FR3100820A1

FR3100820A1 - Procédé de génotypage adapté au traitement d’un grand nombre d’échantillons, notamment en cas de polymorphisme élevé

Info

Publication number: FR3100820A1
Application number: FR1910106A
Authority: FR
Inventors: Pascal Herve
Original assignee: Bionobis SARL
Current assignee: Bionobis SARL
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2039-09-12
Also published as: FR3100820B1; EP4028548A1; WO2021048504A1

Abstract

L’invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons d’ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d’amplification par PCR indexée puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé étant simple, rapide et peu coûteux.

Description

Procédé de génotypage adapté au traitement d’un grand nombre d’échantillons, notamment en cas de polymorphisme élevé

L’invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons d’ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d’amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l’état de la technique.

Le séquençage à haut débit (aussi appelé NGS pour Next Generation Sequencing) permet d’opérer en parallèle un très grand nombre de séquences courtes. Le principe de cette technique est le suivant : Les séquences à analyser sont tout d’abord préparées par ajout de séquences adaptatrices aux extrémités. Elles sont ensuite fixées sur un support solide via ces séquences adaptatrices et chaque fragment est enrichi pour former des « clusters » clonaux qui seront séquencés par la suite. À chaque cycle, l'ajout d'un nucléotide se traduit par un signal fluorescent associé à chacun des quatre nucléotides de l'ADN. Ces signaux sont ensuite analysés par un logiciel de traitement de données qui restitue le résultat de la lecture des séquences. Cette méthode est rapide et précise.

Afin de permettre un multiplexage élevé et dans ce contexte assurer la stabilité des duplex d’ADN hydridés lorsque la température de demi-dénaturation (Tm) est élevée, des bases LNA™(Locked Nucleic Acid) sont ajoutées, notamment dans la méthode NGS développée par la société Fluidigm. Ces bases sont des oligonucléotides modifiés qui obéissent aux règles d'appariement des bases de Watson-Crick et forment des duplex, lesquels sont significativement plus stables que des duplex similaires formés par des oligonucléotides non modifiés. Ainsi, la sensibilité de discrimination entre des allèles ne présentant que des différences mineures, voire un seul nucléotide différent, est possible. Cette technique est particulièrement adaptée lorsque le polymorphisme est très élevé.

Cette technologie NGS est largement utilisée en recherche, comme en diagnostic. Elle permet de séquencer des génomes entiers. Elle constitue ainsi un outil très performant et représente une aide au diagnostic de maladies génétiques et oncologiques par exemple.

Afin de permettre la lecture de séquences cibles, comme ceci est le cas pour le diagnostic, une librairie de séquences est préparée en amont du séquençage afin d’enrichir la librairie en séquences d’intérêt. Cette amplification de séquences est réalisée par réaction de polymérase en chaîne (PCR).

Comme le séquençage NGS permet de lire un grand nombre de séquences simultanément, il est intéressant de mélanger des échantillons provenant de patients différents. Afin d’identifier les séquences provenant d’un même échantillon, celles-ci peuvent être étiquetées lors de l’étape d’amplification par l’ajout de séquences étiquettes ou « index ». La méthode de PCR indexée est connue de l’homme du métier et décrite par exemple dans l’article de Stahlberg A.et al.(Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No.11)

Le document EP 2599877 décrit une méthode de séquençage comprenant une première étape de PCR pendant laquelle les séquences sont marquées à l’aide d’un index puis une seconde étape de séquençage de deuxième génération. Lors du séquençage, une stratégie de cisaillement incomplet de l’ADN est mise en œuvre pour augmenter l’amplitude de lecture des séquences.

Le séquençage NGS bien que très puissant en termes de capacité de séquençage présente des inconvénients. Le principal obstacle est la durée de réalisation d’un génotypage depuis la préparation de l’échantillon jusqu’à l’obtention du résultat qui s’étale sur plusieurs jours.

Il existe un besoin de disposer d’une méthode de séquençage précise et rapide à coût raisonnable.

La présente invention concerne une méthode de génotypage à partir d’échantillons d’ADN comprenant :

une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée en condition de multiplexage faible réalisée en système microfluidique,
- dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant entre 8 et 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ;
une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.

Pour stabiliser les duplex lors du séquençage, les inventeurs ont introduit des séquences d’une dizaine de nucléotides aux extrémités des amorces. Cet ajout permet de se passer des bases modifiées tout en conservant une grande fiabilité de lecture lors du séquençage.

La présente invention concerne également un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée en système microfluidique et d’un séquençage à haut débit de type NGS, ainsi qu’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de bases LNA™.

Avantages de l’invention

La méthode de génotypage selon l’invention présente plusieurs avantages : elle est simple, rapide et peu coûteuse et permet de traiter, en simultané, une grande série d’échantillons.

Elle combine une PCR indexée réalisée dans un système microfluidique (gain de temps et de matériel) avec un système de séquençage NGS (précision, rapidité).

Cette méthode est simple car 100% automatisée. Elle est proposée sous la forme d’un kit prêt à l’emploi. Ce format limite les manipulations par l’expérimentateur et donc les risques d’erreur. Il permet aussi de gagner du temps en diminuant le nombre de gestes à effectuer.

Cette méthode est rapide puisque le résultat est obtenu en moins de 48 heures. En effet, il faut compter 6h15 pour la préparation de la banque, 32h pour le séquençage et 3h30 environ pour l’analyse, et ceci quel que soit le nombre de patients diagnostiqués.

Elle est peu coûteuse et permet de proposer une solution de génotypage efficace et très fiable, accessible au plus grand nombre. Elle a vocation à être déployée dans tous les laboratoires où un génotypage est pratiqué, par exemple dans les centres de recherches, dans les centres hospitaliers, les banques de sang et les centres de transfusion sanguine où elle s’inscrit dans une démarche de maitrise des coûts de santé publique et de productivité.

Elle permet le traitement d’un grand nombre d’échantillons en même temps, ce qui est rentable à la fois en termes de temps et de coût. Dans la version actuelle du kit, il est possible de génotyper en même temps 48 patients.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Un premier objet de l’invention concerne une méthode de génotypage à partir d’échantillons d’ADN comprenant :

une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée en condition de faible mutiplexage et réalisée dans un système microfluidique,
- dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45 à 65 % sont des G ou C ;
une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.

Par « séquence stabilisatrice » au sens de l’invention, on entend une séquence de 8 à 12 nucléotides, à savoir 8, 9, 10, 11 ou 12 nucléotides. De plus, ces séquences sont riches en G et C c’est-à-dire qu’elles contiennent entre 45% et 65% de bases G et/ou C. Des exemples de séquences stabilisatrices utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.1 et SEQ ID No.2. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier saura combiner les bases pour modifier la séquence de la séquence stabilisatrice.

Dans un mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices sont des séquences de 10 nucléotides. Dans un autre mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices contiennent de 50% à 60% de bases G et/ou C. Par exemple, une séquence de 10 nucléotides contient 5 à 6 bases G et/ou C.

Les conditions de « faible multiplexage » s’entendent de conditions permettant d’amplifier une seule cible, voire 2, 3 ou 4 cibles simultanément dans un même mélange réactionnel.

Par « séquence universelle » au sens de l’invention, on entend une séquence définie qui sera utilisée dans tous les amplicons. La méthode met en réalité en œuvre deux types de séquences universelles, une séquence sens et une séquence antisens de sorte à pouvoir définir l’orientation des séquences amplifiées. Des exemples de séquences universelles utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.3 et SEQ ID No.4. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier saura utiliser d’autres séquences en tant que séquences universelles.

L’étape a. d’amplification des séquences d’intérêt repose sur une technologie de PCR indexée permettant de générer simultanément les amplicons et de les marquer à l’aide d’une étiquette spécifique de l’échantillon. De plus, elle est mise en œuvre en système microfluidique.

Elle peut être résumée comme suit :

Conception des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques à amplifier et préparation de mélanges réactionnels pouvant combiner plusieurs couples d’amorces (simplexage ou multiplexage faible)
Préparation des échantillons biologiques à analyser (normalisation de la concentration)
Réaction d’amplification des séquences par PCR, de préférence dans un système microfluidique (pour gain de temps et de matériel), et ajout d’étiquettes spécifiques de l’échantillon sur chaque séquence amplifiée. Cette réaction met en œuvre deux types d’amorces simultanément :
1. des couples d’amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces sens et antisens comprenant chacune une séquence universelle située à leur extrémité 3’, caractérisées en ce que les séquences universelles contiennent à l’extrémité 5’ (entre l’amorce spécifique et la séquence universelle) une séquence stabilisatrice d’une dizaine de nucléotides (généralement entre 8 et 12 nucléotides) constituée de 45% à 65% de nucléotides G ou C;
2. des couples amorces sens et antisens comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles sens et antisens respectivement et une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
Récupération, purification et quantification des produits de PCR indexés (amplicons) en vue de leur séquençage.

Une telle technologie peut être par exemple basée sur celle développée par la société Fluidigm (« Integrated Fluidic Circuit » ou IFC ). Utiliser une telle technologie outre le gain de temps, permet de travailler dans des conditions standardisées.

Dans un mode de réalisation préféré, les amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré, l’étape d’amplification met en outre en œuvre des couples d’amorces destinés à l’indexation et au séquençage des séquences amplifiées, lesdites amorces comprenant :

au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et
une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage,

l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.

Par « index » au sens de l’invention, on entend une séquence utilisée en tant qu’étiquette ou code-barre. Dans le contexte d’un séquençage NGS, les index sont des séquences courtes polymorphes. Un index particulier unique est associé aux échantillons provenant d’un même patient et permet l’étiquetage des séquences de ce patient lors de l’étape d’amplification. Les échantillons provenant de différents patients étant mélangés lors du séquençage, ces index servent à savoir à quel patient associer les séquences après analyse. Des exemples d’index utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 et SEQ ID No.7. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier saura modifier ces index pour proposer une multitude de séquences uniques.

Par « adaptateur nécessaire au séquençage » au sens de l’invention, on entend une séquence permettant la fixation des séquences sur un support en vue de leur séquençage. Des exemples de séquences de fixation nécessaires pour le séquençage utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.8 et SEQ ID No.9. Il s’agit des adapteurs « P5 » et « P7 » proposés par la société Illumina® et adaptés au séquençage NGS. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier peut utiliser d’autres systèmes adaptateurs en fonction de la technologie NGS employée.

L’amplification des séquences d’ADN dans un système microfluidique permet de réaliser 48 PCR par échantillon et de traiter 48 échantillons différents simultanément (soit un total de 2304 chambres réactionnelles traitées en une seule fois), les produits PCR portant chacun une étiquette particulière spécifique de l’échantillon. Ainsi, il est possible de regrouper et mélanger tous les produits PCR afin d’effectuer une seule réaction de séquençage. Le résultat du séquençage fournit alors deux informations par séquence : la lecture de la séquence d’intérêt et l’identification de l’échantillon d’où provient cette séquence. Ainsi, il est possible de réaliser un génotypage pour 48 patients simultanément.

La méthode de génotypage selon l’invention peut être réalisée indifféremment à partir d’ADN d’origine humaine ou animale.

L’étape b. de séquençage repose sur une technologie de séquençage à haut débit telle que la technologie NGS développée notamment par la société Illumina.

Ce type de technologie implique une Tm déterminée (imposée par la technologie utilisée, en d’autres termes paramétrée par le fournisseur). Cette Tm s’avère trop élevée si l’on souhaite séquencer des amplicons obtenus via une PCR indexée en système microfluidique. En effet, ces amorces configurées pour fonctionner en système microfluidique, et dont les séquences complémentaires sont ensuite utilisées lors de l’étape d’amplification ont généralement une Tm plus faible (notamment parce qu’elles sont courtes), ce qui génèrent des problèmes d’instabilité. Dans un tel cas, il est classiquement recommandé d’intégrer des bases LNA™ dans les séquences lors de l’amplification pour que les duplex formés avec les amorces de séquençage et de lecture des index lors du séquençage soient stables. Or, l’ajout de ces bases LNA™ est couteux et constituent des étapes supplémentaires dans la méthode.

De manière très intéressante, les inventeurs ont démontré que des séquences d’une dizaine de nucléotides, appelées « séquences stabilisatrices » permettent de conserver un degré d’hybridation suffisant pour que le séquençage NGS se déroule correctement même lorsque la température de demi-hybridation (Tm) est élevée. Ainsi, ils ont montré que l’effet stabilisateur des bases LNA™ peut être remplacé par l’ajout d’une séquence stabilisatrice et que cette séquence est suffisante pour le résultat du séquençage soit aussi fiable que lorsque des bases LNA™ sont utilisées. Le fait de s’affranchir de l’utilisation de bases LNA™ rend la méthode plus simple et moins coûteuse. Ainsi, la présente invention propose pour la première fois de combiner une PCR indexée en système microfluidique avec un séquençage NGS dans une méthode simple et rapide à mettre en œuvre, et dont le cout est maitrisé. La simplicité et la rapidité sont d’autant plus remarquables qu’un kit prêt à l’emploi pour la mise en œuvre de cette méthode est proposé.

L’étape b. de la méthode selon l’invention est réalisée à l’aide des amorces de séquençage et de lecture d’index, dont aucune ne contient de bases LNA™ mais dont chacune contient une séquence stabilisatrice, à savoir :

un couple d’amorces de séquençage s’hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’extrémité 5’ ; ces amorces permettent d’amplifier les séquences d’intérêt pour le séquençage ;
une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice; cette amorce permet l’amplification de l’index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.

Il est à noter que les séquences stabilisatrices des amorces de séquençage et de l’amorce de lecture d’index sont complémentaires des séquences stabilisatrices présentes sur les séquences amplifiées en vue du séquençage. En d’autres termes, ces séquences stabilisatrices ont les mêmes séquences que celles présentes dans les amorces spécifiques.

Dans un mode de réalisation particulier où l’index est positionné en 3’ de la séquence à analyser, l’amorce de lecture d’index est complémentaire de la séquence universelle antisens et la séquence stabilisatrice est positionnée à son extrémité 3’. En d’autres termes, l’amorce antisens est utilisée en tant qu’amorce sens en amont de l’index.

Des exemples de séquences d’amorces de séquençage utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.10 et SEQ ID No.11. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier peut proposer d’autres d’amorces de séquençage en fonction des séquences universelles encadrant les séquences à amplifier.

Une spécificité de la présente méthode réside dans le nombre élevé de cibles amplifiées qui apporte ainsi une grande diversité de séquences amplifiées. Par conséquent, il n’est pas nécessaire d’utiliser de témoin de diversité de bases lors du séquençage.

Un second objet de l’invention concerne un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée en système microfluidique et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant :

une plaque PCR comprenant des amorces destinées à l’indexation pré-aliquotées mélangées au Master mix.
une plaque PCR comprenant des amorces spécifiques (diluées dans un tampon approprié à l’utilisation en microfluidique)
des couples d’amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces comprenant en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C, la dite séquence stabilisatrice étant précédée d’une séquence universelle ;
des couples d’amorces permettant l’indexation des séquences amplifiées, ces amorces comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider avec lesdites séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ;
d’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™ comprenant un couple d’amorce pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l’index, chacune de ces amorces comprenant une séquence s’hybridant avec une séquence stabilisatrice.

Dans un autre mode de réalisation préféré, ce kit comprend en outre au moins un des éléments suivants :

une solution tampon, préférentiellement présentée en tubes
des mélanges réactionnels pour le séquençage NGS sans base LNA™, préférentiellement présentés en tubes,
une notice d’utilisation

Par « Master Mix », on entend un mélange comprenant de la Taq polymérase, une solution tamponnée contenant du MgCl₂, des dNTPs (mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy-adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy-cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy-guanine tri-phosphate), dTTP (désoxy-thymine tri-phosphate), une solution de DMSO et un tampon qui réduit l’adhésion des molécules sur le plastique.

De manière tout à fait préférée, les plaques PCR sont disposées sur un même support, ledit support étant une plaque microfluidique comprenant des puits et des nano-chambres de réaction. Il est possible d’utiliser une plaque de type IFC (Integrated Fluidic Circuit) support de la société Fluidigm.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne un kit tel que défini précédemment lequel les plaques PCR dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d’une part des amorces spécifiques et d’autre part des amorces permettant l’indexation et des micro-chambres réactionnelles.

Un troisième objet de l’invention concerne un mélange réactionnel pour le séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes :

une amorce de séquençage sens s’hybridant à la séquence universelle située en 5’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;
une amorce de séquençage antisens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;
une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’une de ses extrémités.

Dans un mode de réalisation particulier, l’amorce de lecture d’index est une amorce sens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à son extrémité 3’.

Dans ce mélange, les deux amorces de séquençage aptes à s’hybrider aux séquences universelles situées de part et d’autre de la séquence à analyser permettent l’amplification de cette dernière tandis que l’amorce sens s’hybridant en aval de la séquence à analyser permet l’amplification de l’index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.

Dans un mode de réalisation particulier, le mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprend :

une amorce de séquençage sens de séquence SEQ ID No.10;
une amorce de séquençage antisens de séquence SEQ ID No.11; et
une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID No. 12.

La méthode selon l’invention, ainsi que le kit associé sont particulièrement adaptés au génotypage pour traiter en une seule réaction un grand nombre de séquences (entre 48 et 96), notamment en cas de polymorphisme élevé. Toutefois les amplicons ne doivent pas être trop longs (de préférence < 500pb) et le multiplexage doit être modéré (entre 2 et 3 cibles par réaction PCR). Elle permet ainsi de répondre à des questions complexes d’organisation dans les laboratoires en traitant simultanément un grand nombre de patients.

Les différents modes de réalisation préférés décrits précédemment peuvent être combinés entre eux, deux par deux ou de manière plus étendue, jusqu’à constituer un mode de réalisation préféré combinant tous les modes préférés.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Représentation schématique des amorces utilisées selon un mode de réalisation particulier de la présente invention. (A) amorces spécifiques, (B) séquences universelles et stabilisatrices, (C) Adaptateurs P5-P7 et Index, (D) amorce de séquençage Sens, (E) amorce de séquençage Anti sens, (E) amorce de lecture d’index.

Figure 2 : Représentation d’une séquence amplifiée en tant que descriptif d’un mode de réalisation particulier.

EXEMPLE

EXEMPLE 1 : Principe de la méthode de génotypage NGS sans base LNA ™

1. Amplification des séquences d’intérêt par PCR indexée

A partir de variants alléliques ou de mutations connus dans un système biologique défini, des séquences d’intérêt sont identifiées en vue du génotypage.

Des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques ou mutants à amplifier sont conçus et validés. Ces amorces permettront l’amplification des séquences d’intérêt. Les réactions d’amplification étant réalisées en multiplexage, des mélanges réactionnels combinant plusieurs couples d’amorces sont préparés.

Les échantillons biologiques à analyser sont préparés en vue de la PCR, l’ADN est extrait et purifié. Cette étape de préparation est bien connue de l’homme du métier et aboutit à des échantillons présentant des concentrations en ADN normalisées.

La réaction d’amplification proprement dite est réalisée dans une plaque microfluidique de type IFC de Fluidigm. Les mélanges réactionnels contenant les amorces spécifiques sont déposées dans une première zone de 48 puits et les amorces destinées à l’indexation ainsi que le Master Mix sont déposés dans une seconde zone de 48 puits.

La réaction d’amplification se déroule en conditions standard, dans un automate de type Juno de la société Fuidigm par exemple.

Une fois amplifiées, les séquences sont récupérées, purifiées et quantifiées pour être séquencées.

2. Séquençage NGS

Le séquençage est réalisé dans un séquenceur NGS de la société Illumina.

Le séquençage est réalisé à l’aide du couple d’amorces de séquençage pour amplifier les séquences à analyser et de l’amorce de lecture d’index pour identifier le patient auquel se rapporte la séquence.

Tableau 1 : Récapitulatif des séquences décrites

Descriptif de le séquence	SEQ ID N ^o .	Séquence 5’-3’
Séquence stabilisatrice 1	1	GCAGACTCAG
Séquence stabilisatrice 2	2	TGTTGACTCC
Séquence universelle 1	3	ACACTCACGACATGGTTCTACA
Séquence universelle 2	4	TACCGTAGCAGAGACTTGGTCT
Index 1	5	CGCGACTTGT
Index 2	6	GGTTGGAGTT
Index 3	7	GAGCACGGAA
Adaptateur de séquençage P5 (Illumina®)	8	AATGATACGGCGACCACCGAGATCT
Adaptateur de séquençage P7 (Illumina®)	9	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Amorce de séquençage sens	10	ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAG
Amorce de séquençage antisens	11	TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCC
Amorce de lecture d’index	12	GGAGTCAACAAGACCAAGTCTCTGCTACGGTA

Claims

Méthode de génotypage à partir d’échantillons d’ADN comprenant :
a . une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique,
dans laquelle les couples amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ;
b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
Méthode selon la revendication 1 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice comprend 10 nucléotides dont 5 à 6 nucléotides sont des G ou C.
Méthode selon la revendication 2 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice est choisie parmi les séquences SEQ ID NO. 1 et SEQ ID NO.2
Méthode selon l’une des revendications 1 à 3 dans laquelle lesdites amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice.
Méthode selon la revendication 4 dans laquelle ladite étape d’amplification d’ADN met en outre en œuvre des couples d’amorces destinés à l’indexation et au séquençage des séquences amplifiées comprenant :
au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et

au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage,
l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle l’étape de séquençage est réalisée à l’aide des amorces suivantes :
un couple d’amorces de séquençage s’hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’extrémité 5’ ;

une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice.
Kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant :
une plaque PCR comprenant des amorces destinées à l’indexation pré-aliquotées mélangées au Master mix ;

une plaque PCR comprenant des amorces spécifiques ;

des couples d’amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces comprenant en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels au moins 45% à 65% sont des G ou C, précédée d’une séquence universelle ;

des couples d’amorces permettant l’indexation et le séquençage des séquences amplifiées, ces amorces comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider aux séquences universelles et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ;

d’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™ comprenant un couple d’amorce pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l’index, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice.
Kit selon la revendication 7 dans lequel lesdites plaques dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d’une part des amorces spécifiques et d’autre part des amorces permettant l’indexation et des micro-chambres réactionnelles.
Mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes :
une amorce de séquençage sens s’hybridant à la séquence universelle située en 5’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;

une amorce de séquençage antisens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;

une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’une de ses extrémités 3’.
Mélange selon la revendication 9 dans lequel :
ladite amorce de séquençage sens est de séquence SEQ ID No.10 ;

ladite amorce de séquençage antisens est de séquence SEQ ID No.11; et

ladite amorce de lecture d’index est de séquence SEQ ID No.12.