[go: up one dir, main page]

NO334834B1 - Anti-alfavbeta6-antistoff, celle som produserer slikt antistoff, samt anvendelse av antistoffet for fremstilling av medikamenter - Google Patents

Anti-alfavbeta6-antistoff, celle som produserer slikt antistoff, samt anvendelse av antistoffet for fremstilling av medikamenter Download PDF

Info

Publication number
NO334834B1
NO334834B1 NO20044347A NO20044347A NO334834B1 NO 334834 B1 NO334834 B1 NO 334834B1 NO 20044347 A NO20044347 A NO 20044347A NO 20044347 A NO20044347 A NO 20044347A NO 334834 B1 NO334834 B1 NO 334834B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
amino acid
seq
antibody
acid sequence
set forth
Prior art date
Application number
NO20044347A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20044347L (no
Inventor
Sheila M Violette
Paul H Weinreb
Kenneth J Simon
Dean Sheppard
Diane R Leone
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29586753&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO334834(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc, Univ California filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of NO20044347L publication Critical patent/NO20044347L/no
Publication of NO334834B1 publication Critical patent/NO334834B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1066—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN
Denne oppfinnelsen vedrører generelt området molekylærbiologi og spesielt et blokkerende monoklonalt antistoff mot avP6-integriner, som angitt i krav 1, celler som danner slike antistoffer som angitt i krav 22 samt anvendelse av slike antistoffer for fremstilling av medikamenter spesielt virksomme mot fibrose som angitt i krav 25 og 26.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Integriner er en superfamilie av celleoverflatereseptorer som medierer celle-celle og cellematriks adhesjon. Disse proteinene er kjent for å bringe tilveie forankring så vel som signaler for cellulær vekst, migrasjon og differensiering under utvikling og vedlikehold av vev. Integriner er også implisert i celle-dedifferensiering og invasjon, spesielt hvor celler mister sin spesialiserte form og blir metastaserende kreftceller.
Integriner er heterodimere proteiner bestående av to ikke-kovalent bundne under-enheter, a og p. Bindingsspesifisiteten av integriner dikteres av kombinasjonen av omtrent 18 forskjellige a-kjeder med omtrent 8 forskjellige p-kjeder. avp6-integrinet kan binde til et antall ligander inklusive fibronektin, tenascin, vitronektin og det nylig identifiserte "latency associated peptid" (latensassosiert peptid) "LAP," et 278 aminosyrer stort peptid syntetisert som del av forløper TGF-p proteinet (Munger et al., Cell 96(3)319-328 (1999)). LAP spaltes fra den modne form av TGF-p som et N-terminalt peptid under utskillelse, men forblir ikke-kovalent forbundet med TGF-p for å opprettholde sin latente tilstand. Dette komplekset kan ikke binde til TGF-p reseptoren og er følgelig ikke biologisk aktivt. avP6-integrinet kan binde direkte til et RGD-motiv innbefattet i LAP, hvilket fører til frigjøring av LAP og aktivering av TGF-p. Siden avp6s binding til LAP kan være viktig for omdanningen av TGF-p til dets aktive form, kan blokkering av bindingen føre til inhibering av avp6-mediert aktivering av TGF-p og den assosierte fibrotiske patologi.
Fra US patent 2001/0056076 Al er det kjent antistoffer mot avp6som kan anvendes for fremstilling av medikamenter mot forskjellige sykdommer.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Denne oppfinnelsen baseres på oppdagelse og karakterisering av høyaffinitets-antistoff mot av$ 6, inklusive identifisering og analyse av sentrale aminosyrerester i de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR) av slike antistoff.
Denne oppfinnelsen omfavner et monoklonalt antistoff som (a) spesifikt binder til c-vPe; (b) inhiberer bindingen av avp6til latensassosiert peptid (LAP), med en IC50-verdi lavere enn den av 10D5 (Internasjonal patentsøknad WO 99/07405); og (c) konkurrerer med antistoffet dannet av hybridomet 6.8G6 for bindingen til biotinylert avp6i en buffer omfattende divalente kationer Ca<2+>og Mg<2+>slike antistoffer kan omfatte aminosyresekvenser i CDRene (f.eks. de vist i Figurer 7A og 7B) som bringer til veie bindingsspesifisiteten til avp6. De kan også binde spesifikt til p6-underenheten; og/eller gjenkjenne avp6i immunofargingsmetoder, slik som immunofarging av parafinnedsenket vev.
Det er oppdaget at antistoff som binder til avp6, kan grupperes i biofysisk særskilte klasser og underklasser. En klasse av antistoff utviser evnen til å blokkere binding av en ligand (f.eks. LAP) til avp6(blokkerere). Denne klassen av antistoff kan videre oppdeles i underklasser av kationeavhengige blokkerere og katione-uavhengige blokkerere. Enkelte av de kationeavhengige blokkererne inneholderen arginin-glysin-aspartat (RGD) peptidsekvens, mens de katione-uavhengige blokkerere ikke inneholder en RGD-sekvens. En annen klasse av antistoff utviser evnen til å binde til avp6og blokkerer allikevel ikke binding av avp6til en ligand (ikke-blokkerere).
Som det følger av dette, i enkelte utførelsesformer i henhold til denne oppfinnelse, er enkelte antistoff i henhold til denne oppfinnelse avhengige av divalent kation for binding til avp6, mens andre er divalent kation-uavhengige. Eksempler på kationer er Ca<+>, Mg<2+>og Mn<2+.>
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffet de samme tung og lettkjede polypeptidsekvenser som et antistoff produsert ved hybridom 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 6.2B10, 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5, eller 7.1C5.
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffene en tung kjede hvis komplementari-tetsbestemmelses regioner (CDR) 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består (det vil si med unntak av enkelte konservative variasjoner) av sekvensene i henhold til Sekvens ID nr.: 1, 4 og 7, og/eller en lett kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr.: 10, 13 og 15.
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffene en tung kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr. :3, 5 og 8, og/eller en lett kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr.: 11, 14 og 17.
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffene en tung kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr..: 3, 6 og 9, og/eller en lett kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr..: 12, 14 og 18.
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffene en tung kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr.: 2, 46 og 47, og/eller en lett kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr.: 48, 13 og 16.
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffene en tung kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr.: 49, 51 og 53, og/eller en lett kjede hvis CDRer 1, 2 og 3, i all vesentlighet, henholdsvis består av sekvensene i henhold til sekvens ID nr.: 55, 57 og 59.
I enkelte utførelsesformer omfatter antistoffene henholdsvis tung og lettkjede va-riabelregionsekvenser av
(1) sekvens ID nr.: 19 og 37; (2) sekvens ID nr.: 20 eller 21, og sekvens ID nr.:38; (3) sekvens ID nr.: 22 og.43; (4) sekvens ID nr.: 23 og 44; (5) sekvens ID nr.: 24 og 45; (6) sekvens ID nr.: 25 eller 26 og sekvens ID nr.:42; (7) sekvens ID nr.: 27,28, eller 29, og sekvens ID nr.:39; (8) sekvens ID nr.: 34 eller 35, og sekvens ID nr.:40; (9) sekvens ID nr.: 36 og 41;
(10) sekvens ID nr.: 61 og 63; eller
(11) sekvens ID nr.: 62 og 64.
Denne oppfinnelsen omfavner også sammensetninger omfattende en eller flere antistoff i henhold til denne oppfinnelse og et farmasøytisk akseptabelt bærermateriale. I enkelte av disse sammensetninger konjugeres antistoffene til et cytotoksisk middel (dvs. et middel som forringer levedyktigheten og/eller funksjonene av en celle) som f.eks. et toksin eller a radionuklid. Antistoffene i disse sammensetningene kan være kationavhengige antistoff. Sammensetningene kan administreres til et individ (f.eks. et pattedyr, som f.eks. et menneske) som har eller innehar en risiko for å få en sykdom mediert ved avp5, slik som for å behandle (f.eks. lindre, formilde, redusere, forebygge, utsette begynnelsen av) sykdommen. Eksempler på slike sykdommer innbefatter, men er ikke begrenset til: fibrose (f.eks. forkalkning, arrdannelse, leverfibrose, lungefibrose, og nyrefibrose); psoriasis; kreft (f.eks. epitel kreft; oral, hud, livmorhals, eggstokk, faryngal, laryngal, spiserør, lunge, bryst, nyre eller kolorektal kreft); Alports syndrom; akutte og kroniske skader på lunge, lever, nyre og andre indre organer; og sklerose av lunge, lever, nyre og andre indre organer. Risiko for å få slike sykdommer kan komme fra genetisk predisposisjon, enkelte livsstiler som f.eks. røyking og alkoholisme, eksponering for miljøgifter som f.eks. asbest; fysiologiske betingelser som f.eks. diabetes, hepatittvirusinfeksjon (f.eks. hepatitt C virusinfeksjon), autoimmune sykdommer og medisinske behandlinger som f.eks. strålebehandling.
Denne oppfinnelsen omfavner også celler av hybridomer 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 7.1G10, 7.7G5 og 7.1C5.
Et antistoff i henhold til denne oppfinnelse refererer til et helt antistoff, f.eks. et antistoff omfattende to tunge kjeder og to lette kjeder, eller til et antigenbindende fragment av et helt antistoff som f.eks. et Fab-fragment, et Fab'-fragment, et F(ab')2-fragment eller et F(v)-fragment. Et antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan være et murint antistoff eller en homolog derav, eller et fullstendig humant antistoff. Et antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan også være et humanisert antistoff, et chimerisk antistoff eller et enkeltkjedet antistoff. Et antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan være av hvilken som helst isotype og subtype, f.eks. IgA (f.eks. IgAI og IgA2), IgG (f.eks. IgGI, IgG2, IgG3 og IgG4), IgE, IgD, IgM, hvori de lette kjeder av immunglobulinet kan være av kappa- eller lambdatypen.
I enkelte utførelsesformer kan antistoffet i henhold til oppfinnelsen omfatte en mutasjon (f.eks. delesjon, substitusjon eller addisjon) ved en eller flere (f.eks. 2, 3, 4, 5 eller 6) av enkelte posisjoner i den tunge kjeden slik at effektorfunksjonen av antistoffet (f.eks. evnen av antistoffet til å binde til en Fc-reseptor eller en komplementfaktor) endres uten å påvirke antistoffets antigenbindende evne. I andre utførelsesformer kan antistoffet i henhold til denne oppfinnelse inneholde en mutasjon ved en aminosyrerest som er et sete for glykosylering slik at glykosyleringssetet fjernes. Et slikt antistoff kan inneha klinisk fordelaktige, reduserte ef-fektorfunksjoner eller andre uønskede funksjoner samtidig som dets antigenbindende affinitet beholdes. Mutasjon av et glykosyleringssete kan også være fordel-aktig for prosessutvikling (f.eks. proteinekspresjon og rensing). I stadig videre utfø-relsesformer kan de tunge eller lette kjeder inneholde mutasjoner som øker affinitet eller virkeevne.
Flere av fusjon #6 og fusjon #7 hybridomene ble deponert ved American Type Culture Collection ("ATCC"; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) under Buda-pest-konvensjonen. Hybridomkloner 6.1A8, 6.2B10, 6.3G9, 6.8G6, og 6.2B1 ble deponert den 16. august, 2001, og har henholdsvis aksesjonsnumre ATCC PTA-3647, -3648, -3649, -3645, og -3646. Hybridomkloner 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5, og 7.1C5 ble deponert den 5. desember, 2001, og har henholdsvis aksesjonsnumre ATCC PTA-3896,-3897,-3898, 3899, og -3900. Se tabell 1, infra.
Antistoffene i henhold til oppfinnelsen er anvendbare for behandling av hvilken som helst klinisk uønsket tilstand eller sykdom (som diskutert heri) som medieres ved binding av avp6til sin ligand, som f.eks. LAP og fibronektin. Disse antistoffene kan være mer potente, via høyere affinitet eller aviditet, og katione-avhengighet eller uavhengighet ved binding til ligand, enn tidligere kjente avp6antistoff.
I tillegg til terapeutiske applikasjoner av antistoffene i henhold til oppfinnelsen, særskilt blokkerere, kan den ikke-blokkerende klassen av antistoff anvendes for diagnostiske formål, slik som i antigenbindingsassayer, enzymbundet immunosor-bentassayer (ELISAer), immunohistokjemi og lignende.
Andre særpreg og fordeler i henhold til oppfinnelsen vil være innlysende fra den følgende detaljerte beskrivelse, tegningene og kravene.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figurer IA og IB er stolpediagram som viser resultatene av en cellebindingsassay som bestemte evnen av forskjellige anti-avp6monoklonale antistoff ("mAb") til å binde til p6-transfekterte FDC-P1 celler (ikke-transfekterte celler som kontroll). Figur 2A er en grafisk fremstilling som viser resultatene av ELISA-assayer som bestemte evnen av forskjellige rensede anti-avp6"fusjon 6" monoklonale antistoff til å binde løselig, rekombinant, humant avp6("hsavp6"). Disse antistoffene ble frembrakt ved å immunisere p6-/- mus med løselig, humant, trunkert avp6. Numrene i tegnforklaringen indikerer klonenummeret. For det korresponderende klonenavn, se Tabell 2. Figur 2B er en grafisk fremstilling som viser resultatene av ELISA-assayer som bestemte evnen av forskjellige rensede anti-avp6"fusjon 7" monoklonale antistoff til å binde løselig rekombinant hsavp6. Disse antistoffene ble frembrakt ved å immunisere p6-/- mus med p6-transfekterte NIH 3T3-celler (fusjon #7). Figurer 3A-F er grafer som viser den forskjellige kationeavhengigheten ved binding av forskjellige anti-avP6monoklonale antistoff til hsavP6-Figurer 4A og 4B er grafer som viser at henholdsvis fusjon #6 og fusjon #7 monoklonale antistoff, inhiberer bindingen av biotin-hsavp6til LAP. Figurer 5A-E er grafer som viser at eksemplariske monoklonale antistoff i henhold til oppfinnelsen inhiberer bindingen av p6-transfekterte FDC-Pl-celler til LAP. Figurer 5A og 5B viser resultatene fra fusjon #6 antistoff. Figurer 5C-E viser resultatene fra fusjon #7 antistoff. Figurer 6A og 6B er grafer som viser at henholdsvis fusjon #6 og fusjon #7 antistoff, inhiberer avp6-mediert aktivering av TGF- p, ved anvendelse av en PAI-1 luciferase reportergenassay til å overvåke TGF-p aktivering. Figur 7A viser aminosyresekvensene av de variable regioner av de tunge kjeder av avp6monoklonale antistoff 6.1A8, 6.8G6 (subkloner A og B), 7.7G5, 6.2B1, 6.3G9, 6.2B10 (subkloner A og B), 6.2G2, 6.2A1, 6.4B4 (subkloner A, B og C), 7.10H2, 7.9H5, 7.4A3 (subkloner A og B), 7.1C5 (subkloner A og B) og 7.1G10. Antistoff 6.1A8, 6.8G6 og 7.7G5 er kationeavhengig for binding til avp6, mens antistoff 6.2B1, 6.2A1, 6.3G9, 6.2B10, 6.4B4, 7.1C5 og 7.1G10 er katione-uavhengig (infra). Numrene i parenteser betegner aminosyrerestposisjoner. CDRene er i de store boksene, mens de små boksene inneholdende kursiverte aminosyrer representerer polymorfisme i forskjellige kloner av et spesielt antistoff. Figur 7B viser aminosyresekvensene av de variable regioner av de lette kjeder av av<p>6 monoklonale antistoff 6.1A8, 6.8G6, 6.4B4, 6.2A1, 7.1C5, 7.1G10, 6.2B10, 7.7G5, 6.2B1 og 6.3G9. Figur 8 er et punktdiagram som viser ekspresjonen av avp6i human brystkreft og human skjellet karcinom vevssnitt. Normalt humant vev utviser kun neglisjerbare ekspresjonsnivåer av avp6. Figurer 9A og 9B er kvadratiske kurvediagrammer som illustrerer løsningsbindings-affinitetene av to anti-avp6antistoff, henholdsvis 6.8G6 og 6.3G9, for løselig avp6. Figurer 10A og 10B er stolpediagrammer som demonstrerer evnen av renset monoklonalt antistoff til å konkurrere med henholdsvis biotinylert 6.3G9 og biotinylert 6.8G6, for binding til avp6. Figur 11 er et stolpediagram som viser prosent glatt aktin farging i nyrer fra UUO-dyr behandlet med anti- avp6mAb-behandling. Figur 12 viser avp6ekspresjon i tumorcellelinjer ved FACS-analyse (høyre side av figur) og inhibering av tumorcellelinjers binding til LAP-ligand av mAbs 6.3G9 og 6.4B4 (venstre side av figur). Figur 13 er et stolpediagram som demonstrerer inhibering av tre tumorcellelinjers binding til LAP-ligand av anti-avP6mAber 6.3G9, 6.8G6 og 6.4B4. MAb-binding ble sammenlignet med total binding uten tilsetning av test mAber (TB) og uspesifikk binding til BSA-kontroll alene (NSB). Figurer 14A og 14B er grafer som viser effektene av henholdsvis anti- avp6mAb 6.3G9 og 6.4B4, over en 33 dager lang forsøksperiode på tumorer som oppstår fra subkutant implanterte Detroit 562-celler. Figurer 15A-C er grafer som viser effektene av anti-avp6nnAb på bleomycinindusert lungefibrose. (A) Antistoff behandling med anvendelse av 6.3G9 mAb ble startet ved dag 0 ved tidspunktet for bleomycin administrering og ble undersøkt over en 30 dager lang periode; (B) Antistoff behandling med anvendelse av 6.3G9 mAb ble startet 15 dager etter bleomycin behandling og ble undersøkt over en 30 dager lang periode; (C) Antistoff behandling med anvendelse av 6.3G9, 6.8G6 og 6.4B4 mAber ble startet 15 dager etter bleomycin behandling og ble undersøkt over en 60 dager lang periode. I begge Figurer 15A og 15B representerer stolpediagrammene til venstre ug hydroksyprolin/lunge mens stolpediagrammene til høyre viser prosent økning i hydroksyprolin ovenfor salinebehandlede mus (ingen bleomycin). I Figur 15C viser grafen innhold av hydroksyprolin per lunge.
DETAUERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Denne oppfinnelsen presenterer antistoff som er spesifikke for integrinet avp6. I det minste en av antistoffene (blokkerere) er i stand til å blokkere bindingen av avp6 til LAP eller forebygge aktivering av TGF-p.
Det følgende beskriver de forskjellige fremgangsmåter for å lage antistoffene i henhold til denne oppfinnelse. F.eks. kan antistoff i henhold til denne oppfinnelse også identifiseres ved anvendelse av fagoppvisningsantistoffbibliotek, som f.eks. de beskrevet i Smith, Science 228:1315-7 (1985); U.S. Patenter 5.565.332, 5.733.743, 6.291.650 og 6.303.313. Ytterligere antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan lages ved å koble de tunge kjeder identifisert heri med en ikke-kognat lett kjede, f.eks. en lett kjede identifisert ved fagoppvisningsteknologi.
Ikke- humane hvbridom- antistoff
De monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan frembringes ved vel kjent hybridomteknologi. For å gjøre det immuniseres p6-/- dyr (f.eks. mus, rotter eller kaniner) med rensede eller ubearbeidede avp6-preparater, celler transfekterte med cDNA-konstrukter som koder for av<p6eller begge antigener, celler som konsti-tutivt uttrykker avp6, og lignende. Antigenet kan leveres som renset protein, protein uttrykt på celler, proteinfragment eller peptid derav, eller som nakent DNA eller virale vektorer som koder for proteinet, proteinfragmentet, eller peptidet. Sera av de immuniserte dyr testes deretter for nærvær av anti-avp6antistoff. B-celler isoleres fra dyr som tester positivt, og hybridomer lages med disse B-celler.
Antistoff utskilt av hybridomene screenes for deres evne til å binde spesifikt til avp6
(f.eks. binding til p6-transfekterte celler og ikke til ikke-transfekterte opphavsceller)
og for hvilke som helst andre ønskede karakteristikker, f.eks., med de ønskede CDR konsensussekvenser, inhiberende (eller ikke-inhiberende i tilfelle ikke-blokkerere) overfor bindingen mellom LAP og avp6med en IC50verdi lavere enn det av kjent anti-avp6 antistoff 10D5, eller inhiberende overfor TGF-p aktivering.
Hybridomceller som tester positivt i screeningsassayene dyrkes i et næringsmedium ved betingelser som tillater at cellene utskiller de monoklonale antistoff til kulturmediet. Den kondisjonerte hybridomkultursupernatanten oppsamles deretter og antistoff som finnes i supernatanten renses. Alternativt kan det ønskede antistoff produseres ved å injisere hybridomcellene i bukhinnehulrommet hos et ikke-immunisert dyr (f.eks. en mus). Hybridomcellene prolifererer i bukhinnehulrommet og skiller ut antistoffet som akkumuleres som ascitesvæske. Antistoffet kan deretter høstes ved å trekke ut ascitesvæsken fra bukhinnehulrommet med en sprøyte.
De monoklonale antistoff kan også frembringes ved å isolere antistoffkodende cDNAer fra de ønskede hybridomer, transfektere mammaliske vertsceller (f.eks. CHO eller NSO-celler) med cDNAene, dyrke de transfekterte vertscellene og gjen-vinne antistoffet fra kulturmediet.
Chimeriske antistoff
De monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan også frembringes ved å konstruere et kognat hybridom (f.eks. murint, rotte eller kanin) antistoff. For eksempel kan et kognat antistoff endres ved rekombinant DNA-teknologi slik at deler av eller hele hengsel- og/eller konstante regioner av de tunge og/eller lette kjeder erstattes med de korresponderende komponenter av et antistoff fra en annen art (f.eks. menneske). Generelt forblir de variable regioner av det konstruerte antistoff identisk med eller hovedsakelig identisk med de variable regioner av det kognate antistoff. Et slikt konstruert antistoff kalles et chimerisk antistoff og er mindre anti-genisk enn det kognate antistoff når det administreres til et individ av arten fra hvilket hengsel- og/eller konstante region avledes (f.eks. et menneske). Fremgangsmåter for å lage til chimeriske antistoff er vel kjente innen faget.
De chimeriske antistoff omfattet av denne oppfinnelsen kan inneholde en tung kjede variabel region med en sekvens identisk med (eller hovedsakelig identisk med) hvilken som helst av sekvens ID nr.: 19-24 eller 34-36 og/eller en lett kjede variabel region med en sekvens identisk med (eller hovedsakelig identisk med) hvilken som helst av sekvens ID nr.:37, 38, 40, 41 og 43-45.
Foretrukne humane konstante regioner innbefatter de avledet fra IgGl og IgG4.
Fullstendig humane antistoff
De monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse innbefatter også fullstendig humane antistoff. De kan frembringes ved anvendelse av in vitro-primede humane splenocytter, som beskrevet av Boemer et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991), eller ved anvendelse av fagoppvisnings antistoffbibliotek, som beskrevet i f.eks. U.S.
Patent 6.300.064.
Enkelte andre fremgangsmåter for å produsere fullstendig humane antistoff involverer anvendelsen av ikke-humane dyr som har inaktiverte endogene Ig-loci og er transgene for ikke-rearrangerte humane antistoff tung kjede og lett kjede gener. Slike transgene dyr kan immuniseres med avp6og hybridomer fremstilles deretter fra B-celler avledet derfra. Disse fremgangsmåter beskrives i, f.eks., de forskjellige GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA) publikasjoner/patenter vedrørende transgene mus inneholdende humant Ig-miniloci (f.eks. Lonberg U.S. Patent 5.789.650); de forskjellige Abgenix (Fremont, CA) publikasjoner/patenter med hensyn til XENOMUS (f.eks. Kucherlapati U.S. Patenter 6,075,181, 6,150,584 og 6,162,963; Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994); og Mendez et al., 15(2):146-56 (1997)); og de forskjellige Kirin (Japan) publikasjoner/patenter vedrørende "transomiske" mus (f.eks. EP 843 961, og Tomizulca et al., Nature Geneticsl6:133-1443 (1997)).
Humaniserte antistoff
De monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse innbefatter også humaniserte versjoner av kognate anti-avp6antistoff avledet fra andre arter. Et humanisert antistoff er et antistoff produsert ved rekombinant DNA-teknologi, i hvilket enkelte eller alle aminosyrer av en human immunglobulin lett eller tung kjede som ikke er nødvendig for antigen binding (f.eks. de konstante regioner og rammeverksregionene av de variable regioner) anvendes til å substituere for de korresponderende aminosyrer fra den lette eller tunge kjede av kognate, ikke-humane antistoff. Gjennom et eksempel; en humanisert versjon av et murint antistoff til et gitt antigen har på både dets lette og tunge kjeder (1) konstante regioner av et humant antistoff; (2) rammeverksregioner fra de variable regioner av et humant antistoff; og (3) CDRer fra det murine antistoff. Når nødvendig kan en eller flere rester i de humane rammeverksregioner endres til rester ved de korresponderende posisjoner i det murine antistoff for slik å preservere bindingsaffiniteten av det humaniserte antistoff til antigenet. Denne endringen er enkelte ganger benevnt "tilbake mutasjon." Humaniserte antistoff er generelt mindre sannsynlige til å fremkalle en im-munrespons i mennesker sammenlignet med chimeriske humane antistoff fordi de førstnevnte inneholder betydelig færre ikke-humane komponenter.
Fremgangsmåtene for å frembringe humaniserte antistoff beskrives i, f.eks., Winter EP 239 400; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Queen et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86:10029 (1989); U.S. Patent 6.180.370; og Orlandi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:3833 (1989). Generelt oppnås transplantasjo-nen av murine (eller andre ikke-humane) CDRer på et humant antistoff som følger. CDNAene som koder for tung og lett kjede variable regioner isoleres fra et hybridom. DNA-sekvensene av de variable regioner, inklusive CDRene, bestemmes ved sekvensering. DNAene som koder for CDRene overføres til de korresponderende regioner av et humant antistoff tung eller lett kjede variable regioners kodende sekvens ved setedirigert mutagenese. Deretter tilføyes human konstant region gen-segmenter av en ønsket isotype (f.eks., -yl for CH og k for CL). De humaniserte tunge og lette kjede gener uttrykkes sammen i mammaliske vertsceller (f.eks. CHO eller NSO-celler) for å produsere løselig, humanisert antistoff. For å legge til rette for storskala produksjon av antistoff er det ofte ønskelig å produsere slike humaniserte antistoff i bioreaktorer inneholdende de antistoff-uttrykkende cellene, eller å produsere transgene pattedyr (f.eks. geiter, kyr, eller sauer) som uttrykker antistoffet i melk (se f.eks. U.S. Patent 5.827.690).
Noen ganger fører direkte overføring av CDRer til et humant rammeverk til tap av antigenbindingsaffinitet av det resulterende antistoff. Dette er fordi i enkelte kognate antistoff vekselvirker med enkelte aminosyrer innen rammeverksregionene med CDRene og påvirker således den totale antigenbindingsaffiniteten av antistoffet. I slike tilfeller ville det være kritisk å introdusere "tilbake mutasjoner" (supra) i rammeverksregionene av akseptorantistoffet for å kunne holde tilbake antigenbin-dingsaktiviteten av det kognate antistoff.
Den generelle fremgangsmåten for å gjøre tilbakemutasjoner er kjent innen faget. For eksempel beskriver Queen et al. (supra), Co et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 88:2869-2873 (1991), og WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) en fremgangsmåte som involverer to nøkkeltrinn. Først velges de humane V rammeverksregioner ved computeranalyse for optimal proteinsekvenshomologi til V region rammeverket av det kognate murine antistoff. Deretter modelleres tertiærstrukturen av den murine V region ved bruk av computer for å kunne visualisere rammeverks aminosyrerester som er sannsynlige for å vekselvirke med de murine CDRer, og disse murine aminosyrerester legges deretter over på det homologe humane rammeverk.
Under denne totrinns fremgangsmåten finnes det flere kriterier for å designe humaniserte antistoff. Det første kriterium er å anvende som den humane akseptor rammeverket fra et spesielt humant immunoglobulin, det vil si vanligvis homologt til det ikke-humane donor immunglobulin, eller å anvende et konsensus rammeverk fra mange humane antistoff. Det andre kriterium er å anvende donor aminosyren heller enn akseptoren hvis den humane akseptorrest er uvanlig og donorresten er typisk for humane sekvenser ved en spesifikk rest av rammeverket. Det tredje kriterium er å anvende donor rammeverk aminosyreresten heller enn akseptoren ved posisjoner i umiddelbar nærhet til CDRene.
En kan også anvende en annen fremgangsmåte som beskrevet i, f.eks. Tempest, Biotechnology 9: 266-271 (1991). Under denne tilnærmingsmåten avledes V region rammeverkene fra henholdsvis NEWM og REI lette og tunge kjeder, og anvendes for CDR-transplantering uten radikal introduksjon av musrester. En fordel ved å anvende denne tilnærmingsmåten er at de tredimensjonale strukturene av NEWM og REI variable regioner er kjent fra røntgenkrystallografi og således kan spesifikke vekselvirkninger mellom CDRer og V region rammeverkrester med letthet modelleres.
Andre deler
De monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan videre omfatte andre deler for å påvirke de ønskede funksjoner. For eksempel kan antistoffet bestå av en toksindel (f.eks. tetanustoksin eller ricin) eller et radionuklid (f.eks. mIn eller<90>Y) for dreping av celler målrettet av antistoffene (se, f.eks., U.S. Patent 6.307.026). Antistoffene kan omfatte en del (f.eks. biotin, fluorescerende deler, radioaktive deler, histidinmerke eller andre peptidmerker) for enkel isolering eller påvisning. Anti stoffene kan også omfatte en del som kan forlenge deres halveringstid i serum, f.eks. en polyetylenglykol (PEG) del.
Sykdomsforhold og dyremodeller
Antistoffene i henhold til oppfinnelsen er anvendbare for behandling, inklusive forebygging, av ovp6-medierte sykdommer. Foreksempel kan disse antistoffene anvendes for å behandle fibrose (f.eks. lungefibrose, akutt lungeskade, nyrefibrose, leverfibrose, Alports syndrom og sklerose) ved å blokkere aktivering av TGF-p eller blokkere bindingen av ovp6til hvilke som helst andre ligander, som f.eks. fibronektin, vitronektin og tenascin. Det nye ved denne tilnærmingsmåten innbefatter: (1) den blokkerer aktivering av TGF-p heller enn bindingen av TGF-p til sin reseptor, (2) den kan inhibere TGF-p lokalt (det vil si steder med ovp6-oppregulering) heller enn systemisk, og (3) den inhiberer binding av ovp6til en ligand. For annet enn fibrotiske sykdommer eller betingelser er antistoffene i henhold til oppfinnelsen anvendbare for å behandle kreft eller kreftmetastase (inklusive tumorvekst og invasjon), særskilt epitel-krefttyper. En undergruppe av epitel-krefttyper er skjellet celle karcinom, f.eks., krefttyper assosiert med hode og nakke, oral, bryst, lunge, prostata, livmorhals, faryngal, colon, bukspyttkjertel og eggstokk. Studier med anvendelse av nye ovp6monoklonale antistoff viste at avp6uttrykkes i høy grad i mange epitel-krefttyper, særskilt ved den førende kanten av tumorene. De nye antistoffene kan også anvendes til hvilke som helst andre sykdommer mediert ved avp6, inklusive psoriasis.
De aktuelle behandlingene er effektive på både mennesker og dyr rammet av disse sykdommer. Dyr til hvilke oppfinnelsen er appliserbar omfavner både husdyr og husdyrbesetning, oppdrettet enten som kjæledyr eller for kommersielle formål. Eksempler er hunder, katter, kyr, hester, sauer, svin og geiter.
Effektiviteten av antistoffene i henhold til oppfinnelsen kan testes i forskjellige dyremodeller. Musemodeller for lungefibrose innbefatter bleomycin- (Pittet et al., J. Clin. Invest. 107(12): 1537-1544 (2001); og Mungeretal., supra) og strålings-induserbar lungefibrose (Franko et al., Rad. Res. 140:347-355 (1994)). I bleomy-cinbehandlede mus øker ekspresjonen av ovp6i de epiteliske alveolære celler i lungene. Men p6knockout mus er beskyttet fra bleomycinindusert skade og fibrose.
Musemodeller for nyrefibrose innbefatter COL4A3 -/- mus (se, f.eks., Cosgrove et al., Amer. J. Path. 157:1649-1659 (2000), mus med adriamycinindusert skade
(Wang et al., Kidney International 58: 1797-1804 (2000); Deman et al., Nephrol Dial Transplant 16: 147-150 (2001)), db/db-mus (Ziyadch et al., PNAS USA 97:8015-8020 (2000)), og mus med unilateral ureteral obstruksjon (Fogo et al., Lab Investigation 81: 189A (2001); og Fogo et al., Journal of the American Society of Nephrology 12:819A (2001)). I alle disse modellene utvikler musene nyreskade og fibrose som kan utvikle seg til renalt sammenbrudd. ovp6oppreguleres i den epiteliske kledning av oppadstigende og nedadgående tubuler av nyrene av COL4A3 - /- musene, adriamycinbehandlede mus og mus som gjennomgår unilateral ureteral obstruksjon. Det er sannsynlig at ovp6-ekspresjon også øker i en rekke forskjellige nyreskademodeller.
Anti-dvPemonoklonale antistoff kan også testes for sin evne til å inhibere tumorvekst, fremskridelse og metastase i slike dyremodeller som standard in vivo tumorvekst- og metastasemodeller. Se, f.eks., Rockwell et al., J. Nati. Cancer Inst. 49:735 (1972); Guy et al., Mol. Cell Biol. 12:954 (1992); Wyckoff et al., Cancer Res. 60:2504 (2000); og Oft et al., Curr. Biol. 8:1243 (1998). Viktige avp6-ligander assosiert med kreft kan bestå av TGF-p, hvilket er involvert i metastase (for gjen-nomgang se Akhurst et al., Trends in Cell Biology 11:S44-S51 (2001)), fibronektin og vitronektin.
Effektiviteten av behandlingene i henhold til denne oppfinnelse kan måles med et antall tilgjengelige diagnostiske verktøy, inklusive helsesjekk, blodtester, protein-uriamålinger, creatininnivåer og creatininklarering, pulmonære funksjonstester, plasma blod ureanitrogen (BUN) nivåer, observasjon og opptelling av arrdannelser eller fibrotiske lesjoner, avsetting av ekstracellulær matriks som f.eks. kollagen, glatt muskel aktin og fibronektin, nyrefunksjonstester, ultralyd, magnetisk resonans avbilding (MRI), og CT-scanning.
Farmasøytiske sammensetninger
De farmasøytiske sammensetningene i henhold til denne oppfinnelse omfatter en eller flere antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse, eller farmasøytisk akseptable fragmenter derav, valgfritt med hvilket som helst farmasøytisk akseptabelt bærermateriale. Benevnelsen "bærermateriale" som anvendt heri innbefatter kjente, akseptable adjuvanter og vehikler.
I henhold til denne oppfinnelsen kan de farmasøytiske sammensetningene være i form av et sterilt injiserbart preparat, f.eks. en steril, injiserbar vandig eller olje- aktig suspensjon. Denne suspensjonen kan formuleres i henhold til teknikker kjent innen faget ved anvendelse av passende dispergerende, fuktende og suspenderen-de midler.
De farmasøytiske sammensetningene i henhold til denne oppfinnelse kan gis oralt, topisk, intravenøst, subkutant, intraperitonealt, intramuskulært, intramedulært, intra-artikulært, intrasynovialt, intrasternalt, intratekalt, intrahepatisk eller intrakranialt som ønsket, eller kun lokalt ved lokaliteter med betennelse eller tumorvekst. De farmasøytiske sammensetningene i henhold til denne oppfinnelse kan også administreres ved inhalering gjennom anvendelsen av, f.eks., et forstøvings-apparat, en tørrpulverinhalator eller en målt doseinhalator.
Doseringen og doseringsraten av antistoffene i henhold til denne oppfinnelse som er effektive i å produsere de ønskede effekter, vil være avhengig av en rekke forskjellige faktorer, som f.eks. karakteren av sykdommen som skal behandles, stør-relsen av objektet, målet med behandlingen, den spesifikke farmasøytiske sammensetning som blir anvendt, og vurderingen utført av den behandlende lege. Do-seringsnivåer mellom omtrent 0,001 og omtrent 100 mg/kg kropps-vekt per dag, f.eks. mellom omtrent 0,1 og omtrent 50 mg/kg kroppsvekt per dag av den aktive ingrediens-forbindelse er anvendbare. For eksempel vil et antistoff i henhold til oppfinnelsen administreres ved en dose i området mellom omtrent 0,01 mg/kg kropps-vekt/dag og omtrent 20 mg/kg kroppsvekt/dag, f.eks., i området mellom omtrent
0,1 mg/kg kroppsvekt/dag og omtrent 10 mg/kg kroppsvekt/dag, og ved intervaller fra daglig til hver fjortende dag. I en annen utførelsesform administreres antistoffet ved en dose av omtrent 0,3 til 1 mg/kg kroppsvekt når det administreres intraperitonealt. Alternativt administreres antistoffet ved en dose på omtrent 5 til 12,5 mg/kg kroppsvekt når det administreres intravenøst. I en utførelsesform administreres en antistoffsammensetning i en mengde som er effektiv for å bringe tilveie en plasmakonsentrasjon av antistoff på i det minste 1 mg/ml.
Diagnostiske fremgangsmåter
Antistoffene i henhold til denne oppfinnelse kan anvendes for å diagnostisere sykdomsforhold forbundet med endrede ov(36-ekspresjonsnivåer. En vevsprøve fra et individ, som f.eks. en vevsbiopsi, kroppsvæskeprøve eller skylling (f.eks. alveolær skylling), kan testes i en antigenbindingsassay, ELISA, immunohistokjemiassay og lignende ved anvendelse av antistoffene. En vevsprøve fra et normalt individ anvendes som kontroll.
I praksis vil det anvendes, såfremt ikke indikert annerledes, konvensjonelle teknikker innen cellebiologi, cellekultur, molekylærbiologi, mikrobiologi, rekombinant DNA, proteinkjemi og immunologi, hvilket er kjent innen faget. Slike teknikker beskrives i litteraturen. Se f.eks. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, Ed.), 1984; U.S. Patent 4,683,195 til Mullis et al.; Nucleic acid Hybridization, (B.D. Hames og S.J. Higgins), 1984; Transcription and Translation, (B.D. Hames og S.J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 og 155 (Wu et al., Eds.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. 11. Miller og M.P. Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell og Molecular Biologi (Mayer og Walker, Eds.), 1987; Handbook of Experiment Immunologi, Volumes I-IV (D.M. Weir og CC. Blackwell, Eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, 1986.
Eksempler
De følgende eksempler er ment å illustrere materialene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Passende modifikasjoner og tilpasninger av de beskrevne betingelser og parametere normalt støtt på i antistoff-faget som er innlysende for de med kunnskaper i faget er mulige.
I de følgende eksempler ble p6V- musene frembrakt som beskrevet i Huang et al., J. Cell Biol. 133:921 (1996). Rekombinant humant LAP ble ervervet f ra R & D Systems (Minneapolis, MN). Antistoff 10D5 ble ervervet fra Chemicon (Temecula, CA). L230-hybridomet ble ervervet fra ATCC og det utskilte antistoff ble renset fra supernatanten av mettede kulturer ved affinitetskromatografi på immobilisert protein A. Isotyping av antistoff ble utført ved anvendelse av ISOSTRIP-kit (Roche Diagnos-tics) i henhold til produsentens instruksjoner. Den p6-transfekterte SW480-cellelinje ble forberedt som beskrevet i Weinacker et al., J. Biol. Chem. 269:6940-6948
(1994).
Eksempel 1: Frembringelse av B^- transfekterte stabile cellelinjer
<p>6-transfekterte NIH 3T3 og FDC-P1 celler ble frembrakt ved å elektroporere opp-havscellelinjer med et DNA-konstrukt inneholdende full-lengde murint p6cDNA og en neomycin utvelgbar markør. Stabilt transfekterte celler ble valgt ved å passere celler i kulturmedium inneholdende G418 i 14 dager etterfulgt av fluorescerende
aktivert cellesortering (FACS) til å isolere celler som uttrykker det høyeste nivå av overflate-B6. Transfekterte FDC-Pl-celler ble dyrket i DMEM tilsatt 4 mM L-glutamin justert til å inneholde 1,5 g/L natriumbikarbonat, 4,5 g/l glukose, og 1,0 mM natriumpyruvat, 10 % FBS, 2,5 % muse IL-3 kultursupplement, og 1,5 mg/ml aktiv G418. Transfekterte NIH 3T3-celler ble dyrket i DMEM tilsatt 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, penicillin/streptomycin, og 1 mg/ml aktivt G418.
Eksempel 2: Rensing av humant løselig o„Bfi
ovB6-proteinet ble renset i all vesentlighet som beskrevet i Weinacker, supra. En CHO-cellelinje uttrykkende hsavB6ble dyrket og den resulterende supernatant samlet ved sentrifugering. Integrinet ble renset ved affinitetskromatografi ved anvendelse av anti-ov antistoff L230. Renset L230 ble kryssbundet til CNBr-aktivert Sepharose 4B (Sigma) ved et forhold på 4,8 mg antistoff/ml resin. avB6-supernatanten ble påsatt ved 0,5 mg antistoff/ml resin på L230-affinitetskolonnen, og kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer av hvert av (1) 50 mM Tris-CI, pH 7,5, 1 M NaCI, 1 mM MgCI2; (2) 50 mM Tris-CI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 1 mM MgCl2; og (3) 10 mM Na3P04, pH 7,0. HsovB6ble eluert med 100 mM glysin, pH 2,5 i 1:10 volum av 1 M Na3P04, pH 8,0. Proteinet ble dialysert med flere utskiftinger mot fosfatbuffret saline (PBS) og lagret ved 20 °C.
Eksempel 3: Immunisering av Bk-/- mus
B6-/- mus ble immunisert ved intraperitoneal (IP) injisering med 25 ug av renset rekombinant humant ovB6emulgert i komplett Freund's adjuvant (CFA) ved et vo-lumforhold av 1:1 i et totalt volum av 200 ul. Alternativt ble B6-/- mus immunisert via IP injisering med 4 X IO<6>B6-transfekterte NIH 3T3-celler resuspendert i 100 ul PBS tilsatt 1 mg/ml CaCI2og 1 mg/ml MgCl2, og de samme musene ble injisert i et inntilliggende sted med 100 ul CFA. To uker og fire uker etter innledelse av immu-niseringen ble musene boostet på lignende måte med de samme reagenser med unntak av at ukomplett Freund's adjuvant ble anvendt i stedet for CFA. Musene ble tappet for blod 7 dager etter den endelige boost og anti- B6-titere ble bestemt ved binding av serumet til renset rekombinant humant ovB6eller til B6-transfekterte celler. I tilfellet med mus immunisert med renset rekombinant humant avB6ble musene hvilt i 3 måneder og reimmunisert med det samme antigen blandet med Immu-nEasy (Qiagen). Tre dager før isolering av milter for hybridomfusjoner ble musene immunisert med 12,5 ug av renset rekombinant humant ovB6protein ved både IP og intravenøs injisering. På fusjonsdagen ble dyrene avlivet og deres milter fjernet og malt opp til suspensjoner med enkeltceller. Splenocyttene ble immortalisert ved fusjonering til en cellefusjonspartner som kan selekteres for bruk med medikamenter.
Eksempel 4: Screening av hybridomer
To grupper av antistoff ble frembrakt gjennom immunisering av B6-/- mus. Et sett av antistoff ble frembrakt gjennom immunisering med løselig humant trunkert ovB6(fusjon #6). Det andre settet av antistoff ble frembrakt gjennom immunisering med murine B6-transfekterte NIH 3T3-celler (fusjon #7). Screening for anti-ovB6 antistoff ble gjennomført ved anvendelse av både cellebaserte og celleløse bindingsassayer og funksjonelle assayer som beskrevet nedenfor. Begynnende seleksjon av positive kloner ble basert på binding til renset hsovB6og B6-transfekterte humane og murine celler (ikke-transfekterte celler som kontroll). Valgte kloner ble ekspandert og endelige kulturer ble re-evaluert for binding til både B6-transfekterte og ikke-transfekterte celler i cellebindingsassay (Eksempel 5b, infra) (representative eksempler vist i figurer IA og IB, hvor prefiksene "6." eller "7." av mAb-navnene, hvilke henholdsvis betegner fusjon 6 og fusjon 7, utelates; se også Tabell 2 nedenfor). Enkelte antistoff bandt fortrinnsvis til de B6-transfekterte cellene, mens andre bandt til både transfekterte og ikke-transfekterte celler, hvilket indikerer at kun en delmengde av antistoffene hadde en preferanse for B6(Figurer 1 A og 1 B). Videre seleksjon ble basert på evnen av antistoffet til å blokkere binding av både biotinylert hsavB6og B6-transfekterte murine celler til LAP. Valgte kloner ble underklonet ved anvendelse av FACS og lagret frossent inntil bruk.
Monoklonale antistoff ble screenet for bindingsspesifisitet til ovB6basert på deres evne til å binde B6-transfekterte celler og ikke ikke-transfekterte opphavsceller. Monoklonale antistoff ble videre fastslått som spesifikke bindere av ovB6og ikke av andre av integriner eller ikke-spesifikke integriner (det vil si ikke-ov integriner som binder til RGD-inneholdende ligander) basert på deres manglende binding til cellelinjer som uttrykker avB3, ovB8,O5B1, ovBi eller o5Bi. Disse inkluderte stabile transfekterte celler så vel som ikke-transfekterte JY, K562, SW480, NIH3T3, og FDCP1-cellelinjer.
Enkelte av antistoffene som er deponert ved ATCC listes opp nedenfor i Tabell 1.
Eksempel 5: Assaver for screening og karakterisering
a. QwBft ELISA
En 96-brønns vevskulturskål (Corning COSTAR EASY-WASH) ble belagt med 50 ul/brønn av 5 ug/ml hsovB6 ved 4 °C natten over. Platen ble vasket med vaskebuffer (0,1 % TWEEN-20 i PBS) fire ganger i en automatisert platevasker. Deretter ble 180 pl/brønn av 3 % BSA i TBS tilsatt og skålen inkubert i 1 time ved 25 °C for å blokkere uspesifikk binding. Platen ble vasket som ovenfor, og fortynninger av enten hybridomsupernatant (for screeningsassayer) eller renset antistoff (for karakterisering) i TBS inneholdende 1 mg/ml BSA, 1 mM CaCl2, og 1 mM MgCl2ble tilsatt (50 ul/brønn). Platen ble inkubert i 1 time ved 25 °C, vasket og deretter inkubert i 1 time med 50 ul/brønn peroksidkonjugert geit anti-mus IgG+A+M antistoff (Cap-pel). Bundet antistoff ble påvist ved anvendelse av 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB). Binding ble indikert ved absorbansen målt ved 450 nm.
b. Cellebindingsassav
En 96-brønns vevskulturskål ble belagt med 50 pl/brønn sekundært antistoff (esel anti-mus IgG (Jackson Immunoresearch); 5 (ug/ml fortynnet i 50 mM natriumbikarbonat, pH 9,2) ved 4 °C natten over. Platene ble vasket to ganger med 100 ul/brønn prøvebuffer (RPMI + 2 % BSA) og deretter blokkert med 100 pl/brønn av prøvebufferen ved 37 °C i 1 time. For FDC-PI-celler og B6-transfekterte FDC-P1-celler ble plater blokkert med anti-mus lg (Jackson ImmunoResearch; 20 ug/ml) i 10 minutter ved romtemperatur for å redusere ikke-spesifikk Fc-reseptorbinding av sekundært antistoff (utelatt for andre celletyper). Mens platene ble blokkert ble cellene merket med 2 uM fluorescerende fargestoff (Calcein-AM, Molecular Probes) i prøvebuffer ved 5 X IO<6>celler/ml. Cellene ble inkubert med fargestoffet i prø-vebufferen med forsiktig rysting i et 37 °C vannbad i 15 minutter, samlet ved sentrifugering og resuspendert i prøvebuffer til 5 X IO<6>celler/ml. Etterfølgende blokkeringstrinnet ble bufferen kastet ved å flikke platen og 25 ul/brønn av supernatant eller renset antistoff ble tilsatt platen. Etterfølgende en 15 minutters inkubering ved 37 °C ble 25 pl/brønn av merkede celler tilsatt og ble inkubert i 1 time ved 37 °C. Platen ble vasket 3-5 ganger med prøvebufferen (100 pl/brønn) og fluorescens emittert av bundne celler på platen ble registrert. Bindingsprosenten ble bestemt ved å sammenligne fluorescensen før det endelige vasketrinnet (det vil si totalt antall celler tilsatt) til det etter vasking (det vil si bundne celler).
c. FACS
Celler ble høstet ved trypsinisering, vasket en gang i PBS og deretter resuspendert i FACS-buffer (IX PBS, 2 % FBS, 0,1 % NaN3, 1 mM CaCl2og 1 mM MgCl2). 0,2 X IO<5>celler ble deretter inkubert på is i 1 time i FACS-buffer inneholdende hybridomsupernatant i et totalt volum på 100 ul. Etter inkubering ble cellene vasket to ganger med iskald FACS-buffer, resuspendert i 100 ul FACS-buffer inneholdende 5 ug/ml esel anti-mus IgG PE (Jackson ImmunoResearch) og inkubert på is i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket to ganger med iskald FACS-buffer og resuspendert i 200 ul FACS-buffer. Binding av det PE merkede sekundære antistoffet ble undersøkt ved strømningscytometri.
d. Binding av biotin- hsCvBktil LAP
96-brønns vevskulturskåler (Corning COSTAR EASY-WASH) ble belagt med 0,3 ug/ml rekombinant humant LAP (R&D Systems, Cat. # 246-LP) fortynnet i PBS (50 ul/brønn) ved 4 °C natten over. Etter at belegningsløsningen ble fjernet ble platene blokkert med 180 pl/brønn 3 % BSA/TBS ved 25 °C i 1 time. I en separat 96-brønns rundbunnet plate ble 60 pl/brønn av en 2X utgangsløsning (0,5 ug/ml (1.25 nM) biotin-avB6, 2 mM CaCI2, og 2 mM MgCl2i TBS inneholdende 1 mg/ml BSA) kombinert med 60 pl/brønn av en 2X utgangsløsning av enten en hybridomsupernatant (for screening) eller et renset antistoff (også i TBS-inneholdende 1 mg/ml BSA) og inkubert ved 25 °C i 1 hr. Etter vasking av den LAP-dekkete platen med vaskebuffer (0,1 % TWEEN-20 i PBS) 4 ganger i en automatisert platevasker ble 100 ul av antistoff-ovB6blandingen overført til platen og inkubert i 1 time ved 25 °C. Platen ble vasket som ovenfor og inkubert med 50 ul/brønn av en 1:1000
fortynning av ekstravidin-pepperrotperoksidasekonjugat (Sigma) i TBS (1 mg/ml BSA) i 1 time ved 25 °C. Bundet protein ble påvist ved anvendelse av TMB-subst ratet.
e. Adhesjon av Bk- FDC- PI celler til LAP
En 96-brønns vevskulturskål ble belagt med 50 pl/brønn 0,5 (ug/ml rekombinant humant LAP (R&D Systems) fortynnet i 50 mM natriumbikarbonat, pH 9,2 ved 4 °C natten over. Platen ble vasket to ganger med PBS (100 pl/brønn) og blokkert med 1 % BSA i PBS (100 ul/brønn) i l time ved 25 °C. Platen ble vasket to ganger med 100 ul/brønn prøvebuffer (TBS komplett med 1 mM CaCI2og 1 mM MgCI2). Deretter ble det tilsatt 25 ul av en hybridomsupernatant (eller et renset antistoff) til de enkelte brønner på platen og 25 ul B6-FDC-P1 celler (5 X IO6 celler/ml, merket med Calcein AM som beskrevet ovenfor). Platen ble inkubert ved 25 °C i 1 time og deretter vasket 4-6 ganger med prøvebufferen (100 ul/brønn). Fluorescensen emittert fra celler bundet på platen ble registrert. Bindingsprosent ble bestemt ved å sammenligne fluorescenssignalet før det endelige vasketrinnet (det vil si totalt antall celler tilsatt) med det etter vasking (det vil si bundne celler).
f. TGF- B- bioassav
TGF-B-bioassayen anvendt heri var en variasjon av mink lungeepitelcelle (MLEC) PAI-1 luciferase samkulturassayen beskrevet i Abe et al., Anal. Biochem. 216:276-284 (1994), i hvilken B6-transfekterte celler ble samkultivert med reportercellene for å overvåke aktivering av TGF-B av avB6(Munger, supra). Dette er en kvantitativ bioassay for TGF-B basert på dets evne til å fremkalle ekspresjon av plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1). I denne assayen transfekteres MLEC-celler stabilt med et ekspresjonskonstrukt inneholdende en trunkert PAI-1 promoter fusjonert til ild-flue-luciferase reportergenet. Eksponering av de transfekterte MLEC-cellene overfor aktiv TGF-B (0,2 til > 30 pM) fører til en doseavhengig økning i aktivitet av luciferase i cellelysatene.
For å gjennomføre denne assayen ble TMLC (mink lungeepitel cellelinje Mv 1 Lu) celler transfektert med PAI-l-luciferasekonstruktet. De transfekterte cellene ble dyrket i DMEM + 10 % FBS med L-GIn, Pen/Strep og 200 ug/Ml G418. SW480 celler transfektert med et integrin-B6-konstrukt ("B6-SW480" eller "SW480 B6" celler) ble dyrket i DMEM + 10 % FBS med L-GIn og Pen/Strep. Celler ble hevet fra flasker med PBS + 5 mM EDTA, vasket i PBS + 0,5 % BSA, telt i hemocytometer og utplassert i 96-brønns skåler. SW480-B6celler ble utplassert ved 4 X IO4 celler/brønn i vaskebufferen. Monoklonale antistoff ble fortynnet i DMEM (uten serum), tilsatt SW480-B6-cellene og pre-inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. TMLC celler ble deretter tilsatt ved 2 X 104 celler/brønn til et endelig volum på 100 ul. Platene ble inkubert i 20 timer i en fuktet, C02-anriket inkubator. Supernatant fra platene ble kastet og erstattet med 100 ul PBS + 1 mM Ca<2+>og 1 mM Mg<2+>. Celler i platene ble deretter lysert og nivået av luciferase-aktivitet ble påvist med "glow-type reaction Packard LUCLITE"- kit (#6016911) og TROPIX mikroplate luminometer.
Eksempel 6: Antistoffrensinq
Åtte hybridomkloner fra fusjon #6 (betegnet ved prefikset "6.") og fjorten hybridom kloner fra fusjon #7 (betegnet ved prefikset "7.") ble valgt for videre oppska-lering og karakterisering (Tabell 2).
En småskala kultur (150 ml) av hvert hybridom ble forberedt og supernatanten oppsamlet ved sentrifugering. Antistoff ble renset fra disse supernatantene ved anvendelse av Protein A affinitetskromatografi. For IgG2a-isotype antistoffet ble supernatanten direkte satt på Protein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham. Pharmacia Biotech, AB, Uppsala, Sverige) (1 ml sedimentert sengvolum). Kolonnen ble vasket med PBS og IgG-fraksjonen ble eluert ved anvendelse av 25 mM fosforsyre, 100 mM NaCI, pH 2,8 i 1:20 volum av 0,5 M Na3P04, pH 8,6. For det murine Igd-antistoff ble supernatanten justert til 1,5 M glysin, 3 M NaCI, pH 8,9 før påsetting og kolonnen ble vasket med 25 mM Na3P04, 3 M NaCI, pH 8,6 før eluering. Disse preparater ble anvendt for in vitro biokjemisk karakterisering beskrevet heri.
For anvendelse i dyremodeller ble hybridomkloner skalert opp til 2L medium og dyrket i 4 uker i Lifecell Culture Bags-PL732 (Nexell, Cat. No. R4R2113). Antistoff fra hybridomene ble renset først ved Protein A affinitetskromatografi som beskrevet ovenfor, etterfulgt av et ionebyttetrinn på Q Sepharose (Amersham Pharmacia). Eluatet fra det protein A-kromatografiske trinnet ble justert til pH 8,6 ved anvendelse av 2 M Tris base, fortynnet 10-ganger med vann, og satt på en Q Sepharose kolonne (20 mg protein/ml resin) som var ekvilibrert i 10 mM Na3P04, 25 mM NaCI, pH 8,6. Kolonnen ble vasket med 5 kolonnevolumer av ekvilibreringsbuffer og bundet protein ble eluert ved anvendelse av 25 mM Na3P04, 150 mM NaCI, pH 7,2. De eluerte proteinene ble sterilfiltrert (0,45 um) og lagret ved -70 °C inntil bruk.
Eksempel 7: Karakterisering av rensede antistoff
De rensede antistoffene (Tabell 2, supra) blekarakterisertkvantitativt med hensyn til deres evne til (1) å binde hsavB6, (2) binde B6-transfekterte SW480 og FDC-P1-celler, (3) inhibere binding av biotin-avB6til LAP, (4) inhibere binding av B6-transfekterte FDC-Pl-celler til LAP, og (5) blokkere avB6-mediert aktivering av TGF-B i MLEC-assayen (supra). Den relative virkeevne i hver av disse assayer ble sammenlignet med den av det kjente avB6antistoff 10D5 (Huang et al, J Cell Sei. 111:2189 (1998)) og, i enkelte tilfeller, anti-av antistoffet L230. For karakte-riseringen av fusjon #7-antistoff ble også fusjon #6-antistoffet 6.8G6 anvendt som positiv kontroll.
Et initielt bindingseksperiment (Eksempel 5a, supra), utført i nærvær av 1 mM Ca<2+>og 1 mM Mg<2+>, indikerte at et flertall av de rensede antistoffene bandt til hsavB6(Figurer 2A og 2B). Uventet ble dog ingen binding observert for 10D5 og kloner 7.2F5 og 7.10D7. Et påfølgende eksperiment påviste at binding av 10D5 (Figur 3E), 7.2F5 og 7.10D7 kun ble svakt støttet av Ca<2+>/ Mg<2+>, men mye sterkere av 1 mM MnCI2. Iblant de nye klonene viste tre (6.1A8 (Figur 3A), 7.7G5, og 6.8G6 (Figur 3C) et behov for divalente kationer, selv om ingen forskjell mellom Ca<2+>/ Mg<2+->tilstanden og den Mn<2+->bundne tilstanden ble observert.
De resterende kloner viste intet behov for divalente kationer, det vil si at de kunne binde til antigenet i nærvær av 10 mM EDTA (Figurer 3B, 3D og 3F). FACS-analyse av antistoffbinding til B6-transfekterte NIH 3T3-celler eller SW480-celler viste et lignende mønster, med unntaket av at 10D5, i denne sammenhengen, bandt like-verdig i Ca<2+>/Mg<2+>og Mn<2+->formene. Betingelsene for binding til løselig avB6kan skille seg fra de for binding til celleoverflateuttrykt avB6på grunn av en forskjell i proteinstruktur eller aviditetseffekter.
Disse resultatene antyder at det finnes i det minste 3 forskjellige klasser av B6-blokkerende antistoff i denne gruppen. En av klassene (10D5) skiller mellomCa<2+>/Mg<2+>og Mn<2+->forholdene. En annen klasse (inklusive 6.1A8, 7.7G5, og 6.8G6) fordrer kation, men skiller ikke mellom Ca<2+>/Mg<2+>og Mn<2+>. Den siste klassen (inklusive anti- av antistoff L230, 6.2B10, 6.3G9 (Figur 3B), og 6.2B1 (Figur 3D), 7.1C5, og 7.1G10) er katione-uavhengig.
De rensede antistoffene ble deretter evaluert for deres evne til å inhibere avB6-LAP-vekselvirkningen. I assayen uten celler i henhold til eksempel 5d, supra, viste anti stoff 6.1A5, 6.2B1, 6.3G9, og 6.8G6 IC50-verdier lavere enn det av 10D5 (Figur 4A; Tabell 3). 6.2B10 viste en høyere IC50men ga fremdeles fullstendig inhibering (Figur 4A). 6.4B4 viste kun delvis inhibering, mens 6.6B5 og 6.8B4 ikke viste noen inhibering (Figur 4A). Ved anvendelse av det samme assaysystem viste antistoff 7.1C5, 7.1G10, 7.2A1, 7.4A3, 7.7G5, 7.9G8, 7.9H5, og 7.10H2 IC50-verdier lavere enn det av 10D5 (Figur 4B; Tabell 3). Antistoff 7.2F5, 7.2H2 og 7.8H12 utviste nærmest identisk eller høyere IC50-verdier og ga fremdeles en fullstendig inhibering (Figur 4B).
I den cellulære assay beskrevet i eksempel 5e, supra, ble en lignende trend observert, med unntak av 6.1A8, 6.2B10 og 7.9D4, hvilket var mye mindre potente overfor celler enn overfor renset protein (Figurer 5A-E; Tabell 3).
Samlet indikerer disse resultatene at det har vært mulig å generere antistoff som spesifikt inhiberer vekselvirkningen av både humant og murint avB6med LAP. Enkelte av disse antistoffene bandt til avB6med høy affinitet (tilsynelatende Kder >0,3nM, som bestemt ved strømningscytometre), inhiberte binding av B6-transfekterte celler til LAP med en IC50>0,05 nM (8 ng/mL), og forhindret avB6-mediert aktivering av TGF-B 1 med en IC50>0,58 nM (87 ng/mL).
Til slutt ble de rensede antistoffene evaluatert for deres evne til å blokkere en B6-mediert aktivering av TGF-B i PAI-l/luciferase reportergenassayen (Eksempel 5f,
supra). Enda en gang var 6.3G9, 6.8G6, 6.2BI, 7.1G10, og 7.7G5 i stand til å inhibere avB6-mediert aktivering av TGF-B med IC50-verdier lavere enn 10D5, mens de resterende antistoff virket å være signifikant mindre potente i denne assayen (Figurer 6A og 6B; Tabell 3). Således korreleres evnen til å blokkere avB6s vekselvirkning med LAP med evnen til å inhibere aktivering av TGF-B in vitro.
Deretter ble løsningsaffinitetene av 6.3G9 og 6.8G6 for løselig avB6bestemt ved anvendelse av en kinetisk utelukkelsesassay (KinExA). En serie fortynninger av lø-selig integrin (1 X IO"<8>M til 2,4 X IO"12 M) ble inkubert med 1 X IO"10M av antistoffet i 3 timer. Disse prøver ble deretter sendt gjennom polymetylmetakrylatkuler dekket med integrinet ved anvendelse av et KinExA-instrument (Sapidyne-Instruments, Inc., Boise, Idaho). I tilfellet med 6.8G6 ble 1 mM CaCI2og 1 mM MgCl2inkludert i inkuberings- og prøvebufferene. Mengdene av bundet og fritt antistoff ble bestemt ved anvendelse av et Cy5-merket anti-mus sekundært antistoff. Kvadratisk kurvetilpasning ble utført ved anvendelse av KinExA-programvaren for å oppnå en dissosieringskonstant (Kd) for hver vekselvirkning. Kd'ene bestemt ved anvendelse av denne fremgangsmåten var 15,6 pM for 6.3G9 og 22,8 pM for 6.8G6 (Figurer 9A og 9B). Følgelig hadde begge disse antistoffene svært høye affiniteter for ovB6.
Videre ble det identifisert klasser av anti-ovB6antistoff som gjenkjente "aktiverte" tilstander av integrinet. Det finnes to potensielle aktiveringstilstander av avB6. I den første tilstanden defineres det aktiverte integrin som å ha en høyere affinitet for sin ligand. Antistoff spesifikt for denne aktiverte tilstand utviste forsterket binding til integrinet i nærvær av aktiverende kationer som f.eks. 1 mM MnCI2. En sammenlig-ning av omfanget av binding i 1 mM MnCI2og 1 mM MgCI2(ikke-aktiverende kation) ved strømningscytometri indikerte at enkelte av avB6-antistoffene beskrevet her, inklusive 6.1A8 og 6.6B5, utviste signifikant forsterket binding i nærvær av MnCl2.
I en andre aktivert tilstand av ovB6kan integrinet aktivere latent TGF-B som beskrevet ovenfor. En cellelinje for å uttrykke trunkert ovB6(SW480(B6770T)) ble forberedt. Cellelinjen var i stand til å binde LAP, men kunne ikke aktivere TGF-B i TMLC luciferaseassayen (Munger et al., supra). Antistoff som binder til full-lengde B6-transfekterte SW480-celler, men ikke til de 770T trunkerte transfekterte cellene, var således spesifikk til formen av avB6som er i stand til å aktivere TGF-B. Antistoff 7.8B3 og 7.8C9 møtte dette kriterium.
Eksempel 8. Epitopkartleqqinq ved antistoff konkurranse
De rensede monoklonale antistoff ble også testet for deres evne til å konkurrere med 6.8G6 for binding til biotinylert ovB6i et ELISA-format. I denne assayen ble 6.8G6 belagt på en ELISA-plate og en blanding av det konkurrerende antistoff og biotinylert avB6ble tilsatt i en buffer inneholdende 1 mM hver av Ca<2+>og Mg<2+>. Bundet integrin ble påvist ved anvendelse av ekstravidin-HRP konjugat og konkurrerende antistoff ble bedømt for sin evne til å blokkere binding. Alle konsensusblokkerere (Tabell 2) foruten 6.2B10 (en svak blokkerer) ble vist å ha evne til å konkurrere med 6.8G6 i forskjellig grad (Tabell 4). Disse dataene bekrefter at disse konsensusblokkerere binder til de samme eller overlappende epitoper som 6.8G6. De rensede monoklonale antistoff ble undersøkt for sin evne til å konkurrere med biotinylert 6.3G9 eller biotinylert 6.8G6 for binding til avB6 i ELISA. I denne assayen ble umerket avB6belagt på en ELISA-plate og en blanding av det konkurrerende antistoff og det biotinylerte antistoff ble tilsatt i en buffer inneholdende 1 mM hver av Ca<2+>og Mg<2+>. Bundet biotinylert antistoff ble påvist ved anvendelse av neutravi-din-HRP-konjugat. Dataene viste at de mest potente blokkerende antistoff (f.eks. 6.2B1, 7.1C5, og 7.1G10) konkurrerte med både 6.3G9 og 6.8G6 for binding til avB6(Tabell 4.1 og Figurer 10A og 10B). Antistoff 6.1A8 og 7.7G5 utviste mindre konkurranse, sannsynligvis på grunn av deres lavere affinitet for avB6. Noen av de ikke-blokkerende antistoff eller anti- av antistoffet L230 viste noen som helst konkurranse med 6.3G9 eller 6.8G6 i denne assayen. Disse resultatene indikerer at det avB6-spesifikke blokkerende antistoff binder til det samme eller overlappende epitoper på avB6.
Eksempel 9: CDR- sekvenser
CDNAene for enkelte av de rensede monoklonale antistoff ble isolert og sekvenserte ved anvendelse av vanlige teknikker som beskrevet i Coligan et al. (eds), Current Protocols in Immunology, Wiley, Media, PA (2001). De avledede aminosyresekvenser er vist i Figurer 7A og 7B.
Aminosyresekvenser av den tunge kjede CDRer av høyaffinitetsbindere 6.8G6, 6.1A8, 6.2B1, 6.3G9 og 6.2A1 og av ikke-blokkerende 6.2G2 er sammenlignet som følger (tankestrek indikerer mellomrom).
I sekvens ID nr. 7 indikerer "R" i halvfet (den tolvte rest) at den er underlagt polymorfisme og kan være f.eks. en Q.
Aminosyresekvenser av den lette kjede CDRer av disse fire høyaffinitetsbindere og av ikke-blokkerere 6.2G2 sammenlignes som følger.
Som vist i figurer 7A og 7B synes de mAber som faller innunder den divalent kation-avhengige klasse (f.eks. 6.1A8 og 6.8G6) å inneholde svært lignende aminosyresekvenser innen CDRene, mens de divalent kation-uavhengige mAber (f.eks. 6.2B1 og 6.3G9) inneholder et annet sett av motiver i sine CDRer.
Virkeevnen og spesifisiteten av anti-avB6monoklonale antistoff kan være styrt av subtilt forskjellige aminosyrerester. I tilfellet med 6.1A8 og 6.8G6 er aminosyresekvensene av de variable regioner svært like, inneholdende 10 aminosyreforskjeller i den tunge kjeden, tre av hvilket er konservative, og 11 aminosyreforskjeller i den lette kjede. Enda har disse antistoffene en grovt regnet 100-ganger stor forskjell i aktivitet i in vitro assayer. Aminosyreforskjellene er spredt utover i de variable regioner av polypeptidkjedene og disse rester kan virke alene eller synergistisk med rester på den samme kjede eller partnerkjeden og slik påvirke antistoffenes virkeevne. I den tunge kjeden er sju rester lokalisert slik at de sannsynligvis er i nærhet av, eller spiller en aktiv rolle ved binding til, avB6.
Et RGD-motiv finnes i et antall integrinbindende proteiner (ligander). Dette motivet er vist å mediere deres vekselvirkning med integriner ved å direkte være i kontakt med bindingslommen på integrinet. Fordi RGD i seg selv er nokså vanlig blant integrinbindende proteiner må flankerende rester utenfor motivet spille en rolle i å overføre bindingsspesifisitet til vekselvirkningen integrin-ligand. I 6.1A8 og 6.8G6 er en slik flankerende rest ved posisjon 101 i den tunge kjeden, innen CDR3. Denne aminosyre resten flankerer RGD-motivet og kan være lokalisert ved setet for anti-gengjenkjennelse og derved bidra til bindingspotens og spesifisitet.
Andre forskjellige rester innen de samme tunge kjede CDRer av 6.1A8 og 6.8G6 innbefatter de ved posisjon 33 (CDR1); posisjoner 52, 57, og 65 (CDR2); og posisjon 115 (CDR3). En annen forskjell i den tunge kjeden ligger ved posisjon 4 i rammeverk 1, hvilket er nær N-terminus. Denne resten forutsies av krysta I log råfis-ke modeller til å folde nært til CDRene av antistoffet og kan spille en viktig rolle ved avB6-binding. De tre gjenværende forskjeller mellom 6.1A8 og 6.8G6 er konservative forskjeller ved posisjoner 20 (rammeverk 1), 44 (rammeverk 2) og 82 (rammeverk 3).
Aminosyresekvensene av de kation-uavhengige antistoff er også høyst homologe. De kan oppdeles i to klasser: de som konkurrerer med det RGD-inneholdende antistoff 6.8G6 (det vil si 6.2B1, 6.3G9, 7.10H2, 7.9H5, 7.1C5, 7.1G10 og 7.4A3); og de som ikke gjør det (det vil si 6.2A1, 6.2B10 og 6.4B4). Den 6.8G6-konkurrerende klasse inneholder et FXY-motiv i CDR3 av den tunge kjede, mens den ikke-konkurrerende ikke gjør det. Denne forskjellen antyder at FXY-motivet er viktig for medie-ring av kation-uavhengig binding til avB6. I tillegg binder denne FXY-inneholdende klasse av antistoff sannsynligvis til en epitop på avB6som overlapper med, men likevel er forskjellig fra, den RGD-bindende lomme. Antistoff 6.2B10 og 6.4B4 inneholder ikke et FXY-motiv og er dårlige avB6-blokkerere. De ble vist å binde til den avB61-domene lignende delen og definerer nok en annen epitop til hvilken anti-avB6antistoff binder. Det er interessant at det monoklonale antistoff 6.2A1 tilhører den kation-uavhengige klasse, men ikke inneholder RGD-sekvensen, som andre kation-uavhengige mAber.
Monoklonalt antistoff 7.7G5 tilhører den kationavhengige klasse. Dog er de lette kjede sekvensene av 7.7G5 høyst homolog til den kation-uavhengige, I-domene-bindende antistoff 6.2B10. Den tunge kjeden av 7.7G5 ligner også kation-uavhengig antistoff i CDR1. Likevel er dets CDR2 og CDR3 mer lignende de av den kationavhengige klasse. Denne observasjonen antyder at spesifikke CDRer bestemmer spesifisiteten til et antistoff. Dette er særskilt sant for CDR3 av den tunge kjede, antakelig på grunn av den høye graden av variabilitet innen denne delen av antistoffet. Faktisk inneholder to av tre kationavhengige og sju av ni kation-uavhengige antistoff tungkjede CDR3-sekvenser som sannsynligvis spiller en viktig rolle ved avB6-gjenkjennelse. Det er verd å legge merke til at 7.7G5 mangler et RGD-motiv, men inneholder et XGD-motiv i sin tunge kjede CDR2. Dette XGD-motiv kan virke på en lignende måte som RGD og bestemmer bindingsaffiniteten/spesifisiteten av 7.7G5.
Sekvensobservasjonene ovenfor og konklusjoner derfra bringer til veie en basis for rasjonell design av spesifikke variabel region aminosyresekvenser som bestemmer spesifikke bindingsegenskaper.
Eksempel 10: Diagnostiske antistoff
Antistoff som kan detektere avB6-ekspresjon i parafinnedsenkede vevssnitt eller andre vevsprøver kan være anvendbare for diagnostikk. Disse diagnostiske verktøy kan anvendes til, f.eks. å detektere oppregulert avB6i vevssnitt for indikasjoner som kreft eller fibrose.
For å kunne identifisere antistoff som påviser avB6i parafinnedsenking screenet vi først et panel av antistoff for binding til HPLC-renset B6-underenhet. Antistoff som binder denne underenhet gjenkjenner sannsynligvis lineære peptidepitoper og ble derfor forventet å ha større sannsynlighet for godt resultat i parafinnedsenket vev. Binding til renset B6-underenhet ble gjennomført ved anvendelse av et ELISA-format identisk med det beskrevet for å måle avB6-binding (supra), unntatt med det rensede B6-integrin, heller enn avB6-proteinet, immobilisert på platen. Ved anvendelse av denne fremgangsmåten ble et antall fusjon 6-antistoff i stand til å binde både det rensede avB6-protein og den rensede B6-underenhet identifisert. Se tabell 5, infra, hvor prefikset "6." i klonenavnet er utelatt.
Som vist ovenfor bandt enkelte antistoff til renset B6-underenhet. De vil ha en høy-ere sannsynlighet for å binde denaturert avB6og kan således være anvendbare for å detektere avB6i parafinnedsenkede vevssnitt. Andre antistoff bandt til løselig avB6, men ikke til B6-underenheten. Begge typer antistoff ble anvendt til å farge denaturert parafinnedsenkede B6-transfekterte SW480 celler og ikke-transfekterte opphavsceller og dataene er vist i Tabell 6.
For å farge parafinnedsenkede vev eller celler ble prøveslidene først av-parafinert ved inkubering i de følgende løsninger: (1) Xylen, 5 minutter, to ganger; (2) 100 % etanol, 2 minutter, to ganger; (3) 95 % etanol, 2 minutter, to ganger; (4) 50 % etanol, 2 minutter, en gang; og (5) destillert vann, 2 minutter, en gang. Slidene ble deretter inkubert i en løsning bestående av 200 ml metanol og 3 ml 30 % H202i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase. Slidene ble vasket to ganger i PBS i 2 minutter hver gang. Parafinsnittene på slidene ble deretter avmaskert med pepsin (Zymed 00-3009) i 5 minutter ved 37 °C. Slidene ble vasket igjen to ganger i PBS i 2 minutter hver gang. Deretter ble slidene blokkert med avidin og deretter biotin (Vector SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA), 10 minutter hver ved romtemperatur, med vasking mellom hver inkubering som beskrevet ovenfor. Etterat blokkeringsløsningen ble tømt av slidene ble det primære antistoff (hybridomkultur-supernatant) fortynnet i PBS/0,1 % BSA påført slidene og inkubert natten over ved 4 °C.
Den neste dag ble slidene vasket i PBS som beskrevet ovenfor. Imens ble avidin-biotinkompleks pepperrotperoksidaseløsningen (ABC reagent) forberedt som følger: 1 ml PBS ble blandet med 20 ul løsning A (1:50) og 20 ul løsning B (1:50) fra Vector Kit PK-6102 og blandingen ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur før bruk. Under denne perioden ble slidene inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med anti-mus-biotinylert antistoff (1:200) fra Vector-Kitet med 15 ul/ml normal serum. Slidene ble deretter skylt to ganger i PBS, 2 minutter hver gang. Deretter ble den ovenfor beskrevne ABC-reagensen applisert på slidene og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Slidene ble vasket igjen som beskrevet ovenfor. Deretter ble substratet (Vector SK-41 00), 100 ul DAB (3,3'-diaminobenzidin) applisert på slidene og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. DAB ble forberedt som føl-ger: til 5 ml H20 tilsett 2 dråper buffer-utgangsløsning, bland godt; tilsett deretter 4 dråper DAB-utgangsløsning, bland godt; og tilsett deretter 2 dråper H202-Iøsning, bland godt. Deretter ble slidene vasket i rennende vann i 2 minutter. Deretter ble DAB-signalet forsterket for alle slidene som følger: skyll parafin snittene i 0,05 M natriumbikarbonat, pH 9,6, i 10 minutter; tørk vekk overflødig buffer; påfør den DAB-forsterkende løsningen 15 sekunder; og skyll deretter raskt med vann i 1 minutt for å stoppe reaksjonen. Slidene ble deretter farget i Mayers Hematoxylin (en nukleær motfarge) i 1 min. Slidene ble vasket i rennende vann i 1 minutt og deretter nedsenket i PBS i 1 minutt slik at hematoksylinet ble blått. Slidene ble deretter skylt igjen i rennende vann i 1 minutt og dehydrert og klargjort som følger: ned-senk i (1) 95 % etanol i 1 minutt, to ganger; (2) 100 % etanol i 1 minutt, to ganger; og (3) Xylen i 2 minutter, to ganger. Dekkglass ble deretter påført slidene ved anvendelse av permount.
Resultatene tydet på at fusjon 6 antistoff 1A1, 2C4, 3B2, 3B11, 5D6, 5G9, 5H3, 6D12, 7C7, 9B5, 9B7, 9D11, 9F5, 10E4, 10H11, 6H8, 7A5, 7G9, 9A3, 2A1, 2E5, 4E4, 4H4, 8B4, 2G2, og 4E6, hvilket alle kunne binde til renset B6-underenhet (Tabell 5), visselig farget parafinnedsenkede B6-transfekterte SW480-celler sterkt, men ikke farget ikke-transfekterte opphavsceller (Tabell 6).
Eksempel 11: Diagnose av kreft
ovB6uttrykkes normalt ved neglisjerbare til lave nivåer i friskt voksent vev. Dog oppreguleres ovB6-ekspresjon ved skade, fibrose, og kreft (se f.eks. Thomas et al. J. Invest. Dermatology 117:67-73 (2001); Brunton et al., Neoplasia 3: 215-226
(2001); Agrez et al., Int. J. Cancer 81:90-97 (1999); Breuss, J Cell Science 108:2241-2251 (1995)). Således kan antistoff som spesifikt binder til ovB6uttrykt på parafinnedsenket vev anvendes i standard immunohistokjemiteknikker til å påvise ovB6-ekspresjon for å stille diagnose av fibrose, kreft og hvilke som helst andre sykdommer i hvilket ovB6oppreguleres.
Som beskrevet ovenfor binder enkelte antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse til HPLC-renset B6-integrin og parafinnedsenkede og fiksert B6-transfekterte celler. Disse antistoffene ble også vist å binde til representative skjelett- og bryst-kreftvev i immunofarging. Se, f.eks. Figur 8 hvor monoklonalt antistoff 6.2A1 ble anvendt til å vise relativ farging av parafinnedsenkede bryst- og skjellet karcino-mer. Således er disse nye antistoff anvendbare som diagnostiske verktøy.
Eksempel 12: Effekter av anti- o„Bfi blokkerende mAber i Alport mus
Kollagen 4A3 (COL4A3) knockout- (Alport) mus er etablert som en in vivo modell for nyrefibrose og brukt til å undersøke den terapeutiske effekten av farmakologiske midler (supra). Vi undersøkte mAb 6.8G6 (kationeavhengig) og 6.3G9 (katione-uavhengig) i Alport-mus for å bestemme om de kunne inhibere fibrosen som normalt observeres i sju uker gamle Alport-mus. Som vist ovenfor ble disse to antistoff funnet å inhibere ovB6-binding til LAP og å inhibere aktivering av TGF-B i en bioassay. Antistoff 1E6 ble anvendt som en negativ kontroll.
Tre uker gamle Alport-mus ble gitt intraperitoneale injeksjoner 3 ganger per uke med et av de følgende antistoff: (1) 6.8G6, 4 mg/kg (7 mus); (2) 6.3G9,4 mg/kg (4 mus); og (3) 1E6, I mg/kg (6 mus). Injeksjonene ble opprettholdt i 4 uker. Musene ble deretter avlivet og deres nyrer gjenvunnet.
Parafinnedsenkede snitt av nyrene ble laget som beskrevet ovenfor og deretter farget til å påvise glatt muskel aktin, en markør for myoblaster og matriksavsetting ved nyrefibrose. Vi fant en betydningsfull minskning i glatt muskel aktinfarging i både de interstitiale og glomerulare regioner av nyren fra Alport-musene behandlet med mAb 6.8G6 eller 6.3G9, sammenlignet med mus behandlet med 1E6.
Figurer 11A og 11B viser et punktdiagram av farging i de glomerulære og interstitiale regioner av Alport nyren. Der var signifikant redusert glatt muskel aktin farging i nyrene av Alport musene behandlet med 6.8G6 og 6.3G9, sammenlignet med negativ kontroll lE6-behandlede mus.
Eksempel 13: Effektivitet av anti- o„B £ mAber i forebygging av unilateral ureteral obstruksionsindusert nefrosklerose
Vi brukte en annen musemodell for renal fibrotisk fremskridelse for å undersøke den antifibrotiske effektiviteten av 6.8G6 og 6.3G9. I denne musemodell ligeres en ureter av dyret hvilket fører til unilateral ureteral obstruksjon (UUO). UUO forårsa-ker progressive nefrosklerose uten rask renalt sammenbrudd i mus fordi den ikke-obstruerte nyre kan opprettholde relativt normal renal funksjon. Mens den obstru erte nyre gjennomgår hurtig global fibrose gjennomgår den ikke-obstruerte nyre adaptiv hypertrofi.
Denne studien kvantifiserte morfometrisk virkningen av anti-avB6-behandling på UUO-indusert renal fibrose.8-12 uker gamle, virale antigen-frie C57BL hannmus av 25,5±0,2 g vekt (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble anvendt. Musene ble tillat å tilpasse seg i sju dager før studien begynte. Musene hadde ad libitum tilgang til bestrålt standard musefor og sterilt vann gjennom hele tilpasnings- og eksperi-mentperioden. Kroppsvekt ble målt ved intervaller som del av dyrenes helseover-våking. Resultatene viste at alderstilpassede ikke-opererte mus gikk opp omtrent 10 % i kroppsvekt over den to uker lange forsøksperioden. UUO mus mistet omtrent 9 % av kroppsvekten ved dag 2, men gjenvant gradvis den tapte kroppsvekten ved dag 14. Dette vektendringsmønsteret forekom uten hensyn til terapeutiske behandling.
For å fremkalle renal fibrose ble den venstre ureter aseptisk isolert via en venstre-for-midtlinjen laparotomi under ketamin:xylazin (100:10 mg/kg s.c.) anestesi. To tette, sperrende 6-0 silkeligaturer ble plassert på ureteren ved nivået til den lavere pol av nyren, og ureteren kuttet mellom ligaturene. Den abdominale veggen ble stengt med 4-0 Vicryl suturer og huden stengt med 4-0 nylon. Dyrene ble tillat å komme seg på en varmepute og gitt 0,05 mg/kg s.c. buprenorfin to ganger daglig på dager 0 og 1. Fremgangsmåten ble tilpasset fra Ma et al., Kidney Int. 53 (4):937-944 (1998).
Musene ble deretter oppdelt i de følgende studiegrupper:
Alle dyr foruten de i gruppe 5 ble dosert to ganger ukentlig og det begynte dagen før kirurgi.
Dyrene ble deretter avlivet med karbondioksid ved dag 10 etter ligering og disse-kert. I UUO mus var den renale pelvis og ureteren markert oppsvulmet og væske-fylt ovenfor den blokkerende ligaturen. Graden av oppsvulming og omfang av gjenværende nyrevevmasse varierte mellom behandlingsgrupper. Gruppe 2 utviste omtrent halvparten så mye oppsvulming som negative kontrollgrupper. Ligerte nyrer var bleke i farge. Motsidige nyrer var lyse røde og forstørret med omtrent en tred-jedel.
Deretter ble begge nyrer (venstre ligert, høyre ikke-ligert) fra dyrene fjernet og halvert transverst gjennom midtpunktet av den renale pelvis. Den ene halvparten av hver nyre ble plassert i 10 % nøytral, bufret formalin for fiksert-vevsfarging. Den andre halvparten av hver nyre ble plassert i 15 % sukrose, etterfulgt av 30 % sukrose, for immunohistokjemisk farging.
Formalinfikserte nyresnitt ble immunofarget for myofibroblaster (glatt muskel aktin), en markør for fibrose. Bilder ble tatt ved standardiserte lysforhold og digitale kamera eksponerings innstillinger, korrigert for bakgrunn, og kalibrert med av-standsstandarder. Bilder av sammenhengende felt dekkende den hele venstre nyresnitt ble tatt fra hvert dyr for kvantifisering.
Glatt muskel aktin ble uttrykt som en prosent av totalt vevsareal innen de målte felt. Disse inkluderte alle kortikale og medulære vev fra snitt foruten den renale papill.
Som konklusjon viser mus behandlet med 6.3G9 og 6.8G6 en signifikant reduksjon
i fibrose.
Eksempel 14: Effektivitet av anti- cU3fi- blokkerende mAber overfor bleomvcinindu-sert lungefibrose i mus
Bleomycinindusert lungefibrose i mus er etablert som en in vivo modell for lungefibrose og brukt til å teste de terapeutiske effekter av farmakologiske midler. Betennelse er normalt tydelig 5-15 dager etter bleomycinbehandling. I 129-art mus øker graden av pulmonar fibrose i stigende grad i opp til 60 dager etter bleomycinbehandling. Matriks akkumulering blir vanligvis detekterbar rundt dag 15. I dette eksempelet ble mAb 6.3G9 injisert intraperitonealt ved en konsentrasjon av 4 mg/kg/dose i mus med bleomycin-indusert lungefibrose begynnende ved dag 0 eller dag 15, tre ganger ukentlig. Lungefibrose ble indusert ved dag 0 ved å admi- nistrere en enkel intratrakal dose av bleomycin ved en konsentrasjon av 0,03 enhe-ter/kg i 50 ul steril saline. Dyrene ble avlivet ved dag 30 og omfanget av lungefibrose ble vurdert. Antistoff 1E6 ble anvendt som en negativ kontroll.
Lunger ble høstet fra hvert dyr og innhold av hydroksyprolin ble målt som et regis-ter av lungekollagenavsetting, som beskrevet i Munger et al., supra. Som vist i Figur 15A inhiberte behandling med 6.3G9 begynnende ved dag 0 signifikant bleomycinindusert økning i lungeinnhold av hydroksyprolin. Først og fremst var 6.3G9 behandlingen i det minste like effektiv når den begynte 15 dager etter bleomycinadministrering, et tidspunkt når kollagenavsetting allerede hadde begynt.
Vi undersøkte også effektene av 6.3G9, kationavhengig 6.8G6, og det ikke-blokkerende antistoff 6.4B4 til å inhibere mer alvorlige grader av lungefibrose i en utvidet bleomycinindusert fibrose protokoll (med varighet 60 dager). For å gjøre dette startet vi antistoffbehandlingen 15 dager etter bleomycinadministrering (dag 15). Lunger ble deretter høstet ved dag 60 for å bestemme innhold av hydroksyprolin. Som vist i Figur 15C inhiberte behandling med 6.8G6 signifikant bleomycin-indusert fibrose (en mer enn 70 % reduksjon i innhold av hydroksyprolin sammenlignet med dyr behandlet med bleomycin og salin). Behandling med 6.3G9 viste også en trend mot beskyttelse, men disse resultatene nådde ikke statistisk signifi-kans (Figur 15C).
Som konklusjon reduserte både kationavhengige og kation-uavhengige anti-avB6-blokkerende mAber lungefibrose i mus behandlet med bleomycin. Videre var denne intervensjonen effektiv selv når antistoffbehandling ikke ble initiert før etter begynnende inntreden av fibrose.
Eksempel 15: Qpprequlerinq avCvBki humane psoriasislesioner
For å kunne bestemme hvorvidt avB6er involvert i psoriasis ble avB6-ekspresjon undersøkt i lesjonale og ikke-lesjonale hudbiopsier fra fem psoriasispasienter og fire normale individer. Ved anvendelse av mAb 6.2A1 immunofarging fant vi en signifikant økning i avB6-ekspresjon i psoriatiske lesjoner, som sammenlignet med ikke-lesjonal hud fra psoriatiske pasienter og normale kontroller. Således antyder oppre-guleringen av avB6i psoriatiske lesjoner både diagnostiske og terapeutiske implika-sjoner for anvendelsen av anti-avB6antistoff.
Eksempel 16: Qpprequlerinq av o„ Bfi i mus og human lever med bileær kanal sykdom
Som tidligere diskutert er ovB6-ekspresjon implisert i vevskade. I denne studien ble ekspresjon av ovB6undersøkt i mus og human lever skadet av bileær kanal sykdom.
Hepatisk skade i mus ble indusert av ligering av gallekanalen. Se, f.eks. George et al., P NAS 96:12719-24 (1999); George et al., Am J Pathol 156:115-24 (2000). Ved anvendelse av mAb 6.2G2 fant vi at ekspresjon av ovB6ble signifikant ved dager 9, 14 og 16 etterfølgende gallekanalligering.
På lignende måte utviste humane leversnitt fra pasienter med bileær kanal sykdom oppregulert ekspresjon av ovB6som bestemt ved immunohistokjemi ved anvendelse av mAb 6.2G2. Forhøyet ekspresjon av avB6ble observert f.eks. i leverprøver fra en 44 år gammel mann med akutt cholestase, en post-transplant 59 år gammel mann med akutt bikeær kanalobstruksjon, en 22 år gammel mann med galleatresi, og en
24 år gammel mann med kronisk bileær kanalobstruksjon.
Til oppsummering er de nye anti-ovB6antistoff nyttige diagnostiske og terapeutiske verktøy for leversykdommer.
Eksempel 17: Qpprequlerinq avCvBki forskjellige humane krefttyper
Integrin ovB6uttrykkes normalt ved neglisjerbare til lave nivåer i friskt voksent vev. En rekke forskjellige humane tumorvev ble evaluert for ovB6-ekspresjon ved anvendelse av antistoffet 6.2A1 og fremgangsmåter generelt beskrevet heri. Resultatene viste at ovB6-integrin ekspresjon signifikant ble oppregulert i flere humane epitele krefttyper. Spesielt viste immunohistologi at ovB6ble uttrykt særskilt betydelig på kantene av tumorøyer i mange av de epitele krefttypene. For å undersøke videre ekspresjon av ovB6i epitel kreftceller ble Detroit 562-celler (farynx karcinom) og SCC-14-celler (tunge skjellet cellekarcinom) så vel som SW480B6-celler (supra) ble farget med 6.3G9 og 6.4B4 og analysert ved strømningscytometri.
Den høyre side av figur 12 viser ovB6-ekspresjon på de forskjellige tumorcellelinjer som indikert ved 6.3G9-binding i fluorescens aktivert cellesortering (FACS). Den solide søylen representerer 6.3G9-binding mens den åpne søylen representerer bakgrunnsbinding av det sekundære mAb alene. Linjediagrammet på venstre side av Figur 12 viser inhibering av tumorcellelinjers binding til LAP-ligand ved å øke konsentrasjonen av 6.3G9 eller 6.4B4. 6.4B4 var en signifikant mindre virkningsfull inhibitor av avB6-binding til LAP, sammenlignet med 6.3G9 (> 10-ganger IC50for Detroit 562, > 30-ganger IC50for SW480B6, og > 100-ganger IC50for SCC-14). Dette er i overensstemmelse med tidligere in vitro resultater som indikerer at 6.3G9 er et potent blokkerende mAb og 6.4B4 er et svakt blokkerende mAb. Disse data er også i overensstemmelse med neglisjerbar inhiberende aktivitet av 6.4B4 i Detroit xenograft-modellen (Figur 14B). Figur 13 viser videre den relative inhibering av tumorcellelinjers binding til LAP av forskjellige anti-avB6mAber. Både 6.3G9 og 6.8G6 utviste ekvivalent inhiberende aktivitet (i overensstemmelse med alle tidligere data) mens 6.4B4 var en signifikant mindre virkningsfull inhibitor av avB6-binding til LAP.
Eksempel 18: Effekter av anti- a„Bfi- blokkerende mAber i en human tumor xeno-qraft- modell
Immunodefekte dyr (f.eks. nakne mus og Scid-mus) transplantert med humane tumor xenografter er etablert som et anvendbart in vivo modellsystem for å under-søke de terapeutiske effekter av anti-kreftmidler (se, f.eks. van Weerden et al., Prostate 43(4)263-71 (2000); Bankert et al., Front Biosci 7:c44-62 (2002)). Således kan de blokkerende anti-avB6monoklonale antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse undersøkes in vivo i en xenograft-modell for deres evne til å inhibere tumorvekst. I dette eksperimentet undersøkte vi evnen av enkelte av de nye avB6-antistoff mot å inhibere tumorvekst i atymiske nakne hunnmus transplantert med kreft human faryngal (Detroit 562-cellelinje) xenograft.
For å gjøre dette ble Detroit 562-celler (ATCC) utplassert i in vitro i minimum es-sensielt medium (Eagle) med 2 mM L-glutamin og Earles BSS justert til å inneholde 1,5 g/l natriumbikarbonat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 1,0 mM natriumpyruvat, og 10 % føtalt kalveserum, uten antibiotika. Omtrent 5 X IO<6>celler/0,2 ml media (uten serum) ble implantert subkutant i nakne mus på den høyre flanke. Tre til fire dager senere ble tumorstørrelsesmålinger startet og fortsatt inntil tumorene ble omtrent 5 mm (lengde) gange 5 mm (vidde). Musene ble randomisert og injisert intraperitonealt med test-antistoffene eller kontrolløsninger på dag 1, etterfulgt av tre injeksjoner ukentlig over en periode på 33 dager. Test-antistoffene og kontrolløsninger var: (1) 6.3G9, 1 mg/kg, 10 mus; (2) 6.3G9, 4 mg/kg, 10 mus;
(3) 6.3G9, 10 mg/kg, 10 mus; (4) 6.4B4, 1 mg/kg, 10 mus; (5) 6.4B4, 4 mg/kg, 10 mus; (6) 6.4B4, 10 mg/kg, 10 mus; og (7) vehikkelkontroll (PBS), 0,2 ml/per mus, 30 mus. I tillegg ble cis-platinum injisert i 10 mus subkutant ved 2 mg/kg som en kjemoterapeutisk kontroll. Cis-platinum-injeksjonene ble utført ved dag 1 og deretter hver andre dag i totalt seks behandlinger. Ved slutten av 33 dagers perioden ble dyrenes vekt og tumorstørrelser målt, ovB6-ekspresjon vurdert ved immunhistologi og serum anti-ovB6-nivåer målt.
Immunohistologisk farging viste at de implanterte tumorceller i høy grad uttrykte ovB6in vivo. Tumorvektdata viste videre at blokkerende mAb 6.3G9 effektivt inhiberte tumorvekst ved alle tre konsentrasjoner undersøkt (Figur 14A). I motsetning inhiberte svakt blokkerende mAb 6.4B4 ikke tumorvekst (Figur 14B).
Til oppsummering inhiberte blokkerende antistoff tumorvekst med 40-50 % i de behandlede mus. I motsetning inhiberte ikke et svakt blokkerende anti-ovB6antistoff tumorvekst.
Eksempel 19: CvBfi- antistoff internalisering
Antistoff som internaliseres av celler tilbyr en fordel for enkelte kliniske indikasjoner som f.eks. kreft, fordi antistoffene deretter kan konjugeres med toksiner, radioaktive forbindelser eller andre anti-kreftmidler for å selektivt målrette og inhibere vekst av kreftceller. Evnen av anti-ovB6antistoff til å bli internalisert ble undersøkt i
SW480B6( supra) og SCC-14 celler.
Celler ble delt 1:5 og utplassert på 4-kamrede glasslides for inkubering over natten ved 37 °C, 5 % C02. Den neste dag ble mAb 6.8G6, 6.1A8, 6.3G9, 7.1C5, 6.4B4, 10D5, og 8B3 fortynnet til en endelig konsentrasjon av 20 ug/mL. MAbene eller medium alene ble tilsatt til passende brønner. Et tidsforløp for internalisering ble kjørt fra 0 timer til 48 timer. Tidspunkter inkludert var 0, 5, 10 og 30 minutter og 1, 4, 24 og 48 timer. Et sekundært antistoff (anti-murine-Alexa 594) ble tilsatt som en negativ kontroll. Internalisering ble stoppet ved hvert tidspunkt ved å fjerne antistoffet og vaske cellelaget med buffer. Hvete kim agglutinin-Alexa-488 ble tilsatt i 20 minutter ved 18 °C for å farge den ytre kanten av cellene med grønn fluorescens. Etter at cellene ble vasket ble Cytofix/-Cytoperin løsning tilsatt i 20 minutter ved 18 °C for å fiksere og permeabilisere cellene. Cellene ble vasket igjen og det sekundære anti-mus-Alexa 594 (rød fluorescens) ble tilsatt i 20 minutter ved 18 °C for å merke det bundne eller internaliserte murine ovB6-antistoff. Cellene ble deretter vasket og fiksert ved addisjon av 2 % paraformaldehyd og undersøkt ved konfokal mikroskopi. Bilder ble deretter tatt med et Leitz Plan-Apokromatisk 63x (1.32 numerisk blenderåpning, oljeimmersjon) objektiv (Leica) med en 2x digital zoom. Hver ramme representerte en enkelt optisk seksjon fra midtseksjonen av cellene observert for internalisering under alle betingelser. Det var ingen farging observert i kjernen.
Internalisering ble observert for kation-avhengige mAber (RGD-inneholdende ligandhermere) som f.eks. 6.8G6 og 6.1A8. Ingen internalisering ble observert for kation-uavhengige mAber som f.eks. 6.3G9, 7.1C5 og 6.4B4.

Claims (36)

1. Monoklonalt antistoff som er et avB6-blokkerende antistoff eller et antigenbindende fragment derav, karakterisert vedat det: (a) spesifikt binder til avB6og ikke andre av-integriner; (b) inhiberer bindingen av avB6til latensassosiert peptid (LAP) med en IC50-verdi lavere enn det av 10D5; og (c) konkurrerer med antistoffet dannet av hybridomet 6.8G6 (ATCC deponeringsnummer PTA-3645) for bindingen til biotinylert avB6i en buffer omfattende divalente kationer Ca<2+>ogMg<2+>.
2. Antistoff eller antigenbindende fragment derav i følge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter de samme tunge- og lettkjede polypeptidsekvenser som et antistoff dannet av hybridom (a) 6.1A8 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3647); (b) 6.3G9 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3649); (c) 6.8G6 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3645); (d) 6.2B1 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3646); (e) 7.1G10 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3898); (f) 7.7G5 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3899); eller (g) 7.1C5 (ATCC aksesjonsnummer PTA-3900).
3. Antistoff eller antigenbindende fragment derav i følge krav 1,karakterisert vedat bindingen mellom antistoffet eller det antigenbindende fragment og avB6er uavhengig av et divalent kation.
4. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede komplementaritetsbestemmelsesregioner (CDR) 1, 2 og 3, hvor tung kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, tungkjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og tungkjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 7 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 7 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ IDNO: 10 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 10 eller aminosyresekvensen med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 13 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 13 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 15 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 15 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon.
5. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 4,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3, hvor tung kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 1, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4 og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 7; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 10, lett kjede CDDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt iSEQ ID NO: 13 og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 15.
6. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindene fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3 hvor den tunge kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO:
5 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 8 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 8 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 11 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 11 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 14 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 14 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og lett kjede CDR 3 omfatter ami nosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 17 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 17 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon.
7. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 6,karakterisert vedat antistoffet eler det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3 hvor den tunge kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5, og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 8; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 11, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 14, og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 17.
8. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3 hvor den tunge kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 6 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO:
6 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 9 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 9 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 12 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 12 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 14 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 14 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 18 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 18 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon.
9. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 8,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3 hvor den tunge kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 3, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 6, og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 9; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 12, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 14, og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 18.
10. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3 hvor den tunge kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 46 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 46 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 47 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 47 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 48 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 48 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 13 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 13 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon, og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 16 eller aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 16 med en substitusjon ved en aminosyreposisjon.
11. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 10,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) tung kjede CDR 1, 2 og 3 hvor den tunge kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2, tung kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 46, og tung kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 47; og (b) lett kjede CDR 1, 2 og 3 hvor lett kjede CDR 1 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 48, lett kjede CDR 2 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 13, og lett kjede CDR 3 omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 16.
12. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter en tung kjede variabel domenesekvens av enhver av SEQ ID NO: 19-24 eller 34-36.
13. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter en variable tung kjede omfattende en aminosyresekvens valgt fra sekvenser angitt i SEQ ID NO: 19-24 eller 34-36 og et lett kjede variabelt domene omfattende en aminosyresekvens valgt fra sekvenser angitt i SEQ ID NO: 37, 38, 40, 41 og 43-45.
14. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter: (a) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 19 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 37; eller (b) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 20 eller 21 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 38; eller (c) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 22 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 43; eller (d) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 23 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 44; eller (e) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 24 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 45; eller (f) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 34 eller 35 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 40; eller (g) den tung kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 36 og den lett kjede variable domenesekvens ifølge SEQ ID NO: 41.
15. Antistoff eller antigenbindene fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav binder oppløselig avB6, men binder ikke til (36 subenheten.
16. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge kravl,karakterisert vedat antistoffet eller der antigenbindende fragment derav forhindrer aktivering av TGF-B.
17. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav omfatter tung kjede komplementaritetsbestemmende områder 1, 2 og 3 og lett kjede komplementaritetsbestemmende område 1, 2 og 3, hvor nevnte antistoff konkurrerer med 6.8G6 (ATCC deponeringsnummer PTA-3645) for binding til avB6og inneholder et FXY-motiv i CDR3 av den tunge kjede.
18. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav inneholder en mutasjon ved et aminosyreresiduum som er et sete for glykosylering slik at glykosyleringssetet blir fjernet.
19. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment derav (i) er en humanisert form av et antistoff dannet av et hybridom valgt fra gruppen bestående av hybridom 6.1A8 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3647, hybridom 6.3G9 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3649, hybridom 6.8G6 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3645, hybridom 6.2B1 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3646, hybridom 7.1G10 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3898, hybridom 7.7G5 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3899 og hybridom 7.1C5 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3900, og (ii) inneholder en mutasjon ved et aminosyreresiduum som er et sete for glykosylering i antistoffet dannet av et hybridom valgt fra gruppen bestående av hybridom 6.1A8, hybridom 6.3G9, hybridom 6.8G6, hybridom 6.2B1, hybridom 7.1G10, hybridom 7.7G5 og hybridom 7.1C5 slik at glykosyleringssetet er fjernet.
20. Antistoff eller antigenbindende fragment ifølge krav 19,karakterisert vedat antistoffet eller det antigenbindende fragment (i) er en humanisert form av et antistoff dannet av hybridom 6.3G9 med ATCC aksesjonsnummer PTA-3649 og (ii) inneholder en mutasjon ved et aminosyreresiduum som er et sete for glykosylering i antistoffet dannet av hybridom 6.3G9 slik at glykosyleringssetet er fjernet.
21. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge ethvert av kravene 1 - 20, karakterisert vedat antistoffet er konjugert il en substans valgt fra gruppen bestående av et toksin, et radionuklid, en fluorescent markør, en peptid-markør, en histidinmarkør, biotin, polyetylenglykol og et cytotoksisk middel.
22. Celle av hybridom 6.1A8 (ATCC deponeringsnummer PTA-3647) eller av hybridom 6.3G9 (ATCC deponeringsnummer PTA-3649) eller av hybridom 6.8G6 (ATCC deponeringsnummer PTA-3645) eller av hybridom 6.2B1 (ATCC deponeringsnummer PTA-3646) eller av hybridom 7.1G10 (ATCC deponeringsnummer PTA-3898) eller av hybridom 7.7G5 (ATCC deponeringsnummer PTA 3899) eller av hybridom 7.1C5 (ATCC deponeringsnummer PTA-3900).
23. Antistoff dannet av cellen ifølge krav 22.
24. Sammensetning for behandling av en sykdom mediert av avB6 i et menneske omfattende antistoffet eller det antigenbindende fragment derav ifølge ethvert av kravene 1-20 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.
25. Anvendelse av antistoff ifølge ethvert av kravene 1-20 for fremstilling av et medikament til behandling av en sykdom mediert av avB6i et menneske som har sykdommen.
26. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sykdommen er fibrose.
27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor fibrosen er skleroma, arrdannelse, leverfibrose, nyrefibrose eller lungefibrose.
28. Anvendelse ifølge krav 27, hvor fibrosen er lungefibrose.
29. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sykdommen er akutt lungeskade.
30. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sykdommen er psoriasis.
31. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sykdommen er kreft.
32. Anvendelse ifølge krav 31, hvor kreften er oral, hud, cervikal, epitelial, ova-risk, faryngeal, øsofagal, lunge, bryst, nyre eller kolorektal kreft.
33. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sykdommen er Alports syndrom.
34. Anvendelse ifølge krav 25, hvor antistoffet er konjugert til et cytotoksisk middel.
35. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sykdommen er akutt nyreskade.
36. Anvendelse ifølge krav 27, hvor fibrosen er nyrefibrose.
NO20044347A 2002-03-13 2004-10-13 Anti-alfavbeta6-antistoff, celle som produserer slikt antistoff, samt anvendelse av antistoffet for fremstilling av medikamenter NO334834B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36499102P 2002-03-13 2002-03-13
US42628602P 2002-11-13 2002-11-13
PCT/US2003/008048 WO2003100033A2 (en) 2002-03-13 2003-03-13 ANTI-αvβ6 ANTIBODIES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20044347L NO20044347L (no) 2004-12-13
NO334834B1 true NO334834B1 (no) 2014-06-16

Family

ID=29586753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20044347A NO334834B1 (no) 2002-03-13 2004-10-13 Anti-alfavbeta6-antistoff, celle som produserer slikt antistoff, samt anvendelse av antistoffet for fremstilling av medikamenter

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7465449B2 (no)
EP (4) EP1490110B1 (no)
JP (6) JP4473117B2 (no)
KR (1) KR101098109B1 (no)
CN (4) CN104805090A (no)
AR (1) AR038970A1 (no)
AU (1) AU2003261071C1 (no)
BR (1) BRPI0308585B8 (no)
CA (1) CA2478833C (no)
CL (8) CL2010000792A1 (no)
EA (1) EA011853B1 (no)
ES (1) ES2389037T3 (no)
HK (2) HK1074381A1 (no)
IL (4) IL164021A0 (no)
IS (1) IS7443A (no)
ME (1) ME00804B (no)
MX (1) MXPA04008870A (no)
MY (2) MY147019A (no)
NO (1) NO334834B1 (no)
NZ (2) NZ535425A (no)
PL (1) PL216223B1 (no)
RS (1) RS52488B (no)
WO (1) WO2003100033A2 (no)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7465449B2 (en) * 2002-03-13 2008-12-16 Biogen Idec Ma Inc. Anti-αvβ6 antibodies
WO2003087340A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
CA2434668A1 (en) 2003-07-04 2005-01-04 Laurence Mulard Novel approach to design glycopeptides based on o-specific polysaccharide of shigella flexneri serotype 2a
AU2012258386B2 (en) * 2005-07-08 2014-08-07 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
CN102875681A (zh) * 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
EP1974213A4 (en) * 2006-01-17 2009-03-25 Biosite Inc HIGHLY SENSITIVE SECRETAGOGIN ASSAYS AND ITS USE IN DIAGNOSIS AND / OR FORECASTING
WO2008008315A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
BRPI0715141A2 (pt) * 2006-08-03 2013-06-04 Astrazeneca Ab agente de ligaÇço alvejante, anticorpo isolado, fragmento de anticorpo isolado, molÉcula de Ácido nucleico, vetor, cÉlula hospedeira, mÉtodos para produzir um agente de ligaÇço alvejado, para produzir um anticorpo, para produzir um fragmento de anticorpo, para tratar um tumor maligno em um animal, para tratar inflamaÇço, e para inibir a interaÇço de alfabeta6 com seu ligando, e, conjugado
WO2008147434A1 (en) * 2006-10-19 2008-12-04 The Regents Of The University Of California TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC ASTHMA USING ANTAGONISTS OF INTEGRIN αVβ6
DK2164992T3 (en) * 2007-05-30 2016-08-15 Lpath Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR BONDING OF LYTHOPHOSPHATIC ACID
US20110064744A1 (en) * 2007-05-30 2011-03-17 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
HUE033825T2 (en) * 2007-11-16 2018-01-29 Univ Rockefeller Beta-amyloid protein protofibrillum-specific antibodies
ES2549903T3 (es) 2008-05-07 2015-11-03 Argos Therapeutics, Inc. Anticuerpos humanizados contra interferón alfa humano
CA2723842A1 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Peter Vanlandschoot Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof
CN102099491A (zh) 2008-05-15 2011-06-15 北卡罗来纳-查佩尔山大学 调节血管生成的新靶标
CA2738252C (en) 2008-09-26 2018-05-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
CA2771441C (en) 2009-08-19 2016-10-11 Merck Patent Gmbh Antibodies for the detection of integrin complexes in ffpe material
WO2011119524A1 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel targets for regulation of angiogenesis
ES2552954T3 (es) 2010-04-30 2015-12-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos anti-C5a y métodos para el uso de los anticuerpos
US20130066055A1 (en) 2011-04-21 2013-03-14 Bayer Intellectual Property Gmbh New binder-drug conjugates (adcs) and use thereof
WO2012154983A2 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-pax8 antibodies
BR112014019861A2 (pt) * 2012-02-17 2017-07-04 Seattle Genetics Inc anticorpo, ácido nucleico isolado, método de tratamento de um paciente com câncer, e, composição farmacêutica de um anticorpo
US10316103B1 (en) 2012-03-30 2019-06-11 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-Uroplakin III antibodies
WO2014052672A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Biocare Medical, Llc Anti-uroplakin ii antibodies systems and methods
DK2905335T3 (en) * 2012-10-03 2018-03-12 Chiome Bioscience Inc Anti-human dlk-1 antibody with anti-tumor activity in vivo
PT2766048E (pt) 2012-10-12 2015-02-25 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
US10429390B2 (en) 2012-12-18 2019-10-01 Biocare Medical, Llc Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer
EP2962113B1 (en) 2013-02-28 2019-04-03 Biocare Medical, LLC Anti-p40 antibodies systems and methods
ES2687439T3 (es) 2013-03-13 2018-10-25 Medimmune Limited Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014143739A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
GB201305668D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Avs6 Integrin Antagonists
AU2014312086B2 (en) 2013-08-30 2020-03-12 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
KR102150616B1 (ko) 2013-09-12 2020-09-03 삼성전자주식회사 c-Met 표적 화합물-생체활성 물질 접합체 및 그 용도
EP3052523B1 (en) * 2013-10-01 2021-03-10 Medimmune Limited Methods of treating and diagnosing alpha-v-beta-6 overexpressing cancer
US9816997B2 (en) 2013-10-03 2017-11-14 Biocare Medical, Llc Anti-SOX10 antibody systems and methods
CN109908017A (zh) 2013-12-19 2019-06-21 高露洁-棕榄公司 口腔护理组合物
PE20160996A1 (es) 2013-12-23 2016-11-09 Bayer Pharma AG Conjugados de farmacos anticuerpo (adcs) con inhibidores de ksp
US20170008955A1 (en) * 2014-02-03 2017-01-12 Cnj Holdings, Inc. Humanized beta-amyloid binding molecules and uses thereof
KR20220025917A (ko) 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201417002D0 (en) 2014-09-26 2014-11-12 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compound
AU2016282723B2 (en) 2015-06-22 2021-09-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (ADCs) and antibody prodrug conjugates (APDCs) with enzymatically cleavable groups
US10973923B2 (en) 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
JP6913078B2 (ja) * 2015-08-13 2021-08-04 ニューヨーク・ユニバーシティ タウの短縮型Ａｓｐ４２１エピトープに特異的な、抗体を基にした分子、ならびにタウ異常症の診断および治療におけるそれらの使用
CA2994888A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Immunogen, Inc. Therapeutic combinations comprising anti-folr1 immunoconjugates
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
US20190144547A1 (en) * 2015-11-23 2019-05-16 Merck Patent Gmbh Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders
GB201604680D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
GB201604681D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
SG10202008909VA (en) 2016-03-24 2020-10-29 Bayer Pharma AG Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
WO2018017797A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Georgia State Universtiy Research Foundation Monoclonal antibodies to b virus and their use for identification of b virus specific reactive peptides
JP2019534882A (ja) 2016-10-11 2019-12-05 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 免疫介在性療法薬を有する抗体−薬物コンジュゲート
US10953020B2 (en) 2016-11-08 2021-03-23 Reata Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating Alport syndrome using bardoxolone methyl or analogs thereof
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN116712540A (zh) 2016-12-14 2023-09-08 比奥拉治疗股份有限公司 使用整联蛋白抑制剂治疗胃肠道疾病
KR102628678B1 (ko) 2016-12-21 2024-01-25 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc)
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
KR20190099250A (ko) 2016-12-21 2019-08-26 바이엘 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
GB201720989D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical compounds
BR112020022961A2 (pt) 2018-05-11 2021-02-17 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited inibidores de furina
EP3796942A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 ADC Therapeutics SA Molecular adjuvant
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
KR20210095165A (ko) 2018-11-19 2021-07-30 프로제너티, 인크. 바이오의약품으로 질환을 치료하기 위한 방법 및 디바이스
GB201908536D0 (en) 2019-06-13 2019-07-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Compounds
IL293238A (en) * 2019-11-26 2022-07-01 Childrens Hospital Med Ct Cela-1 inhibition for treatment of lung disease
BR112022009570A2 (pt) 2019-12-05 2022-08-02 Seagen Inc Anticorpo anti-¿v¿6 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, conjugado anticorpo-fármaco, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para produção de um anticorpo anti-¿v¿6 ou fragmento de ligação ao antígeno, para produção de um conjugado anticorpo anti-¿v¿6-fármaco e para tratamento de câncer em um indivíduo, e, composição farmacêutica
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
US20240425601A1 (en) * 2021-01-26 2024-12-26 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating and preventing disease associated with avb8 integrin
CN117222410A (zh) 2021-02-03 2023-12-12 Bp资产V股份有限公司 用于吸入的弗林蛋白酶抑制剂的制剂
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2023194895A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Pyrrol derivatives as inhibitors of apolipoprotein l-1
WO2024263932A2 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Mythic Therapeutics, Inc. Itgb6-binding proteins and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010056076A1 (en) * 1997-08-08 2001-12-27 Xiaozhu Huang Treatment of acute lung injury and fibrosis with antagonists of alphavbeta6

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US5223493A (en) 1984-12-28 1993-06-29 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory compounds for ophthalmic use
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
AU613590B2 (en) 1986-11-19 1991-08-08 Bristol-Myers Squibb Company Hybridomas producing monoclonal antibodies to new mucin epitopes
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5804381A (en) * 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9009549D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Recombinant antibody and method
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5962643A (en) 1991-07-11 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Integrin β subunit and uses thereof
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
US5420120A (en) 1993-12-17 1995-05-30 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory glucocorticoid compounds for topical ophthalmic use
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6417324B1 (en) * 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
PT719859E (pt) 1994-12-20 2003-11-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo monoclonal anti-alfa v-integrina
US5795894A (en) 1995-05-02 1998-08-18 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinn antagonists
US5719156A (en) 1995-05-02 1998-02-17 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinin antagonists
US5696267A (en) 1995-05-02 1997-12-09 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins as neurokinin antagonists
US5688960A (en) 1995-05-02 1997-11-18 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins useful as neurokinin antagonists
US5654316A (en) 1995-06-06 1997-08-05 Schering Corporation Piperidine derivatives as neurokinin antagonists
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997006822A1 (en) 1995-08-17 1997-02-27 Protein Design Labs, Inc. Anti-selectin antibodies for prevention of multiple organ failure and acute organ damage
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
CA2230759C (en) 1995-08-29 2012-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for producing the same
US5691362A (en) 1996-06-05 1997-11-25 Schering-Plough Corporation Substituted benzene-fused hetero- and carbocyclics as nuerokinin antagonists
EP0909277B2 (en) * 1996-06-07 2008-12-24 Poniard Pharmaceuticals, Inc. Humanized antibodies that bind to the same antigen as bound by antibody nr-lu-13, and their use in pretargeting methods
AU6721696A (en) 1996-07-15 1998-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Cd44-like protein
US5789422A (en) 1996-10-28 1998-08-04 Schering Corporation Substituted arylalkylamines as neurokinin antagonists
US5783579A (en) 1996-12-20 1998-07-21 Schering Corporation Spiro-substituted azacyclic-substituted piperazino derivatives as neurokinin antagonists
ATE322508T1 (de) 1998-01-23 2006-04-15 Merck Patent Gmbh Verwendung des antikörpers 271.14d9.f8 (dsm acc2331) um die bindung zwischen alphavbeta6- integrin und fibronectin in vitro zu hemmen
JP2002533064A (ja) 1998-12-19 2002-10-08 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング インテグリンαｖβ６阻害剤
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7776315B2 (en) 2000-10-31 2010-08-17 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and additional active ingredients
DE10063173A1 (de) 2000-12-18 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Harnstoff- und Urethanderivate
EE200300509A (et) 2001-04-13 2004-08-16 Biogen, Inc. Antikehad VLA-1 vastu
DE10118550A1 (de) 2001-04-14 2002-10-17 Merck Patent Gmbh Liganden des Integrins alpha¶nu¶beta¶6¶
GB2380127A (en) 2001-09-26 2003-04-02 Isis Innovation Treatment of chronic joint inflammation
PT2336184E (pt) 2002-02-25 2015-03-09 Biogen Idec Inc Administração de agentes para o tratamento da inflamação
US7465449B2 (en) * 2002-03-13 2008-12-16 Biogen Idec Ma Inc. Anti-αvβ6 antibodies
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
EP1511738A4 (en) 2002-05-17 2007-05-09 Scios Inc TREATMENT OF FIBROPROLIFERATIVE DISEASES USING TGF BETA INHIBITORS
KR20050089151A (ko) 2002-11-26 2005-09-07 프로테인 디자인 랩스 인코포레이티드 혈관형성을 조절하는 α5β1 인테그린에 대한 키메라성 및인간화 항체
US20040253311A1 (en) 2002-12-18 2004-12-16 Roger Berlin Multi-layer tablet comprising non-steroidal anti-inflammatory drugs, decongestants and non-sedating antihist amines
ATE399542T1 (de) 2003-10-01 2008-07-15 Merck Patent Gmbh Alfavbeta3 und alfavbeta6 integrin antagonisten als antifibrotische mittel
CA2544855A1 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Bayer Pharmaceuticals Corporation Immunohistochemical methods
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
WO2008008315A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
WO2008147434A1 (en) 2006-10-19 2008-12-04 The Regents Of The University Of California TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC ASTHMA USING ANTAGONISTS OF INTEGRIN αVβ6
GB0803192D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Mubio Products Bv SCLC biomarker panel
CA2747937C (en) 2008-12-23 2019-02-26 Merck Patent Gmbh Biomarkers for inhibitors with anti-angiogenic activity
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
US20150086570A1 (en) 2012-03-29 2015-03-26 Biogen Idec Ma Inc. Biomarkers for use in integrin therapy applications

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010056076A1 (en) * 1997-08-08 2001-12-27 Xiaozhu Huang Treatment of acute lung injury and fibrosis with antagonists of alphavbeta6

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XUE, H. et al, Role of the alphav-beta6 Integrin in Human Oral Squamous Cell Carcinoma Growth in Vivo and in Vitro, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, Vol 288, side 610-618, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ563951A (en) 2009-04-30
RS80704A (en) 2006-12-15
CL2010000788A1 (es) 2011-02-18
JP2009100763A (ja) 2009-05-14
CN102659946A (zh) 2012-09-12
US20090186036A1 (en) 2009-07-23
EP2287198A3 (en) 2011-05-25
BRPI0308585B1 (pt) 2019-10-15
CN1646160A (zh) 2005-07-27
IS7443A (is) 2004-09-09
JP2015126743A (ja) 2015-07-09
CL2010000789A1 (es) 2011-02-18
BR0308585A (pt) 2005-02-01
BRPI0308585B8 (pt) 2021-05-25
ES2389037T3 (es) 2012-10-22
EA200401198A1 (ru) 2005-04-28
CN102924598A (zh) 2013-02-13
CL2010000792A1 (es) 2011-02-18
JP2015091807A (ja) 2015-05-14
AU2003261071C1 (en) 2008-12-11
JP5616932B2 (ja) 2014-10-29
US9745376B2 (en) 2017-08-29
EP1490110A4 (en) 2006-12-27
EP2287199B1 (en) 2017-08-02
JP2013014592A (ja) 2013-01-24
JP4473117B2 (ja) 2010-06-02
EP2287199A2 (en) 2011-02-23
NZ535425A (en) 2008-05-30
EP2336185A1 (en) 2011-06-22
AU2003261071A1 (en) 2003-12-12
US8153126B2 (en) 2012-04-10
CL2010000790A1 (es) 2011-02-18
CL2010000791A1 (es) 2011-02-18
CL2010000786A1 (es) 2011-02-18
KR20040095281A (ko) 2004-11-12
ME00804B (me) 2012-03-20
MY154009A (en) 2015-04-30
US7465449B2 (en) 2008-12-16
WO2003100033A3 (en) 2004-07-15
IL164021A0 (en) 2005-12-18
CN102924598B (zh) 2014-12-31
IL164021A (en) 2013-04-30
MY147019A (en) 2012-10-15
US20150140609A1 (en) 2015-05-21
CA2478833C (en) 2015-11-10
US20120251532A1 (en) 2012-10-04
EP1490110B1 (en) 2012-06-13
AU2003261071B2 (en) 2008-05-15
IL225633B (en) 2021-12-01
EP2287199A3 (en) 2011-05-25
CL2010000787A1 (es) 2011-02-11
IL225633A0 (en) 2014-03-31
PL216223B1 (pl) 2014-03-31
AR038970A1 (es) 2005-02-02
NO20044347L (no) 2004-12-13
RS52488B (en) 2013-02-28
EA011853B1 (ru) 2009-06-30
CA2478833A1 (en) 2003-12-04
JP2012228269A (ja) 2012-11-22
CL2010000785A1 (es) 2011-02-18
EP2287198A2 (en) 2011-02-23
PL372662A1 (en) 2005-07-25
KR101098109B1 (ko) 2011-12-26
CN104805090A (zh) 2015-07-29
JP2005528099A (ja) 2005-09-22
HK1213007A1 (zh) 2016-06-24
HK1074381A1 (en) 2005-11-11
WO2003100033A2 (en) 2003-12-04
MXPA04008870A (es) 2005-06-17
EP1490110A2 (en) 2004-12-29
US20050255102A1 (en) 2005-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO334834B1 (no) Anti-alfavbeta6-antistoff, celle som produserer slikt antistoff, samt anvendelse av antistoffet for fremstilling av medikamenter
CN101287841B (zh) 抗-αvβ6抗体及其用途
CA2988115A1 (en) Anti-gitr antibodies for cancer diagnostics
JP2009516506A (ja) 抗アルファ２インテグリン抗体およびその使用
CN103298490A (zh) 结合背板胶质乙酰酯酶的抗体
CN100509851C (zh) 抗αvβ6抗体
Violette et al. Anti-αvβ6 antibodies
Violette et al. Anti-α ν β 6 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA, US

MK1K Patent expired