DE10028257A1 - Analysechip für elektrofokussiertes Spotten - Google Patents
Analysechip für elektrofokussiertes SpottenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Analysechip für elektrofokussiertes Spotten, umfassend DOLLAR A a) eine Bodenplatte, die mit einem elektrisch leitenden Material in Form eines Punktrasters partiell beschichtet ist, wobei die einzelnen Punkte miteinander elektrisch leitend verbunden und durch Randkontakte einzeln oder in Serie adressierbar sind, und DOLLAR A b) eine auf der Bodenplatte angebrachte Lochplatte, die ein dem Punktraster der Bodenplatte entsprechendes Lochmuster aufweist.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Analysechip für elektrofokussiertes
Spotten, der umfasst:
- a) eine Bodenplatte, die mit einem elektrisch leitenden Material in Form eines Punktrasters partiell beschichtet ist, wobei die einzelnen Punkte miteinander elektrisch leitend verbunden und durch Randkontakte einzeln oder in Serie ad ressierbar sind, und
- b) eine auf der Bodenplatte angebrachte Lochplatte, die ein dem Punktraster der Bodenplatte entsprechendes Lochmuster aufweist.
Analysechips, insbesondere Biochips, sind aus dem Stand der Technik be
kannt. So können beispielsweise mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen
beladene Biochips zum spezifischen Nachweis von Antikörpern verwendet wer
den. Weiterhin kann mit Hilfe von mit unterschiedlichen DNA-Sequenzen bela
denen Biochips eine DNA-Sequenzierung vorgenommen werden, da sich ein
zelsträngige DNA-Abschnitte an komplementäre Abschnitte anlagern (hybridi
sieren).
G. Wallraff et. al. (Chemtech Febr. 1997,22) beschreiben unterschiedliche Her
stellungsverfahren von Biochips zur DNA-Sequenzierung. Diese Biochips be
stehen aus einem ebenen Träger, beispielsweise aus Glas, der auf seiner O
berfläche in eng benachbarten Bereichen mit einer Dichte von bis zu 106 pro
cm2 sich in der Sequenz unterscheidende Oligonukleotide trägt. Die Nukleotid
sequenzen werden an die entsprechenden Bereiche der Oberfläche des Trä
gers gekoppelt bzw. dort synthetisiert, wobei die übrigen Bereiche zu schützen
sind, was mit einem hohen Aufwand verbunden ist.
Nach einem dort beschriebenen Verfahren werden fertig synthetisierte Oligonukleotide
mittels Feinstdosierung an bestimmte Stellen der Oberfläche eines
Substrats gebracht und dort kovalent gebunden. Nachteilig hierbei ist, daß bei
zunehmender Dichte der aufzubringenden Sequenzen pro Substratfläche durch
Kontamination benachbarter Bereiche die notwendige Reinheit der Sequenzen
nicht gewährleistet ist.
Nach einem anderen Verfahren werden die Nukleotid-Sequenzen auf dem Sub
strat unter Verwendung photolabiler Schutzgruppen synthetisiert. Durch den
Einsatz von aus der Photolithographie bekannten Maskentechniken werden die
Schutzgruppen dort abgespalten, wo Nukleotid-Sequenzen aufgebaut werden
sollen. Bei einer hohen Dichte unterschiedlicher Sequenzen bezogen auf die
Substratfläche führt jedoch beispielsweise Streulicht zu einer unerwünschten
Abspaltung von Schutzgruppen in unbelichteten Regionen des Substrats und
damit zu einer Ankoppelung von Nukleotiden in Regionen, die eigentlich ge
schützt sein sollten.
Aus der DE-A-198 23 876 ist ein Biochip bekannt, dessen Oberfläche zur Ver
hinderung von Kontaminationen durch Proben aus benachbarten Bereichen des
Chips räumlich segmentiert ist. Die Herstellung des Chips ist jedoch sehr auf
wendig.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Mikroarrays, Biochips oder Analyse
chips weisen im wesentlichen folgende Nachteile auf:
Hochviskose Probenlösungen, insbesondere Proben, die große Protein- oder
Nukleinsäuremoleküle in hoher Konzentration enthalten, führen oft zu inhomo
genen Spots und erzwingen zeitintensive Nachbearbeitungen und teure zusätz
liche Untersuchungen.
Außerdem wird das Problem von möglichen Kreuzkontaminationen durch be
nachbarte Spots, wie oben beschrieben, entweder gar nicht oder nur sehr auf
wendig gelöst.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen neuen
Analysechip bereitzustellen, der die genannten Nachteile des Standes der
Technik überwindet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Analysechip für elektrofokussier
tes Spotten, umfassend
- a) eine Bodenplatte, die mit einem elektrisch leitenden Material in Form ei nes Punktrasters partiell beschichtet ist, wobei die einzelnen Punkte miteinan der elektrisch leitend verbunden und durch Randkontakte einzeln oder in Serie adressierbar sind, und
- b) eine auf der Bodenplatte angebrachte Lochplatte, die ein dem Punktras ter der Bodenplatte entsprechendes Lochmuster aufweist.
Der erfindungsgemäße Analysechip ermöglicht es vorteilhafterweise, Proben
unabhängig von ihrer Viskosität mit Hilfe von Elektroden an definierten Punkten
des Punktrasters (Arrays) zu fokussieren und zu immobilisieren. Durch die Fo
kussierfähigkeit erfolgt gleichzeitig eine Erhöhung der lokalen Konzentration der
Proben und so eine höhere Spezifität. Während der Analyse selbst besteht die
Möglichkeit das Testgut an die einzelnen Positionen des Arrays zu adressieren.
So kann potentiell jede untersuchte Information mit der höchst möglichen Sensi
tivität aufgespürt werden. Die durch die Lochplatte gebildeten Kavitäten schlie
ßen eine Kreuzkontamination durch benachbarte Spots aus.
Der erfindungsgemäße Analysechip weist eine "Sandwich-Struktur" auf.
Die Bodenplatte besteht aus einem nicht elektrisch leitfähigen Material, vor
zugsweise aus Glas oder Kunststoff. Es ist besonders bevorzugt, einen einfa
chen, handelsüblichen Standard Glasobjektträger mit den Maßen 75 mm × 25 mm
einzusetzen.
Die Bodenplatte wird in einem Punktraster mit einer elektrisch leitfähigen Ver
bindung, vorzugsweise mit einem Metall, besonders bevorzugt mit Gold partiell
beschichtet.
Die Beschichtung erfolgt im bevorzugten Fall der metallischen Beschichtung
insbesondere durch Bedampfung. Die Bedampfung kann beispielsweise wie
folgt durchgeführt werden:
- a) Vorfertigung einer Maske, diese wird auf die Bodenplatte aufgelegt und Me tall (z. B. Gold) wird aufgedampft.
- b) Die Bodenplatte wird komplett mit Metall bedampft, eine Fotolackschicht wird darüber gelegt, mit einer vorgefertigten Maske belichtet und die festgelegte Struktur durch Ätzen freilegt.
- c) Die Bodenplatte wird komplett mit Metall bedampft, eine Maske wird erstellt und die Strukturen werden mit Hilfe eines Lasers hervorgehoben/eingearbeitet.
Es können jedoch auch alle anderen dem Fachmann bekannten Beschich
tungsverfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Analysechips einge
setzt werden.
Damit jeder einzelne Punkt des Rasters adressierbar ist, wird die Beschichtung
so durchgeführt, daß die einzelnen Punkte in einem festgelegten Muster mitein
ander verbunden sind. Zusätzlich sind die Punkte über Randkontakte einzeln
bzw. in Reihe durchkontaktiert.
Am äußeren Rand der Bodenplatte kann ein Bar-Code angebracht werden oder
eine andere Form der vorzugsweise computerlesbaren Kennzeichnung der auf
gebrachten Spots.
Für die zweite Schicht des "Sandwichs" wird eine Lochplatte mit einer Auflö
sung und Verteilung der Löcher wie sie durch die partielle Beschichtung auf der
Bodenplatte vorgegeben ist, eingesetzt.
Die Lochplatte wird vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff gefertigt, insbeson
dere aus einem Spezialglas, das es erlaubt, Mikrostrukturen mit sehr hohen
Aspektverhältnissen (Lochtiefe/Lochbreite) zu erzeugen. Ein solches Spezial
glas ist beispielsweise das von der Fa. Schott unter dem Markennamen
FOTURAN erhältliche Glas.
Der Kunststoff, aus dem die Lochplatte alternativ erzeugt werden kann, ist vor
zugsweise schwarz eingefärbtes Polycharbonat. Mit einem Laser bearbeitet
kann es die gleichen wenn nicht sogar bessere Strukturen aufweisen als Glas.
Geeignete Polycharbonate sind beispielsweise die von der Firma Bayer AG un
ter den Markennamen Makrolon® oder Bayfol®
erhältlichen Polycarbonate.
Die Löcher in der Lochplatte haben vorzugsweise das gleiche Rastermaß wie
das Punktraster der Bodenplatte. Jedoch unterscheiden sie sich von diesem in
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in der Größe. Vorzugsweise
beträgt das Verhältnis der Durchmesser von Kavität und Sensorfläche etwa 1 : 1
bis 2 : 1, wobei jeder Punkt des Punktrasters eine Sensorfläche darstellt. Beson
ders bevorzugt weisen die Sensorflächen einen Durchmesser von etwa 1 bis
etwa 100 µm, insbesondere etwa 1 bis etwa 10 µm, und die Kavitäten einen
Durchmesser von etwa 2 bis etwa 200 µm, insbesondere etwa 2 bis etwa 20 µm,
auf.
Vorzugsweise sind die Löcher der Lochplatte so geformt, daß sich die Kavitäten
der Lochplatte in Richtung der Bodenplatte verjüngen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her
stellung eines Analysechips, dadurch gekennzeichnet, daß man
- A) eine Bodenplatte mit einem elektrisch leitenden Material in Form eines Punktrasters partiell so beschichtet, daß die einzelnen Punkte miteinan der elektrisch leitend verbunden und durch Randkontakte einzeln oder in Serie adressierbar sind,
- B) eine Lochplatte herstellt, deren Lochmuster dem Punktraster der Boden platte entspricht und
- C) Boden- und Lochplatte so zusammensetzt, daß die Punkte der Boden platte mit den Löchern der Lochplatte eine Flucht ergeben.
Dieses wird erzielt, in dem die Lochplatte deckungsgleich zu drei Seiten auf die
Bodenplatte aufgelegt wird.
Vorzugsweise werden die beiden Bauteile mithilfe eines Klebers, insbesondere
eines fluoreszenzarmen Klebers miteinander verbunden.
Die einzelnen Randkontakte, die die beschichteten Punkte untereinander ver
binden, liegen für die direkte Kontaktierung frei.
Die Bestückung des Analysechips mit für die gewünschte Analyse geignetem
Material kann wie folgt ablaufen: Die einzelnen Kavitäten werden mit einer elek
trisch, leitenden Salzlösung gefüllt. Über die Randkontakte werden die einzel
nen Sensorflächen mit einer bestimmten positiven Spannung belegt. Fährt die
Spotternadel auf die vorgelegte Position und taucht die Nadelspitze in die ge
füllte Kavität, wird eine negative Spannung an die Nadel gelegt und die definier
te Probemenge wandert durch die Salzlösung direkt auf das positive geladene
Sensorfeld. Durch diesen Vorgang ergeben sich die oben bereits erwähnten
Vorteile:
Unabhängig von der Viskosität der Lösung, wird durch einen festgelegten Zeit
faktor ein Spannungsfeld angelegt und dadurch eine definierte Menge an Pro
benlösung abgezogen.
Durch die elektrisch leitfähige Sensorfläche am Boden der Kavität wird die ge
samte Probenlösung auf einen Punkt, mit immer der gleichen Größe, elektrisch
fokussiert.
Durch die vorhandene Kavität gibt es keine Einschränkungen aufgrund von
Kreuzkontaminationen durch benachbarte Spots.
Die Proben können feucht, durch Abdecken der Kavitäten, oder trocken gela
gert werden.
Durch das Anlegen eines Spannungsfeldes kann eine schnelle lokale Hybridi
sierung durchgeführt werden. Vorzugsweise wird beim Spott-Vorgang, d. h.
wenn die Nukleinsäure-Sonden aufgebracht werden, an die Metallstruktur ein
Gleichstromfeld angelegt (Kavität positive Spannung, Spotternadel negative
Spannung). Bei der anschließenden Hybridisierung sowie beim elektrostringen
ten Waschvorgang wird vorzugsweise ein Wechselstrom im Hz bis kHz-Bereich
angelegt.
Der erfindungsgemäße Analysechip kann mit jedem Molekül bestückt werden,
das einer Elektrofokussierung zugänglich ist. Hierbei sind insbesondere elekt
risch geladene Oligo- und Polymere synthetischen oder natürlichen Ursprungs
zu nennen. Geeignete Oligo- oder Polymere sind beispielsweise Nukleinsäuren
wie DNA, RNA oder PNA (Peptide Nucleic Acid) sowie Proteine, insbesondere
DNA-assozierte und regulatorische Proteine.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Analysechips auf dem Gebiet der Untersuchung und Er
fassung von Erbinformation oder von Veränderung von Erbinformation, insbe
sondere auf dem Gebiet der in vitro Diagnostik von Erkrankungen bei Tieren,
Pflanzen oder Menschen, der Lebensmittelüberwachung sowie der Erfassung
von Kombinationen und Codierungsverfahren für die industrielle Nutzung von
Stoffen oder Lebewesen.
Beispielsweise lassen sich mittels des erfindungsgemäßen Analysechips Kom
binationen und Codierungsverfahren von Ölen, Lacken oder Tieren erfassen.
Lacke mit einer bestimmten Zusammensetzung (RAL Nummern) bekommen
zum Beispiel einen DNA-Zusatz und können so über den Chip mit den entspre
chenden Gegenstücken identifiziert werden. Landwirtschaftliche Betriebe für
Tierproduktion erhalten zum Beispiel bestimmte DNA-Marker für ihr Vieh, wel
ches nach der Schlachtung über eine Gewebe- oder Flüssigkeitsuntersuchung
entsprechend analysiert und zugeordnet wird, um eventuelle "schwarz" Importe
verfolgen bzw. ausschließen zu können. Mithilfe des erfindungsgemäßen Ana
lysechips läßt sich auch der Status quo eines Genexpressionsmusters erfassen
und so beispielsweise der Status der Genaktivierung bei Pflanzen oder Tieren
bestimmen.
Die Zeichnungen stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar:
Fig. 1 Dreidimensionale Ansicht des Analysechips im Querschnitt (A-Loch
platte, B-Punktraster [Metallstruktur], C-Kavität, D-Bodenplatte)
Fig. 2 Ausschnitt aus der Lochplatte
Fig. 3 Lochplatte
Fig. 4 Chip mit Punktraster
Fig. 5 Chip mit Randkontakten
Claims (9)
1. Analysechip, umfassend
- a) eine Bodenplatte, die mit einem elektrisch leitenden Material in Form ei nes Punktrasters partiell beschichtet ist, wobei die einzelnen Punkte miteinan der elektrisch leitend verbunden und durch Randkontakte einzeln oder in Serie adressierbar sind, und
- b) eine auf der Bodenplatte angebrachte Lochplatte, die ein dem Punktras ter der Bodenplatte entsprechendes Lochmuster aufweist.
2. Analysechip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrisch
leitende Material Metall, insbesondere Gold ist.
3. Analysechip nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Lochplatte aus Glas oder Kunststoff, insbesondere aus schwarz eingefärb
tem Polycarbonat oder FOTURAN® besteht.
4. Analysechip nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn
zeichnet, daß sich die Kavitäten der Lochplatte in Richtung der Bodenplatte
verjüngen.
5. Analysechip nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Verhältnis der Durchmesser von Kavität und Sensorfläche
etwa 1 : 1 bis 2 : 1 beträgt.
6. Analysechip nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Sensorflächen einen Durchmesser von etwa 1 bis etwa
100 µm und die Kavitäten einen Durchmesser von etwa 2 bis etwa 200 µm
aufweisen.
7. Verfahren zur Herstellung eines Analysechips, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- A) eine Bodenplatte mit einem elektrisch leitenden Material in Form eines Punktrasters partiell so beschichtet, daß die einzelnen Punkte miteinan der elektrisch leitend verbunden und durch Randkontakte einzeln oder in Serie adressierbar sind,
- B) eine Lochplatte herstellt, deren Lochmuster dem Punktraster der Boden platte entspricht,
- C) Boden- und Lochplatte so zusammensetzt, daß die Punkte der Boden platte mit den Löchern der Lochplatte eine Flucht ergeben.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt III)
Boden- und Lochplatte mittels eines Klebers, insbesondere mittels eines flu
oreszenzarmen Klebers verbindet.
9. Verwendung eines Analysechips nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auf
dem Gebiet der in vitro Diagnostik von Erkrankungen bei Tieren, Pflanzen
oder Menschen, der Lebensmittelüberwachung sowie der Erfassung von
Kombinationen und Codierungsverfahren für die industrielle Nutzung von
Stoffen oder Lebewesen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000128257 DE10028257A1 (de) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | Analysechip für elektrofokussiertes Spotten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000128257 DE10028257A1 (de) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | Analysechip für elektrofokussiertes Spotten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10028257A1 true DE10028257A1 (de) | 2001-12-20 |
Family
ID=7645039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000128257 Withdrawn DE10028257A1 (de) | 2000-06-09 | 2000-06-09 | Analysechip für elektrofokussiertes Spotten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10028257A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2191553A1 (es) * | 2002-01-22 | 2003-09-01 | Univ Rovira I Virgili | Metodo para la fabricacion de chips para la deteccion de analitos. |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03122554A (ja) * | 1989-10-06 | 1991-05-24 | Tdk Corp | 電気化学発光検出用容器 |
| WO1996007917A1 (en) * | 1994-09-09 | 1996-03-14 | Nanogen, Inc. | Automated molecular biological diagnostic system |
| US6033916A (en) * | 1996-01-17 | 2000-03-07 | Micronas Intermetall Gmbh | Measuring device and method for making same |
-
2000
- 2000-06-09 DE DE2000128257 patent/DE10028257A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03122554A (ja) * | 1989-10-06 | 1991-05-24 | Tdk Corp | 電気化学発光検出用容器 |
| WO1996007917A1 (en) * | 1994-09-09 | 1996-03-14 | Nanogen, Inc. | Automated molecular biological diagnostic system |
| US6033916A (en) * | 1996-01-17 | 2000-03-07 | Micronas Intermetall Gmbh | Measuring device and method for making same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JP 3-122554. Patent Abstracts of Japan * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2191553A1 (es) * | 2002-01-22 | 2003-09-01 | Univ Rovira I Virgili | Metodo para la fabricacion de chips para la deteccion de analitos. |
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