 2개의 방법이 사용되어 왔다. 첫 번째 방법은 키메라 항체인데, 이는 일반적으로 사람 불변 영역에 융합된 비-사람 (예를 들어, 마우스와 같은 설치류) 가변 도메인을 포함한다. 항체의 항원-결합 부위가 가변 영역내에 위치하기 때문에, 키메라 항체는 항원에 대한 이의 결합 친화성을 보유하지만 사람 불변 영역의 이펙터 기능을 획득함으로써 상기 설명된 바와 같이 이펙터 기능을 수행할 수 있다. 전형적으로 키메라 항체는 재조합 DNA 방법을 이용하여 생성된다. 항체를 엔코딩하는 DNA (예를 들어, cDNA)가 분리되고 통상적인 절차를 이용하여 시퀀싱된다 (예를 들어, 본 발명의 항체의 H 및 L 쇄 가변 영역을 엔코딩하는 유전자, 예를 들어 상기 설명된 SEQ ID No:19 및 21의 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함에 의해). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 전형적인 공급원으로서 기능한다. 분리된 경우, DNA는 발현 벡터내로 넣어진 후, 다른 경우에는 면역글로불린 단백질을 생성하지 못하는 숙주 세포, 예를 들어 E.Coli, COS 세포, CHO 세포, PerC6 세포 또는 골수종 세포내로 트랜스펙션되어, 항체가 합성된다. DNA는 사람 L 및 H 쇄에 대한 코딩 서열로 상응하는 비-사람 (예를 들어, 뮤린) H 및 L 불변 영역을 치환함으로써 변형될 수 있다 (참조: Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)). 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열 SEQ ID No:19를 지닌 V_H 도메인과 사람 불변 영역에 융합된 서열 SEQ ID No:21을 지닌 V_L 도메인을 포함하는 키메라 항체가 제공된다 (IgG 이소타입, 예를 들어 IgG1일 수 있음).

두 번째 방법은 가변 영역을 사람화시킴으로써 항체의 비-사람 성분이 감소된 사람화 항체를 생성시키는 것을 포함한다. 2가지 사람화 기술이 관심을 끌었다. 첫 번째는 CDR 그래프팅에 의한 사람화이다. CDR은 항체의 N-말단 근처에서 루프를 이루고, 여기에서 프레임워크 영역에 의해 제공된 스캐폴드(scaffold)에 마운팅된(mounted) 표면을 형성한다. 항체의 항원-결합 특이성은 주로 토포그래피(topography) 및 항체의 CDR 표면의 화학적 특성에 의해 정해진다. 따라서, 이러한 특징들은 개개의 CDR의 형태, CDR의 상대적 배치, 및 CDR을 포함하는 잔기들의 측쇄의 성질과 배치에 의해 결정된다. 면역원성의 커다란 감소는 비-사람 (예를 들어, 뮤린) 항체 ("도너" 항체)의 CDR만을 적절한 사람 프레임워크 ("억셉터 프레임워크")와 불변 영역상으로 그래프팅시킴으로써 달성될 수 있다 (참조: Jones et al (1986) Nature 321,522-525 and Verhoeyen M et al(1988) Science 239, 1534-1536). 그러나, CDR 그래프팅은 그 자체로서 항원-결합 특성의 완전한 보유를 초래할 수 없고, 현저한 항원-결합 친화성이 회복되어야 하는 경우 사람화 분자에서 도너 항체의 일부 프레임워크 잔기들이 보존될 필요가 있다 (때대로 "복귀돌연변이(backmutation)"라고 지칭됨)는 것이 자주 관찰된다 (참조: Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al(1991) Nature 351, 501-502). 이러한 경우, 사람 프레임워크(FR)를 제공하기 위해, 비-사람 도너 항체에 대해 최대의 서열 상동성 (전형적으로 60% 이상)을 나타내는 사람 V 영역이 데이터베이스로부터 선택될 수 있다. 사람 FR의 선택은 사람 컨센서스(consensus) 또는 개개의 사람 항체로부터 이루어질 수 있다. 필요한 경우, CDR 형태를 보존하기 위해, 도너 항체로부터의 핵심 잔기들이 사람 억셉터 프레임워크내로 치환된다. 이러한 구조적으로 중요한 잔기들을 확인하는 것을 보조하기 위해 항체의 컴퓨터 모델링이 이용될 수 있다 (참조: WO99/48523).

또한, 사람화는 "베니어링(veneering)" 공정에 의해 달성될 수 있다. 독특한 사람 및 뮤린 면역글로불린 중쇄와 경쇄 가변 영역의 통계 분석은 노출된 잔기들의 정밀한 패턴이 사람과 뮤린 항체에서 상이하고 대부분의 개개의 표면 위치가 소수의 상이한 잔기들에 대한 강력한 선호(preference)를 나타낸다는 것을 밝혀주었다 (참조: Padlan E.A. et al (1991) Mol.Immunol.28, 489-498 and Pedersen J.T. et al (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973). 따라서, 사람 항체에서 통상적으로 발견되는 잔기들과 상이한, 비-사람 Fv의 프레임워크 영역내의 노출된 잔기를 대체함으로써 상기 비-사람 Fv의 면역원성을 감소시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성이 표면 접근성과 상호관련될 수 있으므로, 표면 잔기들을 대체하는 것이 사람 면역계가 마우스 가변 영역을 "발견하지 못하게(invisible)" 하기에 충분할 수 있다 (참조: Mark G.E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134). 이러한 사람화 절차는 "베니어링"이라 지칭되는데, 이는 항체의 표면만이 변화될 뿐이고 지탱하고 있는 잔기들은 영향을 받지 않은 상태로 존재하기 때문이다. 추가의 대안적인 방법들로는 WO04/006955에 제시된 방법 및 세균 발현 시스템을 사용하여 서열면에서 사람 생식선(human germline)에 가까운 항체를 생성시키는 Humaneering^TM (Kalobios) 절차가 있다 (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego,California).

"유래된"이라는 용어가 물질에 대한 물리적 기원이라는 의미에서 공급원(source)을 규정할 뿐만 아니라 그러한 물질과 구조적으로 동일하지만 참조 공급원(reference source)으로부터 비롯되지 않은 물질도 규정하고자 한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, "도너 항체에서 발견되는 잔기들"은 반드시 도너 항체로부터 정제된 것일 필요가 없다.

특정한 아미노산 치환은 "보존적"인 것으로 간주된다는 것이 당 분야에 널리 인식되어 있다. 아미노산은 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 몇몇 군으로 분류되고, 본 발명의 치료용 항체의 결합 친화성을 전부 보유하거나 실질적으로 전부 보유하는 군내에서의 치환은 보존적 치환으로서 간주되는데, 이에 대해서는 하기 표 1이 참조된다:

표 1

1.1.3 다중특이적 및 이중특이적 항체

본 발명의 항원 결합성 단백질은 다중특이적일 수 있는데, 즉, 이러한 단백질은 1개 이상의 항원과 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항원 결합성 단백질은 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 지닌 항체 유도체로서, 본 발명의 일부를 또한 형성한다. 이러한 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합적 생성은 2개의 면역글로불린 H 쇄-L 쇄 쌍의 동시발현(coexpression)을 기반으로 하는데, 여기서 상기 2개의 H 쇄는 상이한 결합 특이성을 지닌다 (참조: Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 and Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659). H 및 L 쇄의 무작위 조합으로 인해 10개의 상이한 항체 구조물의 잠재적 혼합물이 생성되며, 이러한 혼합물중에서 단지 하나가 요망되는 결합 특이성을 지닌다. 또 다른 방법은 요망되는 결합 특이성을 지닌 가변 도메인을, 힌지 영역의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합시키는 것을 포함한다. 융합체의 하나 이상에 존재하는 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 CH1 영역을 지니는 것이 바람직하다. 이러한 융합체를 엔코딩하는 DNA 및 요망되는 경우 L 쇄가 별도의 발현 벡터내로 삽입된 후, 적절한 숙주 생물체내로 코트랜스펙션(cotransfection)된다. 그러나, 2개의 쇄 또는 3개의 모든 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터내로 삽입시키는 것이 가능하다. 한 가지 바람직한 방법에서, 이중특이적 항체는 제 1 결합 특이성을 지닌 H 쇄와 제 2 결합 특이성을 제공하는 H-L 쇄 쌍으로 구성되어 있고, 여기서 상기 H 쇄는 한 쪽 아암(arm)에 존재하고 H-L 쇄 쌍은 다른 쪽 아암에 존재한다 (참조: WO94/04690). 또한, 문헌 [Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986]이 참조된다.

치료용 단백질을 뇌에 전달하는 것은 혈뇌 장벽(BBB)의 존재에 의해 방해를 받아 왔고, 눈과 혈류 사이에 유사한 혈액 망막 장벽이 존재한다. 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체 단편을 BBB와 같은 생물학적 장벽을 가로질러 전달하는 것이 요망되는 경우, 필요에 따라 그러한 전달을 향상시키기 위해 다양한 방법들이 제안되었고, 혈액 망막 장벽을 가로지를 수 있게 하기 위해 유사한 방법들이 적용가능하다.

혈액으로부터 필요한 영양분과 인자를 수득하기 위해, BBB는 일부 특정한 수용체를 지니는데, 이들 수용체는 화합물들을 순환중인 혈액으로부터 뇌로 수송한다. 연구 결과, 인슐린 (참조: Duffy KR et al (1989) Brain Res. 420:32-38), 트랜스페린 (참조: Fishman JB et al (1987) J.Neurosci 18:299-304) 및 인슐린 유사 성장 인자 1과 2 (참조: Pardridge WM (1986) Endocrine Rev.7:314-330 and Duffy KR et al (1986) Metabolism 37:136-140)와 같은 일부 화합물이 수용체 매개성 트랜스싸이토시스(transcytosis)를 통해 BBB를 횡단하는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 분자들에 대한 수용체는 소위 "벡터드(vectored)" 항체를 사용하여 본 발명의 치료용 항체가 뇌에 접근하게 하는 잠재적 수단을 제공한다 (참조: Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321). 예를 들어, 트랜스페린 수용체에 대한 항체는 뇌 실질(brain parenchyma)내로 역동적으로(dynamically) 수송되는 것으로 밝혀졌다 (참조: Friden PM et al (1991) PNAS 88:4771-4775 and Friden PM et al (1993) Science 259:373-377). 따라서, 한 가지 잠재적 방법은 상기 설명된 바와 같이 이중특이적 항체 또는 이중특이적 단편을 생성시키는 것인데, 여기서 제 1 특이성은 상기 설명된 바와 같이 β-아밀로이드의 잔기 28-35를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프에 대한 것이고 제 2 특이성은 BBB에 위치하는 수송 수용체, 예를 들어 트랜스페린 수송 수용체에 대한 것이다.

본 발명에 의해 고려되는 다른 이중특이적 항체는 β-아밀로이드에 대해 제 1 특이성을 지니고, 보체 경로의 활성화제, 예를 들어 비제한적으로 보체 인자 D와 같은 보체 인자의 활성을 억제시키기 위해 이에 대해 제 2 특이성을 지닌 이중특이적 항체 또는 이의 이중특이적 단편을 포함한다.

본 발명의 다중특이적 항원 결합성 단백질은, β-아밀로이드, 예를 들어 상기 설명된 바와 같은 β-아밀로이드의 잔기 28-35를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프에 대해 제 1 특이성을 지니고 BBB 또는 혈액-망막 장벽에 위치한 수송 수용체에 대해 제 2 특이성을 지니고 보체 경로의 활성화제에 대해 제 3 특이성을 지닌 단백질을 포함한다.

1.2 항체 단편 및 다른 단백질 구조물, 예를 들어 도메인

본 발명의 특정 구체예에서, 항원 결합성 단편인 치료용 항체가 제공된다. 이러한 단편은 무손상 및/또는 사람화 및/또는 키메라 항체의 작용성 항원 결합성 단편, 예를 들어 상기 설명된 항체의 Fab, Fd, Fab', F(ab')₂, Fv, ScFv 단편일 수 있다. 불변 영역이 결여된 단편은 전형적 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력 또는 항체 의존성 세포독성을 매개하는 능력이 없다. 통상적으로, 이러한 단편은 무손상 항체의 단백분해, 예를 들어 파파인 분해에 의해 생성되지만 (참조: WO 94/29348), 재조합적으로 형질전환된 숙주 세포로부터 직접 생성될 수 있다. ScFv의 생성에 대해서는, 문헌 [Bird et al (1988) Science, 242, 423-426]이 참조된다. 또한, 항체 단편은 하기 기재된 다양한 공학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.

Fv 단편은 이들의 2개의 쇄의 상호작용 에너지가 Fab 단편 보다 더 적은 것으로 여겨진다. V_H와 V_L도메인의 결합을 안정화시키기 위해, 이들 도메인은 펩티드 (Bird et al, (1988) Science 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883), 이황화물 다리 (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) 및 "놉 인 홀(knob in hole)" 돌연변이 (Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788)를 사용하여 연결되었다. ScFv 단편은 당업자에게 널리 공지된 방법들에 의해 생성될 수 있다 (참조: Whitlow et al(1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 and Huston et al(1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217). ScFv는 E.Coli와 같은 세균 세포에서 생성될 수 있지만, 보다 전형적으로는 진핵 세포에서 생성된다. ScFv의 한 가지 단점은 생성물이 1가라는 점 (이는 다가 결합으로 인한 증가된 결합력(avidity)을 배제시킴)과 반감기가 짧다는 것이다. 이러한 문제점들을 극복하기 위한 시도로는 화학적 커플링 (Adams et al (1993) Can.Res 53, 4026-4034 and McCartney et al(1995) Protein Eng. 8, 301-314)에 의하거나 쌍을 이루지 않은 C 말단 시스테인 잔기를 함유하는 ScFv의 자발적인 부위-특이적(site-specific) 이합체화 (참조: Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204))에 의해 추가의 C 말단 시스테인을 함유하는 ScFV로부터 생성된 2가 (ScFv')₂를 포함한다. 또한, ScFv는 펩티드 링커를 3개 내지 12개의 잔기로 축소함에 의해 다합체를 형성하도록 함으로써 "디아바디(diabody)"를 형성할 수 있다 (참조: Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448). 링커를 추가로 감소시키면 ScFV 삼합체("트리아보디(triabody)", 참조: Kortt et al(1997) Protein Eng, 10, 423-433) 및 사합체("테트라보디(tetrabody)", 참조: Le Gall et al(1999) FEBS Lett, 453, 164-168) 가 생성될 수 있다. 2가 ScFV 분자의 작제(construction)는, "미니안티보디(miniantibody)" (참조: Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) 및 "미니보디(minibody)" (참조: Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061)를 형성하도록 단백질 이합체화 모티프를 사용하는 유전자 융합(genetic fusion)에 의해 또한 달성될 수 있다. 또한, 2개의 ScFv 단위를 제 3의 펩티드 링커에 의해 결합시킴으로써 ScFv-Sc-Fv 탠덤(tandem) ((ScFV)₂)이 생성될 수 있다 (참조: Kurucz et al(1995) J.Immol.154, 4576-4582). 이중특이적 디아보디는 짧은 링커에 의해 또 다른 항체의 V_L 도메인에 연결된 하나의 항체로부터의 V_H 도메인으로 구성된 2개의 단일 쇄 융합 생성물의 비공유 결합을 통해 생성될 수 있다 (참조: Kipriyanov et al(1998), Int.J.Can 77,763-772). 이러한 이중특이적 디아바디의 안정성은 상기 기재된 이황화물 다리 또는 "놉 인 홀" 돌연변이의 도입에 의해 또는 2개의 하이브리드 ScFv 단편이 펩티드 링커를 통해 연결된 단일 쇄 디아보디(ScDb)의 형성에 의해 향상될 수 있다 (참조: Kontermann et al(1999) J.Immunol.Methods 226 179-188). 예를 들어 ScFv 단편을 힌지 영역을 통해 IgG 분자의 CH3 도메인 또는 Fab 단편에 융합시킴으로써 4가의 이중특이적 분자가 이용가능하다 (참조: Coloma et al(1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163). 또한, 이중특이적 단일 쇄 디아보디들의 융합에 의해 4가의 이중특이적 분자가 생성되었다 (참조: Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94). 또한, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프를 함유하는 링커를 사용하는 ScFv-ScFv 탄뎀 (DiBi 미니안티보디, 참조: Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49)의 이합체화에 의해 또는 분자내 쌍형성을 방지하는 배향으로 4개의 항체 가변 도메인 (V_H 및 V_L)을 포함하는 단일 쇄 분자 (탠덤 디아보디, 참조: Kipriyanov et al, (1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56)의 이합체화에 의해 보다 작은 4가의 이중특이적 분자가 형성될 수 있다. Fab' 단편의 화학적 커플링에 의해 또는 류신 지퍼(zipper)를 통한 이종이합체화(heterodimerization)에 의해 이중특이적 F(ab')₂ 단편이 생성될 수 있다 (참조: Shalaby et al, (1992) J.Exp.Med. 175, 217-225 and Kostelny et al (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553). 또한, 분리된 V_H 및 V_L 도메인이 이용가능하다 (참조: US 6, 248,516; US 6,291,158; US 6, 172,197).

"면역글로불린 단일 가변 도메인"이란 어구는 상이한 V 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(V_H, V_HH, V_L)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 다른 상이한 가변 영역들 또는 가변 도메인들이 그러한 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합을 위해 필요하지 않는 경우 (즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인들과 무관하게 항원과 결합하는 경우), 상기 다른 영역들 또는 도메인들과 포맷(format) (예를 들어, 동종다합체(homo-multimer) 또는 이종다합체(hetero-multimer))을 이루며 존재할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 이러한 용어가 본원에서 사용되는 경우 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 사람 항체 가변 도메인일 수 있지만, 또한 설치류와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다 (예를 들어, WO 00/29004에 기재된 바와 같은, 너어스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) V_HH dAb). 카멜리드 V_HH는, 본래 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생성시키는, 낙타, 라마(llama), 알파카(alpaca), 단봉낙타(dromedary) 및 과나코(guanaco)를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 V_HH도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 사람화될 수 있고, 이러한 도메인은 여전히 본 발명에 따른 "도메인 항체"로 간주된다. 본원에서 사용되는 경우, V_H는 카멜리드 V_HH 도메인을 포함한다.

또한, 항원 결합성 단편은 도메인과 같은 비-항체 단백질 스캐폴드상의 하나 이상의 CDR의 배열에 의해 제공될 수 있다. 도메인은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있다. 이는 상기 설명된 바와 같이 도메인 항체일 수 있거나, 천연 리간드가 아닌 항원에 대한 결합을 수득하기 위해 단백질 공학처리(engineering)된, CTLA-4, 리포칼린(lipocalin), SpA, 애피바디(Affibody), 아비머(avimer), GroEl, 트랜스페린, GroES 및 피브로넥틴/아드넥틴(fibronectin/adnectin)으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.

이와 관련하여, "도메인"이란 용어는 폴딩된 단백질 구조를 지칭하는데, 이러한 구조는 단백질의 나머지 부분과 무관한 3차 구조를 지닌다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 구별된 기능적 특성을 담당하고, 많은 경우에 그러한 단백질 및/또는 도메인의 잔여 부분의 기능 상실없이 다른 단백질로 첨가되거나 이동되거나 전달될 수 있다. "단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징이 되는 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열에 의해 대체된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.

1.3 헤테로컨쥬게이트(heteroconjugate) 항체

헤테로컨쥬게이트 항체는 본 발명의 구체예를 또한 형성하는 유도체이다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 형성된 2개의 공유결합된 항체들이다 (참조: US 4,676,980).

1.4 다른 변형

항체의 Fc 영역과 다양한 Fc 수용체(FcγR) 간의 상호작용은 항체-의존성 세포독성(ADCC), 보체의 고정, 식세포작용 및 항체의 반감기/제거율을 포함하는 항체의 이펙터 기능을 매개하는 것으로 믿어진다. 본 발명의 항체의 Fc 영역에 대한 다양한 변형은 요망되는 이펙터 특성에 따라 수행될 수 있다. 특히, 전형적 경로에 의해 보체를 활성화시키는 기능 a) 및 항체-의존성 세포독성을 매개하는 기능 b)이 본질적으로 결여된 사람 불변 영역은, EP0307434 (WO8807089), EP 0629 240 (WO9317105) 및 WO 2004/014953에 기재된, 예를 들어 234번, 235번, 236번, 237번, 297번, 318번, 320번 및/또는 322번 위치에서의 돌연변이와 같은 특정 돌연변이를 함유하는 IgG4 불변 영역, IgG2 불변 영역 및 IgG1 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역의 CH2 도메인내에서의 잔기 235 또는 237의 돌연변이 (Kabat 번호매김; EU Index system)는 개별적으로 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII에 대한 결합을 감소시켜서 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 감소시키는 것으로 공지되었다 (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). 또한, 일부 보고서에는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 보급하거나 매개하는 데에 있어서 상기 잔기들의 일부가 관련된다는 것이 공지되었다 (Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). 따라서, 보체 매개성 효과와 FcγR 매개성 효과 둘 모두를 감소시키기 위해 잔기 235 및 237 둘 모두가 알라닌 잔기로 돌연변이되었다 (Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48; and WO9958679). 이러한 불변 영역들을 포함하는 항체는 "비용해성" 항체로 명명될 수 있다.

혈청 반감기를 증가시키기 위해 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프가 항체내로 혼입될 수 있다 (참조: US 5,739,277).

현재 5개의 사람 Fc 수용체, 즉, FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 신생아 FcRn가 인식되어 있다. 문헌 [Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604]에는 공통적인 일련의 IgG1 잔기가 모든 FcγR과 결합하는 데에 관여하며, FcγRII와 FcγRIII는 이러한 공통적인 일련의 잔기에 속하지 않는 별개의 부위를 이용한다는 것이 입증되어 있다. 알라닌으로 변화된 경우 모든 FcγR에 대한 결합을 감소시켰던 1군의 IgG1 잔기들은 다음과 같다: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239. 이들 모두는 IgG CH2 도메인에 존재하고, CH1과 CH2를 연결하는 힌지 근처에 모여있다. FcγRI는 결합을 위해 단지 공통적인 일련의 IgG1 잔기들을 이용하지만, FcγRII와 FcγRIII는 그러한 공통적인 일련의 잔기들에 더하여 별개의 잔기들과 상호작용한다. 일부 잔기의 변화는 단지 FcγRII (예를 들어, Arg-292) 또는 FcγRIII (예를 들어, Glu-293)에 대한 결합을 감소시켰다. 일부 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대해 개선된 결합을 나타내었지만, 다른 수용체에 대한 결합에는 영향을 미치지 못했다 (예를 들어, Ser-267Ala은 FcγRII에 대한 결합을 개선시켰지만, FcγRIII에 대한 결합은 영향을 받지 않았다). 다른 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대해 개선된 결합을 나타내며 다른 수용체에 대한 결합은 감소시켰다 (예를 들어, Ser-298Ala는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시켰고, FcγRII에 대한 결합을 감소시켰다). FcγRIIIa의 경우, 가장 잘 결합하는 IgG1 변이체는 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서 조합된 알라닌 치환을 지녔다. 신생아 FcRn 수용체는 IgG 분자가 분해되지 않게 함으로써 혈청 반감기 및 조직을 가로지르는 트랜스싸이토시스를 향상시키는 데에 관여하는 것으로 믿어진다 (참조: Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57 and Ghetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766). 사람 FcRn과 직접 상호작용하는 것으로 측정된 사람 IgG1 잔기로는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435가 있다.

본 발명의 치료용 항체는 상기 불변 영역 변형 중 어느 것이든 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 치료용 항체는 전형적 경로에 의해 보체를 활성화시키는 기능 a)과 항체-의존성 세포독성을 매개하는 기능을 본질적으로 결여하고 있다. 보다 특정한 구체예에서, 본 발명은 반감기/제거율 및/또는 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC 및/또는 보체 의존성 세포독성 및/또는 보체 용해를 변화시키도록 상기 상세히 설명된 잔기 변화 중 어느 하나 (또는 그 초과)를 지닌 본 발명의 치료용 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 치료용 항체는 이소타입 사람 IgG1의 불변 영역을 지니며, 이러한 불변 영역은 235번 (예를 들어, L235A) 및 237번 (예를 들어, G237A) (Kabat에 개략적으로 설명된 EU 스킴(scheme)에 따른 번호매김) 위치에서의 알라닌 (또는 파괴성(disrupting)) 치환을 지닌다.

본 발명의 다른 유도체는 본 발명의 항체의 글리코실화(glycosylation) 변이체를 포함한다. 항체가 이의 불변 영역의 보존된 위치에서 글리코실화된 경우 항체 기능, 특히 상기 설명된 것들과 같은 이펙터 기능에 대해 중대한 효과를 미치는 것으로 알려져 있다 (참조: Boyd et al(1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318). 하나 이상의 탄수화물 부분이 첨가되거나, 치환되거나, 결실되거나, 변형된, 본 발명의 치료용 항체의 글리코실화 변이체가 고려된다. 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 모티프가 도입되면 탄수화물 부분의 효소적 결합을 위한 잠재적 부위가 생성되므로, 이는 항체의 글리코실화를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876]에서는, TNFR-IgG 면역부착소(immunoadhesin)의 말단 시알릴화(sialylation)가, 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제 및/또는 알파 2,3 시알릴트랜스퍼라아제를 사용한 리갈락토실화(regalactosylation) 및/또는 리시알릴화(resialylation) 공정을 통해 증가되었다. 말단 시알릴화를 증가시키는 것은 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 것으로 믿어진다. 항체는 대부분의 당단백질과 마찬가지로 전형적으로 글리코폼(glycoform)의 혼합물로서 천연적으로 생성된다. 이러한 혼합물은, 항체가 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에서 생성되는 경우에 특히 분명하다. 규정된(defined) 글리코폼을 제조하기 위해 다양한 방법이 개발되었다 (참조: Zhang et alScience (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727). 따라서, 본 발명은 상기 항체의 규정된 개수 (예를 들어, 7개 이하, 예를 들어 5개 이하, 예를 들어 2개 또는 1개)의 글리코폼(들)을 포함하는 본원에 기재된 다수의 치료용 항체 (IgG 이소타입, 예를 들어 IgG1일 수 있음)에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 유도체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌과 같은 비-단백성(non-proteinaeous) 중합체에 커플링된 본 발명의 치료용 항체를 포함한다. 단백질을 PEG에 컨쥬게이션시키는 것은 단백질의 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 단백질의 항원성과 면역원성을 감소시키는 확립된 기술이다. 다양한 분자량과 유형 (선형 또는 분지형)에 의한 페길화(PEGylation)를 사용하는 것이 무손상 항체 뿐만 아니라 Fab' 단편에 대해 조사되었다 (참조: Koumenis I.L. et al(2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95). 특정 구체예는, PEG에 커플링된, 전형적 경로에 의해 보체를 활성화시키는 이펙터 기능 a)과 항체-의존성 세포독성을 매개하는 이펙터 기능 (b)이 없는 본 발명의 항원-결합 단편 (예를 들어 Fab 단편 또는 scFv)을 포함한다.

2. 제조 방법

본 발명의 항체는 염소 (참조: Pollock et al (1999), J.Immunol.Methods 231:147-157), 닭 (참조: Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55), 마우스 (참조: Pollock et al ibid) 또는 식물 (참조: Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590)과 같은 트랜스제닉 생물체에서 제조될 수 있다. 또한, 항체는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 전형적으로 본 발명의 항체는 당업자에게 널리 공지된 재조합 세포 배양 기술을 이용하여 제조된다. 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 분리되고, 추가 증식(propagation) 또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 플라스미드와 같은 복제가능한 벡터내로 삽입된다. 한 가지 유용한 시스템은 글루타메이트 합성효소 시스템 (예를 들어, 론자 바이올로직스(Lonza Biologics)에 의해 판매되는 것), 특히 숙주 세포가 CHO 또는 NSO인 시스템이다 (하기 참조). 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브)를 이용하여 용이하게 분리되고 시퀀싱된다. 사용될 수 있는 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 파아지, 트랜스포손, 미니크로모솜(minichromsome)이 있고, 이들 중에서 플라스미드가 전형적인 구체예이다. 일반적으로, 이러한 벡터는, 발현을 촉진시키기 위해 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 결합된, 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 엘리먼트, 프로모터 및 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 경쇄와 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 개별 벡터내로 삽입되어 동일한 숙주 세포내로 동시에 또는 순차적으로 (예를 들어, 형질전환, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션 또는 형질도입에 의해) 도입될 수 있거나, 요망되는 경우 중쇄와 경쇄 둘 모두가 동일한 벡터내로 삽입된 후 그렇게 도입될 수 있다.

유전 암호의 중복성(redundancy)으로 인해, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대한 대체(alternative) 폴리뉴클레오티드가 또한 이용가능하다는 것이 당업자에게 즉시 명백할 것이다.

2.1 신호 서열

본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체는 성숙 단백질의 N 말단에 특정 절단 부위를 갖는 이종(heterologous) 신호 서열을 지닌 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되어야 한다. 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 알칼리 포스파타아제, 페니실리나아제(penicillinase) 또는 열 안정성 엔테로톡신 II 리더(leader)일 수 있다. 효모 분비의 경우, 신호 서열은 효모 인버타아제(invertase) 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파타아제 리더일 수 있다 (참조: WO90/13646). 포유동물 세포 시스템의 경우, 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호 및 천연 면역글로불린 신호 서열 (예를 들어, 사람 Ig 중쇄)가 이용가능하다. 전형적으로, 신호 서열은 본 발명의 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 리딩 프레임 형태로(in reading frame) 라이게이션(ligation)된다.

2.2 복제 기점

복제 기점은 당 분야에 널리 공지되어 있는데, 대부분의 그람-음성 세균에 대해서는 pBR322이고, 대부분의 효모에 대해서는 2μ 플라스미드이고, 대부분의 포유동물 세포에 대해서는 다양한 바이러스 기점, 예를 들어 SV40, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스, VSV 또는 BPV이다. 일반적으로, SV40 복제 기점 성분은 포유동물 통합(integrated) 발현 벡터에 필요하지 않다. 그러나, SV40 ori가 포함될 수 있는데, 이는 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.

2.3 선별 마커

전형적인 선별 유전자는, 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나(a), 영양분 결핍(auxotrophic deficiency)을 보충하거나 복합 배지에서 이용가능하지 않은 영양분을 공급하거나(b), (a)와 (b) 둘 모두를 수행하는(c), 단백질을 엔코딩한다. 선별 계획은 벡터(들)을 함유하지 않는 숙주 세포의 증식을 정지시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 치료용 항체를 엔코딩하는 유전자를 사용하여 성공적으로 형질전환된 세포는 동시전달된(co-delivered) 선별 마커에 의해 부여된 예를 들어 약물 내성으로 인해 생존한다. 한 가지 예는 DHFR-선별 시스템인데, 여기서 형질전환체는 DHFR 음성 숙주 계통에서 생성된다 (참조: Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9:64-68). 이러한 시스템의 경우, DHFR 유전자는 본 발명의 항원 결합성 단백질 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 항체 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 동시전달되고, 그 후, DHFR 양성 세포가 뉴클레오시드 회수(nucleoside withdrawal)에 의해 선별된다. 필요한 경우, DHFR 유전자 증폭에 의해 형질전환체를 선별하기 위해 DHFR 억제제인 메토트렉세이트가 또한 사용된다. DHFR 유전자를 본 발명의 항체와 같은 항원 결합성 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 작용성 유도체에 작동적으로 결합시킴으로써, DHFR 유전자 증폭은 요망되는 관심있는 항원 결합성 단백질 서열, 예를 들어 항체 서열의 동반 증폭을 일으킨다. CHO 세포는 이러한 DHFR/메토트렉세이트 선별을 위한 특히 유용한 세포주이고, DHFR 시스템을 사용하여 숙주 세포를 증폭시키고 선별하는 방법은 당 분야에 잘 정립되어 있다 (참조: Kaufman R.J. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621; 개관에 대해서는 문헌 [Werner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug]이 참조됨). 또 다른 예는 글루타메이트 합성효소 발현 시스템이다 (Bebbington et al Biotechnology 1992 Vol 10 p169). 효모에서 사용되는 적절한 선별 유전자는 trp1 유전자이다 (참조: Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979).

2.4 프로모터

본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 발현시키기 위한 적절한 프로모터가 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 엔코딩하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동적으로 결합된다. 원핵 숙주를 위한 프로모터로는 phoA 프로모터, 베타-락타마아제와 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타아제, 트립토판 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 Tac이 있다. 효모 세포에서의 발현을 위한 적절한 프로모터로는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소(glycolytic enzyme), 예를 들어 에놀라아제(enolase), 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코오스 6 포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제 및 글루코키나아제가 있다. 유도성 효모 프로모터로는 알코올 데히드로게나아제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타아제, 메탈로티오네인, 및 질소 대사 또는 말토오스/갈락토오스 이용을 담당하는 효소가 있다.

포유동물 세포 시스템에서의 발현을 위한 프로모터로는 바이러스 프로모터, 예를 들어 폴리오마, 계두(fowlpox) 및 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소(bovine) 유두종 바이러스, 조류(avian) 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (특히, 즉시형 초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스(rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터 및 초기 또는 후기 시미안(Simian) 바이러스 40 및 비-바이러스(non-viral) 프로모터, 예를 들어 EF-1알파를 포함하는 RNA 폴리머라아제 II 프로모터가 있다 (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322). 프로모터의 선택은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 적절한 양립성(compatibility)을 기초로 이루어질 수 있다.

2.5 인핸서 엘리먼트

적절한 경우, 예를 들어 고등 진핵생물에서 발현되는 경우, 추가의 인핸서 엘리먼트가 상기 설명된 프로모터 위치에 존재하는 엘리먼트 대신에 또는 이에 더하여 포함될 수 있다. 적절한 포유동물 인핸서 서열로는 글로빈(globin), 엘라스타아제(elastase), 알부민, 페토프로테인(fetoprotein), 메탈로티오닌(metallothionine) 및 인슐린으로부터의 인핸서 엘리먼트가 있다. 또한, 진핵 세포 바이러스, 예를 들어 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 바큘로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 유전자좌로부터의 인핸서 엘리먼트가 사용될 수 있다 (참조: WO04/009823). 이러한 인핸서들은 전형적으로 벡터상에서 프로모터의 업스트림에 있는 부위에 위치하지만, 이들은 또한 다른 부위에 위치할 수 있는데, 예를 들어 비번역된 영역내에 위치하거나 폴리아데닐화 신호의 다운스트림에 위치한다. 인핸서의 선택 및 위치배정(positioning)은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 적절한 양립성을 기초로 하여 이루어질 수 있다.

2.6 폴리아데닐화/종결

진핵 시스템의 경우, 폴리아데닐화 신호는 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 결합된다. 이러한 신호는 전형적으로 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치한다. 포유동물 시스템의 경우, 이러한 신호의 비제한적인 예로는 성장 호르몬, 신장 인자(elongation factor)-1 알파 및 바이러스 (예를 들어, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스 장말단(long terminal) 반복체로부터 유래된 것들이 있다. 효모 시스템의 경우, 폴리아데닐화/종결 신호의 비제한적인 예로는 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 및 알코올 데히드로게나아제 1(ADH) 유전자로부터 유래된 것들이 있다. 원핵 시스템의 경우, 폴리아데닐화 신호는 필요치 않으며, 그 대신 보다 짧고 더욱 한정된 종결자 서열(terminator sequence)을 사용하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열의 선택은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 적절한 양립성을 기초로 하여 이루어질 수 있다.

2.7 수율 향상을 위한 다른 방법/엘리먼트

상기 사항에 더하여, 수율을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 다른 특징으로는 크로마틴 리모델링 엘리먼트, 인트론 및 숙주-세포 특이적 코돈 변형이 있다. 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체의 코돈 사용빈도(codon usage)는 전사체 및/또는 생성물 수율을 증강시키기 위해 숙주 세포의 코돈 편향(bias)에 적합하도록 변화될 수 있다 (참조: Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24). 코돈의 선택은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 적절한 양립성을 기초로 하여 이루어질 수 있다.

2.8 숙주 세포

본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 엔코딩하는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적절한 숙주 세포는 원핵, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 적절한 원핵 세포로는 진정세균, 예를 들어 엔테로박테리아세애(enterobacteriaceae), 예를 들어 E.Coli (예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325), 엔테로박터(Enterobacter), 얼위니아(Erwinia), 클레브시엘라 프로테우스(Klebsiella Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 쉬겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실러스, 예를 들어 바실러스 서브틸리스(B.subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B.licheniformis) (참조: DD 266 710), 슈도모니스, 예를 들어 슈도모나스 애루기노사(P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 있다. 효모 숙주 세포에 대해서는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스(Kluyveromyces) (예를 들어, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로위아(yarrowia) (EP 402,226), 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris) (EP 183,070, 또한 문헌 [Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192]이 참조됨), 칸디다(Candida), 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234), 페니실린(Penicillin), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페리길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 아스페르길루스 니둘란스(A.nidulans) 및 아스페르길루스 니게르(A.niger)가 또한 고려된다.

원핵 및 효모 숙주 세포가 본 발명에 의해 구체적으로 고려되지만, 전형적으로 본 발명의 숙주 세포는 척추동물 세포이다. 적절한 척추동물 숙주 세포로는 포유동물 세포, 예를 들어 COS-1 (ATCC No.CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), 사람 배아 신장 세포주 293, PerC6 (Crucell), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO (예를 들어, CHO-K1, ATCC NO: CCL 61), DHFR- CHO 세포주, 예를 들어 DG44 (Urlaub et al, Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12 pp555-566), 특히 현탁 배양을 위해 적합된 CHO 세포주, 마우스 세르톨리(sertoli) 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개(canine) 신장 세포 (ATCC CCL 34), 사람 폐 세포 (ATCC CCL75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포, 예를 들어 NS0 (참조: US 5,807,715), Sp2/0, Y0가 있다.

따라서, 본 발명의 한 가지 구체예에서, 본원에 기재된 치료용 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 벡터를 포함하는 안정하게 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 전형적으로, 이러한 숙주 세포는 상기 경쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터와 상기 중쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 포함한다.

또한, 이러한 숙주 세포는 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체의 특성, 기능 및/또는 수율을 변화시키기 위해 추가로 공학처리되거나 적합될 수 있다. 비제한적인 예로는 특정 조절(modifying) (예를 들어, 글리코실화) 효소 및 단백질 폴딩 샤퍼론(chaperone)의 발현이 있다.

2.9 세포 배양 방법

본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 엔코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 배양될 수 있다. 숙주 세포는 스피너(spinner) 플라스크, 진탕 플라스크, 롤러 보틀(roller bottle), 웨이브(wave) 반응기 (예를 들어, 웨이브바이오테크.컴(wavebiotech.com)으로부터의 System 1000) 또는 중공 섬유 시스템에서 배양될 수 있지만, 대규모 생산을 위해서는 교반 탱크 반응기 또는 백(bag) 반응기 (예: Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA)가 특히 현탁 배양을 위해 사용되는 것이 바람직하다. 전형적으로, 교반 탱커(stirred tanker)는, 예를 들어 분사기(sparger), 배플 또는 하부 전단임펠러(low shearimpeller)를 사용하는 통기(aeration)를 위해 적합된다. 버블 컬럼(bubble column) 및 에어리프트(airlift) 반응기의 경우, 공기 또는 산소 버블에 의한 직접적인 통기가 사용될 수 있다. 숙주 세포가 무혈청 배지에서 배양되는 경우, 통기 처리로 인한 세포 손상을 방지하는 것을 보조하기 위해 플루로닉(pluronic) F-68과 같은 세포 보호제가 보충될 수 있다. 숙주 세포 특성에 따라, 앵커리지(anchorage) 의존성 세포주의 경우 성장 기질로서 마이크로캐리어(microcarrier)가 사용될 수 있거나 세포가 현탁 배양에 적합될 수 있다 (후자가 전형적임). 숙주 세포, 특히 척추동물 숙주 세포를 배양하는 데에는 다양한 동작 모드, 예를 들어 뱃치(batch), 페드-뱃치(fed-batch), 반복 뱃치 공정 (참조: Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109), 연장(extended) 뱃치 공정 또는 관류 배양(perfusion culture)을 이용할 수 있다. 재조합적으로 형질전환된 포유동물 숙주 세포가 우태아 혈청(FCS)을 포함하는 배지와 같은 혈청 함유 배지에서 배양될 수 있지만, 이러한 숙주 세포가 무혈청 배지, 예를 들어 문헌 [Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 기재된 바와 같은 무혈청 배지, 또는 필요에 따라 글루코오스와 같은 에너지원 및 재조합 인슐린과 같은 합성 성장 인자가 보충된, 시판 배지, 예를 들어 ProCHO-CDM 또는 UltraCHO^TM (Cambrex NJ, USA)에서 배양되는 것이 바람직하다. 숙주 세포를 무혈청 배양하는 데에는 그러한 세포가 무혈청 조건에서 증식하도록 적합될 것을 필요로 한다. 한 가지 적합화 방법은 그러한 숙주 세포를 혈청 함유 배지에서 배양하고, 상기 배양 배지의 80%를 무혈청 배지로 반복적으로 교환함으로써, 상기 숙주 세포가 무혈청 조건에 적응하게 하는 것이다 (참조: Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers).

배지내로 분비된 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체는 의도된 용도를 위해 적절한 정제도를 제공하도록 다양한 기술을 이용하여 배지로부터 회수되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 사람 환자의 치료를 위해 본 발명의 치료용 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 사용하는 것은 전형적으로, 치료용 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 포함하는 배양 배지와 비교한 경우, 환원성 SDS-PAGE에 의해 측정한 경우 95% 이상의 순도, 더욱 전형적으로는 98% 또는 99% 순도를 요구한다. 먼저, 배양 배지로부터의 세포 파편은 전형적으로 원심분리에 이은 미세여과, 한외여과 및/또는 다층여과(depth filtration)를 사용한 상층액의 정화(clarification) 단계를 사용하여 분리된다. 또한, 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체는 사전 원심분리없이 미세여과, 한외여과 또는 다층여과에 의해 수거될 수 있다. 다양한 다른 기술, 투석 및 겔 전기영동 및 크로마토그래피 기술, 예를 들어 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)(HA), 친화성 크로마토그래피 (임의로 폴리히스티딘과 같은 친화성 태깅(tagging) 시스템을 포함함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, 참조: US 5, 429,746)가 이용가능하다. 한 가지 구체예에서, 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체는, 다양한 정화 단계 후에, 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피에 이은 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 암모늄 설페이트 침전과 같은 추가의 크로마토그래피 단계를 사용하여 포획된다. 전형적으로, 다양한 바이러스 제거 단계가 또한 사용된다 (예: 예를 들어, DV-20 필터를 사용한 나노여과). 이러한 다양한 단계 후에, 적어도 10mg/ml 또는 그 초과, 예를 들어 100mg/ml 또는 그 초과의 본 발명의 항체를 포함하는 정제된 (전형적으로 모노클로날) 제제가 제공되고, 이에 따라 이는 본 발명의 구체예를 형성한다. 100mg/ml 또는 그 초과로 농축시키는 것은 초원심분리에 의해 이루어질 수 있다. 적절하게는, 이러한 제제는 본 발명의 항체의 응집된 형태를 실질적으로 함유하지 않는다.

항체 단편의 발현을 위해 세균 시스템이 특히 적합하다. 이러한 단편은 세포내에 위치하거나 주변세포질(periplasma)내에 위치한다. 당업자에게 공지된 방법에 따라 활성 단백질을 형성하도록 불용성 주변세포질 단백질이 추출되고 리폴딩(refolding)될 수 있다 (참조: Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 and Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277).

3. 약제 조성물

상기 설명된 본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체의 정제된 제제 (특히 모노클로날 제제)는 상기 개략적으로 설명된 것들과 같은 사람 질병 및 장애의 치료에 사용되는 약제 조성물내로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 공지되어 있고 허용되는 제약 실무에 의해 요구되는 약제학적으로 허용되는 (즉, 비활성인) 담체를 추가로 포함한다 (참조: Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed,(1980), Mack Publishing Co.). 이러한 담체의 예로는 멸균 담체, 예를 들어 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로오스 용액이 있으며, 이는 소듐 아세테이트 트리히드레이트와 같은 적절한 완충제에 의해 5 내지 8 범위의 pH와 같은 약제학적으로 허용되는 pH로 완충된다. 주사용 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피내, 피하, 근내, 문맥내(intraportal) 주사에 의해 또는 눈으로의 국소 또는 눈주위(periocular) 적용에 의한 눈으로의 국부적 전달 또는 눈내로의 유리체내(intravitreal) 주사에 의해 투여됨) 또는 연속 주입용 약제 조성물은 적절하게는 가시적인(visible) 미립자 물질을 함유하지 않으며, 1mg 내지 10g의 치료용 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체, 전형적으로는 5mg 내지 1g, 더욱 상세하게는 5mg 내지 25mg 또는 50mg의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 포함할 수 있다. 이러한 약제 조성물의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 한 가지 구체예에서, 약제 조성물은, 단위 투여 형태의 1mg 내지 10g의 본 발명의 치료용 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를, 임의로 사용 설명서와 함께 포함한다. 본 발명의 약제 조성물은 당업자에게 널리 공지되어 있거나 명백한 방법에 따라 투여 전에 재구성되도록 동결건조(냉동건조)될 수 있다. 본 발명의 구체예가 IgG1 이소타입을 지닌 본 발명의 항체를 포함하는 경우, 이러한 이소타입의 항체의 금속 매개성 분해의 정도를 감소시키기 위해, 구리를 포함하는 금속 이온의 킬레이터, 예를 들어 시트레이트 (예를 들어, 소듐 시트레이트) 또는 EDTA 또는 히스티딘이 약제 조성물에 첨가될 수 있다 (참조: EP0612251). 또한, 약제 조성물은, 가용화제, 예를 들어 아르기닌 염기, 세정제/항-응집제, 예를 들어 폴리소르베이트 80, 및 바이알 헤드스페이스(headspace) 산소를 대체하는 비활성 가스, 예를 들어 질소를 포함할 수 있다.

본 발명의 항원 결합성 단백질, 예를 들어 항체를 투여하기 위한 유효량 및 투여 계획(regime)은 일반적으로 경험적으로 결정되며, 환자의 연령, 체중 및 건강 상태 및 치료하고자 하는 질병 또는 장애와 같은 인자에 좌우된다. 이러한 인자들은 주치의(attending physican)의 지식범위내에 있는 것이다. 적절한 투여량을 선택하는 데에 있어서의 지침은 예를 들어 문헌 [Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 발견될 수 있지만, 일반적으로 1mg 내지 10g일 것이다. 한 가지 구체예에서, 사람 환자를 치료하기 위한 투여 계획은 1mg 내지 1g의 본 발명의 치료용 항체를 주 1회 또는 2주마다 피하 투여하거나, 1개월 또는 2개월 마다 정맥내 주입하는 것이다. 이러한 투여량은 0.014 내지 140mg/kg, 예를 들어 0.014 내지 14mg/kg에 상응한다. 또한, 본 발명의 조성물은 예방적으로 사용될 수 있다.

또한, 조성물은 국소 적용, 유리체내 주사 또는 눈주위 투여, 즉, 안구뒤(retrobulbar), 안구주위(peribulbar), 테논낭하(subtenon) 또는 결막하(subconjunctival) 주사를 통한 공막하(subsclerally) 투여에 의해 눈에 보다 국부적으로 전달될 수 있다. 치료용 항체의 수동적 투여, 예를 들어 정맥내 투여를 통해 드루젠 감소를 달성하기 위해 전신 투여가 충분할 수 있다. 다른 국부 투여 경로는 치료용 항체가 낮은 투여량에서 눈의 후방 분절(posterior segment)에 보다 용이하게 도달할 수 있게 한다. 국소 적용은 토끼 모델에서 항체 단편이 눈의 후방부에 침투할 수 있게 하는 것으로 공지되었다 (Williams KA, Bereton HM, Farrall A, Standfield SD, Taylor SD, Kirk LA, Coster DJ (2005) Eye 19; 910-913). 항체 단편 또는 완전한 모노클로날 항체의 유리체내 주사가 공지되었고, 라니비주맙(ranibizumab)과 베바시주맙(bevacizumab) 제품의 경우 AMD 환자에게서 좋은 내약성을 나타낸다. 또한, 치료용 항체는 유리체내 임플란트(implant)에 의해 투여될 수 있다. 안구뒤 및 안구주위 주사는 특수한 23 내지 26 게이지 니들을 사용하여 달성될 수 있고, 유리체내 주사 보다 덜 침입적이다. 테논낭하 주사는 장기간 동안 공막과 접촉한 상태로 조성물을 위치시키는데, 이는 안구 후방으로 침투하는 것을 보조할 수 있다. 결막 바로 아래에 단백질을 주사하는 것이 토끼 모델에서 공지되었는데, 이는 분자가 더욱 직접적으로 공막을 가로질러 확산하여 눈의 후방 분절에 도달하게 할 수 있다. 투여가 덜 빈번해질 수 있도록 안구내 또는 안구주변으로 장기간에 걸쳐 물질을 방출시킬 수 있는 지속 방출 약물 전달 시스템이 또한 사용될 수 있다. 이러한 시스템으로는 치료용 조성물로 충전되거나 코팅될 수 있는, 미셀(micelle), 겔, 하이드로겔, 나노입자, 마이크로캡슐 또는 임플란트가 있다. 이러한 시스템은 주사에 의해 또는 다른 이미 공지된 덜 침입적인 경로 중 어느 하나에 의해, 즉, 눈주위 또는 공막하 경로를 통해 눈의 유리체내로 전달될 수 있다. 이러한 지속 방출 시스템 및 국부 전달 경로의 예로는 망막 후방 및 RPE 층을 표적으로 하는 나노입자 기반 제형의 공막하 투여 또는 유리체내 투여를 위한 열 민감성 서방형 하이드로겔이 있다 (Janoira KG, Gunda S, Boddu SHS, Mitra AK, (2007) Expert Opin Drug Deliv 4: 371-388 Birch DG, Liang FQ, (2007) Int J Nanomed 2:65-77). 전달 시스템 및 국부 투여 경로의 그 밖의 많은 조합이 가능하고, 이러한 조합은 치료용 항체의 조성물에 대해 고려될 수 있다. 또한, 항체는 물리적 장치에 의해, 예를 들어 이온토포레시스(iontophoresis)를 통해 전달될 수 있다 (Association for Research in Vision and Ophthalmology, 2008, Annual meeting, April 27^th - May 1^st, Posters #98/A125 & #1813/D693 from EyeGate Pharma: Blalock et al., & Ruiz-Perez et al).

4. 임상적 용도

증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병으로는 알츠하이머병, 경증 인지력 손상, 다운증후군, 네덜란드형의 β-아밀로이드증 관련 유전성 뇌출혈, 뇌 β-아밀로이드 혈관병증 및 다양한 유형의 퇴행성 치매, 예를 들어 파킨슨병, 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 피질 기저 변성 및 알츠하이머병의 미만성 루이 보디형과 관련된 퇴행성 치매, 연령 관련 황반 변성(AMD), "녹내장형" 질병 및 Aβ 의존성 백내장 형성이 있는 것으로 인식된다.

본 발명의 구체예에서, 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병은 알츠하이머병이다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병은 연령 관련 황반 변성(AMD), "녹내장형" 질병 또는 Aβ 의존성 백내장 형성이다.

본 발명이 사람 질병 또는 장애의 치료와 관련하여 주로 설명되었지만, 본 발명은 사람 이외의 포유동물의 유사한 질병 또는 장애의 치료에 또한 적용될 수 있다.

실시예

방법

ABi8200 FMAT를 위한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 8200 형광 매크로(macro) 공초점 세포 검출 시스템

Biacore ^TM /Biacore SPR을 사용하여 분자 상호작용의 실시간 동력학(kinetics)의 측정을 가능하게 하는 장치

CM5 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스로 코팅된 범용(general purpose) 표면을 지닌 Biacore ^TM 센서 칩

cSLO 공초점 주사 레이저 검안경

ELISA 효소 결합 면역흡착 검정

FMAT 형광측정 미소용적 검정 기술(fluorometric microvolume assay technology) (Applied Biosystems)

FPLC 고속 단백질 액체 크로마토그래피

IHC 면역조직화학

Integra CL1000 아이비에스 인테그라 바이오사이언시즈(IBS Integra Biosciences)에 의해 판매되는 미니-바이오리액터(mini-bioreactor)

MSD® 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)

ProSepA HiTrap 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)에 의해 판매되는 FPLC용 단백질 A 컬럼

RU 공명 단위(Resonance Unit) (Biacore 측정에서 센서 칩에 대한 결합을 정량하기 위한 임의 단위)

SDS-PAGE 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

SPR (표면 플라스몬 공명) - 센서 칩상의 질량 변화를 측정하기 위한 Biacore ^TM 기기에 의해 사용되는 물리적 현상

SPSS 통계 분석 소프트웨어 패키지

SRU 표지 비함유 생화학적 상호작용을 모니터링하는 것을 가능하게 하는 SRU BIND^TM바이오센서 기술

재료

BSA 우혈청 알부민

C57/BL6 "C57 black 6" - 실험용 마우스의 통상적인 근교계(inbred strain)

DAB 3,3'디아미노벤지딘

DAPI 4',6-디아미디노-2-페닐인돌

DMEM 둘베코(dulbecco's) 변형 이글(eagle's) 배지

DMSO 디메틸설폭시드

DTT 디티오트레이톨

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

FA 포름산

FCS 우태아혈청

FITC 플루오레세인 이소티오시아네이트

Glutamax 배양 배지에 첨가되는 글루타민의 안정한 형태 (디펩티드 L-아나닐-L-글루타민 보충제)

HEK 사람 배아 신장 293 세포

HBS-EP 완충액 0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20을 함유하는 범용 Biacore ^TM 완충액

HEPES N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)

Histoclear 조직 제거제(clearing agent)

HRP 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase)

IMS 공업용 메틸레이티드 스피릿(methylated spirit)

리포펙타민 인비트로겐/깁코(Invitrogen/Gibco)에 의해 판매되는 양이온성 액체 기반 세포 트랜스펙션 작용제

NaCl 소듐 클로라이드

Opti-MEM 인비트로겐/깁코의 변형 이글 배지 기반 배지

PBS 포스페이트 완충 식염수

PFA 파라포름알데히드

PEG 폴리에틸렌 글리콜

PPD 정제된 단백질 유도체

PRF F12 영양 혼합물(Nutrient Mixture) F-12를 지닌, 페놀 레드 비함유 배지

RIBI 물-오일 에멀젼 기반 항원 애쥬번트

RT-PCR 역전사 - 폴리머라아제 연쇄 반응

TASTPM APP695 스웨디시(Swedish) 돌연변이 마우스 (TAS10)를 PS-1M146V 계통 (TPM)과 교배함으로써 생성된 2중 트랜스제닉 마우스 계통

TBS TRIS 완충 식염수

Transfast 프로메가(Promega)에 의해 판매되는 리포솜 트랜스펙션 작용제

Tris HCl 트리스-(히드록시메틸)아미노메탄 히드로클로라이드

Tween-20 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트

Versene 금속 이온 킬레이팅 작용제 (에틸렌디아민테트라아세트산)

약어

AMD 연령 관련 황반 변성

APP 아밀로이드 전구체 단백질

BM 부르크막(Bruch's membrane)

CFH 보체 인자 H

CFI 보체 인자 I

CHO 차이니즈 햄스터 난소 세포

CNV 맥락막 혈관신생

CPM 분(minute) 당 카운트(count)

CSF 뇌척수액

ICV 뇌실내

IgG 면역글로불린 감마

i.p. 복강내

hAPP 사람 아밀로이드 전구체 단백질

HIER 열 유도된 항원 회수(heat-induced antigen retrieval)

HVT 건강한 자원자

KD 평형시 해리 상수

NDS 정상 당나귀 혈청

MO 개월령(months old)

MRT 평균 체류 시간

OS 외부 분절(outer segment)

RPE 망막 색소 상피 세포

사람 베타 아밀로이드에 대해 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 생성

먼저, 1세트의 마우스를, PPD에 N-말단 커플링된 펩티드 CGGGNKGAIIGLMVGG (β-아밀로이드의 잔기 27-38을 함유함) (SEQ ID No:7)로 면역화시켰다. 이러한 마우스의 면역 반응은, 혈청 샘플을 채취하고 이를 동일한 펩티드의 오발부민 컨쥬게이트를 사용하여 ELISA로 시험함으로써 면역화된 마우스에 대해 항체 역가를 측정함에 의해 평가하였다. 단지 약한 반응이 관찰되었다. 또 다른 실험에서, 마우스 세트를, 복강내 경로를 통해, RIBI 애쥬번트 중의 PPD (정제된 단백질 유도체; Cambridge Research Biochemicals)에 컨쥬게이션된 N-말단 커플링된 CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG (β-아밀로이드의 잔기 22-38을 함유함) 10g으로 면역화시켰다. 이러한 마우스의 면역 반응을, 또 다시, 각각의 부스트(boost) 후 7일째에 혈청 샘플을 채취하고 이를 ELISA로 시험함으로써 면역화된 마우스에 대해 항체 역가를 측정함에 의해 평가하였다. 2.5g의 펩티드 컨쥬게이트를 사용한 부스팅에 의해 마우스가 최적 반응에 도달한 경우 (마지막 2개의 혈청 샘플에서의 항체 역가의 비교 분석을 기초로 함), 최상의 항체 역가를 지닌 마우스를 선별하고, 하이브리도마 생성을 위해 비장을 취하였다. 비장 세포를 수득하고 이를 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마를 생성시켰다. 그 후, 생성된 혼합 세포 집단을 96 웰 세포 배양 플레이트내로 플레이팅 아웃(plated out)하였다.

그 후, 배양 상층액에 함유되어 있는 발현된 항체 각각을 FMAT (형광 미소용적 검정 기술) 균일 면역검정으로 스크리닝하였다. 29개의 포지티브 항체가 이러한 스크리닝 캐스케이드(screening cascade)로부터 확인되었는데, 이들 항체는 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)에 수동 흡수된 오발부민 단백질에 대해서는 네거티브였지만, 하기 (i) 내지 (iv)에 대해서는 포지티브였다:

(i) 폴리스티렌 비드에 결합된, N-말단 커플링된 CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG (22-38) (SEQ ID No:73) 오발부민 컨쥬게이트,

(ii) 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 비드에 결합된, N-말단 바이오티닐화된 β-아밀로이드(1-40) 펩티드,

(iii) 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 비드에 결합된, C-말단 바이오티닐화된 β-아밀로이드(1-40) 펩티드, 및

(iv) 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 비드에 결합된, N-말단 바이오티닐화된 β-아밀로이드 (24-34) 펩티드로서, β-아밀로이드의 잔기 24-34가 VGSNKGAIIGL (SEQ ID No:8)인 펩티드.

선택된 항체 상층액 샘플을, 하기 개략적으로 설명된 바와 같이 β-아밀로이드(1-40)에 대한 결합 동력학에 대해 분석하였다.

표면 플라스몬 공명 검정을 사용한 결합 상호작용 오프-레이트(off-rate) (kd)의 측정

Biacore A100 기기를 사용하여, 29개의 선택된 항체와 β-아밀로이드(1-40)의 상호작용에 대한 오프-레이트 동력학을 제공하였다. 이를 위해, 스트렙타비딘 Biacore 센서칩 플로우셀(flowcell)을 저수준의 N-말단 바이오티닐화된 β-아밀로이드(1-40)로 유도체화시켰다. 각각의 항체 샘플에 대해 3개의 곡선을 생성시키고, 속도 방정식에 적합시켜서 해리 속도를 수득하였다. 12개의 클론에 대해, 오프-레이트에 기초한 등급화(ranking)가 가능하지 않았는데, 이는 해리 속도를 측정하는 것이 선택된 실험 조건을 사용하여 가능하지 않기 때문이었다. 그러나, 이러한 조건하에서, 모든 12개의 클론은 10^-5이상의 오프-레이트(kd)를 나타내었다.

사람 β-아밀로이드 결합 ELISA

상기 확인된 하이브리도마 상층액에 함유되어 있는 29개의 항체를 ELISA에 의해 사람 β-아밀로이드(1-40)에 결합하는 것에 대해 재시험하였다. 타당한 비교가 가능하게 하기 위해, IgG 정량화 ELISA를 사용하여 배양 상층액에 함유되어 있는 항체의 농도를 결정하였다. 작용성 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 일련의 이소타입 특이적 검출 항체를 사용하여 사람 β-아밀로이드 결합 ELISA를 수행하였다. 모든 29개의 항체가 이러한 ELISA 포맷에서 사람 β-아밀로이드(1-40)에 결합하였다. 각각의 결합된 항체 클론에 대한 이소타입은 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b에 대해 사용되고 있는 이소타입 특이적 2차 항체에 의해 확인될 수 있었다. 한 가지 경우, 작용성 이소타입들의 혼합물이 관찰되었다.

오버랩핑(overlapping) 펩티드를 사용하는 ELISA에 의한 에피토프 맵핑

하이브리도마 상층액에 함유되어 있는 1차 스크린으로부터 선택된 29개의 항체에 의해 인식되는 에피토프를 β-아밀로이드 1-42 펩티드의 완전한 서열을 포함하는 31개의 12량체 오버랩핑 펩티드 세트를 사용하여 ELISA에 의해 맵핑하였다. 모든 펩티드는 3 아미노 C-말단 링커 (글리신-세린-글리신) 및 말단 바이오티닐화된 리신 잔기를 함유하였다.

96 웰 면역검정 플레이트를 4℃에서 증류수 중의 웰 당 0.5㎍의 스트렙타비딘 100㎕ (Sigma)을 사용하여 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 3회 세척하고 (PBS/0.01% Tween 20), 웰을 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 웰 당 3% BSA 250㎕를 사용하여 차단하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 100ul의 펩티드 용액 (PBS 중의 1% BSA 0.1% Tween 20 중의 0.5ug/웰)을 실온에서 3시간 동안 3중(triplicate) 웰에 첨가하였다. DMSO 단독 대조 웰을 또한 준비하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 100㎕의 29개의 하이브리도마 상층액 (1% BSA/ 0.1% Tween 20 중에서 1/20으로 희석됨)을 모든 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 항-마우스 IgG 항체-호오스 래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (Amersham, PBS 중의 1% BSA, 0.1% Tween 20 중에서 1:2000으로 희석됨)를 웰 당 100㎕로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 3회 세척하고, 실온에서 약 5분간 웰 당 100ul의 테트라메틸벤지딘 (Sigma) 기질을 사용하여 검출 항체의 결합을 발색시켜서 청색 발색을 모니터링하였다. 반응을 정지시키고, 450nm에서 각각의 웰에 대해 광학 밀도를 판독하였다.

모든 항체는 모티프 KGAIIGLM (β-아밀로이드의 잔기 28-35에 상당함) (SEQ ID No:9)를 함유하는 매우 유사한 영역에 결합하였다.

표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정된 결합 동력학

29개의 푸울(pool)로부터 선택된 8개의 모노클로날 항체에 대한 β-아밀로이드 친화성 및 동력학을, Biacore 3000 기술을 사용하여 보다 상세하 평가하였다. 정제된 마우스 항체 제제를 폴리클로날 항-마우스 IgG 항체 칩 표면상에 포획시켰다. 새로 제조된 사람 β-아밀로이드 1-40을 HBS-EP 완충액중에서 희석시키고, 4 내지 500nM의 농도로 5분간 포획된 항체 표면위를 통과시켰다. 주사 후 해리를 추가 20분간 관찰하였다. 100mM H₃PO₄의 펄스에 의해 재생(regeneration)을 달성하였다. 항체 포획 및 β-아밀로이드 결합의 후속 사이클은 재생에 의해 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다. 모든 작업은 블랭크(blank) 표면 및 블랭크 완충 주사액(buffer injection)에 대해 2중 참조(double referenced)되었다. 수득된 데이터는 표 2에 제시되어 있다.

표 2 - 8개의 선택된 정제 항체에 대한 Biacore 친화성 및 동력학 데이터; 제시된 KD 값은 하나의 실험으로부터의 것임

결과는 모든 8개의 모노클로날 항체의 친화성이 유사하지만, 16D4가 나머지 클론과 비교하여 적어도 12배 내지 2.5배 낮은 친화성을 나타내었음을 보여주었다. 이러한 하나의 실험에서 나머지 7개 항체들 사이의 KD 값의 차이는 4.4배 이하였다. 이러한 클론들 중 2개인 5D1와 6F6을 추가의 스케일-업(scale-up)을 위해 선택하였고, 3중으로 재시험하였다. 이러한 데이터는 표 3에 제시되어 있다.

표 3 - 정제된 모노클로날 항체 6F6과 5D1에 대한 Biacore 동력학 및 친화성 데이터 (3중 작업)

또한, 동일한 Biacore 방법을 사용하여, 6F6이 사람 및 마우스 β-아밀로이드 (1-40) 및 β-아밀로이드 (1-42)에 결합하는 것을 조사하였다. 6F6은 이러한 펩티드들 모두에 유사한 값을 나타내며 결합하였다.

세포 발현된 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 대한 결합

β-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 명명되는 타입 I 트랜스멤브레인(transmembrane) 전구체 단백질의 단백분해 절단에 의해 형성된 펩티드들로 구성되어 있다. APP가 커다란 세포외 도메인을 지니므로, 이러한 단백질에 대한 결합은 잠재적으로 항체 의존성 세포독성 반응(ADCC)을 개시할 수 있다.

FMAT ^TM ABI8200 기반 검정

형광측정 미소부피 검정 기술(FMAT; Cellular Detection System 8200)을 사용하여, HEK 293T 세포상에서 발현된 아밀로이드 전구체 단백질에 대해 상기 선택된 8개의 항체로 세포 기반 결합 검정을 수행하였다. 허위(mock) 트랜스펙션되거나 전장 사람 APP를 엔코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션된 HEK293T 세포를 트랜스펙션후 48시간째에 수거하였다. 트랜스펙션된 세포를 다양한 희석률의 하이브리도마 상층액과 인큐베이션하거나, APP의 세포외 도메인에 대한 정제된 포지티브 대조 항체 LN27 (Zymed) 마우스 IgG 및 β-아밀로이드 펩티드의 유리(free) N-말단만을 인식하는 네거티브 대조 항체 (인하우스(in house) 시약)와 인큐베이션하였다. FMAT blue 태깅된(tagged) 항-마우스 항체를 사용하여 항체 결합을 발색시키고, 셀룰라 디텍션 시스템(Cellular Detection System) 8200을 사용하여 검출하였다. 허위 트랜스펙션된 세포로부터 수득된 백그라운드(background) 신호를 APP 트랜스펙션된 세포로부터 공제(subtracted)하였다. 7개의 클론은, 포지티브 대조 모노클로날 항체 LN27과 비교하여, HEK293T 세포상에서 발현된 APP에 결합하지 않았다. 허위 트랜스펙션된 HEK293T 세포와 관련된 결과를 고찰한 경우, 하나의 클론(5C9)이 HEK293T 세포에 대해 비특이적 결합의 증거를 나타냈는데, 이는 이러한 특정 클론의 APP 결합 능력을 해석하는 것을 어렵게 한다.

트랜스제닉 마우스의 뇌 절편에서의 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 대한 결합

2개월령 TASTPM (Howlett et al 2008) 또는 12개월령 TAS10 마우스의 뇌 절편을 IHC에 의해 조사하였다. 절편을 85% 포름산으로 처리하고, 전장 APP 결합을 위해 염색하였다. 선택된 연령에서, 각각의 마우스는 임의의 아밀로이드 플라크 침착을 나타내지 않지만, 약간의 염색은 이러한 기술을 사용하여 접근가능한 세포내 아밀로이드로 인한 것일 수 있다. 6F6는 이러한 절편에서 염색을 나타내지 않은 반면 전장 APP에 대한 대조 항체 (Zymed)는 염색을 나타내었다.

Fab 단편으로서의 사람 β-아밀로이드 결합 ELISA

비드상에 고정된 파파인을 사용하는 표준 프로테아제 절단에 의해 6F6의 Fab 단편을 생성시켰다 (Pierce #20341). ELISA 플레이트상에 고정된 사람 Aβ 펩티드 (1-40)에 결합하는 것에 대해 6F6 IgG의 정제된 Fab 단편을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 1회의 ELISA 실험으로부터의 결과는 6F6의 Fab 단편이 여전히 Aβ 펩티드 (1-40)에 결합할 수 있음을 나타내었다.

사람 자원자로부터의 혈장 샘플에서의 천연 사람 아밀로이드에 대한 6F6의 결합

건강한 자원자(HVT)로부터의 전혈을 정맥천자(venipuncture)에 의해 K2 EDTA 튜브내로 수집하고, 튜브를 즉시 얼음상에 놓았다. 혈액 샘플을, 4℃에서 15분간 2000 x g로 스피닝(spinning)함으로써 30분 이내에 처리하여, 혈장을 수득하였다. 그 후, 프로테아제 억제제 (Roche Complete Protease Inhibitor cocktail, Cat No: 11 973 580 001, Roche Applied Science)를 제조업자의 지시에 따라 혈장에 첨가하였다. 그 후, 혈장의 분취액을 -70℃ 이하에서 동결시킨 후 분석하였다.

검정은 96-웰 ECL면역검정 포맷 (Meso Scale Discovery, MSD)에서 포획 항체로서 6F6을 사용하였다. 요약하면, 6F6을 96-웰 MSD 플레이트상으로 스폿-코팅(spot-coat)한 후, 샘플 (검정 캘리브레이터(assay calibrator), 네거티브 대조표준, QC 및 시험 샘플)을 첨가하였다. 인큐베이션한 후, 결합되지 않은 물질을 세척해낸 다음, 검출 항체 (바이오티닐화된 4G8 (β-아밀로이드 에피토프 17-24에 대해 특이적임))를 적용하고 인큐베이션하였다. 이어서, 세척한 후, 스트렙타비딘-설포-TAG(streptavidin-sulfo-TAG)를 첨가하였다. 이러한 인큐베이션의 종료시에, 세척 단계를 적용하였다. 플레이트에 MSD 리드 버퍼(Read Buffer) T를 첨가하면 전기화학발광 신호가 MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 6000으로 판독될 수 있게 하였다. 분석물 농도는, 공지된 농도의 A1-42를 사용하여 확립한 검정 표준 곡선을 사용하여 MSD 신호로부터 역산(back-calculation)하였다. 검정을 위한 정량 하한은 78.1 pg/mL 이었다.

표 4에는 상기 설명된 6F6-4G8 항체 검정에 의해 측정된 10 HVT 혈장 샘플의 Aβ 농도가 요약되어 있다. 모든 샘플을 2중으로 시험하였다.

표 4. 6F6-4G8 항체에 의해 측정된 HVT 샘플 중의 Aβ 농도

웨스턴 블롯에 의한 천연 및 변성 조건하에서의 A1-42에 대한 결합

정제된 6F6 모노클로날 항체를 다양한 형태의 Aβ1-42에 결합하는 것에 대해 조사하고, 천연(native) 또는 변성(denaturing) SDS-PAGE 하에서 분석하였다. Aβ1-42는 새로 제조된 것을 사용하거나, 4℃에서 PRF F12로 밤새 전처리된 것을 사용하거나, 37℃에서 PBS 중에서 밤새 정치시킨 것을 사용하거나 37℃에서 10mM HCl 중에서 밤새 정치시킨 것을 사용하였다. 제제를 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 6F6 항체 또는 6E10 (사람 Aβ 1-16에 대해 특이적인 항체; 시판 시약, Eurogentec) 및 5G5 (Aβ1-42에 대해 특이적인 시약, 인하우스 시약)을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 결과는 천연 겔상에서 6E10이 고차 형태(higher form)의 아밀로이드를 인식하는 반면 6F6과 5G5는 이러한 올리고머 및 피브릴(fibrillar) 형태에 대해 비교적 약한 신호를 나타낼 뿐이었다. 변성 조건하에서, 6F6과 5G5는 베타 아밀로이드의 단량체 형태를 주로 인식하는 반면, N-말단 특이적 6E10은 이러한 실험에서 사용된 변성 조건에 의해 분해되지 않는 베타 아밀로이드의 고차(higher) 응집체에 결합할 수 있었다 (도 1 참조). 결론적으로, 이것은 상기 조건하에서 그리고 상기 설명된 아밀로이드 제제를 사용하는 경우, 6F6이 Aβ1-42의 저분자량 형태 및 단량체에 우선적으로 결합한다는 것을 나타낸다.

정제된 모노클로날 항체 6F6의 ELISA에 의한 에피토프 맵핑

정제된 6F6 모노클로날 항체를 사용하여, 상기 개략적으로 설명된 에피토프 맵핑을 ELISA에 의해 반복하였다. 사용된 프로토콜은, 희석된 하이브리도마 배양 상층액 대신 100㎕의 희석된 정제된 항체 용액 (1% BSA 중의 0.1ug/ml)을 첨가하는 것을 제외하고는 동일하였다.

정제된 6F6 항체는 모티프 KGAIIGL (β-아밀로이드의 잔기 28-34에 상당함)에 결합하였지만, 결합은 잔기 35M이 펩티드에 포함되어 있는 경우 (β-아밀로이드의 잔기 28-35에 상당함; (SEQ ID No:9)) 훨씬 향상되었다. 오버랩핑 에피토프 맵핑 기술을 사용하는 경우 이웃하는 잔기들의 경미한 기여가 배제될 수 없다.

모노클로날 항체 6F6의 표면 플라스몬 공명에 의한 에피토프 맵핑

스트렙타비딘 코팅된 센서칩에 의해 포획된 β-아밀로이드 서열의 24-35 (SEQ ID No:10: VGSNKGAIIGLMGSG), 28-39 (SEQ ID No:11: KGAIIGLMVGGVGSG) 및 31-42 (SEQ ID No:12: IIGLMVGGVVIAGSG)를 나타내는 C-말단 바이오티닐화된 펩티드로 정제된 6F6 모노클로날 항체를 8 내지 64nM로 3분간 주입하였다. Biacore 3000 기기를 사용하여 실험을 수행하였다. 결과는 6F6이 β-아밀로이드의 펩티드 24-35와 28-39에 결합할 수 있지만 펩티드 31-42에 결합할 수 없음을 나타내었는데, 이는 상기 오버랩핑 펩티드 결과를 확인해준다. 또한, 이는 6F6과 결합하는 데에 있어서 잔기 31-35가 충분치 않고, 35번 위치 위쪽에 있는 잔기들이 이러한 항체와 결합하는 데에 관여하는 것으로 여겨지지 않음을 나타낼 수 있다.

아밀로이드가 중추 투여된 후 아밀로이드 혈중 수준에 대한 항-β-아밀로이드 모노클로날 항체 6F6 및 5D1의 정맥내 투여의 효과

본 연구의 목적은 시험 항체가 정맥내로 미리 주사된 마우스에서 ¹²⁵I (1μCi) β-아밀로이드 1-40의 뇌실내(ICV) 주사 후의 혈중 방사능 수준을 조사하는 데에 있었다.

¹²⁵I (μ1Ci) β-아밀로이드 1-40을, ICV 캐뉼러삽입된(cannulated) 수컷 C57BL6/J 마우스 (처리 당 n=8-10)에 ICV 주입에 의해 투여하였다. ¹²⁵I β-아밀로이드 1-40를 ICV 주입하기 1시간 전에, 포스페이트 완충 식염수(PBS) 또는 600㎍의 항-β-아밀로이드 모노클로날 항체 6F6 또는 5D1을 마우스에게 정맥내 주사하였다. ICV 주입 후에 동물들을 우리로 복귀시키고, ICV-주입 후 4시간째에 선별하여 혈액을 채취하고, 분 당 카운트(counts per minute, CPM) 감마 방사선을 검출하였다.

외과적 준비

마우스를 이소플루오란 (3-5%)의 흡입에 의해 마취시키고, 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 넣었다. 임의의 외과적 절차 전에, 진통을 위해 마우스에게 0.05mls (스톡(stock)으로부터의 1:10 희석액)의 피하용 vetergesic® (Buprenorphine)을 투여하였다. 두부(scalp)의 정중선을 따라 절개하고, 두개골(skull)의 배측면(dorsal aspect)을 깨끗이 하고 건조시켰다. 정수리점(bregma)에 대한 하기 스테레오택식 좌표에서 두개골에 구멍(bore hole)을 뚫어 측뇌실(lateral ventricle)내로 캐뉼러를 넣었다 (전후(anterioposterior) (AP): -0.5, 측면(lateral) (L): +0.7, 배측/복측(dorsal/ventral) (DV): -2.5). 두개골에 추가로 2개의 구멍을 뚫어서 피질 스크류(cortical screw)를 넣었다. 캐뉼러를 시아노아크릴레이트 겔에 의해 적소에 앵커링시키고, 절개부를 시아노아크릴레이트 겔 헤드캡(headcap) 주변에서 봉합하였다. 수술후에, 마우스에게 0.3ml 식염수를 피하 투여하고, 마취로부터 회복되도록 따뜻한 환경에 두었다. 바로잡기 반사(righting relex)의 회복시에, 마우스를 한 마리씩 수용하고, 표준 수술후 관리를 5일간 받게 하였다. 5일간 또는 수술전 체중으로 되돌아 갈때까지 추가의 절차를 수행하지 않았다.

캐뉼러 배치

회복 후에, 안지오텐신 II 음용 반응(drinking response)에 의해 캐뉼러 배치를 확인하였다. 각각의 마우스에게 100ng의 안지오텐신 II를 ICV 투여하였다. 투여 후, 15분간 물 섭취를 관찰하였다.

결과

비히클이 투여된 동물과 비교하여 모노클로날 항체 6F6과 5D1 둘 모두가 투여된 동물의 혈액에서 유의할 만한 방사능 증가가 관찰되었는데, 이는 아마도 순환 중인 방사성표지된 β-아밀로이드와 결합함으로써 표지된 β-아밀로이드 1-40 펩티드의 혈중 반감기를 연장시키는 능력으로 인한 것이다. 모노클로낭 항체들 간의 차이는 유의할 만하지 않았다. 6F6과 5D1 처리는 CPM 대 비히클 주사된 대조표준에서 통계적으로 유의할 만한 증가를 일으켰다 - (CPM: 비히클 1280 +/- 312; 5D1 8152 +/- 2001; 6F6 8875 +/- 2123) 단변량(Univariate) ANOVA, F (3,32) = 15.14, p<0.001 (로그 변환된 데이터), post-hoc LSD 시험 ***p<0.001 모든 군 대 비히클.

기니피그에서 6F6-아밀로이드 복합체 형성의 약동학의 조사

본 연구의 목적은 사람과 동일한 β-아밀로이드 아미노산 서열을 지닌 기니피그에서 생체내 항체-β-아밀로이드 복합체 형성을 측정하는 데에 있었다. 이는 19일의 기간에 걸쳐 다양한 시점에서 유리 항체 농도와 항체-β-아밀로이드 복합체를 측정함으로써 달성되었다.

방법

수컷 던킨-하틀리(Dunkin-Hartley) 기니피그를, 2중 경정맥 캐뉼러를 사용하여 이소플루오란 마취하에 외과적으로 준비하였다. 캐뉼러삽입된 기니피그에게 1시간에 걸쳐 항체 6F6 (n = 6)을 정맥내 주입시켰다. PBS 용액 중의 정제된 항체 제제를, 3 mg/kg의 표적 투여량을 달성하기 위해 각각 0.700 및 0.625 mL/kg/h로 투여하였다. 혈액 샘플 (60 ㎕)을 투여 전에(0분) 각각의 기니피그로부터 채취하고, 주입 개시후에 하기 시점에서 EDTA 튜브를 사용하여 수거하였다 (20일에 걸쳐): 15분째, 30분째, 45분째, 60분째 (iv 주입 오프(infusion off)), 90분째, 120분째, 180분째, 360분째, 8시간째, 10시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째, 120시간째, 144시간째, 168시간째, 192시간째, 216시간째, 240시간째, 264시간째, 312시간째, 360시간째, 408시간째 및 456시간째.

대량의 샘플 (0.5 ml)을 주입 개시 후 0시간째, 10시간째, 96시간째, 216시간째, 312시간째 및 456시간째에 채취하였다. 20일째의 최종 혈액 샘플 채취 후, 동물들을 마취시키고, 방혈시켰다. ELISA에 의해 분석할 때까지 혈장 샘플을 -80℃에서 저장하였다. β-아밀로이드 1-40 코팅된 마이크로타이터(microtiter) 플레이트를 사용하는 항원 결합 ELISA에 의해 유리 항체 수준을 평가하였다. 0시간째, 10시간째, 96시간째, 196시간째, 312시간째 및 456시간째의 혈장 샘플을 이러한 웰에 첨가하고, 결합된 6F6 모노클로날 항체를 항-마우스 IgG-HRP 컨쥬게이트를 사용하여 검출하였다. β-아밀로이드-항체 복합체는, β-아밀로이드 42 C-말단-특이적 폴리클로날 항체로 코팅된 플레이트상에서의 포획에 의해 검출하였다. 포획된 복합체는, 항-마우스 IgG 바이오틴 컨쥬게이트와 스트렙타비딘 유로퓸 크립테이트에 의해 6F6 모노클로날 항체를 통해 검출하였다.

결과

유리 항체 수준은 IV(정맥내) 전달 후에 예상된 바와 같이 신속히 증가하였지만, 또한 처음 24시간 기간내에 신속히 감소하였다. 수준은 약 160시간째에 정상 상태 수준에 도달하였다. 결과는 6F6 항체에 대해 1.75 ml/h/kg의 혈액 제거율 그리고 49.4시간의 평균 체류 시간(MRT)을 나타낸다.

또한, 복합체 수준은 항체의 투여 후에 신속히 상승하였고, 평균 복합체 수준은 연구의 나머지 기간에 걸쳐 그러한 수준에서 안정적으로 유지되었다. 그러나, 개개의 동물은 상당한 변동을 나타내었다. 일부 동물에서, 복합체 수준은 감소하였고, 일부 동물에서는 복합체 수준이 증가하였지만, 대부분의 경우 복합체 수준은 약 216시간째 이후에는 안정적인 것으로 나타났다. 실험은 사람 등가 아밀로이드(human equivalent amyloid)와의 복합체가 생체내에서 형성될 수 있고, 복합체의 수준은 1회 투여 후에 혈장에서 장기간 동안 불변 상태로 존재함을 나타내었다.

트랜스제닉 TASTPM 마우스에서의 6F6을 사용한 4주 투여 연구

사람 아밀로이드 전구체 단백질(hAPP)을 과발현하는 트랜스제닉(tg) 마우스는 아밀로이드증 모델을 제공하고, 아밀로이드 생산, 격리(sequestration) 및 침착에 대한 약물의 영향을 연구하기에 적절하다. 이러한 연구를 위해, 본 발명자들은 사람 아밀로이드 전구체 단백질과 프레세닐린(presenilin) 1의 돌연변이형을 과발현하는 TASTPM 트랜스제닉 마우스 (APP695 스웨디시 돌연변이 마우스 (TAS10)와 PS-1M146V 계통 (TPM)을 교배시킴으로써 생성된 2중 트랜스제닉 마우스 계통 (Howlett et al 2008))을 사용하였다. 약 10주령의 수컷 및 암컷 마우스에서 연구를 수행하였다.

동물들은 3개의 처리군으로 존재하였다:

처리군:

(A) 연구 개시시의 아밀로이드 수준을 측정하기 위해 화합물이 투여되지 않은, 1일째에 실험종결된 Tg 동물 (n=16; 수컷 9마리, 암컷 7마리)

(B) 4주간 주 2회로 복강내 주사에 의해 비히클(PBS)이 투여된 Tg 동물 (n=19; 수컷 9마리, 암컷 10마리)

(C) 4주간 주 2회로 복강내 주사에 의해 마우스 당 6F6 300g이 투여된 Tg 동물 (n=19; 수컷 9마리, 암컷 10마리)

투여 계획을 1주 간격으로 개시하며 동물들을 3개의 처리 코호트(cohort)로 분류하였다.

처리 군 당 3마리의 수컷과 3마리의 암컷 동물로부터 2회, 4회, 6회 및 8회 투여 전에 꼬리 정맥 채혈에 의해 혈액 샘플을 채취하였다. 종점(terminal) EDTA 혈장 샘플을 1일째 (군 A)에 또는 최초 투여 후 4주째 (군 B 및 C)에 모든 군으로부터 준비하였다. 좌우측 뇌반구(brain hemisphere)를 취하고, 스냅(snap) 동결시키고, 생화학적 아밀로이드 수준에 대한 후속 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 또한, 꼬리 첨단부를 취하고, 이를 유전자형의 확인을 위해 사용하였다.

뇌 균질물에서의 생화학적 아밀로이드 로드(load)의 측정

추출된 뇌 샘플내의 Aβ1-40과 Aβ1-42의 수준을, ORIGEN 기술 (Igen Internatioanl Inc)을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 뇌반구를 칭량하고, 컴플리트(Complete) TM 프로테아제 억제제 (Roche Diagnostic)를 150mg/ml w/v로 함유하는 5M 구아니딘 HCl (Calbiochem) 중에서 소형(hand held) 막자(pestle)를 사용하여 추출하였다. 추출물을 Igen 완충액으로 희석시키고, 20000g에서의 원심분리에 의해 청징화된(cleared) 1:10 및 1:40 희석액을 검정에서 사용하였다.

ORIGEN 검정은, 샘플로부터 Aβ를 포획하기 위해 고정된 바이오티닐화된 6E10 항체 (사람 Aβ 1-16에 대해 특이적임; Signet Labs)와 함께 스트렙타비딘 코팅된 다이나비즈(Dynabeads) (Dynal)를 사용하였고, 결합된 Aβ의 검출에는 ori-tag 표지된 G210 (Aβ1-40에 대해 특이적인 항체; 인하우스 시약) 또는 5G5 (Aβ1-42에 대해 특이적인 항체; 인하우스 시약)을 사용하였다.

각각의 군으로부터 사후(post-mortem) Aβ1-40 및 Aβ1-42 부담(burden)의 분석은 이러한 연구에서 그리고 여기서 사용된 분석 방법에 의해 6F6 처리 관련 뇌 아밀로이드의 감소를 나타내지 않았다. 뇌 아밀로이드의 잠재적 감소에 대한 확정적인 결론에 도달할 수 없었는데, 이는 연구 과정에서 비히클 처리된 동물들의 뇌에서의 Aβ 증가 패턴이 미미했고, 모든 동물에 걸쳐 균일하지 않았기 때문이다.

6F6 항체의 혈장 수준의 측정

장기간(longitudinal) 및 종점 EDTA 혈장 샘플을 ELISA에 의해 항체 수준에 대해 평가하였다. 요약하면, 샘플을 1:50, 1:500 및 1:5000으로 희석하고, PBS로 희석된 0.5 ㎍/ml의 고정된 Aβ1-40 펩티드를 지닌 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 세척하고, 결합된 6F6 항체를, 항-마우스 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 사용하여 검출하였다. 0 내지 30㎍/ml의 8개의 공지된 6F6 농도를 사용하여 생성된 표준 곡선을 이용함으로써 샘플내의 농도를 측정하였다.

결과는 모든 마우스에게 6F6 항체가 성공적으로 투여되었고, 종점 혈장 농도는 약 250㎍/ml의 평균값을 지녔음을 나타내었다. 장기간 혈장 샘플은 반복 투여로 인해 2회 및 4회 투여 사이에 혈장 수준의 증가를 나타내었지만 샘플 채취된 모든 동물에서 연구의 종료시까지 150 ㎍/ml 이상의 수준을 유지하였다.

면역침전 및 웨스턴 블롯에 의한 혈장내의 아밀로이드-항체 복합체의 측정

항체-Aβ 복합체가 이러한 생체내 연구에서 형성되었는 지를 알아보기 위해, 면역침전에 이어 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 복합체의 형성에 대해 혈장 샘플을 조사하였다. 요약하면, 15㎕ 혈장 샘플을 인큐베이션하고, 4℃에서 3시간 동안 10 ㎕의 단백질 A 세파로오스 비드 슬러리와 함께 진탕시켰다. 프로테아제 억제제를 함유하는 1ml의 빙냉(ice cold) PBS로 비드를 5회 세척하였다. 매번 샘플을 4℃에서 2000rpm으로 2분간 원심분리하였다. 세척 후, 0.1M DTT를 함유하는 20㎕ 전기영동 샘플 완충액에 비드를 재현탁시켰다. 샘플을 5분간 비등시키고, 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 상층액을 다시 비등시킨 후, 샘플을 10% Bis/tris 미니겔(minigel)상에 로딩하고, 전기영동에 의해 분리하였다. 겔을 니트로셀룰로오스 막상으로 블롯팅하고, 6E10 항체 (사람 Aβ 1-16에 대해 특이적임; Signet Labs)를 사용하여 프로빙(probing)하였다. 결합된 6E10의 검출에는 IR dye800 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (H+L) 항체 (Rockland)를 사용하였다. 오디시(Odysee) 적외선 이미징 시스템을 사용하여 블롯을 가시화시켰다.

결과는 면역침전법을 이용하여 공동 정제된(co-purified) 블롯상에서 저분자량 Aβ가 검출될 수 있음을 나타내었다. 이는 6F6과 Aβ와의 복합체가 생체내에서 형성되어 혈장 샘플에 존재한다고 결론내려지게 할 것이다. 밴드 세기(band intensity)는 시험된 암컷 동물에서 보다 약했다. 종합해보면, 이는 6F6이 생체내에서 사람 Aβ에 결합할 수 있고, 웨스턴 블롯팅에 의해 검출될 수 있는 안정한 복합체를 형성할 수 있음을 확인해주었다.

트랜스제닉 hAPP 마우스에서의 6F6을 사용한 16주 투여 연구

뮤린 Thy-1 프로모터의 제어를 받으며 hAPP(751)를 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하였는데, 이러한 마우스는 런던(London) (717) 및 스웨디시(Swedish)(670/671) 돌연변이를 지닌 사람 APP를 높은 수준으로 발현함으로써 아밀로이드 베타 1-40 및 아밀로이드 베타 1-42 (Aβ1-40 및 Aβ1-42)의 연령 의존성 증가를 일으킨다. 이러한 마우스는 약 4개월째에서 시작하는 이른 연령에서 아밀로이드 침착물로 구성된 플라크를 생성시킨다. 뇌 병상(pathology)의 중증도는 연령 증가 및 행동 결핍과 상호관련된다.

투여되는 화합물의 정체를 숨긴 채로 조사자가 모르게 하여 이러한 연구를 수행하였다. 4개월령의 암컷 트랜스제닉 마우스를 3개의 군 (군 당 n = 15) 및 비-트랜스제닉 한배새끼(littermate)의 군으로 배정하고, 4개월의 기간에 걸쳐 복강내 경로를 통해 매주 처리하였다. 한배새끼 군 및 대조 IgG가 투여된 Tg 군은 대조표준의 역할을 하였다. 처리의 종료시에, 행동 시험을 수행하고 (Morris Water Maze, New Object Recognition Task), 동물들을 치사시켰다. 뇌, CSF 및 혈장을 수집하였다. 각각의 뇌의 한 쪽 반구를 조직학적 평가를 위해 처리하고, 두 번째 것은 TBS, 트리톤 X-100, SDS 및 포름산(FA) 뇌 균질물 분획 뿐만 아니라 CSF 중에서 Aβ1-38, Aβ1-40 및 Aβ1-42를 측정하기 위해 즉시 동결시켰다. 항-베타 아밀로이드 항체 6E10를 사용하는 면역염색을 이용하여 고정 샘플(fixed sample)내의 뇌 플라크 로드를 측정하고, 컴퓨터 이미지 분석 소프트웨어(Image Pro Plus, version 4.5.1.29)를 이용하여 플라크 표면적 및 플라크 개수를 측정하고 계수하였다. VIP 검출 시스템 (Vector®)을 사용하여 바이오티닐화 2차 항체에 의해 마킹된(marked) 시냅토피신(synaptophysin) 특이적 항체 염색 (Neomarkers®) 항체를 사용하여 시냅스 밀도를 조사하였다.

처리 군: Tg 동물의 3개 군 (15마리/군) 및 비-트랜스제닉 C57BL6 동물의 1개 군 (n=15):

(A) 17mg/kg bw의 화합물 6F6이 매주 투여된 Tg 동물 (n=15)

(B) 17mg/kg bw의 화합물 mIgG2a이 투여된 Tg 동물 (n=15)

(D) 33mg/kg bw의 화합물 6F6이 투여된 Tg 동물 (n=15)

(E) 비-트랜스제닉 한배새끼; 17mg/kg bw의 mIgG2a가 투여됨 (n=15)

순차적으로 추출된 뇌 균질물 및 CSF에서의 생화학적 아밀로이드 로드의 측정

CSF를 처리군 A, B 및 D의 동물로부터 수집하고, 즉시 동결시킨 후, ELISA 기술에 의한 추가 분석을 위해 준비하였다. 뇌 균질물의 경우, 군 A, B 및 D의 동물로부터의 동결된 반구를 프로테아제 억제제 칵테일(cocktail)을 함유하는 5 ml TRIS 완충 식염수(TBS) 중에서 균질화시켰다. 뇌 균질물의 거의 절반을 분취하여 즉시 동결시켰다. 나머지 절반을 74,500 g에서 1시간 동안 원심분리하고, 생성된 상층액 (= TBS 분획)을 분취하고, 측정할 때까지 -20℃에서 유지시켰다. 펠릿(pellet)을 트리톤 X-100 (2.5 ml) 중에 현탁시키고, 원심분리하고, 상층액을 분취하고, -20℃에서 유지시켰다. 이러한 단계를 SDS (2.5 ml)를 사용하여 반복하였다. SDS 분획의 펠릿을 70% 포름산 (0.5ml) 중에 현탁시킨 후, 원심분리하였다. 수득된 상층액을 1M TRIS (9.5 ml)로 중화시키고, 분취하고, -20℃에서 유지시켰다. 제조업자의 지시사항에 따라 시판되는 키트 (Sector Imager MS2400를 사용하는 Mesoscale Discovery Abeta 3-plex kit #K15148E)를 사용하여 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42를 측정하기 위해 CSF 뿐만 아니라 4개의 뇌 분획 샘플을 사용하였다. 습뇌(wet brain) g 당 Aβ ng으로서 뇌 수치(brain value)를 계산하였고, CSF 수치는 ml 당 Aβ pg로서 계산하였다.

TBS 분획의 경우, Aβ 수준은 모든 3개의 아밀로이드 종에 대해 군 B의 동물이 최저였다. Aβ42의 경우, 6F6 처리 군 A 및 D에서의 이러한 증가는 대조 군 B에 비해 유의할 만하였지만 (군 A에 대해 p<0.05이고, 군 D에 대해 p<0.001임), Aβ38 및 Aβ40의 경우에는 유의할 만하지 않았다. 트리톤 X-100 분획의 경우, 평균 Aβ42 수준이 대조 군 B에 비해 6F6 처리 군 A (p<0.05) 및 D (p<0.01)에서 또한 유의할 만하게 증가하였다. 군 B 및 D의 Aβ40 수준은 유의할 만하게 다르지 않았던 반면, 군 A의 Aβ40 수준은 대조 군 B에 비해 유의할 만하게 증가하였다 (p<0.05). 유의성(significance)이 없다고 하더라도, 대조 군 B에 비해 6F6 처리 군 A에서 Aβ38이 증가한 것이 관찰되었지만, 6F6 처리 군 D에서는 대조 군 B에 비해 약간 감소하였다. SDS 및 FA 분획에서 측정된, 결합된 수불용성 Aβ는, 군 B (Aβ38 및 Aβ42) 또는 D (Aβ 38 및 Aβ 40)에 비해 6F6 처리 군 A 동물의 뇌에서 유의할 만하게 높았다. 대조 군 B 및 6F6 처리 군 D는 유의할 만하게 다르지 않았다.

CSF 샘플의 경우, Aβ38, Aβ40 수준에 대한 유의할 만한 차이가 군 사이에서 관찰되지 않았다. Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준은 6F6 처리 군 A와 비교하여 대조 군 B 동물에서 약간 낮았다. 6F6 처리 군 D 동물의 CSF Aβ42 수준은 대조 군 B와 비교하여 유의할 만하게 증가하였는데 (p<0.05), 아마도 이는 CSF내로의 격리 또는 간접적으로는 혈류를 통한 가용성 Aβ42의 동원(mobilisation)을 나타낸다.

시냅스 밀도의 측정

동물 당 3개의 슬라이스(slice)를 항-시냅토피신 항체 (1:200; Neo Markers; Cat# RM9111-SO)와 바이오티닐화된 2차 항체 (1:200; Vector Laboratories; Cat# PK-6101)로 염색시킨 후, VIP 발색시켰다 (퍼옥시다아제에 대한 기질 키트; Cat# SK4600). 개개의 평균 시냅스 밀도를 측정하기 위해, 슬라이스 및 영역 (해마 CA1, CA3 및 덴테이트 기루스 미디얼 블레이드(dentate gyrus medial blade, DGmb)로부터의 과립층) 당 3개의 이미지를 마크로(macro) 기반 측정 절차로 평가하였다. 마크로 작업 동안, 이미지를 동일하게 대비시키고, 일정한 한계치를 초과한 시냅스를 계수하였다. 단일 및 연속 시냅스를 크기 제한의 사용하에 개별적으로 계수하였다. 연속 시냅스의 전체 면적을 단일 시냅스의 평균 크기에 의해 나눈다. 최종적인 시냅스 카운트는 하기 식을 이용하여 계산한다:

또한, 이미지 면적은 혈관의 면적 감소와 관련하여 백그라운드 보정되고(background corrected), 혈관의 면적에 의해 감소된 전체 이미지 면적에 대해 시냅스의 합이 고려된다

처리 군 A, B 및 D로부터 취해진 해마 뇌 절편의 CA1, CA3 및 GDmb 영역에서 시냅스 카운트를 측정한 경우, 처리 군 사이에서 시냅스 밀도는 불변 상태로 유지되었다.

결합되지 않은 (유리) 전체 베타 아밀로이드의 장기간 혈장 수준의 측정

생체내 혈액 샘플을 처리 개시 (0일째) 전에 취하고 안면(facial) 정맥/동맥으로부터 하악골(mandibular) 샘플채취에 의해 3주째, 6주째, 9주째 및 12주째에 재차 취하였다. 혈장을 수득하기 위해 혈액 샘플을 EDTA 바이알 및 코팅되지 않은 바이알내로 수집하였다. 모든 혈장 샘플을 동결시키고, 분석할 때까지 저장하였다.

결합되지 않은 (유리) 아밀로이드의 수준과 전체 아밀로이드 (결합되지 않은 Aβ 및 항체와 복합체화된 것)의 수준을, 기롤랩 워크스테이션(Gyrolab^TM workstation)을 사용하여 측정하였다. 바이오티닐화 6F6 뮤린 mAb를 유리 β-아밀로이드 검정을 위한 포획 시약으로서 사용하고, 바이오티닐화 N-말단 특이적 항-β-아밀로이드 항체 (인하우스 시약)를 전체 β-아밀로이드 검정을 위한 포획 항체로서 사용하였다. 포획 시약 둘 모두를, 스트렙타비딘 코팅된 매트릭스를 함유하는 기로스 바이오애피(Gyros Bioaffy) CD 포획 컬럼상에 포획시켰다. 포획 항체를 700nM의 농도로 첨가하였다. 두 검정 모두의 경우, 검출을 위해, Alexa 647 표지된 4G8 (β-아밀로이드 에피토프 17-24에 대해 특이적임)을 12.5nM의 농도로 사용하였다. 샘플내의 β-아밀로이드의 양을 정량하기 위해, Aβ1-42 표준 곡선을 작도하여 (Innogenetics Aβ1-42), 31.25 pg/ml 내지 20000 pg/ml의 동적 범위(dynamic range)를 제공하였다. Aβ1-42 표준 곡선 및 혈장 샘플의 희석을 β-아밀로이드 고갈된 사람 혈장에서 수행하였다. 장치에 내재해 있는 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석한 후, 엑셀(Excel)로 플롯팅하였다.

전체 β-아밀로이드 수준은 17 mg/kg 및 33 mg/kg 6F6 처리 군 둘 모두에서 3주째 (최초 시점)까지 2000배가 넘게 증가하였다. 33 mg/kg 처리 군이 연구 기간 동안 약간 더 높은 전체 β-아밀로이드 수준을 지니는 것으로 관찰되었지만 투여량 수준 증가와 상호관련되지 않았는데, 아마도 이는 효과가 포화 상태에 도달하고 있었음을 나타내는 것이다. 6F6 처리 군 둘 모두에 대한 유리 β-아밀로이드 수준은 최초의 처리후 시점 (3주째)까지 비-트랜스제닉 마우스가 나타낸 백그라운드 수준으로 존재하는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 이러한 검정에 의해 검출된 β-아밀로이드의 전부는 아니지만 대부분이 항체-β-아밀로이드 복합체와 관련되었기 때문이었을 것이다. 처리 간섭이 없는 경우, 트랜스제닉 마우스에 대한 베타 아밀로이드의 기선(base line) 수준은 비-트랜스제닉 대조 마우스 보다 약 6배 높았다.

6E10 염색을 사용한 플라크 로드의 측정

18마리의 Tg 마우스 (Tg 군 A; B 및 D 중 6마리)의 뇌 절반(brain half)으로부터, 아밀로이드 침착을 정량하기 위해 뇌 당 충분한 수의 슬라이스(slice)를 준비하였다. 6E10 면역반응성을 해마와 피질에서 정량적으로 평가하였다. 층 당 15개 절편 (전체 5개 층은 팍시노스(Paxinos)와 프랭클린(Franklin)으로부터의 모폴로지 아틀라스(morphology atlas) "더 마우스 브레인(The Mouse Brain)" (2nd Edition)에 따른 104도 내지 105도, 107도 내지 108도, 111도 내지 112도, 115도 내지 116도 및 118도 내지 119도에 상응함)을 각각 5μm 두께로 (Leica SM 2000R) 화살모양으로(sagittally) 절단하였다. 절차 변동으로 인한 바이어스(bias)를 피하기 위해, 조사되는 모든 트랜스제닉 동물의 조직을 정확하게 동일한 방식으로 처리하였다.

사람 아밀로이드 펩티드의 위치 1-17에 대해 유도된 모노클로날 6E10 항체 (Signet®)를 사용하여 아밀로이드 침착 및 플라크 로드를 측정하였다. 해마와 피질의 측정된 영역 면적은 모든 조사된 뇌 전체에 걸쳐 일정하였는데, 이는 면역조직화학적 염색 단계 (예를 들어, 수축(shrinkage), 다양한 절단 환경 등)에서 조직에 대한 네거티브 효과를 배제시키고, 처리 유도된 위축(atrophy)이 없음을 나타낸다. 플라크 로드 데이터를 슬라이스내의 개개의 영역 크기와 관련시켜서, 인공물(artifact), 폴딩(folding) 또는 소실 조각(missing piece)에 대처할 수 있게 하였다. 고투여량 6F6 처리 (군 D)은 저투여량 6F6 처리 (군 A; ANOVA: 피질 및 해마: p<0.01) 및 대조 군 B에 비해 해마와 피질내의 플라크 면적 비율을 현저히 감소시켰다 (도 2). 동일한 경향이 mm² 당 플라크 개수에서 나타났는데, 이는 대조 군 B (t-test: 피질: p= 0.093) 및 저투여량 6F6 처리 군 A (t-test: 해마: p=0.051 도 3)에 비해 6F6 처리 군 D에서 또 다시 적었다. 평균 플라크 크기는 모든 처리 군 간에 변함이 없었다.

보체 인자 H 결핍 마우스의 눈에서 아밀로이드증의 입증: '건조' AMD 모델

동물

10주령, 3개월령, 6개월령, 9개월령 및 1년령 cfh ^-/- 마우스 (n=6) (10세대 이상 동안 C57BL/6 유전적 배경쪽으로 역교배됨) 및 연령 매칭되는(age-matched) 정상 C57BL/6 마우스 (n=6)를, 12시간 명(160 lux)-암 주기가 있는 온도 제어되는 환경에서 수용하고, 정규 실험실 식이를 공급하며 유지시켰다 (실험실 사료(lab chow)를 임의로 섭취하게 함). 마우스를 마취시키고 (0.75 ml 케타민(Ketamine), 0.5 ml 도미토르(Domitor), 0.2 ml/100 g의 0.75 ml 멸균수, 이는 필요에 따라 복강내로 보충됨), cSLO 이미징을 수행하기 10분 내지 15분 전에 국소용 1% 트로피카미드와 2.5% 페닐에프린 히드로클로라이드를 사용하여 상기 마우스의 동공을 확장시켰다. 각각의 이미지 시퀀스(image sequence) 전에, 수 방울의 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (0.3%)를 눈에 떨어뜨려 건조되지 않게 하였다. 모든 실험 절차는 법령 [United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act 1986]에 부합하였고, 이러한 법령하에서 상기 절차를 수행하였다.

망막 이미징

하기 상세한 설명된 바와 같이 3개월령, 6개월령 및 12개월령 cfh ^-/- (n=12) 및 연령 매칭되는 대조 (n=6) 마우스에 대해 이미징을 수행하였다. 하기 설명된 바와 같이 공초점 주사 레이저 검안경을 사용하여 고해상(high-resolution) 및 고대비(high contrast) 망막 이미지를 획득하였다. 요약하면, 488-nm 및 820-nm 레이저 선(laser line)을 사용하여 리플렉턴스 이미징(reflectance imaging)을 수행하였다. 488-nm를 사용하여 마우스 망막의 자발형광(autofluorescence) 및 플루오레세인 혈관촬영 이미지를 기록하였다. 498 nm에서 여기(excitation) 및 장벽의 에지(edge)를 지닌 빌트-인(built-in) 표준 방출 컷-오프(cut-off) 필터 (50% 투과율 값)를 사용하였다.

마우스를 마취시키고 (0.75 ml 케타민, 0.5 ml 도미토르, 0.2 ml/100 g의 0.75 ml 멸균수, 이는 필요에 따라 복강내로 보충됨), 이미징을 수행하기 10분 내지 15분 전에 국소용 1% 트로피카미드와 2.5% 페닐에프린 히드로클로라이드를 사용하여 상기 마우스의 동공을 확장시켰다. 각각의 이미지 시퀀스 전에, 1방울의 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (0.3%)를 눈에 떨어뜨려 건조되지 않게 하였다. 공지된 방법을 변경시킨 방법을 이용하며 공초점 주사 레이저 검안경 (Heidelberg Retina Angiograph, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)을 사용하여 고해상 및 고대비 망막 이미지를 생체내에서 획득하였다 (Guo L, Salt TE, Maass A, Luong V, Moss SE, Fitzke FW, Cordeiro MF (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci47:626-633). 요약하면, 핀홀(pinhole) 직경을 100μm로 감소시켜서 축방향 해상도를 개선시키고, 레이저 출력을 증가시켜서 신호 대 잡음 비를 개선시켰다. 마우스 동공에서의 출력은 488nm에서 1400W인 것으로 측정되었다. 특수 설계된 평오목(plano-concave) 콘택트렌즈를 마우스에 장착시키고, 초장(extra-long) 작업 거리를 지닌 50x 현미경 렌즈를 사용하여 광출력(optical power)을 제공하였는데, 이는 광학 해상력을 개선시키고 직경이 3μm만큼 작은 미세모세관(micro-capillary) 구조를 검출할 수 있게 하였다. 토모그래피 이미지 스택(tomographic image stack)을 기록하였는데, 여기서 축 평면을 유리체에서 공막으로(vitreal-to-scleral) 그리고 중심에서 주변으로(central-to-peripheral) 15-μm 간격으로 순차적으로 이동시켜서 1차 혈관총(primary plexus)을 지나 외부 혈관총(outer plexus)까지의 망막 혈관계를 가시화시켰다. 모든 이미지 시퀀스를 8.9 Hz에서 10⁰필드-오브-뷰(field-of-view)로 획득하고, 8-비트 768 768-픽셀 이미지 파일로서 디지털화하여, 1.2 μm/픽셀의 측면 이미지 해상도를 생성시켰다. 마우스 눈에서의 축방향 해상도는 5 내지 8 μm인 것으로 측정되었다.

SPSS (Chicago, IL)를 사용하여 스튜던트 언페어드(Student unpaired) t test를 이미지 데이터에 적용함으로써, cfh ^-/- 및 연령 매칭된 대조 동물 간의 RPE 수준에서의 망막하 자발형광 침착물 개수의 차이를 분석하였다.

조직학 및 면역조직화학

요약하면, 동물들을 케타민과 도미토르를 사용하여 깊이 마취시킨 후, 10주령 cfh ^-/- 마우스 (n=6), 3개월령 (n=3), 6개월령 (n=3), 9개월령 (n=3) 및 1년령 cfh ^-/- 마우스 (n=6)를 0.1 M PBS에 이어 4% 파라포름알데히드 (0.1 M PBS 중, pH 7.2)로 관류시켰다. 눈을 분리하고, 30% 수크로오스 용액 (0.1 M PBS 완충액 중)에서 동결보호(cryoprotection)시키기 전에 4% 파라포름알데히드에 넣고 4℃에서 24시간 동안 정치시켰다. 각막 절개를 통해 수정체를 분리하고, 눈을 OCT 화합물 중에서 신속히 동결시키고, 면역조직화학 분석을 위해 10μm의 두께로 절편화하였다 (상세한 사항은 하기 설명되어 있음). 선택된 동물의 신경망막(neural retina) 및 맥락막을 분리하여 각각 플랫-마운팅(flat-mount)시켰다. cfh ^-/- 마우스 (n=20) 및 연령 매칭되는 대조 (n=20) 마우스로부터의 안구 절편을 1차 항체와 인큐베이션시킨 후, (표 5) 핵을 염색시키기 위해 형광 컨쥬게이션된 적절한 2차 항체 및 DAPI와 인큐베이션시켰다 (상세한 사항은 하기 설명되어 있음).

실온에서 면역조직화학을 수행하였는데, 4% 파라포름알데히드내에 고정된 눈으로부터의 10μm 두께의 동결 절편(cryostat section)에 대해 수행하였다. 0.3% Triton X-100을 지닌 pH 7.4의 0.1M 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중의 5% 정상 당나귀 혈청 중에서 망막 절편을 1시간 동안 차단시키고, 0.3% Triton X-100을 지닌 0.1M PBS 중의 1% 정상 당나귀 혈청을 사용하여 희석시킨 1차 항체와 인큐베이션시켰다. 각각의 1차 항체의 희석법은 하기 설명하는 바와 같았다. 1차 항체에 노출시킨 후, 세척하고, 필요한 경우 형광 컨쥬게이션된 적절한 2차 항체 (Santa Cruz, Biotechnology, Inc.; 당나귀 항 마우스 sc-2099는 0.3% Triton과 2% 정상 혈청을 지닌 PBS 중에서 구성됨 (1:100 희석률, 1차 항체와 동일한 희석액))와 절편을 2시간 동안 노출시켰다 (FITC Santa Cruz, Biotechnology, Inc., 당나귀 항 마우스 sc-2099). 네거티브 대조표준은 이소타입 매칭되는 관련없는 항체 또는 1차 항체가 생략된 것으로 구성되었다. 후속하여, 0.5 ml의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (5 ml의 0.1M PBS에 대한 1㎕의 DAPI 스톡(stock) 용액; Sigma-Aldrich)을 사용하여 핵을 1분간 염색시켰다. 그 후, 0.1M PBS를 사용하여 슬라이드를 수 회 세척한 후, Tris 완충 식염수 (pH 7.4)로 4회 세척하고, 최종적으로 유리 커버슬립(coverslip)을 VECTASHIELD (Vector Laboratories)에 마운팅하였다.

절편을 관찰하고, 8비트/채널 그리고 1024x1024 px의 레이저 주사 공초점 현미경 (Leica SP2; Leitz) 또는 에피-형광(Epi-fluorescence) 광학(bright-field) 현미경 (Olympus BX50F4, Olympus, Japan)으로 이미지를 획득하였는데, 여기서 데이터는 Nikon DXM1200 (Nikon,Tokyo, Japan) 디지털 카메라를 사용하여 3840x3072 px 해상도에서 24 비트 컬러 이미지로서 획득되었다.

시판되는 1차 항체

C3 (FITC-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 1:100 희석액; ICNBiomedicals)를, 망막 절편을 염색시키기 위해 지시된 희석률에서 사용하였다.

본 연구에서 사용되는 항-아밀로이드 데이터 항체:

(1) 1/250 희석률로 IHC 파라핀 임베딩된(embedded) 절편에서 사용이 권고되는, 설치류 아밀로이드 베타에 대해 특이적인 Covance SIG-39153 토끼 폴리클로날 Ab,

(2) 1/100 내지 1/1000 희석률로 IHC 파라핀 임베딩된 절편에서 사용이 권고되는, 사람과 마우스 둘 모두의 아밀로이드 베타를 인식하는 Calbiochem NE1002 (4G8) 마우스 모노클로날 Ab (IgG2b) (포름산 전처리가 필요함),

(3) 1/100 희석률로 IHC 파라핀 임베딩된 절편에서 사용이 권고되는, 사람과 마우스 둘 모두의 아밀로이드 베타를 인식하는 Abcam ab2539 토끼 폴리클로날 Ab (IHC 염색 절차 전에 열 매개된 항원 회수를 필요로 함)

시판되는 2차 항체

표 5: 본 연구에서 사용되는 시판 2차 Ab

cfh ^-/- 마우스에서의 드루제노이드-유사(Drusenoid-like) 침착물의 검출

자발형광 침착물은 노화된 cfh ^-/- 마우스의 망막에서 검출될 수 있다. 형광 지질인 드루제노이드-유사 침착물은 cfh ^-/- 마우스의 약 14주령째에서 검출될 수 있고, 이러한 침착물은 연령이 늘어남에 따라 증가하고, 망막하 공간 (RPE의 정상쪽(apical side))에 위치해 있다. 또한, 이러한 침착물은 야생형 마우스에도 존재하지만, 현저히 낮은 정도로 존재한다. 예를 들어, 6개월령 cfh ^-/- 마우스의 망막의 cSLO 이미지는 회색 배경상에 몇몇 자발형광성 백색 스폿을 확인해주며, 이는 IHC에 대한 시험관내 망막 스프레드(retinal spread)내에서 10x 그리고 40x 배율에서 녹색 (FITC) 채널내의 용이하게 확인가능한 자발형광성 침착물로서 관찰될 수 있다. 자발형광 침착물 간에는 형광 방출 스펙트럼의 커다란 변동이 존재한다 (데이터는 제시되지 않음).

cfh -/- 마우스의 망막의 절편이 IHC 자발형광에 의해 조사되는 경우, RPE 세포의 정상쪽에 있는 망막하 공간에서 보체 C3 침착 부위와 관련하여 드루제노이드-유사 침착물이 관찰될 수 있다. 이는 12개월령 cfh ^-/- 마우스에서 관찰될 수 있다 (데이터는 제시되지 않음).

시판되는 항-아밀로이드 베타 Ab를 사용한 CFH -/- 마우스 눈의 분석

Aβ 염색에 대해 포지티브한 것으로 확인된, 고정된 사람 알츠하이머 뇌의 시판되는 절편 (Abcam ab4582)을 사용하여 표 6에 제시된 3개의 시판되는 항-아밀로이드 베타 Ab의 교차반응성을 검사하였다.

이를 위해 사용된 절차는 다음과 같았다:

뇌 파라핀 절편의 경우:

1. 자일렌 - 10분

2. 100% 에탄올 - 8분

3. 95% 에탄올 - 5분

4. 증류수 - 5분

5. 항원 회수;

- Ab2539 HIER와 시트레이트 완충액

- NE1002(4G8) - 70% 포름산

- SIG-39153

파라핀 및 동결 절편 둘 모두의 경우:

6. PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

7. 5% 정상 당나귀 혈청을 사용하여 1시간 동안 차단

8. PBS를 사용하여 간단히 세척

9. 하기와 같이 1차 항체를 적용:

- Ab 2539 - 1:100

- NE1002 (4G8) - 1:200

- SIG-39153 - 1:250

밤새 인큐베이션

10. PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

11. 하기와 같이 2차 항체를 적용:

ab2539의 경우 - Ab sc-2090 1/100

NE1002의 경우 - Ab sc-2099 1/100

SIG-39153의 경우 - Ab sc-2090 1/100

1시간 동안 인큐베이션

12. PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

13. 1분간 DAPI

12. PBS를 사용하여 세척, 3회

13. TBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 4회

14. 마운팅(mount), 커버슬립 그리고 밀봉.

예상된 바와 같이, 사람 베타 아밀로이드 (NE1002 [4G8], 및 ab2539)와 교차반응할 수 있는 1차 항체만이 사람 알츠하이머 뇌 조직에서 사람 아밀로이드 베타 플라크의 포지티브 검출을 제공하였다 (데이터는 제시되지 않음).

시판되는 Ab를 사용한 노화 (1년령이 지난) 및 10주령 마우스 CFH-/-에서의 아밀로이드 베타의 검출

표 6: 본 연구에서 사용되는 1차 아밀로이드 베타 항체

하기 절차를 수행하였다:

1. 슬라이드를 수 시간 동안 공기 건조

2. 3회 세척

3. 5% NDS를 사용하여 1시간 동안 차단

4. 표 6으로부터의 1차 항체를 다음과 같이 준비:

a. SIG39153 - 1:250

b. NE1002 (4G8) - 1:200

c. Ab2539 1:500

5. 간단히 세척 그리고 1차 항체를 사용하여 밤새 인큐베이션

6. 3회 세척

7. 2차 항체를 다음과 같이 준비:

a. 항-토끼 FITC

b. 항-마우스 FITC

1시간 동안 인큐베이션

8. 3회 세척

9. 1분간 DAPI 적용

10. PBS를 사용하여 3회 세척

11. TBS를 사용하여 4회 세척

12. 마운팅, 커버슬립 그리고 밀봉.

먼저, 상기 설명된 시판되는 3개의 항-아밀로이드 베타 1차 항체를 사용하여, 12 내지 13개월령의 연령 매칭되는 cfh ^-/- 마우스 및 야생형 한배새끼 대조표준 (C57Bl/6)으로부터의 고정된 망막 눈 조직를 조사하였다. 관련된 2차 형광 표지된 2차 Ab를 사용하여 각각의 1차 Ab를 검출하였다. Ab SIG39153의 경우, (상기 설명된 뇌 샘플에서와 같이) 제조업자의 권고된 프로토콜을 수행했음에도 불구하고 어느 조직에서도 신호가 검출될 수 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, 아밀로이드 베타는 시판되는 나머지 항-아밀로이드 베타 1차 항체 둘 모두를 사용하여 노화된 cfh ^-/- 마우스의 망막에서 특이적으로 검출될 수 있었다. 이러한 데이터의 예는 도 4에 도시되어 있는데, 여기서 패널 (A)는 노화된 야생형 마우스로부터의 망막 조직을 나타내고, 패널 (B)는 노화된 cfh ^-/- 마우스로부터의 조직을 나타내는데, 둘 모두 ab2539를 1차 Ab로서 사용하여 프로빙된 것이고, 패널 (C)는 노화된 야생형 마우스로부터의 망막 조직을 나타내고, 패널 (D)는 노화된 cfh ^-/- 로부터의 조직을 나타내는데, 둘 모두 NE1002 (4G8)를 1차 Ab로서 사용하여 프로빙된 것이다. 데이터는 아밀로이드-베타가 특히 노화된 cfh ^-/- 마우스의 부르크막 주위에 침착되어 있음을 나타낸다. RPE/브루크막 계면에서의 침착된 아밀로이드 베타에 대한 항체의 교차반응성의 신호는 도 4 (B)와 (D)에 백색 화살표로 강조표시된 진한 백색 줄무늬로서 관찰될 수 있다. 또한, 일부 아밀로이드 침착이 cfh-/- 마우스의 눈의 신경섬유층과 신경절 세포의 영역에서 관찰될 수 있는데, 이는 예를 들어 도 4 (B)의 상부에 백색 화살표로 강조표시된 신호이다.

후속하여, NE1002 (4G8)와 ab2539 항-아밀로이드 베타 1차 항체 둘 모두를 사용하여 10주령, 연령 매칭되는 cfh ^-/- 마우스 및 야생형 한배새끼 대조표준 (C57Bl/6)으로부터의 고정된 망막 눈 조직을 조사하였다. 또 다시, 아밀로이드 베타는 cfh ^-/- 마우스의 망막에서 특이적으로 검출될 수 있었지만, 야생형 한배새끼의 망막에서는 그렇지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 데이터는 아밀로이드 베타 침착이 10주령 cfh ^-/- 마우스 (n=3)의 망막의 10%에서 일어남을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 침착은 주로 망막 색소 상피층 (RPE)의 기저쪽상에 존재하고, 기저판(basal laminar) 침착과 관련된 것으로 여겨진다 (데이터는 제시되지 않음). 10주령째의 아밀로이드 베타 침착이 "드루제노이드" 자발형광 침착과 보체 C3 침착이 cfh -/- 마우스에서 최초로 나타난 시점과 유사함이 주목된다.

cfh ^-/- 마우스 눈의 망막에서의 6F6과 아밀로이드 베타와의 교차반응성

본 연구에서 사용되는 1차 항체

(i) 6F6 마우스 모노클로날 Ab, IgG2a,

(ii) 마우스 IgG2a 이소타입 대조 모노클로날 Ab (시토신 데아미나아제 항원에 대해 특이적인 인하우스 시약),

(iii) 마우스 IgG2a, 카파 [MOPC-173] 이소타입 대조 모노클로날 Ab (ab18413, Abcam), 공지되지 않은 특이성을 지닌 Balb/c 골수종 유래된 클론

하기 절차를 수행하였다:

1. 슬라이드를 수 시간 동안 공기 건조

2. 1XPBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

3. PBS 중의 0.3% Triton X-100 중의 5% 정상 당나귀 혈청을 사용하여 차단 그리고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션

4. PBS 중의 0.3% Triton X-100 중의 1% 정상 당나귀 혈청으로 희석시켜서 1차 항체를 준비

a. 마우스 모노클로날 아밀로이드 베타 6F6 i) - 1:1000, 1:2000 및 1:4000

b. 마우스 IgG2a 대조표준 ii) 1:1000, 1:2000 및 1:4000

간단히 세척

5. 1차 항체를 적용 그리고 실온에서 밤새 인큐베이션

다음날:

1. 1X PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

2. PBS 중의 0.3% Triton X-100 중의 1% 정상 당나귀 혈청으로 희석시켜서 2차 항체를 준비

a. 염소 항-마우스 Alexa Fluor 488 (1:2000)

2차 항체를 적용 그리고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션

3. 1 X PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

4. PBS 중의 1:5000으로 DAPI 적용 그리고 암실에서 1분간 인큐베이션

5. 1 X PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

6. 1XTBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 4회

7. 벡타쉴드(Vectashield)를 사용하여 마운팅, 커버슬립 그리고 밀봉.

먼저, 연령 매칭되는 cfh ^-/- 마우스 및 12 내지 13개월령의 야생형 한배새끼 대조표준 (C57Bl/6)으로부터의 고정된 망막 눈 조직을 상기 개략적으로 설명된 바와 같이 조사하였다. 시판되는 항-아밀로이드 베타 Ab에 의해 검출된 망막 영역과 유사한 망막 영역에 대해 6F6의 교차반응성이 존재하였지만, 대조 항체와 관련하여 유사한 교차반응성이 존재하였는데, 이는 어느 정도는 2차 Ab 단독의 백그라운드 교차반응성으로 인한 것일 수 있다. 또한, 약간의 백그라운드 염색이 야생형 샘플에서 관찰될 수 있었다.

상기 기술한 백그라운드 염색을 분석하기 위해, 실험을 반복하였는데, 단 2차 항체를 Alexa Fluor 488 표지된 항-마우스 IgG Ab에서 FITC 표지된 분자로 바꾸었다. 또한, 1차 대조 항체를 시판되는 이소타입 대조표준 (iii)으로 바꾸었다.

본 실험을 위해 사용된 절차는 다음과 같았다:

슬라이드를 수 시간 동안 공기 건조

1XPBS를 사용하여 세척, 5분간 1회

PBS 중의 0.3% Triton X-100 중의 5% 정상 당나귀 혈청을 사용하여 차단, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션

PBS 중의 0.3% Triton X-100 중의 1% 정상 당나귀 혈청으로 희석시켜서 1차 항체를 준비

a) 마우스 IgG2a, Kappa ab18413 1:100

간단히 세척

1차 항체를 적용 그리고 실온에서 밤새 인큐베이션

다음날:

1XPBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

PBS 중의 0.3% Triton X-100 중의 % 정상 당나귀 혈청으로 희석시켜서 2차 항체를 준비

b) 당나귀 항 마우스 FITC (1:300)

2차 항체를 적용 그리고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션

1 X PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

PBS 중의 1:5000으로 DAPI를 적용 그리고 암실에서 1분간 인큐베이션

1 X PBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 3회

1XTBS를 사용하여 세척, 매회 5분씩 4회

벡타쉴드를 사용하여 마운팅, 커버슬립 그리고 밀봉.

상기 염색 절차에 의해 수득된 데이터의 예는 도 5에 도시되어 있다. 패널 (A)는 6F6을 1차 항체로서 1:4000의 희석률로 사용하여, 노화된 cfh ^-/- 마우스의 망막의 절편을 염색시켜 수득한 데이터를 도시하고, 패널 (B)는 이소타입 대조표준 (iii)을 1차 항체로서 (6F6과 유사한 w/v 희석률로) 사용하여, 노화된 cfh ^-/- 마우스 (표지된 cfh-/- 시판 네거티브 대조표준)의 망막의 절편을 염색시켜 수득한 데이터를 도시하고, 패널 (C)는 6F6을 1차 항체로서 1:4000의 희석률로 사용하여, 연령 매칭되는 야생형 대조 마우스의 망막의 절편을 염색시켜 수득한 데이터를 도시하고, 패널 (D)는 6F6을 1차 항체로서 1:4000의 희석률로 사용하여, 노화된 cfh ^-/- 마우스의 망막의 절편을 염색시켜 수득한 데이터를 도시한다.

데이터는 6F6이 연령 매칭되는 야생형 마우스 (도 5C)에는 존재하지 않는 cfh ^-/- 마우스의 망막에 침착된 아밀로이드 베타를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인해준다 (도 5A). 6F6의 특이성은, 시판되는 이소타입 대조표준을 6F6과 유사한 w/w 희석률로 1차 항체로서 사용한 경우 염색의 완전한 부재(absence)에 의해 확인되었다 (도 5B). 또 다른 인하우스 이소타입 대조 항체 (ii)를 1:4000의 희석률로 사용하여 수득한 데이터 (도 5D)는 cfh ^-/- 마우스에서의 특이적 망막 염색을 시사하였다. 그러나, 이는 이러한 이소타입 매칭되는 항체의 특이성에 의해 설명될 수 있는데, 그 이유는 시토신 데아미나아제가 노화된 cfh ^-/- 마우스에서 잘 일어날 수 있는 세포 파괴에 대한 마커이기 때문이다. 되돌아보면, 이는 본 실험에서 이소타입 특이적 Ab 대조표준에 대한 적절한 선택이 아니었다.

6F6 및 4G8에 대한 cfh-/- 마우스 눈의 망막에서의 아밀로이드의 교차반응성의 시간 경과.

연령 매칭되는 C57Bl/6 (야생형) 및 cfh-/- 마우스를 10주째 시점 내지 12개월째 시점 사이의 중간 시점에서 면역조직화학에 의해 유사하게 분석하였다: 3개월령 (n=3) 6개월령 (n=3) 및 9개월령 (n=3). 6F6 또는 Calbiochem NE1002 (4G8)을 1차 검출 항체로서 사용하여 분석을 수행하였다. 3개월령째에, 총계 수준(gross level)에서는 야생형 마우스와 cfh-/- 마우스 간에 차이를 거의 관찰할 수 없었다. 그러나, 6개월령째에, cfh-/- 마우스에서는 부르크막과 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 경계부 주변에서 아밀로이드 침착이 명확하게 검출될 수 있었지만 연령 매칭되는 야생형 대조 마우스에서는 그렇지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 6개월 시점에서, 4G8을 사용한 염색은 RPE와 BM 간의 전체 경계부를 커버하는 것으로 여겨졌고, 1차 항체로서 6F6을 사용한 유사한 염색은 더욱 점상(punctuate)이었다 (데이터는 제시되지 않음). 6개월령 시점은 연령 매칭되는 야생형 대조표준에 비해 cfh-/- 마우스 망막에서의 아밀로이드 침착 수준이 IHC에 의해 명백히 구별됨을 나타내었다.

요약하면, cfh ^-/- 마우스는 눈, 특히 망막에서 급성(rapid) 아밀로이드증 모델을 나타내고, 이는 그러한 모델의 "건조" AMD 표현형과 밀접하게 연관될 수 있다. 마우스는 망막에서 아밀로이드 베타에 대한 6F6와 같은 치료용 항-아밀로이드 베타 Ab의 효과를 분석하기 위한 양호한 모델을 나타낼 것이다.

아밀로이드 베타가 보체 인자 I에 결합하는 것을 간섭하는 6F6의 능력의 입증

아밀로이드 베타와 보체 인자 H(CFH)에 대한 '파트너'이고 보조인자인 보체 인자 I (CFI) 간의 직접적 상호작용을 나타내는 최근 공개된 데이터 (Wang, J. et al., 2008)는 cfh ^-/- 마우스 망막에서의 신속한 아밀로이드 베타 침착을 설명하는 것을 보조할 수 있다. CFH의 부재하에서, 아밀로이드 베타는 마우스 망막에서 임의의 "파트너가 없는(unpartnered)" CFI에 자유롭게 결합할 것이다 (Wang, J. et al., 2008, 미공개 데이터). 치료용 항-아밀로이드 베타 항체인 6F6 또는 사람화된 등가물이 아밀로이드 베타에 결합함으로써 아밀로이드 베타와 CFI의 상호작용을 간섭할 수 있다는 것을 입증하기 위해, 문헌 [Wang, J. et al., 2008]에 기재된 실험과 유사한 일련의 실험이 수행될 수 있었다. 6F6을 시판되는 아밀로이드 베타 단백질 제제 (예를 들어, 펩티드 인스티튜트(Peptide Institute)로부터 구입한 것)와 사전 인큐베이션(pre-incubation)하는 것이 시판되는 CFH 단백질 (Quidel Corporation)의 존재 및 부재하에서 시판되는 CFI 단백질 (Quidel Corporation)과 결합하는 6F6의 능력에 미치는 효과는 공지된 바와 같이 측정될 수 있고 (Wang, J. et al., 2008, p716-717), 표준 공동-면역침전(co-immunoprecipitation) 연구 및/또는 BiaCore 분석에 의해 분석될 수 있었다. 유사하게는, CFH의 존재 및 부재하에서 사전 형성된(pre-formed) 아밀로이드 베타:CFI 복합체를 붕괴시키는 6F6 항체의 능력은 공동-면역침전 연구 및/또는 BiaCore 분석에 의해 확인될 수 있었다. 유사하게는, 6F6을 시판되는 아밀로이드 베타 단백질 제제 (예를 들어, 펩티드 인스티튜트로부터 구입한 것)와 사전 인큐베이션하는 것이 시판되는 CFH 단백질 (Quidel Corporation)의 존재 및 부재하에서 시판되는 CFI 단백질 (Quidel Corporation)의 기능에 영향을 주는 6F6의 능력에 미치는 효과는 공지된 바와 같이 (Wang, J. et al., 2008, p717) 보체 C3b (Quidel Corporation) 분해 검정을 사용하여 측정될 수 있고, 표준 SDS PAGE에 의해 분석될 수 있었다. 유사하게는, CFH의 존재하에서 사전 형성된 아밀로이드 베타:CFI 복합체를 붕괴시킴으로써 C3b 분해 기능을 CFI/CFH 복합체에 복원시키는, 6F6 항체의 능력이 공지된 바와 같이 (Wang, J. et al., 2008, p717) 확인될 수 있고, 표준 SDS PAGE에 의해 분석될 수 있었다.

아밀로이드 베타가 망막하 조직에서 저등급(low-grade) 망막 염증을 일으키는 보체 인자 I의 기능을 차단함으로써 드루젠내에서 보체 시스템을 활성화시킨다는 가설을 뒷받침하기 위해 최근 공개된 시험관내 연구로부터의 결과가 제안되었고, 이로써 AMD의 발생과 관련된 인자들 중 4가지인 염증, 보체 활성화, 아밀로이드 베타 침착 및 드루젠을 결부시켰다 (Wang, J. et al., 2008). 보체 인자 I에 결합하는 것에 대해 보체 인자 H와 잠재적으로 경합함으로써 또 다른 보체 경로를 활성화시키는 데에 있어서의 아밀로이드 베타의 효과에 대한 이러한 직접적인 증거는 과거에 공지된 바가 없었다 (Wang, J. et al., 2008). 활성화된 보체 C3 성분의 제거에 대한 아밀로이드 베타의 네거티브 효과를, 6F6와 같은 항체의 치료적 투여에 의해 간섭하는 것은 AMD를 정지시키거나 반전시키는 데에 있어서 신규한 작용 메커니즘을 구성할 수 있었다.

티오플라빈(Thioflavin) T 염색 및 6F6 교차반응성을 사용한 노화된 사람 눈에서의 아밀로이드 베타 침착의 검출

사람 도너 눈 조직의 샘플을 무어필즈 아이 뱅크(Moorfields Eye Bank, Moorfields Eye Hospital, London, UK)로부터 입수하였다. 수득된 첫 번째 샘플은 65세 백인(Caucasian man)의 것이었다 (Moorfields Eye Bank, Moorfields Eye Hospital, London, UK). 눈을 고정시키고, 앞서 설명한 바와 같이 같이 처리하고, 절편을 이미 공개된 프로토콜을 사용하여 티오플라빈 T (Sigma T3516)로 염색시켰다 (Anderson et al., Exp Eye Res (2004), 78; 243-256; Levine, H, Methods in Enzymology (1999), 309;274-284). 눈 조직을 사용하여 생성시킨 티오플라빈 T 염색 데이터는, 기저판 침착물 주위에서 희미한 백색 염색으로서 그리고 눈 조직의 사람 외망막(outer retina)내의 RPE 부르크막 계면 주위에서 드루젠으로서 관찰될 수 있는 티오플라빈 T 결합된 아밀로이드 베타로부터의 형광 신호를 나타내었다.

41세 및 90세 사람으로부터의 샘플을 포함하는 사람 도너 눈 조직의 추가의 샘플을 무어필즈 아이 뱅크(Moorfields Eye Bank, Moorfields Eye Hospital, London, UK)로부터 입수하였다. 이러한 눈을 또 다시 고정시키고, 앞서 설명한 바와 같이 처리하였지만, 이번에는 절편을 1차 항체로서 6F6을 사용하여 염색시키고, 앞서 설명한 바와 같이 FITC 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 2차 항체를 사용하여 가시화시켰다. 90세 눈 샘플은 처리 동안 망막의 대부분이 소실되었지만, 남아있는 조직의 외부 절편에서 6F6에 대한 아밀로이드 교차반응성이 검출될 수 있었다. 이러한 염색은 41세 남성으로부터의 눈의 외부 절편 또는 망막에는 존재하지 않았다. 눈 조직의 사람 도너는 공식적으로 AMD에 걸린 것으로 진단된 적은 없었지만, 무거운 기저판 침착물의 존재 및 또한 이러한 침착물의 아밀로이드 베타와의 관련성은 65세 남성으로부터의 티오플라빈 T 염색된 눈 조직에서의 초기 건조 AMD의 병인(aetiology)을 강력하게 시사한다. 90세 눈의 샘플의 경우 조직 처리로 인해 망막의 대부분이 소실되었지만, 남아있는 조직에서 6F6에 대한 아밀로이드 교차반응성이 검출될 수 있었고 41세 남성 (AMD의 증상을 나타내기에는 너무 젊은 것으로 고려됨)으로부터의 눈의 외부 절편 또는 망막에서는 검출될 수 없었다는 사실은 노화된 사람 눈에서 발견되는 아밀로이드와 결합하는 데에 있어서의 6F6-유사 항체의 용도를 잘 예견해준다.

하이브리도마 가변 영역의 클로닝

가변 영역 서열

전체 RNA를 모든 하이브리도마 세포주로부터 추출한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 cDNA 서열을 역전사 및 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 생성시켰다. RT-PCR에 대한 정방향 프라이머는 뮤린 면역글로불린 유전자 선도(leader)-서열에 대해 특이적인 축퇴성(degenerate) 프라이머들의 혼합물이었고, 역방향 프라이머는 항체 불변 영역에 대해 특이적이었는데, 예를 들어 중쇄에 대해서는 6F6 뮤린 이소타입 IgG2a에 대해 그리고 경쇄에 대해서는 뮤린 카파에 대해 특이적이었다. 프라이머를 존스(Jones)와 벤디그(Bendig) (Bio/Technology 9:88, 1991)가 기술한 전략에 따라 설계하였다. 정확한 V-영역 서열의 후속 확인을 가능하게 하기 위해 V-영역 서열 둘 모두에 대해 RT-PCR을 2중으로 수행하였다. RT-PCR에 의해 생성된 V-영역 생성물을 클로닝하고 (Invitrogen TA Cloning Kit), 서열 데이터를 수득하였다.

6F6 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:19)

6F6 V_H DNA 서열 (SEQ ID No:20)

6F6 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:21)

6F6 V_L DNA 서열 (SEQ ID No:22)

2C1 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:31)

2C1 V_H DNA 서열 (SEQ ID No:32)

2C1 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:33)

2C1 V_L DNA 서열 (SEQ ID No:34)

2E11 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:35)

2E11 V_H DNA 서열 (SEQ ID No:36)

2E11 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:37)

2E11 V_L DNA 서열 (SEQ ID No:38)

4D4 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:39)

4D4 V_HDNA 서열 (SEQ ID No:40)

4D4 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:41)

4D4 V_LDNA 서열 (SEQ ID No:42)

5C9 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:43)

5C9 V_HDNA 서열 (SEQ ID No:44)

5C9 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:45)

5C9 V_LDNA 서열 (SEQ ID No:46)

5D1 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:47)

5D1 V_HDNA 서열 (SEQ ID No:48)

5D1 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:49)

5D1 V_LDNA 서열 (SEQ ID No:50)

14B3 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:51)

14B3 V_HDNA 서열 (SEQ ID No:52)

14B3 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:53)

14B3 V_LDNA 서열 (SEQ ID No:54)

16D4 V_H 아미노산 서열 (SEQ ID No:55)

16D4 V_HDNA 서열 (SEQ ID No:56)

16D4 V_L 아미노산 서열 (SEQ ID No:57)

16D4 V_LDNA 서열 (SEQ ID No:58)

상보성 결정 영역(CDR)은 아미노산 서열에서 밑줄그어져 있다.

6F6 키메라의 클로닝 및 발현

작용성 뮤린 V 영역의 정확한 클로닝을 확인하기 위해 사용될 수 있는 재조합 항체 물질을 발현시키기 위해, 중쇄에 대해 사람 IgG1로 그리고 경쇄에 대해 사람 C 카파 영역으로 그래프팅된(grafted) 모(parent) 뮤린 V 영역으로 구성된 키메라 6F6 항체 (6F6c)을 생성시켰다. 6F6 뮤린 중쇄 및 경쇄 V 영역을 엔코딩하는 DNA와 신호 서열 (Kabat et al "Sequences of Immunological Interest", NIH, 1991, Fifth edition, p.30 95VNP'CL)을, 사람 불변 영역 (각각 IgG1 Fc 불능 또는 사람 C 카파)을 이미 함유하고 있는 포유동물 발현 벡터 RLD-bshe (중쇄에 대해) 및 RLN-bshe (경쇄에 대해)내로 인프레임 클로닝하였다. 적절한 클로닝 부위를 도입함으로써, VH 아미노산 서열의 FR4 (프레임워크 영역 4 (CDR3 다음에 위치하고 첫 번째 불변 도메인에 앞서 위치하는 V-영역 서열))내의 아미노산 서열을 Seq ID19에 제시된 바와 같은 TTLTVSS에서 TLVTVSS로 변경시켰다.

중쇄 발현을 위한 RLD-bshe 발현 벡터의 엘리먼트:

염기쌍 DNA 세그먼트의 설명

0 - 1014 프로모터 (SV40/RSV)

1015 - 2442 항체 중쇄

2443 - 2765 Poly A

2766 - 3142 BG 프로모터

3239 - 3802 DHFR

3803 - 4162 Poly A

4163 - 6322 전체 백본(Total backbone)

5077 - 5937 (상보 가닥) 베타 락타마아제

(상기 제공된 벡터의 엘리먼트의 위치 및 전체 크기는 예시 목적으로 기재된 것일 뿐이며, 항체 쇄 삽입물의 크기에 따라 달라질 것이다)

경쇄 발현을 위한 RLN-bshe 발현 벡터의 엘리먼트:

염기쌍 DNA 세그먼트의 설명

0 - 1014 프로모터 (SV40/RSV)

1015 - 1731 항체 경쇄

1732 - 2051 Poly A

2388 - 2764 BG 프로모터

2774 - 3568 네오마이신

3569 - 3876 Poly A

3877 - 6063 전체 백본

5077 - 5937 (상보 가닥) 베타 락타마아제

정확하게 클로닝된 V_H및 V_L 서열을 지닌 클론을 확인하였고, CHO 세포에서 발현시키기 위한 플라스미드를 제조하였다. 발현된 6F6c 항체를, FPLC 시스템상에서의 단백질 A 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제한 후, Biacore^TM 기술을 사용하는 SPR 및 ELISA에 의해 Aβ에 결합하는 것에 대해 시험하였다. 결과는 정확한 6F6 마우스 V 영역을 클로닝되고 발현되어 모(parent) 뮤린 항체 6F6와 유사한 특징을 지닌 작용성 항체를 생성시켰음을 나타내었다.

중쇄 사람화 전략

6F6 마우스 가변 중쇄 서열에 대해, JH4 minigene (Kabat: YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No:15))과 함께 마우스 6F6 가변 중쇄 서열 (SEQ ID No:19)과 58% 동일성을 지닌 (CDR을 포함함) 사람 생식선 억셉터 프레임워크를 선택하였다 (IGHV1-24, SEQ ID No:13). JH4 minigene 잔기의 최초 4개의 잔기는 도너 항체로부터 유입되는 CDR에 의해 대체되는 CDR3 영역내에 포함된다.

일련의 34개의 사람화된 가변 중쇄 변이체를 서열 비교 및 항체 기능에 대한 가능한 영향을 기초로 하여 생성시켰다. 6F6 뮤린 중쇄 CDR (Kabat 정의(definition)를 사용함) (SEQ ID No: 1, 2 및 3)을 상기 선택된 사람 억셉터 프레임워크내로 그래프팅하였다. 1번, 5번, 13번, 24번, 27번, 28번, 29번, 30번, 37번, 40번, 41번, 48번, 66번, 67번, 69번, 71번, 75번, 76번, 93번 및 94번 (Kabat 번호매김) 위치로부터 선택된 2개 내지 15개 위치에서의 치환을 포함하는 다수의 사람화된 가변 중쇄 변이체를 설계하였다 (표 7). CDRH3의 Kabat 정의에 바로 인접해 있는 93번 및 94번 위치가 연구된 모든 변이체에 포함되었다.

표 7 조사된 V _H 복귀돌연변이 목록

경쇄 사람화 전략

6F6 마우스 가변 경쇄 서열에 대해, 서열 유사성을 기초로 하여 J-영역 카파 1 (Kabat: WTFGQGTKVEIK)과 함께 마우스 6F6 가변 경쇄 서열 (SEQ ID No:21)과 79% 동일성을 지닌 (CDR을 포함함) 사람 생식선 억셉터 프레임워크를 선택하였다 (IGKV2-28). JK-1 minigene 잔기의 최초 2개 잔기가 CDR3 영역에 포함되고, 이는 마우스 6F6 경쇄 CDR3내의 최종 2개 잔기와 동일하다.

6F6 뮤린 경쇄 CDR (Kabat 정의를 사용함) (SEQ ID No: 4, 5 및 6)을 상기 선택된 사람 억셉터 프레임워크내로 그래프팅하여 가변 직선(straight) 그래프트 경쇄 LO를 제공하였다. 서열 비교 및 항체 기능에 대한 가능한 영향을 기초로 하여 일련의 13개의 사람화된 가변 경쇄 변이체를 추가로 생성시켰다. 8번, 11번, 43번, 63번, 64번, 100번 및 104번 (Kabat 번호매김) 위치로부터 선택된 1개 내지 4개 위치에서의 치환을 포함하는 사람화된 가변 경쇄 변이체를 설계하였다 (표 8).

표 8 조사된 V _L 복귀돌연변이 목록

사람화된 중쇄 및 경쇄 DNA의 작제

오버랩핑 올리고(overlapping oligo)의 증대(build up) 및 PCR 증폭에 의해 또는 기존의 변이체를 주형으로서 사용하는 특정 부위(site directed) 돌연변이유발에 의해 사람화된 V 영역을 새로 합성하였다. 포유동물 발현 벡터 RLD-bshe 및 RLN-bshe 내로 클로닝하기 위한 제한 부위 및 뮤린 신호 서열 (Kabat et al "Sequences of Immunological Interest", NIH, 1991, Fifth edition, p.30 95VNP'CL)을 포함시켰다. 그 후, 신호 서열 및 제한 부위와 함께 사람화된 V 영역을 엔코딩하는 PCR 생성물을 포유동물 발현 벡터내로 인프레임 클로닝하였는데, 중쇄 변이체를 RLD-bshe내로 클로닝하여 전장 사람 IgG1 Fc 돌연변이된 중쇄를 엔코딩하는 DNA를 생성시켰고, 사람 카파 불변 영역을 엔코딩하는 DNA를 함유하는 RLN-bshe 내로 경쇄 변이체를 인프레임 클로닝하여 전장 사람 카파 경쇄를 엔코딩하는 DNA를 생성시켰다.

사람화된 중쇄 및 경쇄 항체 조합물 발현의 대표적인 예

6-웰 플레이트에서 사람화된 경쇄 및 중쇄 DNA 작제물의 조합물을 평가하기 위해, 먼저 CHOK1 세포를 소규모로 일시적 트랜스펙션시켰다. 5% 초저수준(ultra low) IgG 우태아 혈청과 2mM 글루타민을 지닌 DMEM F12 중에서 계대시킨 CHOK1 세포를, 6-웰 플레이트에서 컨플루언시(confluency)까지 증식시켰다. 컨플루언트 세포를, 옵티멤 글루타맥스(Optimem Glutamax) 배지 (Invitrogen) 중의 전체 7.5 μg DNA: 30 μg 트랜스펙션 지질 (적절한 지질에 대해서는 WO2006/053783가 참조됨)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 72시간째에, 상층액을 수거하고, 항체 농도에 대해 검정한 후, 사람 Aβ에 결합하는 것에 대해 ELISA에 의해 시험하였다.

또한, 일렉트로포레이션에 의해 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 RLD 및 RLN 플라스미드를 CHO 세포내로 코-트랜스펙션(co-transfection)시킴으로써 사람화된 항체를 대규모로 발현시켰다. 뉴클레오시드 비함유 배지를 사용하여, 적절한 항체를 발현시키는 세포의 안정한 폴리클로날 집단을 선택하였다. 항체를 회수하고, ProSepA HiTrap 컬럼을 사용하는 FPLC에 의해 상층액으로부터 정제하였다.

β-아밀로이드 결합 ELISA에서 사람화된 V _H 변이체의 평가

소규모 6-웰 배양액에서 발현된 34개의 사람화된 V_H 변이체를, 사람 Aβ 펩티드 (1-40)에 결합하는 것에 대해 평가하였다. 모든 34개의 중쇄를 L2 경쇄와 조합시켜서 시험하였다 (하기 표 8 참조). L2와의 일부 조합물은 항체 물질을 발현시켰지만 β-아밀로이드 1-40에 결합하지 못했으므로, 이러한 조합물에 대해 EC50 값은 생성될 수 없었다. EC50 값이 생성될 수 있는 경우, 이러한 값은 실험에 따라 달라졌지만, 각각의 실험에서 기준으로서 함유되었던 6F6 뮤린 V-영역을 사용하는 키메라 작제물의 EC50 값과 비교하여 약 30배 증가된 EC50 값에서 동일한 값까지의 범위였다. CDRH3의 Kabat 정의에 바로 인접해 있는 93번 및 94번 잔기가 모든 사람화된 변이체에서 유지되었다. 구조적인 측면에서 CDRH1의 일부인 것으로 간주될 수 있는 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196(4):901-917) 27번 내지 30번 위치는 복귀돌연변이된 경우 93번 및 94번 단독에서의 치환 보다 더욱 우수한 결합을 제공하였다. 확고한 결합을 제공하기 위해 24번 및 37번 잔기 둘 모두에서의 복귀돌연변이가 함께 필요하였는데, 이들 잔기 중 하나가 없는 경우 사람화된 변이체는 이러한 ELISA 포맷에서 그리고 L2 경쇄와 조합된 경우 Aβ 펩티드 (1-40)에 효율적으로 결합하지 못했다. 표 9는 L2 경쇄와의 조합을 기초로 하여 아밀로이드 결합 특성의 측면에서 최상의 사람화된 V_H 변이체를 나타낸다.

표 9 선택된 사람화된 V _H 변이체

β-아밀로이드 결합 ELISA에서 사람화된 V _L 변이체의 평가

사람 Aβ 펩티드 (1-40)에 결합하는 것에 대해 소규모 6-웰 배양액에서 발현된 사람화된 L0 및 V_L 변이체를 평가하였다. 모든 변이체를 H11과 조합시켜서 시험하였다. 표 10에는 생성된 모든 작용성 V_L 변이체가 요약되어 있다.

표 10 선택된 사람화된 V _L 변이체

경쇄 L2 및 L9, L10, L12 및 L13과의 최상의 V_H 변이체 H11 중쇄 조합물을 더욱 면밀히 조사하였다. 이러한 실험을 위해, 현탁 CHO 세포에서 생성시킨 정제된 항체 물질을 사용하였다. 2가지 상이한 코팅 농도의 Aβ 펩티드 (1-40)를 사용한 2개의 독립적인 실험의 결과가 하기 표 11에 나타나 있다.

표 11 Aβ 펩티드 (1-40)에 결합하는 사람화된 변이체에 대한 EC50 값

농도는 마이크로타이터 플레이트를 코팅하기 위해 사용된 Aβ-펩티드를 의미하는데, 제시된 값은 2중(duplicate) 웰로부터 수득된 것이고 각각의 쌍에 대한 SD가 제시되어 있다.

용액 중의 사람 β-아밀로이드 1-40에 결합하는 것에 대한 경합 ELISA

6F6c 및 사람화된 항체인 H11L2, H11L9, H11L10, H11L12 및 H11L13을, 용액 중의 Aβ1-40 펩티드에 결합하고 사람 Aβ1-40 펩티드와 마우스 6F6 모노클로날 항체의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 경합 ELISA로 평가하였다. 일정한 농도의 바이오티닐화된 β-아밀로이드 1-40을, 연속 희석된 양의 사람화된 6F6 항체 변이체와 사전 인큐베이션시켰다. 그 후, 복합체화된 아밀로이드와 유리 아밀로이드를 포함하는 혼합물을, 고정된 마우스 6F6 모노클로날 항체를 함유하는 웰에 첨가하고, 실온에서 15분간 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 후, 고정된 모(parental) 6F6 모노클로날 항체와 결합하기 위해 여전히 이용가능한 유리 β-아밀로이드의 양을, 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트를 사용하여 검출하였다.

표 12는 정제된 항체 물질을 사용하는 2개의 독립적인 실험에 대한 이러한 경합의 IC50 값을 나타낸다. 모든 사람화된 변이체는 매우 유사한 IC50 값을 나타내며 6F6 모(parental) 모노클로날 항체에 결합하는 것에 대해 효과적으로 경합할 수 있었다.

표 12: ELISA에 의한 사람화된 변이체가 사람 β-아밀로이드 1-40에 결합하는 것에 대해 6F6 모노클로날 항체와 경합하는 것에 대한 IC50 값

표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정된 사람화된 변이체의 결합 동력학

선택된 중쇄 및 경쇄 조합물의 친화도를, Biacore T100 기기를 사용하여 측정하였다. 단백질 A 표면 Biacore 칩을 통해 고정된 사람화된 항체 및 β-아밀로이드 1-40 펩티드를 사용하여 3개의 독립적인 실험을 수행하였다. 6F6의 키메라 분자가 기준 분자로서의 역할을 하였다. 이를 위해, 제조업자의 권고에 따라 1차 아민 커플링에 의해 단백질 A를 CM5 칩상에 고정시켰다. 항-β-아밀로이드 항체를 이러한 표면상에 포획하고, 안정화 기간 후에, 사람 β-아밀로이드 1-40을 1/2 희석액(halving dilution)으로 하여 256-2nM 농도로 통과시켰다. 포획된 항체 표면으로의 완충액 주입을 사용하여 Biacore 최상 실시(best practice)에 따라 데이터 세트(data set)를 이중 참조(double reference)하였다. 선택된 약산성(mild acidic) 재생 조건은 포획된 항체를 분리시켰지만 또 다른 포획 사건을 수행하기 위한 단백질 A 표면의 능력에 현저히 영향을 미치지 않았다. 작업을 25℃에서 HBS-EP 중에서 수행하였다. 결과는 표 13에 모든 3개의 실험의 평균으로서 요약되어 있다.

표 13 선택된 정제된 사람화 항체 변이체에 대한 Biacore 친화도 및 동력학적 데이터

데이터는 3개의 독립적 실험의 평균 KD 및 SD를 나타낸다.

사람화된 항체 H11L9의 에피토프 정밀 맵핑(fine mapping)

사람화된 모노클로날 항체 H11L9의 최소 결합 에피토프를, SRU BIND 플레이트 판독기 (SRU Biosytems)를 사용하여 정밀 맵핑하였다. 에피토프의 정밀 맵핑을 위해 18개 아미노산 서열을 기초로 하여 3개의 펩티드 세트를 생성시켰다: a) 잔기 27-37 10개가 연속적으로 알라닌 잔기로 대체된, 알라닌 스캐닝(scanning) 펩티드 세트; b) 23번 잔기에서 출발하여 18량체 펩티드의 N-말단으로부터 하나의 잔기가 계속하여 제거된, N-말단 트렁케이션된 펩티드 세트 및 c) 40번 잔기에서 출발하여 18량체 펩티드의 C-말단으로부터 하나 잔기가 계속하여 제거된, C-말단 트렁케이션된 펩티드 세트.

모든 펩티드를 하기 포맷으로 생성시켰다: 바이오틴-SGSG 링커-PEPTIDE-아미드, 여기서 상기 링커는 모든 펩티드가 22량체가 됨을 보장하도록 필요한 경우 길어졌다.

스트렙타비딘 코팅된 바이오센서 플레이트 (SRU Biosytems)를 PBS로 세척하고, 거꾸로(upside down) 스피닝하여 완충액을 제거한 후, PBS, 0.1% tween20 및 0.4% 아세토니트릴로 세척하고, 거꾸로 스피닝하여 잔류 완충액을 제거하였다. 웰을 100ul의 PBS, 0.1% tween20 및 0.4% 아세토니트릴 중에서 재현탁시키고, SRU 플레이트 판독기로 판독하여 기선을 설정하였다. 그 후, 50ul의 완충액을 제거하고, 50ul의 희석된 펩티드를 첨가하고, 결합하게 하였다. 그 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, 100ul의 PBS 중에서 재현탁시키고, 기선을 재측정하였다. 기선이 안정화된 경우, 50ul의 완충액을 제거하고, H11L9와 대조 항체를 30ug/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 항체의 결합을 모니터링하였다. 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 100ul의 PBS 중에 재현탁시키고, 세척 단계에 의해 제거될 것인 약한 결합제를 찾기 위해 항체의 첨가에 대해 플레이트를 재측정하고 역참조(referenced back)하였다. 세척 플레이트 결합 수준을 획득하여, 다양한 펩티드 세트에 대한 항체 결합을 분석하였다.

영역의 N-말단 결실은, 잔기 D23 내지 N27이 순차적으로 결실된 경우 결합에 대해 효과를 나타내지 않았다. K28의 결실은 50% 이상 결합을 감소시켰지만, 잔기 G29 내지 A30의 결실은 결합을 추가로 감소시키지 않았다. 잔기 I31 그리고 그 너머의 잔기가 결실되면 결합은 완전히 제거되었다. 이는 완전한 결합을 위해서는 N-말단 경계가 K28을 필요로 한다는 것을 규정하였다. 영역의 C-말단 결실은, 잔기 V40 내지 L34가 하나씩 결실되는 경우 결합에 대해 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 위치 G33 그리고 그 너머의 잔기가 결실되면 결합은 완전히 제거되었다. 이는 결합을 위해서는 C-말단 경계가 적어도 잔기 G33을 필요로 한다는 것을 규정하였다. 따라서, 함께 획득된 N-말단 및 C-말단 결실 데이터는 베타-아밀로이드 펩티드내의 잔기 28-33인 최소 에피토프 KGAIIG에 대해 H11L9를 정밀 맵핑하였다. 이는, 잔기 M35의 제거가 6F6에 의한 결합 신호의 감소(drop)를 야기하는 것으로 여겨졌다는 것을 제외하고는, 모노클로날 항체 6F6에 의한 보다 초기의 오버랩핑 펩티드 에피토프 맵핑을 확인해주었다

잔기 N27 내지 G37로부터의 알라닌 대체 스캐닝은 아미노산 I32, 특히 G33의 알라닌으로의 대체가 결합에 최대 영향을 미쳤음을 나타내었다. 또한, 이러한 데이터는, G33이 이러한 항체의 결합에 대해 결정적인 것으로 여겨졌다는, 상기 C-말단 결실 데이터를 확인해주었다. 결과는 표 14에 개략적인 형태로 요약되어 있다.

표 14 H11L9에 대한 에피토프 정밀 맵핑의 개략적 요약

사람화된 항체 H11L9의 면역제거(de-immunisation)

잠재적 Th-세포 에피토프의 인실리코(in silico) 평가를 수행하였고, 이러한 에피토프를 파괴시키며 작용성(functionality)을 보존하기 위해 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 (각각 SEQ ID No:24 및 SEQ ID No:26)의 아미노산 서열 중의 선택된 잔기를 대안적인 잔기로 대체하였다. Vh에 대한 23번, 30번, 31번, 38번, 42번, 61번 및 95번 위치 및 VL에 대한 11번, 30번, 52번 및 53번 잔기를 각각의 위치에 대해 표 15 및 16에 제시된 대안적인 아미노산으로 대체하였다.

표 15 사람화된 Vh H11에서의 선택된 아미노산 대체

표 16 사람화된 V _L L9에서의 선택된 아미노산 대체

상기 설명된 바와 같은 오버랩핑 올리고의 새로운 증대 및 PCR 증폭에 의해 또는 주형으로서 H11 및 L9 중쇄 및 경쇄 변이체를 사용하는 특정 부위 돌연변이유발에 의해 V 영역을 합성하였다. 포유동물 발현 벡터 RLD-bshe와 RLN-bshe내로의 클로닝을 위한 제한 부위 및 뮤린 신호 서열 (Kabat et al "Sequences of Immunological Interest", NIH, 1991, Fifth edition, p.30 95VNP'CL)을 포함시켰다. 그 후, 변화된 V 영역을 엔코딩하는 생성물을 포유동물 발현 벡터내로 클로닝시켰는데, 중쇄 변이체는 pEF 프로모터를 지닌 RLD-bshe내로 클로닝하여 전장 사람 IgG1 Fc 돌연변이된 중쇄를 엔코딩하는 DNA를 생성시켰고, 경쇄 변이체는 사람 카파 불변 영역을 엔코딩하는 DNA를 함유하며 pEF 프로모터를 지닌 RLN-bshe내로 인프레임 클로닝하여 전장 사람 카파 경쇄를 엔코딩하는 DNA를 생성시켰다.

먼저, 신규한 Vh 변이체 H36-H44를 발현시키고, L9 경쇄와 조합시켜서 평가하고, 신규한 VL 변이체 L15-L18을 발현시키고, H11 중쇄와 조합시켜서 평가하였다. 발현 배양 상층액과 ELISA 및 Biacore 분석을 사용하여 합성 베타 아밀로이드 1-40에 결합하는 것에 대해 발현된 항체를 검정하였다. 이러한 평가를 수행한 후, 결합 효능을 최상으로 보유했던 단일 변화들을 조합시켜서 중쇄 및 경쇄 작제물인 H45-H51 및 L19-L22를 생성시켰다. 이러한 신규한 쇄 변이체를 상기 개략적으로 설명된 바와 같이 파트너 쇄인 H11 및 L9와 조합시켜서 다시 발현시켰다. 이러한 2번째 세트의 변이체로부터, 최상의 중쇄 (H48-H51) 또는 경쇄 (L19-L21)를 서로 조합시켜서 3번째 세트를 생성시키고, 이를 다시 발현시키고 베타 아밀로이드 1-40에 대한 결합 동력학에 대해 Biacore에 의해 조사하였다. 표 17은 이러한 조합 및 결합 동력학을 나타낸다.

표 17: 사람화되고 면역제거된 작제물의 선택된 세트 및 결합 동력학 (Biacore)

결합 동력학을 측정하기 위해 사용되는 Biacore 방법

1차 아민 커플링에 의해 항-사람 IgG (Biacore BR-1008-39)를 CM5 바이오센서 칩에 커플링시켰다. 항-베타 아밀로이드 항체가 이러한 표면상에 포획되었다. 그 후, 베타 아밀로이드 (1-40)를, 2중 참조를 위해 사용되는 0nM (즉, 포획된 항체 표면상에 완충액만이 통과됨)과 함께 256, 64, 16, 4 및 1nM로 통과시켰다. 각각의 아밀로이드 주입 사이에, 3M MgCl₂를 사용하여 표면을 재생시켰는데, 이는 포확된 항체를 분리시키지만 후속 분석을 위해 항체를 포획하는 항-사람 표면의 능력에 현저한 영향을 미치지 않았다. T100에 고유한 1:1 모델을 사용하여 데이터를 분석하였다. 작업 완충액(running buffer)으로서 HBS-EP를 사용하여 25℃ 및 37℃에서 작업을 수행하였다.

이러한 패널로부터, 생리적 온도에서의 결합 동력학에 대해 일부 작제물을 또한 평가하였다. 표 18은 37℃에서 이러한 작제물들의 서브셋(subset)의 결합 동력학을 나타낸다.

표 18: 37℃에서 결합 동력학에 대해 평가된 표 147로부터의 작제물의 선택된 서브셋 (Biacore)

억셉터 프레임워크 및 사람화된 변이체의 V-영역의 아미노산 서열

IGVH1-24 중쇄 억셉터 프레임워크 V 영역, 아미노산 서열 (SEQ ID No:13)

IGVH1-24 중쇄 억셉터 프레임워크 V 영역 DNA (SEQ ID No:14)

IGKV2-28 경쇄 억셉터 프레임워크 V 영역 아미노산 서열 (SEQ ID No:16)

IGKV2-28 경쇄 억셉터 프레임워크 V 영역 DNA (SEQ ID No:17)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H11 DNA 서열 (SEQ ID No:23)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H11 아미노산 서열 (SEQ ID No:24)

사람화된 경쇄 V 영역 변이체 L9 DNA 서열 (SEQ ID No:25)

사람화된 경쇄 V 영역 변이체 L9 아미노산 서열 (SEQ ID No:26)

성숙한 H11 중쇄 아미노산 서열 (SEQ ID No:27)

성숙한 L9 경쇄 아미노산 서열 (SEQ ID No:28)

최적화된 H11 중쇄 DNA (SEQ ID No:29)

최적화된 L9 경쇄 DNA (SEQ ID No:30)

H48 중쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:59)

H48 중쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:60)

H49 중쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:61)

H49 중쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:62)

H50 중쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:63)

H50 중쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:64)

H51 중쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:65)

H51 중쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:66)

L19 경쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:67)

L19 경쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:68)

L20 경쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:69)

L20 경쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:70)

L21 경쇄 V 영역 변이체 아미노산 서열 (SEQ ID No:71)

L21 경쇄 V 영역 변이체 DNA 서열 (SEQ ID No:72)

SEQUENCE LISTING <110> ELLIS Jonathan Henry FORD Susannah Karen GERMASCHEWSKI Volker SODEN Peter Ernest WATTAM Trevor Anthony Kenneth ALARD Philippe Marc Louis LEWIS Alan THOMAS Pamela Joan <120> Antigen Binding Proteins <130> PB62764 <140> PCT/EP2008/067138 <141> 2008-12-09 <150> GB 0724185.4 <151> 2007-12-11 <150> GB 0806230.9 <151> 2008-04-04 <150> US 61/043839 <151> 2008-04-10 <160> 73 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 aa <400> 1 Val Tyr Tyr Val His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 aa <400> 2 Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 aa <400> 3 Ser Gly Tyr 1 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 aa <400> 4 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 aa <400> 5 Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 aa <400> 6 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate containing beta amyloid residues 27-38 used for immunisation and screening <400> 7 Cys Gly Gly Gly Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Assay peptide containing beta amyloid residues 24-34 <400> 8 Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope mapping peptide containing beta amyloid residues 28-35 <400> 9 Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope mapping peptide containing beta amyloid residues 24-35 <400> 10 Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope mapping peptide containing beta amyloid residues 28-39 <400> 11 Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope mapping peptide containing beta amyloid residues 31-42 <400> 12 Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 98 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr <210> 14 <211> 294 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaca 294 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro 100 <210> 17 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactcct 300 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Lys Gln Leu Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 20 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtggagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag gttctggctt caacattaag gtctactatg tgcactggct gaagcagttg 120 actgagcagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg aaaatggtga aactatatat 180 accccgaaat tccaggacaa ggccactttg acagtagaca catcatccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac gctgccgtgt actattgtgt tagttcgggc 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 21 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp 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112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H11 VH aa <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 25 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L9 VL DNA <400> 25 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc aatcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagcaa gagtctccta cataggaatg gcatcaccta tttgtattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggggtcc ctgacaggtt cagtagcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgcg ctcaaaatct agaactttgg 300 acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaa 333 <210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L9 VL aa <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H11 heavy chain aa <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro 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Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 29 <211> 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Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 36 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag gttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gtctactata tccactggtt gaagcagttg 120 actgagcagg gcctagaatg gattggaagg attgatcctg aaaatggtga aactaagtat 180 gtcccgaaat tccagggcaa ggccacttta acagtagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcacctca gcagcctgac atctgaggac actggcgtct attactgtgt tacctcgggc 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Ala Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg 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Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 40 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtggagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag gttctggctt caacattaag gtctactatg ttcactggct gaagcagttg 120 actgagcagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg agaatggtga aactctatac 180 accccgaaat tccagggcaa ggccactttg acagtagaca catcatccaa cacagcctac 240 ctgcagctca acagcctgac atctgaggac actgccgtct attattgtgt tagttcgggc 300 tactggggcc aaggcacctc tctcacagtc tcctca 336 <210> 41 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 42 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 42 gatattgtga tgacgcagtc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagcaa gagtctccta cataggaatg gcatcaccta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cactagcagt gggtcaggaa ctgatttcac tctgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaactttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Thr Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Phe Gly Pro Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ser 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Ser Val Ser Ser 100 105 110 <210> 44 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 44 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag tttgtgaggc caggggcctc agtcaagtta 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa acctactata tacactggct gaaacagagg 120 actgaccagg gcctggagtg gattggaagg attgatcccg aggatggtga aactaaattt 180 ggcccgaaat tccggggcaa ggccacttta acagcagaca catcctccaa cacagcctcc 240 ctacaactca gcagtctgac atctgaggac actggcgtct attactgtgt tacctcgggc 300 tactggggcc aaggcaccac tctctcagtc tcctca 336 <210> 45 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 46 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcctcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcttgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaactttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Lys Gln Leu Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 48 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 48 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag gttctggctt caacattaag gtctactatg tgcactggct gaagcagttg 120 actgagcagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg aaaatggtga aactaaatat 180 gccccgaaat tccaggacaa ggccactttg acagtagaca catcctccaa tacagcctac 240 cttcacctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attattgtgt tagttcgggc 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 49 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 50 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 50 gacattgtga tgacgcagtc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta cataggaatg gcatcaccta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cactagcagt gggtcaggaa ctgatttcac tctgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattattgtg ctcaaaatct agaactttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 51 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Lys Gln Leu Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Leu Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 52 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtggagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag gttctggctt caacattaag gtctactatg ttcactggct gaagcagttg 120 actgagcagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg agaatggtga aactctatat 180 accccgaaat tccagggcaa ggccactttt acagtagaca catcatccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attattgtgt tagttcgggc 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 53 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 gatattgtga tgacgcagtc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagcaa gagtctccta cataggaatg gcatcaccta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cactagcagt gggtcaggaa ctgatttcac tctgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaactttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Leu Lys Gln Leu Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Gln Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 56 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactggtt gaagcagttg 120 actgagcagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg aaaatggtga aactcaatat 180 gccccgaaat tccagggcaa ggcctcttta acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 cttcacctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgt tagttcgggc 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 58 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 58 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaactttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 59 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H48 heavy chain aa <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile His Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 60 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H48 heavy chain DNA <400> 60 caggtgcagc tcgtgcagag cggcgccgag gtgaaagaac ccggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg gcagcggctt caacatccac gtgtactacg tgcactggct gaggcagctg 120 cccgagaagg gcctggagtg gattggcagg atcgaccccg agaacggcga gaccatctac 180 acccccaagt tccaggacaa ggccaccctg accgtggaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag gtccgaggat accgccgtct actactgcgt gagcagcggg 300 tattggggcc agggcacact agtgaccgtg tccagc 336 <210> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H49 heavy chain aa <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 62 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H49 heavy chain DNA <400> 62 caggtgcagc tcgtgcagag cggcgccgag gtgaaagaac ccggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg gcagcggctt caacatcaaa acctactacg tgcactggct gaggcagctg 120 cccgagaagg gcctggagtg gattggcagg atcgaccccg agaacggcga gaccatctac 180 acccccaagt tccaggacaa ggccaccctg accgtggaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag gtccgaggat accgccgtct actactgcgt gagcagcggg 300 tattggggcc agggcacact agtgaccgtg tccagc 336 <210> 63 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H50 heavy chain aa <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile His Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 64 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H50 heavy chain DNA <400> 64 caggtgcagc tcgtgcagag cggcgccgag gtgaaagaac ccggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaccg gcagcggctt caacatccac gtgtactacg tgcactggct gaggcagctg 120 cccgagaagg gcctggagtg gattggcagg atcgaccccg agaacggcga gaccatctac 180 acccccaagt tccaggacaa ggccaccctg accgtggaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag gtccgaggat accgccgtct actactgcgt gagcagcggg 300 tattggggcc agggcacact agtgaccgtg tccagc 336 <210> 65 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H51 heavy chain aa <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile His Thr Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 66 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H51 heavy chain DNA <400> 66 caggtgcagc tcgtgcagag cggcgccgag gtgaaagaac ccggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg gcagcggctt caacatccac acctactacg tgcactggct gaggcagctg 120 cccgagaagg gcctggagtg gattggcagg atcgaccccg agaacggcga gaccatctac 180 acccccaagt tccaggacaa ggccaccctg accgtggaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag gtccgaggat accgccgtct actactgcgt gagcagcggg 300 tattggggcc agggcacact agtgaccgtg tccagc 336 <210> 67 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L19 light chain aa <400> 67 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Asp His Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 68 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L19 light chain DNA <400> 68 gacatcgtga tgacccagag cccactgagc aatcccgtga ctcccggcga gcccgcctca 60 atcagctgca ggagcagcaa gagcctgctg cacaggaacg gcaagaccta cctgtactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct accagatgga ccacctggcc 180 agcggcgtgc ccgaccggtt ctctagcagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgcg cccagaacct ggagctctgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aaa 333 <210> 69 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L20 light chain aa <400> 69 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Asp His Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 70 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L20 light chain DNA <400> 70 gacatcgtga tgacccagag cccactgagc aatcccgtga ctcccggcga gcccgcctca 60 atcagctgca ggagcagcaa gagcctgctg cacaggaacg gcatcaccta cctgtactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct accagatgga ccacctggcc 180 agcggcgtgc ccgaccggtt ctctagcagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgcg cccagaacct ggagctctgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aaa 333 <210> 71 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L21 light chain aa <400> 71 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Asp Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L21 light chain DNA <400> 72 gacatcgtga tgacccagag cccactgagc aatcccgtga ctcccggcga gcccgcctca 60 atcagctgca ggagcagcaa gagcctgctg cacaggaacg gcaagaccta cctgtactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct accagatgga caacctggcc 180 agcggcgtgc ccgaccggtt ctctagcagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgcg cccagaacct ggagctctgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aaa 333 <210> 73 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide conjugate containing beta amyloid residues 22-38 used for immunisation and screening <400> 73 Cys Gly Gly Gly Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 1 5 10 15 Leu Met Val Gly Gly 20

Claims

β-아밀로이드의 잔기 28-35를 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식하며 하기 CDR을 포함하는, 치료용 항체:

.
제 1항에 있어서, β-아밀로이드의 잔기 28-34 또는 28-33을 함유하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식하는, 치료용 항체.
제 1항에 있어서, β-아밀로이드의 잔기 28-35의 영역내에 존재하는 β-아밀로이드 펩티드의 에피토프를 인식하는, 치료용 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체가 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 유도체인, 치료용 항체.
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제 1항에 있어서, 사람 억셉터(acceptor) 중쇄 프레임워크가 프레임워크 4와 함께 IGHV1-24 (SEQ ID No:13)로부터 유래되는, 치료용 항체.
제 6항에 있어서, 상기 프레임워크 4 서열이 사람 JH4 minigene (Kabat)에 의해 엔코딩된 서열 YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No:15)이고, 전체 중쇄 CDR3 서열이 도너(donor) 면역글로불린에 의해 제공되는, 치료용 항체.
제 1항에 있어서, 사람 억셉터 경쇄 프레임워크가 프레임워크 4와 함께 IGKV2-28 (SEQ ID No:16)로부터 유래되는, 치료용 항체.
제 8항에 있어서, 상기 프레임워크 4 서열이 사람 JK-1 minigene (Kabat)에 의해 엔코딩된 서열 WTFGQGTKVEIK (SEQ ID No:18)인, 치료용 항체.
제 1항에 있어서, 사람 억셉터 중쇄 프레임워크가 IGHV1-24와 JH4 minigene으로부터 유래되고, 사람 억셉터 경쇄 프레임워크가, 서열 SEQ ID No:19로 구성된 도너 V_H 도메인 및 β-아밀로이드 펩티드에 대한 도너 항체의 결합 친화성을 전부 보유하는 서열 SEQ ID No:21로 구성된 V_L 도메인에서 발견되는 상응하는 잔기들을 기준으로 하여 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환을 함유하거나 함유하지 않는 IGKV2-28과 JK-1 minigene으로부터 유래되고,
상기 하나 이상의 아미노산 잔기 치환은 하기 잔기들로부터 선택된, 치료용 항체:

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제 10항에 있어서, 상기 사람 억셉터 중쇄 프레임워크가 하기 잔기들을 포함하는, 치료용 항체:

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제 10항 또는 제 12항에 있어서, 사람 억셉터 경쇄 프레임워크가 하기 잔기들로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 지니는, 치료용 항체:

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제 13항에 있어서, 상기 사람 억셉터 경쇄 프레임워크가 하기 잔기들을 포함하는, 치료용 항체:

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제 1항에 있어서, SEQ ID No:24에 제시된 서열로 구성된 V_H 도메인 및 SEQ ID No:26에 제시된 서열로 구성된 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체.
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제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No:27에 제시된 서열로 구성된 중쇄와 SEQ ID No:28에 제시된 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 치료용 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 치료용 항체를 포함하는, 알츠하이머병, 연령 관련 황반변성, 녹내장 또는 β-아밀로이드 의존성 백내장 형성을 치료하기 위한 약제 조성물.
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제 29항에 있어서, 보체 경로 억제제 또는 보체 경로 활성화제의 억제제를 추가로 포함하는, 약제 조성물.
제 33항에 있어서, 상기 보체 경로 억제제가 보체 인자 H(complement factor H, CFH) 또는 가용성 보체 수용체 1(soluble complement receptor 1, sCR1)인, 약제 조성물.
제 33항에 있어서, 상기 보체 경로 활성화제의 억제제가 보체 인자 D(CFD) 억제제인, 약제 조성물.
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제 1항에 있어서, 서열 SEQ ID No:19로 구성된 V_H 도메인 및 서열 SEQ ID No:21로 구성된 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체.
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