FR3110178A1

FR3110178A1 - Procédé de génotypage adapté au traitement simultané d’un grand nombre de patients

Info

Publication number: FR3110178A1
Application number: FR2004917A
Authority: FR
Inventors: Pascal Herve
Original assignee: Bionobis SARL
Current assignee: Bionobis SARL
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2040-05-18
Also published as: WO2021234269A1; EP4153778A1; FR3110178B1

Abstract

L’invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre de patients. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d’amplification par PCR indexée puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple et moins coûteux que les procédés de l’état de la technique.

Description

Procédé de génotypage adapté au traitement simultané d’un grand nombre de patients

L’invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre de patients. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d’amplification par PCR indexée puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l’état de la technique.

Le séquençage à haut débit (aussi appelé NGS pour Next Generation Sequencing) permet d’opérer en parallèle un très grand nombre de séquences courtes. Le principe de cette technique est le suivant : les séquences à analyser sont tout d’abord préparées par ajout de séquences adaptatrices aux extrémités. Elles sont ensuite fixées sur un support solide via ces séquences adaptatrices et chaque fragment est enrichi pour former des « clusters » clonaux qui seront séquencés par la suite. À chaque cycle, l'ajout d'un nucléotide se traduit par un signal fluorescent associé à chacun des quatre nucléotides de l'ADN. Ces signaux sont ensuite analysés par un logiciel de traitement de données qui restitue le résultat de la lecture des séquences. Cette méthode est rapide et précise.

Afin d’assurer la stabilité des duplex d’ADN hydridés lorsque la température de demi-dénaturation (Tm) est élevée, notamment en cas de multiplexage élevé, des bases LNA™ (Locked Nucleic Acid) sont ajoutées, notamment dans la méthode NGS développée par la société Fluidigm. Ces bases sont des oligonucléotides modifiés qui obéissent aux règles d'appariement des bases de Watson-Crick et forment des duplex, lesquels sont significativement plus stables que des duplex similaires formés par des oligonucléotides non modifiés. Ainsi, la sensibilité de discrimination entre des allèles ne présentant que des différences mineures, voire un seul nucléotide différent, est possible. Cette technique est particulièrement adaptée lorsque le polymorphisme est très élevé.

Cette technologie NGS est largement utilisée en recherche, comme en diagnostic. Elle permet de séquencer des génomes entiers. Elle constitue ainsi un outil très performant et représente une aide au diagnostic de maladies génétiques et oncologiques par exemple.

Afin de permettre la lecture de séquences cibles, comme ceci est le cas pour le diagnostic, une librairie de séquences est préparée en amont du séquençage afin d’enrichir la librairie en séquences d’intérêt. Cette amplification de séquences est réalisée par réaction de polymérase en chaîne (PCR).

Comme le séquençage NGS permet de lire un grand nombre de séquences simultanément, il est intéressant de mélanger des échantillons provenant de patients différents. Afin d’identifier les séquences provenant d’un même échantillon, celles-ci peuvent être étiquetées lors de l’étape d’amplification par l’ajout de séquences étiquettes ou « index ». La méthode de PCR indexée est connue de l’homme du métier et décrite par exemple dans l’article de Stahlberg A.et al.(Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No.11)

Le document EP 2599877 décrit une méthode de séquençage comprenant une première étape de PCR pendant laquelle les séquences sont marquées à l’aide d’un index puis une seconde étape de séquençage de deuxième génération. Lors du séquençage, une stratégie de cisaillement incomplet de l’ADN est mise en œuvre pour augmenter l’amplitude de lecture des séquences.

Le séquençage NGS bien que très puissant en termes de capacité de séquençage présente des inconvénients. Le principal obstacle est la durée de réalisation d’un génotypage depuis la préparation de l’échantillon jusqu’à l’obtention du résultat qui s’étale sur plusieurs jours.

Il existe un besoin de disposer d’une méthode de séquençage précise et rapide à coût raisonnable.

La présente invention concerne une méthode de génotypage adaptée au traitement simultané d’un grand nombre d’échantillons d’ADN provenant de patients comprenant :

une étape d’amplification de l’ADN provenant de chaque patient par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée,
- dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant entre 8 et 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ;
une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.

Pour stabiliser les duplex lors du séquençage, les inventeurs ont introduit des séquences d’une dizaine de nucléotides aux extrémités des amorces. Cet ajout permet de se passer des bases modifiées tout en conservant une grande fiabilité de lecture lors du séquençage.

La présente invention concerne également un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS, ainsi qu’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de bases LNA™.

Avantages de l’invention

La méthode de génotypage selon l’invention présente plusieurs avantages : elle est simple, rapide et peu coûteuse et permet de traiter, en simultané, une grande série d’échantillons provenant de différents patients.

Elle combine une PCR indexée avec un système de séquençage NGS (précision, rapidité).

Cette méthode est simple, elle ne nécessite pas d’autre équipement lourd autre qu’une machine PCR et un équipement destiné au séquençage NGS. Elle est proposée sous la forme d’un kit prêt à l’emploi. Ce format limite les manipulations par l’expérimentateur et donc les risques d’erreur. Il permet aussi de gagner du temps en diminuant le nombre de gestes à effectuer.

Cette méthode est rapide du fait que l’amplification et l’indexation sont réalisées en une seule et même étape. A titre d’exemple, le résultat peut être obtenu en moins de 48 heures si l’on traite jusqu’à 96 échantillons en même temps et que l’on dispose d’une seule machine PCR. On comprend que le temps de traitement dépend de l’environnement technique (nombre de machines disponibles) et du nombre d’échantillons à traiter, mais que la méthode selon l’invention sera néanmoins plus rapide que les méthodes existantes jusqu’alors.

Cette méthode est peu coûteuse et permet de proposer une solution de génotypage en un seul locus ou un petit nombre de loci (généralement entre 1 et 5), simple à mettre en œuvre et très fiable, accessible au plus grand nombre. Elle a vocation à être déployée dans tous les laboratoires où un génotypage est pratiqué, par exemple dans les centres de recherches, dans les centres hospitaliers, les banques de sang et les centres de transfusion sanguine où elle s’inscrit dans une démarche de maitrise des coûts de santé publique et de productivité.

Elle permet de diagnostiquer un grand nombre de patients en même temps, ce qui est rentable à la fois en termes de temps et de coût. Dans la version actuelle de la méthode, notamment sous forme du kit, il est possible de génotyper simultanément de 2 à 384 patients. Les échantillons étant traités en plaques de 96 puits, il est préféré de traiter un multiple de 96 échantillons (96, 192, 288, 384).

Cette méthode est particulièrement applicable au génotypage de maladies dans lesquelles un seul gène est impliqué. Il peut s’agir de diagnostiquer des maladies héréditaires dans le cadre d’un diagnostic familial, diagnostic prénuptial ou prénatal, d’une étude de suivi de chimérisme post-greffe ou de diagnostiquer une cohorte de patients atteints de cancers sur quelques mutations-clés.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Un premier objet de l’invention concerne une méthode de génotypage adaptée au traitement simultané d’un grand nombre de patients comprenant :

une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée,
- dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45 à 65 % sont des G ou C ;
une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.

Par « séquence stabilisatrice » au sens de l’invention, on entend une séquence de 8 à 12 nucléotides, à savoir 8, 9, 10, 11 ou 12 nucléotides. De plus, ces séquences sont riches en G et C c’est-à-dire qu’elles contiennent entre 45% et 65% de bases G et/ou C. Un amplicon contient donc deux séquences stabilisatrices qui joueront des rôles différents pendant le séquençage : l’une s’hybridant à une amorce de séquençage et l’autre s’hybridant à une amorce de lecture. Des exemples de séquences stabilisatrices utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.1 et SEQ ID No.2. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier saura combiner les bases pour modifier la séquence de la séquence stabilisatrice.

Dans un mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices sont des séquences de 10 nucléotides. Dans un autre mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices contiennent de 50% à 60% de bases G et/ou C. Par exemple, une séquence de 10 nucléotides contient 5 à 6 bases G et/ou C.

L’étape a. d’amplification des séquences d’intérêt repose sur une technologie de PCR indexée permettant de générer simultanément les amplicons et de les marquer à l’aide d’une étiquette spécifique de l’échantillon. Elle peut être résumée comme suit :

Conception des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques à amplifier.
Préparation des échantillons biologiques à analyser (normalisation de la concentration).
Réaction d’amplification des séquences par PCR avec ajout d’étiquettes spécifiques de l’échantillon (index) sur chaque séquence amplifiée. Cette réaction met en œuvre deux types d’amorces simultanément :
- des couples d’amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces sens et antisens comprenant chacune une séquence universelle située à leur extrémité 3’, caractérisées en ce que les séquences universelles contiennent à l’extrémité 5’ (entre l’amorce spécifique et la séquence universelle) une séquence stabilisatrice d’une dizaine de nucléotides (généralement entre 8 et 12 nucléotides) constituée de 45% à 65% de nucléotides G ou C;
- des couples amorces sens et antisens comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles sens et antisens respectivement et une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
Récupération, purification et quantification des produits de PCR indexés (amplicons) en vue de leur séquençage.

Dans un mode de réalisation préféré, les amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice.

Par « séquence universelle » au sens de l’invention, on entend une séquence définie qui sera utilisée dans tous les amplicons. Ces séquences jouent deux rôles : d’une part, elles permettent l’hybridation des amorces d’indexation en vue de l’ajout de l’index pendant l’étape d’amplification, et d’autre part elles permettent l’amplification des séquences en vue de leur lecture pendant l’étape de séquençage. La méthode met en réalité en œuvre deux types de séquences universelles, une séquence sens et une séquence antisens de sorte à pouvoir définir l’orientation des séquences amplifiées. Des exemples de séquences universelles utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.3 et SEQ ID No.4. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier saura utiliser d’autres séquences en tant que séquences universelles.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré, l’étape d’amplification met en outre en œuvre des couples d’amorces destinés à l’indexation (dites « amorces d’indexation ») des séquences amplifiées, lesdites amorces comprenant :

au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et
une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage,

l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.

Par « index » au sens de l’invention, on entend une séquence utilisée en tant qu’étiquette ou code-barre. Dans le contexte d’un séquençage NGS, les index sont des séquences courtes polymorphes. Un index particulier unique est associé à chaque patient. Les échantillons provenant de différents patients, en particulier de 2 à 384 patients, étant mélangés lors du séquençage, ces index servent à savoir à quel patient associer les séquences après analyse. Des exemples d’index utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 et SEQ ID No.7. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier saura modifier ces index pour proposer une multitude de séquences uniques.

Par « adaptateur nécessaire au séquençage » au sens de l’invention, on entend une séquence permettant la fixation des séquences sur un support en vue de leur séquençage conformément au protocole de séquençage NGS utilisé. Des exemples de séquences de fixation nécessaires pour le séquençage utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.8 et SEQ ID No.9. Il s’agit des adapteurs « P5 » et « P7 » proposés par la société Illumina® et adaptés au séquençage NGS. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier peut utiliser d’autres systèmes adaptateurs en fonction de la technologie NGS employée.

L’amplification des séquences d’ADN par PCR indexée permet l’obtention de produits PCR portant chacun une étiquette particulière spécifique de chaque patient. Ainsi, il est possible de regrouper et mélanger tous les produits PCR afin d’effectuer une seule réaction de séquençage. Le résultat du séquençage fournit alors deux informations par séquence : la lecture de la séquence d’intérêt et l’identification du patient auquel correspond cette séquence.

Par la méthode selon l’invention, il est possible de réaliser un génotypage à un locus particulier pour 1 patient ou de préférence 2 à 384, et de manière encore plus préférée pour un multiple de96 patientssimultanément, à savoir 96, 192, 288 ou 384 patients. Il est également possible de détecter plusieurs mutations par patients (situées sur des régions distantes ou sur la même région) en utilisant plusieurs amorces simultanément dans un système d’amplification en multiplexage, donc sans diminuer le même nombre de patients traités simultanément.

La méthode de génotypage selon l’invention peut être réalisée indifféremment à partir d’ADN d’origine humaine ou animale.

L’étape b. de séquençage repose sur une technologie de séquençage à haut débit telle que la technologie NGS développée notamment par la société Illumina®.

Ce type de technologie impose une Tm déterminée (imposée par la technologie utilisée, en d’autres termes paramétrée par le fournisseur), ce qui implique d’intégrer des bases LNA™ dans les séquences lors de l’amplification pour que les duplex formés avec les amorces de séquençage et de lecture des index lors du séquençage soient stables. Or, l’ajout de ces bases LNA™ est couteux et constituent des étapes supplémentaires dans la méthode.

De manière très intéressante, les inventeurs ont démontré que des séquences d’une dizaine de nucléotides, appelées « séquences stabilisatrices » permettent de conserver un degré d’hybridation suffisant pour que le séquençage NGS se déroule correctement même lorsque la température de demi-hybridation (Tm) est élevée. Ainsi, ils ont montré que l’effet stabilisateur des bases LNA™ peut être remplacé par l’ajout d’une séquence stabilisatrice et que cette séquence est suffisante pour le résultat du séquençage soit aussi fiable que lorsque des bases LNA™ sont utilisées. Le fait de s’affranchir de l’utilisation de bases LNA™ rend la méthode plus simple et moins coûteuse. Ainsi, la présente invention propose pour la première fois de combiner une PCR indexée avec un séquençage NGS dans une méthode simple à mettre en œuvre, et dont le cout est maitrisé. Un kit prêt à l’emploi permet une mise en œuvre simplifiée de la méthode proposée.

L’étape b. de la méthode selon l’invention est réalisée à l’aide des amorces de séquençage et de lecture d’index, dont aucune ne contient de bases LNA™ mais dont chacune contient une séquence stabilisatrice, à savoir :

un couple d’amorces de séquençage s’hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’extrémité 5’ ; ces amorces permettent d’amplifier les séquences d’intérêt pour le séquençage ;
une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice; cette amorce permet l’amplification de l’index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.

Il est à noter que les séquences stabilisatrices des amorces de séquençage et de l’amorce de lecture d’index sont complémentaires des séquences stabilisatrices présentes sur les séquences amplifiées en vue du séquençage. En d’autres termes, ces séquences stabilisatrices ont les mêmes séquences que celles présentes dans les amorces spécifiques.

Dans un mode de réalisation particulier où l’index est positionné en 3’ de la séquence à analyser, l’amorce de lecture d’index est complémentaire de la séquence universelle antisens et la séquence stabilisatrice est positionnée à son extrémité 3’. En d’autres termes, l’amorce antisens est utilisée en tant qu’amorce sens en amont de l’index.

Des exemples de séquences d’amorces de séquençage utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID No.10 et SEQ ID No.11. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier peut proposer d’autres d’amorces de séquençage en fonction des séquences universelles encadrant les séquences à amplifier.

Un second objet de l’invention concerne un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant :

une première série de contenants (de type tube PCR) comprenant chacun au moins un couple d’amorces spécifiques d’un locus d’intérêt à amplifier, ces amorces comprenant en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C, la dite séquence stabilisatrice étant précédée d’une séquence universelle ;

une deuxième série de contenants (de type tube PCR) comprenant chacun :
- un couple d’amorces particulier permettant d’indexer chaque séquence amplifiée de manière patient-spécifique (amorces d’indexation), ces amorces comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider avec lesdites séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ; et
- un mix d’amplification
une troisième série de contenants (de type tube) comprenant un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™ comprenant un couple d’amorces pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l’index, chacune de ces amorces comprenant une séquence s’hybridant avec une séquence stabilisatrice.

Les tubes des première et deuxième séries sont utilisés pour la PCR indexée, leur nombre est donc identique. Au contraire, le mélange de la troisième série sert pour le séquençage et est le même pour toutes les réactions ; il peut être fourni dans un tube unique ou dans différents tubes, notamment autant de tubes que pour chacune des première et deuxième séries.

On peut associer plusieurs couples d‘amorces spécifiques dans les tubes de la première série, de sorte à amplifier plusieurs mutations simultanément (multiplexage). On amplifiera ainsi 1, 2, 3, 4 et jusqu’à 5 mutations différentes à partir d’un même échantillon.

Dans un autre mode de réalisation préféré, ce kit comprend en outre au moins un des éléments suivants :

des mélanges réactionnels pour le séquençage NGS sans base LNA™, préférentiellement présentés en tubes,
une notice d’utilisation.

Par « mix d’amplification », on entend un mélange comprenant de la Taq polymérase, une solution tamponnée contenant du MgCl₂, des dNTPs (mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy-adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy-cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy-guanine tri-phosphate), dTTP (désoxy-thymine tri-phosphate), une solution de DMSO et un tampon qui réduit l’adhésion des molécules sur le plastique.

Dans un mode de réalisation particulier, le mélange réactionnel pour le séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprend des amorces qui sont configurées comme suit :

une amorce de séquençage sens s’hybridant à la séquence universelle située en 5’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;
une amorce de séquençage antisens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;
une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’une de ses extrémités.

Dans un mode de réalisation encore plus particulier, l’amorce de lecture d’index est une amorce sens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à son extrémité 3’.

Dans ce mélange, les deux amorces de séquençage aptes à s’hybrider aux séquences universelles situées de part et d’autre de la séquence à analyser permettent l’amplification de cette dernière tandis que l’amorce sens s’hybridant en aval de la séquence à analyser permet l’amplification de l’index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.

Dans un mode de réalisation tout à fait particulier, le mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprend :

une amorce de séquençage sens de séquence SEQ ID No.10;
une amorce de séquençage antisens de séquence SEQ ID No.11; et
une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID No. 12.

La méthode selon l’invention, ainsi que le kit associé, sont particulièrement adaptés au génotypage d’un grand nombre de patients, en particulier de 2 à 384 patients, en une seule réaction. Toutefois les amplicons ne doivent pas être trop longs (de préférence < 500pb) et le multiplexage doit être modéré (entre 1 et 5, de préférence de 2 à 3 cibles par réaction PCR). Elle permet aux laboratoires de répondre à des questions récurrentes de génotypage en traitant simultanément un grand nombre de patients.

Les différents modes de réalisation préférés décrits précédemment peuvent être combinés entre eux, deux par deux ou de manière plus étendue, jusqu’à constituer un mode de réalisation préféré combinant tous les modes préférés.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

: Représentation schématique des amorces utilisées selon un mode de réalisation particulier de la présente invention. (A) amorces spécifiques, (B) séquences universelles et stabilisatrices, (C) Adaptateurs P5-P7 et Index, (D) amorce de séquençage Sens, (E) amorce de séquençage Anti sens, (E) amorce de lecture d’index.

: Représentation d’une séquence amplifiée en tant que descriptif d’un mode de réalisation particulier.

EXEMPLE

EXEMPLE 1 : Principe de la méthode de génotypage NGS sans base LNA ™

1. Amplification des séquences d’intérêt par PCR indexée

A partir de variants alléliques ou de mutations connus dans un système biologique défini, des séquences d’intérêt sont identifiées en vue du génotypage.

Des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques ou mutants à amplifier sont conçus et validés. Ces amorces permettront l’amplification des séquences d’intérêt.

Les échantillons biologiques à analyser sont préparés en vue de la PCR, l’ADN est extrait et purifié. Cette étape de préparation est bien connue de l’homme du métier et aboutit à des échantillons présentant des concentrations en ADN normalisées.

La réaction d’amplification proprement dite est réalisée par PCR indexée, selon un protocole classique. A cet effet, les amorces spécifiques ainsi que les amorces destinées à l’indexation et le mix d’amplification sont mélangés dans des tubes adaptés à l’équipement PCR utilisé. La réaction d’amplification se déroule en conditions standard.

Une fois amplifiées, les séquences sont récupérées, purifiées et quantifiées pour être séquencées.

2. Séquençage NGS

Le séquençage est réalisé dans un séquenceur NGS de la société Illumina.

Le séquençage est réalisé à l’aide du couple d’amorces de séquençage pour amplifier les séquences à analyser et de l’amorce de lecture d’index pour identifier le patient auquel se rapporte la séquence.

Tableau 1: Récapitulatif des séquences décrites

Descriptif de le séquence	SEQ ID N ^o .	Séquence 5’-3’
Séquence stabilisatrice 1	1	GCAGACTCAG
Séquence stabilisatrice 2	2	TGTTGACTCC
Séquence universelle 1	3	ACACTCACGACATGGTTCTACA
Séquence universelle 2	4	TACCGTAGCAGAGACTTGGTCT
Index 1	5	CGCGACTTGT
Index 2	6	GGTTGGAGTT
Index 3	7	GAGCACGGAA
Adaptateur de séquençage P5 (Illumina®)	8	AATGATACGGCGACCACCGAGATCT
Adaptateur de séquençage P7 (Illumina®)	9	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Amorce de séquençage sens	10	ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAG
Amorce de séquençage antisens	11	TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCC
Amorce de lecture d’index	12	GGAGTCAACAAGACCAAGTCTCTGCTACGGTA

Claims

Méthode de génotypage adaptée au traitement d’un grand nombre de patients simultanément comprenant :
une étape d’amplification de l’ADN provenant de chaque patient par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée,

dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant entre 8 et 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ;

une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
Méthode selon la revendication 1 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice comprend 10 nucléotides dont 5 à 6 nucléotides sont des G ou C.
Méthode selon la revendication 2 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice est choisie parmi les séquences SEQ ID NO. 1 et SEQ ID NO.2
Méthode selon l’une des revendications 1 à 3 dans laquelle lesdites amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice.
Méthode selon la revendication 4 dans laquelle ladite étape d’amplification d’ADN met en outre en œuvre des couples d’amorces destinés à l’indexation et au séquençage des séquences amplifiées comprenant :
au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et

au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage,
l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle l’étape de séquençage est réalisée à l’aide des amorces suivantes :
un couple d’amorces de séquençage s’hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’extrémité 5’ ;

une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice.
Kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant :
une première série de contenants comprenant chacun au moins un couple d’amorces spécifiques du locus d’intérêt à amplifier, ces amorces comprenant en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C, ladite séquence stabilisatrice étant précédée d’une séquence universelle ;

une deuxième série de contenants comprenant chacun un couple d’amorces particulier permettant d’indexer chaque séquence amplifiée de manière patient-spécifique, ces amorces comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider avec lesdites séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ; et un mix d’amplification ;

une troisième série de contenants comprenant un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™ comprenant un couple d’amorces pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l’index, chacune de ces amorces comprenant une séquence s’hybridant avec une séquence stabilisatrice.
Kit selon la revendication 7 dans lequel les amorces comprises dans ledit mélange réactionnel sont configurées comme suit :
une amorce de séquençage sens s’hybridant à la séquence universelle située en 5’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;

une amorce de séquençage antisens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ;

une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’une de ses extrémités.
Kit selon l’une des revendications 7 ou 8 comprenant :
une amorce de séquençage sens de séquence SEQ ID No.10;

une amorce de séquençage antisens de séquence SEQ ID No.11 ; et

une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID No. 12.
Utilisation d’un kit tel qu’il a été défini aux revendications 7 à 9 pour le suivi du chimérisme post-greffe.