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ES2225407T3 - Metodo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad. - Google Patents

Metodo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad.

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ES2225407T3
ES2225407T3 ES01203717T ES01203717T ES2225407T3 ES 2225407 T3 ES2225407 T3 ES 2225407T3 ES 01203717 T ES01203717 T ES 01203717T ES 01203717 T ES01203717 T ES 01203717T ES 2225407 T3 ES2225407 T3 ES 2225407T3
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ES
Spain
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high density
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ordered
target substances
substances
Prior art date
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ES01203717T
Other languages
English (en)
Inventor
James R. Hudson, Jr.
Elliot P. Dawson
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BioVentures Inc
Original Assignee
BioVentures Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

Un método para producir una disposición ordenada de alta densidad que comprende las etapas de enrollar una membrana impregnada con líneas de sustancias diana para producir un haz y cortar en sentido transversal el haz para producir una pluralidad de disposiciones ordenadas de alta densidad, caracterizado por que: el haz de hebras diana se ha estabilizado embebiendo el haz en un material; y en el que la localización de cada sustancia diana en el haz está registrada en una base de datos.

Description

Método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad.
Antecedentes
Disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias dianas inmovilizadas naturales o sintéticas permiten seleccionar simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas. Tales disposiciones ordenadas de alta densidad han demostrado ser útiles en diversos campos tecnológicos incluyendo química, genética, inmunología, ciencia de materiales, medicina, biología molecular y farmacología. Por ejemplo, se usan disposiciones ordenadas de alta densidad de ácidos nucleicos para determinar secuencias de genes, para detectar la presencia de mutaciones génicas y para detectar la expresión diferencial cualitativa y cuantitativa de productos génicos. De forma similar, disposiciones ordenadas de alta densidad de péptidos se usan para cartografiar secuencias epitópicas que producen respuestas inmunes. Además, disposiciones ordenadas de sustancias dianas se usan para identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos.
Actualmente, los métodos para la construcción de disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias de ensayo son generalmente de dos tipos. El primero, las disposiciones ordenadas se construyen aplicando individualmente las sustancias dianas preformadas naturales o sintéticas, tales como biomoléculas, directamente a posiciones específicas en un soporte. Los soportes incluyen membranas de nitrocelulosa, nailon, poli(fluoruro de vinilideno), vidrio, silicio u otros materiales y las sustancias dianas se pueden inmovilizar en el soporte exponiendo el soporte a radiación ultravioleta o cociendo el soporte, entre otras técnicas. Uno de tales métodos se describe en Pietu et al., "Novel Gene Transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array", Genome Research (1996) 6: 492-503, incorporado íntegramente en esta memoria por referencia. Se han ideado varios dispositivos para automatizar el método de aplicación.
El segundo método de fabricar disposiciones ordenadas de alta densidad implica sintetizar in situ en un soporte las sustancias dianas individuales en posiciones específicas. En una versión de este método, se usa química fotosintética para preparar simultáneamente series de distintas sustancias dianas en posiciones únicas del soporte. En otra versión de este método, las sustancias dianas se sintetizan enmascarando o bloqueando físicamente áreas seleccionadas de un soporte y la deseada reacción química de síntesis se lleva a cabo en la porción del soporte sin enmascarar. Ejemplos de este método se describen en Fodor et al., "Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Syntheses", Science (1991)251:767-777; Patente de Estados Unidos 5.436.327; y en Southern, E.M. et al., "Analyzing and Comparing Nucleic Acid Sequences by Hybridization to Arrays of Oligonucleotides; Evaluation using Experimental Models", Genomics (1992) 13: 1008-1017, incorporadas íntegramente en este documento por referencia.
Ambos métodos de construir disposiciones ordenadas de alta densidad tienen asociadas varias desventajas. Primeramente, los métodos sólo pueden producir un número relativamente limitado de disposiciones ordenadas idénticas a la vez. En segundo lugar, es difícil verificar las disposiciones ordenadas producidas mediante estos métodos durante la producción para determinar la integridad de las etapas de producción. En tercer lugar, muchas sustancias potencialmente dianas no se pueden aplicar a soportes y no se pueden sintetizar in situ en soportes mediante los métodos usados actualmente. Además, no se describen las disposiciones ordenadas compuestas por sustancias de ensayo demás de una categoría química, tales como disposiciones ordenadas de sustancias de ensayo péptidos y ácidos nucleicos. También, los métodos sólo son capaces de producir disposiciones ordenadas de sustancias dianas en una capa que tiene un espesor relativamente limitado. Además, cada uno de los métodos puede producir disposiciones ordenadas con dimensiones de la zona de la sustancia diana relativamente limitadas.
La patente internacional WO 99/03341 describe el uso de materiales porosos en forma de varillas o láminas que tienen compuestos inmovilizados sobre ellos. Al material poroso se le da forma de haz comprimiendo radialmente las varillas o envolviendo la lámina en espiral.
La patente internacional WO 96/17246 describe elementos delgados que son vehículos en forma de haz planos o alargados que tienen moléculas inmovilizadas sobre ellos. Después el haz se corta en sentido transversal para formar una disposición ordenada.
El documento US 4.820.504 describe un bloque de tisú con múltiples muestras que tiene una pluralidad de muestras de tisú en varillas, envueltas en una carcasa que posteriormente se corta en sentido transversal.
Por lo tanto, existe la necesidad de un método alternativo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad que no tenga las desventajas inherentes a los métodos conocidos para producción de disposiciones ordenadas de alta densidad. Por ejemplo, el método preferiblemente debería poder producir un gran número de disposiciones ordenadas idénticas simultáneamente, rápidamente y con un coste eficaz. El método debería poder usar una amplia variedad de sustancias dianas y de soportes, incluyendo sustancias de ensayo y soportes que no se pueden incorporar en disposiciones ordenadas obtenidas por los métodos presentes. El método debería poder producir disposiciones ordenadas de más de dos dimensiones, con espesores y tamaños variables y con configuraciones distintas de la configuración plana. Además, el método debería poder producir disposiciones ordenadas que tengan distintas dimensiones de la zona de la sustancia diana, incluyendo zonas de distinto tamaño para diferentes sustancias dianas en una disposición ordenada. También, el método debería poder producir disposiciones ordenadas de alta densidad para sustancias de ensayo de diferentes categorías o clases químicas, tales como disposiciones ordenadas de sustancias de ensayo péptidos y ácidos nucleicos. Además, el método debería poder usar sustancias dianas preformadas o usar sustancias dianas sintetizadas in situ, si es necesario, para incorporar las ventajas de estos métodos.
Sumario
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias dianas que comprende la etapa de cortar en sentido transversal un haz de hebras dianas, en las que las hebras dianas comprenden las sustancias dianas y en las que el cortar en sentido transversal da como resultado una disposición ordenada de alta densidad. El método también puede comprender una etapa de estabilizar el haz, incorporar un material adicional en el haz o interrogar la disposición ordenada de alta densidad.
También se proporciona una disposición ordenada de alta densidad producida cortando en sentido transversal un haz que comprende un gran número de hebras dianas, en la que el gran número de hebras dianas comprende sustancias dianas. Las disposiciones ordenadas de alta densidad pueden tener sustancias dianas presentes en uno, dos o tres ejes cartesianos.
Además se proporciona un método para preparar una disposición ordenada de alta densidad que comprende la etapa de enrollar una membrana o apilar membranas impregnadas con líneas de sustancias dianas para producir un haz. También, se proporciona un método para determinar secuencias de genes, detectar la presencia de mutaciones génicas, detectar la expresión diferencial cualitativa o cuantitativa de productos génicos, cartografiar secuencias epitópicas que producen respuestas inmunes o identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos, usando las disposiciones ordenadas de alta densidad producidas según la presente invención.
Figuras
Las características, aspectos y ventajas de la presente invenciones entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y figuras acompañantes en las que:
las Figuras 1 a 3 representan la producción de disposiciones ordenadas de alta densidad que usan un haz o fibras que comprenden sustancias dianas según la presente invención;
las Figuras 4 a 5 representan la producción de disposiciones ordenadas de alta densidad que usan un haz que comprende una membrana que tiene líneas de sustancias dianas apiladas en la membrana según la presente invención;
las Figuras 6 a 8 representan la producción de disposiciones ordenadas de alta densidad empleando un haz que comprende un gran número de membranas que tienen líneas de sustancias dianas conocidas aplicadas en la membrana según la presente invención;
las Figuras 9 a 11 representan la producción de disposiciones ordenadas de alta densidad que emplean un haz que comprende una membrana enrollada que tiene líneas de sustancias dianas conocidas aplicadas en la membrana según la presente invención;
las Figuras 12 a 14 representan la producción de disposiciones ordenadas de alta densidad empleando un haz que comprende tubos rellenos con sustancias dianas según la presente invención;
la Figura 15 es una fotografía de un autorradiógrafo que muestra el resultado de un estudio de hibridación realizado en una disposición ordenada producida según la presente invención; y
la Figura 16 es una fotografía de un autorradiógrafo que muestra el resultado de un estudio de hibridación desarrollado en otra disposición ordenada producida según la presente invención.
Descripción
Según una realización de la presente invención, se proporciona un método para fabricar una disposición ordenada de alta densidad de sustancias dianas para determinar la identidad o propiedades de analitos o para determinar la identidad o propiedades de sustancias dianas. Según otra realización de la presente invención, se proporciona una disposición ordenada de alta densidad de sustancias dianas para determinar la identidad o propiedades de analitos o para determinar la identidad o propiedades de las sustancias dianas.
El término "sustancia diana", como se emplea en este documento, se refiere al componente de la disposición ordenada de alta densidad que potencialmente interactúa con uno o más analitos de interés. Las sustancias dianas pueden ser átomos, moléculas, productos químicos complejos, orgánulos, virus, células o materiales, o pueden ser combinaciones de esas entidades, o pueden ser otras entidades como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento. Por ejemplo, las sustancias dianas de una disposición ordenada de alta densidad según la presente invención se pueden seleccionar entre una o más del grupo de átomos tales como cinc, azufre y oro; biomoléculas tales como polinucleótidos, DNA, RNA, péptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, lípidos, inmunoglobulinas y sus análogos y variantes sintéticos; virus; componentes subcelulares tales como cromosomas microdiseccionados y mitocondrias, células, incluyendo células procariotas, arqueobacterias y células eucariotas; y materiales tales como aleaciones metálicas, materiales cerámicos, vidrios, semiconductores, superconductores, plásticos, materiales polímeros, madera, tejidos y hormigón.
El término "analito", como se emplea en este documento se refiere a una entidad cuya identidad o propiedades se han de determinar por interacción con las sustancias dianas de una disposición ordenada de alta densidad según la presente invención. Alternativa o simultáneamente, el analito se puede usar para determinar la identidad o propiedades de las sustancias dianas por interacción con las sustancias dianas de una disposición ordenada de alta densidad según la presente invención. Los analitos se pueden seleccionar del mismo grupo que las sustancias dianas, tales como proteínas o ácidos nucleicos, o pueden ser una condición física o medioambiental tal como una o más condiciones seleccionadas del grupo que consiste en temperatura, pH, o concentración salina.
El término "hebra diana", como se emplea en este documento, se refiere a una tira de la sustancia diana. Estas tiras pueden estar formadas en su totalidad por una o más sustancias dianas, o pueden comprender una o más sustancias dianas con un soporte o un contenedor. Las sustancias dianas pueden estar absorbidas, adsorbidas, unidas, embebidas en el soporte o revestir al mismo o pueden estar contenidas en el contenedor. Por ejemplo, las hebras dianas pueden incluir varillas coladas de sustancias dianas tales como aleaciones metálicas, hormigón o plástico, o pueden incluir sustancias dianas absorbidas en fibras de vidrio o hilos de seda, unidas a fibras de polímero, embebidas en una varilla porosa, revistiendo un alambre metálico o contenidas en una matriz de gelatina. Además, las hebras dianas pueden incluir líneas de sustancias dianas que están escritas, trazadas, impresas o abollonadas en un portaobjetos de vidrio o en una membrana tal como una hoja plana de sustancia polimérica o en un soporte equivalente. Además, las hebras dianas pueden incluir sustancias dianas unidas a la parte interior de tubos.
El término "matriz", como se usa en este documento, se refiere a un material en el que se pueden embeber sustancias dianas o al que se pueden unir sustancias dianas para suministrar un soporte estructural adicional, para servir como espaciador, para exponer la sustancia diana a analito o para influir en la interacción entre la sustancia diana y el analito tal como por aislamiento eléctrico de sustancias dianas unas de otras. Las matrices pueden ser materiales polímeros tales como una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en aerogel, agarosa, albúmina, gelatina, hidrogel y poliacrilamida.
El término "haz", como se usa en este documento, se refiere a una disposición ordenada o grupo de hebras dianas. Por ejemplo, un haz puede incluir un apilamiento de hebras dianas en la que cada hebra diana comprende un tubo lleno con una sustancia diana, o en el que cada hebra diana comprende líneas de sustancias dianas extendidas en una membrana, o en la que cada hebra diana comprende un alambre de una sustancia diana.
Método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad según la presente invención comprende las etapas de (a) reunir un haz de hebras dianas, y (b) cortar en sentido transversal el haz para producir una disposición ordenada. Además, el método puede incluir una etapa de estabilización de las hebras dianas o haces. También, el método puede incluir una etapa de incorporar uno o más materiales adicionales a las disposiciones ordenadas de alta densidad. Además, el método puede incluir una etapa de interrogar la disposición ordenada de alta densidad.
Reunión de un haz de hebras dianas
Se puede producir un haz de disposiciones ordenadas de hebras dianas mediante varios métodos. Por ejemplo, un haz de hebras dianas se puede producir llenando primero tubos con sustancias dianas o con sustancias dianas en combinación con una matriz. La sustancia diana se puede incluir dentro de la matriz sin estar químicamente enlazada a la matriz o se puede unir a la matriz por fuerzas covalentes, por fuerzas iónicas, por enlace de hidrógeno o por otras formas de unión. Después los tubos se disponen y se aseguran de manera sustancialmente paralela a sus ejes longitudinales para producir el haz de hebras dianas.
También se puede producir un haz de hebras dianas revistiendo o impregnando primero un soporte, tal como una membrana, fibra, tubo o varilla, con una sustancia diana, o aplicando disoluciones de sustancia diana a un soporte con la punta de una pluma estilográfica, tal como la punta de una pluma de ave o un aerógrafo, o con una impresora de tinta, abollonando o transfiriendo térmicamente disoluciones de sustancias dianas a un soporte. A continuación, estos soportes se apilan, se enrollan o se doblan para producir el haz de hebras dianas. El haz resultante contiene filas de sustancias dianas que se alinean relativamente paralelas al eje longitudinal de aplicación de la sustancia diana.
Cortar en sentido transversal los haces para producir las disposiciones ordenadas
Después de la unión, los haces se cortan en sentido transversal para producir las disposiciones ordenadas. Los haces se pueden cortar en sentido transversal con un microtomo, láser, sierra, alambre caliente u otro dispositivo o método de corte como se entenderá por los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento. El corte en sentido transversal puede dar como resultado una disposición ordenada de alta densidad con sustancias dianas que tiene cualquiera de una amplia variedad de espesores. Por ejemplo, la disposición ordenada puede tener sustancias dianas con un espesor de entre alrededor de 0,1 \mum a alrededor de 1 mm o más grueso. Además, al contrario que los métodos conocidos anteriormente para producir disposiciones ordenadas, el método descrito en este documento puede producir fácilmente disposiciones ordenadas que tienen sustancias dianas con un espesor mayor que 50 \mum. Esto es ventajoso porque puede aumentar la señal generada por la sustancia diana comparada con las señales generadas por sustancias dianas en disposiciones ordenadas más finas.
En una realización preferida, el haz reunido tiene hebras dianas cuyos ejes longitudinales son sustancialmente paralelos unos a otros y el haz se corta en sentido transversal sustancialmente de manera perpendicular a los ejes longitudinales de las hebras dianas para producir las disposiciones ordenadas de alta densidad. El corte en sentido transversal también se puede realizar a otro ángulo que no sea sustancialmente perpendicular a los ejes longitudinales de las hebras dianas, tal como para producir disposiciones ordenadas ovales a partir de un haz cilíndrico.
Dependiendo de la forma del haz y de la dirección de corte en sentido transversal, la etapa de corte en sentido transversal puede producir disposiciones ordenadas de alta densidad con uno, dos o tres ejes analíticos, esto es, disposiciones ordenadas de alta densidad que tienen sustancias dianas en uno, dos o tres ejes cartesianos. Por ejemplo, disposiciones ordenadas con un eje analítico se pueden obtener cortando en sentido transversal un haz que tiene sustancias dianas en un único plano. Disposiciones ordenadas con dos ejes analíticos pueden ser el resultado de cortar en sentido transversal un haz que tiene sustancias dianas situadas en distintos planos. Disposiciones ordenadas con dos ejes analíticos también se pueden producir mediante la combinación de disposiciones ordenadas con un único eje analítico y con ejes múltiples. Las disposiciones ordenadas con tres ejes analíticos se pueden producir mediante combinación de disposiciones ordenadas con un único eje analítico y con ejes analíticos múltiples, mediante la combinación de una disposición ordenada con un único eje analítico con una disposición ordenada con dos ejes analíticos o mediante la combinación de varias disposiciones ordenadas con dos ejes analíticos.
Por ejemplo, una disposición ordenada de alta densidad con un eje analítico se puede producir cortando en sentido transversal un haz formado a partir de hebras dianas preparadas depositando sustancias dianas en líneas paralelas en una membrana plana, en la que el corte en sentido transversal se realiza en un plano perpendicular al plano formado por las líneas. De manera similar, una disposición ordenada de alta densidad con dos ejes analíticos se puede producir cortando en sentido transversal un haz formado a partir de hebras dianas que comprenden un apilamiento de membranas, en el que cada membrana tiene sustancias dianas depositadas en líneas paralelas y en la que se corta en sentido transversal en un plano perpendicular al eje longitudinal de las líneas de sustancia diana. Además, una disposición ordenada de alta densidad con tres ejes analíticos se puede producir apilando varias disposiciones ordenadas de alta densidad con dos ejes analíticos producidos por este corte en sentido transversal.
Estabilización del haz de hebras dianas
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad según la presente invención también puede incluir una etapa de estabilización del haz de hebras dianas. La estabilización puede mejorar la forma o la función del haz u disposición ordenada, tal como haciendo que el haz sea más fácil de cortar en sentido transversal o aislando las sustancias dianas unas de otras en la disposición ordenada. La etapa de estabilización se puede realizar en cualquier momento durante o después de la unión del haz de hebras dianas, según sea apropiado para el tipo de estabilización. Por ejemplo, la estabilización se puede realizar embebiendo el haz de hebras dianas en una matriz, tal como resinas epoxídicas, polipropileno o poliesti-
reno.
Incorporación de materiales adicionales a las disposiciones ordenadas de alta densidad
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad según la presente invención también puede incluir una etapa de incorporación de uno o más materiales adicionales en las disposiciones ordenadas de alta densidad durante o después de la unión del haz de hebras dianas, incluso después de la etapa de corte en sentido transversal. Estos materiales pueden mejorar la forma o la función de la disposición ordenada de alta densidad. Por ejemplo, la etapa de incorporación puede incluir añadir antioxidantes o inhibidores microbianos u otras sustancias para mantener la integridad de la disposición ordenada de alta densidad con el tiempo.
Además, la etapa de incorporación puede incluir añadir sustancias a la matriz que reduzcan el ruido de fondo, tal como un colorante de contraste no fluorescente o que incrementen la señal de detección. De forma similar, la etapa de incorporación puede incluir añadir una sustancia centelleante a la matriz para facilitar la detección de analitos radiactivos. También, la etapa de incorporación puede incluir añadir a la matriz cofactores necesarios para ciertos modos de detección, tales como enzimas secundarias que son necesarias para el desarrollo del color enzimático, o un colorante de transferencia de energía que puede incrementar la detección de una marca fluorescente. Además, una de las superficies de una disposición ordenada de alta densidad producida con el método aquí descrito se puede revestir con plata u otro material reflector para incrementar la cantidad de luz disponible para la
detección.
Interrogación de las disposiciones ordenadas de alta densidad
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad según la presente invención también puede incluir una etapa de interrogar las disposiciones ordenadas de alta densidad. En una realización preferida, la etapa de interrogación se selecciona entre el grupo de inspección visual con o sin magnificación, deposición química, sondeo eléctrico, percepción mecánica y percepción magnética. En otra realización, la etapa de interrogación comprende situar la disposición ordenada muy próxima a un conjunto de electrodos interdigitados medir los cambios de capacitancia resultantes de las interacciones entre las sustancias dianas de la disposición ordenada de alta densidad y los electrodos interdigitados.
Producción de disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de haces que comprenden fibras
En una realización, las disposiciones ordenadas de alta densidad se producen a partir de haces de hebras dianas que comprenden fibras o hilos. Las fibras o hilos pueden comprender materiales naturales o sintéticos seleccionados del grupo que consiste en algodón, seda, nailon y poliéster, o pueden ser otros materiales como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
En una realización preferida, los haces de hebras dianas se producen impregnando directamente fibras con una disolución acuosa de la sustancia diana. Una serie de tales fibras se impregnan con distintas sustancias dianas y la identidad de la sustancia diana que contiene cada fibra se registra en una base de datos. Las fibras se lavan para eluir las sustancias dianas sin unir y se tratan con una sustancia que no interfiere para bloquear los sitios de unión no específicos de las fibras y las sustancias dianas inmovilizadas. Después las fibras se secan para fijar el agente bloqueante a la fibra y a las sustancias dianas inmovilizadas.
Después, las fibras se unen en haces anotando la posición de cada fibra y su sustancia diana inmovilizada asociada en la base de datos. El haz de fibras se estabiliza preferiblemente embebiendo o impregnando de otra forma el haz en una matriz para proporcionar un soporte estructural al haz.
Después, se corta en sentido transversal el haz sustancialmente de manera perpendicular al eje longitudinal de las fibras empleando instrumentación adecuada para proporcionar diversas disposiciones ordenadas de alta densidad. Preferiblemente, el corte en sentido transversal da como resultado gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad idénticas. La identidad y posición de las sustancias dianas en cada disposición ordenada se siguió a través de la información de la base de datos. Estas disposiciones ordenadas se pueden utilizar para seleccionar simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas, o se pueden utilizar para otros propósitos como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
Haciendo ahora referencia a las Figuras 1 a 3, en ellas se muestran respectivamente, hebras dianas 10 que comprenden una serie de fibras revestidas 12 impregnadas con sustancias dianas conocidas; las hebras dianas 10 están embebidas en una matriz 14 y reunidas en un haz 16; y el haz 16 se corta en sentido transversal para producir un gran número de disposiciones ordenadas de alta densidad idénticos 18, donde cada disposición ordenada tiene sustancias dianas en dos ejes analíticos.
Producción de disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de haces que comprenden membranas
En una realización, se producen disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de haces que comprenden membranas. Las membranas pueden comprender láminas planas finas de una sustancia polímero, o pueden comprender otros materiales como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
En una realización preferida, los haces se producen aplicando líneas de una composición que contiene las sustancias dianas en las membranas escribiendo, dibujando, imprimiendo o abollonando. La identidad y posición de cada sustancia diana se registra en una base de datos. Después, las membranas se tratan, si es necesario, para fijar las sustancias dianas a la membrana.
Una membrana producida de esta manera se puede cortar en sentido transversal para producir una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad, teniendo cada disposición ordenada sustancias dianas dispuestas en un eje analítico. Haciendo ahora referencia a las Figuras 4 y 5, en ellas se muestran respectivamente, un haz 20 que comprende una membrana 33 que tiene líneas 24 de sustancias dianas conocidas aplicadas a la membrana 22; el haz 20 se corta en sentido transversal para producir una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad 26, donde cada disposición ordenada tiene sustancias dianas dispuestas en un eje analítico.
Alternativamente, una gran cantidad de membranas producidas de esta manera se pueden reunir en haces teniendo la identidad y posición de cada sustancia diana inmovilizada anotadas en la base de datos. La reunión puede comprender enrollar o doblar la membrana, o puede comprender apilar una gran cantidad de membranas impregnadas en sustancias dianas. Si es necesario, el haz se estabiliza tal como embebiendo o impregnando de otra manera el haz en una matriz para proporcionar soporte estructural al haz.
Después, el haz se corta en sentido transversal sustancialmente de manera perpendicular al eje longitudinal de las líneas de la sustancia diana de las membranas usando instrumentación adecuada para proporcionar una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad, en las que cada disposición ordenada tiene sustancias dianas dispuestas en dos ejes analíticos. Preferiblemente, el corte en sentido transversal da como resultado una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad idénticas. La posición e identidad de las sustancias dianas se siguen a través de la información de la base de datos. Estas disposiciones ordenadas se pueden utilizar para seleccionar simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas, o se pueden utilizar para otros propósitos como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
Haciendo ahora referencia ahora a las Figuras 6 a 8, en ellas se muestra respectivamente, una gran cantidad de membranas 28 que tienen líneas 30 de sustancias dianas aplicadas en cada membrana 28; las membranas 28 están apiladas y estabilizadas para formar el haz 32; el haz 32 se corta en sentido transversal para producir una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad 34, donde cada disposición ordenada tiene sustancias dianas 30 dispuestas en dos ejes analíticos.
Haciendo referencia ahora a las Figuras 9 a 11, en ellas se muestra respectivamente, una membrana 36 que tiene líneas de sustancias dianas conocidas 38 aplicadas a la membrana 36; la membrana 36 se enrolla y se estabiliza para formar un haz 40; el haz 40 se corta en sentido transversal para producir una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad 42, donde cada disposición ordenada tiene sustancias dianas 38 dispuestas en dos ejes analíticos.
Producción de disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de haces que comprenden tubos
En una realización, se producen disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de hebras dianas que comprenden tubos. Los tubos pueden comprender poliimida, nailon, polipropileno, poliuretano, silicona, vinilacetato de etilo, acero inoxidable, cobre, vidrio o sílice fundida o pueden ser otros materiales como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
En una realización preferida, se producen hebras dianas revistiendo el interior de los tubos con una disolución acuosa de la sustancia diana tal que la sustancia diana se absorbe, adsorbe o se une covalentemente a la superficie interior de los tubos. Alternativamente, los tubos se pueden llenar con las sustancias dianas con o sin embeber las sustancias dianas en una matriz. Se produce una serie de tales tubos revistiendo o llenando los tubos con diferentes sustancias dianas y la identidad de cada hebra diana y la sustancia diana que contiene se registra en una base de datos.
Después, los tubos se reúnen en haces anotando la posición de cada tubo y su sustancia diana asociada en la base de datos. El haz de tubos se estabiliza preferiblemente embebiendo el haz en una matriz para proporcionar soporte estructural al haz.
Después, el haz se corta en sentido transversal sustancialmente de manera perpendicular al eje longitudinal de los tubos usando instrumentación adecuada para proporcionar una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad. Preferiblemente, el corte en sentido transversal da como resultado una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad idénticas. La identidad y posición de las sustancias dianas se siguen a través de la información de la base de datos. Estas disposiciones ordenadas se pueden utilizar para seleccionar simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas, o se pueden utilizar para otros propósitos como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
Haciendo referencia ahora a las Figuras 12 a 14, en ellas se muestran respectivamente, hebras dianas 44 que comprenden una serie de tubos 46 llenos con sustancias dianas 48 conocidas; las hebras dianas 44 embebidas en una matriz 50 y reunidas en un haz 52; el haz 52 se corta en sentido transversal para producir disposiciones ordenadas de alta densidad 54, donde cada disposición ordenada tiene sustancias dianas 48 dispuestas en dos ejes analíticos.
Ejemplo I Producción y uso de disposiciones ordenadas de alta densidad que comprenden hilos revestidos con DNA
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de un haz que comprende fibras o hilos según la presente invención se emplea para producir disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias dianas DNA como sigue. Se evalúa hilo de algodón en cuanto a su capacidad para humedecerse por una disolución acuosa sumergiendo el hilo en agua. El agua formando una capa en la superficie del hilo indica que el hilo podría tener aglutinantes, aceites u otros materiales en su superficie que pueden afectar negativamente a la capacidad para humedecerse del hilo para producir hebras dianas. Si durante el ensayo para determinar la capacidad para humedecerse, tiene lugar la formación de una capa, los hilos deberían lavarse en metanol, etanol u otro disolvente adecuado miscible con el agua para eliminar los materiales no deseados. Después los hilos se colocan en agua y se cambia el agua varias veces hasta que cada hilo está completamente mojado.
Después, los hilos se transfieren a una disolución acuosa de una sustancia catiónica polímera tal como poli(L-lisina) y se les deja alcanzar el equilibrio con la disolución de poli(L-lisina) durante unas pocas horas. Los hilos se retiran de la disolución de poli(L-lisina) y se secan para fijar la poli(L-lisina) a la superficie de los hilos. Después de la fijación, los hilos se lavan en una disolución tamponada y el tampón se cambia varias veces. Los hilos se retiran del tampón y se dejan secar.
Los hilos se cortan después con una longitud que varía desde un centímetro hasta unos pocos metros, según sea apropiado para las dimensiones del haz que se va a construir. Cada hilo destinado al haz se corta preferiblemente con la misma longitud.
A continuación, cada hilo cortado se pone en contacto con una disolución de DNA que tiene una secuencia específica conocida que será la sustancia diana inmovilizada. Preferiblemente, la secuencia de DNA es diferente para cada hilo. El DNA empleado preferiblemente debe ser monocatenario si es para usar en estudios de hibridación de ácidos nucleicos, pero también se puede dejar en forma bicatenaria. El DNA puede ser de fuentes naturales tales como preparaciones de plásmidos, cromosomas artificiales en levadura, librerías BAC, librerías YAC u otras librerías de DNA tales como marcadores de secuencias expresadas, o pueden producirse sintéticamente mediante la reacción en hebra de la polimerasa u otros procesos sintéticos. El hilo y la disolución de DNA se incuban durante un periodo que está en el intervalo de unos pocos minutos a unas pocas horas, según se necesite para saturar completamente con DNA los sitios de unión disponibles en el hilo.
Después, los hilos revestidos con DNA se secan en un horno a aproximadamente 60ºC durante un periodo suficiente para fijar el DNA a los hilos. Alternativamente, el DNA se puede fijar a los hilos humedeciendo el hilo revestido con DNA seco con etanol o metanol 100% durante unos pocos minutos y dejando secar los hilos. La identidad de cada hilo y su sustancia diana secuencia de DNA inmovilizado se registra en una base de datos. A continuación, los hilos se lavan individualmente en un tampón tal como 1xTE (10 mM tris, 1 mM EDTA, Ph 7,6) para eliminar del hilo el DNA sin unir. Los hilos revestidos con DNA se secan de nuevo.
Un haz de hilos revestidos con DNA se reúnen después situando los hilos paralelos y adyacentes unos a otros registrando en la base de datos la posición de cada hilo en el haz y el DNA asociado a él. El haz de hilos se estabiliza embebiéndolo en una matriz tal como polimetacrilato, resinas epoxídicas, polietilenglicol, ceras de parafina, gomas, poliacrilamida y otros materiales similares que, preferiblemente, a temperatura elevada o en forma sin polimerizar, pueden manejarse en forma líquida que es adecuada para embeber los hilos. Los hilos embebidos se dejan endurecer o reticular para comunicar una estructura rígida al haz.
En una realización preferida, se evita que los hilos se impregnen completamente con la matriz en la que se embeben y se separe el DNA inmovilizado, revistiendo los hilos con una sustancia tal como gelatina, sacarosa o poli(alcohol vinílico), a la que la matriz es impermeable. Esto se realiza humedeciendo los hilos que llevan el DNA inmovilizado en una disolución que contiene de alrededor de 0,01% a alrededor de 10% en peso de la sustancia y dejando secar los hilos antes de embeberlos en la matriz.
El haz estabilizado se corta después perpendicularmente al eje longitudinal de los hilos empleando un microtomo o dispositivo similar para crear un gran número de disposiciones ordenadas de alta densidad preferiblemente con un espesor entre alrededor de 0,1 y 100 micrómetros. Cada disposición ordenada de alta densidad resultante tiene el mismo patrón de secuencias de DNA en regiones espaciales específicas o zonas de la disposición ordenada con las sustancias dianas dispuestas en dos ejes analíticos.
Un uso de estas disposiciones ordenadas de DNA es detectar secuencias marcadas de DNA de una muestra que son complementarias a sustancias dianas DNA monocatenario de la disposición ordenada incubando la muestra y la disposición ordenada en condiciones de hibridación durante un periodo de tiempo suficiente para que tenga lugar la hibridación. El DNA sin hibridar se elimina lavando. Las marcas se detectan después y se determinan las zonas que proporcionan señal. Estas zonas se comparan con la base de datos que contiene la identidad de las sustancias dianas DNA de la disposición ordenada para establecer la identidad del DNA marcado de la muestra.
Ejemplo II Producción y uso de disposiciones ordenadas de alta densidad que comprenden hilos revestidos con péptidos
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad a partir de un haz que comprende fibras o hilos según la presente invención se emplea para producir disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias dianas péptidos como sigue. Se evalúa hilo de algodón en cuanto a su capacidad para humedecerse por una disolución acuosa sumergiendo el hilo en agua. El agua formando una capa en la superficie del hilo indica que el hilo podría tener aglutinantes, aceites u otros materiales en su superficie que pueden afectar negativamente a la capacidad para humedecerse del hilo para producir hebras dianas. Si durante el ensayo para determinar la capacidad para humedecerse, tiene lugar la formación de una capa, los hilos deberían lavarse en metanol, etanol u otro disolvente adecuado miscible con el agua para eliminar los materiales no deseados. Después los hilos se colocan en agua y se cambia el agua varias veces hasta que cada hilo está completamente mojado.
Después, los hilos se transfieren a una disolución acuosa de una sustancia catiónica polímera tal como poli(L-lisina) y se les deja alcanzar el equilibrio con la disolución de poli(L-lisina) durante unas pocas horas. Los hilos se retiran de la disolución de poli(L-lisina) y se secan para fijar la poli(L-lisina) a la superficie de los hilos. Después de la fijación, los hilos se lavan en una disolución tamponada y el tampón se cambia varias veces. Los hilos se retiran del tampón y se dejan secar.
Los hilos se cortan después con una longitud que varía desde un centímetro hasta unos pocos metros, según sea apropiado para las dimensiones del haz que se va a construir. Cada hilo destinado al haz se corta preferiblemente con la misma longitud. El hilo de algodón se evalúa en cuanto a su capacidad para humedecerse con una disolución acuosa, se transfiere a una disolución acuosa de una sustancia catiónica polimérica tal como poli(L-lisina), y se deja que alcance el equilibrio con la disolución de poli(L-lisina) durante unas pocas horas. Los hilos se retiran de la disolución de poli(L-lisina) y se secan par fijar la poli(L-lisina) a la superficie de los hilos. Después de la fijación, los hilos se lavan en disolución tamponada y el tampón se cambia varias veces. Los hilos se retiran del tampón y se dejan secar.
A continuación, cada hilo cortado se pone en contacto con una disolución en dimetilsulfóxido (DMSO) de péptidos con una secuencia específica conocida que será la sustancia diana inmovilizada. Preferiblemente, la secuencia de péptidos es diferente para cada hilo. Los péptidos individuales para usar como sustancias dianas se obtienen comercialmente o se preparan con la síntesis de Merifield, (tal como se trata en Bodanszky, M y Troust, B. Eds. Principles of Peptide Synthesis, 2ª edición, Springer-Verlag, New York, 1993, incorporado íntegramente por referencia), como entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento. Cada hilo y la disolución de péptido se incuban durante un periodo que está en el intervalo de unos pocos minutos a unas pocas horas, según se necesite para saturar completamente con el péptido los sitios de unión disponibles en el hilo.
Los hilos revestidos con péptido se escurren para eliminar el exceso de disolución de DMSO y después se incuban con pentanos mezclados o una sustancia equivalente para precipitar los péptidos en la superficie de los hilos. Los hilos revestidos con péptidos se secan a temperatura ambiente o entre alrededor de 60ºC y 70ºC, con o sin vacío. La identidad de cada hilo y de su sustancia diana secuencia de péptidos inmovilizada se registra en una base de datos. Los hilos revestidos con péptidos se lavan después en un tampón acuoso tal como 0,01 a 1,0 M tris pH 7,0 o disolución salina de pH 7,0 tamponada con fosfato, tal como cloruro sódico 120 mM, cloruro potásico 2,7 mM y fosfato 10 mM (disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) para eliminar de los hilos los péptidos sin unir y se seca de nuevo a temperatura ambiente o entre alrededor de 60ºC y 70ºC, con o sin vacío.
Un haz de hilos revestidos de péptidos se reúne después situando los hilos paralelos y adyacentes unos a otros registrando la posición de cada hilo en el haz y su péptido asociado. El haz de hilos se estabiliza embebiéndolo en una matriz tal como polimetacrilato, resinas epoxídicas, polietilenglicol, ceras de parafina, gomas, poliacrilamida y otros materiales similares que, preferiblemente, a temperatura elevada o en forma sin polimerizar, pueden manejarse en forma líquida que es adecuada para embeber los hilos. Los hilos embebidos se dejan endurecer o reticular para comunicar una estructura rígida al haz.
En una realización preferida, se evita que los hilos se impregnen completamente con la matriz en la que se embeben y se separe el péptido inmovilizado, revistiendo los hilos con una sustancia tal como gelatina, sacarosa o poli(alcohol vinílico), a la que la matriz es impermeable. Esto se realiza humedeciendo los hilos que llevan el péptido inmovilizado en una disolución que contiene de alrededor de 0,01% a alrededor de 10% en peso de la sustancia y dejando secar los hilos antes de embeberlos en la matriz.
El haz estabilizado se corta después perpendicularmente al eje longitudinal de los hilos empleando un microtomo o dispositivo similar para crear un gran número de disposiciones ordenadas de alta densidad preferiblemente con un espesor entre alrededor de 0,1 y 100 micrómetros. Cada disposición ordenada de alta densidad resultante tiene el mismo patrón de secuencias de péptidos en regiones espaciales específicas o zonas de la disposición ordenada.
Un uso de estas disposiciones ordenadas de péptidos es detectar la presencia del analito anticuerpo en una muestra, en la que el anticuerpo se puede unir a al menos una sustancia diana péptido en la disposición ordenada. La presencia de los analitos anticuerpos se determina incubando la muestra y la disposición ordenada en condiciones adecuadas durante un periodo de tiempo suficiente para que tenga lugar la unión del analito anticuerpo. La muestra sin unir se elimina lavando. El anticuerpo unido se detecta después empleando anticuerpos secundarios biotinilados y detección con estreptavidina marcada tal como fosfatasa alcalina, fluoresceína o estreptavidina marcada con oro, según las técnicas conocidas por los que tienen experiencia en la técnica, la identidad de las sustancias dianas de las zonas que muestran unión se establece por referencia a la base de datos. La unión indica la presencia de anticuerpos que tienen un dominio epitópico para el péptido en la zona. Esta unión puede ser la evidencia de la exposición a un organismo o de la infección por el mismo, si la muestra proviene del suero de un paciente.
Ejemplo III Producción y uso de disposiciones ordenadas de alta densidad que comprenden DNA impregnado en una membrana
El método para producir disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias dianas según la presente invención se usó para crear disposiciones ordenadas a partir de DNA impregnado en una membrana como sigue. Se empleó The Saccharomyces Genome Database de Stanford University, Palo Alto, California, USA como fuente para identificar secuencias genómicas existentes de forma natural. Empleando esta información, se seleccionaron al azar 16 oligonucleótidos con temperaturas de fusión similares entre el genoma de levadura como sustancias dianas. Cada secuencia tenía entre 28 y 35 nucleótidos y se sintetizó mediante la química estándar de la cianoetilfosforamidita según el método descrito en Gait, M.J., Ed., Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984. Cada secuencia de sustancias dianas tenía 100 residuos de timidina en el extremo 3' para facilitar la unión del oligonucleótido a la membrana. Véase, por ejemplo, Erlich, Henry A. y Bugawan, Teodorica L., HLA Class II Gene Polymorphism: DNA Typing, Evolution, and Relationship to Disease Susceptibility in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, Nueva York, págs. 193-208, 1989, incorporado íntegramente a este documento por referencia. Las 16 sustancias dianas, etiquetadas con el nº 1 al nº 16, se disolvieron individualmente en agua tratada con pirocarbonato de dietilo hasta una concentración final de 10 \mug/\mul.
Las sustancias dianas se aplicaron usando una punta de aplicación que tiene un depósito con una capacidad de 11 \mul conectado con el extremo mediante un pequeño canal capilar. La punta se usó para dibujar líneas de sustancias dianas con una separación de aproximadamente 1 mm a 3 mm en membranas de 20 cm x 20 cm, membranas de nailon cargadas + Hybond^{TM} N (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). El depósito de la punta se rellenó con 10,5 \mul de una disolución de la primera de las 16 sustancias dianas usando un pipeteador Eppendorf® 2-10 \mul.
La primera membrana, membrana nº 1, se situó en el tablero de una mesa, plano y limpio con una lámina de papel encerado mayor que la membrana, que se usó como separador situado entre la membrana y el tablero de la mesa en la preparación del empaquetado. La punta se alineó de forma que ambos lados del canal capilar tocaran el papel encerado a alrededor de 1 cm desde el borde de la membrana y suavemente la punta se arrastró manualmente a través del papel encerado y la membrana usando una regla como guía para dibujar una línea recta de la sustancia diana paralela a un borde de la membrana. La disolución de sustancia diana salió de la punta y se agotó después de dibujar una línea de aproximadamente 12-16 cm de largo. Este ciclo se repitió para cada disolución de sustancias dianas en la primera membrana hasta que la membrana nº 1 comprendió 16 líneas paralelas de distintas sustancias dianas de DNA separadas aproximadamente por 1 mm a 3 mm.
Este procedimiento se repitió para producir dos membranas adicionales, membranas nº 2 y nº 3, excepto que cada disolución de sustancia diana DNA se aplicó tres veces consecutivas resultando un total de 48 líneas paralelas de sustancias dianas en las membranas nº 2 y nº 3. Cada línea de sustancias dianas se marcó con el propósito de identificarla en todas las membranas.
Las membranas que comprendían las líneas de sustancias dianas DNA se dejaron secar al aire durante unas 2 horas y después se reticularon mediante la aplicación de 1.200 \mujulios de radiación electromagnética UV durante 35 segundos usando un Stratagene 2400 Stratalinker® (Stratagene, La Jolla, CA, USA). En cada una de las tres membranas, se cortó una tira de aproximadamente 2 cm de ancho por 20 cm de largo, empezando por el borde de la membrana que contenía la primera de las líneas de la sustancia diana, de manera que las líneas de las sustancias dianas fueran paralelas al borde de 2 cm de las tiras.
Se prepararon sondas de DNA marcadas radiactivamente que eran complementarias a la secuencia de sustancias dianas nº 1 y nº 7 empleando técnicas estándar. Se ensayó la hibridación entre las sondas marcadas radiactivamente y una disposición ordenada producida a partir de la membrana nº 1 usando técnicas estándar. En resumen, los oligonucleótidos de DNA se marcaron empleando el equipo Ready to Go Kinase^{TM} (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) empleando gamma-^{32}P-ATP (ICN Radiochemicals, Irvine, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. Las sondas marcadas se purificaron empleando columnas Nick^{TM} (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante, y se diluyeron hasta aproximadamente 1x10^{6} cpm/ml.
Se realizaron la prehibridación e hibridación empleando 10 ml de tampón HyperHyb^{TM} (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL, USA) según las instrucciones del fabricante en un horno de hibridación Mini-6^{TM} (Hybaid, Ltd., Middlesex, UK) a 42ºC durante una hora cada una. Los lavados posteriores a la hibridación se realizaron empleando tres lavados de 10 ml durante 15 minutos cada uno en 1xSSC, dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,01% a 42ºC. El lavado final se realizó con 100 ml de 1xSSC (NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2) (Research Genetics), tampón SDS al 0,01% (Sigma) a 42ºC durante 15 minutos. El aclarado final se realizó con 10 ml de tampón 1xSSC. Después las membranas se secaron al aire durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
Se realizó una autorradiografía situando las disposiciones ordenadas en contacto con una película para rayos-X Biomax^{TM} MS ó MR (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) a temperatura ambiente durante entre aproximadamente ½ hora a 4 horas hasta que se obtuvo la intensidad de imagen deseada. Todas las sondas se hibridaron con la sustancia diana adecuada de la disposición ordenada demostrando que las sustancias dianas DNA estaban unidas a la membrana y disponibles para el sondeo y que tal sondeo daba resultados de hibridación específicos y no ambiguos.
A continuación, la porción que quedaba de 20 cm por 18 cm de las membranas nº 1, 2 y 3 se empleó para producir disposiciones ordenadas como sigue. Las membranas se sumergieron en gelatina teleóstea al 3% (Sigma) en agua desionizada y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente para bloquear las membranas. Las membranas se lavaron después tres veces en 600 ml de agua desionizada para eliminar la gelatina sin unir. Se secó el exceso de humedad de las membranas entre dos láminas de papel secante 903 (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente durante la noche.
A continuación, se cortó una tira de 2 cm por 20 cm de cada una de las tres membranas nº 1, nº 2, nº 3, perpendicularmente a las líneas de las sustancias dianas con un borde de 2 cm paralelo a las líneas de las sustancias dianas. Cada una de las tiras se enrolló de forma apretada alrededor de un eje paralelo a las líneas de sustancias dianas para producir un cilindro, siendo la porción de membrana que no tenía sustancias dianas aplicadas la parte interior del cilindro. Se empleó esmalte de uñas transparente para sellar el borde libre de 3 mm de las tiras para evitar que el cilindro se desenrollara. Se sumergió cada cilindro en una ampolla de plástico de 1,25 por 7,5 cm rellena con medio para embeber suave LR White (Sigma) sin polimerizar que se preparó según las instrucciones del fabricante hasta que el cilindro se impregnó totalmente con el medio. Después, cada cilindro se colocó en la base de la ampolla rellena con el medio, se centró y se dejó que polimerizara durante la noche a 60ºC. Cada ampolla que contenía un cilindro embebido se retiró y se situó a temperatura ambiente y se observó que la polimerización fuera completa.
Se produjo después una gran cantidad de disposiciones ordenadas de aproximadamente 10 micrómetros de espesor cortando en sentido transversal repetidamente cada cilindro embebido perpendicularmente a su eje longitudinal, esto es, perpendicularmente al eje longitudinal de cada línea de sustancia diana. El corte en sentido transversal se realizó empleando un microtomo manual, modelo DK-10 (Edmund Scientific, Barrington, NJ, USA).
Empleando técnicas estándar, se prepararon sondas de DNA marcadas radiactivamente que eran complementarias a la secuencia de sustancias dianas nº 1 y nº 7. Se probó la hibridación entre las sondas marcadas radiactivamente y una disposición ordenada producida a partir de la membrana nº 1 empleando técnicas estándar. En resumen, los oligonucleótidos de DNA se marcaron empleando el equipo Ready to Go Kinase^{TM} (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) empleando gamma-^{32}P-ATP (ICN Radiochemicals, Irvine, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. Las sondas marcadas se purificaron empleando columnas Nick^{TM} (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante, y se diluyeron hasta 1x10^{6} cpm/ml.
Se realizaron la prehibridación e hibridación empleando 10 ml de tampón HyperHyb^{TM} (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL, USA) según las instrucciones del fabricante en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con cierre de rosca) a 42ºC durante una hora en un horno de hibridación Mini-6 (Hybaid, Ltd., Middlesex, UK) a 42ºC. Los lavados posteriores a la hibridación se realizaron empleando tres lavados de 1,5 ml durante 15 minutos cada uno en 1xSSC, dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,01% a 42ºC. El lavado final se realizó con 100 ml de 1xSSC (NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2) (Research Genetics), tampón SDS al 0,01% (Sigma) a 42ºC durante 15 minutos. El aclarado final se realizó con 10 ml de tampón 1xSSC. Después las disposiciones ordenadas se secaron al aire durante aproximadamente 15-30 minutos. Se realizó una autorradiografía situando las disposiciones ordenadas en contacto con una película para rayos-X Biomax^{TM} MS ó MR (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) a temperatura ambiente durante entre aproximadamente ½ hora a 4 horas hasta que se obtuvo la intensidad de imagen deseada. Después se hicieron fotografías de las autorradiografías reveladas.
Se probó la hibridación entre las sondas marcadas radiactivamente y una disposición ordenada producida a partir de la membrana nº 1 empleando técnicas estándar. Todas las sondas se hibridaron con la sustancia diana adecuada de la disposición ordenada demostrando que las sustancias dianas DNA estaban unidas a la membrana y disponibles para el sondeo y que tal sondeo daba resultados de hibridación específicos y no ambiguos.
Las disposiciones ordenadas se sometieron a ensayo en cuanto a su funcionalidad como sigue. Una sonda de DNA marcada radiactivamente complementaria a la sustancia nº 1 se usó para sondar una disposición ordenada producida a partir de la membrana nº 2. Haciendo ahora referencia a la Figura 15, en ella se puede ver una fotografía de la autorradiografía del resultado. Como se puede ver, tuvo lugar la hibridación entre la sonda y tres zonas de la disposición ordenada que contenían sustancia diana nº 1, con una mínima hibridación cruzada en las otras 45 zonas que representan las 15 restantes sustancias dianas DNA. Por tanto, la disposición ordenada demostró tanto funcionalidad para los estudios de hibridación así como especifidad.
A continuación, una disposición ordenada producida a partir de la membrana nº 3 se sondó con DNA marcado radiactivamente que era complementario a las sustancias dianas nº 1 y nº 7. Haciendo ahora referencia a la Figura 16, se puede ver una autorradiografía del resultado. Como puede verse, tuvo lugar la hibridación entre las sondas y seis zonas de la disposición ordenada, con hibridación cruzada mínima para las otras 42 zonas que representan las restantes 14 sustancias dianas DNA.
Aunque la presente invención se ha discutido con considerable detalle haciendo referencia a ciertas realizaciones preferidas, son posibles otras realizaciones. Por lo tanto, el alcance de las reivindicaciones adjuntas no debería limitarse a la descripción de las realizaciones preferidas contenidas en este documento.

Claims (4)

1. Un método para producir una disposición ordenada de alta densidad que comprende las etapas de enrollar una membrana impregnada con líneas de sustancias diana para producir un haz y cortar en sentido transversal el haz para producir una pluralidad de disposiciones ordenadas de alta densidad, caracterizado porque:
el haz de hebras diana se ha estabilizado embebiendo el haz en un material; y
en el que la localización de cada sustancia diana en el haz está registrada en una base de datos.
2. Un método para determinar secuencias génicas, detectar la presencia de mutaciones génicas, detectar la expresión diferencial cualitativa o cuantitativa de productos génicos, cartografiar secuencias epitópicas que provocan respuestas inmunes, o identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos, caracterizándose el método por la etapa de proporcionar una disposición ordenada de alta densidad según la reivindicación 1.
3. Un método para producir una disposición ordenada de alta densidad que comprende la etapa de apilar una pluralidad de membranas impregnadas con líneas de sustancias diana para producir un haz y cortar transversalmente el haz para producir una pluralidad de disposiciones ordenadas de alta densidad, caracterizado porque:
el haz de hebras diana se ha estabilizado embebiendo el haz en un material; y
en el que la localización de cada sustancia diana en el haz está registrada en una base de datos.
4. Un método para determinar secuencias génicas, detectar la presencia de mutaciones génicas, detectar la expresión diferencial cualitativa o cuantitativa de productos génicos, cartografiar secuencias epitópicas que provocan respuestas inmunes, o identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos, caracterizándose el método por la etapa de proporcionar una disposición ordenada de alta densidad según la reivindicación 3.
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