FR2970782A1 - Dispositif de diagnostic multifonctionnel - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à un dispositif de diagnostic comprenant : > des anticorps spécifiques de l'hémoglobine, préférentiellement de la globine; > optionnellement, une solution de lyse; > une solution d'extraction d'ADN génomique et/ou bactérien; et > des billes de verre.

Description

Dispositif de diagnostic multifonctionnel

La présente invention concerne un dispositif de diagnostic multifonctionnel, particulièrement pertinent pour le diagnostic des maladies digestives ainsi que pour le dépistage du cancer colorectal chez un sujet. Les tests de recherche de saignement occulte dans les selles constituent actuellement la procédure la plus utilisée pour un dépistage du cancer colorectal organisé dans des grandes populations asymptomatiques. Parmi eux, les tests basés sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux reconnaissant la partie globine de l'hémoglobine apparaissent plus performants que les tests traditionnels utilisant la résine de gaïac. Néanmoins, ce type de test de dépistage souffre d'un certain nombre d'inconvénients. L'inconvénient majeur de ce type de test est sa faible sensibilité, laissant un nombre inacceptable de faux négatifs parmi les sujets soumis audit test qui tout en étant porteurs d'une tumeur ne seront pas détectés en raison de l'absence d'un saignement continu des tumeurs colorectales. La spécificité de ce test reste également médiocre. En effet, l'apparition de sang dans les selles peut être liée à une affection non tumorale: hémorragies gastrique, iléale, ou recto-coliques d'origine non tumorale, lésions anales hémorroïdaires ou fissuraires. Aussi, dans les conditions actuelles du dépistage, près de 50% des coloscopies réalisées chez les individus ayant un test de recherche de sang occulte positive, sont normales. D'autre part, près de 50% des sujets porteurs d'une tumeur colique, bénigne ou maligne, ne sont pas identifiés comme tels par cette stratégie de dépistage.

De façon surprenante, les inventeurs ont réussi à mettre en oeuvre un test moléculaire permettant d'identifier plusieurs marqueurs d'intérêt dont l'hyperméthylation est spécifique des cancers colorectaux. Ce test moléculaire, combiné au test immunologique de détection de sang occulte offre des perspectives avantageuses au dépistage des cancers colorectaux. Cependant, la mise en oeuvre de ces deux tests simultanément ou séquentiellement peut s'avérer longue, fastidieuse et coûteuse. En outre, les kits de diagnostic actuellement sur le marché ne sont pas adaptés à la mise en oeuvre simultanée ou séquentielle d'un test immunologique et du test moléculaire développé par les inventeurs. En effet, le matériel génétique présent dans les tissus ou les cellules à analyser sont sujets à des contaminations, notamment bactériennes, si ces dernières sont maintenues dans les milieux classiquement utilisés dans les kits de diagnostic immunologique permettant la détection de sang occulte. Il existe donc un besoin pour un test simple et efficace permettant d'écarter les faux négatifs et les faux positifs, se basant sur la mise en oeuvre de plusieurs techniques de dépistage de différente nature, à partir d'un seul et même échantillon du sujet à tester. La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin. En effet, de manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont réussi à adapter lesdits milieux actuellement utilisés dans les kits de diagnostic immunologique pour mettre au point un seul et unique dispositif de diagnostic, permettant la combinaison simultanée ou séquentielle de deux méthodes pour le diagnostic du cancer colorectal chez un sujet.

Les inventeurs ont développé un dispositif de diagnostic particulièrement adapté à la mise en oeuvre de plusieurs tests de diagnostic, se basant sur des approches différentes. Il permet la mise en oeuvre simultanée de plusieurs tests de diagnostic sur un seul et même échantillon biologique obtenu à partir d'un sujet.

Préférentiellement, cet échantillon biologique est constitué par les selles dudit sujet en quête d'un diagnostic. Ainsi, l'invention concerne un dispositif de diagnostic comprenant : - des anticorps spécifiques de l'hémoglobine, préférentiellement de la globine; - optionnellement, une solution de lyse; - une solution d'extraction d'ADN génomique ou bactérien; et - des billes de verre. Un tel dispositif permet, dans un premier temps, la mise en oeuvre d'un test immunologique par la détection et la mesure de sang occulte dans les selles d'un sujet. Une telle présence est corrélée avec la présence ou le risque d'apparition de pathologies cancéreuses chez ledit sujet. Le dispositif de l'invention permet, dans un second temps, la mise en oeuvre d'un test moléculaire. Ce test peut prendre plusieurs formes: i) il permet de détecter et de quantifier d'éventuelles modifications de l'ADN des cellules dudit sujet. Plus spécifiquement, le dispositif selon l'invention permet de détecter la présence d'une mutation d'un gène marqueur du cancer colorectal, préférentiellement un gène choisi parmi le gène Kras et le gène APC, ou de déterminer une instabilité génétique au niveau des séquences répétées microsatellites de l'ADN choisies parmi Bat25 et Bat26;et/ou ii) il permet également d'évaluer le degré de méthylation de plusieurs gènes que les inventeurs ont identifié comme marqueurs de cancer colorectaux. Ces marqueurs sont notamment les gènes Wifl, NPY, PENK; et/ou iii) il permet en outre d'identifier et quantifier un profil bactérien fécal particulièrement caractéristique de l'existence d'un cancer colorectal.

Le dispositif selon l'invention pour la mise en oeuvre d'un test immunologique La détection et la mesure de sang occulte dans les selles est réalisée avec le dispositif selon l'invention par le biais d'un test dit immunologique. Ce test permet de détecter la présence et mesurer la concentration de sang occulte dans les selles d'un sujet à l'aide d'anticorps spécifiques de l'hémoglobine, préférentiellement de la globine de l'hémoglobine. De tels anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Les connaissances générales de l'homme du métier lui permettent d'obtenir de tels anticorps spécifiques de l'hémoglobine. Par "sujet", on entend un individu sain ou un individu susceptible d'être atteint d'un cancer ou en quête de dépistage, de diagnostic ou de suivi, et plus généralement tout individu présentant un symptôme subjectif ou physique conduisant des acteurs de santé à recourir à des tests de diagnostic. Le terme sujet désigne également des animaux sains ou pour lesquels un diagnostic ou dépistage s'avère nécessaire.

Par "diagnostic", on entend la détection d'une prédisposition à développer une pathologie, mais aussi la détection d'une pathologie déjà installée chez un sujet. Par "diagnostic immunologique" ou "test immunologique", on entend un test de diagnostic basé sur la recherche de sang occulte dans les selles d'un sujet à l'aide d'anticorps spécifique de l'hémoglobine. Par "saignement colique", ou "sang occulte" ou "saignement occulte", on désigne la présence de sang dans les selles d'un sujet. Typiquement, les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal contre l'antigène d'intérêt, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps. Dans le cadre de cette invention, par "antigène d'intérêt", on entend l'hémoglobine ou préférentiellement la globine.

Cette hémoglobine ou globine peut être humaine ou animale en fonction de la nature du sujet à tester. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes (Kôhler et Milstein, 1975). Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps 20 recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. Des exemples d'anticorps spécifiques de la globine de l'hémoglobine sont connus et sont largement disponibles dans le commerce. De tels anticorps sont par exemple commercialisés par les sociétés EIKEN et INTEX Diagnostika. La société EIKEN commercialise d'ailleurs un dispositif permettant la détection de sang occulte dans les selles d'un sujet à l'aide d'anticorps spécifiques de l'hémoglobine. Préférentiellement, l'anticorps spécifique de l'hémoglobine est marqué. Par "marquage", on entend la fixation d'un réactif capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces réactifs consiste en: - les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la (3-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, - les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, les molécules radioactives comme le 32 P, le 35 S ou le 125 I, et - les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines. Dans le cadre de la présente invention, les anticorps spécifiques de l'hémoglobine, et plus préférentiellement de la globine peuvent être immobilisés sur un support solide adapté au sein du dispositif de diagnostic selon l'invention ou bien placé en suspension dans un milieu adapté. Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif selon l'invention comprend un support solide sur laquelle sont fixés les anticorps spécifiques de l'hémoglobine. Les anticorps sont donc immobilisés sur un support solide au sein du dispositif de diagnostic selon l'invention. Ledit support solide peut être en verre, ou plastique, notamment en polystyrène ou en nitrocellulose. Dans ce mode de réalisation particulier, les anticorps s'adsorbent spontanément et irréversiblement sur la membrane. Ils peuvent donc être attachés à la paroi du dispositif, ou bien sur des particules mobiles au sein dudit dispositif. Tout matériel non lié à l'anticorps peut être enlevé selon des techniques largement utilisées comme la centrifugation, la décantation du surnageant, ou l'élution. De manière préférée, le dispositif selon l'invention comporte une quantité d'anticorps suffisamment élevée pour permettre une détection efficace de l'hémoglobine éventuellement présente dans les selles des sujets à tester. L'homme du métier est en mesure d'adapter cette quantité d'anticorps en fonction de la quantité de selles utilisées pour la mise en oeuvre du test immunologique.

Le dispositif selon l'invention pour la mise en oeuvre d'un test moléculaire Le dispositif de diagnostic selon l'invention permet, dans un second temps, la mise en oeuvre d'un test dit moléculaire. Ce test permet une extraction d'ADN total pour permettre la détection et la quantification d'éventuelles modifications de l'ADN des cellules dudit sujet et la caractérisation de l'ADN bactérien dudit sujet. Les tests immunologiques et moléculaires peuvent être mis en oeuvre de manière simultanée ou séquentielle. Préférentiellement, l'extraction d'ADN génomique se fait entre 24h et 72h, préférentiellement 48h après la mise en contact des selles du sujet à tester avec le dispositif de diagnostic selon l'invention. Par "diagnostic moléculaire" ou "test moléculaire", on entend un test basé sur l'analyse de l'ADN génomique du sujet ou de l'ADN bactérien issu des bactéries fécales présentes dans les selles dudit sujet à tester. De manière particulière, cette expression s'applique aux tests de diagnostic se basant sur l'analyse directe des séquences de tout ou une partie de l'ADN d'intérêt et/ou après amplification d'une partie d'ADN d'intérêt et l'analyse de degrés de méthylation de gènes marqueurs du cancer colorectal, identifiés par les inventeurs. D'une manière générale, cette expression s'applique à tout test de diagnostic se basant sur l'analyse de marqueurs d'ADN humain ou bactérien spécifiques des maladies digestives. Cette expression englobe donc l'identification et la quantification d'une population bactérienne dans le cancer du colon (Sobhani et al, P1oS One, 2011 in press), la maladie de Crohn (Sokol et al, Gut. 2007 Jan;56(1):152-4 ; Seksik et al, J Clin Microbiol. 2005 Sep;43(9):4654-8. ; Sokol H, et al; Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Oct 28;105(43):16731-6), dans les maladies du foie et des voies biliaires (Abu-Shanab A, Quigley EM.Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2010 Dec;7(12):691-701) ou encore dans les maladies extra digestives telles que l'obésité ou le diabète (Furet etal ; Diabetes. 2010 Dec;59(12):3049-57). Par "ADN total", on entend sans distinction l'ADN génomique et bactérien. Par "ADN génomique", on entend l'ADN issu des cellules d'un sujet, généralement de cellules épithéliales de ce sujet. Cette expression s'applique notamment à l'ADN des cellules intestinales exfoliées qui se retrouvent dans les selles du sujet à tester. Cet ADN est extrait et purifié puis amplifié par PCR. Les produits d'amplification sont ensuite analysés à la recherche de mutations spécifiques de pathologies cancéreuses. Par "ADN bactérien" ou "ADN plasmidique" on entend l'ADN issu des bactéries présentes dans l'échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. Cette expression s'applique notamment à l'ADN des bactéries provenant de la flore intestinal du sujet à tester. Par "extraction d'ADN", on entend toute technique permettant d'isoler l'ADN génomique ou bactérien à partir d'un échantillon biologique, préférentiellement à partir de selles d'un sujet à tester. Dans le cadre de cette invention, on entend une technique permettant d'isoler l'ADN obtenu à partir des selles du sujet. L'ADN ainsi extrait peut être de l'ADN génomique ou de l'ADN bactérien. L'ADN peut ensuite être utilisé à des fins de diagnostic moléculaire, notamment pour le diagnostic de pathologies cancéreuses, telles que les cancers colorectaux. Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe : - lyse des cellules, généralement à l'aide d'une solution de lyse, classiquement utilisée dans l'art antérieur et largement décrite, comme par exemple dans le cadre de la méthode dite d'extraction au phénol-chloroforme; - élimination des protéines qui peuvent représenter un contaminant important pour l'étude de l'ADN génomique ou bactérien; - élimination des autres acides nucléiques, notamment des ARNs; - concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool absolu 100%, notamment a l'aide de plusieurs lavages à l'éthanol 70%.

L'homme du métier pourra se référer aux kits commerciaux, comme par exemple le kit QIAamp DNA Stool (Qiagen) et permettant une extraction facile, efficace et reproductible de l'ADN génomique. Les solutions de lyse et d'extraction d'ADN permettent la mise en oeuvre d'une extraction d'ADN d'un échantillon biologique, préférentiellement les selles du sujet à tester, selon les techniques classiquement décrites dans l'art antérieur. Cette extraction peut se faire par une première étape de lyse cellulaire. La lyse peut se faire de différentes manières: dislocation par voie mécanique, choc hypotonique, lyse chimique, ou encore digestion par protéinase K. Préférentiellement, cette lyse est une étape de lyse chimique.

Dans un mode de réalisation particulier, la solution de lyse présente dans le dispositif de diagnostic selon l'invention est un mélange de détergent et de protéinaseK. Un tel mélange permet de dissocier les cellules, les tissus, les enveloppes des virus et de libérer les acides nucléiques. De manière non limitative, les détergents actuellement les plus usités sont le dodécyl sulfate de sodium (SDS), le sarcosyl, le Tween® 20, le Nonidet. La présence de la solution de lyse au sein du dispositif selon l'invention est optionnelle et conditionne le procédé exploitant ledit dispositif. Aussi, si le dispositif ne comprend pas de solution de lyse, il conviendra de faire subir une étape de lyse cellulaire à l'échantillon biologique testé, avant de le mettre en contact avec ledit dispositif. Après cette lyse cellulaire, il convient de procéder à l'extraction d'ADN génomique à proprement parler. Dans un mode de réalisation particulier, cette étape d'extraction se fait à l'aide d'un agent chaotropique, de manière préférée le thiocyanate de guanidium (GTC). Le GTC a pour fonction de disloquer les membranes des tissus de cellules et de dénaturer les protéines. En outre la suppression de ponts disulfures protéique, évitant toute renaturation protéique peut se faire par l'ajout de beta mercaptoéthanol dans le milieu. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, la solution d'extraction d'ADN 20 présent dans le dispositif de diagnostic selon l'invention est un mélange de thiocyanate de guanidium et de beta-2-mercaptoéthanol. La présente invention prévoit également la possibilité d'effectuer cette étape d'extraction selon la technique dite du phénol-chloroforme. Le phénol est en effet un puissant déprotéinisant. Son addition dans le milieu contenant le lysat cellulaire a pour conséquence de dénaturer les protéines. Après centrifugation, elles se situent à l'interface entre la phase aqueuse (qui contient les acides nucléiques) et la phase organique. Après transfert de la phase aqueuse dans un autre tube, les acides nucléiques sont traités par un mélange chloroforme-alcool isoamylique. Cette étape permet d'éliminer les traces de phénol. Cette étape est essentielle puisque le phénol est connu pour être toxique mais est également un inhibiteur de la Taq polymérase. Après mélange, et centrifugation et élimination de la phase organique, les acides nucléiques sont à l'état soluble dans la phase aqueuse. Ainsi, la solution d'extraction d'ADN comprend préférentiellement du thiocyanate de guanidium et du béta-2-mercaptoéthanol. L'homme du métier est susceptible d'adapter la composition et les concentrations en thiocyanate de guanidium et de béta-2-mercaptoéthanol. L'homme du métier pourra se référer au manuel "Principes de biologie moléculaire en biologie clinique" par Amezian, Bogard et Lamoril, Campus Reference, Elsevier.

Typiquement, la solution d'extraction d'ADN comprend du thiocyanate de guanidium 4M et du béta-2-mercaptoéthanol à 0,5%. Le dispositif de diagnostic selon l'invention comprend des billes, préférentiellement des billes de verre. Typiquement, il s'agit de billes de verre calibrées à 0,5 mm. Ces billes permettent d'améliorer, de manière mécanique, les performances de l'action chimique de la solution de lyse. Elles participent donc à la lyse des cellules présentes dans les selles du sujet à tester. Préférentiellement, le volume total des billes n'excède pas 1/3 du volume total du dispositif selon l'invention.

L'invention se rapporte en outre à une méthode de dépistage du cancer colorectal comprenant : A) la détermination de sang occulte dans les selles dudit sujet à l'aide du dispositif de diagnostic selon l'invention; B) l'extraction d'ADN génomique ou bactérien à partir des selles dudit sujet à l'aide du dispositif de diagnostic selon l'invention. La détermination de sang occulte à l'étape A) de la méthode selon l'invention se fait à l'aide du test immunologique mis en oeuvre grâce aux anticorps spécifiques de l'hémoglobine présents dans le dispositif de l'invention.

Typiquement les selles du sujet à tester peuvent être mises au contact du dispositif directement après le prélèvement ou bien après une première étape de lyse cellulaire. Ce test immunologique révèle la présence de sang avec une grande précision. L'échantillon biologique est mis en contact desdits anticorps spécifiques de l'hémoglobine. La visualisation des réactions immunologiques peut être effectuée par tout moyen de détection, tels que des moyens directs ou indirects. La détection directe peut se faire sans l'intermédiaire d'un marquage, on observe les réactions immunologiques par exemple par résonance plasmonique de surface ou par voltamétrie cyclique sur une électrode portant un polymère conducteur. De manière préférée, la détection directe se fait par l'intermédiaire d'un marquage dudit anticorps. Les systèmes indirects de détection peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/antiligand sont bien connus de l'homme du métier, comme par exemple le couple biotine/streptavidine. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte le partenaire de liaison. L'anti-ligand peut être détectable directement par les réactifs marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand. Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier. Typiquement, après conjugaison de l'hémoglobine, préférentiellement la globine, et de son anticorps spécifique, on procède à une purification, généralement mise en oeuvre par chromatographie, par exemple d'exclusion, par affinité ou par dialyse. On peut ensuite évaluer la concentration en hémoglobine des selles analysées selon les techniques classiques de l'art antérieur. La présence de sang occulte dans les selles est corrélée avec un risque de présence d'une pathologie cancéreuse, telle qu'un cancer de l'intestin, du colon ou du rectum.

L'extraction d'ADN génomique ou bactérien à partir des selles dudit sujet à l'étape B) de la méthode se fait selon les modalités développées précédemment.

Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de dépistage du cancer colorectal chez un sujet selon l'invention comprend en outre: C) la détermination de la présence d'une mutation d'un gène marqueur du cancer colorectal; et/ou D) la détermination d'une instabilité génétique au niveau des séquences répétées microsatellites de l'ADN choisies parmi Bat25 et Bat26; et /ou E) la mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi NPY, PENK, Wifl et leurs fragments ou variants dans les selles dudit sujet à l'aide du dispositif selon l'invention; et/ou. F) l'identification et la quantification d'un profil bactérien fécal caractéristique 5 de l'existence d'un cancer colorectal.

La méthode de l'invention prévoit une étape C) de détermination de la présence d'une mutation d'un gène marqueur du cancer colorectal. Préférentiellement, cette étape C) est une étape de détermination de la présence d'une mutation d'un gène 10 choisi parmi le gène Kras et le gène APC. A l'aide de ses connaissances générales, l'homme du métier peut aisément déterminer la présence ou l'absence de mutations dans ces gènes dans l'échantillon biologique étudié à l'aide du dispositif selon l'invention. Une telle détermination de la présence ou l'absence de mutations dans ces gènes permet aux professionnels de la santé de déterminer dans quelle mesure un 15 patient pourrait réagir à un traitement donné. Par "mutation", on entend tout phénomène de modification du matériel génétique. Ce terme englobe les insertions, les substitutions et les délétions. Par "gène Kras", on entend le gène codant pour la protéine Kras. De récentes études on montré que la présence d'une mutation du gène Kras est associée à une 20 absence de bénéfice clinique aux traitements anti-EGFR. Ainsi, en déterminant la présence ou l'absence de mutation du gène Kras chez un sujet, les acteurs de santé peuvent adapter la thérapie adéquate pour ledit sujet. En effet, seuls les patients ayant une tumeur avec un gène Kras de type non-muté peuvent bénéficier d'un traitement anti-EGFR.

Par "gène APC", on entend le gène codant pour la protéine "Adenomatous polyposis coli". Ce gène a été décrit comme possédant une activité suppressive de tumeurs. Aussi, il est actuellement reconnu qu'une mutation du gène APC chez un sujet donné, notamment une mutation conduisant à l'inactivation de ce gène, est associée à l'existence d'un cancer colorectal chez ledit sujet.

La méthode de l'invention prévoit une étape D) de détermination d'une instabilité génétique au niveau des séquences répétées microsatellites de l'ADN choisies parmi Bat25 et Bat26. La fréquence des altérations génétiques des séquences répétées microsatellites de l'ADN peut être aisément déterminée par l'homme du métier. Par "Bat25" ou "Bat26", on désigne deux microsatellites quasi-homozygtes, quasi-monomorphes et mononucléotidiques. Bat25 correspond à une répétition de thymines (queue poly(T)) et Bat26 correspond à une répétition d'adénines (queue poly(A)). Par "microsatellites", on entend de courtes séquences d'ADN formées de la répétition d'un motif lui-même constitué d'une à quatre bases. Par "instabilité génétique au niveau des séquences répétées microsatellites de l'ADN", se caractérise par la variation anormale du nombre de séquences répétées dans l'ADN tumoral comparé à l'ADN du même sujet provenant de tissu sain.

La méthode de l'invention prévoit une étape E) de détection d'hyperméthylation de gènes marqueurs précédemment identifiés par les inventeurs et d'une manière générale de tout autre marqueur d'ADN humain ou bactérien spécifique des maladies digestives. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, la méthode de dépistage du cancer colorectal selon l'invention comprend en outre la mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi Wifl, NPY, PENK et leurs fragments ou variants dans les selles dudit sujet à l'aide du dispositif selon les revendications. L'analyse de la méthylation de l'ADN peut être effectuée en utilisant des techniques basées sur la PCR qualitative et/ou quantitative comme la MSP (méthylation spécifique PCR), le séquençage bisulfite, la digestion par une enzyme de restriction sensible aux méthylations couplée avec la PCR. Par "méthylation" on entend l'addition d'un groupement méthyl au niveau du carbone 5' d'une cytosine dans un dinucléotide CpG. Ces dinucléotides sont peu fréquents dans la structure de l'ADN, sauf dans les "îlots" CpGs. Ces îlots sont typiquement représentés au niveau de la région promotrice des gènes. Ainsi, lorsqu'on parle de méthylation d'un gène, on fait référence à la méthylation de la région promotrice dudit gène. La présence d'un groupement méthyle en un site précis empêche l'interaction entre le gène et les facteurs de transcription. Typiquement, les groupes méthyles empêchent les facteurs de transcription de se fixer sur le site d'amplification et au promoteur, et à l'ARN polymérase de se fixer sur le site d'initiation. Aussi, la méthylation de la région promotrice a pour conséquence la répression de la transcription de l'ADN. L'expression "méthylation d'un gène" englobe la méthylation des îlots CpG de la séquence nucléotidique du gène mais également la méthylation des séquences nucléotidiques du promoteur du gène auquel cette expression s'applique. Par "PCR Multiplex", on entend une forme de PCR, généralement une PCR quantitative permettant l'amplification simultanée de plusieurs cibles d'intérêt en une seule étape, en utilisant une ou plusieurs amorces spécifiques. Cette technique est très avantageuse pour déterminer la présence de délétions, mutations, polymorphismes ou hyperméthylation de plusieurs marqueurs. Par opposition, l'expression "PCR Monoplex" fait référence à une forme de 5 PCR, généralement une PCR quantitative, permettant l'amplification d'une seule cible d'intérêt. Par "méthylation spécifique PCR", on entend une technique classique de l'art antérieur permettant de mesurer le degré de méthylation d'un gène. Cette technique se base sur le principe de la PCR quantitative. Typiquement, cette 10 technique repose sur le traitement avec le bisulfite de sodium de l'échantillon d'ADN à étudier. Ce traitement permet de transformer chacune des cytosines non méthylées en uraciles dans l'ADN traité. L'échantillon ainsi traité subit ensuite une PCR avec des amorces spécifiques des gènes à traiter. La détermination de la nature des amorces spécifiques dépend de la séquence nucléotidique à amplifier. Dans le cadre 15 de cette invention, la méthylation spécifique PCR est préférentiellement mise en oeuvre en mode multiplex, on parle alors de Methylation Specific PCR en mode multiplex, soit MSPM. Par "gène Wifl", on entend le gène qui code pour la protéine WIF agissant comme inhibiteur de la voie Wnt. L'élément initiateur de la carcinogénèse colorectale 20 est l'inactivation du gène APC dont la protéine joue un rôle relatif au contrôle de la prolifération, de l'apoptose et de la migration des cellules épithéliales intestinales. Cette inactivation provoque l'activation de certaines voies de signalisation, telles que celle de la WNT/Béta-caténine et la formation d'adénomes précoces. Il est connu que Wifl est l'un des gènes impliqués dans l'inhibition de la voie de signalisation Wnt.

Aussi, l'hyperméthylation du gène Wifl s'accompagne de la levée d'inhibition de cette voie. Par "gène NPY", on entend le gène qui code pour le neuropeptide Y ou NPY.

Par "gène PENK", on entend le gène qui code pour la neuropeptide proenképhaline A ou PENK. Ces deux neuropeptides sont impliqués dans la prise alimentaire, l'absorption des nutriments et l'équilibre de la dépense énergétique de l'organisme. Ce sont des neuropeptides régulateurs des fonctions digestives qui peuvent également réguler la prise alimentaire et le comportement neuro-digestif. Par "fragment d'un gène", on entend une séquence dudit gène d'une longueur d'au moins 50 paires de bases, préférentiellement d'une longueur comprise entre 60 à 110 paires de bases. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides nucléiques ou au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par "variants présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins 98 %", on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, de façon plus préférée au moins 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Cette étape E) de la méthode selon l'invention peut également comprendre la mesure du degré de méthylation d'un gène de ménage. Préférentiellement, cette étape de mesure du degré de méthylation du gène de ménage s'effectue de manière simultanée à la mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi Wifl, NPY, PENK et leurs fragments ou variants et/ou de manière simultanée à la mesure du degré de méthylation du gène Wifl ou un de ses fragments ou variants. Par "gène de ménage", ou "gène ménager" ou "gène constitutif", ou encore "housekeeping gene", on entend un gène constitutionnel qui code principalement pour des protéines essentielles aux fonctions cellulaires de base. De manière préférée, l'expression des gènes de ménage selon l'invention est ubiquitaire et stable entre les différents tissus. Préférentiellement le gène de ménage est choisi parmi les gènes codant pour l'albumine, la beta actine, l'alpha actine, beta microglobuline, préférentiellement l'albumine. Ces gènes de ménage présentent un intérêt majeur dans le contexte de l'invention. En effet, le degré de méthylation des gènes NPY, PENK et Wifl ou leurs fragments ou variants est exprimé par rapport à la méthylation d'un gène de ménage dont l'expression est stable. Par "degré de méthylation" ou "taux de méthylation", on entend le pourcentage du nombre de sites CpG méthylées du gène cible par rapport à un standard. Par gène cible, on entend un gène pour lequel on veut mesurer le degré de méthylation. Dans le cadre de la présente invention, ces gènes cibles sont Wifl, NPY, PENK, l'albumine et leurs fragments ou variants. Par standard, on entend la séquence sauvage dudit gène cible ou bien la séquence d'un gène de ménage.

Le calcul du degré de méthylation se fait selon les techniques de quantification bien connues de l'homme du métier. Cette quantification peut être absolue ou relative. De manière préférée, son calcul se fait selon la technique dite du AACt bien connue de l'art antérieur. De manière préférée, la méthode de l'invention comprend en outre une étape de comparaison des degrés de méthylation d'une part des gènes Wifl et d'un gène de ménage, ou leurs fragments ou variants et d'autre part des gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants à une valeur seuil, ladite valeur seuil étant déterminée en fonction des besoins en termes de spécificité et de sensibilité.

Enfin, la méthode de l'invention prévoit une étape F) d'identification et la quantification d'un profil bactérien fécal caractéristique de l'existence d'un cancer colorectal. Préférentiellement, l'étape F) est une étape d'identification et de quantification d'un profil bactérien de bactéries appartenant aux genres Bacteroides ou Prevotella.

Il est aujourd'hui admis que la flore intestinale a une influence sur la santé et le bien être de l'individu. De récentes études ont mis en évidence l'ensemble des microorganismes constituant la flore intestinale, qui peut s'élever jusqu'à 500 types de microorganismes (Volker Mai et al, American Society for Nutritional Sciences, 2003; Qin et al., Nature, 2010; Lay et al., Applied and Environmental microbiology, 2005) composant 1014 bactéries/gr de selles. De récentes études mettent en lumière l'influence de cette flore intestinale dans le syndrome du colon irritable (Balfour Sartor, Gastroenterology, 2008), dans l'obésité (Bajzer et al., Nature, 2006), dans la maladie de Crohn (Seksik et al., Gut, 2003), et plus récemment dans le cancer.

En effet, les inventeurs ont mis en évidence une modification de la flore colique de sujets atteints de cancers colorectaux, notamment une élévation de la quantité de bactéries appartenant aux genres Bacteroides ou Prevotella. L'analyse de cet ADN bactérien, dans les conditions standards bien connues de l'homme du métier, permet donc la détermination de la composition de la flore intestinale du sujet à tester. Plus précisément, cette analyse permet à l'homme du métier de déterminer la quantité des bactéries cibles pertinentes pour le diagnostic du cancer colorectal dans les selles du sujet à tester. Cette quantité peut ensuite être comparée à une valeur seuil, obtenue chez un 10 sujet sain, c'est à dire ne souffrant pas de pathologies digestives, notamment de cancers colorectaux.

EXEMPLE Collecte de l'échantillon Les selles fraichement émises sont collectées dans un pot ou contenaire dédié. Le sujet doit mettre ses selles sur un support solide et à l'abri de toute 5 contamination par eau ou urines. Mise en contact avec le dispositif selon l'invention Le sujet doit tremper le piston du dispositif dans les selles ainsi recueillies et remettre le piston dans son étui. La quantité approximative de selles prélevées est estimée à 10 à 20 mg de selles diluées dans 2 mL de solution de lyse et d'extraction.

10 Détermination de la présence de sang occulte Basé sur la réaction Ag-Ac, la présence de globine humaine est détectée et quantifiée in situ en cuve de lecture dédiée. La réaction immunologique Ag-AC est réalisée par la mise en contact de 50 µl de la solution d'anticorps à un volume de 50 µL de solution biologique. Les deux solutions sont prélevées et introduites dans la 15 cuve réactionnelle selon un mode manuel ou automatique. La lecture se fait de façon automatisée et directement au sein de ladite cuve de lecture selon le procédé d'opacité turbidimétrique: l'hémoglobine complexée à l'anticorps forme un agglomérat proportionnel à la concentration de globine. La lecture optique précisera le point correspondant sur une courbe d'étalon.

20 Extraction ADN génomique Protocole: Après 48h de contact du complexe [selles (10-20 mg)- tampon de lyse cellulaire-billes] une extraction de l'ADN génomique a été effectuée en utilisant les principaux éléments constituant le kit QIAamp DNA Stool (Qiagen). Le protocole détaillé est décrit ci-dessous : 1- les 2 ml du complexe [selles-tampon de lyse cellulaire-billes] sont récupérés en tube de 2 ml, puis vortexés en « Disruptor Beads » (Scientific Industries, Inc, USA) pendant 5 minutes et le tout centrifugé à 16,400 tr/min pendant 2 min 2- prélever 1400 µl de surnageant et procéder au transfert du volume dans un tube de 2 ml 3- ajouter une tablette InhibitEX (neutralise les inhibiteurs de PCR), vortexer pendant 1 min et laisser 1 min de contact à température ambiante 4- centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 16, 400 tr/min 5- prélever le surnageant et l'introduire dans un tube de 1,5 ml puis centrifuger 3 min à 16, 400 tr/min 6- introduire dans un tube de 2 ml, 600 µl de surnageant, 25 µl de protéinase K (100 mg/ml) et 600 µl de tampon AL. Vortexer le mélange pendant 15 secondes 7- incuber le mélange à 70°C pendant 10 min 8- ajouter 600 µl d'éthanol 100% au lysat et vortexer 9- filtrer les 1800 µl de lysat dans une colonne QIAamp et centrifuger 1 min à 16,400 tr/min 10- introduire 500 µl de tampon de lavage AW 1 à la colonne et centrifuger 1 min à 16,400 tr/min 11- introduire 500 µl de tampon de lavage AW2 à la colonne et centrifuger 3 min à 16,400 tr/min 12- installer la colonne sur un tube de 1,5 ml. Elution de l'ADN par 200 µl d'eau stérile 13- détermination de la concentration de l'ADN par mesure spectrophotométrique à 260 nm5

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1. Dispositif de diagnostic comprenant : - des anticorps spécifiques de l'hémoglobine, préférentiellement de la globine; 5 - optionnellement, une solution de lyse; - une solution d'extraction d'ADN génomique et/ou bactérien; et - des billes de verre.
2. 2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisée en ce que la solution d'extraction 10 d'ADN comprend du thiocyanate de guanidium et du béta-2-mercaptoéthanol.
3. 3. Dispositif de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les anticorps spécifique de l'hémoglobine, préférentiellement de la globine, sont des anticorps monoclonaux.
4. 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisée en ce que la volume de billes n'excède pas 1/3 du volume total dudit dispositif.
5. 5. Méthode de dépistage du cancer colorectal chez un sujet, comprenant : 20 A) la détermination de sang dans les selles dudit sujet à l'aide du dispositif de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 4; B) l'extraction d'ADN génomique ou bactérien à partir des selles dudit sujet à l'aide du dispositif de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 4. 15
6. 6. Méthode de dépistage du cancer colorectal chez un sujet selon la revendication 5, comprenant en outre: C) la détermination de la présence d'une mutation d'un gène marqueur du cancer colorectal; et/ou D) la détermination d'une instabilité génétique au niveau des séquences répétées microsatellites de l'ADN choisies parmi Bat25 et Bat26; et/ou E) la mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi Wifl, NPY, PENK, et leurs fragments ou variants dans les selles dudit sujet à l'aide du dispositif selon l'une des revendications 1 à 4; et/ou F) l'identification et la quantification d'un profil bactérien fécal caractéristique de l'existence d'un cancer colorectal.
7. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape C) est une étape de détermination de la présence d'une mutation d'un gène choisi parmi le gène Kras et 15 le gène APC.
8. 8. Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce que l'étape F) est une étape d'identification et de quantification d'un profil bactérien de bactéries appartenant aux genres Bacteroides ou Prevotella. 20