DE69833698T2

DE69833698T2 - Verfahren zur Herstellung von Arrays hoher Dichte

Info

Publication number: DE69833698T2
Application number: DE69833698T
Authority: DE
Inventors: Jr. James R. Huntsville Hudson; Elliot P. Murfreesboro Dawson
Original assignee: BioVentures Inc
Current assignee: BioVentures Inc
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-05-19
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: CN1677077A; HK1080942A1; CN100367023C; JP2001515735A; CN100367024C; CN1677079A; DE69825496D1; IL134702A0; IL134702A; CN100337106C; AU7498598A; HK1032261A1; CN1249418C; ATE319986T1; US20030096292A1; DE69825496T2; US20010019827A1; HK1080941A1; ES2225407T3; WO1999013313A1

Description

HINTERGRUND
Hochdichte Anordnungen immobilisierter natürlicher oder synthetischer Zielsubstanzen ermöglichen das simultane Screenen von Analyten im Hinblick auf die Anwesenheit bestimmter Eigenschaften. Solche Anordnungen hoher Dichte haben sich in einer Vielfalt technologischer Gebiete wie u.a. Chemie, Genetik, Immunologie, Materialwissenschaft, Medizin, Molekularbiologie und Pharmakologie als nützlich erwiesen. Hochdichte Anordnungen von Nucleinsäuren werden zum Beispiel zum Ermitteln von Gensequenzen, Nachweisen der Anwesenheit von Genmutationen und Erfassen der qualitativen und quantitativen Differentialexpression von Genprodukten verwendet. Ebenso werden hochdichte Anordnungen von Peptiden zum Kartieren epitopischer Sequenzen verwendet, die Immunreaktionen hervorrufen. Des Weiteren werden Anordnungen von Zielsubstanzen zum Identifizieren von Verbindungen zur Entwicklung von Pharmazeutika verwendet.
Derzeit gibt es im Allgemeinen zwei Arten von Verfahren für die Konstruktion hochdichter Anordnungen von Testsubstanzen. Zunächst werden Anordnungen durch individuelles Aufbringen vorgebildeter natürlicher oder synthetischer Zielsubstanzen, wie Biomoleküle, direkt auf bestimmte Orte auf einem Träger konstruiert. Zu Trägern gehören Membranen von Nitrocellulose, Nylon, Polyvinylidindifluarid, Glas, Silizium oder anderen Materialien, und die Zielsubstanzen können am Träger immobilisiert werden, indem der Träger unter anderem ultravioletter Strahlung ausgesetzt oder gebacken wird. Ein solches Verfahren ist in Pietu et al., „Novel Gene Transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array", Genome Research (1996) 6: 492–503, durch Bezugnahme hierin vollständig eingeschlossen, offenbart. Es wurden verschiedene Vorrichtungen für die Automatisierung des Applikationsverfahrens entwickelt.
Ein weiteres Verfahren, das in der WO 96/17246 beschrieben ist, beinhaltet das Zusammenbündeln länglicher, dünner Tragelemente, wobei jedes Element ein ausgewähltes Molekül aufweist, und Unterteilen der Bündel, um zweidimensionale Anordnungen zu erzeugen.
Das zweite Verfahren zur Konstruktion hochdichter Anordnungen schließt das Synthetisieren individueller Zielsubstanzen in situ an bestimmten Orten auf einem Träger ein. In einer Version dieses Verfahrens wird photosynthetische Chemie angewendet, um simultan eine Reihe verschiedener Zielsubstanzen an einmaligen Orten auf dem Träger herzustellen. In einer anderen Version dieses Verfahrens werden Zielsubstanzen synthetisiert, indem ausgewählte Bereiche auf einem Träger physisch maskiert oder blockiert werden und die gewünschte chemische Synthesereaktion am unmaskierten Abschnitt des Trägers stattfindet. Beispiele für dieses Verfahren sind in Fodor et al., „Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Syntheses", Science (1991) 251: 767–777; United States Patent 5,436,327; und Southern, E. M. et al., „Analyzing and Comparing Nucleic Acid Sequences by Hybridization to Arrays of Oligonucleotides; Evaluation using Experimental Models", Genomics (1992) 13: 1008–1017, offenbart, die hierin durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen sind.
Beide Verfahren zur Konstruktion von Anordnungen hoher Dichte haben mehrere Nachteile. Zunächst einmal können die Verfahren stets nur eine relativ begrenzte Anzahl identischer Anordnungen zur gleichen Zeit produzieren. Zum Zweiten ist es schwierig, die mit diesen Verfahren erzeugten Anordnungen im Laufe der Produktion zu prüfen, um die Integrität der Produktionsschritte zu ermitteln. Zum Dritten können viele potenzielle Zielsubstanzen nicht auf Träger aufgebracht und mit derzeit angewendeten Verfahren nicht in situ auf Trägern synthetisiert werden. Ferner werden Anordnungen aus Testsubstanzen von mehr als einer chemischen Kategorie, wie Anordnungen von Peptiden und Nucleinsäure-Testsubstanzen, nicht beschrieben. Außerdem können die Verfahren nur Anordnungen von Zielsubstanzen in einer Lage mit relativ begrenzter Dicke produzieren. Des Weiteren kann jedes Verfahren Anordnungen mit Zielsubstanz-Zonendimensionen von nur relativ begrenzter Größe produzieren.
Folglich besteht ein Bedarf an einem alternativen Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen, das nicht die für bekannte Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen typischen Nachteile hat. Das Verfahren sollte zum Beispiel vorzugsweise eine große Zahl identischer Anordnungen simultan, schnell und kostengünstig produzieren können. Im Rahmen des Verfahrens sollte eine breite Vielfalt von Zielsubstanzen und Trägern verwendbar sein, einschließlich Testsubstanzen und Träger, die mit derzeit angewendeten Verfahren nicht in Anordnungen eingebaut werden können. Das Verfahren sollte Anordnungen in mehr als zwei Dimensionen, in unterschiedlichen Dicken und Größen und in anderen Konfigurationen als einer ebenen Konfiguration produzieren können. Ferner sollte das Verfahren Anordnungen mit einer Vielfalt von Zielsubstanz-Zonendimensionen produzieren können, einschließlich verschieden großer Zonen für verschiedene Zielsubstanzen in einer Anordnung.
Außerdem soll das Verfahren hochdichte Anordnungen von Testsubstanzen unterschiedlicher Kategorien oder chemischer Klassen produzieren können, wie Anordnungen von Peptid- und Nucleinsäure-Testsubstanzen. Ferner sollten im Rahmen des Verfahrens vorgebildete Zielsubstanzen oder Zielsubstanzen verwendet werden können, die bei Bedarf in situ synthetisiert werden, um die Vorteile dieser Verfahren einzuschließen.
ZUSAMMENFASSUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen von Zielsubstanzen gemäß Definition in Anspruch 1 bereitgestellt. Das Verfahren kann auch einen Schritt des Stabilisierens des Bündels, Einbauens eines zusätzlichen Materials in das Bündel oder Abfragens der hochdichten Anordnung beinhalten.
Außerdem wird eine Anordnung hoher Dichte gemäß Definition in Anspruch 16 bereitgestellt. Die Anordnungen hoher Dichte können Zielsubstanzen in drei kartesischen Achsen haben.
Ferner wird ein Verfahren zum Ermitteln von Gensequenzen, Nachweisen der Anwesenheit von Genmutationen, Erfassen der qualitativen oder quantitativen Differentialexpression von Genprodukten, Kartieren epitopischer Sequenzen, die Immunreaktionen hervorrufen, oder Identifizieren von Verbindungen zur Entwicklung von Pharmazeutika bereitgestellt, wobei die gemäß der vorliegenden Erfindung produzierten Anordnungen hoher Dichte verwendet werden.
FIGUREN
Die Merkmale, Aspekte und Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung, den beiliegenden Ansprüchen und den Begleitfiguren besser verständlich. Dabei zeigt:
1 bis 3 die Herstellung hochdichter Anordnungen unter Verwendung eines Bündels von Fasern, die Zielsubstanzen beinhalten, gemäß der vorliegenden Erfindung;
4 bis 5 die Herstellung hochdichter Anordnungen unter Verwendung eines Bündels, das eine Membran beinhaltet, auf der Zielsubstanzlinien aufgebracht sind, gemäß der vorliegenden Erfindung;
6 bis 8 die Herstellung hochdichter Anordnungen unter Verwendung eines Bündels, das eine Mehrzahl von Membranen beinhaltet, auf denen Linien bekannter Zielsubstanzen aufgebracht sind, gemäß der vorliegenden Erfindung;
9 bis 11 die Herstellung hochdichter Anordnungen unter Verwendung eines Bündels, das eine aufgerollte Membran beinhaltet, auf der Linien bekannter Zielsubstanzen aufgebracht sind, gemäß der vorliegenden Erfindung;
12 bis 14 die Herstellung hochdichter Anordnungen unter Verwendung eines Bündels, das Röhren beinhaltet, die mit Zielsubstanzen gefüllt sind, gemäß der vorliegenden Erfindung;
15 ein Foto eines Autoradiogramms, das das Ergebnis einer Hybridisierungsstudie an einer Anordnung zeigt, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde; und
16 ein Foto eines Autoradiogramms, das das Ergebnis einer Hybridisierungsstudie an einer anderen Anordnung zeigt, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
BESCHREIBUNG
Gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer hochdichten Anordnung von Zielsubstanzen zur Ermittlung der Identität oder Eigenschaften von Analyten oder zur Ermittlung der Identität oder Eigenschaften der Zielsubstanzen bereitgestellt. Gemäß einer anderen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird eine hochdichte Anordnung von Zielsubstanzen zur Ermittlung der Identität oder Eigenschaften von Analyten oder zur Ermittlung der Identität oder Eigenschaften der Zielsubstanzen bereitgestellt.
Der hierin verwendete Begriff „Zielsubstanz" bezieht sich auf die Komponente der hochdichten Anordnung, die potenziell mit einem oder mehreren Analyt(en) von Interesse interagiert. Zielsubstanzen können Atome, Moleküle, komplexe Chemikalien, Organellen, Viren, Zellen oder Materialien oder Kombinationen dieser Entitäten oder andere Entitäten sein, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird. Die Zielsubstanzen einer hochdichten Anordnung gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel ausgewählt werden aus einem oder mehreren Mitgliedern der Gruppe bestehend aus Atomen, wie Zink, Schwefel und Gold; Biomolekülen wie Polynucleotide, DMA, RNA, Peptide, Proteine, Glycoproteine, Lipoproteine, Kohlenhydrate, Lipide, Immunglobuline und ihre synthetischen Analoge und Varianten; Viren; subzellulären Komponenten wie mikrozerlegte Chromosomen und Mitochondrien; Zellen, einschließlich prokaryotischer Zellen, Archaebakterien und eukaryotischer Zellen; und Materialien wie Metalllegierungen, Keramik, Glas, Halbleiter, Supraleiter, Kunststoffe, Polymermaterialien, Holz, Stoff und Beton.
Der hierin verwendete Begriff „Analyt" bezieht sich auf eine Entität, deren Identität oder Eigenschaften durch Interaktion mit den Zielsubstanzen auf einer hochdichten Anordnung gemäß der vorliegenden Erfindung ermittelt werden soll(en). Alternativ oder simultan kann der Analyt zur Ermittlung der Identität oder Eigenschaften der Zielsubstanzen durch Interaktion mit den Zielsubstanzen auf einer hochdichten Anordnung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Analyte können aus der gleichen Gruppe wie die Zielsubstanzen ausgewählt werden, wie Proteine oder Nucleinsäuren, oder sie können eine physikalische oder umwelttechnische Bedingung sein, wie eine oder mehrere Bedingung(en), die aus der Gruppe bestehend aus Temperatur, pH-Wert oder Salzkonzentration ausgewählt wird/werden.
Der hierin verwendete Begriff „Zielstrang" bezieht sich auf einen Streifen der Zielsubstanz. Dieser Streifen kann ganz aus einer oder mehreren Zielsubstanzen bestehen oder kann eine oder mehrere Zielsubstanzen mit einem Träger oder einem Behälter umfassen. Die Zielsubstanzen können in, an bzw. auf dem Träger absorbiert, adsorbiert, angebracht, eingebettet oder aufgetragen werden oder im Behälter enthalten sein. Die Zielstränge können zum Beispiel gegossene Stäbe aus Zielsubstanzen wie Metalllegierungen, Beton oder Kunststoff beinhalten, oder sie können Zielsubstanzen beinhalten, die auf Glasfasern oder Seidenfäden absorbiert, an Polymerfasern angebracht, in einem porösen Stab eingebettet, auf einen Metalldraht aufgetragen oder in einer Gelatinematrix enthalten sind. Ferner können Zielstränge Linien von Zielsubstanzen beinhalten, die auf einen Glasträger oder eine Membran, wie eine dünne, ebene Polymersubstanzplatte, oder einen äquivalenten Träger geschrieben, gezogen, gedruckt oder geprägt sind. Darüber hinaus können Zielstränge Zielsubstanzen beinhalten, die an der Innenseite von Röhren angebracht sind.
Der hierin verwendete Begriff „Matrix" bezieht sich auf ein Material, in das Zielsubstanzen eingebettet oder an dem Zielsubstanzen angebracht werden können, um zusätzlichen strukturellen Halt zu geben, um als Abstandsstück zu fungieren, um die Zielsubstanz dem Analyt darzubieten oder um die Interaktion zwischen Zielsubstanz und Analyt zu beeinflussen, zum Beispiel durch elektrisches Isolieren von Zielsubstanzen voneinander. Matrizen können Polymermaterialien sein, wie z.B. eine oder mehrere Substanzen, die aus der Gruppe bestehend aus Aerogel, Agarose, Albumin, Gelatine, Hydrogel und Polyacrylamid ausgewählt werden.
Der hierin verwendete Begriff „Bündel" bezieht sich auf eine geordnete Zusammenstellung oder Zusammenfügung von Zielsträngen. Ein Bündel kann zum Beispiel einen Stapel von Zielsträngen beinhalten, wobei jeder Zielstrang eine mit einer Zielsubstanz gefüllte Röhre umfasst, oder wobei jeder Zielstrang auf eine Membran gezogene Zielsubstanzlinien umfasst, oder wobei jeder Zielstrang einen Draht aus einer Zielsubstanz umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Anordnungen hoher Dichte
Das Verfahren zur Herstellung von Anordnungen hoher Dichte gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte: (a) Zusammenfügen eines Bündels aus Zielsträngen und (b) Unterteilen des Bündels, um eine Anordnung zu erzeugen. Außerdem kann das Verfahren einen Schritt des Stabilisierens der Zielstränge oder Bündel beinhalten. Ferner kann das Verfahren einen Schritt des Einbauens von einem oder mehreren zusätzlichen Materialien in die hochdichten Anordnungen beinhalten. Außerdem kann das Verfahren einen Schritt des Abfragens der hochdichten Anordnung beinhalten.
Zusammenfügen eines Bündels von Zielsträngen
Anordnungsbündel von Zielsträngen können mit einer Reihe von Verfahren hergestellt werden. Ein Bündel von Zielsträngen kann zum Beispiel hergestellt werden, indem zunächst Röhren mit Zielsubstanzen oder mit Zielsubstanzen in Kombination mit einer Matrix gefüllt werden. Die Zielsubstanz kann in der Matrix eingeschlossen werden, ohne chemisch an die Matrix gebunden zu werden, oder sie kann durch kovalente Kräfte, Ionenkräfte, Wasserstoffbindung oder durch andere Befestigungsarten an der Matrix befestigt werden. Die Röhren werden dann im Wesentlichen parallel zu ihrer Längsachse angeordnet und gesichert, um das Bündel von Zielsträngen zu erzeugen.
Ein Bündel von Zielsträngen kann auch hergestellt werden, indem zunächst ein Träger, wie eine Membran, Faser, Röhre oder ein Stab, mit einer Zielsubstanz beschichtet oder imprägniert wird, oder indem Zielsubstanzlösungen mit einer Füllfederspitze wie einer Künstler-Krähenfederkielspitze oder einer Spritzpistole auf einen Träger aufgebracht werden, oder indem Zielsubstanzlösungen durch Tintenstrahldruck, Prägung oder Thermotransfer auf einen Träger aufgebracht werden. Anschließend werden diese Träger gestapelt, aufgerollt oder gefaltet, um das Bündel von Zielsträngen zu bilden. Das resultierende Bündel enthält Reihen von Zielsubstanzen, die relativ parallel zur Längsachse der Zielsubstanzapplikation ausgerichtet sind.
Unterteilen der Bündel zur Herstellung der Anordnungen
Nach dem Zusammenfügen werden die Bündel unterteilt, um die Anordnungen zu erzeugen. Die Bündel können mit einem Mikrotom, einem Laser, einer Säge, einem heißen Draht oder einer anderen Schneidvorrichtung oder einem anderen Verfahren unterteilt werden, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird. Das Unterteilen kann zu einer hochdichten Anordnung mit Zielsubstanzen einer beliebigen aus vielen verschiedenen Dicken führen. Die Anordnung kann zum Beispiel Zielsubstanzen mit einer Dicke zwischen etwa 4,1 μm und etwa 1 mm oder dicker haben. Im Gegensatz zu früheren bekannten Verfahren zur Herstellung von Anordnungen kann das hierin offenbarte Verfahren ferner ohne weiteres Anordnungen mit Zielsubstanzen mit einer Dicke von mehr als 50 μm produzieren. Dies ist von Vorteil, da dadurch das von der Zielsubstanz erzeugte Signal im Vergleich zu Signalen verstärkt werden kann, die von Zielsubstanzen auf dünneren Anordnungen erzeugt werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung hat das zusammengefügte Bündel Zielstränge mit Längsachsen, die im Wesentlichen parallel zueinander sind, und das Bündel wird im Wesentlichen lotrecht zur Längsachse der Zielstränge unterteilt, um die hochdichten Anordnungen zu produzieren. Die Unterteilung kann auch in einem anderen Winkel als im Wesentlichen lotrecht zur Längsachse der Zielstränge erfolgen, zum Beispiel für die Herstellung ovaler Anordnungen aus einem zylindrischen Bündel.
Je nach der Form des Bündels und der Richtung der Unterteilung, kann der Unterteilungsschritt hochdichte Anordnungen mit einer, zwei oder drei analytischen Achsen hervorbringen, d.h. hochdichte Anordnungen mit Zielsubstanzen in einer, zwei oder drei kartesischen Achsen. Anordnungen mit einer analytischen Achse können z.B. aus einer Querunterteilung eines Bündels hervorgehen, bei dem die Zielsubstanzen in einer einzelnen Ebene liegen. Anordnungen mit zwei analytischen Achsen können aus einer Querunterteilung eines Bündels hervorgehen, bei dem die Zielsubstanzen in einer Mehrzahl von Ebenen liegen. Anordnungen mit zwei analytischen Achsen können auch durch Kombinieren mehrerer Anordnungen mit einer einzelnen analytischen Achse erzeugt werden. Anordnungen mit drei analytischen Achsen können durch Kombinieren mehrerer Anordnungen mit einer einzelnen analytischen Achse, durch Kombinieren einer Anordnung mit einer einzelnen analytischen Achse mit einer Anordnung mit zwei analytischen Achsen oder durch Kombinieren einer Mehrzahl von Anordnungen mit zwei analytischen Achsen produziert werden.
Eine hochdichte Anordnung mit einer analytischen Achse kann zum Beispiel durch Unterteilen eines Bündels hergestellt werden, das aus Zielsträngen besteht, die durch Absetzen von Zielsubstanzen in parallelen Linien auf eine flache Membran hergestellt wurden, wobei die Unterteilung in einer Ebene lotrecht zu der von den Linien gebildeten Ebene stattfindet. Ebenso kann eine hochdichte Anordnung mit zwei analytischen Achsen durch Unterteilen eines Bündels hergestellt werden, das aus Zielsträngen besteht, die einen Stapel von Membranen umfassen, wobei jede Membran in parallelen Linien abgesetzte Zielsubstanzen aufweist, und wobei die Unterteilung in einer Ebene lotrecht zu den Längsachsen der Zielsubstanzlinien erfolgt. Ferner kann eine hochdichte Anordnung mit drei analytischen Achsen durch Stapeln einer Mehrzahl hochdichter Anordnungen mit zwei analytischen Achsen hergestellt werden, die durch diese Unterteilung hergestellt wurden.
Stabilisieren des Bündels von Zielsträngen
Das Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem einen Schritt des Stabilisierens des Bündels von Zielsträngen beinhalten. Eine Stabilisierung kann die Form oder Funktion des Bündels oder der Anordnung verbessern, indem das Bündel zum Beispiel leichter unterteilbar wird oder Zielsubstanzen in der Anordnung voneinander isoliert werden. Der Stabilisierungsschritt kann passend zur Art der Stabilisierung jederzeit während oder nach dem Zusammenfügen des Bündels von Zielsträngen erfolgen. Die Stabilisierung kann zum Beispiel durch Einbetten des Bündels aus Zielsträngen in einer Matrix, wie Epoxy, Polypropylen oder Polystyrol, erreicht werden.
Einbauen zusätzlicher Materialien in die hochdichten Anordnungen
Das Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch einen Schritt des Einbauens von einem oder mehreren zusätzlichen Materialien in hochdichte Anordnungen während oder nach dem Zusammenfügen des Bündels von Zielsträngen, einschließlich nach dem Unterteilungsschritt, beinhalten. Diese Materialien können die Form oder Funktion der hochdichten Anordnung verbessern. Der Einbauschritt kann zum Beispiel das Zugeben von Antioxydationsmitteln oder mikrobiellen Inhibitoren oder anderen Substanzen beinhalten, um die Integrität der hochdichten Anordnung im Laufe der Zeit zu wahren.
Ferner kann der Einbauschritt die Zugabe von Substanzen zur Matrix beinhalten, die Hintergrundrauschen reduzieren, wie ein nicht fluoreszierender Gegenfarbstoff, oder die das Erfassungssignal verstärken. Ebenso kann der Einbauschritt die Zugabe eines Szintillators zur Matrix beinhalten, um den Nachweis radioaktiver Analyten zu erleichtern. Außerdem kann der Einbauschritt die Zugabe von Cofaktoren zur Matrix beinhalten, die für bestimmte Nachweisarten erforderlich sind, wie Sekundärenzyme, die zur enzymatischen Farbentwicklung notwendig sind, oder ein Energietransferfarbstoff, der den Nachweis einer fluoreszierenden Markierung verbessern kann. Ferner kann eine Oberfläche einer Anordnung hoher Dichte, die mit dem hierin offenbarten Verfahren hergestellt wird, mit Silber oder einem anderen reflektierenden Material beschichtet werden, um die für den Nachweis verfügbare Lichtmenge zu erhöhen.
Abfragen von Anordnungen hoher Dichte
Das Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem einen Schritt des Abfragens hochdichter Anordnungen beinhalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird der Abfrageschritt aus der Gruppe bestehend aus visueller Begutachtung mit oder ohne Vergrößerung, chemischer Ablagerung, elektrischer Sondierung, mechanischer Erfassung und magnetischer Erfassung ausgewählt. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet der Schritt des Abfragens das Platzieren der Anordnung in die Nähe einer Ansammlung von miteinander verflochtenen Elektroden und Messen von Kapazitätsänderungen, die sich aus Interaktionen zwischen den Zielsubstanzen auf der Anordnung hoher Dichte und miteinander verflochtenen Elektroden ergeben.
Produktion hochdichter Anordnungen aus Fasern beinhaltenden Bündeln
In einer Ausgestaltung werden hochdichte Anordnungen aus Bündeln von Zielsträngen hergestellt, die Fasern oder Fäden beinhalten. Die Fasern oder Fäden können natürliche oder synthetische Materialien beinhalten, die aus der Gruppe bestehend aus Baumwolle, Seide, Nylon und Polyester ausgewählt werden, oder andere Materialien sein, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die Bündel von Zielsträngen durch direktes Imprägnieren von Fasern mit einer wässrigen Lösung der Zielsubstanz hergestellt. Eine Reihe solcher Fasern wird mit verschiedenen Zielsubstanzen imprägniert und die Identität der jeweiligen Zielsubstanzen, die in den jeweiligen Fasern enthalten sind, wird in einer Datenbank aufgezeichnet. Die Fasern werden gewaschen, um ungebundene Zielsubstanzen herauszuspülen, und mit einer nicht störenden Substanz behandelt, um unspezifische Bindungsorte auf den Fasern und den immobilisierten Zielsubstanzen zu blockieren. Die Faser werden dann getrocknet, um das Blockierungsmittel an der Faser und an den immobilisierten Zielsubstanzen zu fixieren.
Die Fasern werden dann zu Bündeln zusammengefügt, wobei der Ort jeder Faser und ihrer zugehörigen immobilisierten Zielsubstanz in der Datenbank notiert wird. Das Faserbündel wird vorzugsweise stabilisiert, indem das Bündel in einer Matrix eingebettet oder anderweitig imprägniert wird, um dem Bündel strukturellen Halt zu geben.
Das Bündel wird dann mit geeigneten Instrumenten im Wesentlichen lotrecht zur Längsachse der Fasern unterteilt, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen zu erhalten. Vorzugsweise führt das Unterteilen zu einer Mehrzahl identischer hochdichter Anordnungen. Identität und Ort der Zielsubstanzen auf jeder Anordnung werden über die Informationen in der Datenbank verfolgt. Diese Anordnungen können zum simultanen Screenen von Analyten im Hinblick auf die Anwesenheit bestimmter Eigenschaften genutzt werden, oder sie können für andere Zwecke verwendet werden, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird.
Die 1 bis 3 zeigen jeweils Zielstränge 10, die eine Reihe beschichteter Fasern 12 umfassen, die mit bekannten Zielsubstanzen imprägniert sind; die in einer Matrix 14 eingebetteten Zielstränge 10, die zu einem Bündel 16 zusammengefügt sind; und das Unterteilen des Bündels 16, um eine Mehrzahl identischer hochdichter Anordnungen 18 zu erzeugen, wobei jede Anordnung Zielsubstanzen in zwei analytischen Achsen aufweist.
Produktion hochdichter Anordnungen aus Membranen beinhaltenden Bündeln
In einer Ausgestaltung werden hochdichte Anordnungen aus Bündeln hergestellt, die Membranen beinhalten. Die Membranen können dünne ebene Platten aus einer Polymersubstanz umfassen oder andere Materialien beinhalten, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die Bündel durch Aufbringen von Linien einer Zusammensetzung, die die Zielsubstanzen enthält, auf die Membranen durch Schreiben, Ziehen, Drucken oder Prägen produziert. Identität und Ort der jeweiligen Zielsubstanzen werden in einer Datenbank aufgezeichnet. Die Membranen werden dann bei Bedarf behandelt, um die Zielsubstanzen an der Membran zu fixieren.
Eine auf diese Weise produzierte Membran kann unterteilt werden, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen zu erzeugen, wobei jede Anordnung in einer analytischen Achse angeordnete Zielsubstanzen aufweist. Die 4 und 5 zeigen jeweils ein Bündel 20, das eine Membran 22 mit darauf aufgebrachten Linien bekannter Zielsubstanzen 24 beinhaltet; und das Unterteilen des Bündels 20, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen 26 zu produzieren, wobei jede Anordnung Zielsubstanzen hat, die in einer analytischen Achse angeordnet sind.
Alternativ kann eine Mehrzahl von in dieser Weise produzierten Membranen zu Bündeln zusammengefügt werden, wobei Identität und Ort der jeweiligen immobilisierten Zielsubstanzen in der Datenbank notiert werden. Zum Zusammenfügen kann die Membran aufgerollt oder gefaltet werden oder es können mehrere mit Zielsubstanz imprägnierten Membranen gestapelt werden. Bei Bedarf wird das Bündel zum Beispiel durch Einbetten oder anderweitig Imprägnieren des Bündels in einer Matrix stabilisiert, um dem Bündel strukturellen Halt zu geben.
Das Bündel wird dann mit geeigneten Instrumenten im Wesentlichen lotrecht zur Längsachse der Zielsubstanzlinien auf den Membranen unterteilt, um mehrere hochdichte Anordnungen zu erhalten, wobei jede Anordnung Zielsubstanzen aufweist, die in zwei analytischen Achsen angeordnet sind. Vorzugsweise führt das Unterteilen zu einer Mehrzahl identischer hochdichter Anordnungen. Ort und Identität der Zielsubstanzen werden über die Informationen in der Datenbank verfolgt. Diese Anordnungen können zum simultanen Screenen von Analyten im Hinblick auf die Anwesenheit bestimmter Eigenschaften genutzt werden, oder sie können für andere Zwecke verwendet werden, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird.
Die 6 bis 8 zeigen jeweils eine Mehrzahl von Membranen 28 mit Linien von Zielsubstanzen 30, die auf die jeweiligen Membranen 28 aufgebracht sind; die zur Bildung des Bündels 32 gestapelten und stabilisierten Membranen 28; und das Unterteilen des Bündels 32, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen 34 zu produzieren, wobei jede Anordnung in zwei analytischen Achsen angeordnete Zielsubstanzen 28 hat.
Die 9 bis 11 zeigen jeweils eine Membran 35 mit Linien bekannter Zielsubstanzen 38, die auf die Membran 36 aufgebracht sind; die zur Bildung eines Bündels 40 aufgerollte und stabilisierte Membran 36; und das Unterteilen des Bündels 40, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen 42 zu produzieren, wobei jede Anordnung in zwei analytischen Achsen angeordnete Zielsubstanzen 38 hat.
Produktion hochdichter Anordnungen aus Röhren beinhaltenden Bündeln
In einer Ausgestaltung werden hochdichte Anordnungen aus Zielsträngen hergestellt, die Röhren beinhalten. Die Röhren können Polyimid, Nylon, Polypropylen, Polyurethan, Silikon, Ethylvinylacetat, Edelstahl, Kupfer, Glas oder Quarzgut beinhalten oder aus anderen Materialien bestehen, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung werden Zielstränge produziert, indem die Innenseite der Röhren mit einer wässrigen Lösung der Zielsubstanz so beschichtet wird, dass die Zielsubstanz an der/die Innenfläche der Röhren absorbiert, adsorbiert oder kovalent gebunden wird. Alternativ können die Röhren mit den Zielsubstanzen gefüllt werden, wobei die Zielsubstanzen in einer Matrix eingebettet werden oder auch nicht. Eine Reihe solcher Röhren wird durch Beschichten oder Füllen der Röhren mit verschiedenen Zielsubstanzen produziert, und die Identität der jeweiligen Zielstränge und der darin enthaltenen Zielsubstanz wird in einer Datenbank aufgezeichnet.
Die Röhren werden dann zu Bündeln zusammengefügt, wobei der Ort jeder Röhre und ihrer zugehörigen Zielsubstanz in der Datenbank notiert wird. Das Röhrenbündel wird vorzugsweise durch Einbetten des Bündels in einer Matrix stabilisiert, um dem Bündel strukturellen Halt zu geben.
Das Bündel wird dann mit geeigneten Instrumenten im Wesentlichen lotrecht zur Längsachse der Röhren unterteilt, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen zu erhalten. Vorzugsweise führt das Unterteilen zu einer Mehrzahl identischer hochdichter Anordnungen. Identität und Ort der Zielsubstanzen werden über die Informationen in der Datenbank verfolgt. Diese Anordnungen können zum simultanen Screenen von Analyten im Hinblick auf die Anwesenheit bestimmter Eigenschaften genutzt werden, oder sie können für andere Zwecke verwendet werden, wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird.
Die 12 bis 14 zeigen jeweils Zielstränge 44, die eine Reihe von Röhren 46 umfassen, die mit bekannten Zielsubstanzen 48 gefüllt sind; die in einer Matrix 50 eingebetteten und zu einem Bündel 52 zusammengefügten Zielstränge 44; und das Unterteilen des Bündels 52, um hochdichte Anordnungen 54 zu produzieren, wobei jede Anordnung in zwei analytischen Achsen angeordnete Zielsubstanzen 48 hat.
BEISPIEL I
Produktion und Verwendung hochdichter Anordnungen, die mit DNA beschichtete Fäden beinhalten
Das Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen aus einem Fasern oder Fäden umfassenden Bündel gemäß der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung hochdichter Anordnungen von DNA-Zielsubstanzen wie folgt angewendet. Die Benetzbarkeit eines Baumwollfadens mit einer wässrigen Lösung wird durch Eintauchen des Fadens in Wasser beurteilt. Wasserperlen auf der Oberfläche des Fadens sind ein Hinweis darauf, dass sich auf der Oberfläche des Fadens möglicherweise Bindemittel, Öle oder andere Materialien befinden, die sich auf die Benetzbarkeit des Fadens zur Herstellung von Zielsträngen negativ auswirken können. Kommt es während des Benetzbarkeitstests zu Perlenbildung, sollten die Fäden in Methanol, Ethanol oder einem anderen geeigneten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gewaschen werden, um die unerwünschten Materialien zu beseitigen. Die Fäden werden dann in Wasser gelegt und das Wasser wird mehrere Male ausgetauscht, bis jeder Faden vollständig befeuchtet ist. Anschließend werden die Fäden in eine wässrige Lösung einer kationischen Polymersubstanz wie Poly-L-Lysin gegeben und mit der Poly-L-Lysin-Lösung einige Stunden lang äquilibrieren gelassen. Die Fäden werden dann aus der Poly-L-Lysin-Lösung genommen und getrocknet, um das Poly-L-Lysin an die Oberfläche der Fäden zu fixieren. Nach dem Fixieren werden die Fäden in gepufferter Lösung gewaschen, wobei der Puffer mehrere Male ausgetauscht wird. Die Fäden werden aus dem Puffer herausgenommen und trocknen gelassen.
Die Fäden werden dann in Stücke geschnitten, die je nach den Abmessungen des konstruierten Bündels zwischen einem Zentimeter und ein paar Meter liegen. Alle für das Bündel bestimmten Fäden werden vorzugsweise auf dieselbe Länge geschnitten.
Anschließend wird jeder geschnittene Faden mit einer DNA-Lösung mit einer bestimmten bekannten Sequenz, die die immobilisierte Zielsubstanz sein soll, in Kontakt gebracht. Die DNA-Sequenz ist vorzugsweise für jeden Faden unterschiedlich. Die verwendete DNA soll vorzugsweise einzelsträngig sein, wenn sie für Nucleinsäurehybridisierungsstudien verwendet werden soll, kann ansonsten aber in der doppelsträngigen Form belassen werden. Die DNA kann von natürlichen Quellen wie Plasmidpräparaten, künstlichen Hefechromosomen, BAC-Bibliotheken, YAC-Bibliotheken oder anderen DNA-Bibliotheken wie exprimierte Sequenzetiketten stammen oder sie kann durch Polymerasekettenreaktion oder andere Syntheseverfahren synthetisch hergestellt werden. Faden und DNA-Lösung werden dann ein paar Minuten bis ein paar Stunden lang inkubiert, d.h. so lange, bis die verfügbaren Bindungsorte auf dem Faden mit DNA vollständig gesättigt sind.
Die mit DNA beschichteten Fäden werden dann in einem Ofen bei etwa 60°C so lange getrocknet, bis die DNA an den Fäden fixiert ist. Alternativ kann die DNA an den Fäden fixiert werden, indem der mit der getrockneten DNA beschichtete Faden mit 100% Ethanol oder Methanol ein paar Minuten lang befeuchtet wird und die Fäden trocknen gelassen werden. Die Identität der jeweiligen Fäden und ihrer Sequenz der immobilisierten DNA-Zielsubstanz werden in einer Datenbank aufgezeichnet. Anschließend werden die Fäden einzeln in einem Puffer wie 1 × TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) gewaschen, um ungebundene DNA von den Fäden zu entfernen. Die mit DNA beschichteten Fäden werden wieder getrocknet.
Ein Bündel aus mit DNA beschichteten Fäden wird dann zusammengefügt, indem die Fäden parallel zueinander und nebeneinander gelegt werden. Der Ort jedes Fadens in dem Bündel und seine zugehörige DNA werden in der Datenbank aufgezeichnet. Das Fadenbündel wird durch Einbetten in einer Matrix stabilisiert, die z.B. aus Polymethacrylat, Epoxidharzen, Polyethylenglykol, Paraffinwachsen, Gummis, Polyacrylamid und anderen ähnlichen Materialien besteht, die vorzugsweise in flüssiger Form bei erhöhter Temperatur oder in unpolymerisierter Form, die zum Einbetten der Fäden geeignet ist, verarbeitet werden können. Man lässt die eingebetteten Fäden härten oder vernetzen, um dem Bündel eine steife Struktur zu verleihen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird verhindert, dass die Fäden vollständig mit der Einbettungsmatrix imprägniert werden und die immobilisierte DNA maskieren, indem die Fäden mit einer Substanz wie Gelatine, Saccharose oder Polyvinylalkohol beschichtet werden, für die die Matrix undurchlässig ist. Dies wird durch Befeuchten der Fäden, die die fixierte, immobilisierte DNA tragen, mit einer Lösung, die zwischen etwa 0,01 Gew.-% und etwa 10 Gew.-% der Substanz enthält, und Trocknenlassen der Fäden vor dem Einbetten in der Matrix erreicht.
Das stabilisierte Bündel wird dann mit einem Mikrotom oder einer ähnlichen Vorrichtung lotrecht zur Längsachse der Fäden unterteilt, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen zu erzeugen, die vorzugsweise eine Dicke zwischen etwa 0,1 und 100 Mikron haben. Jede daraus hervorgehende hochdichte Anordnung weist das gleiche Muster von DNA-Sequenzen in bestimmten räumlichen Regionen oder Zonen der Anordnung auf, wobei die Zielsubstanzen in zwei analytischen Achsen angeordnet sind.
Eine Verwendungsmöglichkeit dieser DNA-Anordnungen ist der Nachweis markierter DNA-Sequenzen in einer Probe, die komplementär zu einzelsträngigen DNA-Zielsubstanzen in der Anordnung sind, durch Inkubieren von Probe und Anordnung unter Hybridisierungsbedingungen über einen Zeitraum, der zur Hybridisierung ausreicht. Nicht hybridisierte DNA wird durch Waschen entfernt. Die Markierungen werden dann erfasst und die signalerzeugenden Zonen ermittelt. Diese Zonen werden mit der Datenbank verglichen, die die Identität der DNA-Zielsubstanzen auf der Anordnung enthält, um die Identität der markierten DNA in der Probe zu ermitteln.
BEISPIEL II
Produktion und Verwendung hochdichter Anordnungen, die mit Peptid beschichtete Fäden beinhalten
Das Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen aus einem Fasern oder Fäden umfassenden Bündel gemäß der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung hochdichter Anordnungen von Peptid-Zielsubstanzen wie folgt angewendet. Die Benetzbarkeit eines Baumwollfadens mit einer wässrigen Lösung wird durch Eintauchen des Fadens in Wasser beurteilt. Wasserperlen auf der Oberfläche des Fadens sind ein Hinweis darauf, dass sich auf der Oberfläche des Fadens möglicherweise Bindemittel, Öle oder andere Materialien befinden, die sich auf die Benetzbarkeit des Fadens zur Herstellung von Zielsträngen negativ auswirken können. Kommt es während des Benetzbarkeitstests zur Perlenbildung, sollten die Fäden in Methanol, Ethanol oder einem anderen geeigneten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gewaschen werden, um die unerwünschten Materialien zu beseitigen. Die Fäden werden dann in Wasser gelegt und das Wasser wird mehrere Male ausgetauscht, bis alle Fäden vollständig befeuchtet sind.
Anschließend werden die Fäden in eine wässrige Lösung einer kationischen Polymersubstanz wie Poly-L-Lysin gegeben und mit der Poly-L-Lysin-Lösung einige Stunden lang äquilibrieren gelassen. Die Fäden werden dann aus der Poly-L-Lysin-Lösung herausgenommen und getrocknet, um das Poly-L-Lysin an die Oberfläche der Fäden zu fixieren. Nach dem Fixieren werden die Fäden in gepufferter Lösung gewaschen, wobei der Puffer mehrere Male ausgetauscht wird. Die Fäden werden aus dem Puffer herausgenommen und trocknen gelassen.
Die Fäden werden dann in Stücke geschnitten, die je nach den Abmessungen des konstruierten Bündels zwischen einem Zentimeter und ein paar Meter liegen. Alle für das Bündel bestimmten Fäden werden vorzugsweise auf dieselbe Länge geschnitten. Ein Baumwollfaden wird im Hinblick auf die Benetzbarkeit mit einer wässrigen Lösung beurteilt, in eine wässrige Lösung einer kationischen Polymersubstanz wie Poly-L-Lysind gegeben und mit der Poly-L-Lysin-Lösung einige Stunden lang äquilibrieren gelassen. Die Fäden werden aus der Poly-L-Lysin-Lösung herausgenommen und getrocknet, um das Poly-L-Lysin an die Oberfläche der Fäden zu fixieren. Nach dem Fixieren werden die Fäden in gepufferter Lösung gewaschen, wobei der Puffer mehrere Male ausgetauscht wird. Die Fäden werden aus dem Puffer herausgenommen und trocknen gelassen.
Anschließend wird jeder geschnittene Faden mit einer Dimethylsulfoxid-(DMSO)-Lösung von Peptid mit einer bestimmten bekannten Sequenz, die die immobilisierte Zielsubstanz sein soll, in Kontakt gebracht. Die Peptidsequenz ist vorzugsweise für jeden Faden unterschiedlich. Individuelle Peptide, die als Zielsubstanzen verwendet werden können, sind im Handel erhältlich oder werden durch Merifield-Synthese hergestellt (wie z.B. in Bodanszky, M. und Troust, B. Eds. Principles of Peptide Synthesis, 2. Ausg., Springer-Verlag, New York, 1993, durch Bezugnahme vollständig hierin eingeschlossen, erörtert ist), wie die Fachperson anhand der Offenbarung hierin verstehen wird. Jeder Faden und jede Peptidlösung werden dann ein paar Minuten bis ein paar Stunden lang inkubiert, d.h. so lange, bis die verfügbaren Bindungsorte auf dem Faden mit Peptid vollständig gesättigt sind.
Überschüssige DMSO-Lösung wird von den mit Peptid beschichteten Fäden durch Abtupfen entfernt, die dann mit gemischten Pentanen oder einer äquivalenten Substanz inkubiert werden, um die Peptide auf die Oberfläche der Fäden zu präzipitieren. Die mit Peptid beschichteten Fäden werden dann bei Raumtemperatur oder zwischen etwa 60°C und 70°C mit oder ohne Vakuum getrocknet. Die Identität der jeweiligen Fäden und ihrer Sequenz der immobilisierten Peptidzielsubstanz werden in einer Datenbank aufgezeichnet. Die mit Peptid beschichteten Fäden werden dann in wässrigem Puffer wie 0,01 bis 1,0 M tris, pH 7,0 oder phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0, wie 120 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid und 10 mM Phosphat (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) gewaschen, um ungebundene Peptide von den Fäden zu entfernen, und bei Raumtemperatur oder zwischen etwa 60°C und 70°C mit oder ohne Vakuum wieder getrocknet.
Ein Bündel von mit Peptid beschichteten Fäden wird dann zusammengefügt, indem die Fäden parallel zueinander und nebeneinander gelegt werden. Der Ort jedes Fadens in dem Bündel und sein zugehöriges Peptid werden in der Datenbank aufgezeichnet. Das Fadenbündel wird durch Einbetten in einer Matrix stabilisiert, die zum Beispiel aus Polymethacrylat, Epoxidharzen, Polyethylenglykol, Paraffinwachsen, Gummis, Polyacrylamid und anderen ähnlichen Materialien besteht, die vorzugsweise in flüssiger Form bei erhöhter Temperatur oder in unpolymerisierter Form, die zum Einbetten der Fäden geeignet ist, verarbeitet werden können. Man lässt die eingebetteten Fäden härten oder vernetzen, um dem Bündel eine steife Struktur zu verleihen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird verhindert, dass die Fäden vollständig mit der Einbettungsmatrix imprägniert werden und das immobilisierte Peptid maskieren, indem die Fäden mit einer Substanz wie Gelatine, Saccharose oder Polyvinylalkohol beschichtet werden, für die die Matrix undurchlässig ist. Dies wird durch Befeuchten der Fäden, die die fixierte, immobilisierte DNA tragen, mit einer Lösung, die etwa 0,01 Gew.-% und etwa 10 Gew.-% der Substanz enthält, und Trocknenlassen der Fäden vor dem Einbetten in der Matrix erreicht.
Das stabilisierte Bündel wird dann mit einem Mikrotom oder einer ähnlichen Vorrichtung lotrecht zur Längsachse der Fäden unterteilt, um eine Mehrzahl hochdichter Anordnungen zu erzeugen, die vorzugsweise eine Dicke zwischen etwa 0,1 und 100 Mikron haben. Jede daraus hervorgehende hochdichte Anordnung weist das gleiche Muster von Peptid-Sequenzen in bestimmten räumlichen Regionen oder Zonen der Anordnung auf.
Eine Verwendungsmöglichkeit dieser Peptid-Anordnungen ist der Nachweis der Anwesenheit eines Antikörperanalyts in einer Probe, wobei sich der Antikörper an wenigstens eine Peptidzielsubstanz auf der Anordnung binden kann. Die Anwesenheit von Antikörperanalyten wird durch Inkubieren von Probe und Anordnung unter geeigneten Bedingungen über einen Zeitraum, der für eine Bindung zwischen dem Antikörperanalyt ausreicht, bestimmt. Ungebundene Probe wird durch Waschen entfernt. Der gebundene Antikörper wird dann mit biotinylierten Sekundärantikörpern und einem markierten Streptavidin-Nachweis wie alkalische Phosphatase, Fluorescein oder goldmarkiertes Streptavidin gemäß Techniken nachgewiesen, die der fachkundigen Person bekannt sind, und die Identität der Peptidzielsubstanzen auf den Bindung anzeigenden Zonen wird anhand der Datenbank ermittelt. Eine Bindung weist auf die Anwesenheit eines Antikörpers mit einer epitopischen Domäne für das Peptid in der Zone hin. Diese Bindung kann ein Beweis für den Kontakt mit oder die Infektion durch einen Organismus sein, wenn die Probe von Serum eines Patienten stammt.
BEISPIEL III
Produktion und Verwendung hochdichter Anordnungen, die auf eine Membran imprägnierte DNA umfassen
Das Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen von Zielsubstanzen gemäß der vorliegenden Erfindung wurde zur Erzeugung von Anordnungen von auf eine Membran imprägnierter DNA wie folgt angewendet. Die Saccharomyces-Genomdatenbank in der Stanford University, Palo Alto, Kalifornien, USA, wurde als Quelle zur Identifizierung natürlich existierender Genomsequenzen verwendet. Mit diesen Informationen wurden 16 Oligonucleotide mit ähnlicher Schmelztemperatur zufällig aus dem Hefegenom als Zielsubstanzen ausgewählt. Jede Sequenz hatte zwischen 28 und 35 Nucleotide und wurde durch standardmäßige Cyanoethylphosphoramiditchemie mit dem in Gait, M. J., Ed., Oligonucleotid Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984, offenbarten Verfahren synthetisiert. Jede Zielsubstanzsequenz hatte 100 Thymidinreste am 3'-Ende, um die Bindung des Oligonucleotids an der Membran zu erleichtern (siehe z.B. Erlich, Henry A. und Bugawan, Teodorica L., HLA Class II Gene Polymorphism: DNA Typing, Evolution, and Relationship to Disease Susceptibility in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York, S. 193–208, 1989, hierin vollständig durch Bezugnahme eingeschlossen). Die 16 Zielsubstanzen, mit Nr. 1 bis Nr. 16 markiert, wurden einzeln in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser auf eine Endkonzentration von 10 μg/μl gelöst.
Die Zielsubstanzen wurden mit einer Applikationsspitze mit einem 11 μl fassenden Reservoir, das mit der Spitze über einen kleinen Kapillarkanal verbunden war, aufgetragen. Mit der Spitze wurden Linien von Zielsubstanzen etwa 1 mm bis 3 mm voneinander beabstandet auf 20 cm × 20 cm Membranen von Hybond^TM N+geladene Nylonmembranen (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) gezogen. Das Spitzenreservoir wurde mit einem Eppendorf^® 2–10 μl Pipettor mit 10,5 μl einer Lösung der ersten der 16 Zielsubstanzen gefüllt.
Die erste Membran (Membran Nr. 1) wurde auf eine saubere, ebene Tischplatte gelegt, wobei ein Wachspapierbogen, der größer als die Membran war und als Trennstück in der Verpackung des Herstellers verwendet wurde, zwischen die Membran und die Tischplatte gelegt wurde. Die Spitze wurde so ausgerichtet, dass beide Seiten des Kapillarkanals das Wachspapier etwa 1 cm vom Rand der Membran berührten, und die Spitze wurde gleichmäßig manuell über das Wachspapier und die Membran gezogen, wobei ein Lineal als Führung diente, um eine gerade Linie der Zielsubstanz parallel zu einem Rand der Membran zu ziehen. Die Zielsubstanzlösung wurde nach dem Ziehen einer etwa 12–16 cm langen Linie aus der Spitze abgesaugt und abgelassen. Dieser Zyklus wurde für jede Zielsubstanzlösung auf der ersten Membran wiederholt, bis Membran Nr. 1 16 parallele Linien verschiedener DNA-Zielsubstanzen aufwies, die etwa 1 mm bis 3 mm voneinander beabstandet waren.
Dieses Verfahren wurde für die Produktion von zwei zusätzlichen Membranen, Membran Nr. 2 und Nr. 3, wiederholt, mit der Ausnahme, dass jede Lösung der DNA-Zielsubstanz dreimal hintereinander aufgetragen wurde, so dass insgesamt 48 parallele Linien aus Zielsubstanzen auf den Membranen Nr. 2 und Nr. 3 erzeugt wurden. Jede Zielsubstanzlinie wurde für Identifikationszwecke auf allen Membranen markiert.
Man ließ die Membranen, die die Linien aus DNA-Zielsubstanzen beinhalteten, etwa 2 Stunden lang an der Luft trocknen und benetzte sie dann durch Aufbringen von 1200 μJoules elektromagnetischer UV-Strahlung über einen Zeitraum von 35 Sekunden mit einem Stratagene 2400 Stratalinker^® (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Beginnend an dem Rand der Membran, der den vorderen Rand der Zielsubstanzlinien enthielt, wurde ein etwa 2 cm breiter und 20 cm langer Streifen so aus jeder der drei Membranen geschnitten, dass die Zielsubstanzlinien parallel zum 2 cm Rand der Streifen waren.
Radioaktiv markierte DNA-Sonden, die komplementär zur Sequenz der Zielsubstanzen Nr. 1 und Nr. 7 waren, wurden mit Standardtechniken präpariert. Ein Hybridisierungsversuch wurde zwischen den radioaktiv markierten Sonden und einer aus der Membran Nr. 1 produzierten Anordnung mit Standardtechniken unternommen. Kurz, die DNA-Oligonucleotide wurden mit dem Ready to Go Kinase^TM Kit (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) mit Gamma-³²P-ATP (ICN Radiochemicals, Irvine, CA, USA) gemäß Herstelleranweisungen markiert. Die markierten Sonden wurden mit Nick^TM Säulen (Pharmacia) gemäß Herstelleranweisungen gereinigt und auf etwa 1 × 10⁶ cpm/ml verdünnt.
Eine Vorhybridisierung und Hybridisierung fand mit 10 ml HyperHyb^TM Puffer (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL, USA) gemäß Herstelleranweisungen in einem Mini-6^TM-Hybridisierungsofen (Hybaid, Ltd., Middlesex, UK) bei 42°C je eine Stunde lang statt Die Wäschen nach der Hybridisierung umfassten drei jeweils 15-minütige 10 ml Wäschen in 1 × SSC, 0,01% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 42°C. Eine letzte Wäsche erfolgte 15 Minuten lang in 100 ml 1 × SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) (Research Genetics), 0,01% SDS-Puffer (Sigma) bei 42°C. Eine letzte Spülung erfolgte in 10 ml 1 × SSC Puffer. Die Membranen wurden dann 1 bis 2 Stunden lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet.
Im Rahmen einer Autoradiographie wurden die Anordnungen mit Biomax^TM MS oder MR Röntgenfilm (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) bei Raumtemperatur etwa 1/2 bis 4 Stunden lang in Kontakt gebracht, bis die gewünschte Bildintensität erhalten wurde. Alle Sonden hybridisierten mit der entsprechenden Zielsubstanz auf der Anordnung, wodurch demonstriert wurde, dass die DNA-Zielsubstanzen an die Membran gebunden waren und zur Sondierung zur Verfügung standen, und dass eine solche Sondierung spezifische, eindeutige Hybridisierungsergebnisse hervorbrachte. Anschließend wurde der restliche 20 cm mal 18 cm große Abschnitt der Membranen Nr. 1, 2 und 3 wie folgt zur Produktion von Anordnungen verwendet. Die Membranen wurden in 3% Teleostean-Gelatine (Sigma) in deionisiertem Wasser eingetaucht und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um die Membranen zu blockieren. Die Membranen wurden dann dreimal in 600 ml deionisiertem Wasser gewaschen, um ungebundene Gelatine zu entfernen. Die Membranen wurden durch Abtupfen von überschüssiger Feuchtigkeit zwischen zwei Lagen von 903 Fließpapier (Schleicher und Schuell, Keene, NH, USA) befreit und über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft trocknen gelassen.
Anschließend wurde jeweils ein 2 cm mal 20 cm großer Streifen von den drei Membranen Nr. 1, 2 und 3 lotrecht zu den Zielsubstanzlinien abgeschnitten, wobei der 2 cm Rand parallel zu den Zielsubstanzlinien war. Jeder der Streifen wurde fest um eine Achse parallel zu den Zielsubstanzlinien aufgerollt, um einen Zylinder zu bilden, wobei der Abschnitt der Membran, auf dem keine Zielsubstanzen aufgebracht waren, der innerste Teil des Zylinders war. Der lose 3 mm Rand der Streifen wurde mit farblosem Nagellack verschlossen, um ein Abwickeln des Zylinders zu verhindern. Jeder Zylinder wurde in einen Kunststoffkolben (1,25 cm × 7,5 cm) eingetaucht, der mit unpolymerisiertem, weichem Einbettungsmedium LR White^TM (Sigma) gefüllt war, das gemäß Herstelleranweisungen hergestellt wurde, bis der Zylinder vollständig mit dem Medium gesättigt war. Jeder Zylinder wurde dann auf den Boden des mit dem Medium gefüllten Kolbens gesetzt, zentriert und über Nacht bei 60°C polymerisieren gelassen. Die jeweiligen Kolben mit eingebettetem Zylinder wurden entfernt und bei Umgebungstemperatur aufbewahrt und die Polymerisation wurde als beendet beobachtet.
Eine Mehrzahl von Anordnungen mit einer Dicke von etwa 10 Mikron wurde dann durch wiederholtes Unterteilen der jeweiligen eingebetteten Zylinder lotrecht zu ihrer Längsachse produziert, d.h. lotrecht zur Längsachse der jeweiligen Zielsubstanzlinien. Das Unterteilen wurde mit einem Handmikrotom, Modell DK-10 (Edmund Scientific, Barrington, NJ, USA), durchgeführt.
Radioaktiv markierte DNA-Sonden, die komplementär zur Sequenz der Zielsubstanzen Nr. 1 und Nr. 7 waren, wurden mit Standardtechniken präpariert. Ein Hybridisierungsversuch wurde zwischen den radioaktiv markierten Sonden und einer aus Membran Nr. 1 produzierten Anordnung mit Standardtechniken unternommen. Kurz, die DNA-Oligonucleotide wurden mit dem Ready to Go Kinase^TM Kit (Pharmacia, Piscataway, NI, USA) mit Gamma-³²P-ATP (ICN Radiochemicals, Irvine, CA, USA) gemäß Herstelleranweisungen markiert. Die markierten Sonden wurden mit Nick^TM Säulen (Pharmacia) gemäß Herstelleranweisungen gereinigt und auf etwa 1 × 10⁶ cpm/ml verdünnt.
Eine Vorhybridisierung und Hybridisierung fand mit 10 ml HyperHyb^TM Puffer (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL, USA) gemäß Herstelleranweisungen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel eine Stunde lang bei 42°C in einem Mini-6-Hybridisierungsofen (Hybaid Ltd., Middlesex, UK) bei 42°C statt. Die Wäschen nach der Hybridisierung umfassten drei jeweils 15-minütige 1,5 ml Wäschen in 1 × SSC, 0,01% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 42°C. Eine letzte Wäsche erfolgte 15 Minuten lang in 100 ml 1 × SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) (Research Genetics), 0,01% SDS-Puffer (Sigma) bei 42°C. Eine letzte Spülung erfolgte in 10 ml 1 × SSC Puffer. Die Anordnungen wurden dann etwa 15 bis 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Im Rahmen einer Autoradiographie wurden die Anordnungen mit Biomax^TM MS oder MR Röntgenfilm (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) bei Raumtemperatur etwa 1/2 bis 4 Stunden lang in Kontakt gebracht, bis die gewünschte Bildintensität erhalten wurde. Anschließend wurden Fotos der entwickelten Autoradiogramme gemacht.
Ein Hybridisierungsversuch wurde zwischen den radioaktiv markierten Sonden und einer aus Membran Nr. 1 produzierten Anordnung mit Standardtechniken unternommen. Alle Sonden hybridisierten mit der entsprechenden Zielsubstanz auf der Anordnung, wodurch demonstriert wurde, dass die DNA-Zielsubstanzen an die Membran gebunden waren und zur Sondierung zur Verfügung standen und dass eine solche Sondierung spezifische, eindeutige Hybridisierungsergebnisse hervorbrachte. Die Anordnungen wurden wie folgt im Hinblick auf ihre Funktionalität getestet.
Eine radioaktiv markierte DNA-Sonde komplementär zur Zielsubstanz Nr. 1 wurde zum Sondieren einer aus Membran Nr. 2 produzierten Anordnung verwendet. 15 zeigt ein Photo des Autoradiogramms, das das Ergebnis zeigt. Wie erkennbar ist, fand eine Hybridisierung zwischen der Sonde und drei Zonen auf der Anordnung mit der Zielsubstanz Nr. 1 statt, wobei es zu einer minimalen Kreuzhybridisierung mit den anderen 45 Zonen, die die restlichen 15 DNA-Zielsubstanzen repräsentierten, kam. Folglich wies die Anordnung sowohl Funktionalität für Hybridisierungsstudien als auch Spezifität auf.
Anschließend wurde eine aus Membran Nr. 3 produzierte Anordnung mit radioaktiv markierter DNA komplementär zu den Zielsubstanzen Nr. 1 und Nr. 7 sondiert. In 16 ist ein Autoradiogramm dargestellt, das das Ergebnis zeigt. Wie erkennbar ist, fand eine Hybridisierung zwischen den Sonden und sechs Zonen auf der Anordnung statt, wobei es zu einer minimalen Kreuzhybridisierung mit den anderen 42 Zonen, die die restlichen 14 DNA-Zielsubstanzen repräsentierten kam.
Die vorliegende Erfindung wurde zwar sehr detailliert mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausgestaltungen beschrieben, doch sind auch andere Ausgestaltungen möglich. Folglich ist der Umfang der beiliegenden Ansprüche nicht auf die hierin enthaltene Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen begrenzt.

Claims

Verfahren zur Herstellung hochdichter Anordnungen von Zielsubstanzen, die ein Bündel von Zielsträngen umfassen, die Zielsubstanzen umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den Schritt des Unterteilens des Bündels von Zielsträngen und Kombinierens des unterteilten Bündels mit einem oder mehreren anderen unterteilten Bündeln umfasst, wobei das Kombinieren in einer Anordnung hoher Dichte resultiert, die Zielsubstanzen in drei kartesischen Achsen hat.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den Schritt des Stabilisierens des Bündels umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Stabilisierungsschritt durch Einbetten des Bündels in einem Material erfolgt, das ausgewählt wurde aus der Gruppe bestehend aus Epoxy, Polypropylen und Polystyrol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das ferner den Schritt des Einbauens eines zusätzlichen Materials in das Bündel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das zusätzliche Material ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Antioxydationsmittel, einem mikrobiellen Inhibitor, einem nicht fluoreszierenden Gegenfarbstoff, einem Sekundärenzym und einer reflektierenden Substanz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das ferner den Schritt des Abfragens der Anordnung hoher Dichte umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Abfageschritt eine Aktivität umfasst, die ausgewählt wurde aus der Gruppe bestehend aus: visuelle Begutachtung, chemische Ablagerung, elektrische Sondierung, mechanische Erfassung, magnetische Erfassung und Messung von Kapazitätsänderungen, die sich aus Interaktionen zwischen den Zielsubstanzen auf der Anordnung hoher Dichte und miteinander verflochtenen Elektroden ergeben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei wenigstens eine der Zielsubstanzen in dem Unterteilungsschritt ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Zink, Schwefel, Gold, Polynucleotiden, DNA, RNA, Peptiden, Proteinen, Glykoproteinen, Lipoproteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Immunglobulinen, Viren, Chromosomen, Mitochondrien, prokaryotischen Zellen, Archaebakterien, eukaryotischen Zellen, Metalllegierungen, Keramik, Glas, Halbleitern, Supraleitern, Kunststoffen, Polymermaterialien, Holz, Stoff und Beton.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Bündel in dem Unterteilungsschritt einen Zielstrang umfasst, der ausgewählt wurde aus der Gruppe bestehend aus einem gegossenen Stab der Zielsubstanz, einer auf einer Glasfaser absorbierten Zielsubstanz, einer auf einem Seidenfaden absorbierten Zielsubstanz, einer an einer Polymerfaser angebrachten Zielsubstanz, einer in einen porösen Stab eingebetteten Zielsubstanz, einer auf einen Metalldraht aufgetragenen Zielsubstanz, einer in einer Gelatinematrix enthaltenen Zielsubstanz, einer auf einen Glasträger gezogenen Zielsubstanzlinie, einer auf eine Membran gezogenen Zielsubstanzlinie und einer an der Innenseite einer Röhre angebrachten Zielsubstanz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Unterteilen mit einer Schneidvorrichtung erfolgt, die ausgewählt wurde aus der Gruppe bestehend aus einem Mikrotom, einem Laser, einer Säge und einem heißen Draht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Unterteilen so erfolgt, dass die resultierende Anordnung hoher Dichte eine Dicke von etwa 0,1 μm bis etwa 1,0 mm hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Unterteilen so erfolgt, dass die resultierende Anordnung hoher Dichte eine Dicke von mehr als 50 μm hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Schritt des Kombinierens der unterteilten Bündel das Stapeln einer Mehrzahl unterteilter Zielstrangbündel umfasst.
Anordnung hoher Dichte, die mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 hergestellt wird.
Verfahren zum Ermitteln von Gensequenzen, Nachweisen der Anwesenheit von Genmutationen, Erfassen der qualitativen oder quantitativen Differentialexpression von Genprodukten, Kartieren epitopischer Sequenzen, die Immunreaktionen hervorrufen, oder Identifizieren von Verbindungen zur Entwicklung von Pharmazeutika, wobei das Verfahren den Schritt des Bereitstellens einer Anordnung hoher Dichte nach Anspruch 14 umfasst.
Hochdichte Anordnung von Zielsubstanzen, die in drei Kartesischen Achsen vorliegen, die hergestellt wird durch Unterteilen eines Bündels aus einer Mehrzahl von Zielsträngen und Kombinieren des unterteilten Bündels mit einem oder mehreren anderen unterteilten Bündeln, wobei die Mehrzahl von Zielsträngen Zielsubstanzen umfasst.
Anordnung hoher Dichte nach Anspruch 16, wobei wenigstens eine der Zielsubstanzen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zink, Schwefel, Gold, Polynucleotiden, DNA, RNA, Peptiden, Proteinen, Glykoproteinen, Lipoproteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Immunglobulinen, Viren, Chromosomen, Mitochondrien, prokaryotischen Zellen, Archaebakterien, eukaryotischen Zellen, Metalllegierungen, Keramik, Glas, Halbleitern, Supraleitern, Kunststoffen, Polymermaterialien, Holz, Stoff und Beton.
Anordnung hoher Dichte nach einem der Ansprüche 16 bis 17, die ferner eine Substanz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Epoxy, Polypropylen und Polystyrol.
Anordnung hoher Dichte nach einem der Ansprüche 16 bis 18, die ferner ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antioxydationsmittel, einem mikrobiellen Inhibitor, einem nicht fluoreszierenden Gegenfarbstoff, einem Sekundärenzym und einer reflektierenden Substanz.
Anordnung hoher Dichte nach einem der Ansprüche 16 bis 19, die eine Dicke von etwa 0,1 μm bis etwa 1,0 mm hat.
Anordnung hoher Dichte nach einem der Ansprüche 16 bis 19, die eine Dicke von mehr als 50 μm hat.
Verfahren zum Ermitteln von Gensequenzen, Nachweisen der Anwesenheit von Genmutationen, Erfassen der qualitativen oder quantitativen Differentialexpression von Genprodukten, Kartieren epitopischer Sequenzen, die Immunreaktionen hervorrufen, oder Identifizieren von Verbindungen zur Entwicklung von Pharmazeutika, wobei das Verfahren den Schritt des Bereitstellens einer Anordnung hoher Dichte nach den Ansprüchen 16 bis 21 umfasst.