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EP3017062A1 - Kit et methode de detection in vitro du rhesus d - Google Patents

Kit et methode de detection in vitro du rhesus d

Info

Publication number
EP3017062A1
EP3017062A1 EP14736754.4A EP14736754A EP3017062A1 EP 3017062 A1 EP3017062 A1 EP 3017062A1 EP 14736754 A EP14736754 A EP 14736754A EP 3017062 A1 EP3017062 A1 EP 3017062A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
primers
sample
plasma
rhd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP14736754.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Grégory RAUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP3017062A1 publication Critical patent/EP3017062A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a kit for the in vitro detection of the fetal RHD gene in a sample of plasma or maternal serum, comprising at least eight primers specific for sequence SEQ ID NO: 1 to 8, or variants of said primers having at least less than 90% identity, preferably at least 95% identity with the latter, or a mixture of them.
  • the present invention also relates to the use of the kit in a method of in vitro detection of the fetal RHD gene in a sample of plasma or maternal serum.
  • Rh system is the most complex blood group system because it is the most polymorphic and the most immunogenic in terms of transfusion.
  • the current RH phenotype comprises the major RH1 (D) antigen encoded by the RHD gene, and the RH2 (C), RH3 (E), RH4 (c) and RH5 (e) antigens encoded by the RHCE gene.
  • RH1 major RH1
  • C major RH2
  • E RH3
  • RH4 c
  • RH5 (e) antigens encoded by the RHCE gene Depending on the allelic forms, 8 classical haplotypes are distinguished.
  • Non-invasive detection of the major RH1 (D) antigen is a major diagnostic issue, especially in pregnant women with negative phenotype D (RhD).
  • D RH1
  • anti-D alloimmunization has become a rare disease, but the perinatal consequences are particularly serious: risk of severe fetal anemia may be complicated by anasarca, fetal death in utero (spontaneous or sometimes secondary to In utero transfusion therapy), severe jaundice and neonatal anemia requiring specialized management. It corresponds, in the RhD-negative pregnant woman, to the synthesis of anti-D IgG antibodies in response to the transplacental passage of RhD positive fetal red cells in the maternal circulation. Maternal anti-Ds that cross the placenta to the fetal circulation cause haemolysis and anemia in the RhD-positive fetus.
  • Anti-D immunoglobulin prevention has dramatically reduced new alloimmunization. Nevertheless, these immunoglobulins remain products derived from the blood and their use should be limited to the minimum, whether it is on signs of call (metrorrhagia, abdominal trauma, amniocentesis ...), or carried out systematically towards 28 weeks of Amenorrhea (SA). Detection of the presence of the major antigen by the end of the first trimester of pregnancy RH1 (D) in the fetus would avoid useless immunoglobulin injections to negative RhD mothers whose child is also RhD negative. This situation accounts for more than a third of all RhD-negative pregnant women.
  • Non-invasive fetal RH1 (D) genotyping in maternal blood is therefore of major interest.
  • the genes encoding the RH system are the RHD and RHCE homologous genes (i.e. 96% identity), located on chromosome 1, and composed of 10 exons organized in a similar fashion.
  • the very peculiar organization of these 2 genes with an opposite "head-to-tail” orientation facilitates gene rearrangements between RHD and RHCE, and the appearance of hybrid genes.
  • These hybrid genes will code for proteins called "HR variants".
  • HR variants proteins
  • RH W1 phenotypes (weak D) characterized by decreased level of membrane expression of RH1 antigen
  • RH phenotypes -1 (D negative) characterized by the absence of the RH1 (D) antigen on the erythrocyte surface.
  • the frequency of this RH: -1 (negative D) phenotype is not the same in all populations:
  • RH phenotype -1 (D negative): either there is a complete deletion of the entire RHD gene (the most frequent molecular mechanism responsible for the RH: -1 phenotype (negative D) in populations European and Chinese), and the woman is then phenotyped RH: -1 (D negative) and the RHD gene is absent;
  • RHD gene is present but does not code the RH1 antigen, because of gene mutations or insertions making this RHD gene incapable of synthesize RH1 (D) antigen, and this is called RHD ⁇ J pseudo gene, or because of the constitution of a hybrid gene not synthesizing RH1 antigen (D), including the hybrid gene RHCceS.
  • RHD ⁇ J pseudo gene and RHCceS hybrid gene the woman has a RH: -1 (negative D) phenotype, but there is a detectable RHD gene. Genotyping would be positive, but there is no risk of fetal maternal alloimmunization (false positive).
  • the molecular mechanisms leading to the non-production of the RH1 protein are different according to the ethnic origins of the woman: in women of European origin, the predominant mechanism of the phenotype RH: -1 (D negative) is the complete deletion of the RH1 (D) gene, whereas in African women, the RH: -1 (negative D) phenotype is in 66% of cases linked to the RHD ⁇ J pseudo gene, in 18% of cases linked to the complete deletion of RH1 gene (D) and in 15% of cases related to the presence of the hybrid gene RHCceS.
  • the establishment of the genotype is a first step to establish the presence or absence of the RHD gene. Its absence leads to a phenotype RH: -1 (negative D).
  • the inventor has now developed a new in vitro detection test of the fetal RHD gene in a maternal blood sample, which is economical, quick to implement, with which the results are generally quick to obtain (generally in 24h). Said test is also very easily interpretable, and requires no fluorophore or any particular technology.
  • the subject of the invention is therefore a kit for the in vitro detection of the fetal RHD gene in a sample of plasma or maternal serum, comprising at least the following eight primers, or variants of said primers having at least 90% identity, preferably at least 95% identity with the latter, or a mixture between some of the following eight primers and certain variants:
  • the kit is very useful for the in vitro detection of the fetal RHD gene in a sample of plasma or maternal serum. Indeed, this kit makes it possible to detect several exons in the same amplification reaction. More particularly, the kit of the invention makes it possible to amplify exons 5, 7 and 10 in the same reaction. In addition, the kit of the invention contains primers for amplifying the RASSF1A promoter, which provides an internal amplification control. The kit of the invention thus makes it possible to unequivocally and rapidly distinguish between a RHD-positive fetal DNA and a RHD-negative fetal DNA. The invention also relates to an in vitro method for detecting the fetal RHD gene in a sample of plasma or maternal serum, comprising the following steps: a) treatment of the sample of plasma or maternal serum with a methylation-sensitive enzyme,
  • step b) treatment of the mixture obtained in step b) by real-time PCR
  • step c) performing and analyzing the melting temperature curve of the products amplified in step c).
  • the different primers correspond to complementary portions of portions of the RHD and RASSF1A genes.
  • the method of the invention thus makes it possible to detect exons 5, 7 and 10 at the same time, that is to say in a single amplification reaction, contrary to the methods of the prior art.
  • it makes it possible to detect the RASSF1A promoter, which makes it possible to have an amplification control in the same reaction.
  • the application WO 2012/1 12970 describes a technique comprising several separate amplifications carried out in an emulsion. Moreover, this request recommends using the digital PCR for this purpose.
  • Maaskant-van Wijk et al. (Transfusion, 38 (1 1 -12): 1015-1021, 1998) provides a method for detecting exons that are specific for RHD genes, that is to say that are not present in the homologous gene RHCE. As a result, this document does not make it possible to detect the RCceS hybrid gene, whereas the present invention offers this possibility.
  • WO 98/39474 discloses a method for detecting the fetal genotype of the RHD gene based on amplification with a single pair of primers, but not a multiplexed reaction such as that of the invention.
  • Aubin et al. (Br J Haematol, 98 (2): 356-364, 1997) does not disclose a multiplex test, but only amplifications of individual exons in separate reactions.
  • the method of the invention thus makes it possible to determine the RHD genotype of the fetal DNA in a single reaction. It thus provides a fetal RHD genotyping test, which is economical, easy and quick to implement, and whose results are of simple and immediate interpretation.
  • RH1 rhesus D
  • Cloning of RH1 (rhesus D) genes and identification of fetal DNA circulating in maternal blood made it possible to determine fetal RH1 from serum or plasma of pregnant women.
  • the sample of plasma or maternal serum is preferably, according to the invention, a sample of plasma or maternal serum of negative RhD phenotype. It comes from maternal blood. Typically, a volume of 10 .mu.l of plasma or maternal serum is sufficient for the process according to the invention.
  • the preparation of the plasma or serum sample from the maternal blood sample is performed according to standard methods.
  • the starting maternal sample may also consist of amniotic fluid or chorionic villus.
  • the sample of plasma or maternal serum is first subjected to a DNA extraction step (step a ')), said DNA then being treated according to step a) .
  • the DNA extraction step makes it possible to extract the free fetal DNA circulating in the maternal blood (cell-free circulating fetal DNA or cffDNA).
  • the concentration of free fetal DNA circulating in the maternal serum is very high compared to that of the fetal cells, simplifying the procedure and making it faster.
  • the concentration of fetal DNA increases steadily throughout pregnancy (from 3.4% in the first trimester to 6.2% in the 3rd trimester).
  • this fetal DNA is "diluted" within a DNA that is largely in the majority and highly homologous that is the original free circulating DNA.
  • maternal without being specifically isolated at present. Only fetal gene sequences that are absent or different from the maternal genome, as is the case with the RASSF1A gene, can therefore be investigated and / or studied.
  • the DNA extraction is carried out according to the conventional procedure known from the prior art. Typically, it can be done with any commercial extraction kit, such as Qiagen's QIAamp DSP Virus kit or Macherey-Nagel's NucleoSpin Plasma XS kit.
  • the method according to the invention comprises a step a) of treating the sample of plasma or maternal serum (or of the extracted DNA if step a ') is present) by a methylation-sensitive enzyme.
  • This step a) makes it possible to differentiate the promoter of the hypermethylated fetal RASSF1A gene from the hypomethylated maternal RASSF1A gene promoter. The methylation of this promoter is therefore different between the fetal DNA and the maternal DNA.
  • This treatment consists of an enzymatic digestion of the DNA to be analyzed by a methylation-sensitive enzyme, for example BstU I (restriction endonuclease resulting from Bacillus stearothermophilus U458), Bsh1236l (restriction endonuclease resulting from Bacillus sphaericus RFL1236), Accll ( restriction endonuclease from Acinetobacter calcoaceticus), BstFNI (restriction endonuclease from Geobacillus stearothermophilus FN) or Mvn1 (restriction endonuclease from Methanococcus vannielii).
  • This step a) is done conventionally according to routine methods, and according to the usual recommendations of suppliers of enzymes sensitive to methylation.
  • the in vitro method for detecting the fetal RHD gene in a sample of plasma or maternal serum comprises the following steps: a ') extraction of DNA from a sample of plasma or maternal serum, a) treatment of the extracted DNA obtained in step a ') with a methylation-sensitive enzyme,
  • step b) treatment of the mixture obtained in step b) by real-time PCR
  • step c) performing and analyzing the melting temperature curve of the products amplified in step c).
  • the kit and the method according to the invention can also be modified in that the two primers SEQ ID NO: 3 and 4 are replaced by two complementary primers of a gene promoter having a different methylation state for the fetal DNA and for the maternal DNA, said two complementary primers being capable of amplifying by PCR a segment having a percentage of CG of between 70 and 90%, preferably between 70 and 80%.
  • the primers SEQ ID NO: 1 and 2 correspond to the forward and reverse primers, respectively, located on exon 7 of the RHD gene.
  • the primers SEQ ID NO: 5 and 6 correspond to the forward and reverse primers located on the exon 5 of the RHD gene.
  • the primers SEQ ID NO: 7 and 8 correspond to the forward and reverse primers, respectively, located on the exon 10 of the RHD gene.
  • primers are specific for the RHD gene, and are optimized to improve the specificity of enzymatic amplification during real-time PCR and / or to obtain an adequate melting temperature.
  • the primers SEQ ID NO: 1 and 2 were further optimized to have a directly readable melting temperature.
  • the primers SEQ ID NO: 3 and 4 correspond to the forward and reverse primers located on the promoter of the RASSF1A gene.
  • the promoter of the RASSF1A gene is here used as a control; if amplification is observed in real-time PCR, then fetal DNA is present in the sample.
  • the specific primers SEQ ID NO: 3 and 4 are very sensitive and specific to the RASSF1A promoter, and constitute a very good indicator of the presence of fetal DNA.
  • the eight primers according to the present invention can be used as such, i.e. as a mixture of SEQ ID NO: 1 to 8 sequences.
  • variants having at least 90% identity, preferably at least 95% identity with said eight primers can be used.
  • a mixture of variants of each of the eight primers of SEQ ID NO: 1 to 8 can be used, said variants having at least 90% identity, preferably at least 95% identity with said eight primers.
  • each of the eight primers SEQ ID NO: 1 to 8 is present either as such or in the form of variant.
  • percent identity between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention, is meant a percentage of identical nucleobases between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length.
  • best alignment or “optimal alignment” is meant the alignment for which the percentage of identity determined as hereinafter is the highest.
  • sequence comparisons between two nucleic acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being performed by segment or by "comparison window” to identify and compare the local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981, J.
  • the eight primers, their variants or their mixtures are used simultaneously in a mixture with the sample of plasma or maternal serum (or DNA extracted if step a ')), in step b) of the method according to the invention. It follows that a single mixture is necessary to simultaneously perform the different PCRs in real time. This is called real-time multiplex PCR.
  • the mixing of step b) is typically in an aqueous medium, typically in sterile water.
  • the mixture is subjected to a real-time PCR amplification step c). Due to a unique initial mixture between the primers and the maternal sample (step b)), the real-time PCR performed simultaneously amplifies exons 5, 7 and 10 of the RHD gene, and the RASSF1A promoter, if are here.
  • the real-time PCR is carried out by the following successive steps: an initial denaturation step at a temperature of between 90 ° C. and 100 ° C., preferably between 93 ° C. and 98 ° C., for a time between 1 and 10 minutes;
  • First phase denaturation at a temperature between 90 ° C and 100 ° C, preferably between 93 ° C and 98 ° C, for a time between 5 and 20 seconds;
  • Second phase hybridization / elongation at a temperature between 55 ° C and 65 ° C, preferably between 57 ° C and 62 ° C, for a time between 5 and 20 seconds; said first and second phases being repeated 50 to 60 times, and - a cooling step at a temperature between 60 ° C and 70 ° C, for a time between 1 and 10 minutes.
  • Real-time PCR can be done on any suitable device. Typically, one can use the Bio-Rad CFX96 platform, or the Roche LightCyler LC 480.
  • step c) of real-time PCR because of the choice of specific primers, specific amplicons are obtained, characterized by a single melting temperature.
  • This melting temperature is significantly different (i.e., at least 1 ° C) for each amplicon.
  • the method according to the invention comprises a step d) of producing and analyzing the melting temperature curve of the products amplified in step c).
  • This step d) of carrying out and analyzing the melting curve is preferably carried out as follows: a high resolution melting curve of the amplified products is carried out from a temperature of 60 ° C. to 100 ° C. with temperature increments ranging from 0.01 ° C to 0.5 ° C, preferably from 0.04 ° C to 0.2 ° C.
  • the analysis of the melting temperature curve of step d) is carried out between 65 ° C. and 95 ° C. Since each specific amplicon has a unique melting temperature, which is significantly different for each amplicon, the melting temperature curve is composed of 4 peaks for a RHD positive fetal DNA: one for the RHD exon 5 amplicon, one for the RHD exon 7 amplicon, one for the RH amplicon, exon 10 of RHD, and one for the amplicon of the RASSF1A promoter.
  • each of these amplicons has a specific melting temperature range: preferably, the amplicon of exon 5 of RHD has a melting point of between 74.5 and 77.1 ° C; preferably, the amplicon of exon 10 of RHD has a melting point of 79.5 to 82.4 ° C; preferably, the amplicon of exon 7 of RHD has a melting temperature of between 83.5 and 85.3 ° C .; and preferably, the amplicon of the RASSF1A promoter has a melting point of between 91.9 and 94.0 ° C.
  • Figure 1 shows an example of a result obtained for a positive RHD fetal DNA (Figure 1A, 4 peaks), for which the mother will have to be treated with anti-D, and for a negative RHD fetal DNA ( Figure 1B; ), for which no treatment of the mother is necessary.
  • the melting temperature curve is composed of only one peak for a negative RHD fetal DNA, namely that of the amplicon of the RASSF1A promoter. If the melting temperature curve includes the amplicon peak of the RASSF1A promoter, and also includes the amplicon peak of exon 10, but not that of exon 5 and / or that of exon 7, then the fetal DNA is RHD negative, and is found in the case of mutations type pseudo RHD ⁇ J gene or hybrid gene RHCceS.
  • RHD ⁇ J thus RHD negative pseudo gene in the fetal DNA
  • specific primers of this mutation give the amplicon a melting temperature of between 86.30 ° C. and 90.08 ° C., ideally a melting point of between 87 ° C. and 88 ° C.
  • These primers are chosen to hybridize to all or part of the 37 base pairs inserted upstream of exon 4 of the RHD gene, responsible for the mutation, and therefore the formation of the pseudo gene RHD ⁇ J.
  • Figure 1 Melt temperature curves obtained for RHD positive (A), or RHD negative (B) fetal DNA.
  • Blood samples of 5 ml are taken from two pregnant women A and B.
  • the plasma is extracted using a commercial kit according to the indications of the supplier (Kit NucleoSpin Plasma XS Macherey-Nagel).
  • the two plasma samples thus recovered are treated with the enzyme BstU I, according to the protocol given by the manufacturer (New England Biolabs).
  • each of the samples thus treated is mixed with a composition comprising the 8 primers SEQ ID NO: 1 to 8, in an aqueous solution, to obtain a final volume of 20 ⁇ .
  • the two samples are then subjected to a real-time PCR, according to the conditions specified in the description above, and with the following specifications: initial denaturation: at 98 ° C for 2 minutes;
  • Two-phase amplification First phase: denaturation at 98 ° C for 10 seconds;
  • Second phase hybridization / elongation at 57 ° C for 5 seconds; said first and second phases being repeated 55 times, and cooling at 65 ° C for 1 minute.
  • a melting curve (in high resolution) of PCR amplified products is carried out from a temperature of 60 ° C to 100 ° C with temperature increments of 0.2 ° C.
  • the melting temperature curve from the sample of patient B is in Figure 1B: a single peak is observed, that of RASSF1A. Fetal DNA is therefore RHD negative, and no treatment of the mother is necessary.

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Abstract

La présente invention est relative à un kit pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant au moins huit amorces spécifiques de séquence SEQ ID NO : 1 à 8, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange d'entre elles. La présente invention est également relative à l'utilisation du kit dans une méthode de détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel.

Description

KIT ET METHODE DE DETECTION IN VITRO DU RHESUS D
La présente invention se rapporte à un kit pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant au moins huit amorces spécifiques de séquence SEQ ID NO : 1 à 8, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange d'entre elles.
La présente invention est également relative à l'utilisation du kit dans une méthode de détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel.
Le système Rhésus (RH) est le système de groupe sanguin le plus complexe, car le plus polymorphe et le plus immunogène sur le plan transfusionnel. Le phénotype RH courant comprend l'antigène majeur RH1 (D) codé par le gène RHD, et les antigènes RH2 (C), RH3 (E), RH4 (c) et RH5 (e) codés par le gène RHCE. En fonction des formes alléliques, 8 haplotypes classiques sont distingués.
La détection non invasive de l'antigène majeur RH1 (D) est un enjeu diagnostic majeur, notamment chez les femmes enceintes de phénotype D (RhD) négatif. En effet, l'allo-immunisation anti-D est devenue une pathologie rare, mais dont les conséquences périnatales restent particulièrement graves : risque d'anémie fœtale grave pouvant se compliquer d'anasarque, de mort fœtale in utero (spontanée ou parfois secondaire au traitement par transfusion in utero), d'ictère et d'anémie néonatals graves nécessitant une prise en charge spécialisée. Elle correspond, chez la femme enceinte RhD négatif, à la synthèse d'anticorps IgG anti-D en réponse au passage transplacentaire d'hématies fœtales RhD positif dans la circulation maternelle. Les anti-D maternels traversant le placenta vers la circulation fœtale provoquent en retour une hémolyse et une anémie chez le fœtus RhD positif.
La prévention par immunoglobulines anti-D a fait baisser de manière spectaculaire les nouvelles allo-immunisations. Néanmoins, ces immunoglobulines restent des produits dérivés du sang et leur utilisation devrait être limitée au minimum, qu'elle soit sur signes d'appel (métrorragies, traumatisme abdominal, amniocentèse...), ou réalisée de manière systématique vers 28 semaines d'aménorrhée (SA). La détection, dès la fin du premier trimestre de la grossesse, de la présence de l'antigène majeur RH1 (D) chez le fœtus permettrait d'éviter les injections d'immunoglobulines inutiles aux mères RhD négatif dont l'enfant est lui aussi RhD négatif. Cette situation représente plus du tiers de toutes les femmes enceintes RhD négatif.
Le génotypage RH1 (D) fœtal non invasif sur sang maternel est donc d'un intérêt majeur.
Au niveau génétique, les gènes codant le système RH sont les gènes homologues (i.e. 96 % d'identité) RHD et RHCE, localisés sur le chromosome 1 , et composés de 10 exons organisés de façon similaire. L'organisation très particulière de ces 2 gènes avec une orientation opposée « tête bêche » facilite les réarrangements géniques entre RHD et RHCE, et l'apparition de gènes hybrides. Ces gènes hybrides vont coder pour des protéines appelés «variants RH». Pour le gène RHD, ces modifications génétiques donnent lieu à des phénotypes différents : phénotypes RH:P1 (D partiels) caractérisés par des modifications qualitatives de la protéine RH1. Ces modifications peuvent donner lieu à une allo- immunisation anti-RH1 (anti-D) en cas de stimulation obstétrico- transfusionnelle ;
phénotypes RH:W1 (D faibles) caractérisés par un niveau d'expression membranaire diminué de l'antigène RH1 ;
- enfin, phénotypes RH:-1 (D négatifs) caractérisés par l'absence de l'antigène RH1 (D) à la surface des érythrocytes. La fréquence de ce phénotype RH:-1 (D négatif) n'est pas la même dans toutes les populations :
o 15 % environ chez les populations caucasiennes ;
o 3 % à 5 % chez les populations africaines ; et
o moins de 0,1 % chez les populations d'origine asiatique.
Deux mécanismes sont à l'origine du phénotype RH:-1 (D négatif) : soit il existe une délétion complète de la totalité du gène RHD (mécanisme moléculaire le plus fréquent responsable du phénotype RH: -1 (D négatif) dans les populations européennes et chinoises), et la femme est alors phénotypée RH:-1 (D négatif) et le gène RHD est absent ;
soit le gène RHD est présent mais ne code pas l'antigène RH1 , en raison de mutations ou d'insertions géniques rendant ce gène RHD incapable de synthétiser d'antigène RH1 (D), et on parle alors de pseudo gène RHD^J, ou alors en raison de la constitution d'un gène hybride ne synthétisant pas d'antigène RH1 (D), notamment le gène hybride RHCceS. Dans ces deux situations (pseudo gène RHD^J et gène hybride RHCceS), la femme présente un phénotype RH:-1 (D négatif), mais il existe un gène RHD détectable. Le génotypage serait donc positif, mais aucun risque d'allo-immunisation fœto- maternelle n'existe (faux positif).
Au final, les mécanismes moléculaires aboutissant à la non-production de la protéine RH1 sont différents en fonction des origines ethniques de la femme : chez les femmes d'origine européenne, le mécanisme prédominant du phénotype RH:-1 (D négatif) est la délétion complète du gène RH1 (D), alors que chez la femme africaine le phénotype RH:-1 (D négatif) est dans 66 % des cas lié au pseudo gène RHD^J, dans 18 % des cas lié à la délétion complète du gène RH1 (D) et dans 15 % des cas lié à la présence du gène hybride RHCceS. L'établissement du génotype est une première étape permettant d'établir la présence ou non du gène RHD. Son absence conduit à un phénotype RH:-1 (D négatif). En revanche, son identification ne suffit pas à la déduction directe du phénotype RH:1 (D positif) ; il convient de s'assurer que ce gène est fonctionnel, donc de rechercher les variants les plus fréquents, avant d'en déduire le phénotype. Les tests existant aujourd'hui sur le marché, tels que le test « Free DNA Fetal Kit® RhD » de Bio-Rad, permettent d'établir la présence ou non du gène RHD chez le fœtus à partir d'un prélèvement sanguin maternel. Ces tests reposent sur la détection des exons 5, 7 et 10 du gène RHD, à l'aide d'amorces et de sondes spécifiques, lesdites sondes étant marquées à l'aide d'un fluorophore. Des PCR sont ensuite réalisées.
Cependant, ces tests sont coûteux et longs à mettre en œuvre (2 semaines sont généralement requises pour obtenir le résultat). En outre, ils nécessitent une certaine technicité et requièrent la présence de fluorophores ; enfin, ils sont réalisés de façon séquentielle. En effet, la détection des exons 5, 7 et 10 se fait, pour un échantillon d'une patiente, de façon indépendante par 3 PCR séparées dans 3 sous- échantillons, dans des puits distincts. Il existe donc un besoin pour disposer d'un test de génotypage du RHD fœtal, qui soit économique, facile et rapide à mettre en œuvre, et dont les résultats soient d'interprétation simple et immédiate.
De façon surprenante, l'inventeur a maintenant mis au point un nouveau test de détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon sanguin maternel, qui est économique, rapide à mettre en œuvre, avec lequel les résultats sont généralement rapides à obtenir (généralement en 24h). Ledit test est en outre très facilement interprétable, et ne requiert aucun fluorophore ni aucune technologie particulière.
L'invention a donc pour objet un kit pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants :
• taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ I D NO : 1 )
· actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2)
• AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)
• ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)
• ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)
• C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)
· CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)
• CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8).
Ledit kit est très utile pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel. En effet, le présent kit permet de détecter plusieurs exons dans une même réaction d'amplification. Plus particulièrement, le kit de l'invention permet d'amplifier les exons 5, 7 et 10 dans la même réaction. En outre, le kit de l'invention contient des amorces permettant d'amplifier le promoteur RASSF1A, lequel fournit un témoin interne d'amplification. Le kit de l'invention permet ainsi de distinguer de façon univoque et rapide entre un ADN fœtal RHD positif et un ADN fœtal RHD négatif. L'invention a également pour objet un procédé in vitro de détection du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant les étapes suivantes : a) traitement de l'échantillon de plasma ou de sérum maternel par une enzyme sensible à la méthylation,
b) mélange de l'échantillon traité obtenu en a) avec au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants :
taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ ID NO : 1 ) actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2) AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)
ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)
ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)
C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)
CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)
CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8),
c) raitement du mélange obtenu à l'étape b) par PCR en temps réel,
d) réalisation et analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c).
Les différentes amorces correspondent à des portions complémentaires de parties des gènes RHD et RASSF1A. La méthode de l'invention permet ainsi de détecter les exons 5, 7 et 10 en même temps, c'est-à-dire dans une seule réaction d'amplification, contrairement aux méthodes de l'art antérieur. En outre, elle permet de détecter le promoteur de RASSF1A, ce qui permet de disposer d'un témoin d'amplification dans la même réaction.
Aucune publication de l'art antérieur ne décrit une telle méthode alliant une amplification simultanée de 4 séquences nucléotidiques (PCR multiplexe) d'un organisme complexe suivie d'une analyse directe et simultanée de la températures de fusion des 4 amplicons, permettant ainsi une discrimination directe et sans ambiguïté de ces amplicons.
Par exemple, la demande WO 2012/1 12970 décrit une technique comportant plusieurs amplifications séparées réalisées dans une émulsion. D'ailleurs, cette demande préconise d'utiliser pour cela la PCR digitale. Le document Maaskant-van Wijk et al. (Transfusion, 38(1 1 -12) : 1015-1021 , 1998) fournit une méthode pour détecter les exons qui sont spécifiques des gènes RHD, c'est-à-dire qui ne sont pas présents dans le gène homologue RHCE. De ce fait, ce document ne permet pas de détecter le gène hybride RCceS, alors que la présente invention offre cette possibilité.
WO 98/39474 divulgue une méthode de détection du génotype fœtal du gène RHD basée sur une amplification avec une seule paire d'amorces, mais pas une réaction multiplexe telle que celle de l'invention. De la même façon, Aubin et al. (Br J Haematol, 98(2) : 356-364, 1997) ne divulgue pas de test multiplex, mais uniquement des amplifications d'exons individuels dans des réactions distinctes.
La méthode de l'invention permet donc de déterminer le génotype RHD de l'ADN foetal en une seule réaction. Elle fournit ainsi un test de génotypage du RHD fœtal, économique, facile et rapide à mettre en œuvre, et dont les résultats sont d'interprétation simple et immédiate.
Le clonage des gènes du système RH1 (rhésus D) et l'identification d'ADN fœtal circulant dans le sang maternel ont rendu possible la détermination de RH1 fœtal à partir du sérum ou du plasma de femmes enceintes. L'échantillon de plasma ou de sérum maternel est de préférence, selon l'invention, un échantillon de plasma ou de sérum maternel de phénotype RhD négatif. Il provient du sang maternel. Typiquement, un volume de 10μΙ de plasma ou de sérum maternel est suffisant pour le procédé selon l'invention. La préparation de l'échantillon de plasma ou sérum à partir de l'échantillon de sang maternel est réalisée selon des méthodes standard. L'échantillon maternel de départ peut également être constitué de liquide amniotique ou de villosité chorionique.
De préférence, dans le procédé selon l'invention, l'échantillon de plasma ou de sérum maternel est préalablement soumis à une étape d'extraction d'ADN (étape a')), ledit ADN étant ensuite traité selon l'étape a). L'étape d'extraction d'ADN permet d'extraire l'ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel (cell-free circulating fetal DNA ou cffDNA). La concentration en ADN fœtal libre circulant dans le sérum maternel est très élevée comparativement à celle des cellules fœtales, simplifiant la procédure et la rendant plus rapide. La concentration en ADN fœtal augmente constamment tout au long de la grossesse (de 3,4 % au 1 er trimestre à 6,2 % au 3e trimestre). Par ailleurs, cet ADN fœtal est « dilué » au sein d'un ADN largement majoritaire et hautement homologue qu'est l'ADN libre circulant d'origine maternelle, sans qu'on puisse l'isoler spécifiquement actuellement. Ne pourront donc être recherchées et/ou étudiées que les seules séquences géniques fœtales absentes ou différentes du génome maternel, comme cela est le cas du gène RASSF1A. L'extraction d'ADN se fait selon la procédure classique connue de l'art antérieur. Typiquement, elle peut se faire avec tout kit d'extraction commercial, notamment le kit QIAamp DSP Virus de Qiagen ou le kit NucleoSpin Plasma XS de Macherey-Nagel.
Le procédé selon l'invention comprend une étape a) de traitement de l'échantillon de plasma ou de sérum maternel (ou de l'ADN extrait si l'étape a') est présente) par une enzyme sensible à la méthylation. Cette étape a) permet de différencier le promoteur du gène RASSF1A fœtal, qui est hyperméthylé, du promoteur du gène RASSF1A maternel, hypométhylé. La méthylation de ce promoteur est donc différente entre l'ADN fœtal et l'ADN maternel. Ce traitement consiste en une digestion enzymatique de l'ADN à analyser par une enzyme sensible à la méthylation, par exemple BstU I (endonucléase de restriction issue de Bacillus stearothermophilus U458), Bsh1236l (endonucléase de restriction issue de Bacillus sphaericus RFL1236), Accll (endonucléase de restriction issue d'Acinetobacter calcoaceticus), BstFNI (endonucléase de restriction issue de Geobacillus stearothermophilus FN) ou Mvnl (endonucléase de restriction issue de Methanococcus vannielii). Cette étape a) se fait classiquement selon des méthodes de routine, et selon les recommandations d'usage des fournisseurs d'enzymes sensibles à la méthylation.
Aussi, de préférence, le procédé in vitro de détection du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel selon l'invention comprend les étapes suivantes : a') extraction d'ADN à partir d'un échantillon de plasma ou de sérum maternel, a) traitement de l'ADN extrait obtenu à l'étape a') par une enzyme sensible à la méthylation,
b) mélange de l'échantillon traité obtenu en a) avec au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants :
• taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ I D NO : 1 ) • actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2)
• AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)
• ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)
• ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)
• C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)
• CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)
• CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8),
c) traitement du mélange obtenu à l'étape b) par PCR en temps réel,
d) réalisation et analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c).
Le kit et le procédé selon l'invention peuvent également être modifiés en ce que les deux amorces SEQ ID NO :3 et 4 sont remplacées par deux amorces complémentaires d'un promoteur de gène présentant un état de méthylation différent pour l'ADN fœtal et pour l'ADN maternel, lesdites deux amorces complémentaires étant capables d'amplifier par PCR un segment ayant un pourcentage de CG compris entre 70 et 90 %, de préférence entre 70 et 80%.
Les amorces SEQ ID NO :1 et 2 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur l'exon 7 du gène RHD.
Les amorces SEQ ID NO :5 et 6 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur l'exon 5 du gène RHD.
Les amorces SEQ ID NO :7 et 8 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur l'exon 10 du gène RHD.
Ces amorces sont spécifiques du gène RHD, et sont optimisées pour améliorer la spécificité de l'amplification enzymatique lors de la PCR en temps réel et/ou obtenir une température de fusion adéquate. Les amorces SEQ ID NO :1 et 2 ont en outre été optimisées pour présenter une température de fusion directement lisible.
Les amorces SEQ ID NO :3 et 4 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur le promoteur du gène RASSF1A.
Le promoteur du gène RASSF1A est ici utilisé comme témoin ; si une amplification est observée en PCR en temps réel, alors de l'ADN fœtal est présent dans l'échantillon. En effet, grâce à leur optimisation, les amorces spécifiques SEQ ID NO :3 et 4 sont très sensibles et spécifiques du promoteur de RASSF1A, et constituent un très bon témoin de la présence d'ADN fœtal.
En effet, les résultats obtenus avec les kits actuellement disponibles sur le marché ne peuvent faire de différence entre un résultat RHD négatif, et un résultat RHD négatif dû à l'absence d'ADN fœtal. Par conséquent, en cas de résultat négatif, un nouveau prélèvement sanguin chez la femme enceinte est nécessaire 2 semaines plus tard environ, pour pouvoir refaire le test. Cela est bien évidemment très contraignant.
Avec le procédé et le kit selon l'invention, ce problème se trouve résolu grâce à la présence des amorces SEQ ID NO :3 et 4, qui permettent d'identifier spécifiquement la présence d'ADN fœtal. La différence entre un résultat RHD négatif et un résultat RHD négatif dû à l'absence d'ADN fœtal est donc directement visible lors de l'analyse des résultats.
Les huit amorces selon la présente invention peuvent être utilisées en tant que telles, i.e. sous forme de mélange des séquences SEQ ID NO :1 à 8.
Alternativement, on peut utiliser des variants ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec lesdites huit amorces. Dans ce cas, un mélange de variants de chacune des huit amorces de SEQ ID NO :1 à 8 peut être utilisé, lesdits variants présentant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec lesdites huit amorces.
Enfin, on peut également utiliser un mélange entre certaines des huit amorces SEQ ID NO :1 à 8, et certains variants. Dans ce cas, chacune des huit amorces SEQ ID NO :1 à 8 est présente soit en tant que telle, soit sous forme de variant.
Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acide nucléique au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de bases nucléiques identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981 , J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl).
En outre, les huit amorces, leurs variants ou leurs mélanges, sont utilisées simultanément en mélange avec l'échantillon de plasma ou de sérum maternel (ou de l'ADN extrait si étape a')), dans l'étape b) du procédé selon l'invention. Il résulte qu'un seul et unique mélange est nécessaire pour réaliser simultanément les différentes PCR en temps réel. On parle alors de PCR multiplex en temps réel. Le mélange de l'étape b) se fait typiquement dans un milieu aqueux, typiquement dans de l'eau stérile.
Après cette étape de mélange, le mélange est soumis à une étape c) d'amplification par PCR en temps réel. Du fait d'un mélange initial unique entre les amorces et l'échantillon maternel (étape b)), la PCR en temps réel effectuée amplifie simultanément les exons 5, 7 et 10 du gène RHD, et le promoteur de RASSF1A, s'ils sont présents.
Typiquement, la PCR en temps réel se fait par les étapes successives suivantes : une étape de dénaturation initiale à une température comprise entre 90° C et 100°C, de préférence comprise entre 93°C et 98°C, pendant un temps compris entre 1 et 10 minutes ;
une étape d'amplification en deux phases :
Première phase : dénaturation à une température comprise entre 90° C et 100°C, de préférence comprise entre 93°C et 98°C, pendant un temps compris entre 5 et 20 secondes ; Seconde phase : hybridation / élongation à une température comprise entre 55° C et 65° C, de préférence comprise entre 57° C et 62° C, pendant un temps compris entre 5 et 20 secondes ; lesdites première et seconde phases étant répétées 50 à 60 fois, et - une étape de refroidissement à une température comprise entre 60° C et 70° C, pendant un temps compris entre 1 et 10 minutes.
On obtient ainsi, après 50 à 60 cycles identiques d'amplification des fragments d'intérêt, les amplicons souhaités.
La PCR en temps réel peut se faire sur tout appareil adapté. Typiquement, on peut utiliser la plateforme Bio-Rad CFX96, ou le LightCyler LC 480 de Roche.
A la fin de l'étape c) de PCR en temps réel, du fait du choix des amorces spécifiques, on obtient des amplicons spécifiques, caractérisés par une température de fusion unique. Cette température de fusion est significativement différente (i.e. d'au moins 1 °C) pour chaque amplicon. Aussi, le procédé selon l'invention comprend une étape d) de réalisation et d'analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c). Cette étape d) de réalisation et d'analyse de la courbe de fusion est de préférence effectuée comme suit : une courbe de fusion haute résolution des produits amplifiés est réalisée à partir d'une température de 60°C jusqu'à 100°C avec des incréments de température compris entre 0,01 °C et 0,5° C, de préférence compris entre 0,04° C et 0,2°C.
De préférence, l'analyse de la courbe de température de fusion de l'étape d) s'effectue entre 65° C et 95° C. Puisque chaque amplicon spécifique a une température de fusion unique, qui est significativement différente pour chaque amplicon, la courbe de température de fusion est composée de 4 pics pour un ADN fœtal RHD positif : un pour l'amplicon de l'exon 5 de RHD, un pour l'amplicon de l'exon 7 de RHD, un pour l'amplicon de l'exon 10 de RHD, et un pour l'amplicon du promoteur de RASSF1A.
Chacun de ces amplicons a une plage de température de fusion spécifique : de préférence, l'amplicon de l'exon 5 de RHD a une température de fusion comprise entre 74,5 et 77,1 °C ; de préférence, l'amplicon de l'exon 10 de RHD a une température de fusion comprise entre 79,5 et 82,4° C ; - de préférence, l'amplicon de l'exon 7 de RHD a une température de fusion comprise entre 83,5 et 85,3°C ; et de préférence, l'amplicon du promoteur de RASSF1A a une température de fusion comprise entre 91 ,9 et 94,0° C.
La figure 1 montre un exemple de résultat obtenu pour un ADN fœtal RHD positif (Figure 1A ; 4 pics), pour lequel la mère devra être traitée par des anti-D, et pour un ADN fœtal RHD négatif (Figure 1 B ; 1 pic), pour lequel aucun traitement de la mère n'est nécessaire.
En outre, la courbe de température de fusion n'est composée que d'un seul pic pour un ADN fœtal RHD négatif, à savoir celui de l'amplicon du promoteur de RASSF1A. Si la courbe de température de fusion comprend le pic de l'amplicon du promoteur de RASSF1A, et comprend aussi le pic de l'amplicon de l'exon 10, mais pas celui de l'exon 5 et/ou celui de l'exon 7, alors l'ADN fœtal est RHD négatif, et se trouve dans les cas de mutations type pseudo gène RHD^J ou gène hybride RHCceS.
Si aucun pic n'est détecté, alors aucun ADN fœtal, ou de l'ADN fœtal en quantité indétectable, n'est présent dans l'échantillon, et qu'il est donc nécessaire de refaire le test.
La lecture du résultat est donc instantanée, et la décision quant au traitement de la mère en découle directement.
Dans un mode de réalisation complémentaire, afin de détecter spécifiquement le pseudo gène RHD^J (donc RHD négatif) dans l'ADN fœtal, des amorces spécifiques de cette mutation sont utilisées. Ces dernières confèrent à l'amplicon une température de fusion comprise entre 86,30° C et 90,08° C, idéalement une température de fusion comprise entre 87° C et 88° C. Ces amorces sont choisies pour d'hybrider à tout ou partie des 37 paires de bases insérées en amont de l'exon 4 du gène RHD, responsables de la mutation, et donc de la formation du pseudo gène RHD^J.
Les exemples qui suivent, illustrent, mais ne visent pas à limiter la portée de l'invention. Il sera évident pour l'homme de l'art que des variantes et modifications sont possibles et entrent dans le cadre et l'esprit de l'invention.
Les légendes des figures sont les suivantes :
Figure 1 : Courbes des températures de fusion obtenues pour un ADN fœtal RHD positif (A), ou RHD négatif (B).
EXEMPLE :
Des échantillons sanguins de 5 ml sont prélevés sur deux femmes enceintes A et B. Le plasma est extrait à l'aide d'un kit commercial selon les indications du fournisseur (Kit NucleoSpin Plasma XS de Macherey-Nagel).
Les deux échantillons de plasma ainsi récupérés, de 40 μΐ, sont traités avec l'enzyme BstU I, selon le protocole donné par le fabriquant (New England Biolabs).
Puis chacun des échantillons ainsi traités est mélangé avec une composition comprenant les 8 amorces SEQ ID NO : 1 à 8, dans une solution aqueuse, pour obtenir un volume final de 20μΙ.
Les deux échantillons sont ensuite soumis à une PCR en temps réel, selon les conditions spécifiées dans la description ci-dessus, et avec les spécifications suivantes : dénaturation initiale : à 98° C pendant 2 minutes ;
amplification en deux phases : Première phase : dénaturation à 98° C pendant 10 secondes ;
Seconde phase : hybridation / élongation à 57° C pendant 5 secondes ; lesdites première et seconde phases étant répétées 55 fois, et refroidissement à 65° C, pendant 1 minute. Enfin, une courbe de fusion (en haute résolution) des produits amplifiés en PCR est réalisée à partir d'une température de 60° C jusqu'à 100°C avec des incréments de température de 0,2° C.
Les résultats sont présentés en Figure 1 : La courbe de température de fusion issue de l'échantillon de la patiente A est en Figure 1A : 4 pics sont observés, donc l'ADN fœtal est RHD positif. La patiente A doit donc être traitée par des anti-D.
La courbe de température de fusion issue de l'échantillon de la patiente B est en Figure 1 B : un seul pic est observé, celui de RASSF1A. L'ADN fœtal est donc RHD négatif, et aucun traitement de la mère n'est nécessaire.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Kit pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants : taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ ID NO : 1 ) actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2)
AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)
ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)
ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)
C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)
CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)
CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8).
2. Procédé in vitro de détection du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant les étapes suivantes :
a) traitement de l'échantillon de plasma ou de sérum maternel par une enzyme sensible à la méthylation,
b) mélange de l'échantillon traité obtenu en a) avec au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants : taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ ID NO : 1 ) actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2)
AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)
ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)
ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)
C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)
CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)
CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8), c) traitement du mélange obtenu à l'étape b) par PCR en temps réel, d) réalisation et analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c).
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'échantillon de plasma ou de sérum maternel est préalablement soumis à une étape d'extraction d'ADN, ledit ADN étant ensuite mélangé selon l'étape a).
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, qui comprend les étapes suivantes : a') extraction d'ADN à partir d'un échantillon de plasma ou de sérum maternel, a) traitement de l'ADN extrait obtenu à l'étape a') par une enzyme sensible à la méthylation,
b) mélange de l'échantillon traité obtenu en a) avec au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants : taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ ID NO :1 ) actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2) AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3) ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4) ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5) C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6) CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7) CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8), c) traitement du mélange obtenu à l'étape b) par PCR en temps réel, d) réalisation et analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c).
5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, dans lequel l'enzyme sensible à la méthylation est choisie parmi BstU I, Bsh1236l, Accll, BstFNI et Mvnl.
6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, dans lequel l'étape de PCR en temps réel c) se fait par les étapes successives suivantes :
une étape de dénaturation initiale à une température comprise entre 90° C et 100° C, de préférence comprise entre 93° C et 98° C, pendant un temps compris entre 1 et 10 minutes ;
une étape d'amplification en deux phases :
Première phase : dénaturation à une température comprise entre 90° C et 100° C, de préférence comprise entre 93° C et 98° C, pendant un temps compris entre 5 et 20 secondes ;
Seconde phase : hybridation / élongation à une température comprise entre 55° C et 65° C, de préférence comprise entre 57° C et 62° C, pendant un temps compris entre 5 et 20 secondes ;
lesdites première et seconde phases étant répétées 50 à 60 fois, et une étape de refroidissement à une température comprise entre 60° C et 70° C, pendant un temps compris entre 1 et 10 minutes.
7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, dans lequel l'étape d) comprend la réalisation d'une courbe de fusion haute résolution des produits amplifiés à l'étape c) à partir d'une température de 60° C jusqu'à 100° C avec des incréments de température compris entre 0,01 ° C et 0,5° C, de préférence compris entre 0,04° C et 0,2° C.
8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, dans lequel l'échantillon de plasma ou de sérum maternel est un échantillon de plasma ou de sérum maternel RhD négatif.
9. Utilisation du kit selon la revendication 1 , pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel.
10. Kit selon la revendication 1 ou son utilisation selon la revendication 9, ou procédé selon l'une des revendications 2 à 8, dans lequel les deux amorces SEQ ID NO :3 et 4 sont remplacées par deux amorces complémentaires d'un promoteur de gène présentant un état de méthylation différent pour l'ADN fœtal et pour l'ADN maternel, lesdites deux amorces complémentaires étant capables d'amplifier par PCR un segment ayant un pourcentage de CG compris entre 70 et 90 %, de préférence entre 70 et 80%.
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