CN110055347A - 一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法，属于高分辨熔解曲线分析技术领域。本发明方法采用1对特异性引物，基于实时荧光PCR(Real‑time PCR)熔解曲线鉴别红色毛癣菌、趾间毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、和Microsporum incurvatum。所述1对特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于临床诊断、环境监测、食品安全等方面对皮肤癣菌的鉴别，从而为皮肤癣菌的感染治疗、环境卫生和食品安全的监测提供确实可靠的依据。
Description
技术领域
本发明涉及高分辨熔解曲线分析方法的应用，具体涉及一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法，所述的五种皮肤癣菌分别是红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum。
背景技术
浅部真菌病是指由致病真菌或条件致病真菌感染人皮肤，指(趾)甲或毛发等浅表组织引起的疾病，是皮肤科门诊中的常见病，多发病。据报道，该病在人群中的患病率可高达20％-25％，且发病率仍呈逐年上升趋势。而皮肤癣菌是浅部真菌感染中最常见的病原菌，是一类嗜角质的病原性真菌，寄生或腐生于这些部位的角蛋白组织中，引起体癣、股癣和手足癣等皮肤癣菌病，危害人体健康，影响其正常生活。因此，需要快速、准确的鉴定出皮肤癣菌的菌种，为临床精准用药提供依据。
皮肤癣菌一般被分为3个属：毛癣菌属，表皮癣菌属和小孢子菌属。传统的皮肤癣菌鉴定依赖于菌落形态、镜下特征(主要是大分生孢子的形态特征)，生理、生化等表型特征。但形态学鉴定耗时费力，且对工作人员操作技术要求较高。随着分子生物学的迅速发展，越来越多的分子诊断学技术应用于皮肤癣菌的快速诊断。几丁质是一种纤维状的多糖，构成包括皮肤癣菌在内的许多真菌的细胞壁。几丁质合成酶(CHS)基因在多种真菌(如白色念珠菌，构巢曲霉等)中得到表达，通过对比序列发现该基因区域具有高度保守性，适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育分析。因此，通过使用引物对扩增CHS基因后进行测序，在NCBI进行基本局部比对，可以进行菌株鉴定，但该方法难以对所有菌株进行准确鉴定，且存在无扩增现象。此外，常用的技术还有有聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，即针对某一基因片段进行PCR扩增后，用合适的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切产物的长度多态性，从而进行菌种鉴定，但该方法的实验过程复杂，不利于推广；或者采用随机扩增多态性DNA分析(RAPD),虽然具有所需DNA量小、敏感性高、操作简便迅速、便于大规模使用及费用低等优点，但其重复性和特异性往往受反应条件的制约，反应条件的改变往往影响检测结果的准确性。
高分辨熔解曲线(High resolution melting,HRM)分析技术，其原理是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，DNA片段单个碱基的差异都会使熔解温度(以下简称Tm)发生变化，从而使DNA片段在升温解链过程中形成不同的熔解曲线，进而区分不同菌种。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，与其他遗传分型技术相比，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，且结果准确，实现了真正的闭管操作。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种基于RT-PCR熔解曲线分析的鉴别五种皮肤癣菌的方法，特别是一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的方法。
本发明的另一目的在于提供一种适用于高分辨熔解曲线能同时鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的一个特异性引物对。
本发明应用高分辨熔解曲线分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，CHS基因序列不同会使双链DNA的Tm值发生变化，从而双链DNA在升温过程中先后解链，形成不同的熔解曲线形状。荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度和时间曲线上就能判断是否存在有差异的CHS基因片段，且CHS基因序列的差异会影响熔解曲线的峰形，能有效区分不同菌种的CHS基因。
为了实现本发明的目的，本发明仔细研究了红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporumincurvatum这五种皮肤癣菌的基因组序列，在CHS基因序列中寻找差异性靶序列，确定上述五种皮肤癣菌的差异性靶序列分别如SEQ ID NO.3-7所示。通过精心设计和筛选，设计一对特异性引物，使用该对引物通过HRM技术能够特异地鉴别上述五种皮肤癣菌。
本发明首先提供了适用于高分辨熔解曲线能鉴别上述五种皮肤癣菌的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒或检测试剂。
本发明提供了所述特异性引物对在鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporumincurvatum中的应用。
本发明提供了所述特异性引物对在制备鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporumincurvatum的试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了上述的特异性引物在保障食品安全或环境卫生监测中的应用。
本发明提供一种鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的方法，是应用本发明设计的上述特异性引物，以待测样品的DNA为模板，使用Real-time PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中熔解曲线的峰形判定结果。
上述Real-time PCR方法中30μL PCR反应体系为：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water1.5μL、待测DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。
Real-time PCR反应条件为：预变性：95℃10min；95℃15s，65℃45s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。
本发明上述方法的熔解曲线制作条件为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，同时连续检测荧光强度；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。
具体地，本发明方法鉴别结果的判断原则是每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的皮肤癣菌，
其中，Tm值在82-85℃范围内出现熔解峰为红色毛癣菌(T.rubrum)检出；
Tm值在83-86℃范围内出现熔解峰为趾间毛癣菌(T.interdigitale)检出；
Tm值在84-87℃范围内出现熔解峰为絮状表皮癣菌(E.floccosum)检出；
Tm值在88-90℃范围内出现熔解峰为犬小孢子菌(M.canis)检出；
Tm值在86-88℃范围内出现熔解峰为Microsporum incurvatum检出。
本发明还提供了用于鉴别五种皮肤癣菌的靶序列组合，所述五种皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum，用于鉴定红色毛癣菌(T.rubrum)的靶序列含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
用于鉴定趾间毛癣菌(T.interdigitale)的靶序列含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
用于鉴定絮状表皮癣菌(E.floccosum)的靶序列含有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
用于鉴定犬小孢子菌(M.canis)的靶序列含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
用于鉴定Microsporum incurvatum的靶序列含有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
具体地，本发明提供了用于鉴定红色毛癣菌(T.rubrum)的靶序列，其含有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明提供了用于鉴定趾间毛癣菌(T.interdigitale)的靶序列，其含有如SEQID NO.4所示的核苷酸序列；
本发明提供了用于鉴定絮状表皮癣菌(E.floccosum)的靶序列，其含有如SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列；
本发明提供了用于鉴定犬小孢子菌(M.canis)的靶序列，其含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
本发明提供了用于鉴定Microsporum incurvatum的靶序列，其含有如SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列。
本发明提供了上述方法在环境卫生监测、食品安全监测中的应用。
本发明的Real-time PCR熔解曲线分析方法采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行后续PCR产物电泳检测与分析，简化操作流程、降低实验检测成本，提高检测效率、避免样品和环境的交叉污染。同时本发明的方法具有良好的特异性，保证该方法能够特异性的检出红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum，避免了假阳性。
本发明的HRM分析方法还具有较高的灵敏度，对上述五种皮肤癣菌检测下限为20-100拷贝，具有很高灵敏度，且标准峰形区分明显，能有效区分前述不同菌种的CHS序列。本发明采用HRM分析方法无需设计特异性探针，与其他鉴别菌种的方法相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，PCR扩增后无需进行电泳，实现闭管操作，防止交叉污染。本发明方法可用于临床诊断、环境卫生监测、食品安全等方面对上述五种真菌的鉴别，从而为皮肤癣菌的感染治疗、环境卫生和食品安全的监测提供确实可靠的依据。
附图说明
图1为本发明鉴别五种皮肤癣菌的高分辨熔解峰值图谱。
图2为本发明方法对五种皮肤癣菌DNA模板的检测限结果图。图中曲线由左到右分别对应，5×106拷贝，5×105拷贝，5×104拷贝，5×103拷贝，5×102拷贝，5×10拷贝。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1鉴别五种皮肤癣菌方法的建立和特异性、灵敏度验证
本发明仔细研究了红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum这五种皮肤癣菌的基因组序列，在CHS序列中寻找差异性靶序列，通过精心设计和筛选，设计一对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，使用该对引物通过HRM技术能够特异地鉴别上述五种皮肤癣菌。该引物的设计无法通过计算机软件自动得出，需要依据丰富的经验选取靶序列片段和长度，在考虑序列GC含量的同时依据以下公式计算Tm值。合成引物后进行反复试验，得到一对能够区分上述五种皮肤癣菌的最佳引物。
利用高分辨熔解曲线分析技术鉴别五种皮肤癣菌，其步骤如下：
1.采用粗提法提取待测真菌样本的基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测。
2.对比已鉴定出的五种皮肤癣菌(红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporumincurvatum)CHS区的序列(序列分别见SEQ ID NO.3-7)，利用SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增，PCR产物长度约200bp，引物信息如下：
F 5’-TCGCGCACCAGCAGCAAGAC-3’，(SEQ ID NO.1)
R 5’-CCTTGACCTCCATGCCTATCT-3’(SEQ ID NO.2)
3.配制反应体系。在每一个PCR反应孔中按照下表加入2×Mix Taqman PCRMaster 15ul、引物F 0.9μl、引物R 0.9μl(引物浓度均为10μM)、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3ul、Evagreen,20×in Water1.5μl、待测DNA模板2μl，用灭菌纯水补足体系至30μl。
4.在ABI QuantStudio 6flex上进行反应，PCR反应程序如表1：
表1
5.利用ABI软件进行结果分析，通过标准曲线基于曲线偏移和曲线形状变化展现不同皮肤癣菌种的CHS差异。其标准峰形区分明显，如图1所示。Tm值在82-85℃范围内出现熔解峰为红色毛癣菌(T.rubrum)检出；Tm值在83-86℃范围内出现熔解峰为趾间毛癣菌(T.interdigitale)检出；Tm值在84-87℃范围内出现熔解峰为絮状表皮癣菌(E.floccosum)检出；Tm值在88-90℃范围内出现熔解峰为犬小孢子菌(M.canis)检出；Tm值在86-88℃范围内出现熔解峰为Microsporum incurvatum检出。
6.HRM灵敏度验证
以10倍系列稀释的五种皮肤癣菌(红色毛癣菌，趾间毛癣菌，絮状表皮癣菌，犬小孢子菌和Microsporum incurvatum)的标准DNA为模板进行HRM扩增，分析其标准峰形。结果表明该方法对五种皮肤癣菌DNA模板的检测下限20-100拷贝，具有很高的灵敏度，见图2。
7.HRM特异性验证
利用本发明同时对多种真菌(Trichophyton rubrum，Trichophytoninterdigitale，Epidermophyton floccosum，Microsporum canis，Microsporumincurvatum，Talaromyces funiculosus，Curvularia hominis，Aspergillus sydowii，Meyerozyma caribbica，Kurtzmaniella cleridarum，Pichia kluyveri，Wickerhamomycesanomalus，Trichosporon asahii，Cladosporium sphaerospermum，Microascus murinus，Hortaea werneckii，Fusarium oxysporum，Candida albicans)进行鉴定。
同时采用高分辨熔解曲线分析方法和测序法，对来自全国10个不同省市的菌株进行鉴定。经过菌株培养、DNA提取等步骤后，用高分辨熔解曲线分析技术参照本实施例前述方法进行鉴定，同时使用测序法，使用Claudia Cafarchia(Molecular characterizationof selected dermatophytes and their identification by electrophoreticmutation scanning)所采用引物对目标真菌菌株CHS区域准确扩增，得到PCR产物后进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对，得到其菌种。将两种方法的鉴定结果进行对比。结果显示，利用本发明建立的高分辨熔解曲线鉴定五种皮肤癣菌的方法和传统PCR扩增后测序方法鉴别出的五种皮肤癣菌菌均能一一对应；而非皮肤癣菌均未成功扩增。表明本发明方法能特异、有效地用于五种皮肤癣菌的区分鉴定。
实施例2本发明方法的应用
1.选取100个在全国10个不同省市的医院皮肤科就诊的皮肤癣菌病的患者标本，使用含0.5％氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂基(PDA)，在28℃恒温条件下进行分离培养，对培养阳性的标本进行鉴定。
2.采用粗提法提取待测真菌样本的基因组DNA，后续鉴定方法参照实施例1的操作方法进行。利用ABI软件进行结果分析，通过标准曲线基于曲线偏移和曲线形状变化展现不同皮肤癣菌的CHS差异。鉴定结果如下表2。
表2
对于采用实施例1方法鉴别出相应皮肤癣菌的样本，再采用与实施例1相同的PCR扩增后测序方法分别检测该样本，确定两种方法检测结果一致。由此可见本发明方法具有良好的准确性。
对于表2中检测结果显示未扩增的样本，采用与实施例1相同的PCR测序方法分别检测该样本，结果均不是红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum这五种皮肤癣菌中的任一种，可见本发明鉴别五种皮肤癣菌的方法特异性高，无假阴性或无假阳性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 金华市中心医院
<120> 一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法
<130> KHP191111398.4
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcgcacca gcagcaagac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttgacctc catgcctatc t 21
<210> 3
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtccagat ggggcaggag gcatggagag attgtcgtct gcatcgtctc agacggccgt 60
ggaaagatca atccacgcac cagagctgtc ctggctggtc tcggtgtcta tcaggacggc 120
attgccaaac agcaggtcaa cggcaaagac gtcactgccc acatctacga gtataccacc 180
cagataggca tggaggtcaa ggggacccaa gtcctcctca agccccggcc agggatgcca 240
gtccagctcc tcttctgtct caaggagaag aaccagaaga agatcaactc ccacagatgg 300
ttcttccagg cctttggccg tgtcctcgac cccaacatct gcgtactcct cgacgccgga 360
acaaaaccag gcaggcagag catataccag ctctggcgtg ccttttgacc tcga 414
<210> 4
<211> 419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgacgctag actggggcag gaggcctgga gagatcgtcg tctgcatcgt ctccgacggc 60
cgtgcaaaaa tcaatccgcg cacgagagcc gtgctggccg ggctgggggt ctaccaggac 120
ggcattgcca aacagcaggt caacggcaag gacgtcaccg cccacatcta cgagtacacc 180
acccagatcg gcatggaggt caagggcacc caggtcatcc tcaagcctcg gccgggcatg 240
cccgtccagc tcctcttctg cctcaaggag aagaaccaga agaagatcaa ctcgcaccgg 300
tggttcttcc aggccttcgg ccgcatcctc gacccaaaca tctgcgtcct cctcgacgcc 360
gggacaaagc cggggaagca gagcatatac cagctctggc gtgcctttgg acctcgatg 419
<210> 5
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgctacga ctgcggcagg agcctggaag aagattgtcg tctgtatcgt ctcagacggc 60
cgtgcaaaga tcaatccacg cacgagagct gtccttgccg gtctgggtgt ctatcaagat 120
ggtattgcca aacagcaggt caacggtaaa gacgtcaccg ctcacatcta cgagtacacc 180
acccagatag gcatggaggt taagggcacc caggtcgttc tcaagccccg gccgggaatg 240
ccagtacaac tccttttctg tctcaaggag aagaaccaga agaagatcaa ctctcacaga 300
tggttcttcc aggccttcgg ccgtgtcctc gaccccaaca tctgtgtcct cctcgacgcc 360
ggaacaaagc caggcaggca gagtatatac caactctggc gtgccttttt aacctcgaat 420
<210> 6
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagactggg gtagagcctg gaagaagatt gtcgtttgta tcgtctcaga cggtcgtgca 60
aagataaatc cgcgtacgag agctgtcctt gccggtctag gcgtttacca agatggcatt 120
gccaaacagc aggtcaacgg taaagacgtc actgcgcaca tctacgaata taccacccag 180
ataggcatgg aggtcaaggg cacccaggtt attctcaagc cgcggccggg aatgccggtc 240
cagctcctct tctgtcttaa agagaagaac cagaagaaga tcaactctca cagatggttc 300
ttccaagcct ttggtcgcgt cctcgacccc aatatctgtg ttctcctcga cgcgggaaca 360
aaaccaggcg gccgaagtat ataccaactc tggcgtgcct tttgacctcg a 411
<210> 7
<211> 412
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagtctagac tggggtagag cctggagagt tgtcgtttgt attgtctcag acggtcgtgc 60
aaagataaac ccacgtacaa gagctgtcct tgccggtcta ggtgtttacc aagatggcat 120
tgctaagcag caggttaacg gtaaagacgt cactgctcac atctacgaat ataccaccca 180
gataggcatg gaggtcaagg gcacccaggt tatcctcaag ccgcggccag gaatgccagt 240
ccagcttctc ttctgtctta aagagaagaa tcagaaaaag atcaactctc acagatggtt 300
cttccaagcc tttggccgtg tcctcgaccc caatatctgt gttctcctcg atgctggaac 360
aaaaccaggc gggcgaagta tataccagct ctggcgtgcc ttttgacctc ga 412
Claims (10)
1.适用于高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的特异性引物对，所述五种皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1-2所示的序列或其特异性序列。
2.含有权利要求1所述特异性引物对的试剂盒或检测试剂。
3.权利要求1所述特异性引物对在制备鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporumincurvatum的试剂盒或检测试剂中的应用。
4.权利要求1所述的特异性引物对在保障食品安全或环境卫生监测中的应用。
5.一种鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的特异性引物对，以待测样品的DNA为模板，使用Real-time PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中熔解曲线的峰形判定结果。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR方法中30μL PCR反应体系为：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference Dye Ⅱ 0.3μL、Evagreen，20×in Water1.5μL、待测DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应条件为：预变性：95℃10min；95℃15s，65℃45s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，熔解曲线制作条件为：95℃10s，60℃1min，0.025℃/s升温至95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，同时连续检测荧光强度；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。
9.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的皮肤癣菌，
其中，Tm值在82-85℃范围内出现熔解峰为红色毛癣菌(T.rubrum)检出；
Tm值在83-85℃范围内出现熔解峰为趾间毛癣菌(T.interdigitale)检出；
Tm值在84-87℃范围内出现熔解峰为絮状表皮癣菌(E.floccosum)检出；
Tm值在88-90℃范围内出现熔解峰为犬小孢子菌(M.canis)检出；
Tm值在86-88℃范围内出现熔解峰为Microsporum incurvatum检出。
10.用于鉴别五种皮肤癣菌的靶序列组合，所述五种皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum，其特征在于，
用于鉴定红色毛癣菌(T.rubrum)的靶序列含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
用于鉴定趾间毛癣菌(T.interdigitale)的靶序列含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
用于鉴定絮状表皮癣菌(E.floccosum)的靶序列含有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
用于鉴定犬小孢子菌(M.canis)的靶序列含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
用于鉴定Microsporum incurvatum的靶序列含有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
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