[go: up one dir, main page]

EA011853B1 - АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβ - Google Patents

АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβ Download PDF

Info

Publication number
EA011853B1
EA011853B1 EA200401198A EA200401198A EA011853B1 EA 011853 B1 EA011853 B1 EA 011853B1 EA 200401198 A EA200401198 A EA 200401198A EA 200401198 A EA200401198 A EA 200401198A EA 011853 B1 EA011853 B1 EA 011853B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
hybridoma
heavy chain
antibody according
atcc pta
Prior art date
Application number
EA200401198A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401198A1 (ru
Inventor
Шелия М. Вайолетт
Пол Х. Вейнреб
Кеннет Дж. Саймон
Дин Шеппард
Дайан Р. Леоне
Original Assignee
Байоджен Айдек Ма Инк.
Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29586753&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA011853(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Байоджен Айдек Ма Инк., Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния filed Critical Байоджен Айдек Ма Инк.
Publication of EA200401198A1 publication Critical patent/EA200401198A1/ru
Publication of EA011853B1 publication Critical patent/EA011853B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1066—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с αβ, а также к способам применения данных антител для лечения млекопитающих, характеризующихся риском наличия опосредованных αβзаболеваний, или для диагностики опосредованных αβзаболеваний.

Description

Область изобретения
Изобретение относится, в общем, к области молекулярной биологии, и конкретно к антителам против аУв6-интегринов.
Предпосылки изобретения
Интегрины представляют собой надсемейство рецепторов клеточной поверхности, которые опосредуют адгезию клетка-клетка и клетка-матрикс. Данные белки, как известно, обеспечивают заякоривание, а также сигналы клеточного роста, миграции и дифференцировки во время развития и восстановления ткани. Интегрины также вовлечены в обратную дифференцировку и инвазию клеток, особенно когда клетки теряют свою специализированную форму и становятся метастазирующими раковыми клетками.
Интегрины представляют собой гетеродимерные белки, составленные из двух нековалентно связанных субъединиц, α и β. Специфичность связывания интегринами диктуется комбинацией некоторых из 18 различных α-цепей с некоторыми из 8 различных β-цепей. аУв6-Интегрин может связываться с некоторым количеством лигандов, включая фибронектин, тенасцин, витронектин и недавно идентифицированный ассоциированный с латентностью пептид БАР, пептид из 278 аминокислот, синтезированный в виде части белка-предшественника ΤΟΕ-β (Мипдег с1 а1., Се11 96 (3): 319-328 (1999)). ЬЛР отщепляется от зрелой формы ΤΟΕ-β в виде Ν-концевого пептида во время секреции, но остается нековалентно ассоциированным с ΤΟΕ-β для поддержания его латентного состояния. Данный комплекс не может связываться с рецептором ΤΟΕ-β и поэтому не активен биологически. α,,βί,-Интегрин может связываться непосредственно с ΚΟΌ-мотивом, содержащимся внутри ЬЛР, что приводит к высвобождению ЬЛР и активации ΤΟΕ-β. Поскольку связывание ανβ6 с ЬЛР может иметь значение при переходе ΤΟΕ-β в его активное состояние, блокирование данного связывания может приводить к ингибированию а.ДБ-опосредованной активации ΤΟΕ-β и ассоциированной фиброзной патологии.
Сущность изобретения
Данное изобретение основывается на открытии и характеристике высокоаффинных антител против ανβ6, включая идентификацию и анализ ключевых аминокислотных остатков в областях, определяющих комплементарность (СЭК.) таких антител.
Данное изобретение относится моноклональному антителу, которое: (а) специфически связывается с ανβ6; (Ь) ингибирует связывание ανβ6 с его лигандом, таким как ЬЛР, фибронектин, витронектин и тенасцин, со значением 1С50, меньшим, чем у антитела 10Ό5 (публикация заявки на выдачу международного патента \¥0 99/07405); (с) блокирует активацию ΤΟΕ-β; (й) содержит определенные аминокислотные последовательности в СЭК (например, такие, как показано на фиг. 7А и 7В), которые обеспечивают специфичность связывания с ανβ6; (е) специфически связывается с субъединицей β6 и/или (Г) распознает ανβ6 в процедурах иммунного окрашивания, таких как иммунное окрашивание залитых в парафин тканей.
Было обнаружено, что антитела, которые связываются с ανβ6, могут быть разделены на биофизически различные классы и субклассы. Один из классов антител проявляет способность блокировать связывание лиганда (например, БАР) с ανβ6 (блокаторы). Данный класс антител может далее разделяться на субклассы катионзависимых блокаторов и катионнезависимых блокаторов. Некоторые из катионзависимых блокаторов содержат пептидную последовательность аргинин-глицин-аспартат (ΚΟΌ), а катионнезависимые блокаторы не содержат ΚΟΌ-последовательность. Другой класс антител проявляет способность связываться с ανβ6 и при этом не блокирует связывания ανβ6 с лигандом (неблокирующие антитела).
Соответственно, в некоторых осуществлениях данного изобретения некоторые антитела согласно изобретению являются катионзависимыми двухвалентными в плане связывания ανβ6, в то время как другие являются катионнезависимыми двухвалентными в плане связывания ανβ6. Типовыми катионами являются Са2+, Мд2+ и Мп2+.
В некоторых осуществлениях антитело содержит те же полипептидные последовательности легких и тяжелых цепей, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.1А8, 6.3Ο9, 6.8Ο6, 6.2В1, 6.2В10, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1Ο10, 7.7Ο5 или 7.1С5.
В некоторых осуществлениях антитела содержат тяжелую цепь, области, определяющие комплементарность, (СЭК) 1, 2 и 3 которой состоят, по существу (т.е., за исключением некоторых консервативных вариаций), из последовательностей 8Εβ ГО N0: 1, 4 и 7, соответственно, и/или легкую цепь, СЭК 1, и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 10, 13 и 15, соответственно.
В некоторых осуществлениях антитела содержат тяжелую цепь, СЭК 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 3, 5 и 8, соответственно, и/или легкую цепь, СЭК 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 11, 14 и 17, соответственно.
В некоторых осуществлениях антитела содержат тяжелую цепь, СЭК 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 3, 6 и 9, соответственно, и/или легкую цепь, СОК 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 12, 14 и 18, соответственно.
В некоторых осуществлениях антитела содержат тяжелую цепь, СЭК 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 2, 46 и 47, соответственно, и/или легкую цепь, СЭК 1, 2 и которой состоят, по существу, из последовательностей 8Εβ ГО N0: 48, 13 и 16, соответственно.
- 1 011853
В некоторых осуществлениях антитела содержат тяжелую цепь, СЭВ 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Ε6 ГО N0: 49, 51 и 53, соответственно, и/или легкую цепь, СЭВ 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Ε6 ГО N0: 55, 57 и 59, соответственно.
В некоторых осуществлениях антитела содержат тяжелую цепь, СОВ 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Ε6 ГО N0: 50, 52 и 54, соответственно, и/или легкую цепь, СОВ 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из последовательностей 8Ε6 ГО N0: 56, 58 и 60, соответственно.
В некоторых осуществлениях антитела содержат последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, любую из 8Ε6 ΙΌ N0: 19-36 и 61-62.
В некоторых осуществлениях антитела содержат последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей:
(1) 5Е<2 Ю N0: 19 и 37;
(2) ЗЕ<2 10 N0: 20 или 21 и ЗЕ<2 Ю N0: 38;
(3) ЗЕО 10 N0: 22 и 43;
(4) ЗЕС ю N0: 23 и 4 4;
(5) 5Е0 ю N0: 24 и 4 5;
(6) 5Е0 ю N0: 25 или 26 и 5Εζ) Ю N0: 42;
(7) ЗЕО ю N0: 27, 28 или 29, и ЗЕ<2 Ю N0: 39;
(8) ЗЕ<2 ю N0: 34 или 35, и ЗЕ<2 Ю N0: 40;
(9) ЗЕО ю N0: 36 и 41;
(10) ЗЕО Ю N0: 61 и 63; или (11) ЗЕО Ю N0: 62 и 64, соответственно.
В некоторых осуществлениях антитела специфически связываются с ανβ6, но не ингибируют связывание с пептидом, ассоциированным с латентностью (ΕΑΡ). По меньшей мере, некоторые из данных антител способны связываться с ανβ6 в залитых в парафин срезах тканей и поэтому могут использоваться для диагностических целей. Типовые антитела включают в себя 6.2А1 и 6.2Е5.
Данное изобретение также относится к антителам, которые связываются с теми же эпитопами, что и любое из описанных выше антител.
Данное изобретение также относится к композициям, включающим в себя одно или несколько антител согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых из данных композиций антитела конъюгируют с цитотоксическим агентом (т.е. с агентом, который ослабляет жизнеспособность и/или функции клетки), таким как токсин или радионуклид. Антитела в данных композициях могут быть катионзависимыми антителами. Композиции могут вводиться субъекту (например, млекопитающему, такому как человек), страдающему от заболевания, опосредованного ανβ6, или при риске такого заболевания, для лечения (например, облегчения, смягчения, снижения, предотвращения, отложения приступа) заболевания. Неограничивающие примеры таких заболеваний охватывают фиброз (например, склеродермию, рубцы, фиброз печени, фиброз легких и фиброз почек); псориаз; злокачественные опухоли (например, эпителиальный рак; рак ротовой полости, кожи, шейки матки, яичников, глотки, гортани, пищевода, легких, молочной железы, почки или колоректальный рак); синдром Альпорта; острые и хронические повреждения легкого, печени, почек и других внутренних органов и склероз легкого, печени, почек и других внутренних органов. Риски возникновения таких заболеваний могут быть результатом генетической предрасположенности; некоторых жизненных привычек, таких как курение и алкоголизм; воздействия загрязнителей окружающей среды, таких как асбест; физиологических состояний, таких как диабет, инфекция вирусным гепатитом (например, инфекция вирусным гепатитом С), аутоиммунные заболевания; и медицинских процедур, таких как радиационная терапия.
Данное изобретение также относится к способам детекции ανβ6 в образце ткани от млекопитающего (например, человека), охватывающим контактирование образца ткани с антителом по изобретению, таким как 6.2А1 и 6.2Е5.
Данное изобретение также относится к клеткам гибридом 6.1А8, 6.2В10, 6.369, 6.866, 6.2В1, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1610, 7.765 и 7.1С5; выделенным нуклеиновым кислотам, включающим в себя кодирующую последовательность, любую из 8Ε6 ГО N0: 19-45 и 61-64; выделенным полипептидам, включающим в себя аминокислотную последовательность, любую из 8Ε6 ГО N0: 19-45 и 61-64.
Антитело согласно изобретению относится к полноразмерному антителу, например антителу, включающему в себя две тяжелые цепи и две легкие цепи, или к антигенсвязывающему фрагменту полноразмерного антитела, такому как РаЬ-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент или Р(у)-фрагмент. Антитело согласно изобретению может быть мышиным антителом, или его гомологом, или полноразмерным человеческим антителом. Антитело согласно изобретению также может быть гуманизированным антителом, химерным антителом или одноцепочечным антителом. Антитело согласно изобретению может
- 2 011853 относиться к любому изотипу и субтипу, например к 1дА (например, 1дА1 и 1дА2), 1дС (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4), 1дЕ, Ι§Ό, 1дМ, где легкие цепи иммуноглобулина могут быть типа каппа или лямбда.
В некоторых осуществлениях антитело согласно изобретению может включать в себя мутацию (например, делецию, замену или добавление) в одной или нескольких (например, 2, 3, 4, 5 или 6) конкретных позициях в тяжелой цепи, так что эффекторная функция антитела (например, способность антитела связываться с Ее-рецептором или с фактором комплемента) изменена без влияния на антигенсвязывающую активность антитела. В других осуществлениях антитело согласно изобретению может содержать мутацию в аминокислотном остатке, который представляет собой участок гликозилирования, так что участок гликозилирования элиминируется. Такое антитело может обладать предпочтительным для клиники снижением эффекторных функций или других нежелательных функций при сохранении его антигенсвязывающей активности.
Мутация участка гликозилирования также может быть благоприятной для разработки способа (например, экспрессии и очистки белка). В других осуществлениях тяжелые или легкие цепи могут содержать мутации, которые повышают сродство или эффективность.
Некоторые из гибридом слияния #6 и слияния #7 поместили на хранение в Ашепсаи Туре СиЙшс СоИесйои (АТСС; Р.О. Βοx 1549, Маиаккак, УА 20108, США) по Будапештскому соглашению. Гибридомные клоны 6.1А8, 6.2В10, 6.3С9, 6.8С6 и 6.2В1 поместили на хранение 16 августа 2001г., и они имеют инвентарные номера АТСС РТА-3647, -3648, -3649, -3645 и -3646, соответственно. Гибридомные клоны 6.2А1, 6.2Е5, 7.1С10, 7.7С5 и 7.1С5 поместили на хранение 5 декабря 2001г., и они имеют инвентарные номера АТСС РТА-3896, -3897, -3898, -3899 и -3900, соответственно. См. табл. 1 ниже.
Антитела согласно изобретению могут использоваться для лечения любого нежелательного для клиники состояния или заболевания (обсуждающегося в данном описании), которое опосредовано связыванием ανβ6 с его лигандом, таким как БАР и фибронектин. Данные антитела могут быть более эффективными за счет более высокого сродства или авидности и зависимости или независимости связывания лиганда от катионов по сравнению с ранее известными антителами против ανβ6.
В дополнение к терапевтическим применениям антител согласно изобретению, особенно блокаторов, класс неблокирующих антител может использоваться для диагностических целей, таких как анализы связывания антител, иммуноферментные сорбционные анализы (ЕБ18А), иммуногистохимия и т.п.
Другие свойства или преимущества изобретения будут ясны из дальнейшего подробного описания, фигур и формулы изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1А и 1В представляют собой гистограммы, на которых показаны результаты анализа по захвату клеток, в котором определяли способность различных моноклональных антител (шАЬ) против ανβ6 связывать трансфицированные β6 клетки ЕБС-Р1 (в качестве контроля - нетрансфицированные клетки).
Фиг. 2А представляет собой график, на котором показаны результаты анализов ЕБ18А, в которых определяли способность различных очищенных моноклональных антител против ανβ6 слияния 6 связывать растворимый рекомбинантный ανβ6 человека (1ικα,,β6). Данные антитела получали путем иммунизации мышей β6-/- растворимым укороченным человеческим ανβ6. Числа в подписи к фигуре, справа, указывают на номера клонов. Соответствующие названия клонов см. в табл. 2.
Фиг. 2В представляет собой график, на котором показаны результаты анализов ЕБ18А, в которых определяли способность различных очищенных моноклональных антител против ανβ6 слияния 7 связывать растворимый рекомбинантный 1ικα,,β6. Данные антитела получали путем иммунизации мышей ανβ6-/- трансфицированными β6 клетками ΝΙΗ 3Т3 (слияние #7).
Фиг. 3А-Е представляют собой графики, на которых показана дифференциальная зависимость от катионов связывания различных моноклональных антител против ανβ6 с Ηκανβ6.
Фиг. 4А и 4В представляют собой графики, на которых показано, что моноклональные антитела слияния #6 и слияния #7, соответственно, ингибируют связывание биотин-йкаЩ6 с БАР.
Фиг. 5А-Е представляют собой графики, на которых показано, что моноклональные антитела согласно изобретению ингибируют связывание трансфицированных β6 клеток ЕБС-Р1 с БАР. На фиг. 5 А и 5В показаны результаты, полученные с антителами слияния #6. На фиг. 5С-Е показаны результаты, полученные с антителами слияния #7.
Фиг. 6А и 6В представляют собой графики, на которых показано, что антитела слияния #6 и слияния #7, соответственно, ингибируют опосредованную ανβ6 активацию ТСЕ-β, с использованием анализа с использованием гена-репортера РА1-1-люциферазы для мониторинга активации ТСЕ-β.
Фиг. 7А отображает аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей моноклональных антител против ανβ6 6.1А8, 6.8С6 (субклоны А и В), 7.7С5, 6.2В1, 6.3С9, 6.2В10 (субклоны А и В), 6.2С2, 6.2А1, 6.4В4 (субклоны А, В и С), 7.10Н2, 7.9Н5, 7.4А3 (субклоны А и В), 7.1С5 (субклоны А и В) и 7.1С10. Антитела 6.1 А8, 6.8С6 и 7.7С5 являются катионзависимыми в плане связывания с ανβ6, в то время как антитела 6.2В1, 6.2А1, 6.3С9, 6.2В10, 6.4В4, 7.1С5 и 7.1С10 являются катионнезависимыми (см. ниже). Номера сносок означают позиции аминокислотных остатков. СЭВ находятся в больших прямоугольниках, в то время как малые прямоугольники содержат показанные курсивом
- 3 011853 аминокислоты, характеризующиеся полиморфизмом в различных клонах конкретного антитела.
На фиг. 7В отображены аминокислотные последовательности вариабельных доменов легких цепей моноклональных антител против ανβ6 6.1А8, 6.866, 6.4В4, 6.2А1, 7.1С5, 7.1610, 6.2В10, 7.765, 6.2В1 и 6.369.
Фиг. 8 представляет собой график рассеяния, на котором показана экспрессия ανβ6 в срезах ткани рака молочной железы человека и плоскоклеточной карциномы человека. Нормальные ткани человека характеризуются лишь незначительными уровнями экспрессии ανβ6.
Фиг. 9А и 9В представляют собой графики кривых второго порядка, изображающие связывающие активности в растворе двух антител против ανβ6 6.866 и 6.369, соответственно, в отношении растворимого ανβ6.
Фиг. 10А и 10В представляют собой гистограммы, на которых демонстрируется способность очищенных моноклональных антител конкурировать с биотинилированным 6.369 и биотинилированным 6.866, соответственно, за связывание с ανβ6.
Фиг. 11 представляет собой диаграмму, на которой показан процент окрашивания гладкомышечного актина в почках от животных ϋϋΘ, подвергшихся лечению шЛЬ против ανβ6.
На фиг. 12 показаны экспрессия ανβ6 в опухолевых клеточных линиях путем ЕЛС8-анализа (правая сторона фигуры) и ингибирование связывания лиганда БАР опухолевыми клеточными линиями за счет тАЬ 6.369 и 6.4В4 (левая сторона фигуры).
Фиг. 13 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется ингибирование связывания тремя опухолевыми клеточными линиями лиганда БАР за счет тАЬ против ανβ6 6.369, 6.866 и 6.4В4. Связывание тАЬ сравнивали с общим связыванием без добавления тестовых тАЬ (ТВ) и неспецифическим связыванием лишь с контролем В8А (Ν8Β).
Фиг. 14А и 14В представляют собой графики, на которых показаны эффекты тАЬ против ανβ6 6.369 и 6.4В4, соответственно, после периода исследования длительностью 33 суток в отношении опухолей, возникших вследствие имплантированных подкожно клеток ΌοΙιόιΙ 562.
Фиг. 15А-С представляют собой графики, на которых показаны эффекты тАЬ против ανβ6 при индуцированном блеомицином фиброзе легких. (А) Обработка антителами с использованием тАЬ 6.369 начиналась на сутки 0 с момента введения блеомицина, и за ней следили в течение периода 30 суток; (В) обработка антителами с использованием тАЬ 6.369 начиналась на сутки 15 после обработки блеомицином, и за ней следили в течение периода 30 суток; (С) обработка антителами с использованием тАЬ 6.369, 6.866 и 6.4В4 начиналась на сутки 15 после обработки блеомицином, и за ней следили в течение продленного периода 60 суток. На фиг. 15 А и 15В диаграммы слева представляют собой мкг гидроксипролина/легкое, в то время как диаграммы справа показывают процентное повышение по гидроксипролину по сравнению с обработанными солевым раствором мышами (без блеомицина). На фиг. 15С на графике показано содержание гидроксипролина на легкое.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к классам и субклассам антител, которые специфичны в отношении интегрина ανβ6. Антитела по меньшей мере одного класса (блокаторы) способны блокировать связывание ανβ6 с Ь-АР или предотвращать активацию Τ6Ε-β.
Далее описаны различные способы получения антител согласно изобретению. Способы, известные в данной области, но не описанные конкретно в данном описании, также входят в объем данного изобретения. Например, антитела согласно изобретению могут также идентифицироваться с использованием библиотек антител на основе фагового дисплея, таких как описанные 8ιηί11ι. 8с1епсе 228: 1315-7 (1985); в патентах США 5565332, 5733743, 6291650 и 6303313. Дополнительные антитела согласно изобретению могут быть получены путем связывания идентифицированных в данном описании тяжелых цепей с неродственной легкой цепью, например с легкой цепью, идентифицированной по технологии фагового дисплея.
Антитела не относящихся к человеку гибридом
Моноклональные антитела согласно изобретению могут генерироваться путем хорошо известной гибридомной технологии. Для ее осуществления β6-/- животных (например, мышей, крыс или кроликов) иммунизируют очищенными или неочищенными препаратами ανβ6, клетками, трансфицированными конструкциями кДНК, кодирующими αν, β6 или оба антигена, клетками, которые конститутивно экспрессируют ανβ6, и т.п. Антиген может доставляться в виде очищенного белка, белка, экспрессированного на клетках, фрагментов белка или его пептидов или в виде голой ДНК или вирусных векторов, кодирующих белок, фрагмент белка или пептид. Сыворотки иммунизированных животных затем тестируют на наличие антител против ανβ6. Из тест-позитивных животных выделяют В-клетки и гибридомы получают с использованием данных В-клеток.
Антитела, секретируемые гибридомами, подвергают скринингу на их способность специфически связываться ανβ6 (например, связываться с трансфицированными β6 клетками и не связываться с нетрансфицированными исходными клетками) и на любые другие требуемые свойства, например на наличие требуемых консенсусных последовательностей СЭЯ, на ингибирование (или отсутствие ингибирова
- 4 011853 ния в случае неблокирующих антител) связывания ЬЛР и ανβ6 со значением 1С50 ниже такового у известного антитела против ανβ6 10Ό5 или на ингибирование активации ТСЕ-β.
Гибридомные клетки, тест-позитивные в анализах по скринингу, культивируют в питательной среде в условиях, которые обеспечивают секрецию клетками моноклональных антител в культуральную среду. Затем приведенную к должным условиям культуральную надосадочную жидкость собирают и очищают содержащиеся в надосадочной жидкости антитела. Альтернативно, требуемое антитело может продуцироваться путем инъекции гибридомных клеток в брюшную полость неиммунизированного животного (например, мыши). Гибридомные клетки пролиферируют в брюшной полости, секретируя антитело, которое накапливается в виде асцитной жидкости. Затем антитело может быть собрано путем отбора шприцом асцитной жидкости из брюшной полости.
Моноклональные антитела также могут генерироваться путем выделения кодирующих антитела кДНК из требуемых гибридом, трансфекции клеток хозяина-млекопитающего (например, клеток СНО или N80) данными кДНК, культивирования трансфицированных клеток хозяина и получения антитела из культуральной среды.
Химерные антитела
Моноклональные антитела согласно изобретению также могут генерироваться путем конструирования родственного гибридомного (например, мышиного, крысиного или кроличьего) антитела.
Например, родственное антитело может быть изменено путем технологии рекомбинантной ДНК, так что целые области шарнира и/или константные области тяжелых и легких цепей или их части замещают соответствующими компонентами антитела из другого вида (например, человека). В общем, вариабельные домены сконструированного антитела остаются идентичными или, по существу, идентичными в отношении вариабельных доменов родственного антитела. Такое сконструированное антитело называют химерным антителом, и оно менее антигенно, чем родственное антитело при введении субъекту вида, из которого происходят области шарнира и/или константные области (например, человека). Способы получение химерных антител хорошо известны в данной области.
Химерные антитела, относящиеся к настоящему изобретению, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий последовательность, идентичную (или, по существу, идентичную) любой из 8ЕЦ ΙΌ N0: 19-36, и/или вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий последовательность, идентичную (или, по существу, идентичную) любой из 8ЕЦ ΙΌ N0: 37-45.
Предпочтительные константные области человека включают в себя те, что происходят от 1дС1 и 1дС4. Полностью человеческие антитела
Моноклональные антитела согласно изобретению также включают в себя полностью человеческие антитела. Они могут быть получены с использованием примированных ίη νίΐτο человеческих спленоцитов, как описано Воегпег е1 а1., 1. 1ттипо1. 147: 86-95 (1991), или с использованием библиотек антител фагового дисплея, как описано, например, в патенте США 6300064.
В некоторые другие способы получения полностью человеческих антител вовлечено применение не относящихся к человеку животных, которые содержат инактивированные эндогенные локусы 1д и являются трансгенными по неперестроенным генам тяжелых цепей и легких цепей человеческих антител. Таких трансгенных животных можно иммунизировать ανβ6, и затем из происходящих оттуда В-клеток получают гибридомы. Данные способы описаны, например, в различных публикациях/патентах СепРйатт/Мебагех (Ра1о Α1ΐο, Калифорния), касающихся трансгенных мышей, содержащих мини-локусы 1д человека (например, ЬопЬетд, патент США 5789650); в различных публикациях/патентах АЬдешх (ЕгетоШ. Калифорния) в отношении ΧΕΝΟΜΙ0Έ (например, Кисйег1арай, патенты США 6075181, 6150584 и 6162963; Стееп е1 а1., №1Шге СепеРсз 7: 13-21 (1994); и Менбех е1 а1., 15 (2): 146-56 (1997)); в различных публикациях/патентах Κίτίη (Япония), касающихся трансомных мышей (например, ЕР 843961 и Топнхика е1 а1., №Шге Сепейсз 16: 133-1443 (1997)).
Гуманизированные антитела
Моноклональные антитела согласно изобретению также включают в себя гуманизированные версии родственных антител против ανβ6, происходящие из других видов. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, продуцируемое по технологии рекомбинантной ДНК, где некоторые или все аминокислоты тяжелой или легкой цепи человеческого иммуноглобулина, которые не требуются для связывания антитела (например, константные области и каркасные области вариабельных доменов), используют для замещения соответствующих аминокислот из легкой или тяжелой цепи родственного, не относящегося к человеку антитела. Например, гуманизированная версия мышиного антитела к данному антигену имеет в обеих его тяжелых и легких цепях: (1) константные области человеческого антитела; (2) каркасные области из вариабельных доменов человеческого антитела и (3) СЭВ из мышиного антитела. При необходимости один или несколько остатков в каркасных областях человека могут заменяться остатками из соответствующих позиций мышиного антитела, так что сохраняется сродство связывания гуманизированного антитела с антигеном. Данное изменение иногда называют обратная мутация. Гуманизированные антитела обычно реже вызывают иммунный ответ у людей по сравнению с химерными человеческими антителами, поскольку первые содержат заметно меньше не относящихся к человеку компонентов.
- 5 011853
Способы получения гуманизированных антител описаны, например, в ^1п1сг. ЕР 239400; 1оие8 е! а1., №а!иге 321: 522-525 (1986); Ктесйтаии е! а1., №а!иге 332: 323-327 (1988); Уетйоеуеи е! а1., 8с1еисе 239: 1534-1536 (1988); Онеен е! а1., Ргое. №а!. Лсаб. 8с1. И8Л 86: 10029 (1989); в патенте 6180370; и От1аи61 е! а1., Ргос. №111. Лсаб. 8с1. И8Л 86: 3833 (1989). В общем, трансплантация мышиных (или других, не относящихся к человеку) СЭВ на антитело человека достигается следующим образом. кДНК, кодирующие вариабельные домены легких и тяжелых цепей, выделяют из гибридомы. Последовательности ДНК вариабельных доменов, включая СЭВ, определяют путем секвенирования. ДНК, кодирующие СЭВ, переносят в соответствующие области кодирующей последовательности вариабельных доменов легких и тяжелых цепей человеческого антитела путем сайт-специфического мутагенеза. Затем добавляют сегменты генов человеческих константных областей требуемого изотипа (например, γ1 для СН и к для СЬ). Гуманизированные тяжелые и легкие цепи совместно экспрессируют в клетках хозяина-млекопитающего (например, клетках СНО или N80) для получения растворимого гуманизированного антитела. Для облегчения крупномасштабной продукции антител часто требуется продуцировать такие гуманизированные антитела в биореакторах, содержащих экспрессирующие антитела клетки, или получать трансгенных млекопитающих (например, коз, коров или овец), которые экспрессируют данное антитело в молоке (см., например, патент США 5827690).
Иногда прямой перенос СЭВ в каркас антител человека приводит к потере сродства связывания антигена полученного в результате антитела. Это происходит потому, что в некоторых родственных антителах некоторые аминокислоты в каркасных областях взаимодействуют с СЭВ и так влияют на общее сродство связывания антителом. В таких случаях критичным является введение обратных мутаций (см. выше) в каркасные области акцепторного антитела для сохранения антигенсвязывающей активности родственного антитела.
Общий подход к получению обратных мутаций известен в данной области. Например, у Онееи е! а1. (выше), Со е! а1., в Ргос. №11. Лсаб. 8сЕ И8Л 88: 2869-2873 (1991), и в \УО 90/07861 (Рто!еш Эе^ди ЬаЬк 1ис.) описан подход, в который вовлечены две ключевые стадии. Во-первых, каркасные У-области человека выбирают путем компьютерного анализа для оптимальной гомологии белковой последовательности в отношении каркаса У-области родственного мышиного антитела. Затем на компьютере моделируют третичную структуру мышиной У-области для визуализации аминокислотных остатков каркаса, которые, вероятно, взаимодействуют с мышиными СЭВ, и данные мышиные аминокислотные остатки затем накладывают на гомологичный каркас человека.
По данному двухстадийному подходу имеется несколько критериев для конструирования гуманизированных антител. Первым критерием является применение в качестве человеческой акцепторной части каркаса конкретного человеческого иммуноглобулина, который обычно гомологичен не относящемуся к человеку донорному иммуноглобулину, или применение консенсусного каркаса из многих человеческих антител. Вторым критерием является применение донорной аминокислоты вместо акцепторной, если человеческий акцепторный остаток не является обычным, а донорный остаток является типичным для последовательностей человека в положении конкретного остатка каркаса. Третьим критерием является применение донорного аминокислотного остатка каркаса, а не акцепторного, в положениях, непосредственно прилегающих к СЭВ.
Также можно использовать другой подход, описанный, например, Тетрек!, Вю1ес111'1о1оду 9: 266-271 (1991). По данному подходу каркасы У-области, происходящие из тяжелых и легких цепей №Е\УМ и ВЕ1, соответственно, используются для трансплантации СЭВ без радикального введения мышиных остатков. Преимущество применения данного подхода состоит в том, что трехмерные структуры вариабельных областей №Е\УМ и ВЕ1 известны из данных рентгеновской кристаллографии и, таким образом, могут легко моделироваться конкретные взаимодействия между СЭВ и остатками каркаса У-области.
Другие фрагменты
Моноклональные антитела согласно изобретению могут далее включать в себя другие фрагменты для выполнения требуемых функций. Например, антитела могут включать в себя фрагмент токсина (например, столбнячного токсина или рицина) или радионуклида (например, 1П1и или 90Υ) для уничтожения клеток, пораженных данными антителами (см., например, патент США 6307026). Антитела могут включать в себя фрагмент (например, биотин, флуоресцентные фрагменты, радиоактивные фрагменты, гистидиновую метку или другие пептидные метки) для простого выделения или детекции. Антитела могут также включать в себя фрагмент, который может продлевать их период полужизни в сыворотке, например фрагмент полиэтиленгликоля (РЕС).
Состояния заболевания и модели животных
Антитела согласно изобретению могут использоваться при лечении, включая профилактику, опосредованных ανβ6 заболеваний. Например, данные антитела могут использоваться для лечения фиброза (например, фиброза легких, острого повреждения легких, фиброза почек, фиброза печени, синдрома Альпорта и склеродермии) путем блокирования активации ТСЕ-β или блокирования связывания ανβ6 с любыми другими лигандами, такими как фибронектин, витронектин и тенасцин. Новизна данного подхода включает в себя следующее: (1) при нем блокируется активация ТСЕ-β, а не связывание ТСЕ-β с его
- 6 011853 рецептором, (2) при нем может ингибироваться ТСР-β местно (т.е. в участках положительной регуляции ανβ6), а не системно, и (3) при нем ингибируется связывание ανβ6 с лигандом. Кроме заболеваний или состояний фиброза, антитела согласно изобретению могут использоваться при лечении злокачественных опухолей или метастазов злокачественных опухолей (включая рост и инвазию опухоли), особенно эпителиальных раков. Подмножество эпителиальных раков включает в себя плоскоклеточную карциному, например рак головы и шеи, ротовой полости, молочной железы, легких, предстательной железы, шейки матки, глотки, толстой кишки, поджелудочной железы и яичников. Исследования авторов изобретения с использованием новых моноклональных антител против ανβ6 продемонстрировали, что ανβ6 высокоэкспрессирован во многих эпителиальных раках, особенно в наиболее выраженном участке опухолей. Новые антитела также могут использоваться в отношении многих других заболеваний, опосредованных ανβ6, включая псориаз.
Способы лечения согласно данному изобретению эффективны в отношении субъектов, являющихся людьми и животными, пораженных данными состояниями. Субъекты-животные, к которым может применяться данное изобретение, охватывают как домашних животных, так и скот, который держат в качестве любимцев или для коммерческих целей. Примерами являются собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи и козы.
Эффективность антител согласно изобретению может тестироваться на различных экспериментальных животных. Модели фиброза легких на мышах включают в себя индуцированный блеомицином (РШс1 е! а1., 1. С11П. 1иуек!. 107 (12): 1537-1544 (2001); аиб Миидег е! а1., выше) и облучением фиброз легких (Ртаико е! а1., Каб. Кек. 140: 347-355 (1994)). У обработанных блеомицином мышей экспрессия ανβ6 повышается в эпителиальных альвеолярных клетках легких. Но β6-нокаут-мыши защищены от индуцированного блеомицином повреждения и фиброза.
Модели фиброза почек на мышах включают в себя СОЬ4А3-/- мышей (см., например, Сокдгоуе е! а1., Атег. 1. Ра111. 157: 1649-1659 (2000), мышей с индуцированным адриамицином повреждением (^аид е! а1., К1биеу 1и!ета!юиа1 58: 1797-1804 (2000); Иетаи е! а1., №рйго1. И1а1. Тгаикр1аи!. 16: 147-150 (2001)), мышей бЬ/бЬ (21уабей е! а1., ΡΝΑ8 И8А 97: 8015-8020 (2000)) и мышей с односторонней закупоркой мочеточника (Родо е! а1., ЬаЬ. 1иуекйда!юи 81: 189А (2001); и Родо е! а1., 1оитиа1 οί 111е Атепсаи 8ос1е1у οί №р11го1оду 12: 819А (2001)). Во всех этих моделях у мышей развиваются повреждение и фиброз почек, что может прогрессировать в почечную недостаточность. ανβ6 положительно регулируется в эпителиальной выкладке восходящих и нисходящих трубочек почек СОЬ4А3-/- мышей, обработанных адриамицином мышей и мышей, которые претерпевают одностороннюю закупорку мочеточника. Вероятно, что экспрессия ανβ6 также возрастает при различных моделях повреждения почек.
Моноклональные антитела против ανβ6 также могут тестироваться на предмет их способности ингибировать рост, прогрессирование и метастазирование опухоли в таких моделях на животных, как стандартные модели опухолевого роста 1и у1уо и модели метастазирования. См., например, Коскете11 е! а1., ί. Ν!1. Саисег 1ик!. 49: 735 (1972); Сиу е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 12: 954 (1992); ХУускоГГ е! а1., Саисег Кек. 60: 2504 (2000); и ОГ! е! а1., Сигг. Вю1. 8: 1243 (1998). Значимые лиганды ανβ6 при раке могут включать в себя ТСР-β, который участвует в метастазировании (для обзора см. Акйигк! е! а1., Тгеибк ш Се11 Вю1оду 11: 844-851 (2001)), фибронектин и витронектин.
Эффективность способов лечения согласно изобретению можно измерять некоторым количеством доступных диагностических инструментов, включая физическую оценку, тесты крови, измерения протеинурии, уровня креатинина и клиренса креатинина, тесты функции легких, уровни азота плазмы крови и мочи (ΒυΝ), наблюдение и подсчет рубцов или фиброзных очагов повреждения, отложение внеклеточного матрикса, такого как коллаген, гладкомышечный актин и фибронектин, тесты функции почек, ультразвуковое исследование, магнитно-резонансные снимки (МК1) и КТ-сканирование.
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции согласно изобретению включают в себя одно или несколько антител согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые производные, необязательно с любым фармацевтически приемлемым носителем. Используемый в данном описании термин носитель включает в себя известные приемлемые адъюванты и носители.
Согласно изобретению фармацевтические композиции могут быть в виде стерильных препаратов для инъекций, например стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Данная суспензия может составляться по способам, известным в данной области, с использованием подходящих диспергирующих, увлажняющих и суспендирующих средств.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут вводиться путем перорального, местного, внутривенного, подкожного, внутрибрюшинного, внутримышечного, интрамедуллярного, внутрисуставного, интрасиновиального, внутригрудинного, интратекального, внутрипеченочного или внутричерепного введения, в зависимости от требований, или непосредственно местно в участках воспаления или опухолевого роста. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут также вводиться путем ингаляции, например посредством применения распылителя, ингалятора сухого порошка или ингалятора с отмеряемой дозой.
- 7 011853
Дозировка и мощность дозы антител согласно изобретению, эффективные для продукции требуемых эффектов, зависят от различных факторов, таких как природа подлежащего лечению заболевания, размер субъекта, цель лечения, конкретная используемая фармацевтическая композиция и решение лечащего врача. Уровни дозировки составляют примерно от 0,001 до 100 мг/кг массы тела в сутки, например примерно от 0,1 до 50 мг/кг массы тела в сутки подлежащего использованию соединения активного ингредиента. Например, антитело согласно изобретению вводят в дозе, изменяющейся от примерно 0,01 до примерно 20 мг/кг массы тела/сутки, например изменяющейся от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг массы тела/сутки, и с интервалами от 1 до 14 суток. В другом осуществлении антитело вводят в дозе от примерно 0,3 до примерно 1 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном введении. Еще в одном осуществлении антитело вводят в дозе от примерно 5 до примерно 12,5 мг/кг массы тела при внутривенном введении. В одном из осуществлений композицию антитела вводят в количестве, эффективном для обеспечения уровня антитела в плазме, равного по меньшей мере 1 мг/мл.
Способы диагностики
Антитела согласно изобретению могут использоваться для диагностики состояний заболевания, ассоциированных с измененными уровнями экспрессии ανβ6. Образец ткани из субъекта, такой как биопсия ткани, образец жидкости организма или лаваж (например, альвеолярный лаваж), может тестироваться в анализе захвата антигена, ЕБ18А, иммуногистохимическом анализе и т.п. с использованием антител. Образец ткани из нормального субъекта используют в качестве контроля.
При воплощении настоящего изобретения будут использоваться, кроме указанных иначе случаев, общепринятые способы клеточной биологии, культуры клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, белковой химии и иммунологии, которые относятся к данной профессиональной области. Такие способы описаны в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬота!оту Мапиа1, 2пб ебйюп (8атЬгоок е! а1., Ебк.), 1989; Ойдопис1еойбе 8уп!йек1к, (М.1. Сай, Еб.), 1984; патент США 4683195, выданный Ми1йк е! а1.; ШсШс Ас1б НуЬг1б17айоп, (Β.Ό. Натек апб 8.1. Нфдшк), 1984; Ттапкспрйоп апб Тгапк1айоп, (Β.Ό. Натек апб 8.1. Шддшк), 1984; СиЙите ок Ашта1 Се11к (Κ.Ι. Егекйпеу, Еб.), 1987; 1ттоЫНхеб Се11к апб Епхутек. 1КБ Ргекк, 1986; А Ртасйса1 Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошпд (Β. РегЬа1), 1984; Ме1йобк 1п Еп7уто1о§у, Уо1итек 154 апб 155 (ХУи е! а1., Ебк.), Асабетю Ргекк, Ыете Уотк; Сепе Тгапккег Уес1отк ког Маттайап Се11к (1.Н. МШег апб М.Р. Са1ок, Ебк.), 1987; 1ттипосйет1са1 Ме!йобк т Се11 апб Мо1еси1аг В1о1оду (Мауег апб Уа1кег, Ебк.), 1987; НапбЬоок ок Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек Ι-ΐν (О.М. ХУей апб С.С. В1аск\се1к Ебк.), 1986; Матри1айпд !йе Мойке ЕтЬгуо, 1986.
Кроме случаев, где оговорено иначе, все используемые в данном описании технические и научные термины имеют значения, сходные с теми, которые понимаются обычным специалистом в данной области, к которой относится данное изобретение. Типовые способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в данном описании, также могут использоваться при воплощении настоящего изобретения. Все публикации или другие ссылки, приведенные в данном описании, включены во всей своей полноте в качестве ссылки. В случае конфликта для контроля будет служить следующая спецификация, включающая в себя определения. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие. В пределах данного описания слово включать в себя или такие его варианты, как включает в себя или включающий в себя, как это понимается, подразумевает включение установленного объекта и группы объектов, но не исключение любого другого объекта или группы объектов.
Примеры
Следующие примеры предназначены для иллюстрации способов и материалов настоящего изобретения. Подходящие модификации и адаптации описанных условий и параметров, обычно встречающихся в области применения антител, которые очевидны специалистам в данной области, находятся в пределах существа и объема настоящего изобретения.
В следующих примерах получают β6-/- мышей, как это описано у Ниапд е! а1., в 1. Се11 Вю1. 133: 921 (1996). Рекомбинантный БАР человека приобретали у К & Ό 8ук!етк (Мхппеаройк, Миннесота). Антитело 10Ό5 приобретали у Сйетюоп (Тетеси1а, Калифорния). Гибридому Б230 приобретали в АТСС и секретируемое антитело очищали из надосадочной жидкости насыщенных культур путем аффинной хроматографии на иммобилизированном белке А. Определение изотипа антител проводили с использованием набора 18О8ТК1Р (Косйе П1адпокйск) в соответствии с инструкциями производителя. Трансфицированную β6 клеточную линию 8ХУ480 получали, как описано у ХУешаскег е! а1., в 1. Вю1. Сйет. 269: 6940-6948 (1994).
Пример 1. Получение трансфицированных β6 стабильных клеточных линий.
Трансфицированные β6 клетки МН 3Т3 и ЕБС-Р1 получали путем электропорации родительских клеточных линий ДНК-конструкциями, содержащими полноразмерную мышиную кДНК β6 и селективный маркер неомицин. Стабильно трансфицированные клетки отбирали путем пассирования клеток в культуральной среде, содержащей С418, в течение 14 суток с последующей сортировкой активированных флуоресценцией клеток (ЕАС8) для выделения клеток, экспрессирующих наивысший уровень поверхностного β6. Трансфицированные клетки ЕБС-Р1 культивировали в БМЕМ, дополненной 4 мМ Бглутамина, доведенной до содержания 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы и 1,0 мМ пирувата
- 8 011853 натрия, 10% РВ8, 2,5 добавки для культуры мышиного 1Ь-3 и 1,5 мг/мл активного 0418. Трансфицированные клетки ΝΙΗ 3Т3 культивировали в ΌΜΕΜ, дополненной 10% РВ8, 2 мМ Ь-глутамина, пенициллином/стрептомицином и 1 мг/мл активного 0418.
Пример 2. Очистка растворимого ανβ6.
Белок ανβ6 очищали, по существу, как описано выше ХУстасксг, выше. Культивировали клеточную линию СНО, экспрессирующую 115(/.,,(% и полученную в результате надосадочную жидкость собирали центрифугированием. Интегрин очищали путем аффинной хроматографии с использованием антитела против αν Ь230. Очищенное Ь230 перекрестно связывали с активированной СЫВг сефарозой 4В (81дша) в отношении 4,8 мг антитела/мл смолы. Надосадочную жидкость ανβ6 загружали в отношении 0,5 мг антитела/мл смолы на аффинную колонку с Ь230 и колонку промывали 10 объемами колонки с использованием каждый раз: (1) 50 мМ Тгк-С1, рН 7,5, 1М №С1, 1 мМ МдС12; (2) 50 мМ Тгк-С1, рН 7,5, 50 мМ №С1, 1 мМ МдС12; и (3) 10 мМ Να3ΡΟ4, рН 7,0. Η§ανβ6 элюировали 100 мМ глицина, рН 2,5 в 1:10 объема 1М Ν3ΡΟ4, рН 8,0. Белок диализовали против нескольких смен забуференного фосфатом солевого раствора (РВ8) и хранили при -20°С.
Пример 3. Иммунизация β6-/- мышей.
β6-/- мышей иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции (ΙΡ) 25 мкг очищенного рекомбинантного человеческого ανβ6, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (СРА) при объемном соотношении 1:1 в общем объеме 200 мкл. Альтернативно, β6-/- мышей иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции с 4х106 трансфицированными β6 клетками ΝΙΗ 3Т3, ресуспендированными в 100 мкл РВ8, дополненного 1 мг/мл СаС12 и 1 мг/мл МдС12, и тем же мышам делали инъекции в прилегающий участок 100 мкл СРА. Через 2 и 4 недели после первой иммунизации мышей сходным образом стимулировали теми же реагентами, за исключением того, что, вместо СРА, использовали неполный адъювант Фрейнда. Мышей забивали через 7 суток после окончательной стимуляции и определяли титры против β6 путем связывания сыворотки с очищенным рекомбинантным человеческим ανβ6 или с трансфицированными β6 клетками. В случае иммунизации мышей очищенным рекомбинантным человеческим ανβ6 мышей оставляли в покое на 3 месяца и повторно иммунизировали тем же антигеном, смешанным с 1ттипЕа5у (01адсп). За 3 суток до выделения селезенок для слияния гибридом мышей иммунизировали 12,5 мкг очищенного рекомбинантного белка ανβ6 человека путем внутрибрюшинной и внутривенной инъекций. В сутки слияния животных фиксировали, извлекали их селезенки и гомогенизировали их в суспензию единичных клеток. Спленоциты иммортализовали путем слияния с подлежащим селекции лекарственным средством клеточным партнером по слиянию.
Пример 4. Скрининг гибридом.
Две группы антител генерировали путем иммунизации β6-/- мышей. Один набор антител генерировали путем иммунизации растворимым человеческим укороченным ανβ6 (слияние #6). Другой набор антител генерировали путем иммунизации мышиными трансфицированными β6 клетками ΝΙΗ 3Т3 (слияние #7). Скрининг антител против ανβ6 проводили с использованием как основанных на клетках, так и бесклеточных анализов связывания и функциональных анализов, как это описано ниже. Начальная селекция позитивных клонов основывалась на связывании очищенного 1ΐ5(/.νβ6 и трансфицированных β6 человеческих и мышиных клеток (нетрансфицированные клетки в качестве контроля). Выбранные клоны размножали и конечные культуры повторно оценивали на предмет связывания с трансфицированными β6 и с нетрансфицированными клетками в анализе захвата клеток (пример 5Ь, см. ниже) (репрезентативные примеры показаны на фиг. 1А и 1В, где приставки 6. или 7. названий тАЬ, которые обозначают слияние 6 и слияние 7, соответственно, пропущены; см. также табл. 2 ниже). Некоторые антитела связываются преимущественно с трансфицированными β6 клетками, в то время как другие связываются с трансфицированными и с нетрансфицированными клетками, и это указывает на то, что лишь подмножество антител имеет предпочтение в отношении β6 (фиг. 1А и 1В). Дальнейший отбор основывался на способности антител блокировать связывание биотинилированного 1ΐ5(/.νβ6 и трансфицированных β6 мышиных клеток с ЬАР. Выбранные клоны субклонировали с использованием РАС8 и хранили замороженными до использования.
Моноклональные антитела подвергали скринингу на специфичность связывания с /νβ6, основываясь на их способности связывать трансфицированные β6 клетки и отсутствии связывания ими нетрансфицированных исходных клеток. Далее подтверждали, что моноклональные антитела представляют собой средства специфического связывания ανβ6 и не связываются с другими (/.„-интегринами и неспецифическими интегринами (т.е. не относящимися к αν интегринами, которые связываются с содержащими Κ.ΟΌ лигандами), основываясь на их неспособности связываться с клеточными линиями, экспрессирующими ανβ3, ανβ8, α5βι, ανβι или α5βι. Они включали в себя стабильные трансфицированные клетки, а также нетрансфицированные клеточные линии 1Υ, К562, 8ХУ480, ΝΙΗ3Τ3 и РБСР1.
Некоторые из антител, которые были депонированы в АТСС, перечислены ниже в табл. 1.
- 9 011853
Таблица 1
Депонированные гибридомы
Клоны гибридомы № АТСС Дата депонирования
6.1А8 РТА-3647 16 августа 2001 г.
6.2В10 РТА-3648 16 августа 2001 г.
6.369 РТА-3649 16 августа 2001 г.
6.866 РТА-3645 16 августа 2001 г.
6.2В1 РТА-3646 16 августа 2001 г.
6.2А1 РТА-3896 5 декабря 2001 г.
6.2Е5 РТА-3897 5 декабря 2001 г.
7.1610 РТА-3898 5 декабря 2001 г.
7.765 РТА-3899 5 декабря 2001 г.
7.1С5 РТА-3900 5 декабря 2001 г.
Пример 5. Анализы по скринингу и характеристике.
a. ЕБ18А ανβ6.
96-луночный планшет для микротитрования (Согшид СО8ТЛВ ЕЛ8У-\УЛ8Н) покрывали 50 мкл/лунка 5 мкг/мл 1§ανβ6 при 4°С в течение ночи. Планшет промывали буфером для промывки (0,1% Τ\νΕΕΝ-2Ο в РВ8) 4 раза в автоматическом устройстве для промывки планшетов. Затем добавляли 180 мкл/лунка 3% В8А в ТВ8 и инкубировали в течение 1 ч при 25°С для блокирования неспецифического связывания. Планшет промывали, как описано выше, и добавляли разведения гибридомной надосадочной жидкости (для анализов по скринингу) или очищенного антитела (для характеристики) в ТВ8, содержащем 1 мг/мл В8А, 1 мМ СаС12 и 1 мМ МдС12 (50 мкл/лунка). Планшет инкубировали в течение 1 ч при 25°С, промывали и затем инкубировали в течение 1 ч с 50 мкл/лунка конъюгированного с пероксидазой антитела козы против мышиных 1дС+А+М (Сарре1). Связанное антитело детектировали с использованием 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ). Связывание выявляли по поглощению, измеряемому при 450 нм.
b. Анализ захвата клеток.
96-луночный планшет для микротитрования покрывали 50 мкл/лунка раствора вторичного антитела (антитело осла против 1д6 мыши (1аск§оп 1ттипоге8еагс1); 5 мкг/мл, растворенного в 50 мМ бикарбонате натрия, рН 9,2) при 4°С в течение ночи. Планшеты промывали дважды 100 мкл/лунка буфера для анализа (ВРМ1+2% В8А) и затем блокировали 100 мкл/лунка буфера для анализа при 37°С в течение 1 ч. Для клеток ЕБС-Р1 и трансфицированных β6 клеток ЕОС-Р1 планшеты блокировали антителами против мышиных 1д (1аск§оп 1ттипоКе8еагсЬ; 20 мкг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре для снижения неспецифического связывания вторичным антителом Ес-рецепторов (пропускается для других клеточных типов). В то время, как планшеты блокировали, клетки метили 2 мкМ флуоресцентной меткой (Са1сет-АМ, Мо1еси1аг РтоЬек) в буфере для анализа при концентрации 5х106 клеток/мл. Клетки инкубировали с меткой в буфере для анализа при осторожном смешивании на водяной бане при 37°С в течение 15 мин, собирали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для анализа до 5х106 клеток/мл. После стадии блокирования буфер отбрасывали путем вытряхивания планшета и в планшет добавляли 25 мкл/лунка надосадочной жидкости или очищенного антитела. После 15 мин инкубации при 37°С добавляли 25 мкл/лунка меченых клеток и планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Планшет промывали 3-5 раз буфером для анализа (100 мкл/лунка) и фиксировали флуоресценцию, испускаемую захваченными клетками на планшете. Процент связывания определяли путем сравнения флуоресценции перед конечной стадией промывки (т. е. общего числа добавленных клеток) с таковой после промывки (т. е. связавшихся клеток).
c. ЕАС8.
Клетки собирали путем трипсинизации, 1 раз отмывали РВ8 и затем ресуспендировали в буфере для ЕАС8 (1Х РВ8, 2% ЕВ8, 0,1% №Ν3, 1 мМ СаС12 и 1 мМ МдС12). Затем 0,2х105 клеток инкубировали на льду в течение 1 ч в буфере ЕАС8, содержащем гибридомную надосадочную жидкость в общем объеме 100 мкл. После инкубации клетки отмывали 2 раза ледяным буфером для ЕАС8, ресуспендировали в 100 мкл буфера для ЕАС8, содержащего 5 мкг/мл антитела осла против мышиных 1д6 РЕ (1аск§оп 1ттипоК.е8еатсЬ) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Клетки затем дважды промывали ледяным буфером для ЕАС8 и ресуспендировали в 200 мкл буфера для ЕАС8. За связыванием меченного РЕ вторичного антитела следили путем проточной цитометрии.
й. Связывание биотин-115</.,-в6 с БАР.
96-луночные планшеты для микротитрования (Согпшд СО8ТАК. ΕΛ8Υ-\νΛ8Η) покрывали 0,3 мкг/мл
- 10 011853 рекомбинантного человеческого ЬАР (В & Ό ЗуДсшк. кат. номер 246-ЬР). разведенного в РВ8 (50 мкл/лунка) при 4°С в течение ночи. После того. как раствор для покрытия был удален. планшеты блокировали 180 мкл/лунка 3% В8А/ТВ8 при 25°С в течение 1 ч. В отдельном 96-луночном круглодонном планшете 60 мкл/лунка 2х маточного раствора (0,5 мкг/мл (1,25 нМ) биотинин-а^. 2 мМ СаС12 и 2 мМ МдС12 в ТВ8. содержащем 1 мг/мл В8А) совмещали с 60 мкл/лунка 2х маточного раствора гибридомной надосадочной жидкости (для скрининга) или очищенного антитела (также в ТВ8. содержащем 1 мг/мл В8А) и инкубировали при 25°С в течение 1 ч. После 4-кратной промывки покрытого ЬАР планшета буфером для промывки (0.1% Τ\νΕΕΝ-20 в РВ8) в автоматическом устройстве для промывки планшетов 100 мкл смеси антитело-а^р6 переносили в планшет и инкубировали в течение 1 ч при 25°С. Планшет промывали. как указано выше. и инкубировали с 50 мкл/лунка разведения 1:1000 конъюгата экстравидин-пероксидаза хрена (81дта) в ТВ8 (1 мг/мл В8А) в течение 1 ч при 25°С. Связанный белок детектировали с использованием субстрата ТМВ.
е. Адгезия клеток в6-ЕЭС-Р1 к ЬАР.
96-луночный планшет для микротитрования покрывали 50 мкл/лунка 0.5 мкг/мл рекомбинантного человеческого ЬАР (В & Ό 8ук1етк). разведенного в 50 мМ бикарбоната натрия. рН 9.2. при 4°С в течение ночи. Планшет дважды промывали РВ8 (100 мкл/лунка) и блокировали 1% В8А в РВ8 (100 мкл/лунка) в течение 1 ч при 25°С. Планшет промывали дважды 100 мкл/лунка буфера для анализа (полный ТВ8 плюс 1 мМ СаС12 и 1 мМ МдС12). Далее к отдельным лункам планшета добавляли 25 мкл гибридомной надосадочной жидкости (или очищенного антитела) и 25 мкл клеток р6-ЕПС-Р1 (5х106 клеток/мл. помеченных Са1сеш АМ. как описано выше). Планшет инкубировали при 25°С в течение 1 ч и затем промывали 4-6 раз буфером для анализа (100 мкл/лунка). Фиксировали флуоресценцию. испускаемую клетками. захваченными на планшет. Процент связывания определяли путем сравнения сигнала флуоресценции перед конечной стадией промывки (т.е. общего числа добавленных клеток) с таковым после промывки (т.е. связавшихся клеток).
ί. Биоанализ ТСЕ-β.
Используемый в данном описании биоанализ ТСЕ-β представлял собой вариант анализа в совместной культуре с эпителиальными клетками легких норки (МЬЕС) с РА1-1-люциферазой. описанный АЬе е1 а1.. в Апа1. Вюсйет. 216: 276-284 (1994). где трансфицированные β6 клетки совместно культивировали с репортерными клетками для мониторинга активации ТСЕ-β за счет ανβ6 (Мипдег. выше). Это количественный биоанализ ТСЕ-β. основанный на его способности индуцировать экспрессию ингибитора активатора плазминогена-1 (РА1-1). В данном анализе клетки МЬЕС стабильно трансфицированы экпрессирующей конструкцией. содержащей укороченный промотор РА1-1. слитый с геном-репортером люциферазы светлячка. Воздействие трансфицированных клеток МЬЕС на активный ТСЕ-β (от 0.2 до >30 пМ) приводит к зависимому от дозы повышению люциферазной активности в клеточных лизатах.
Для проведения данного анализа клетки ТМЬС (линия эпителиальных клеток легких норки Му 1 Ьи) трансфицировали конструкцией РА1-1-люцифераза. Трансфицированные клетки выращивали в ЭМЕМ+10% ЕВ8 с Ь-С1п. пен./стреп. и 200 мкг/мл С418. Клетки 8ν480. трансфицированные конструкцией интегрина β6 (клетки β6-δν480 или 8ν480 β6). выращивали в ЭМЕМ+10% ЕВ8 с Ь-С1п и пен./стреп. Клетки поднимали с флаконов посредством РВ8+5 мМ ЕЭТА. промывали в РВ8+0.5% В8А. подсчитывали в гемоцитометре и помещали в 96-луночные планшеты. Клетки 8ν480-β6 помещали в количестве 4х104 клеток/лунка в буфере для промывки. Моноклональные антитела разбавляли ЭМЕМ (бессывороточной). добавляли к клеткам 8ν480-β6 и предварительно инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляли клетки ТМЬС в количестве 2х104 клеток/лунка до конечного объема 100 мкл. Планшеты инкубировали в течение 20 ч в увлажненной. обогащенной СО2 атмосфере инкубатора. Надосадочную жидкость с планшетов отбрасывали и заменяли 100 мкл РВ8+1 мМ Са2+ и 1 мМ Мд2+. Клетки в планшетах затем лизировали и уровень люциферазной активности детектировали посредством набора Раскагб ЬИСМТЕ для реакций светового типа (#6016911) и люминометра для микропланшетов ТВОР1Х.
Пример 6. Очистка антител.
гибридомных клонов из слияния #6 (обозначенных приставкой 6) и 14 гибридомных клонов из слияния #7 (обозначенных приставкой 7) выбирали для дальнейшего размножения и характеристики (табл. 2).
Получали культуру малого масштаба (150 мл) каждой гибридомы и надосадочную жидкость собирали путем центрифугирования. Антитела очищали из данных образцов надосадочной жидкости с использованием аффинной хроматографии белком А. Для антител изотипа 1дС2а надосадочную жидкость загружали непосредственно на Рго1еш А 8ерйаго§е 4 ЕаЫ Е1о\г (Атегайат Рйагташа Вю1есй. АВ. Упсала. Швеция) (1 мл осажденного объема). Колонку промывали РВ8 и фракцию 1дС элюировали с использованием 25 мМ фосфорной кислоты. 100 мМ №С1. рН 2.8. в 1:20 объема 0.5М №3РО4. рН 8.6. Для мышиных антител 1дС1 надосадочную жидкость доводили перед загрузкой до рН 8.9. используя 1.5М глицин. 3М №С1. и колонку промывали 25 мМ №3РО4. 3М №С1. рН 8.6. перед элюированием. Данные препараты использовали для описанной в данном описании биохимической характеристики ш уйго.
- 11 011853
Таблица 2
Характеристика гибридомных клонов
Название клона Я’ клона Изотип Блокатор*
6.1А8 2 1д62а Υ
6.2В10 10 1дС2а Υ
6.369 25 1дС1 Υ
6.4В4 30 1д61 К
6.6В5 46 1дС1 N
6.8В4 55 1д61 N
б. 806 56 1д61 Υ
6.2В1 85 1дС1 Υ
7.1С5 2 1дС2а Υ
7.1610 5 1дС2а Υ
7.2А1 б 1дС2а Υ
7.2Г5 11 1^С2з Υ
7.2Н2 12 Υ
7.4АЗ 17 1дС2а Υ
7.7С5 32 1д61 Υ
7.8Н12 39 1д62а Υ
7.924 40 1д62а N
7.968 41 1д62а Υ
7.9Н5 43 1д62а Υ
7.10ϋ7 44 1д62а Υ
7.10Н2 46 1д62а Υ
*Блокатор определяется как антитело, которое блокирует связывание ανβ6 с БАР, что определено путем блокирования связывания лиганда 1ΐ5ανβ6 или экспрессирующих β6 клеток.
Для применения в экспериментальных животных гибридомные клоны постепенно размножали до 2 л среды и выращивали в течение 4 недель в ЫГсес11 СиНиге Вад§-РБ732 (№хе11, кат. № К4К2113). Антитела из гибридом сначала очищали путем аффинной хроматографии белком А, как описано выше, с последующей стадией ионообменной хроматографии на сефарозе О (АшегкИаш Рйагшас1а). Элюат хроматографической стадии с белком А доводили до значения рН 8,6 с использованием 2М основания Тп5. разведенного в 10 раз водой, и загружали на колонку с сефарозой О (20 мг белка/мл смолы), которую уравновешивали 10 мМ Ыа3РО4, 25 мМ ЫаС1, рН 8,6. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера для уравновешивания и связанный белок элюировали с использованием 25 мМ Ха3РО4, 150 мМ ЫаС1, рН 7,2. Элюированные белки стерильно фильтровали (0,45 мкм) и хранили при -70°С до использования.
Пример 7. Характеристика очищенных антител.
Очищенные антитела (табл. 2, см. выше) подвергали количественной характеристике в отношении их способности: (1) связывать Ηδανβ6, (2) связывать трансфицированные β6 клетки 8ХУ480 и РПС-Р1, (3) ингибировать связывание биотин-α,,β6 с БАР, (4) ингибировать связывание трансфицированных β6 клеток РЭС-Р1 с БАР и (5) блокировать опосредованную ανβ6 активацию ТОР-β в анализе МБЕС (выше). Относительную действенность по каждому из данных анализов сравнивали с таковой известного антитела против ανβ6 10Ό5 (Ниапд е1 а1, 1. Се11 8с1. 111: 2189 (1998)) и, в некоторых случаях, с антителом против αν Б230. Для характеристики антител слияния #7 в качестве положительного контроля также использовали антитело 6.806 слияния #6.
Эксперимент по первоначальному связыванию (пример 5а, выше), проведенный в присутствии 1 мМ Са2+ и 1 мМ Мд2+, показал, что большинство очищенных антител связывали 1ΐ5ανβ6 (фиг. 2А и 2В). Однако неожиданно не наблюдалось связывание 10Ό5 и клонов 7.2Е5 и 7.10Ό7. В последующем эксперименте установлено, что связывание 10Ό5 (фиг. 3Е), 7.2Е5 и 7.10Ό7 лишь слабо поддерживалось Са2+/Мд2+, но более сильно 1 мМ МпС12. Среди новых клонов три (6.1 А8 (фиг. 3А), 7.705 и 6.806 (фиг. 3С)) характеризовались требованием в отношении двухвалентных катионов, хотя не наблюдалось различия между со
- 12 011853 стоянием Са2+/Мд2+ и состоянием связывания Мп2+.
Оставшиеся клоны не характеризовались требованием к двухвалентным катионам, т.е. могли связывать антиген в присутствии 10 мМ ΕΌΤΑ (фиг. 3В, 3Ό и 3Р) . ЕЛС8-анализ связывания антител с трансфицированным β6 клетками ΝΙΗ 3Т3 или клетками 8ХУ480 выявил сходный профиль, за исключением того, что 10Ό5 в данном контексте связывался эквивалентно в состояниях Са2+/Мд2+ и Мп2+. Требования для связывания с растворимым ανβ6 могут отличаться от таковых для экспрессированного на клеточной поверхности ανβ6 вследствие отличия в конформации белка или эффектов авидности.
Данные результаты указывают на то, что в данной группе имеется по меньшей мере 3 различных класса блокирующих β6 антител. Один из данных классов (10Ό5) отличает условия Са2+/Мд2+ и Мп2+. Другой класс (включающий в себя 6.1А8, 7.705 и 6.806) требует наличия катионов, но не различает Са2+/Мд2+ и Мп2+. Последний класс (включающий в себя антитело против αν Ь230, 6.2В 10, 6.309 (фиг. 3В) и 6.2В 1 (фиг. 3Ό), 7.1С5 и 7.1010) является катионнезависимым.
Затем очищенные антитела оценивали на их способность ингибировать взаимодействие ανβ6-ΕΑΡ. В бесклеточном анализе по примеру 5й. см. выше, антитела 6.1 А8, 6.2В 1, 6.309 и 6.806 характеризовались значениями 1С50,меньшими, чем таковое для 10Ό5 (фиг. 4А; табл. 3). 6.2В 10 характеризовалось более высоким 1С50, но при этом давало полное ингибирование (фиг. 4А). 6.4В4 характеризовалось только частичным ингибированием, в то время как 6.6В5 и 6.8В4 не характеризовались ингибированием (фиг. 4А). С использованием той же системы для анализа антитела 7.1С5, 7.1010, 7.2А1, 7.4А3, 7.705, 7.908, 7.9Н5 и 7.10Н2 характеризовались значениями 1С50, меньшими, чем таковое для 10Ό5 (фиг. 4В; табл. 3). Антитела 7.2Е5, 7.2Н2 и 7.8Н12 характеризовались почти идентичными или более высокими значениями 1С50 и еще давали полное ингибирование (фиг. 4В).
В клеточном анализе, описанном в примере 5е выше, наблюдали сходную тенденцию, за исключением 6.1А8, 6.2В10 и 7.9Ό4, которые были менее действенными на клетках, чем очищенный белок (фиг. 5А-Е; табл. 3).
Все вместе, данные результаты указывают на то, что авторами изобретения успешно получены антитела, которые специфично ингибируют взаимодействие человеческого и мышиного ανβ6 с БАР. Некоторые из данных антител связывались с ανβ6 с высоким сродством (обнаруженные Кй>0,3 нМ, что определено путем проточной цитометрии), ингибировали связывание трансфицированных β6 клеток с БАР с 1С50>0,05 нМ (8 нг/мл) и предотвращали опосредованную ανβ6 активацию Τ0Ρ-β1 с 1С50>0,58 нМ (87 нг/мл).
Наконец, очищенные антитела оценивали на их способность блокировать опосредованную ανβ6 активацию Τ0Ρ-β в анализе гена репортера ΡΑΙ-1/люцифераза (пример 5ί, выше). Снова 6.309, 6.806, 6.2В1, 7.1010 и 7.705 были способны ингибировать опосредованную ανβ6 активацию Τ0Ρ-β со значениями 1С50, меньшими 10Ό5, в то время как оставшиеся антитела, как оказалось, были значительно менее действенными в данном анализе (фиг. 6А и 6В; табл. 3). Таким образом, способность блокировать взаимодействие ανβ6 с БАР коррелирует со способностью ингибировать активацию Τ0Ρ-β ш νίίτο.
Таблица 3
Характеристика гибридомных клонов
Название клона № клона ЕС50 ЕЫЗА связывания (нг/мл) 1С50 блокирования ανβ6-Ι,ΑΡ (нг/мл) 1С50 блокирования Г0СР1-ЬАР (нг/мл) 1С50 ΡΑΙ1люциферазы (нг/мл)
6.2В1 85 34,7 225 8 87
6.309 25 76,7 271 17 375
6.806 56 17,5 169 23 312
10ϋ5 - — 605 50 2070
6.1А8 2 3,7 179 2520 -40000
6.2В10 10 78, 9 1950 >30000 >40000
6.4В4 30 25,4 >50000 >30000 >40000
6.6В5 46 17, 1 >50000 >30000 >40000
6.8В4 55 94,4 >50000 >30000 >40000
1.230 — 27,1 229 п.Б.** η. Е.
7.1С10 5 4,2 113 30 250
7.705 32 13,0 155 51 700
7.1С5 32 2,5* 80* 83 ΕΪ . Ъ.
- 13 011853
7.2А1 6 5* 300* 101 п. Ь.
10Э5 - 43* 377 п.б. 2000
7.4АЗ 17 5,7 204 67 3500
7.10Н2 46 6,6 254 63 3500
7.2Н2 12 9,3 370 106 5500
7.9Н5 43 7,3 230 55 7000
7.9С8 41 6,2 264 284 >20000
7.8Н12 39 46.0 1140 969 >20000
7.2Г5 11 >5000 529 1490 >20000
7.904 40 1,7 Неполное >10000 >20000
7.1007 44 >5000 3000* 1120 η. б.
* Данные получены из разных экспериментов.
**Не тестировали.
***Все эксперименты, суммированные в табл. 3, проводили в присутствии 1 мМ Са2+ и 1 мМ Мд2'.
****Антитела, выделенные полужирным шрифтом, представляют собой антитела 10Ό5 и Ь230, известные ранее в данной области, и новые антитела с особо высокой ингибиторной силой в отношении ανβ6.
Затем значения сродства 6.309 и 6.806 в отношении растворимого ανβ6 определяли путем использования анализа кинетического исключения (ΚίηΕχΑ). Серию разведений растворимого интегрина (от 1 х 10-8 до 2,4х10-10М) инкубировали с 1х10-10М антитела в течение 3 ч. Данные образцы затем пропускали через гранулы полиметилметакрилата, покрытые интегрином, с использованием инструмента ΚίηΕχΑ (8ар1бупе 1п51гишсп15. 1пс., Во15С. Айдахо). В случае 6,806 в буферы для инкубации и анализа включали 1 мМ СаС12 и 1 мМ МдС12. Количество связанного и свободного антитела определяли с использованием меченного Су5 вторичного антитела против мышиных антител. Подгонку к кривой второго порядка проводили с использованием программного обеспечения ΚίηΕχΑ с получением константы диссоциации (Кб) для каждого взаимодействия. Кб, определенные с использованием данного способа, составляли 15,6 пМ для 6.309 и 22,8 пМ для 6.806 (фиг. 9А и 9В). Таким образом, оба данных антитела характеризовались очень высокими значениями сродства в отношении ανβ6.
Далее авторы изобретения идентифицировали классы антител против ανβ6, которые распознавали активированные состояния интегрина. Имеется два потенциальных активированных состояния ανβ6. В первом состоянии активированный интегрин определяется как имеющий более высокое сродство в отношении своего лиганда. Антитела, специфичные в отношении данного активированного состояния, характеризовались повышенным связыванием с данным интегрином в присутствии активирующих катионов, таких как 1 мМ МпС12. Сравнение степени связывания в 1 мМ МпС12 и 1 мМ МдС12 (неактивирующий катион) путем проточной цитометрии показало, что некоторые из описываемых в данном описании антител против ανβ6, включая 6.1 А8 и 6.6В5, характеризовались значительно повышенным связыванием в присутствии МпС12.
Во втором активированном состоянии ανβ6 интегрин может активировать латентный Τ0Ε-β, как описано выше. Получали клеточную линию, экспрессирующую укороченный ανβ6 (819480((/6-77(4)). Данная клеточная линия была способна связывать ЬАР, но не могла активировать Τ0Ε-β в анализе ТМЬС-люциферазы (Мипдег е( а1., выше). Антитела, которые связываются с трансфицированными полноразмерным β6 клетками 8^480, но не с трансфицированными укороченным белком клетками 770Т, таким образом, были специфичны к форме ανβ6, которая способна активировать Τ0Ε-β. Антитела 7.8В3 и 7.8 С9 удовлетворяли данным критериям.
Пример 8. Картирование эпитопов путем конкуренции антител.
Очищенные моноклональные антитела также тестировали на их способность конкурировать с 6.806 за связывание с биотинилированным ανβ6 в формате ЕЫ8А. В данном анализе 6.806 покрывали планшет для ЕЬ18А и смесь конкурирующего антитела и биотинилированного ανβ6 добавляли в буфер, содержащий Са2+ и Мд2+, по 1 мМ каждого. Связанный интегрин детектировали с использованием конъюгата экстравидин-НКР и конкурирующие антитела отмечали по их способности блокировать связывание. Все консенсусные блокаторы (табл. 2), кроме 6.2В 10 (слабый блокатор), как было показано, конкурируют в различной степени с 6.806 (табл. 4). Эти данные подтверждают, что эти консенсусные блокаторы связываются с одним и тем же эпитопом, что и 6.806, или с перекрывающимся с ним эпитопом.
- 14 011853
Таблица 4 Картирование эпитопов путем конкуренции антител
Клон Консенсусный блокатор? Конкуренция с 6-866
6.2Ά1 N -
6.4В4 N -
6.6В5 N -
6.8В4 N -
7.9ϋ4 Υ/Ν -
10Э5 Υ ++
В230 Υ ++
6.1А8 Υ
6.2В10 Υ(слабое) -
6.309 Υ +
6.806 Υ ++
6.2В1 Υ ++
7.1С5 Υ +++
7.1010 У +++
7.2А1 Ϊ ++
7.2Г5 Υ ++
7.2Н2 У ++
7.4АЗ У ++
7.705 Υ ++
7.8Н12 Υ ++
7.908 У ++
7 . 9Н5 Υ + +
7.1007 Υ +
7.10Н2 Υ ++
Очищенные моноклональные антитела тестировали на их способность конкурировать с биотинилированным 6.309 или биотинилированным 6.806 за связывание с ανβ6 в ЕЫ8Л. В данном анализе немеченым ανβ6 покрывали планшет для ЕЬ15А и смесь конкурирующего антитела и биотинилированного антитела добавляли в буфер, содержащий Са2+ и Мд2', по 1 мМ каждого. Связанное биотинилированное антитело детектировали с использованием конъюгата нейтравидин-НКР. Эти данные показали, что наиболее действенные блокирующие антитела (например, 6.2В 1, 7.1С5 и 7.1010) конкурировали как с 6.309, так и с 6.806 за связывание с ανβ6 (табл. 4.1 и фиг. 10А и 10В). Антитела 6.1 А8 и 7.705 характеризовались меньшей конкуренцией, возможно, вследствие более низкой аффинности в отношении ανβ6. Ни одно из неблокирующих антител, как и антитело против αν Ь230, не показало в данном анализе какойлибо конкуренции с 6.309 или 6.806. Эти результаты указывают на то, что специфичные в отношении ανβ6 блокирующие антитела связываются на ανβ6 с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами.
Таблица 4.1
Картирование эпитопов путем конкуренции антител
Клон Консенсусный блокатор? Конкуренция с био тинилиро ванным 6.866 Конкуренция с биотинилированным 6.369
6.359 Υ +++ ++ +
6.2В1 Υ + 4· + ++ +
6.856 Υ 4-4-4- ++
7.1С5 У 4-+4- +++
7.1610 Υ +++ +++
7.765 У ++ +
6.1А8 У ++ +
6.2А1 N -
6.2Е5 N -
6.262 N -
6.4В4 N -
7.8133 N -
7.869 N -
Ь230 Υ -
- 15 011853
Пример 9. Последовательности СОЯ.
Выделяли кДНК некоторых из очищенных моноклональных антител и определяли их последовательность с использованием стандартных способов, описанных в СоНдап е1 а1. (ебз), Сиггеп! Рго!осо1з ίη 1ттипо1оду, ^11еу, МеЛа, РА (2001). Предсказанные аминокислотные последовательности показаны на фиг. 7А и 7В.
Аминокислотные последовательности СОЯ тяжелых цепей антител с высоким сродством связывания 6.866, 6.1А8, 6.2В1, 6.369 и 6.2А1 и неблокирующего антитела 6.262 сравнивают следующим образом (тире означают пропуски).
СРН1
6.856 3ΥΤΕΤΡΥΑΜΗ (ЗЕО Ю N0: 1)
6.1А8 3ΥΤΕΤ0ΥΤΜΗ (5Е0 1И N0: 2)
6.2В1 СЕТЕЗКУУМЗ [ЗЕО Ιϋ N0: 3)
6.359 ОЕТЕЗЮТМЗ (5Е0 ιρ N0: 3)
6.2А1 ΟΥΡΕΝΝΡΙ,ΙΕ (ЗЕ2 ΙΡ N0: 49)
6.252 ΟΥΑΕΤΝΥΙΗΕ (ЗЕО ΙΡ N0: 50)
СРК2
6.856 νΐ3ΤΥϊ5ΝΤΝΥΝαΚΓΚ5 (3Ε0 Ιϋ N0: 4)
6.1А8 VIΡΤΥΥ6ΚΤΝΥΝ0ΚΕΕ6 (3Ε0 1И N0: 46)
6.2В1 3Ι335-53ΤΥΥΡΡ3νΚ6 (3Ε0 Ιϋ N0: 5)
6.369 3Ι330-5ΚΜΥΥΡΡΤνΚ6 (3Ε0 ΙΟ N0: 6)
6.2А1 νΐΝΡ536ΒΤΝΥΝΕΚΓΚ5 (3ΕΩ Ιϋ N0: 51)
6.252 νΐ3Ρ536ΙΙΝΥΝΕΚΓΚ6 СРЕЗ (3Ε0 ΙΡ N0: 52)
6.856 ССЬВНСРЕРЗЬКУАМРУ (3Ε0 Ιϋ N0: 7)
6.1А8 66ΕΚΚ0ΡΚΡ31ΚΥΑΜΡ3 (3Ε0 Ιϋ N0: 47)
6.2В1 ΟΑΙΥϋΟ— —ΥΥνΓΆΥ (8Ε0 Ιϋ N0: 8)
6.359 53ΙΥΡ6— —ΥΥνΓΡΥ (3ΕΩ ΙΡ N0: 9)
6.2А1 ΙΥΥ5ΡΗ — —-3ΥΆΜΡΥ <3Ε<2 Ю N0: 53)
6.252 ΙΡ-Υ36— —ΡΥΑΥΡΡ (3Ε0 ΙΟ N0: 54)
В 8ЕО Ш N0: 7 Я полужирным шрифтом (двенадцатый остаток) указывает на то, что данный остаток является предметом полиморфизма и может представлять собой, например, О.
Аминокислотные последовательности СОЯ легких цепей данных четырех антител с высоким сродством связывания и неблокирующего антитела 6.262 сравнивают следующим образом.
СРК1
6.866 ΚΑ3ΰεν3Τ33-ΥΞΥΜΥ (3Ε0 Ιϋ N0: 10)
6.1Α8 ΚΑ303ν3Ι3Τ-ΥΞΥΙΗ (3Εζ) Ιϋ N0: 48)
6.2Β1 3ΑΞ55ν338----УЬУ (3Ε<2 ΙΡ N0: 11)
6. ЗС9 3ΑΝ33ν338----УЬУ (3Ε0 ΙΡ N0: 12)
6.2Α1 ΚΑΒΙΡνΕΤΑνΆ (3Ε0 Ιϋ N0: 55)
6.252 ΚΑ3<2Αν«ΤΑνΑ (3Ε0 ΙΡ N0: 56) СРВ2
6.856 ΥΑ5Ν1Ε5 (3Ε0 ΙΟ N0: 13)
6.1Α8 УАЗИЬЕЗ (3Ε0 Ιϋ N0: 13)
6.2Β1 3Τ3ΝΙΑ3 (3Εζ) ΙΡΝΟ: 14)
6.359 ЗТЗЫЬАЗ (3Ε0 ΙΡ N0: 14}
6.2Α1 5Α3ΥΒΥΤ (3Ε0 ΙΡ N0: 57)
6.262 5Α3Υ0ΥΤ (3Ε0 Ю N0: 58) СРЕЗ
6.866 0НМИЕ1РЕТ (3ΕΏ ΙΡ N0: 15)
6. 1Α8 0Η5ΗΕΙΡΥΤ (3Ε<2 ΙΡ N0: 16)
6.2Β1 Η0Η53ΥΡΡΤ (ЗЕС ΙΡ N0: 17)
6.369 Η0Η3ΤΥΡΡΤ (3Εζ2 ΙΡ N0: 13)
6.2Α1 00ΗΥ6ΙΡΜΤ (3Ε<3 ΙΡ N0: 59)
6.262 ΟΗΗΥΰνΡΗΤ (5Ε<2 ΙΡ N0: 60)
- 16 011853
Как показано на фиг. 7А и 7В, тАЬ, которые входят в состав класса двухвалентных катионзависимых антител (например, 6.1А8 и 6.8Ο6), как кажется, содержат очень сходные аминокислотные последовательности внутри СОК, в то время как двухвалентные катионнезависимые тАЬ (например, 6.2В 1 и 6.3Ο9) содержат другой набор мотивов в своих СОК.
Действенность и специфичность моноклональных антител против ανβ6 может тонко управляться различными аминокислотными остатками. В случае 6.1 А8 и 6.8Ο6 аминокислотные последовательности вариабельных доменов очень сходны и содержат 10 различий аминокислот в тяжелой цепи, три из которых консервативны, и 11 различий аминокислот в легкой цепи. При этом данные антитела характеризуются тем, что имеют примерно 100-кратное различие в активности при анализах ίη νίίτο. Различия аминокислот распределены по вариабельным доменам полипептидной цепи, и данные остатки могут действовать поодиночке или синергически с остатками той же цепи или партнерской цепи, воздействуя на действенность антител. В тяжелой цепи 7 остатков расположены так, что они, вероятно, находятся в близком соседстве к ανβ6 или играют активную роль в его связывании.
КСЭ-Мотив был обнаружен в некотором количестве связывающих интегрины белков (лигандов). Данный мотив, как было показано, опосредовал их взаимодействие с интегринами путем непосредственного контакта со связывающим карманом на интегрине. Поскольку КСЭ сам по себе довольно обычен в связывающих интегрины белках, фланкирующие остатки по сторонам от данного мотива должны играть роль в придании взаимодействию интегрин-лиганд специфичности связывания. В 6.1 А8 и 6.8Ο6 один такой фланкирующий остаток находится в положении 101 в тяжелой цепи внутри СЭК3. Данный аминокислотный остаток фланкирует КСЭ-мотив и может располагаться в участке распознавания антигена, что вносит вклад в действенность и специфичность связывания.
Другие различающиеся остатки в пределах одних и тех же СОК тяжелой цепи 6.1 А8 и 6.8Ο6 включают в себя те, что находятся в положении 33 (СЭК1); в положениях 52, 57 и 65 (СЭК2) и в положении 115 (СЭК3). Другое различие в тяжелой цепи находится в положении 4 в каркасном участке 1, который близок к №концу. Данный остаток, как предсказано путем кристаллографических моделей, находится вследствие фолдинга вблизи СОК антитела и может играть важную роль в связывании ανβ6. Три оставшихся различия между 6.1 А8 и 6.8Ο6 представляют собой консервативные различия в положениях 20 (каркасный участок 1), 44 (каркасный участок 2) и 82 (каркасный участок 3).
Аминокислотные последовательности катионнезависимых антител также высоко гомологичны. Они могут подразделяться на два класса: те, что конкурируют с КСЭ-содержащим антителом 6.8Ο6 (т.е. 6.2В1, 6.3Ο9, 7.10Н2, 7.9Н5, 7.1С5, 7.1Ο10 и 7.4А3); и те, что не конкурируют с ним (т.е. 6.2А1, 6.2В10 и 6.4В4). Класс конкурирующих с 6.8Ο6 антител содержит мотив ΕΧΥ в СЭК3 тяжелой цепи, тогда как класс не конкурирующих антител не содержит его. Это различие указывает на то, что мотив ΕΧΥ важен для опосредования катионнезависимого связывания ανβ6. Кроме того, содержащий ΕΧΥ класс антител, возможно, связывается с эпитопом на ανβ6, который перекрывается с КСЭ-связывающим карманом, хотя и отличается от него. Антитела 6.2В 10 и 6.4В4 не содержат мотив ΕΧΥ и являются слабыми блокаторами ανβ6. Они, как было показано, связываются с частью ανβ6, подобной Ι-домену, и определяют еще один эпитоп, с которым связываются антитела против ανβ6. Интересно, что моноклональное антитело 6.2А1 принадлежит к катионнезависимому классу, но не содержит КСЭ-последовательности. как другие катионнезависимые тАЬ.
Моноклональное антитело 7.7Ο5 относится к катионзависимому классу. Однако последовательность легкой цепи 7.7Ο5 высоко гомологична катионнезависимому, связывающему Ι-домен антителу 6.2В10. Тяжелая цепь 7.7Ο5 также сходна с катионнезависимыми антителами в СЭК1. При этом его СЭК2 и СЭК3 ближе к таковым катионзависимого класса. Данное наблюдение указывает на то, что конкретные СЭК наделяют антитело специфичностью. Это особенно верно для СЭК3 тяжелой цепи, по-видимому, вследствие высокой степени изменчивости в пределах данной части антитела. Фактически, 2 из 3 катионзависимых и 7 из 9 катионнезависимых антител содержат последовательности СЭК3 тяжелой цепи, которые, вероятно, играют важную роль в распознавании ανβ6. Примечательно, что 7.7Ο5 не содержит мотива ΡΟΌ, но содержит мотив ΧΟΌ в СЭК2 его тяжелой цепи. Данный мотив ΧΟΌ может функционировать сходным с КСЭ образом и обеспечивать сродство/специфичность связывания 7.7Ο5.
Указанные выше наблюдения последовательностей и сделанные из них выводы обеспечивают основу для рационального конструирования конкретных аминокислотных последовательностей вариабельных областей, которые приносят конкретные свойства связывания.
Пример 10. Диагностические антитела.
Антитела, которые могут детектировать экспрессию ανβ6 в залитых в парафин срезах тканей или других образцах тканей, могут использоваться в качестве диагностических средств. Данные диагностические средства могут использоваться, например, для детекции положительной регуляции ανβ6 в срезах тканей при таких заболеваниях, как злокачественная опухоль или фиброз.
Для идентификации антител, которые детектируют ανβ6 в залитых в парафин тканях, авторы изобретения сначала подвергали панель антител скринингу на связывание очищенной путем ВЭЖХ субъединицы β6. Антитела, которые связывают данную субъединицу, вероятно, распознают линейные пептидные
- 17 011853 эпитопы, и поэтому ожидалось, что они имеют высокую вероятность успеха связывания в залитых в парафин тканях. Связывание с очищенной субъединицей β6 проводили с использованием формата ЕБ18А, идентичного тому, который был описан для измерения связывания ανβ6 (выше), за исключением применения очищенного интегрина β6, иммобилизованного на планшете, а не белка ανβ6. С использованием данного способа идентифицировали некоторое число антител слияния 6, способных связывать как очищенный белок ανβ6, так и очищенную субъединицу β6. См. ниже табл. 5, где приставка 6 в названии клона пропущена.
Таблица 5
Связывание антител с очищенным ανβ6 или очищенной субъединицей β6
Название клона Связывание с α»β6 Связывание с очищенной путем ВЭЖХ субъединицей Рб
1А1 + б
1А6 + -
1А11 + +
1Е1 + +
1Е6 + +
1Н10 +/- -
2А1 + 4-
2А10 - -
2В8 - -
2В10 + -
2С4 + +
2С7 + 4-
2Е5 + +
263 + -
ЗА6 + -
ЗВ1 + -
ЗВ2 + 4-
ЗВ11 + +
ЗС2 4- +
3ϋ5 4- -
змо + 4-
ЗЕ1 + -
363 - -
365 4- -
369 + -
Зн2 4- -
ЗН11 4- -
4А4 +/- +
4В2 4- -
4В4 + -
4В10 + -
4ϋ2 + -
4Е4 + +
463 + -
464 + 4-
4Н4 +
4Н12 4- -
5А2 + -
5В6 + +
5ϋ6 4- +
5ϋ8 - -
569 4- +
5610 + +
5Η3 + +
6Β1 + +
6Β5 + +
- 18 011853
6С4 + -
6ϋ12 + +
6Е6 + -
6Е10 + -
6СЗ +/- -
7С7 + +
7Е5 + -
7Г8 + -
8В4 + +
836 + -
9В5 + +
9В7 + +
9В9 + -
9В10 + -
9011 + +
9Е12 + +
9Г5 + +
9Е7 - -
931 + -
9Н11 + -
10А2 + -
10АЗ +/- -
10А4 + -
10А8 + -
10А9 + -
10В10 + -
1003 + -
ΙΟϋΙΙ + -
10Е4 + +
10Г1 + -
10Г12 + -
1061 + -
1032 - -
10Н11 + +
1А7 + -
Ю6 + -
Ю9 + -
1Г6 + -
2В1 + -
2Ω9 + +
232 + +
ЗЭ9 + +
ЗЕ5 + -
4312 + -
4Е6 + +
435 + -
5АЗ + -
5ВЗ + -
5В8 + +
5В9 + -
5Г7 + -
6С10 + +
608 + -
6Е4 + -
639 + -
6Н8 + +
6Н9 + -
7А5 + +
7А11 + -
7Б6 + +
739 - +
7НЗ + -
9А2 - -
9АЗ + +
9А4 - -
9А9 + -
9Ώ2 - -
903 - -
9Е4 - -
9Е1 + -
9Г12
9С11
10В5
10В7
10В9
10С5
10С7
10ϋ6
10Ε12
10Γ7 + /+ /+ /+ /+ /Как показано выше, некоторые антитела связывались с очищенной субъединицей β. Они с высокой вероятностью будут связывать денатурированный ανβ6 и, таким образом, могут использоваться при детекции ανβ6 в залитых в парафин срезах тканей. Оба типа антител использовали для окрашивания денатурированных, залитых в парафин трансфицированных в трансфицированных β6 клеток 8\У480 и нетрансфицированных исходных клеток, и данные показаны в табл. 6.
Для окрашивания залитых в парафин тканей или клеток предметные стекла с тканью вначале депарафинизировали путем инкубации в следующих растворах: (1) ксилол, 5 мин, дважды; (2) 100% этанол, 2 мин, дважды; (3) 95% этанол, 2 мин, дважды; (4) 50% этанол, 2 мин, единожды; и (5) дистиллированная вода, 2 мин, 1 раз. Затем предметные стекла инкубировали в растворе, состоящем из 200 мл метанола и 3 мл 30%-ной Н2О2, в течение 15 мин для блокирования эндогенной пероксидазы. Предметные стекла ополаскивали дважды в РВ8 в течение 2 мин каждый раз. Срезы парафина на предметных стеклах затем демаскировали посредством пепсина (2уте6 00-3009) в течение 5 мин при 37°С. Предметные стекла опять дважды ополаскивали в РВ8 в течение 2 мин каждый раз. Затем ткань на предметных стеклах блокировали авидином и затем биотином (Уес!ог 8Р-2001; Уес!ог ЬаЬога!опе8, ВшИидате, Калифорния), по 10 мин каждым при комнатной температуре с описанной выше промывкой между всеми инкубациями. После испарения блокирующего раствора с предметных стекол первичное антитело (культуральная надосадочная жидкость гибридомы), разведенное в РВ8/0,1% В8А, наносили на предметные стекла и инкубировали в течение ночи при 4°С.
На следующий день предметные стекла ополаскивали в РВ8, как описано выше. В это время получали раствор комплекса авидин-биотин-пероксидаза хрена (реагент АВС) следующим образом: 1 мл РВ8 смешивали с 20 мкл раствора А (1:50) и 20 мкл раствора В (1:50) из набора Уес!ог РК-6102 и смесь инкубировали перед использованием в течение 30 мин при комнатной температуре. В течение этого времени предметные стекла инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с биотинилированным антителом против мышиных антител (1:200) из набора Уес!ог с 15 мкл/мл нормальной сыворотки. Предметные стекла ополаскивали 2 раза в РВ8, 2 мин каждый раз. Затем описанный выше реагент АВС наносили на предметные стекла и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Предметные стекла ополаскивали опять, как описано выше. Затем субстрат (Уес!ог 8К-4100), 100 мкл ЭАВ (3,3'-диаминобензидин), наносили на предметные стекла и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. ЭАВ получали следующим образом: к 5 мл Н2О добавляли 2 капли маточного раствора буфера (Вийег 8!оск 8о1и!юи), хорошо смешивали; затем добавляли 4 капли маточного раствора ЭАВ, хорошо перемешивали и затем добавляли 2 капли раствора Н2О2, хорошо смешивали. Затем предметные стекла ополаскивали водой в течение 2 мин. После чего сигнал ЭАВ усиливали для всех предметных стекол с тканью следующим образом: промывали парафиновые срезы в 0,05М бикарбоната натрия, рН 9,6, в течение 10 мин; удаляли избыток буфера; наносили усиливающий раствор для ЭАВ на 15 с и затем быстро ополаскивали водой в течение 1 мин для остановки реакции. Затем предметные стекла окрашивали в гематоксилине Майера (обратное окрашивание ядра) в течение 1 мин. Предметные стекла ополаскивали в текущей воде в течение 1 мин и затем погружали в РВ8 на 1 мин, так что гематоксилин становился голубым. Затем предметные стекла опять ополаскивали в текущей воде в течение 1 мин, обезвоживали и очищали следующим образом: погружали в (1) 95% этанол на 1 мин, дважды; (2) в 100% этанол на 1 мин, дважды; и (3) в ксилол на 2 мин, дважды. Затем на предметные стекла помещали покровные стекла с использованием Регтоии!.
Результаты указывали на то, что антитела слияния 61А1, 2С4, 3В2, 3В11, 5Ό6, 5С9, 5НЗ, 6Ό12, 7С7, 9В5, 9В7, 9Ό11, 9Е5, 10Е4, 10Н11, 6Н8, 7А5, 7С9, 9А3, 2А1, 2Е5, 4Е4, 4Н4, 8В4, 2С2 и 4Е6, из которых все могли связываться с очищенной субъединицей β6 (табл. 5), действительно, сильно окрашивали погруженные в парафин трансфицированные β6 клетки 8^480, в то время как не окрашивали нетрансфицированные исходные клетки (табл. 6).
- 20 011853
Таблица 6
Связывание антител с погруженными в парафин клетками 8\У480
ю# Название клона Связывание с 5Η480/β6 Связывание с ЗИ480
1 1А1 +4-+ -
2 1А8 + +
3 1А11 + + -
4 1Е1 + -
5 1Е6 + + +
7 2А1 +++ -
10 2В10 - -
11 2С4 +++ -
12 2С7 - -
13 2Е5 +++ -
17 ЗВ2 +++ -
18 ЗВ11 ++ -
25 309 -
30 4В4 + +
33 4Е4 +++ -
35 404 - -
36 4Н4 +++ -
39 5В6 + -
40 5Ώ6 +++ -
42 509 +++ -
43 5010 - -
44 5НЗ +++ -
46 6В5 - -
48 6ϋ12 +++ -
52 7С7 ++ -
54 7Е8 - -
55 8В4 +++ -
56 806 - -
57 9В5 ++ -
58 9В7 ++ -
61 9ϋ11 ++ -
62 9Е12 + -
63 9Е5 ++ -
68 10АЗ - -
75 10Е4 +++ -
80 10Н11 ++ -
85 2В1 + +
87 202 +++ -
91 4Е6 +++ -
95 5В8 - -
98 6С10 + -
102 6Н8 ++ -
104 7А5 +++ -
107 709 + + + -
110 9АЗ +++ -
- 21 011853
Пример 11. Диагностика злокачественной опухоли.
ανβ6 обычно экспрессирован в здоровых тканях взрослых на незаметных или низких уровнях. Однако экспрессия ανβ6 положительно регулируется при повреждении, фиброзе или злокачественной опухоли (см., например, ТЬотак е! а1. 1. Шуей. ЭегтаЮ1оду 117: 67-73 (2001); ВгипЮп е! а1., №ор1айа 3: 215226 (2001); Адге/ е! а1., Ιπΐ. 1. Сапсег 81: 90-97 (1999); Вгеикк, 1. Се11 8с1епсе 108: 2241-2251 (1995)). Таким образом, антитела, которые специфически связываются с ανβ6, экспрессированным в залитых в парафин тканях, могут использоваться в стандартных способах иммуногистохимии для детекции экспрессии ανβ6 для диагностики фиброза, злокачественной опухоли и любых других заболеваний, в которых ανβ6 положительно регулируется.
Как описано выше, некоторые антитела согласно настоящему изобретению связываются с очищенным ВЭЖХ интегрином β6 и залитыми в парафин и фиксированными трансфицированными β6 клетками. Данные антитела, как было показано, также связываются с репрезентативными тканями плоскоклеточного рака и рака молочной железы при иммунном окрашивании. См., например, фиг. 8, где моноклональное антитело 6.2А1 использовали для того, чтобы показать относительное окрашивание залитых парафином тканей карциномы молочной железы и плоскоклеточной карциномы. Таким образом, данные новые антитела могут использоваться в качестве диагностических инструментов.
Пример 12. Эффекты блокирующих тАЬ против ανβ6 у мышей Альпорта.
Мыши с нокаутом коллагена 4А3 (СОБ4А3) (Альпорт) были установлены в качестве модели Ш у1уо фиброза почек, и их использовали для тестирования терапевтических эффектов фармакологических средств (выше). Авторы изобретения тестировали тАЬ 6.806 (катионзависимое) и 6.309 (катионнезависимое) у мышей Альпорта для определения того, будут ли они ингибировать фиброз, обычно наблюдаемый у мышей Альпорт в возрасте 7 недель. Как показано выше, эти два антитела, как обнаружено, ингибируют связывание ανβ6 с БАР и ингибируют активацию ТОЕ-β в биоанализе. Антитело 1Е6 применяли в качестве отрицательного контроля.
Мышам Альпорт в возрасте 3 недель вводили 3 раза в неделю внутрибрюшинные инъекции с одним из следующих антител: (1) 6.806, 4 мг/кг (7 мышей); (2) 6.309, 4 мг/кг (4 мыши) и (3) 1Е6, 1 мг/кг (6 мышей). Инъекции продолжали в течение 4 недель. Затем мышей забивали и извлекали их почки.
Залитые в парафин срезы почек получали, как описано выше, и затем окрашивали с целью детекции гладкомышечного актина, маркера миобластов и отложения матрикса при фиброзе почек.
Авторы изобретения обнаружили значимое снижение окрашивания гладкомышечного актина в интерстициальных и гломерулярных областях почек из мышей Альпорта, обработанных тАЬ 6.806 или 6.309, по сравнению с мышами, обработанными 1Е6.
На фиг. 11А и 11В показана точечная диаграмма окрашивания гладкомышечного актина в гломерулярных и интерстициальных областях почки Альпорта. Имело место значимо сниженное окрашивание гладкомышечного актина в почках мышей Альпорта, обработанных 6.806 и 6.309, по сравнению с мышами отрицательного контроля, обработанными 1Е6.
Пример 13. Эффективность тАЬ против ανβ6 при профилактике нефросклероза, индуцированного односторонней закупоркой мочеточника.
Авторы изобретения применяли другую модель прогрессии фиброза почек на мышах для тестирования противофиброзной эффективности 6.806 и 6.309. В данной модели на мышах мочеточник животного лигируют, что приводит к односторонней закупорке мочеточника (БИО). БИО вызывает прогрессирующий нефросклероз без быстрого развития почечной недостаточности у мышей, поскольку незакупоренная почка может относительно нормально поддерживать функцию почек. В то время как закупоренная почка претерпевает быстрый общий фиброз, незакупоренная почка претерпевает адаптивную гипертрофию.
Данное исследование подвергает морфометрическому количественному анализу воздействие обработки антителами против ανβ6 на индуцированный ИИО фиброз почек. Использовали мышей-самцов С57ВБ в возрасте 8-12 недель, без вирусных антигенов, массой 25,5±0,2 г (1аск§оп БаЬога!опе§, Ваг НагЬог, Мэн). Перед началом исследования мышам давали возможность акклиматизироваться в течение 7 суток. Мыши имели свободный доступ к рассеянному стандартному мышиному корму и стерильной воде во время периода акклиматизации и эксперимента. Периодически измеряли массу тела как часть мониторинга здоровья животных. Результаты показывали, что соответствующие по возрасту неоперированные мыши прибавляли примерно 10% массы тела в течение периода двухнедельного исследования. Мыши ИИО теряли примерно 9% массы тела на сутки 2, но постепенно компенсировали потерю массы на сутки 14. Данный профиль изменения массы, как оказалось, не зависел от терапевтической обработки.
Для индукции фиброза почек левый мочеточник асептически выделяли путем лапаротомии левее срединной линии под анестезией кетамином:ксилазином (100:10 мг/кг подкожно). Две плотные, закупоривающие лигатуры шелка 6-0 налагали на мочеточник на уровне нижнего края почки и мочеточник пересекали между лигатурами. Брюшную стенку закрывали швом Уюгу1 4-0, а кожу закрывали нейлоном 4-0. Животным давали возможность восстановиться на электрогрелке и давали подкожно 0,05 мг/кг бупренорфина 2 раза в сутки на сутки 0 и 1. Процедура была адаптирована по Ма е! а1., Клйпеу !п(. 53 (4): 937-944 (1998).
- 22 011853
Затем мышей подразделяли на следующие исследуемые группы.
Группа Обработка Доза п* (мг/кг, в-/б.)
1 6.806 (катион-зависимое тАЬ против α,,βθ) 4 9
2 6.309 (катионнезависимое тАЬ против Οίνββ) 4 8
3 1Е6 (тАЬ отрицательного контроля) 4 10
4 РВ5 - контрольный носитель (ЮОмкл) 8
5 Неоперировэнный, необработанный контроль — 8
*Число животных.
Все животные, кроме группы 5, получали дозу 2 раза в неделю, начиная с суток до хирургического вмешательства.
Затем животных подвергали эвтаназии диоксидом углерода на 10 сутки после лигирования и подвергали диссекции. У мышей ИИО почечная лоханка и мочеточник были заметно вздуты и полны жидкостью над закупоривающей лигатурой. Степень вздутия и степень оставшейся массы почечной ткани варьировали в группах обработки. Группа 2 характеризовалась вздутием, примерно вполовину большим по сравнению с группами отрицательного контроля. Лигированные почки были бледного цвета.
Противоположные почки были ярко-красными и увеличенными примерно на треть.
Далее, обе почки (левая лигированная, правая нелигированная) животных удаляли и рассекали поперечно через центр почечной лоханки. Половину каждой почки помещали в 10% нейтрально забуференный формалин для окрашивания фиксированной ткани. Другую половину каждой почки помещали в 15% сахарозу, затем в 30% сахарозу для иммуногистохимического окрашивания.
Фиксированные формалином срезы почки подвергали иммунному окрашиванию на выявление миофибробластов (гладкомышечного актина), маркеров фиброза. Снимки делали с использованием стандартизованных условий освещения и настроек экспозиции цифровой камеры, откорректированных для фона, и с калибровкой удаленными стандартами. Снимки протяженных полей, покрывающих срез целой почки, получали от каждого животного для количественного анализа.
Гладкомышечный актин выражали как процент от общей площади ткани в пределах измеренных полей. Они включали в себя всю корковую и медуллярную ткань из среза, за исключением почечного сосочка.
В итоге, мыши, обработанные 6.309 и 6.806, характеризовались существенным снижением фиброза.
Пример 14. Эффективность блокирования тАЬ против ανβ6 индуцированного блеомицином фиброза легких у мышей.
Индуцированный блеомицином фиброз легких у мышей принимали в качестве модели фиброза легких ίη νίνο и применяли для тестирования терапевтических эффектов фармакологических средств. Воспаление обычно видно через 5-15 суток после обработки блеомицином. У мышей линии 129 степень фиброза легких прогрессивно возрастает в течение периода не более 60 суток после обработки блеомицином. Накопление матрикса обычно становится выявляемым примерно на 15 сутки. В данном примере тАЬ 6.309 вводили внутрибрюшинной инъекцией в концентрации 4 мг/кг/доза мышам с индуцируемым блеомицином фиброзом легких, начиная с суток 0 или с суток 15, по 3 раза в неделю. Фиброз легких индуцировали на сутки 0 путем введения единственной внутритрахейной дозы блеомицина в концентрации 0,03 ед./кг в 50 мкл стерильного солевого раствора. Животных забивали на сутки 30 и оценивали степень фиброза легких. Антитело 1Е6 использовали в качестве отрицательного контроля.
От каждого животного забирали легкие и измеряли содержание гидроксипролина в качестве индекса отложения коллагена в легких, как описано в Мцпдег с1 а1., выше. Как показано на фиг. 15А, обработка 6.309, начавшаяся на сутки 0, значимо ингибировала индуцированное блеомицином повышение содержание гидроксипролина в легких. Важно то, что обработка 6.309 была, по меньшей мере, столь же эффективной, когда начиналась через 15 суток после введения блеомицина, в момент, когда уже началось отложение коллагена.
Авторы изобретения оценивали эффекты 6.309, катионзависимого 6.806 и неблокирующего антитела 6.4В4 по ингибированию более существенных степеней фиброза легких в продленном протоколе индуцированного блеомицином фиброза (длится 60 суток). Для этого авторы изобретения начинали обработку антителами через 15 суток после введения блеомицина (сутки 15). Затем легкие отбирали на сутки 60 для определения содержания гидроксипролина. Как показано на фиг. 15С, обработка 6.806 значимо ингибировала индуцируемый блеомицином фиброз (более 70% снижения в содержании гиброкси
- 23 011853 пролина по сравнению с животными, обработанными блеомицином и солевым раствором). Обработка 6.3С9 также показала тенденцию к защитному эффекту, но данные результаты не достигали статистической значимости (фиг. 15С).
В итоге, как катионзависимые, так и катионнезависимые антитела, блокирующие ανβ6, снижали фиброз легких у мышей, обработанных блеомицином. Более того, данное вмешательство было эффективным, даже когда обработка антителами не начиналась после первоначального приступа фиброза.
Пример 15. Положительная регуляция ανβ6 в псориазных очагах повреждения у человека.
Для определения того, вовлечен ли ανβ6 в псориаз, оценивали экспрессию ανβ6 в биопсиях кожи с очагами повреждения и без них от 5 пациентов с псориазом и 4 нормальных субъектов. С использованием иммунного окрашивания тАЬ 6.2А1 авторы изобретения обнаружили значимое повышение экспрессии ανβ6 в псориазных очагах повреждения по сравнению с неповрежденной кожей пациентов с псориазом и нормальными контрольными субъектами. Таким образом, положительная регуляция ανβ6 в псориазных очагах повреждения указывает на диагностическое и терапевтическое приложения использования антител против ανβ6.
Пример 16. Положительная регуляция ανβ6 у мыши и человека с заболеванием желчного протока.
Как описывалось ранее, экспрессия ανβ6 имела отношение к повреждению ткани. В данном исследовании экспрессию ανβ6 исследовали в печени мыши и человека, поврежденной заболеванием желчного протока.
Повреждение печени у мышей индуцировали путем лигирования желчного протока. См., например, Сеогде е! а1., ΡNΑ8 96: 12719-24 (1999); Сеогде е! а1., Ат I Ра11ю1 156: 115-24 (2000). С использованием тАЬ 6.2С2 авторы изобретения обнаружили, что экспрессия ανβ6 значительно повышалась на сутки 9, 14 и 16 после лигирования желчного протока.
Сходным образом, срезы печени человека от пациентов с заболеванием желчного протока характеризовались положительной регуляцией экспрессии ανβ6, что определено путем иммуногистохимии с использованием тАЬ 6.2С2. Повышенную экспрессию ανβ6 наблюдали, например, в образцах печени от мужчины в возрасте 44 лет с острым холестазом, мужчины в возрасте 59 лет после пересадки, с острой закупоркой желчного протока, мужчины в возрасте 22 лет с атрезией желчного протока и мужчины в возрасте 24 лет с хронической закупоркой желчного протока.
В итоге, новые антитела против ανβ6 являются полезными в качестве средства диагностики и терапии заболеваний печени.
Пример 17. Положительная регуляция ανβ6 при различных злокачественных опухолях человека.
Интегрин ανβ6 обычно экспрессирован в тканях здоровых взрослых людей на уровнях от незначительных до низких. Различные опухолевые ткани человека оценивали на предмет экспрессии ανβ6 с использованием антитела 6.2А1 и способов, в основном, описанных в данном описании. Результаты показывали, что экспрессия интегрина ανβ6 значимо повышенно регулировалась при некоторых эпителиальных раках человека. Примечательно, что имммуногистология выявила особо выраженную экспрессию ανβ6 на краях опухолевых островков при многих эпителиальных раках. Для дальнейшего исследования экспрессии ανβ6 в эпителиальных раковых клетках клетки Детройт 562 (карцинома глотки) и клетки 8СС-14 (плоскоклеточная карцинома языка), а также клетки 8ХУ480 β6 (см. выше) окрашивали 6.3С9 и 6.4В4 и анализировали путем проточной цитометрии.
На правой стороне фиг. 12 показана экспрессия ανβ6 в разных опухолевых клеточных линиях, на что указывает связывание 6.3С9 при сортировке активированных флуоресценцией клеток (РАС8). Закрашенный пик представляет собой связывание 6.3С9, в то время как незакрашенный пик представляет собой фоновое связывание одного вторичного тАЬ. График линии на левой стороне фиг. 12 показывает ингибирование связывания опухолевых клеточных линий с лигандом БАР за счет повышающихся концентраций 6.3С9 или 6.4В4. 6.4В4 был существенно менее мощным ингибитором связывания ανβ6 с БАР по сравнению с 6.3С9 (>10-кратного 1С50 для Детройт 562, >30-кратного 1С50 для 8ХУ480 β6 и >100-кратного 1С50 для 8СС-14). Это согласуется с предыдущими результатами, полученными ш У11го, которые указывают на то, что 6.3С9 представляет собой мощное блокирующее тАЬ, а 6.4В4 представляет собой слабое блокирующее тАЬ. Эти данные также согласуются с малозначительной ингибирующей активностью 6.4В4 в детройтской модели ксенотрансплантата (фиг. 14В). На фиг. 13 далее показано относительное ингибирование связывания опухолевых клеточных линий с БАР различными тАЬ против ανβ6. Как 6.3С9, так и 6.8С6 характеризовались эквивалентной ингибирующей активностью (в соответствии со всеми предыдущими данными), в то время как 6.4В4 было существенно менее мощным ингибитором связывания ανβ6 с БАР.
Пример 18. Эффекты блокирующих тАЬ против ανβ6 на модели ксенотрансплантата опухоли человека.
Животные с иммунодефицитом (например, голые мыши и 8СШ-мыши), которым пересаживали ксенотрансплантат опухоли человека, были приняты в качестве подходящей модельной системы ш у1уо для тестирования терапевтических эффектов противораковых средств (см., например, уаи ^еетбеи е! а1., Ргок!а!е 43 (4): 263-71 (2000); Ваикей е! а1., Ргои!. Вюкск 7: с. 44-62 (2002)). Таким образом, блокирующие
- 24 011853 моноклональные антитела против ανβ6 по настоящему изобретению могут тестироваться ш νίνο на модели ксенотранспланатата на их способность ингибировать опухолевый рост. В данном эксперименте авторы изобретения тестировали способность некоторых из новых антител против ανβ6 ингибировать опухолевый рост у бестимусных голых самок мышей, которым пересаживали ксенотранспланат рака глотки человека (клеточная линия Детройт 562).
Для этого клетки Детройт 562 (АТСС) пассировали ш νίίτο в минимально необходимой среде (Еад1е) с 2 мМ Б-глутамином и В88 Эрла, доведенной до содержания 1,5 г/л бикарбоната натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 1,0 мМ пирувата натрия, и 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, без антибиотиков. Примерно 5х106 клеток/0,2 мл среды (без сыворотки) имплантировали подкожно голым мышам в правый бок. Через 3-4 суток начались измерения размера опухоли и продолжились до достижения опухолями размеров примерно 5 мм (в длину) на 5 мм (в ширину). Мышей разделяли случайным образом и подвергали внутрибрюшинной инъекции тестируемыми антителами или контрольными растворами на сутки 1, с последующими 3 инъекциями еженедельно в течение периода 33 суток. Тестируемые антитела и контрольные растворы представляли собой: (1) 6.309, 1 мг/кг, 10 мышей; (2) 6.309, 4 мг/кг, 10 мышей; (3) 6.309, 10 мг/кг, 10 мышей; (4) 6.4В4, 1 мг/кг, 10 мышей; (5) 6.4В4, 4 мг/кг, 10 мышей; (6) 6.4В4, 10 мг/кг, 10 мышей; и (7) раствор носителя (РВ8), 0,2 мл/на мышь, 30 мышей. Кроме того, 10 мышам подкожно вводили цис-платину в дозе 2 мг/кг в качестве химиотерапевтического контроля. Инъекции цис-платиной проводили на сутки 1 и затем каждые 2 суток, в общем, за 6 введений. В конце периода 33 суток измеряли массы животных и размеры опухолей, оценивали экспрессию ανβ6 путем иммуногистологии и измеряли уровни антител против ανβ6 в сыворотке.
Иммуногистологическое окрашивание показало, что имплантированные опухолевые клетки сильно экспрессировали ανβ6 ш νίνο. Данные по массе опухоли далее показали, что блокирующее тАЬ 6.309 эффективно ингибировало опухолевый рост во всех трех тестируемых концентрациях (фиг. 14А). Слабо блокирующее тАЬ 6.4В4, наоборот, не ингибировало опухолевый рост (фиг. 14В).
В сумме блокирующие антитела ингибировали опухолевый рост у обработанных мышей на 40-50%. Слабо блокирующее антитело против ανβ6, наоборот, не ингибировало опухолевый рост.
Пример 19. Интернализация антител против ανβ6.
Антитела, которые интернализуются клетками, имеют преимущество для некоторых клинических приложений, таких как злокачественные опухоли, поскольку данные антитела могут затем конъюгироваться с токсинами, радиоактивными соединениями или другими противораковыми средствами для селективного нацеливания и ингибирования роста раковых клеток. Способность антител против ανβ6 интернализоваться исследовали в клетках 8У480 β6 (см. выше) и 8СС-14.
Клетки разделяли 1:5 и высевали на 4-камерные стеклянные предметные стекла для инкубации в течение ночи при 37°С, 5% СО2. На следующие сутки тАЬ 6.806, 6.1А8, 6.309, 7.1С5, 6.4В4, 10Ό5 и 8В3 разбавляли до конечной концентрации 20 мкг/мл. тАЬ или только среду добавляли в подходящие лунки. Временной курс интернализации длился от 0 до 48 ч. Включенные в исследование временные отрезки составляли 0, 5, 10 и 30 мин и 1, 4, 24 и 48 ч. Вторичное антитело (антитело против мышиных антител А1еха 594) добавляли в качестве отрицательного контроля.
Интернализацию останавливали после каждого временного отрезка путем удаления антитела и промывки слоя клеток буфером. Агглютинин зародыша пшеницы А1еха-488 добавляли в течение 20 мин при 18°С для окрашивания внешней границы клеток зеленой флуоресценцией. После промывки клеток добавляли раствор СуЮПх/СуЮрегт на 20 мин при 18°С для фиксации и обеспечения проницаемости клеток. Клетки опять промывали и добавляли вторичное антитело против мышиных антител А1еха 594 (красная флуоресценция) на 20 мин при 18°С для мечения связанного или интернализованного мышиного антитела против ανβ6. Клетки затем промывали и фиксировали путем добавления 2% параформальдегида и оценивали путем конфокальной микроскопии. Затем снимали изображения путем объектива Бей/ Ρ1аη-Αροсй^οтаί^с 63х (1,32 числовая апертура, масляная иммерсия) (Бека) с цифровым увеличением 2х. Каждая рамка представляла собой один оптический срез от среднего среза клеток, которые наблюдали на предмет интернализации при всех условиях. В ядре окрашивания не наблюдалось.
Интернализацию наблюдали для катионзависимых тАЬ (содержащих Β0Ό миметиков лиганда), таких как 6.806 и 6.1А8. Для катионнезависимых тАЬ, таких как 6.309, 7.1С5 и 6.4В4, интернализации не наблюдалось.
- 25 011853
Список последовательностей <110> ΒΙΟΟΕΝ, 1ИС.
ТНЕ ΗΕΟΕΝΤ5 ОР ТНЕ Ш4ШЕН51ТУ ОГ САЫГ0КЙ1А <12 0> АНТИТЕЛА ПРОТИВ АЛЬФА-У БЕТА-6 <130> А136РСТ <140> РСТ/иЗОЗ/08048 <141> 2003-03-13 <150> 60/364,991 <151> 2002-03-13 <150> 60/426,286 <151> 2002-11-13 <160* 64 <170> РабепбШ Уег. 2,1 <210 1 <211> 10 <212> Бедок <213> Ното зархепз <400> 1
Зег Туг ТЬг РЬе Тйг Азр Туг А1а Меб Н1з
10 <210> 2 <211> 10 <212> Белок <213> Ното зартепЗ <400> 2 йег Туг ТЪг РЬе ТЬг Азр Туг ТЬг Меб ΗΪ3 15 10 <210> 3 <211> 10 <212> Белок <213> Ното зарбепе <400?· 3
С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Агд Туг Уа1 Меб Зег
10 <210> 4 <211> 17 <212> Белок <213? Ното зар1епз
- 26 011853 <400> 4
Уа1 Не Зег ТЬг Туг Туг С1у Азп
5
С1у
ТЬг Азп Туг Айп 01П Ьуз РЬе Ьуз 10 15 <210 5 <211> 16 <212> Белок <213> Ното Баргепз <400> 5
Зег 11е Зег Зег <31у С1у Зег ТЬг
5
Туг Туг Рго Азр Зег Уа1 Ьуз <31у
15 <210> 6 <211> 16 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 6
Зег 11е Зег Зег <31у С1у Агд Мек
5
Туг Туг Рго Азр ТЬг УзЬ Ьуз С1у
15 <210> 7 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <220>
<221 > МОР^КЕЯ <222> (12) <223> Агд ог <31п <400> 7
П1у С1у Ъеи Агд Агд 01у Азр Агд
5
Туг
Рго Зег Ьеи Хаа Туг А1а Мек Азр
15 <210> 8 <211> 12 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 8 <31у А1а 11е Туг Азр 01у Туг Туг
5
Уа1 РЬе А1а Туг <210> 9 <211> 12
- 27 011853 <212> Белок <213> Нолю аар1епз <4ΰ0> 9
61у Бег 11е Туг Азр 51у Туг Туг ν&1 РЪе 10 Рго Тух
1 5
<210> 10
<211> 15
<212> Белок
<213> Ното зар1епз
<400> 10
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег ТИх Зег Зег Туг Зег
1 5 10
<2Ю> 11
<211> 12
<212> Белок
<213> Ното зарьепз
<400> 11
Зег А1а Зег Зег Зег 7а1 Зех Зег Зег Туг Ьеи Туг
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212* Белок
<213> Ното варгепз
<400> 12
Бег А1а Азп Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи Туг
1 5 Ю
<2Ю> 13 <211> 7 <212> Белок <213> Ното еарЗепз <400> 13
Тух А1а Зег Азп Ьеи О1и Зег
5 <210> 14 <211> 7 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 14
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А 1а Зег
5
- 28 011853 <210> 15 <211> 9 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 15 <31η ΗΪ3 Азп Тгр С1и Не Рго РЬе ТЬг
5 <210> 16 <211> 9 <212 > Белок <213> Ното варБепз <400> 16 □1п Ндз Бег Тгр С1и 11е Рго Туг ТЫ
5 <210> 17 <211> 9 с212> Белок <:213> Ното заргепэ <400> 17 (51п Тгр Зег Зег Туг Рго Рго ТЫ
5 <210> 18 <211> 9 <212> Белок <213> Ното зардепз <400> 16
ΗΪ3 С1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго Рго ТЫ
5 <210> 19 <211> 126 <212> Белок <213> Ното вардепз <40ΰ> 19
01п Уа1 <31п РЬе <Э1п 61п Зег О1у Рго С1и Ьеи Уа1 Агд Рго <31у Уа1
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз <Э1у Зег Зег Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
ТЫ Мее ΗΪ5 Тгр Уа1 Ьуз Ьеи Зег ΗΪ3 А1а Ьуз ТЫ Ьеи <71и Тгр 11 е
35 40 45
С1у Уа1 11е Азр ТЫ Туг Туг <31у Ьуз ТЫ Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе
55 60
- 29 011853
С1и 65 Е1у Ьув А1а ТЫ МеЕ 70 ТЫ Уа1 Азр Ьуз Зех 75 Зег Зег ТЫ А1а Туг 80
МеЕ Азр Ьеи А1а Агд 05 Ьеи ТЬГ Зег С1и Азр 90 Зег А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Агд С1у <21у 100 РЬе Агд Агд С1у Азр 105 Агд Рго Зег Ьеи Агд 110 Туг А1а
МеЕ Азр Зег Тгр (31у С1п Й1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125 <210> 20 <211> 125 <212 > Белок <213> Ното заргепз
<400> 20 С1и Ьеи Уа1 Агд Рго <31у νβΐ
<31п 1 Уа1 С1п Ьеи ΰΐη 5 С1п Зег С1у Рго
10 15
Зег Уа1 Ьуз Пе Зег Суз Ьуз С1у Зег Зег Туг ТЬг РЬе ТЫ Азр Туг
20 25 30
А1а МеЕ Нхз Тгр Та1 Ьуз Ьеи Зег ΗΪΒ А1а Ьуз Зег Ьеи 31и Тгр 11е
35 40 45
<31у Уа1 Не Зег ТЬг Туг Тух С1у Азп ТЬг Азп Туг Азп 31п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз 31у Ьуз А1а ТЬг МеЕ ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЕ С1и Ьеи А1а Агд Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд *31у 01у Ьеи Агд Агд <31у Азр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а
100 105 110
МеЕ Азр Туг Тгр С1у С1п 31у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125 <210> 21 <211> 126 <212> Белок <213> Ното заргепз
<400> 21
С1п ν&1 С1п Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи ν&ι Агд Рго О1у Уа1
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз 11е Зег Суз Ьуз <31у Зег Зег Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
А1а МеЕ ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз Ьеи Зег Нгз А1а Ьуз Зег Ьеи С1и Тгр 11е
40 45
- 30 011853
С1у Уа1 50 Не Зег ТЫ Туг Туг 55 О1у Азп ТЬг Азп Туг 60 Азп С1п Ьуз РЬе
Ьуз 65 С1у Ьуз Л1а ТЬг Ме! 70 ТЬг Уа1 Авр Ьув Бег 75 Бег Зег ТЬг А1а Туг 80
Мее О1и Ьеи А1а Агд 85 Ьеи ТЬг Зег О1и Азр 90 Бег А1а Уа1 Туг Туг 95 Суд
А1а Агд С1у 01у 100 Ьеи Агд Агд О1у Авр 105 Агд Рго Зег Ьеи <31п 110 Туг А1а
Меб Азр Туг Тгр С1у 01п О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120 125 <210> 22 <211> 119 <212> Белок <213> Ното 5ар1еп5 <400> 22
01ц Уа1 С1п Ьеи О1п <31п Зег 01у Рго С1и Ьеи Уа1 ЬуЭ Рго С1у А1а
1 5 10 15
Бег Уа1 Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Бег РЬе ТЬг О1у Туг
20 25 30
РЬе Ме! Азп Тгр Уа1 Ме! С1п Бег Н1в С1у Ьуз Зег Ьеи 01и Тгр Пе
35 40 45
О1у Агд Не Ьуз Рго Туг Азп 01у Азр Азп РЬе ТуГ Азп <31п Ьуз РЬе
50 55 60
Ме! О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Бег ТЫ Уа1 ΗΪ3
65 70 75 80
Ме! 01и Ьеи Агд Бег Ьеи А1а Бег С1и Авр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Агд Туг 01у ТЬг Туг С1у ме! Азр Туг Тгр (31у О1п С1у
100 105 НО
ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 <210> 23 <211> 120 <212> Белок <213> Ното зархепБ <400> 23 <31и Уа1 Ьуз Ьеи Уа1 01ц Зег <31 у Б1у 01у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у <31у 15 10 15
- 31 011853
Бег Ьеи Ьуз Ьеи Бег Суз А1а А1а Бег О1у РЬе ТЬг РЬе Бег Агд Туг
20 25 30
Уа1 МеС Бег Тгр Уа1 Агд С1П ТЬг Рго <31и Ьуз Агд Ьеи (31и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Бег Не Бег Бег О1у С1у Бег ТЬг Туг Туг Рго Азр Бег Уа1 Ьуз
50 55 60
С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Зег А1а Агд Азп Пе Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
31п Ней Зег Зег Ьеи Агд Зег 51и Азр ТЬг А1а МеЬ Туг Туг суэ А1а
85 90 95
Агд 61у А1а Не Туг Азр (31у Тух Туг Уа1 РЬе А1а Туг Тгр <31у О1п
100 105 НО
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег А1а
115 120 <2Ю> 24 <211> 120 <212> Белок <213 > Ното заргепз <400> 24
С1и Уа1 МеЕ Ьеи 1 Уа1 5 <31и Бег <31у <31у С1у Ьеи 10 Уа1 Ьуз Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Бег Агд Туг
20 25 30
Уа1 МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п ТЬг Рго С1и Ьуз Агд Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Бег Не Зег Зег С1у С1у Агд МеС Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
С1у Агд РЬе ТЬг Не Бег Агд Азр Бег А1а Агд Азп 11а Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
(31п Мес Зег Зег Ьеи Агд Зег Й1и Азр ТЬг А1а МеЕ Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд С1у Бег Не Туг Азр <31у Тут Туг Уа1 РЬе Рго Туг Тгр С1у С1п
100 105 НО
(31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег А1а
115 120
<210> 25 <211> 121 <212> Белок <213> Ното заргепз
- 32 011853
<400> 25 С1и Ьеи Уа1 Агд Рго С1у ТЬг
С1п 1 Уа1 <31п Ьеи С1п 5 С1п Рго С1у А1а
10 15
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1У Туг Зет РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Тгр МеЕ Айи Тгр 7а1 Ьуз С1п Агд Рго О1у <31п С1у Ьеи <Яи Тгр 11е
35 40 45
С1у МеЕ Не ΗΪ3 Рго Зег 11е Зег С1и ТЬг Агд Ьеи Азп Рго Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зет Зег Зег ТНг Уа1 Тут
65 то 75 80
МеЕ С1п Ьеи Зег Зег Рго ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Туг Ьеи О1у Туг Туг ТЬг Тут Тут Б1у Зег Азр Суз Тгр С1у
100 105 110
С1п О1у ТЬг Зег 7а1 ТЬг νβΐ Зег Зет
115 120 <210> 26 <211> 121 <212> Белок <213> Ното зарйепз
<400> 26 Рго С1у А1а С1и 10 Ьеи Уа1 □1у Рго С1у 15 ТЬг
С1п Уа1 1 <31п Ьеи С1п 31η 5
Зег Уа1 Ьуз Ьеи 20 Зег Суз Ьуз А1а Зег 25 31у Тут Зег РЬе ТЬг 30 Зег Тут
Тгр МеЕ Азп 35 Тгр νβΐ Ьуз С1п Агд 40 Рго С1у <31п О1у Ьеи 45 О1и Тгр Пе
(31у МеЕ 50 11е ΗΪ5 Рго Зег 11е 55 Зег С1и ТЬг Агд Ьеи 60 Азп Рго Ьуз РЬе
Ьуз 65 Аар Ьуз А1а ТЬг Ьеи 70 ТЬг Уа1 Азр ТЬг 5ет 75 Зег Зег ТЬг νβΐ Тут 80
МеЕ С1п Ьеи Зег Зет 85 Рго ТЬг Зег Й1и Азр 90 Зет А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Агд Туг Ьеи С1у Тут Туг ТЬг Тут Туг <31у Ьеи Азр Туг Тгр С1у
100 105 ЦО
О1п С1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
- 33 011853 <210> 27 <211> 119 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 27
С1п Уа1 С1п Ьеи С1п 01п Зег О1у А1а Уа1 10 Ьеи Меб Ьуз Рго <31у 15 А1а
1 5
Вег Уа1 Ьуз Х1е Зег Суз Ьуз А1а ТЬг О1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр Не Азр Тгр Не Ьуз С1п Агд Рго С1у Н1н С1у Ьеи О1и Тгр Не
35 40 45
61у 31и АЗП Ьеи Рго 61у ТЫ Агд Азп Азп Туг Азп <31и Азп РЬе Ьуз
50 55 60
С1у Ьуз А1а ТЬг РЬе ТЬг А1а Азр Рго Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг Не
65 70 75 80
αΐη Ьеи Азп Зег Ьеи ТЬг Зег Азр Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд С1и А1а Ьеи. <31у С1у Азр Туг О1у Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у
100 105 110
ТЬг Зег Ьеи ТЬг V*! Зег Зег
115 <210> 28 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зарйепз <400> 28
<31п 1 ν&ι С1п Ьеи <31п 5 <31п Зег 61у А1а Уа1 10 Ьеи Неб Ьуз Рго <31у 15 А1а
Зег ν&ι Ьуз Не 20 Зег Суз Ьуз А1а ТЬг 25 С1у Туг Зег РЬе ТЬг 30 Азп Туг
Тгр Не Азр 35 Тгр Не Ьуз С1п Агд 40 Рго 51у Η1Ξ О1у Ьеи 45 б1и Тгр Не
С1у <31и 50 Азп Ьеи Рго <31у ТЬг 55 Агд АЗП Азп Туг Азп 60 С1и Азп РЬе Ьуз
У1у Ьуз 65 А1а ТЬг РЬе ТЬг 70 А1а Азр Рго Зег Зег 75 Азп ТЬг А1а Туг 11е 80
(31 п Ьеи Азп Зег Ьеи 85 ТЫ Зег Азр Азр Зег 90 А1а Уа1 Туг Туг Суз 95 А1а
Агд С1и А 1а Ьеи (31у б1у Азр Туг νηΐ Ьеи Азр Туг Тгр <31у С1п С1у
100 105 НО
- 34 011853
ТЫ Зег Ьеи ТЬг Ча1 Бег Зег
115 <210> 29 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зариепз <400> 29
<31п 1 Ча1 61п Ьеи С1п С1п Зег <31у А1а Уа1 Ьеи Мек Ьуз РГО <31у 15 А1а
5 10
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а ТЬг 31у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр Не Ьуз С1п Агд Рго <31у ΗΪ3 С1У Ьеи С1и Тгр 11е
35 40 45
С1у О1и Азп Ьеи Рго О1у ТЬг Агд Азп Азп Туг Азп б!и Авп РЬе Ьуз
50 55 60
С1у Агд А1а ТЬг РЬе ТЫ А1а Азр Рго Зег Зег Азп ты Д1а Туг Не
65 70 75 80
С1Т1 Ьеи Азп Бег Ьеи ТЬг Зег Аар Азр Зег А1а Ча1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд <Яи А1а ьеи С1у <31у Азр Туг <31у Ьеи Азр Туг Тгр С1у 31п О1у
100 105 110
ТЬг Зег Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 30 <211> 118 <212> Белок <213> Ното зариепз <400> 30
С1п 1 νβΐ 01п Ьеи <31п 5 С1п Зег О1у Рго О1и 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго 01у 15 А1а
Зег Уа1 Агд 11е 20 Зег Суз Ьуз А1а Зег 25 О1у Туг Не РЬе ТЬг 30 Зег Туг
Туг 11е Н1з 35 Тгр Уа1 Ьуз 01п Агд 40 Рго (Яу 01 п С1у Ьеи 45 01и Тгр Не
<31у Тгр 50 Не Туг Рго О1у Азп 55 Уа1 Азп ТЫ Ьуз Туг 60 Азп О1и Ьуз РЬе
Ьуз 65 Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи 70 ТЫ А1а Азр Ьуз Зег 75 Зег Зег ТЫ А1а Туг ВО
МЫ СЯп Ьеи Зег Зег 85 Ьеи ТЬг Зег 01 и Азр 90 Зег А1а Уа1 Туг РЬе 95 Суз
- 35 011853
А. 1а Агд Н1з ν*ι Ьей Зег <31у Азп РЬе Азр Туг Тгр С1у 31п <31у ТЬг
100 105 НО
ТЬг Ьей ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 31
<211> 118
<212* Белок
<213> Нойю зар1епз
<400> 31
31п Уа1 Θΐη Ьей <31 η <31п Зег Й1у Рго С1и Беи Уа1 Ьуа Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Агд Не Зег Суе Ьуз А1а Зег 61у Туг 11е РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Туг Не Ηίε Тгр Уа1 Ьуз (31п Агд Рго О1у <31п с1у Ьей Й1и тгр 11е
35 40 45
С1у Тгр 11е Туг Рго <31у Азп Уа1 Азп ТЬг Ьуз Тут Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьей ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мей С1п Ьей Зег Зег Ьей ТЬг Зег 31и Азр Зег А1а Уа1 Тут РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд ΗΪ3 7а1 Ьей Зег <31у Азп РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг
100 105 110
ТЬг Ьеи ТЪг Уа1 Зег Зег
115 <210* 32 <211> 118 <212> Белок <213> Ното заръепз
<400* 32
С1п Уа1 О1п Ьей С1п О1п Зег Агд Рго С1и Ьей Уа1 Ьуз РГО Й1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Агд Не Зег Суз Ьуз А1а Зет (31у Туг 11е РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
О'УТ Ьей Н13 Тгр Уа1 Ьуз С1п Агд Рго С1у й1п С1у Ьей С1и Тгр 11е
35 40 45
С1у Тгр 11е Туг Рго С1у Азп С1у Азп ТЬг Ьуз Туг Азп <31и Ьуз РЬе
55 60
- 36 011853
Ьуз 65 Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи 70 ТЫ Зег Азр Ьуз Зег 75 Зег Зег ТЬг А1а Туг 80
МеЬ 51 η Ьеи Зег Зег 85 Ьеи ТЬг Зег 51и Азр 90 Зег А1а Уа1 Туг РЬе 95 Суз
А1а Агд ΗΪ5 7а1 108 Ьеи Зег 51у Азп РЬе 105 Азр Туг Тгр 51у <31п 110 51у ТЬг
ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 33 <211> 118 <212> Белок <213> Ното зархепз
<400> 33 Зег Агд Рго С1и Ьеи Уа1 10 Ьуз Рго 51у А1а 15
<31п 1 Уа1 С31п Ьеи С1п С1п 5
Зег Уа1 Агд Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Не РЬе ТЬг Зег Туг
20 25 30
Туг Ьеи На. а Тгр Уа1 Ьуз 51п Агд Рго 51у <31п С1у Ьеи С1и Тгр Не
35 40 45
Шу Тгр Не Туг Рго С1у Азп б1у Азп ТЫ Ьуз Туг Зег 51и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Зег Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Тух
65 70 75 80
МЫ 51п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЫ Зег 51и Азр Зег А1а 7а1 Туг РЬе Суя
05 90 95
А1а Агд Н15 Уа1 Ьеи Зег 51у Азп РЬе Азр Туг Тгр 51 у 51п 51у ТЫ
100 105 110
ТЫ Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 34 <211> 118 <212> Белок <213> Ното зархепз
<400> 34
С1П Ьеи 51п Уа1 С1п Ьеи С1п <21 п Зег С1у Рго 51и Ьеи Уа1 Ьуз Рго
1 5 10 15
Шу А1а Зег Ьеи Агд Не Зег Суз Ьуз А1а Зег Шу Туг ТЬг РЬе Ьуз
20 25 30
Зег Туг Туг Не Ηϊε Тгр Уа1 Агд 51п Агд Рго <31у С1п 51у Ьеи 31и
35 40 45
- 37 011853
Тгр Не 50 (Ну Тгр 11е Туг Рго 55 <31у Азп Ьеи Азп ТЬг 60 Ьуз Туг Азп (31и
Ьуз 65 РЬе Ьуз 01у Ьуз А1а 70 ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр 75 Ьуз Зег Зег зег ТЬг 80
УаЬ Туг МеЬ Зег Зег 85 Ьеи ТЬг Зег (Пи Азр 90 Зег А1а Уа1 Туг РЬе 95 Суз
А1а Агд ΗΪ5 (Пи. 100 Ьеи Азп 51у Азп РЬе 105 Азр Туг Тгр 61у С1п 110 (Пу ТЬг
ТЬг Ьеи ТЬг 7а1 Зег Зег
115 <210> 35 <211> 118 <212> Белок <213> Ното заргелз <400> 35
<Ϊ1 п 1 Уа1 31п Ьеи С1 п 5 О1П Зег (Ну Рго С1и 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у 15 А1а
Зег Ьеи Агд Не 20 Зег Суз Ьуз А1а Зег 25 С1у Туг ТЬг (Ни Ьуз 30 Зег Туг
Туг 11е ΗΪ3 35 Тгр Уа1 Агд С1п Агд 40 рго С1у С1П 01у Ьеи 45 (Ли Тгр Не
С1у Тгр 50 11е Туг Рго (Ну Азп 55 Рго Айп ТЬг Ьуз Туг 60 Азп (Ни ьуз РЬе
Ьуз 65 <31у Ьуз А1а ТЬг Ьеи 70 ТЬг А1а Азр Ьуз Зег 75 Зег Зег ТЬг ν&1 Туг 80
МеЕ С1п Ьеи Зег Зег 85 Ьеи ТЬг Зег (Пи Азр 90 Зег А1а Уа1 Туг РЬе 95 Суз
А1а Агд Н1з <31и 100 Ьеи Азп <31у Дэп РЬе 105 Азр Туг Тгр Й1у <31п но <51у ТЬг
ТЬг Ьеи ТЬг 115 Уа1 Зег Зег
<210> 36 <211> 118 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 36 (31п 1/а1 <Яп Ьеи <Э1п (31п Зег С1у Рго <31и Ьеи Уа1 Ьуз
10
Рго С1у А1а
- 38 011853
Зег Уа1 Агд Не 20 Зег Суз Ьуз А1а Зег 25 С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 30 Зег Туг
Туг Не НЬз 35 Тгр Уа1 Ьуз С1п Агд 40 Рго 31у С1п С1у Ьеи 45 С1и Тгр Не
(31у Тгр 50 Ьеи Туг Рго 31у Ьуз 55 Не Азп ТЬг Агд Туг 60 Азп С1и Ьуз РЬе
Ьуз 65 С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи 70 11е А1а Азр Ьуз Зег 75 Зег Зег ТЬг А1а Туг 80
МеБ С1п Ьеи Зег Зег 85 Ьеи ТЬг Зег С1и Азр 90 Зег А1а νβΐ Туг РЬе 95 Суз
А1а Агд Н1з Уа1 100 Ьеи Азп (31у Азп РЬе 105 Азр Туг Тгр С1у 61п 110 01у ТЬг
ТЬг Ьеи ТЬг 115 Уа1 Зег Зег
<210> 37 <211> 111 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 37
Азр Не Уа1 Ьеи ТЬг О1п Зег Рго А1а Зег Ьеи А1а 10 Уа1 Зег Ьеи 15 С1у
1 5
О1п Агд А1а ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег б1п Зег Уа1 Зег Не Зег
20 25 30
тьг Туг Зег Туг Не ΗΪ5 Тгр РЬе С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п Рго Рго
35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи 11е Ьуз Туг А1а Зег Азп Ьеи (51и Зег О1у Уа1 Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Азп 11е Нхя
65 70 75 80
Рго Уа1 <Э1и С1и С1и Азр ТЪг А1а Не Туг Туг Суз С1л ΗΪΞ Зег Тгр
85 90 95
С1и 11е Рго Туг ТЬг РЬе Й1у <31у С1у ТЬг Ьуз Уа1 31и 11е Ьуз
100 105 110
<210> 38 <211> 111 <212> Белок <213> Ното зархепз
<400> 38
Азр 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а Зег Ьеи А1а Уа1 Зег Ьеи <31у
1 5 10 15
- 39 011853
(31п Агд А1а Не 20 Не Зег Суз Агд А1а Зег <31п Зег Уа1 Зег ТЬг Зег
25 30
Зег Туг Зег Туг Мек Туг Тгр Тут й1п С1п Ьуз Рго С1у О1п Зег Рго
35 40 45
Ьуз РЬе Ьеи Пе Ьуз Туг А1а Зег Азл Ьеи 61и Зег С1У νβΐ Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег αίγ Зег О1у Зег С1у ТЬг Αερ РЬе ТЬг Ьеи Айп 11е ΗΪ3
65 70 75 80
Рго Уа1 С1и С1и €1и Айр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг Суз 31л Н13 Азл Тгр
05 90 95
С1и Не Рго РЬе ТЬг РЬе С1у 31у С31у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Не Ьуз
100 105 110 <210> 39 <211> 112 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 39
Азр Уа1 Уа1 Мек ТЬг С1п ТЬг Рго Агд Зег Ьеи Рго Уа1 Зег Ьеи <31 у
1 5 10 15
Азр О1п А1а Зег Мек Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьуз ΗΪ3 Зег
20 25 30
АЗп С1у Азр ТЬг Туг Ьеи Н£б Тгр Тут Ьеи С1п Ьуа Рго О1у <31п Зег
35 40 45
Рго Азп Ьеи Ьеи Не Туг Ьуз 7а1 Зег Азп Агд РЬе Зег 61у Уа1 Рго
50 55 60
Азр Агд РЬе Зег <31у Зег <31у Зег 01у ТЬг С1и РЬе ТЬг РЬе Ьуе Не
65 70 75 80
Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг РЬе Суз Зег С1п Зег
85 90 95
ТЬг Н13 Уа1 Рго Туг ТЬг РЬе О1у С1у С1у ТЬг Агд Ьеи С1и 11 е Ьуз
100 105 110 <210> 40 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зарХепз
- 40 011853 <400> 40
Азр Не С1л МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ьеи С1у
1 5 10 15
С1и Агд Уа1 Лап Ьеи ТЬг Суз Агд А1а Бег (31п С1и Не Бег С1у Туг
20 25 30
Ьеи Зег Тгр Ьеи 51п αΐη Ьуз Рго Авр О1у ТЫ Не Ьуз Агд Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег ТЫ Ьеи Азр Зег С1у Уа1 Рго Ьуэ Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег Агд Зег О1у Зег Авр Туг Зег Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 31 и Зег
65 70 75 80
С1и Азр РЬе <31у А5р Туг Туг Суз Ьеи (31п Туг А1а Бег Туг Рго Туг
05 90 95
ТЬг РЬе <31у О1у О1у А1а Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105 <2Ю> 41 <211> 107 <212> Белок <213> Ното вар1епз <400> 41
Авр Не 31 п МеЪ ТЫ С1п Бег Рго Бег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ьеи 15 С1у
1 5 10
С1и Агд Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Агд А1а Зег 31п 31и Х1е Зег О1у Туг
20 25 30
Ьеи Зег Тгр Ьеи 31п 31л Ьуз Рго Азр 01у Зег 11е Ьуз Агд Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег ТЫ Ьеи Азр Зег 31у Уа1 Рго Ьуз Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег Агд Зег 31у Л1а Авр Туг Зег Ьеи ТЫ Не Зег Зег Ьеи <31и Зег
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Авр Туг Туг Суз Ьеи 31п Туг А1а ТЫ Туг Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе 51у 31у С1у ТЬг ьуз Ьеи 31и Не Ьуз
100 105
<210> 42 <211> 106 <212> Белок <213> Ното зархепз
- 41 011853 <400> 42
С1п Не Уа1 Ьеи ТЬг 01п Зег Рго А1а Не Меб Зег А1а Зег Рго <з1у
1 5 10 15
<31и Ьуз Уа1 ТЬг Меб ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Бег Туг Меб
20 25 30
ΗΪ8 Тгр Туг С1п (31п Ьуз Зег (31у ТЬг Зег Рго Агд Агд Тгр 11е Туг
35 40 45
Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег 61у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
С1у Зег (31у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег Меб О1и А1а Уа1
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п О1п Тгр ТЬг Зег Азп Рго РЬе ТЬг
85 90 95
РЬе С1у Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1у 11е Ьуз
100 105 <210> 43 <211> 106 <212> Белок <213> Ното заргепв <400> 43
С1п 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а 11е 10 Меб Зег А1а Зег Рго 15 С1у
С1и Ьуз Уа1 ТЬг 20 Меб ТЬг Суз Зег А1а 25 Зег Зег Зег Уа1 Зег 30 Туг Меб
ΗΪ3 Тгр Туг 35 С1 п С1п Ьуз Зег О1у 40 ТЬг Зег Рго Ьуз Агд 45 Тгр 11е Туг
Авр ТЬг 50 Зег Ьуз Ьеи А1а Зег 55 С1у Уа1 Рго ТЬг Агд 60 РЬе Зег (Ну Зег
<31у Б5 Зег <51у ТЬг Зег Туг 70 бег Ьеи ТЬг Не Азп 75 Зег Меб С1и А1а (31и 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг 85 Туг Суз 01п О1п Тгр 90 Зег Зег Н1з Рго Рго 95 ТЬг
РЬе С1у А1а С1у ТЬг Ьуз Ьеи 01и Ьеи Ьуз
100 105 <210> 44 <211> 108 <212> Белок <213> Ното вархепв
- 42 011853 <4ϋϋ> 44
С-1п 1 11е Уа1 Ьеи ТЫ 5 С1п Зег Рго А1а Не 10 МеЕ Зег А1а Зег Рго 15 О1у
С1и Ьуз Уа1 ТЫ 20 Ьеи ТЬг Суз Зег А1а 25 зех Зег Зег Уа1 Зег 30 Зег Зег
Туг Ьеи Туг 35 Тгр Туг О1п О1п Ьуз 40 Рго 01у Зег Зег Рго 45 Ьуз Ьеи Тгр
Не Туг 50 Зег ТЫ Зег Азп Ьеи 55 А1а Зег Агд Уа1 Рго 60 А1а Агд РЬе Зег
(31у 65 Зег О1у Зег О1у ТЬг 70 Зег Туг Зег Ьеи ТЬг 75 Не Зег Зег МеЕ 31 и 80
А1а О1и Азр А1а А1а 85 Зег Туг РЬе Суз ΗΪ3 90 01 η Тгр Зег Зег Туг 95 Рго
Рго ТЫ РЬе О1у <31у О1у ТЫ Ьуз Ьеи О1и Не Ьуз
100 105 <210> 45 <211> 100 <212> Белок <213> Ното заргепз <4Ο0> 45
О1п Не Уа1 Ьеи ТЬг О1п Зег Рго А1а Не МеЕ Зег А1а Зег Рго 01у
1 5 10 15
<31и Ьуз Уа1 ТЬг Ьеи ТЬг Суз Зег А1а Азп Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Тух Тгр Туг 01 η 61п Ьуз Зег О1у Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег
50 55 60
О1у Зег 01у Зег 31у ТЬг Зег РЬе Зег Ьеи ТЬг 11е Зег Зег МеЕ С1и
65 70 75 80
А1а О1и Азр А1а А1а Зег Туг РЬе Суз Η15 О1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
Рю ТЬг РЬе О1у С1у Е1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Не Ьуз
100 105 <210> 46 <211> 17 <212> Белок <213> Ното аардепз
- 43 011853 <400> 46
Уа1 11 е Азр ТЫ Туг Туг С1у Ьуз ТЬг Азп Туг Азп С1п Ьуз РЬе <31и 15 10 15
С1у <210> 47 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зарАепз <400> 47 &1у С1у РЬе Агд Агд С1у Азр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а МеЕ Азр 15 10 15
Зег <210> 48 <211> 15 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 48
Агд А1а 5ег С1п Зег Ча1 Зег 11е Зег ТЬг Туг Зег Туг Не ΗΪ3
10 15 <210* 49 <211> 10 <212> Белок <213> Ното зарБепз <400> 49
01у Туг Азр РЬе Азп Азп Азр Ьеи Не С1и
1 5 10
<210> 50 <211> 10 <212> Белок <213 > Ното эаргепэ <400> 50 <31у Туг А1а РЬе ТЬг Азп Туг Ьеи Не 31и
1 5 10
<210> 51
<211> 17
<212> Белок
<213> Ното заргепз
- 44 011853 <400> 51
Уа1 Не Азп Рго С1у Бег Й1у Агд
5
Б1у
ТЬг Азп Туг А 3X1 <31 и Ьуз РЬе Ьуз 10 15 <210 52 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 52
Уа1 11е Бег Рго 01 у Бег 01у 11е
5
С1у
11е Азп. Туг Азп 61и Ьуз РЬе Ьуз
15 <210 53 <211> 12 <212> Белок <213> Нотс нар1епз <400> 53
11е Туг Туг С1у Рго Н1з Бег Туг
5
А1а МеС Азр Туг <210 54 <211> 11 <212> Белок <213> Ното зархепз <400 54
Не Азр Туг Бег 01у Рго Туг А1а
5
Уа1 Азр Азр <210> 55 <211> 11 <212> Белок <213> Ното зардепз <400> 55
Ьуз А1а Бег Ьеи Авр ν&1 Агд ТЬг
5
А1а Уа1 А1а <210> 56 <211> 11 <212> Белок <213> Ното зарбепе
- 45 011853 <400> 56 .
Ьуз А1а Зег (31п А1а Уа1 Азп ТЬг А1а Уа1 А1а
10 <210> 57 <211> 7 <212> Белок <213> Ното зар1еп8 <Д00> 57
Зег А1а Зег Туг Агд Туг ТЬг
5 <210> 58 <211> 7 <212> Белок <213 > Ното зардепз <400> 58
Зег А1а Зег Туг С1п Туг ТЬг
5 <210> 59 <211> 9 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 59
С1п С1п Н1з Туг С1у 11е Рго Тгр ТЬг
5 <210> 60 <211> 9 <212> Белок <213> Ното зарз.ел3 <400> 60 *31п Ηΐβ Н1а Туг О1у Уа!. Рго Тгр ТЬг
5 <210> 61 <211> 120 <212> Белок <213> Кото эархепз <400> 61
С1п 5Га1 С1п Ьеи С1п С1п Зег С1у А1а О1и Ьеи А1а Агд Рго О1у ТЬг 15 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суд Ьуз А1а Зег О1у Туг А1а РЬе ТЬг Азп Туг 20 25 30
- 46 011853
ьеи Пе С1и 35 Тгр Уа1 Ьуз 51 η Агд Рго О1у 01п <Э1у Ьеи С1и Тгр Не
40 45
31у Уа1 Не бег Рго <31у бег &1у Не Не Азп Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз <31у Ьуз А1а ТЫ Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз бег Зег Зег ТЫ А1а Туг
65 70 75 80
Мек С1п Ьеи бег бег Ьеи ТЫ бег Азр Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз
85 90 95
Л1а А1а Не Азр Туг бег О1у Рго Туг А1а Уа1 Азр Азр Тгр С1у С1п
100 105 110
О1у ТЬг бег ν&1 ТЫ Уа1 бег Зег
115 120
<210> 62 <211> 121 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 62
С1п 1 7а1 С1п Ьеи С1п <31п Зег С1у А1а 31и Ьеи Уа1 Агд Рго С1у 15 ТЫ
5 10
бег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суя Ьуя А1а бег (31у Туг Азр РЬе Азп Азп Азр
20 25 30
Ьеи Не С1и Тгр Уа1 Ьуз <31п Агд Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр Не
35 40 45
А1а Уа1 Не Азп Рго <31у Зег- <31у Агд ТЫ Азп Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг Уа1 Туг
65 70 75 ВО
Мек С1п Ьеи Зег Зег Ьеи тЬг Зег Азр Авр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз
85 90 95
А1а Мек Не Туг туг С1у Рго ΗΪ3 Зег Туг А1а Мек Азр Туг Тгр С1у
100 105 110
С1п С1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 бег Зег
115 120
<210> 63 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зардепз <400> 63
Азр Не Уа1 Мек ТЫ <31п бег Ηί$
5
Ьуз РЬе Мек Зег ТЬг Уа1 Уа1 <31у
15
- 47 011853
Авр Агд Уа1 Зег 20 Не ТЬг Суз Ьуз А1а 25 Зег Ьеи Авр Уа1 Агд 30 ТЬг А1а
Уа1 А1а Тгр 35 Туг 01п С1П Ьуз Рго 40 01у <31п Зег Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи Не
Туг Зег 50 А1а Зег Туг Агд Туг 55 ТЬг С1у Уа1 Рго Азр 60 Агд РЬе ТЫ С1у
Зег 65 <з1у Зег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг РЬе Азп Не 75 Агд Зег Уа1 С1п А1а 80
О1и Азр Беи А1а Уа1 85 Туг Туг Су© С1п С1п 90 НБз Туг С1у На Рго 95 Тгр
ТЫ РЬе (31у С1у 61у ТЫ Ьуз Ьеи. С1и 11е Ьуз
100 105 <2Ю> 64 <211> 107 <212> Белок <213> Ното эартепз <400> 64
Азр Не Уа1 МеС ТЫ <31п Зег Н1з Ьуз РЬе МеБ Зег ТЬг Зег Уа1 О1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 Зег Уа1 ТЬг Сув Ьуз А1а Зег 61 η А1а Уа1 Азп ТЬг А1а
20 25 30
Уа1 А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 31у С1П Зег Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Туг 31у Туг ТЬг 61у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЫ <Ну
50 55 60
Зег 61 у Зег (Ну ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зет Уа1 61п А1а
65 70 75 80
<31и Азр Беи А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п Н13 ΗΪ3 туг С1у V*! Рго Тгр
85 90 95
ТЫ РЬе <31у С1у <31у ТЬг Ьуз Ьеи 61и Не Ьуз
100 105

Claims (68)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Моноклональное антитело, которое (а) специфически связывается с ανβ6 и (Ь) ингибирует связывание ανβ6 с ассоциированным с латентностью пептидом (БАР) при значении 1С50, меньшем, чем таковое у антитела 10Ό5, причем указанное моноклональное антитело содержит те же самые определяющие комплементарность области (СОЯ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой, выбранной из группы, состоящей из гибридомы 6.1 А8, АТСС РТА-3647, гибридомы 6.309, АТСС РТА-3649, гибридомы 6.806, АТСС РТА-3645, гибридомы 6.2В1, АТСС РТА-3646, 7.1010, АТСС РТА3898, 7.705, АТСС РТА-3899 и 7.105, АТСС РТА-3900.
  2. 2. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОЯ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.1А8, АТСС РТА-3647.
  3. 3. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОЯ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.309, АТСС РТА-3649.
  4. 4. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность
    - 48 011853 области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.806, АТСС РТА-3645.
  5. 5. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.2В1, АТСС РТА-3646.
  6. 6. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 7.1010, АТСС РТА-3898.
  7. 7. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 7.705, АТСС РТА-3899.
  8. 8. Моноклональное антитело по п.1, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 7.105, АТСС РТА-3900.
  9. 9. Антитело по п.1, где связывание между антителом и ανβ6 зависит от двухвалентного катиона.
  10. 10. Антитело по п.9, где двухвалентный катион представляет собой Са2+, Мд2+ или Мп2+.
  11. 11. Антитело по п.1, где его связывание с ανβ6 не зависит от двухвалентного катиона.
  12. 12. Антитело по п.1, в котором определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи имеют, по существу, аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 1, 4 и 7, соответственно.
  13. 13. Антитело по п.1, в котором определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи имеют, по существу, аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 3, 5 и 8, соответственно.
  14. 14. Антитело по п.1, в котором определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи имеют, по существу, аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 3, 6 и 9, соответственно.
  15. 15. Антитело по п.1, в котором определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи имеют, по существу, аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 2, 46 и 47, соответственно.
  16. 16. Антитело по п.1, в котором определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи имеют, по существу, аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 49, 51 и 53, соответственно.
  17. 17. Антитело по п.1, в котором определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи имеют, по существу, аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 50, 52 и 54, соответственно.
  18. 18. Антитело по п.1, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, представляющую собой любую из последовательностей 8Е0 ΙΌ NО: 19-36 и 61, 62.
  19. 19. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ NО: 19 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 37.
  20. 20. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 20 или 21 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 38.
  21. 21. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 22 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 43.
  22. 22. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 23 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 44.
  23. 23. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 24 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 45.
  24. 24. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 25 или 26 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 42.
  25. 25. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 27, 28 или 29 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 39.
  26. 26. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 34 или 35 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 40.
  27. 27. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 36 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 41.
  28. 28. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 61 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 63.
  29. 29. Антитело по п.18, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 62 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ NО: 64.
  30. 30. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с ανβ6, но не ингибирует связывание ανβ6 с ассоциированным с латентностью пептидом (БАР), причем указанное моноклональное антитело содержит те же самые определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой, выбранной из группы, состоящей из гибридомы 6.2А1, АТСС РТА-3896 и гибридомы 6.2Е5, АТСС РТА-3897.
  31. 31. Антитело по п.30, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.2А1, АТСС РТА-3896.
  32. 32. Антитело по п.30, содержащее те же самые определяющие комплементарность области (СОВ)
    - 49 011853 тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.2Е5, АТСС РТА-3897.
  33. 33. Композиция для профилактики или лечения у млекопитающего заболевания, опосредованного ανβ6, содержащая антитело по любому из пп.1-32 и фармацевтически приемлемый носитель.
  34. 34. Композиция по п.33, в которой антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.
  35. 35. Композиция по п.33, в которой антитело представляет собой катионзависимое антитело.
  36. 36. Способ лечения субъекта, характеризующегося наличием заболевания или риском наличия заболевания, опосредованного ανβ6, предусматривающий введение указанному субъекту композиции по п.33, причем указанный способ облегчает течение заболевания или отсрочивает его начало.
  37. 37. Способ по п.36, где субъектом является человек.
  38. 38. Способ по п.36, где заболевание представляет собой фиброз.
  39. 39. Способ по п.38, где фиброз представляет собой склеродермию, рубцы, фиброз печени, фиброз почек или фиброз легких.
  40. 40. Способ по п.36, где заболевание представляет собой псориаз.
  41. 41. Способ по п.36, где заболевание представляет собой рак.
  42. 42. Способ по п.41, где рак представляет собой эпителиальный рак.
  43. 43. Способ по п.41, где рак представляет собой рак ротовой полости, кожи, шейки матки, яичников, глотки, гортани, пищевода, легких, молочной железы, почек или колоректальный рак.
  44. 44. Способ по п.36, где заболевание представляет собой синдром Альпорта или атрезию желчного протока.
  45. 45. Способ по п.36, где заболевание представляет собой острое повреждение легкого.
  46. 46. Способ детекции ανβ6 в образце ткани млекопитающего, предусматривающий обеспечение контакта образца ткани с антителом по п.1 или 30, при этом наличие ανβ6 в образце детектируется в том случае, если указанное антитело связывается с указанным образцом ткани.
  47. 47. Способ по п.46, где антитело выбрано из группы, состоящей из антитела 6.2А1, АТСС РТА-3896 и 6.2Е5, АТСС РТА-3897.
  48. 48. Гибридома 6.1 А8, АТСС РТА-3647, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  49. 49. Гибридома 6.2В 10, АТСС РТА-3648, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  50. 50. Гибридома 6.3Ο9, АТСС РТА-3649, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  51. 51. Гибридома 6.8Ο6, АТСС РТА-3645, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  52. 52. Гибридома 6.2В1, АТСС РТА-3646, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  53. 53. Гибридома 6.2А1, АТСС РТА-3896, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  54. 54. Гибридома 6.2Е5, АТСС РТА-3897, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  55. 55. Гибридома 7.1Ο10, АТСС РТА-3898, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  56. 56. Гибридома 7.7Ο5, АТСС РТА-3899, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  57. 57. Гибридома 7.1С5, АТСС РТА-3900, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
  58. 58. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая последовательности 8Εβ ΙΌ N0: 19-45 и 61-64 вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела по п.1.
  59. 59. Моноклональное антитело, которое: (а) специфически связывается с ανβ6 и (Ь) ингибирует связывание ανβ6 с ассоциированным с латентностью пептидом (ЬАР) при значении 1С50, большем, чем таковое у антитела 10Ό5, причем указанное моноклональное антитело содержит те же самые определяющие комплементарность области (СОК) тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.2В 10, АТСС РТА-3648, или области СОК имеют аминокислотную мутацию, такую, что участок гликозилирования элиминирован.
  60. 60. Применение композиции по п.33 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного ανβ6, где указанное средство облегчает течение заболевания или отсрочивает его начало.
  61. 61. Применение по п.60, где субъектом является человек.
  62. 62. Применение композиции по п.60, где заболевание представляет собой фиброз.
  63. 63. Применение композиции по п.62, где фиброз представляет собой склеродермию, рубцы, фиброз печени, фиброз почек или фиброз легких.
  64. 64. Применение по п.60, где заболевание представляет собой псориаз.
  65. 65. Применение по п.60, где заболевание представляет собой рак.
  66. 66. Применение по п.65, где рак представляет собой рак ротовой полости, кожи, шейки матки, яичников, глотки, гортани, пищевода, легких, молочной железы, почек или колоректальный рак.
  67. 67. Применение по п.60, где заболевание представляет собой синдром Альпорта или атрезию желчного протока.
  68. 68. Применение по п.60, где заболевание представляет собой острое повреждение легкого.
EA200401198A 2002-03-13 2003-03-13 АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβ EA011853B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36499102P 2002-03-13 2002-03-13
US42628602P 2002-11-13 2002-11-13
PCT/US2003/008048 WO2003100033A2 (en) 2002-03-13 2003-03-13 ANTI-αvβ6 ANTIBODIES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401198A1 EA200401198A1 (ru) 2005-04-28
EA011853B1 true EA011853B1 (ru) 2009-06-30

Family

ID=29586753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401198A EA011853B1 (ru) 2002-03-13 2003-03-13 АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβ

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7465449B2 (ru)
EP (4) EP1490110B1 (ru)
JP (6) JP4473117B2 (ru)
KR (1) KR101098109B1 (ru)
CN (4) CN104805090A (ru)
AR (1) AR038970A1 (ru)
AU (1) AU2003261071C1 (ru)
BR (1) BRPI0308585B8 (ru)
CA (1) CA2478833C (ru)
CL (8) CL2010000792A1 (ru)
EA (1) EA011853B1 (ru)
ES (1) ES2389037T3 (ru)
HK (2) HK1074381A1 (ru)
IL (4) IL164021A0 (ru)
IS (1) IS7443A (ru)
ME (1) ME00804B (ru)
MX (1) MXPA04008870A (ru)
MY (2) MY147019A (ru)
NO (1) NO334834B1 (ru)
NZ (2) NZ535425A (ru)
PL (1) PL216223B1 (ru)
RS (1) RS52488B (ru)
WO (1) WO2003100033A2 (ru)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7465449B2 (en) * 2002-03-13 2008-12-16 Biogen Idec Ma Inc. Anti-αvβ6 antibodies
WO2003087340A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
CA2434668A1 (en) 2003-07-04 2005-01-04 Laurence Mulard Novel approach to design glycopeptides based on o-specific polysaccharide of shigella flexneri serotype 2a
AU2012258386B2 (en) * 2005-07-08 2014-08-07 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
CN102875681A (zh) * 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
EP1974213A4 (en) * 2006-01-17 2009-03-25 Biosite Inc HIGHLY SENSITIVE SECRETAGOGIN ASSAYS AND ITS USE IN DIAGNOSIS AND / OR FORECASTING
WO2008008315A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
BRPI0715141A2 (pt) * 2006-08-03 2013-06-04 Astrazeneca Ab agente de ligaÇço alvejante, anticorpo isolado, fragmento de anticorpo isolado, molÉcula de Ácido nucleico, vetor, cÉlula hospedeira, mÉtodos para produzir um agente de ligaÇço alvejado, para produzir um anticorpo, para produzir um fragmento de anticorpo, para tratar um tumor maligno em um animal, para tratar inflamaÇço, e para inibir a interaÇço de alfabeta6 com seu ligando, e, conjugado
WO2008147434A1 (en) * 2006-10-19 2008-12-04 The Regents Of The University Of California TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC ASTHMA USING ANTAGONISTS OF INTEGRIN αVβ6
DK2164992T3 (en) * 2007-05-30 2016-08-15 Lpath Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR BONDING OF LYTHOPHOSPHATIC ACID
US20110064744A1 (en) * 2007-05-30 2011-03-17 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
HUE033825T2 (en) * 2007-11-16 2018-01-29 Univ Rockefeller Beta-amyloid protein protofibrillum-specific antibodies
ES2549903T3 (es) 2008-05-07 2015-11-03 Argos Therapeutics, Inc. Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano
CA2723842A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Peter Vanlandschoot Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof
CN102099491A (zh) 2008-05-15 2011-06-15 北卡罗来纳-查佩尔山大学 调节血管生成的新靶标
CA2738252C (en) 2008-09-26 2018-05-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
CA2771441C (en) 2009-08-19 2016-10-11 Merck Patent Gmbh Antibodies for the detection of integrin complexes in ffpe material
WO2011119524A1 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel targets for regulation of angiogenesis
ES2552954T3 (es) 2010-04-30 2015-12-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos anti-C5a y métodos para el uso de los anticuerpos
US20130066055A1 (en) 2011-04-21 2013-03-14 Bayer Intellectual Property Gmbh New binder-drug conjugates (adcs) and use thereof
WO2012154983A2 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-pax8 antibodies
BR112014019861A2 (pt) * 2012-02-17 2017-07-04 Seattle Genetics Inc anticorpo, ácido nucleico isolado, método de tratamento de um paciente com câncer, e, composição farmacêutica de um anticorpo
US10316103B1 (en) 2012-03-30 2019-06-11 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-Uroplakin III antibodies
WO2014052672A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Biocare Medical, Llc Anti-uroplakin ii antibodies systems and methods
DK2905335T3 (en) * 2012-10-03 2018-03-12 Chiome Bioscience Inc Anti-human dlk-1 antibody with anti-tumor activity in vivo
PT2766048E (pt) 2012-10-12 2015-02-25 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
US10429390B2 (en) 2012-12-18 2019-10-01 Biocare Medical, Llc Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer
EP2962113B1 (en) 2013-02-28 2019-04-03 Biocare Medical, LLC Anti-p40 antibodies systems and methods
ES2687439T3 (es) 2013-03-13 2018-10-25 Medimmune Limited Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014143739A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
GB201305668D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Avs6 Integrin Antagonists
AU2014312086B2 (en) 2013-08-30 2020-03-12 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
KR102150616B1 (ko) 2013-09-12 2020-09-03 삼성전자주식회사 c-Met 표적 화합물-생체활성 물질 접합체 및 그 용도
EP3052523B1 (en) * 2013-10-01 2021-03-10 Medimmune Limited Methods of treating and diagnosing alpha-v-beta-6 overexpressing cancer
US9816997B2 (en) 2013-10-03 2017-11-14 Biocare Medical, Llc Anti-SOX10 antibody systems and methods
CN109908017A (zh) 2013-12-19 2019-06-21 高露洁-棕榄公司 口腔护理组合物
PE20160996A1 (es) 2013-12-23 2016-11-09 Bayer Pharma AG Conjugados de farmacos anticuerpo (adcs) con inhibidores de ksp
US20170008955A1 (en) * 2014-02-03 2017-01-12 Cnj Holdings, Inc. Humanized beta-amyloid binding molecules and uses thereof
KR20220025917A (ko) 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201417002D0 (en) 2014-09-26 2014-11-12 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compound
AU2016282723B2 (en) 2015-06-22 2021-09-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (ADCs) and antibody prodrug conjugates (APDCs) with enzymatically cleavable groups
US10973923B2 (en) 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
JP6913078B2 (ja) * 2015-08-13 2021-08-04 ニューヨーク・ユニバーシティ タウの短縮型Ａｓｐ４２１エピトープに特異的な、抗体を基にした分子、ならびにタウ異常症の診断および治療におけるそれらの使用
CA2994888A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Immunogen, Inc. Therapeutic combinations comprising anti-folr1 immunoconjugates
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
US20190144547A1 (en) * 2015-11-23 2019-05-16 Merck Patent Gmbh Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders
GB201604680D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
GB201604681D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
SG10202008909VA (en) 2016-03-24 2020-10-29 Bayer Pharma AG Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
WO2018017797A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Georgia State Universtiy Research Foundation Monoclonal antibodies to b virus and their use for identification of b virus specific reactive peptides
JP2019534882A (ja) 2016-10-11 2019-12-05 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 免疫介在性療法薬を有する抗体−薬物コンジュゲート
US10953020B2 (en) 2016-11-08 2021-03-23 Reata Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating Alport syndrome using bardoxolone methyl or analogs thereof
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN116712540A (zh) 2016-12-14 2023-09-08 比奥拉治疗股份有限公司 使用整联蛋白抑制剂治疗胃肠道疾病
KR102628678B1 (ko) 2016-12-21 2024-01-25 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc)
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
KR20190099250A (ko) 2016-12-21 2019-08-26 바이엘 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
GB201720989D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical compounds
BR112020022961A2 (pt) 2018-05-11 2021-02-17 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited inibidores de furina
EP3796942A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 ADC Therapeutics SA Molecular adjuvant
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
KR20210095165A (ko) 2018-11-19 2021-07-30 프로제너티, 인크. 바이오의약품으로 질환을 치료하기 위한 방법 및 디바이스
GB201908536D0 (en) 2019-06-13 2019-07-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Compounds
IL293238A (en) * 2019-11-26 2022-07-01 Childrens Hospital Med Ct Cela-1 inhibition for treatment of lung disease
BR112022009570A2 (pt) 2019-12-05 2022-08-02 Seagen Inc Anticorpo anti-¿v¿6 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, conjugado anticorpo-fármaco, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para produção de um anticorpo anti-¿v¿6 ou fragmento de ligação ao antígeno, para produção de um conjugado anticorpo anti-¿v¿6-fármaco e para tratamento de câncer em um indivíduo, e, composição farmacêutica
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
US20240425601A1 (en) * 2021-01-26 2024-12-26 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating and preventing disease associated with avb8 integrin
CN117222410A (zh) 2021-02-03 2023-12-12 Bp资产V股份有限公司 用于吸入的弗林蛋白酶抑制剂的制剂
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2023194895A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Pyrrol derivatives as inhibitors of apolipoprotein l-1
WO2024263932A2 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Mythic Therapeutics, Inc. Itgb6-binding proteins and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0719859A1 (en) * 1994-12-20 1996-07-03 MERCK PATENT GmbH Anti-alpha V-integrin monoclonal antibody
US20010056076A1 (en) * 1997-08-08 2001-12-27 Xiaozhu Huang Treatment of acute lung injury and fibrosis with antagonists of alphavbeta6

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US5223493A (en) 1984-12-28 1993-06-29 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory compounds for ophthalmic use
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
AU613590B2 (en) 1986-11-19 1991-08-08 Bristol-Myers Squibb Company Hybridomas producing monoclonal antibodies to new mucin epitopes
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5804381A (en) * 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9009549D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Recombinant antibody and method
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5962643A (en) 1991-07-11 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Integrin β subunit and uses thereof
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
US5420120A (en) 1993-12-17 1995-05-30 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory glucocorticoid compounds for topical ophthalmic use
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6417324B1 (en) * 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
US5795894A (en) 1995-05-02 1998-08-18 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinn antagonists
US5719156A (en) 1995-05-02 1998-02-17 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinin antagonists
US5696267A (en) 1995-05-02 1997-12-09 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins as neurokinin antagonists
US5688960A (en) 1995-05-02 1997-11-18 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins useful as neurokinin antagonists
US5654316A (en) 1995-06-06 1997-08-05 Schering Corporation Piperidine derivatives as neurokinin antagonists
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997006822A1 (en) 1995-08-17 1997-02-27 Protein Design Labs, Inc. Anti-selectin antibodies for prevention of multiple organ failure and acute organ damage
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
CA2230759C (en) 1995-08-29 2012-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for producing the same
US5691362A (en) 1996-06-05 1997-11-25 Schering-Plough Corporation Substituted benzene-fused hetero- and carbocyclics as nuerokinin antagonists
EP0909277B2 (en) * 1996-06-07 2008-12-24 Poniard Pharmaceuticals, Inc. Humanized antibodies that bind to the same antigen as bound by antibody nr-lu-13, and their use in pretargeting methods
AU6721696A (en) 1996-07-15 1998-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Cd44-like protein
US5789422A (en) 1996-10-28 1998-08-04 Schering Corporation Substituted arylalkylamines as neurokinin antagonists
US5783579A (en) 1996-12-20 1998-07-21 Schering Corporation Spiro-substituted azacyclic-substituted piperazino derivatives as neurokinin antagonists
ATE322508T1 (de) 1998-01-23 2006-04-15 Merck Patent Gmbh Verwendung des antikörpers 271.14d9.f8 (dsm acc2331) um die bindung zwischen alphavbeta6- integrin und fibronectin in vitro zu hemmen
JP2002533064A (ja) 1998-12-19 2002-10-08 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング インテグリンαｖβ６阻害剤
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7776315B2 (en) 2000-10-31 2010-08-17 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and additional active ingredients
DE10063173A1 (de) 2000-12-18 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Harnstoff- und Urethanderivate
EE200300509A (et) 2001-04-13 2004-08-16 Biogen, Inc. Antikehad VLA-1 vastu
DE10118550A1 (de) 2001-04-14 2002-10-17 Merck Patent Gmbh Liganden des Integrins alpha¶nu¶beta¶6¶
GB2380127A (en) 2001-09-26 2003-04-02 Isis Innovation Treatment of chronic joint inflammation
PT2336184E (pt) 2002-02-25 2015-03-09 Biogen Idec Inc Administração de agentes para o tratamento da inflamação
US7465449B2 (en) * 2002-03-13 2008-12-16 Biogen Idec Ma Inc. Anti-αvβ6 antibodies
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
EP1511738A4 (en) 2002-05-17 2007-05-09 Scios Inc TREATMENT OF FIBROPROLIFERATIVE DISEASES USING TGF BETA INHIBITORS
KR20050089151A (ko) 2002-11-26 2005-09-07 프로테인 디자인 랩스 인코포레이티드 혈관형성을 조절하는 α5β1 인테그린에 대한 키메라성 및인간화 항체
US20040253311A1 (en) 2002-12-18 2004-12-16 Roger Berlin Multi-layer tablet comprising non-steroidal anti-inflammatory drugs, decongestants and non-sedating antihist amines
ATE399542T1 (de) 2003-10-01 2008-07-15 Merck Patent Gmbh Alfavbeta3 und alfavbeta6 integrin antagonisten als antifibrotische mittel
CA2544855A1 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Bayer Pharmaceuticals Corporation Immunohistochemical methods
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
WO2008008315A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
WO2008147434A1 (en) 2006-10-19 2008-12-04 The Regents Of The University Of California TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC ASTHMA USING ANTAGONISTS OF INTEGRIN αVβ6
GB0803192D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Mubio Products Bv SCLC biomarker panel
CA2747937C (en) 2008-12-23 2019-02-26 Merck Patent Gmbh Biomarkers for inhibitors with anti-angiogenic activity
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
US20150086570A1 (en) 2012-03-29 2015-03-26 Biogen Idec Ma Inc. Biomarkers for use in integrin therapy applications

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0719859A1 (en) * 1994-12-20 1996-07-03 MERCK PATENT GmbH Anti-alpha V-integrin monoclonal antibody
US20010056076A1 (en) * 1997-08-08 2001-12-27 Xiaozhu Huang Treatment of acute lung injury and fibrosis with antagonists of alphavbeta6

Also Published As

Publication number Publication date
NZ563951A (en) 2009-04-30
RS80704A (en) 2006-12-15
CL2010000788A1 (es) 2011-02-18
JP2009100763A (ja) 2009-05-14
CN102659946A (zh) 2012-09-12
US20090186036A1 (en) 2009-07-23
EP2287198A3 (en) 2011-05-25
BRPI0308585B1 (pt) 2019-10-15
CN1646160A (zh) 2005-07-27
IS7443A (is) 2004-09-09
JP2015126743A (ja) 2015-07-09
CL2010000789A1 (es) 2011-02-18
BR0308585A (pt) 2005-02-01
BRPI0308585B8 (pt) 2021-05-25
ES2389037T3 (es) 2012-10-22
EA200401198A1 (ru) 2005-04-28
CN102924598A (zh) 2013-02-13
CL2010000792A1 (es) 2011-02-18
JP2015091807A (ja) 2015-05-14
AU2003261071C1 (en) 2008-12-11
JP5616932B2 (ja) 2014-10-29
US9745376B2 (en) 2017-08-29
EP1490110A4 (en) 2006-12-27
EP2287199B1 (en) 2017-08-02
JP2013014592A (ja) 2013-01-24
JP4473117B2 (ja) 2010-06-02
EP2287199A2 (en) 2011-02-23
NZ535425A (en) 2008-05-30
EP2336185A1 (en) 2011-06-22
AU2003261071A1 (en) 2003-12-12
US8153126B2 (en) 2012-04-10
CL2010000790A1 (es) 2011-02-18
CL2010000791A1 (es) 2011-02-18
CL2010000786A1 (es) 2011-02-18
KR20040095281A (ko) 2004-11-12
ME00804B (me) 2012-03-20
MY154009A (en) 2015-04-30
US7465449B2 (en) 2008-12-16
WO2003100033A3 (en) 2004-07-15
IL164021A0 (en) 2005-12-18
CN102924598B (zh) 2014-12-31
IL164021A (en) 2013-04-30
MY147019A (en) 2012-10-15
US20150140609A1 (en) 2015-05-21
CA2478833C (en) 2015-11-10
US20120251532A1 (en) 2012-10-04
EP1490110B1 (en) 2012-06-13
AU2003261071B2 (en) 2008-05-15
IL225633B (en) 2021-12-01
EP2287199A3 (en) 2011-05-25
CL2010000787A1 (es) 2011-02-11
IL225633A0 (en) 2014-03-31
NO334834B1 (no) 2014-06-16
PL216223B1 (pl) 2014-03-31
AR038970A1 (es) 2005-02-02
NO20044347L (no) 2004-12-13
RS52488B (en) 2013-02-28
CA2478833A1 (en) 2003-12-04
JP2012228269A (ja) 2012-11-22
CL2010000785A1 (es) 2011-02-18
EP2287198A2 (en) 2011-02-23
PL372662A1 (en) 2005-07-25
KR101098109B1 (ko) 2011-12-26
CN104805090A (zh) 2015-07-29
JP2005528099A (ja) 2005-09-22
HK1213007A1 (zh) 2016-06-24
HK1074381A1 (en) 2005-11-11
WO2003100033A2 (en) 2003-12-04
MXPA04008870A (es) 2005-06-17
EP1490110A2 (en) 2004-12-29
US20050255102A1 (en) 2005-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011853B1 (ru) АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβ
CN102827287B (zh) 用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
EA018260B1 (ru) Антитела к дельта-подобному лиганду 4 человека и их применение
JP2009500041A5 (ru)
JP5238942B2 (ja) ペリオスチンのＥｘｏｎ−１７部位によりコードされるペプチドに対する抗体を含む癌治療剤
CN100509851C (zh) 抗αvβ6抗体
Violette et al. Anti-αvβ6 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent