CN118147287A - 一种检测人类红细胞rhd基因分型的引物组、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明为一种检测人类红细胞RHD基因分型的引物组、试剂盒及其用途。现有RHD基因检测试剂会出现假阳性、假阴性、覆盖变异型不全等问题，这是由引物设计、孔位设计、内参选择、反应条件选择等多方面原因造成的。本发明基于荧光定量PCR反应原理，根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(Genbank)中公开的人类基因序列，针对RHD相关基因突变或缺失、插入等信息设计引物。本发明还包括RHD基因分型的检测试剂盒，其由上述引物组和浓缩反应液组成。该试剂盒按照特定的步骤进行检测，可以有效地提高RHD基因检测的特异性，降低假阳性率和假阴性率，操作更加简便。

Description

一种检测人类红细胞RHD基因分型的引物组、试剂盒及其用途

技术领域：

本发明涉及基因检测试剂盒领域，具体涉及一种检测人类红细胞RHD基因分型的引物组、试剂盒及其用途。

背景技术：

编码RhD血型抗原的RHD基因位于人类第一号染色体短臂区域，有10个外显子和9个内含子，长度57932bp，编码417个氨基酸。外显子全缺失、被RHCE基因替换以及碱基突变等导致抗原减弱或缺失。RhD抗原具有很强的免疫原性，是引起溶血性输血反应以及新生儿溶血症主要原因之一。现有的RHD基因检测试剂会出现假阳性、假阴性、覆盖变异型不全等问题，这是由引物设计、孔位设计、内参选择、反应条件选择等多方面原因造成的。

发明内容：

本发明基于聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)反应原理，利用包被在96孔PCR板中的多组等位基因特异性引物，通过RT-PCR仪器特异性扩增RHD等位基因。扩增反应液中所使用的不饱和荧光染料SYBR GreenⅠ荧光染料，只与双链DNA(dsDNA)结合后发光，未结合dsDNA的荧光染料不发光，发光强度与扩增后的dsDNA含量成正相关。荧光定量PCR仪在最大吸收波长约为497nm、最大发射波长约为520nm波长范围内收集荧光信号。当样本中的DNA被扩增后，RT-PCR仪器收集的荧光信号将形成扩增曲线及特征性熔解曲线。在每个反应孔中均与特异性引物一同包被的内标引物对，用以检验反应体系扩增有效性，并每人份单独包被一孔设定为阴性对照孔。熔解曲线以荧光信号改变的负一次导数与温度作图，Tm值为扩增产物解链50％的温度，在多产物的情况下只显示其中最高Tm值的特征性熔解曲线峰。内标引物对扩增产物的特征性熔解曲线Tm值均低于特异性扩增产物Tm值，特异性引物阴性时均被检出，揭示孔内反应有效；特异性引物阳性时，只显示特异性扩增产物Tm值。当除阴性对照孔无反应外，每个孔位都有一条符合质控要求的扩增曲线及特征性熔解曲线，则表示扩增有效，通过对特征性熔解曲线Tm值定性判断孔位阴阳性，依据结果分型表所示阳性孔位组合，定性判读基因分型结果，基因分型结果需符合人类基因遗传规则。

本发明的试剂盒用于对人类全血中提取纯化的DNA样本定性检测红细胞表面抗原RHD基因的第1/3/4/5/6/7/9/10外显子是否正常存在，以及845A、1227A等SNP位点是否突变，预测RhD血型，为RhD血型鉴定提供参考。检测结果等位基因名称遵循ISBT红细胞免疫遗传和血型命名委员会的RHD(v6.230-SEP-2022)基因命名原则。

本发明引物组的设计依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(Genbank)中公开的人类基因序列，针对RHD相关基因突变或缺失、插入等信息设计特异引物；内标引物设计依据NCBI数据库公开的基因序列信息，根据人类基因的保守区域设计。引物组的序列如SEQ ID No.1-22所示，其中

第一组引物对如序列SEQ ID No.1-2所示，检测RHD基因中第1外显子的信息；

第二组引物对如序列SEQ ID No.3-4所示，检测RHD基因中第3外显子的信息；

第三组引物对如序列SEQ ID No.5-6所示，检测RHD基因中第4外显子的信息；

第四组引物对如序列SEQ ID No.7-8所示，检测RHD基因中第5外显子的信息；

第五组引物对如序列SEQ ID No.9-10所示，检测RHD基因中第6外显子845G基因的信息；

第六组引物对如序列SEQ ID No.11-12所示，检测RHD基因中第6外显子W15基因的信息；

第七组引物对如序列SEQ ID No.13-14所示，检测RHD基因中第7外显子的信息；

第八组引物对如序列SEQ ID No.15-16所示，检测RHD基因中第9外显子1227G基因的信息；

第九组引物对如序列SEQ ID No.17-18所示，检测RHD基因中第9外显子1227A基因的信息；

第十组引物对如序列SEQ ID No.19-20所示，检测RHD基因中第10外显子的信息；

第十一组引物对如序列SEQ ID No.21-22所示，检测RHD基因合子的信息。

每一组引物对分别处于不同的反应容器内。内参引物对的序列如SEQ ID No.23-24所示，内参引物对既可以加入检测孔中，以检测RHD基因的信息，也可以作为阴性对照孔，对检测进行质量控制。

包括以上引物组的检测RHD基因分型的检测试剂盒还包括由PCR buffer、dNTP、Mg离子、DNA聚合酶、SYBR GreenⅠ荧光染料等组成的额浓缩反应液。该试剂盒的使用方法为如下顺序的步骤：

(1)从冷冻冰箱取出试剂盒中所需数量的试剂，室温解冻；

(2)观察PCR板包被的引物及浓缩反应液室温溶解后，其颜色为粉红或紫色方可使用，PCR板包被的引物均于板底存在，否则失效不能使用；

(3)在510μl浓缩反应液中加入650μl纯化水，制成反应液；

(4)每人份样本使用120μl反应液与12μl样本DNA混合，制成工作反应液；

(5)撕掉PCR板上透明封板膜放置在水平桌面，向检测孔中加入10μl工作反应液，向阴性对照孔中加入10μl反应液，加样后用板式离心机瞬时离心或手工轻轻震荡使混合液滑至管底部；

(6)使用推荐封膜机及铝膜热封反应板顶部，反应孔应完全被封闭。封膜机推荐条件：175℃，4.5s；或滴管加入25±10μL石蜡油蜡封，然后将封板膜重新覆上引物板。封膜处可做样本顺序标记；

(7)将密封后的工作引物板放入荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，在96℃进行2分钟的预变性，然后进行5个循环的96℃20秒和68℃60秒的反应，然后进行10个循环的96℃20秒、65℃50秒和72℃45秒的反应，然后进行15个循环的96℃20秒、62℃50秒和72℃45秒的反应，最后在72℃延伸2分钟；

(8)根据阳性判断值和结果分型表对实验结果进行质量控制和结果判读。

本发明的引物组和试剂盒，可以有效地提高RHD基因检测的特异性，降低假阳性率和假阴性率，操作更加简便。

附图说明

图1是实施例1的引物孔位图12孔/人份(96孔，8人份)

图2是实施例一的结果分型表

具体实施方式：

实施例1：一种包含上述引物组的检测人类红细胞RHD基因分型的试剂盒

一、试剂盒组分：RHD引物板(12孔/人份，8人份/板，包被靶基因特异性及人类内参干燥引物，板底部引物为紫色)、浓缩dNTP-Buffer II(510μL/支，由dNTP，Mg²⁺，Taq酶，SYBRGreenⅠ荧光染料等组成，颜色为紫色)。

二、本试剂盒不提供但实验所需的其他试剂及实验耗材

1、全血DNA提取试剂盒——推荐使用天津市秀鹏生物技术开发有限公司生产的‘核酸提取或纯化试剂(磁珠法)’(备案号：津械备20220278号)或苏州天隆生物科技有限公司(陕西械备20210031号)

2、纯化水——规格要求(去离子水)；

3、热封膜机——可加热至200℃平面热封机；

4、热封口铝膜；

三、储存条件及有效期

1、该试剂盒在10～30℃运输，最长运输时间为7天。

2、避免阳光直射，-18℃及以下环境保存，有效期为18个月。

3、试剂开瓶后应立即使用，反复冻融不能超过(包括)6次。

4、生产日期及有效期：见标签。

特别提示：PCR板包被的引物及浓缩dNTP-Buffer II溶液室温溶解后，其颜色为粉红或紫色，否则失效不能使用。

四、适用仪器

荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测系统及相应软件(杭州博日科技有限公司产品型号FQD-96A)；

五、样本要求

1、静脉取人类抗凝全血不小于200μL，2周内使用可在2～8℃保存，否则，样本需要-20℃及以下温度保存；提取纯化的DNA要求：浓度不低于20ng/μL、A260/A280值为1.6～2.0、体积不小于15μL。

注：各浓度样品需按照试剂准备及配制提示内容操作；浓度超过100ng/μL需用纯化水稀释到最佳浓度内。

2、提取后的DNA样品2周内使用可在2～8℃保存，否则，样本需要-20℃及以下温度保存。

3、不可使用肝素抗凝的全血标本。

六、检验方法

1、样品及质控品准备：提取DNA样品要求及操作见上述“样本要求”，冻存的DNA样品室温解冻，冷藏的DNA样品可以马上使用；阴阳性质控1、阴阳性质控2与样本DNA操作相同。

2、试剂准备及配制：

(1)从冷冻冰箱取出试剂盒中所需数量的试剂，室温解冻。引物板可用壁纸刀裁剪相应数量孔位，不可破坏反应孔完整及孔边缘平滑性。

(2)观察PCR板包被的引物及浓缩dNTP-Buffer II溶液室温溶解后，其颜色为粉红或紫色方可使用，PCR板包被的引物均于板底存在，否则失效不能使用。

(3)常温下在15min内完成加样操作，否则在冰盒上进行加样操作。

(4)工作反应液配制：

A.配制dNTP-Buffer II工作液：510μL浓缩dNTP-Buffer II+650μL纯化水

B.工作反应液配制：分别取出所需的DNA和dNTP-Buffer II工作液混合后震荡混匀，800rpm离心数秒，混合液置于管底；

工作反应液用量(每人份样本)＝12μL DNA+120μL dNTP-Buffer II工作液。

(5)撕掉反应板上透明封板膜放置在水平桌面，根据引物孔位图(图1)，向检测孔中加入10μL工作反应液，向阴性对照孔中加入10μL dNTP-Buffer II工作液。

(6)加样时加样枪头抵在加样孔的内侧壁，不能触及底部包被的引物。加样后用板式离心机瞬时离心或手工轻轻震荡使混合液滑至管底部，不可剧烈摇动防止液体溅出。

注：确保将含DNA的混合液覆盖在引物上面(干燥的引物在每个反应管底部)；不同样本加样需更换加样枪头。

(7)工作引物板封膜：使用推荐封膜机及铝膜热封反应板顶部，反应孔应完全被封闭；封膜机推荐条件：175℃，4.5s；或滴管加入25±10μL石蜡油蜡封，然后将封板膜重新覆上引物板(防止石蜡油挥发造成的PCR仪沾染)；封膜处可做样本顺序标记。

(8)密封后的工作引物板可马上进行PCR扩增，或者-18℃保存一周内使用。

3、仪器准备及PCR扩增：

(1)将上述密封后的工作引物板置于PCR仪样本槽相应位置，记录放置顺序。

(2)按下表推荐参数设置，荧光通道选择SYBR，进行PCR扩增。

(3)荧光增益参数设置按照仪器质控要求设置。荧光阈值计算方法3-15循环标准差10倍(仪器默认计算公式)。

4、质量控制：

(1)实验质量控制

阴性对照孔CT/TM值为空白，其他每孔19≤Ct≤26，且Tm值在该孔规定的阴阳判读范围内。否则实验失败，失败原因请查询注意事项相关内容。

(2)使用者质量控制

阴、阳性质控方法：每批次试剂盒使用试剂盒中的质控品进行检测，Ct和Tm应符合孔位阴阳性判读范围。

5、结果判读：依据阳性判断值判读阳性孔位，查询结果分型表(图2)判读基因分型结果。(基因结果需符合人类基因座位规则)

七、阳性判断值

根据每孔的最高熔解曲线Tm值判断孔位阴阳性，Tm值详见下表：

八、检验结果的解释

1、检测范围：RHD*基因E1/E3/E4/E5/E6/E7/E9/E10/E6-845A/E9-1227A(E1-10名称解释：外显子1-10)；检测范围以外的基因区域需选择其他分子生物学方法进行检测；

2、Hy-D孔(11孔)阳性：至少存在一条RHD基因外显子全缺失；Hy-D孔阴性，两条RHD基因未全缺失；

3、D-Exon1(1孔)、D-Exon10(10孔)检测范围不包含SNP位点突变变异体；

4、血清学表型缩写解释

D+	RhD阳性
		D-	RhD阴性
partial D	RhD部分D
		WD	RhD弱D
Weak partial D	RhD弱部分D
		Del	RhDDEL型(吸收放散阳性)

5、RHD*c.960G>A突变为中国人群研究发现，ISBT现未命名；

6、NC孔为阴性对照孔，该引物对同时存在于所有反应孔内，电泳条带864BP(熔解曲线TM76±1)，当反应孔为特异性阳性时，该引物对电泳条带较弱，无TM76熔解曲线峰，是保障特异性引物对在PCR反应中拥有竞争优势设计。

九、检验方法的局限性

1、本试剂盒只针对RHD基因的第1/3/4/5/6/7/9/10外显子是否存在、以及845A、1227A等SNP位点是否突变定性检测，只为上述基因区域影响的RhD血型抗原表达鉴定提供参考。不能用于血源筛查，检测结果不能作为血型鉴定的唯一依据；

2、本试剂盒仅限于使用适用的定量PCR仪器，以及标本处理、检验方法操作；

3、本试剂盒实验操作能够在3小时左右完成，当医师在处理紧急医疗决策时，需考虑到取样到实验结束所需时间至少不能少于3.5小时；

4、本试剂盒检测需具有分子生物学操作知识及经验的合格技术人员操作，以及合格的试验场地；检测结果的判读需掌握遗传知识的技术人员判读；PCR临床应用实验室必须要符合国家PCR实验室技术规范要求；

5、本试剂盒检验方法减少了因需要转移扩增产物而带来的实验室气溶胶污染风险，但不能完全避免该风险，需注意在操作的全流程中避免打翻或倒置PCR板，避免液体流出污染实验室环境。

十、产品性能指标

1、分析性能评估

(1)阳性符合率：对阳性参考品的检测结果应与已知基因分型结果完全相符，符合率应为100％。

(2)阴性符合率：对阴性参考品的检测结果应均为阴性。

(3)重复性：对DNA参考品分型结果应完全一致，且符合其相应的已知结果。

(4)有效检测范围：将浓度为20ng/μL和100ng/μL的DNA参考品进行检测，2份分型结果应完全一致。

(5)不同抗凝剂样本评估：选取1份经Sanger测序法(SBT)鉴定基因型的全血样本，分别采用枸橼酸钠，EDTA抗凝提取DNA，进行检测，测定结果显示枸橼酸钠与EDTA抗凝标本结果与对应基因型完全符合。本试剂盒不适用于肝素抗凝全血样本。

(6)全血样本中溶血与脂血对DNA提取以及对实验结果的影响评估：分别选取经Sanger测序法(SBT)鉴定基因型的4份溶血样本，4份脂血样本，提取DNA，进行检测，测定结果显示标本溶血、脂血对于本试剂盒的使用没有干扰作用。

(7)黄疸全血样本中对实验结果的影响评估：分别选取经Sanger测序法(SBT)鉴定的4份黄疸血液样本，提取DNA，进行检测，测定结果显示黄疸全血标本对本试剂盒的使用没有干扰作用。

(8)随机失败率：剔除系统失败，统计(1)-(7)涉及的相关实验中实验结果按照如下方法计算随机失败率：随机失败率＝随机反应失败的单孔总数/总的反应孔数量，统计结果不大于2％。其中反应失败的孔是指应该出现内参带或阳性带而未出现的孔。

(9)所有比对使用的参考品及样本均经过Sanger测序法(SBT)检测。

2、临床性能评估：

人类红细胞RHD基因分型试剂盒(SSP荧光PCR染料法)检测结果与Sanger测序法(SBT)法检测结果做比较分析，两者结果相符。

十一、注意事项

1、本试剂盒内所有试剂仅用于体外诊断。禁止患者自用。禁止说明书产品应用说明以外的应用使用到临床中。

2、进行该实验的实验室要符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》(卫办医政发(2010)194号)，且实验操作人员需有分子生物学检验专业知识。

3、检测开始前仔细阅读操作说明书，并严格按照实验室SOP文件进行操作。

4、试剂准备区、标本制备区、PCR扩增及扩增产物分析区三个区域的器具不能混用，相关设施设备、器具需按照分子生物学实验室管理的有关规定定期校准、维护。

5、整个实验所有的试剂均无致癌性，但请佩戴一次性手套及口罩避免直接与皮肤接触避免潜在生物风险。

6、实验试剂接触的全部废弃物，包括吸头，EP管，手套，扩增后的反应板以及样本等需进行无害化处理后方可丢弃。丢弃物不可重新带入实验室。

7、不同批号试剂不可混用，所有试剂需在有效期内使用。

8、当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。

9、反应板中的反应液尽量避免气泡存在，石蜡油覆盖整个反应液。

10、故障排除。可能出现的故障及解决办法见下表：

Claims (10)

1.一种检测人类红细胞RHD基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQID No.1-22所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组对应的检测位点分别为：第一组引物对如序列SEQ ID No.1-2所示，检测RHD基因中第1外显子的信息；第二组引物对如序列SEQ ID No.3-4所示，检测RHD基因中第3外显子的信息；第三组引物对如序列SEQ IDNo.5-6所示，检测RHD基因中第4外显子的信息；第四组引物对如序列SEQ ID No.7-8所示，检测RHD基因中第5外显子的信息；第五组引物对如序列SEQ ID No.9-10所示，检测RHD基因中第6外显子845G基因的信息；第六组引物对如序列SEQ ID No.11-12所示，检测RHD基因中第6外显子W15基因的信息；第七组引物对如序列SEQ ID No.13-14所示，检测RHD基因中第7外显子的信息；第八组引物对如序列SEQ ID No.15-16所示，检测RHD基因中第9外显子1227G基因的信息；第九组引物对如序列SEQ ID No.17-18所示，检测RHD基因中第9外显子1227A基因的信息；第十组引物对如序列SEQ ID No.19-20所示，检测RHD基因中第10外显子的信息；第十一组引物对如序列SEQ ID No.21-22所示，检测RHD基因合子的信息。

3.一种检测人类红细胞RHD基因分型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组，每一组引物对分别处于不同的反应容器内。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含内参引物对，其序列如SEQ IDNo.23-24所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物对可以加入检测孔中，检测RHD基因的信息。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物对可以作为阴性对照孔，对检测进行质量控制。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括浓缩反应液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩反应液包括PCR buffer、dNTP、Mg离子、DNA聚合酶、SYBR GreenⅠ荧光染料等。

9.权利要求3所述的试剂盒在非诊断性人类红细胞RHD基因分型检测中的用途。

10.一种如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：

(1)从冷冻冰箱取出试剂盒中所需数量的试剂，室温解冻；

(2)观察PCR板包被的引物及浓缩反应液室温溶解后，其颜色为粉红或紫色方可使用，PCR板包被的引物均于板底存在，否则失效不能使用；

(3)在510μl浓缩反应液中加入650μl纯化水，制成反应液；

(4)每人份样本使用120μl反应液与12μl样本DNA混合，制成工作反应液；

(5)撕掉PCR板上透明封板膜放置在水平桌面，向检测孔中加入10μl工作反应液，向阴性对照孔中加入10μl反应液，加样后用板式离心机瞬时离心或手工轻轻震荡使混合液滑至管底部；

(6)使用推荐封膜机及铝膜热封反应板顶部，反应孔应完全被封闭。封膜机推荐条件：175℃，4.5s；或滴管加入25±10μL石蜡油蜡封，然后将封板膜重新覆上引物板。封膜处可做样本顺序标记；

(7)将密封后的工作引物板放入荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，在96℃进行2分钟的预变性，然后进行5个循环的96℃20秒和68℃60秒的反应，然后进行10个循环的96℃20秒、65℃50秒和72℃45秒的反应，然后进行15个循环的96℃20秒、62℃50秒和72℃45秒的反应，最后在72℃延伸2分钟；

(8)根据阳性判断值和结果分型表对实验结果进行质量控制和结果判读。