DE69805100T2

DE69805100T2 - Antimikrobiell wirksame phospholipide mit antimikrobiellen stoffen

Info

Publication number: DE69805100T2
Application number: DE69805100T
Authority: DE
Inventors: David; Kingston; Paul; S. Cohen; A. Krogfelt; C. Laux; Maryjane Utley
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2002-12-05
Anticipated expiration: 2018-11-21
Also published as: AU1333799A; ATE216585T1; CA2316340A1; WO1999026632A1; EP1051180B1; US6165997A; DE69805100D1; WO1999026632A8; WO1999026632B1; DK1051180T3; AU747288B2; JP2001523723A; ES2177089T3; EP1051180A1; NZ505233A

Description

Hintergrund der Erfindung

Während der letzten Dekaden wurde von einem dramatischen Anstieg von Bakterienstämmen berichtet, die gegenüber Antibiotika multiresistent sind. Dieser Anstieg führte zu dem Auftreten von unheilbaren bakteriellen Infektionen mit tödlichen Ausgang und einem besonders ernsten Problem in Verbindung mit im Krankenhaus erworbenen Infektionen. Das Auftauchen von Antibiotikaresistenz ist ein Ergebnis der mäßigen Verwendung von Antibiotika in der Human- und Tiermedizin. Außerdem kompliziert das Auftreten von Allergien gegen die derzeit wirksamsten antimikrobiellen Mittel weiterhin die Behandlung bakterieller Infektionen.
Im allgemeinen wird angenommen, dass, wenn die Bakterienmembran nur durchlässig gemacht werden könnte, die Wirkung von Antibiotika gesteigert werden könnte. Es wurden große Anstrengungen unternommen, die äußere Membran von Gramnegativen für Antibiotika durchlässig zu machen, in der Hoffnung, dass einige die Durchlässigkeit-fördernden Mittel sich als klinisch nutzbar herausstellen. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Polykationen die äußere Membran durchlässig machen, vermutlich durch Bindung an Lipopolysaccharide (LPS). Unter den polykarionischen die Durchlässigkeit-fördernden Mittel befinden sich Polymixin B und seine Derivate (Vaara, M, und Vaara, T., 1983), einschließlich Deacylpolymixin B und Polymixin B-Nonapeptid (Viljanen, P.H. et al., 1991). Andere polykationische die Durchlässigkeit-fördernden Mittel umfassen das bakterienabtötende/Durchlässigkeits erhöhende Protein, Protamin und verschiedene polykadonische Peptide, einschließlich Lysinpolymere, Defensine, Cecropine, Magainine und Mellitin. Chelatoren, wie Ethylendiamintetraessigsäure (IEDTA), Nitrilotriessigsäure und Natriumhexametaphosphat erwiesen sich als wirksame die Durchlässigkeit der äußeren Membran fördernde Mittel. Chelatoren machen die Membran vermutlich durchlässig durch die Entfernung von Calcium- und Magnesiumionen aus LPS, was zu einer Freisetzung der größten Menge des LPS aus der äußeren Membran führt und folglich zu Destabilisierung der äußeren Membran.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Stoffe, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden, sind Phospholipide, die nicht nur deutlich die Wirkung eines antimikrobiellen Mittels steigern, sondern auch selbst eine antimikrobielle Aktivität besitzen. Die Stoffe werden zur Zeit nicht als Stoffe angesehen, die Resistenzprobleme verursachen. Außerdem sind die Stoffe nicht- toxisch, da Phospholipide natürlicherweise im Wirt vorkommen, d. h. in Schleimhautoberflächen und im Blutkreislauf. Somit werden die Stoffe derzeit als Stoffe angesehen, die keine Probleme im Hinblick auf Allergien verursachen. Phospholipide werden als Träger verschiedener medizinisch aktiver Stoffe verwendet und dienen entweder als Vesikel zur langsamen Freisetzung von z. B. einem Antibiotikum, oder als Mittel zur Beschichtung zum Schutz eines Wirkstoffes vor z. B. dem Abbau durch Säure im Magen. Dies ist das erste Mal, dass Phospholipide der Formel (I) als Verstärker der antimikrobiellen Aktivität verwendet wurden.

Detaillierte Offenbarung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine überraschende verstärkende Wirkung der antimikrobiellen Aktivität eines traditionellen antimikrobiellen Mittels. Die Erfindung offenbart eine Kombination aus a) einem Stoff mit der allgemeinen Formel (I):
bei dem
Z einen Phosphor- oder Schwefeloxysäurerest darstellt, wie:
einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; eine Hydroxylgruppe darstellt und der andere der Reste R&sub1; und R&sub2; für einen gesättigten oder ungesättigten Fettsäurerest mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen steht, und
R&sub3; ein Wasserstoffatom darstellt, und
b) einem antimikrobiellen Mittel zur Verwendung als Medikament.
Beispiele von geeigneten natürlich vorkommenden gesättigten Fettsäureresten sind Reste, die aus Octan-, Decan-, Dodecan-, Tetradecan-, Hexadecan-, Oktadecan-, Eicosan-, Docosan-, Tetracosan-, und Hexacosansäure abgeleitet wurden, und Beispiele von geeigneten natürlich vorkommenden ungesättigten Fettsäuren sind Reste, die aus Hexadec-9-en-, Octadec-9-en-, Octadec-11-en-, Oktadeca-9,12-dien-, Octadeca-9,11,13-trien-, Octadeca-9,12,15-trien-, Octadeca-6,9,12,15-tetraen-, und Eicosa-5,8,11,14-tetraensäure einschließlich der cis- und trans-Isomere hinsichtlich der Ethylen-Doppelbindungen davon. Es wird auch angenommen, dass Stoffe der Formel (I), die Fettsäurereste mit einer ungeraden Anzahl an Kohlenstoffatomen oder Fettsäurereste mit Seitenketten, z. B. Reste, die aus 3,7,11,15- Tetramethylhexadecansäure abgeleitet wurden, enthalten, ebenfalls antimikrobielle Aktivität besitzen.
Bevorzugte Fettsäurereste sind gesättigte Fettsäurereste mit mehr als 7 Kohlenstoffatomen, wie zwischen 10 und 20, bevorzugter 12, 13, 14, 15 oder 18 Kohlenstoffatomen.
Unter antimikrobiellem Mittel wird jegliches Mittel oder Kombination von Mitteln verständen, das im Kampf gegen Infektionskrankheiten verwendet wird. Dies umfaßt, ist aber nicht beschränkt, auf Anti-Pilz-Mittel, antivirale, Anti-Protozoen-Mittel und antimikrobielle Arzneistoffe.
Unter dem Ausdruck "ein Stoff der vorliegenden Erfindung mit einem antimikrobiellen Mittel" wird verstanden, dass mindestens ein Stoff der allgemeinen Formel (I) mit mindestens einem antimikrobiellen Mittel kombiniert wird. Es kann mehr als ein Stoff der Erfindung, wie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder sogar noch mehr verschiedene Stoffe der Erfindung und mehr als ein antimikrobielles Mittel, wie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder sogar noch mehr antimikrobielle Mittel anwesend sein. Jegliche Art der Kombination, die oben beschrieben wurde, fällt in den Schutzbereich der Erfindung.
Unter Kampf gegen Infektionskrankheiten werden die Behandlung, die Vorbeugung, zellabtötende, antibakterielle, bakteriostatische und/oder bakterienabtötende Wirkungen verstanden.
Unter antimikrobieller Wirkung eines Stoffes wird verstanden, dass die Zugabe des Stoffes zu einen Anzuchtmedium das Wachstum des Impfmaterials in der Weise hemmt, dass die koloniebildenden Einheit (cfu) mit dem Stoff weniger als 30%, wie 20%, 15%, 10% oder 5 % der cfu ohne Zugabe des Stoffes beträgt. Bevorzugterweise tötet die Zugabe des Stoffes das Impfmaterial ab, so dass die cfu weniger als 70%, wie 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,1% oder 0,01% des Impfmaterials beträgt.
Unter einer verstärkenden Wirkung eines antimikrobiellen Mittels wird verstanden, dass die minimal hemmende Konzentration (MIC-Wert) des antimikrobiellen Mittels ohne den Stoff der vorliegenden Erfindung mindestens 10-fach durch die Zugabe eines Stoffes der vorliegenden Erfindung vermindert wird. Vorzugsweise ist die Verminderung mindestens 50- fach, wie 100-fach, 500-fach oder sogar 1000-fach. Dies bezieht sich auch auf eine synergistische Wirkung zwischen dem antimikrobiellen Mittel und dem Stoff.
Grampositive und gramnegative Bakterien werden durch die Gramfärbung unterschieden. Ein grampositives Bakterium behält die erste Färbung (Kristallviolett) bei, wenn es mit einem Entfärbemittel (Alkohol oder Aceton) behandelt wird, wogegen ein gramnegatives Bakterium die erste Färbung verliert. Der Unterschied in der Färbung spiegelt die strukturellen Unterschiede der Zellwände von grampositiven und gramnegativen Bakterien wider. Die grampositive Zellwand besteht aus einer relativ dicken Lage aus Peptidoglycan und Teichonsäuren, wogegen die gramnegative Zellwand aus einer relativ dünnen Peptidoglycanlage und einer äußeren Membran besteht, die aus einer Lipiddoppelschicht besteht, die Phospholipide, Lipopolysaccharide, Lipoproteine und Proteine enthält.
In einem Aspekt der Erfindung steigert der Stoff die Wirkung von antimikrobiellen Mitteln.
Einige Stoffe von Bedeutung in Beziehung auf die vorliegende Erfindung, wie MPPA (Monopalmitoylphosphatidsäure) und DPPS (Dipalmitoylphosphatidylserin) kommen in der Natur vor. Phospholipide bestehen aus einen Glyceringerüst mit einer Phosphatgruppe, die die Hydroxylgruppe am C3-Atom ersetzt (Phosphoglyceride) und mit Fettsäuren, die die Hydroxylgruppen an den C1- oder C2- oder an den C1- und C2-Kohlenstoffatomen ersetzen. Jede Anzahl von Kopfgruppen oder Hydroxlgruppen-enthaltende Verbindungen (z. B. Serin, Cholin, Inosit, Ethanolamin) kann mit dem Phosphorsäurerest verestert werden. Phospholipide können durch Bakterien (zur Nutzung) als Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquelle abgebaut werden (Krivan, H.C. et al., 1992). Phospholipide kommen in der Natur in prokaryontischen und eukaryontischen Zellmembranen vor. Gegenwärtig wird von der Erfindern des vorliegenden Anmelung angenommen, dass die Herstellung von Lysophospholipiden (Phospholipide, die nur eine Fettsäure enthalten) ein Mittel der Natur zur Schwächung oder Abtötung einwandernder Bakterien darstellen könnte. Zum Beispiel ist bekannt, dass der Kontakt von Henle-407-Epithelzellen mit Salmonela typhimurium die Aktivierung der Phospholipase A2 in den Henle-407-Zellen (Pace et al., 1993) bewirkt. Phospholipase A2 könnte Lysophospholipide aus den Henle-407-Zellmembranen, die durch Infektion mit S. typhimurium beschädigt wurden, erzeugen. Die Lysophospholipide könnten dann Calcium und Magnesium aus den gramnegativen Bakterienzellen chelatieren und sie dadurch schwächen oder direkt grampositive Zellen abtöten, wie in den Beispielen, die im Folgenden vorgestellt werden, beobachtet wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine gesteigerte Wirkung eines traditionellen antimikrobiellen Mittels durch einen Stoff, der wie oben beschrieben eine niedrige oder gar keine Toxizität besitzt. Außerdem sind die Stoffe der Erfindung wahrscheinlich nicht immunogen, da noch nie irgendwelche allergenen Reaktionen auf Lipide beschrieben wurden. Die Verwendung von Stoffen der Erfindung wird das Auftreten von antibiotikaresistenten Bakterienstämmen vermeiden oder vermindern. Somit gibt es zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung. Aufgrund der Ergebnisse, die in den Beispielen beschrieben werden, wird vorgeschlagen, einen Stoff mit der allgemeinen Formel (I) als ein Medikament in Kombination mit einem antimikrobiellen Mittel zu verwenden. Die Kombination der vorliegenden Erfindung wird in eine pharmazeutische Zubereitung mit eingeschlossen und in der Medizin verwendet.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft die synergistische antimikrobielle Wirkung eines Stoffes wie oben beschrieben, wenn er mit einem antimikrobiellen Mittel zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten, insbesondere von Infektionen, die durch Mikroorganismen verursacht werden, wie Pilz-, Hefe-, Viren-, Protozoen- und Bakterieninfektionen, kombiniert wird.
Die Kombination der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres mit einer Infektion, die durch Spirochäten verursacht wurde, verwendet werden. Bei den Spirochäten kann es sich um Borrelia, Leptospira oder Treponema handeln.
Die Kombination der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres mit einer Infektion, die durch Protozoen verursacht wurde, verwendet werden. Bei den Protozoen kann es sich um Entamoeba histolytica, Pneumocystis carinii, Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Leishmania, Trypanosoma, Isospora gondii oder Plasmodium handeln.
In den vorliegenden Beispielen wurde Pseudomonas aeruginosa als Modellorganismus verwendet, um die Wirkung von Phospholipiden aufzuzeigen.
Pseudomonas aeruginosa ist an sich gegenüber vielen Antibiotika resistent. Ein Teil dieser Resistenz kann auf die relativ niedrige Durchlässigkeit der äußeren Membran von P. aeruginosa für eine Vielzahl von Antibiotika zurückgeführt werden. Ein anderer Teil der Resistenz scheint durch zwei vor Kurzem entdeckte Multiarzneistoff-Ausscheidungssysteme verursacht zu werden. Zusätzlich führen in einigen Fällen Enzyme, die spezifisch Antibiotika inaktivieren, zur Antibiotikaresistenz, z. B. die induzierbare β-Lactamase aus P. aeruginosa. Somit kann die Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres mit einer Infektion, die durch gramnegative Bakterien verursacht wurde, verwendet werden. Bei den gramnegativen Bakterien kann es sich handeln um: Kokken, wie Neisseria (z. B. N. meningitis, N. gonorrhoeae) und Acinetobacter oder Stäbchen, wie Bacterioides (z. B. B. fragilis), Bordetella (z. B. B. pertussis, B. parapertussis), Brucella (z. B. B. melitentis, B. abortus Bang, B. suis), Campylobacter (z. B. C. jejuni, C. coli, C. fetus), Citrobacter, Enterobacter, Escherichia (z. B. E. coli), Haemophilus (z. B. H. influenzae, H. parainfluenzae), Klebstella (z. B. K. pneumoniae), Legionella (z. B. L. pneumophila), Pasteurella (z. B. P. yersinia, P. multocida), Proteus (z. B. P. mirabilis, P. vulgaris), Pseudomonas (z. B. P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei), Salmonella (z. B. S. enteritidis, S. infantitis, S. Dublin, S. typhi, S. paratyphi, S. schottmülleri, S. choleraesius, S. typhimurium, oder irgendeiner ihrer 2.500 anderen Serotypen), Serratia (z. B. S. marscences, S. liquifaciens), Shigella (z. B. S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae, S. boydii), Vibrio (z. B. V. cholerae, V. el tor) und Yersinia (z. B. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres verwendet, das mit Enterobacteriaceen, wie Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis und Klebstella pneumoniae infiziert ist.
Wie das Beispiel 1 zeigt (Tabellen 3 und 4) werden sogar die Stämme, die β- Lactamase bilden und daher gegenüber einer Anzahl Antibiotika resistent sind, bei Anwesenheit von DPPS abgetötet. Im Falle von Klebstella wird die medizinische Bedrohung durch Stämme verursacht, die β-Lactamase bilden und daher gegenüber Antibiotika resistent sind. Daher wird angenommen, dass andere Bakterienstämme, vgl. die oben erwähnten, ebenfalls bei Anwesenheit des Stoffes der Erfindung abgetötet werden.
Die Kombination kann zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres mit einer Infektion, die durch grampositive Bakterien verursacht wird, verwendet werden. Bei den grampositiven Bakterien kann es sich handeln um: Kokken, wie Streptococcus (z. B. S. pneumoniae, S. viridans, S. faecalis, S. pyogenes), Staphylococcus (z. B. S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus) und Stäbchen, wie Actinomyces (z. B. A. israelii), Bacillus (z. B. B. cereus, B. subtilis, B. anthracis), Clostridium (z. B. C. botulinum, C. tetani, C. perfringens, C. difficilis), Corynebacterium (z. B. C. diphtheriae), Listeria und Providencia. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kombination zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres mit einer Infektion verwendet, die durch Staphylococcus und Enterococcus, wie Staphylococcus aureus verursacht wurde.
Die Kombination kann zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tieres mit einer Infektion verwendet werden, die durch Mycoplasma, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und Rickettsiae verursacht wurde.
In den Beispielen werden wissenschaftliche Belege für den Mechanismus durch die der Stoff der vorliegenden Erfindung die Aktivität von Ampicillin gegen P. aeruginosa steigert offengelegt. MPPA bindet sowohl Magnesium als auch Calcium, wodurch die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen zu mehr als 4- bis 5-fach vermindert werden (Tabelle 21 und 22). Die Zugabe von Calcium zu MPPA-Überständen kehren die Steigerung der Aktivität von Ampicillin vollständig um, wogegen die Zugabe von Magnesium dies nicht bewirkt (Tabellen 19 und 20), was anzeigt, dass die Bindung von Calcium am Wichtigsten ist. Eine weitere Unterstützung (der Ansicht), dass die Steigerung auf die Bindung von Calcium durch MPPA zurückzuführen ist, ist der Befund, dass eine höhere Konzentration von MPPA die Aktivität von Ampicillin gegen P. aeruginosa PAO1 erhöhte, sogar wenn die Konzentration von Calcium im L-Nährmedium erhöht wurde (Tabelle 19).
Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass MPPA Calcium und Magnesium aus den Lipopolysacchariden (LPS) der äußeren Membran entfernt, was eine Freisetzung von LPS verursacht, wodurch die Membran destabilisiert und durchlässig z. B. für ein antimikrobielles Mittel wird.
Ein derzeit bevorzugtes antimikrobielles Mittel, das in Kombination mit dem Stoff verwendet werden soll, sollte ein antimikrobielles Mittel sein, das eine antimikrobielle Wirkung durch Hemmung der Zellwandsynthese besitzt, wie β-Lactame und Vancomycin, vorzugsweise Penicilline, wie Amdinocillin, Ampicillin, Amoxicillin, Azlocillin, Bacampicillin, Benzathin-Penicillin G, Carbenicillin, Cloxacillin, Cyclacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Mezlocillin, Nafcillin, Oxacillin, Penicillin G, Penicillin V, Piperacillin und Ticarcillin; Cephalosporine, wie die Arzneistoffe der ersten Generation Cefadroxil, Cefazolin, Cephalexin, Cephalothin, Cephapirin und Cephradin, die Arzneistoffe der zweiten Generation Cefaclor, Cefamandol, Cefonicid, Ceforanid, Cefoxitin und Cefuroxim, oder der dritten Generation Cephalosprine Cefoperazon, Cefotaxim, Cefotetan, Ceftazidim, Ceftizoxim, Ceftriaxon und Moxalactam; Carbapeneme, - wie Imipenem; oder Monobactame, wie Azotreonam.
Die Tetracyclinresistenz wird in vielen Bakterien durch eine verminderte Durchlässigkeit für Tetracyclin (beim Eindringen) in das Bakterium verursacht. Wenn die Membran durch die Anwesenheit des Stoffes der vorliegenden Erfindung durchlässig wird, könnte erwartet werden, dass die Wirkung von Tetracyclinen aufgrund der erhöhten Durchlässigkeit für Tetracycline gesteigert wird, die durch die veränderte Durchlässigkeit für den Arzneistoff verursacht wird.
Von anderen antimikrobiellen Arzneistoffen mit Wirkung über die Hemmung der Proteinsynthese, wie Chlorampenicol; andere Tetracycline, vorzugsweise Demeclocyclin, Doxycyclin, Methacyclin, Minocyclin und Oxytetracyclin; Aminoglycoside, wie Amikacin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Netilmicin, Paromomycin, Spectinomycin, Streptomycin und Tobramycin; Polymixine, wie Colistin, Colistimathat und Polymixin B und Erythromycine und Lincomycine wird ebenfalls erwartet, dass sie eine gesteigerte Aktivität bei Anwesenheit des Stoffes mit der Formel (I) besitzen.
Von antimikrobiellen Mitteln mit Wirkung über die Hemmung der Nucleinsäuresynthese, insbesondere Sulfonamide, wie Sulfacytin, Sulfadiazin, Sulfisoxazol, Sulfmethoxazol, Sulfmethizol und Sulfapyridin; Trimethoprim, Chinolone, Novobiocin, Pyrimethamin und Rifampicin wird ebenfalls erwartet, dass sie eine gesteigerte Aktivität bei Anwesenheit des Stoffes mit der Formel (I) besitzen.
Die Tabellen 15, 17 und 18 zeigen, dass sowohl MPPA als auch MPPC (Monopalmitoylphosphatidylcholin) eine Wirkung gegen grampositve Bakterien aufweisen, aber Tabelle 7 zeigt, dass, obwohl MPPA eine Wirkung gegen P. aeruginoisa PAO1 besitzt, MPPC diese nicht aufweist. Wenn die Wirkung des Stoffes auf gramnegative Bakterien in der Bindung von Calcium und Magnesium besteht, würde man nicht erwarten, dass MPPC wirken würde, da es nicht in der Lage sein sollte, diese Kationen zu binden. MPPC wirkt jedoch auf grampositive Bakterien und bindet diese Kationen nicht. Weil der Mechanismus der Wirkung von MPPA auf grampositive Bakterien vermutlich ähnlich wie der von MPPC ist, ist es daher sehr wahrscheinlich, dass, nicht wie seine Wirkung gegen gramnegative Bakterien, die Wirkung von MPPA auf grampositive Bakterien auf etwas anderes als die Bindung von Calcium und Magnesium zurückzuführen ist. Der genaue Mechanismus ist nicht bekannt, aber es ist bekannt, dass Lipide durch Einfügen und Integration in die Membran an Membranen binden, wodurch die Membran destabilisiert wird. Es wurde vorgeschlagen, dass LPS Erythrocyten zerstört.
Antimikrobielle Mittel, die spezifisch gegen Pilzinfektionen bevorzugt werden, umfassen Amphotericin B, Flucytosin und Ketoconazol. Antimikrobielle. Mittel, die spezifisch gegen Vireninfektionen bevorzugt werden, sind Acyclovir, Amantadin, Azidothymidin, Ribavirin und Vidarabin.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die die Kombination der vorliegenden Erfindung umfaßt, als Paste hergestellt. Dies erfordert die Zugabe von verschiedenen Stoffen für die endgültige Rezeptierung der Paste, die einer Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, gut bekannt sind (siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" und "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology"). Die Paste wird zur örtlichen Anwendung der antimikrobiellen Zusammensetzung für die Bekämpfung von Krankheiten, wie Brandwunden, Ulcus cruris, Akne, Gonorrhoe (einschließlich Harnröhrenentzündung, Endozervixentzündung und Mastdarmentzündung), Milzbrand, Tetanus, Gasgangrän, Scharlach, Wundrose, Sycosis barbae, Haarfollikelentzündung, Impetigo contagiosa, oder Impetigo bullosa geeignet sein.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die die Kombination der vorliegenden Erfindung umfaßt, als Flüssigkeit hergestellt. Dies erfordert die Zugabe von verschiedenen Stoffen für, die endgültige Rezeptierung der Flüssigkeit, die einer Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, gut bekannt sind (siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" und "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology"). Die Flüssigkeit wird zur Injektion in die infizierten Bereiche oder zur Anwendung auf den infizierten Bereichen für die Bekämpfung von Krankheiten, wie Augeninfektionen (Orbitalzellulitis, Konjunctivitis), Periodontitis, Otitis (Otitis media, Sinuitis), Mundinfektionen, Halsinfektionen oder Milzbrand geeignet sein.
In einer weiteren Ausführungsform, der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die die Kombination der vorliegenden Erfindung umfaßt, als Dampf/Nebel hergestellt. Dies erfordert die Zugabe von verschiedenen Stoffen für die endgültige Rezeptierung des Dampfes, die einer Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, gut bekannt sind (siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" mit "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology"). Der Dampf wird zum Einatmen der antimikrobiellen Zusammensetzung z. B. durch die Nase oder den Mund zur Bekämpfung von Krankheiten, wie Lungeninfektionen (wie Lungenentzündung sind Cystischer Fibrose), Diphterie, Pertussis (Keuchhusten), Kehldeckelentzündung, Entzündung des Nasenrachenraums, Bronchitis und Mandelentzündung geeignet sein.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die die Kombination der vorliegenden Erfindung umfaßt, als Flüssigkeit oder Feststoff hergestellt. Dies erfordert die Zugabe von verschiedenen Stoffen für die endgültige Rezeptierung der Flüssigkeit oder des Feststoffes, die einer Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, gut bekannt sind (siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" und "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology"). Die Flüssigkeit oder der Feststoff wird zur oralen Verabreichung der antimikrobiellen Zusammensetzung zur Bekämpfung von Krankheiten, wie Gastritis, Typhus, Gastroenteritis, Milzbrand, Botulismus, pseudomembranöse Colitis, Dysenterie, Enterocolitis, Peritonitis, Abszessen, Pertussis, Cholera, Pest, Cystitis, Lungenentzündung, Meningitis und Crohn's Krankheit geeignet sein.
Viele Krankheiten entstehen aus einer Primärinfektion mit irgendeinem Bakterium, werden aber durch die sekundäre Ausbreitung des infektiösen Agens von der primären Infektionsstelle verursacht. Daher wird der Gebrauch einer Kombination der Erfindung für die Vorbeugung von Krankheiten, wie jeder der Krankheiten, die oben erwähnt wurde, nützlich sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bekämpft oder verhindert die Kombination der vorliegenden Erfindung die Infektion in jeglichem Tier, vorzugsweise einem Säugetier, wie einem Haustier, z. B. Katze, Hund, Meerschweinchen; oder einem Zootier. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das Tier ein Industrietier, vorzugsweise ein Tier vom Bauernhof, wie einer Kuh, ein Pferd, Schwein, Nerz, Ziege oder Schaf, oder ein Vogel, wie Huhn, Strauß, Truthahn, Ente oder Gans. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Säugetier ein Mensch.
In einer noch anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kombination der Erfindung peroral, parenteral, intravenös, örtlich, vaginal oder rektal als aktiver Wirkstoff in gebräuchlichen Arzneimitteln verabreicht.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Arzneimittel, das die Kombination der Erfindung umfaßt. Um die Registrierung zur Verwendung am Menschen zu erhalten, müssen verschiedene Schritte durchgeführt werden.
Den ersten Schritt wird der Test der Kombination der Erfindung in Tiermodellen darstellen. Als ein Beispiel wird die Kombination der Erfindung in dem Rattenmodell für Cystische Fibrose, das von Cash et al., 1979 beschrieben wurde, untersucht. In dem Rattenmodell wurden die P. aeruginosa-Stämme 17107 und 19676 verwendet, da sie in der Lage sind, eine chronische Entzündung der Lunge hervorzurufen. Da MPPA gegen die Stämme 17107 und 19676 in vitro wirkt, wird erwartet, dass es in dem Modell ebenfalls wirkt. Es werden häufig Hautverbrennungs-Modelle verwendet (Kernodle und Kaiser, 1994), mit denen die Wirkung gegen Infektionen mit grampositiven und gramnegativen Bakterien untersucht werden kann. Einer Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, werden andere Tiermodelle für Infektionskrankheiten bekannt sein. Bei jedem dieser Modelle wird angenommen, dass ein Experiment zur Struktur-Wirkungs-Beziehung, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, nötig sein wird. Der örtliche Stoffwechsel, die Diffusion, die Störung des biologischen Gleichgewichts, das Eindringen und die Löslichkeit sind nur einige Faktoren, die den Übergang von den in vitro- zu den in vivo-Daten/Ergebnissen beeinflussen.
Der zweite Schritt wird die Erkundung der Toxizität der Kombination der Erfindung sein. Diese Studien werden an Modellen durchgeführt wie sie die medizinischen Begutachtungsbehörden fordern. Es wird angenommen, dass die Toxizität der Kombination der Erfindung niedrig ist.
Der dritte Schritt wird die Formulierung der Kombination der Erfindung sein. In einem Aspekt der Formulierung, wird sie als ein Präparat zur örtlichen Verabreichung als ein kosmetisches Arzneimittel oder ein Hautpflegemittel, das die Kombination der Erfindung umfaßt, formuliert. Arzneimittel, kosmetische und Hautpflegemittel der Erfindung, die zur örtlichen Verabreichung geeignet sind, können Cremes, Salben, Lotionen, Einreibemittel, Gele, Lösungen, Suspensionen, Pasten, Stifte, Sprays, Shampoos, Seifen, Haarpflegemittel oder Puder sein.
Die örtliche Verabreichung kann eine Verabreichung auf (den Körper) oder von Dosen auf Körperteile sein, die die Infektion aufweisen, z. B. auf einen äußeren Körperteil, wie eine Hautoberfläche. Bei der Anwendung kann es sich um ein einfaches Aufschmieren der Zusammensetzung handeln, oder sie kann jegliches Hilfsmittel, das zur Steigerung des Kontakts zwischen der Zusammensetzung und der Infektionsstelle geeignet ist mit einschließen, wie die Verwendung von Verschlußverbänden, z. B. Verschlußpflaster, die mit der Zusammensetzung der Erfindung bereitgestellt werden. Die Zusammensetzungen können imprägniert oder auf Kissen, Pflaster, Streifen, Mull, Schwammstoffen, Baumwollstücken usw. verteilt werden. Wahlweise kann eine Ast der Injektion in oder nahe der Verletzung angewendet werden.
Die örtlichen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können 0,001- 80 Gew.-% des aktiven Stoffes der Formel (I) basierend auf dem Gesamtgewicht der Präparate umfassen, wie 0,001-40% (Gew./Gew.) der aktiven Verbindung, z. B. 0,1-20%, 0,5-10% oder 2-5%. Es kann mehr als ein Wirkstoff in die Zusammensetzung mit eingeschlossen werden. Die Zusammensetzung wird abhängig von der Art, der Schwere und dem Ort der Infektion am günstigsten 1-10 mal angewendet, wie 1, 2, 3 oder 4 mal am Tag.
Zu örtlichen Verabreichung kann das Präparat gemäß der üblichen Apothekenpraxis mit pharmazeutischen Excipienten, die üblicherweise für örtliche Verabreichungen verwendet werden, formuliert werden. Die Art des Trägers, der bei einem Präparat einer jeglichen speziellen Zusammensetzung angewendet wird, wird von dem Verfahren abhängen, das für die Verabreichung dieser Zusammensetzung beabsichtigt wird. Es können andere Träger als Wasser bei den Zusammensetzungen verwendet werden und sie können Feststoffe oder Flüssigkeiten, wie Aufweichmittel, Lösemittel, Befeuchtungsmittel, Verdickungsmittel und Pulver umfassen. Beispiele für jede dieser Art von Trägern, die einzeln oder als Gemisch von einem oder mehreren Trägern verwendet werden können, sind wie folgt:
Aufweichmittel, wie Stearylalkohol, Glycerylmonoricinoleat, Glycerylmonostearat, Propan-1,2-diol, Butan-1,3-diol, Cetylalkohol, Isopropylisostearat, Stearinsäure, Isobutylpalmitat, Isocetylstearat, Oleylalkohol, Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyloleat, Octadecan-2-ol, Isocetylalkohol, Cetylpalmitat, Dimethylpolysiloxan, Di- n-butylsebacat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Isopropylstearat, Butylstearat, Polyethylenglycol, Trieethylenglycol, Lanolin, Rizinusöl, acetylierte Lanolinalkohole, Petroleum, Mineralöl, Butylmyristat, Isostearinsäure, Palmitinsäure, Isopropyllinoleat, Lauryllactat, Myristyllactat, Decyloleat, Myristylmyristat;
Lösemittel, wie Wasser, Methylenchlorid, Isopropanol, Rizinusöl, Ethylenglycolmonoethylether, Diethylenglycolmonobutylether, Diethylenglycolmonoethylether, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, pflanzliche und tierische Öle, Glycerin, Ethanol, Propanol, Propylenglycol und andere Glycole oder Alkohole, nichtflüchtige Öle;
Befeuchtungsmittel oder feuchtende. Mittel, wie Glycerin, Sorbit, Natrium-2- pyrrolidon-5-carboxylat, lösliches Kollagen, Dibutylphthalat, Gelatine;
Pulver, wie Kreide, Talkum, Kaolin, Stärke und ihre Derivate, Gummis, kolloidales Silicium(IV)oxid, Natriumpolyacrylat, chemisch modifiziertes Magnesiumaluminiumsilikat, hydratisiertes Aluminiumsilikat, Carboxyvinylpolymer, Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylenglycolmonostearat;
Gelier- oder Quellmittel, wie Pektin, Gelatine und ihre Derivate, Cellulosederivate, wie Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder oxidierte Cellulose, Cellulosegummi, Guragummi, Akaziengummi, Karayagummi, Tragantgummi, Bentonit, Agar, Alginate, Carbomer, Gelatine, Blasentang, Ceratonia, Dextran und seine Derivate, Ghattigummi, Hectorit, Ispaghulaschalen, Xanthangummi;
Polymere, wie Polymilchsäure- oder Polyglycolsäurepolymere oder Copolymere davon, Paraffin, Polyethylen, Polyethylenoxid, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyvinylpyrrolidon;
Grenzflächenaktive Mittel, wie nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel, z. B. Glycol und Glycerinester, Macrogolether und -ester, Zuckerether und -ester, wie Sorbitanester, ionische grenzflächenaktive Mittel, wie Aminseifen, Metallseifen, sulfatierte Fettalkohole, Alkyethersulfate, sulfatierte Öle und ampholytischer grenzflächenaktive Mittel und Lecithine;
abpuffernde Mittel, wie Natrium-, Kalium-, Aluminium-, Magnesium- oder Calciumsalze (wie Chloride, Carbonate, Bikarbonate, Citrate, Gluconate, Lactate, Acetate, Gluceptate oder Tartrate).
Zur örtlichen Anwendung kann der pH-Wert der Zusammensetzung im Prinzip innerhalb eines sehr breiten Bereiches liegen, wie 3-9. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird ein pH-Wert nahe dem physiologischen pH-Wert, z. B. ein pH-Wert von etwa 4-8 bevorzugt. Um den gewünschten pH-Wert zu erhalten können übliche Puffermittel, wie oben beschrieben, verwendet werden.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann auch andre Zusatzstoffe, wie stabilisierende Mittel, Konservierungsmittel, solubilisierende Mittel, Färbemittel, chelatierende Mittel, Gel-bildende Mittel, Salbengrundstoffe, pH-Regulatoren, Antioxidantien, Parfüme und Hautschutzmittel, usw. enthalten. Wenn die Zusammensetzung sich in der Form eines Shampoos oder einer Seife befindet, kann die Zusammensetzung weiterhin Schaummittel, Perlmittel und/oder konditionierende Mittel umfassen.
Typische Konservierungsmittel umfassen die Parabene, Formaldehyd, Kathon CG, Bronidox, Bronopol, p-Chloro-m-cresol, Chlorhexidin, Benzalkoniumchlorid, usw.
Wenn sich die Zusammensetzung der Erfindung in der Form eines Shampoos oder einer Seife befindet, können die üblichen Zutaten verwendet werden, und typische Seifen- und Shampoogrundstoffe umfassen solche Bestandteile wie Betain, Natriumlaurylsulfat, Nonylphenol, Imidazol, Sulfosuccinat, rückfettende Mittel, Feuchtigkeitsmittel und konditionierende Mittel.
Die Zusammensetzungen können gemäß der üblichen Apothekenpraktiken formuliert werden und es kann sich handeln um: halbfeste Formulierungen: Gele, Pasten, Gemische. Flüssige Formulierungen: Lösungen, Suspensionen, (Arznei)tränke, Emulsionen. Wie angezeigt, kann ein Arzneimittel der Erfindung einen Stoff der Erfindung oder eine Kombination von solchen Verbindungen umfassen. Beispiele für geeignete funktionelle Derivate umfassen pharmazeutisch verträgliche Salze, die insbesondere auf der Haut pharmazeutisch verträglich sind. Die Beispiele umfassen Phosphate, Sulfate, Nitrate, Iodide, Bromide, Chloride, Borate, sowie Anionen, die aus Carbonsäuren abgeleitet sind, einschließlich Acetat, Benzoat, Stearat, usw. Andere Derivate der Aminofunktion umfassen Amide, Imide, Harnstoffe, Carbamate, usw. Die Beispiele umfassen Salze mit pharmazeutisch verträglichen Kationen, z. B. Lithium, Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink, Aluminium, Fern-, Ferro-, Ammonium- und niedere (C1-6)-Alkylammmoniumsalze. Ester umfassen die Niederalkylester.
Eine Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, wird verstehen, dass die peroralen, parenteralen, intravenösen, örtlichen, vaginalen oder rektalen Formulierungen den Richtlinien zur örtlichen Verabreichung, die oben bekannt gemacht wurden, folgen und gemäß der üblichen pharmazeutischen Praxis (erfolgen), siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences" und "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology".
Der vierte Schritt wird die Herstellung der Kombination der Erfindung unter GMP- (Richtlinien) und die Einreichung einer Bewerbung für klinischen Studien sein. Diese Verfahren sind von den medizinischen Begutachtungsbehörden gut beschrieben und sind einer Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, bekannt.
Die antimikrobielle Wirkung der Kombination der Erfindung kann in verschiedene persönliche Pflege- und Haushaltswaren-Rezeptierungen eingebaut werden, z. B. ein Konservirungsmittel oder ein desinfizierendes Mittel gemäß Standardpraktiken. Eine Ausführungsform dieses Befundes wird die Verwendung in Kosmetika zur Vorbeugung und Behandlung einer fettigen Haut (Akne) darstellen. Eine andere Ausführungsform dieses Befundes wird die Verwendung zur Desinfektion, wie zur Desinfektion von Oberflächen, Haushalts-Gebrauchswaren, Industrie-Gebrauchswaren oder Kontaktlinsen sein. Andere mögliche Anwendungen umfassen die Behandlung von Fußpilz, Halsentzündungen, schlechtem Atem, oder einer Handlotion für trockene Haut mit kleinen Ausschlägen oder andere Bereiche der persönlichen Hygiene. Weitere Anwendungen umfassen die Desinfektion von Zahnpflegemitteln, Zahnimplantaten oder Zahnprothesen. Mögliche Rezeptierungen umfassen Shampoos, Lotionen, Bonbons, Salben, Zahnpaste, oder Schaumsprühmittel und die Rezeptierungen, die oben beschrieben wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kombination der Erfindung in der Lebensmittelindustrie zur Konservierung und/oder zur Desinfektion von Nahrungsmitteln verwendet, um durch Nahrungsmittel übertragene Infektionen zu vermeiden.
Eine andere wichtige Ausführungsform des Auffindens der antimikrobiellen Wirkung der beschriebenen Stoffes wird die Verwendung der Kombination zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen in Pflanzen sein. Pflanzenpathogene stehen in einer parasitischen Beziehung, bei der der Mikroorganismus die Pflanze schädigt. Krankheiten in landwirtschaftlichen Nutzpflanzen erfolgen plötzlich und verursachen langandauernde Schäden. Ausbrüche von Pflanzenkrankheiten zerstören Millionen von Morgen von Nutzpflanzen wodurch sich Massenhungersnöte besonders in den Entwicklungsländern ergeben. Die bevorzugten Pflanzenpathogene, die einer Zusammensetzung mit oder ohne der Anwesenheit eines antimikrobiellen Mittels einschließlich des beschriebenen Stoffes den Weg weisen sind, aber nicht begrenzt auf, Pseudomonas (z. B. S. tabaci, S. angulata, S. phaseolicola, S. pisi, S. glycinea, S. syringae, S. solanacarum, S. caryophylii, S. cepacia, S. marginalis, S. savastonoi, S. marginata), Xanthomonas (z. B. X. phaseoli, X. oryzae, X. pruni, X. juglandis, X. campestris, X. vascularum), Erwinia (z. B. E. amylovora, E. tracheiphila, E. stewartii, E. carotovora), Corynebacterium (z. B. C. insidiosum, C. michiganese, C. facians), Streptomyces (z. B. S. scabies, S. ipomoeae), Agrobacterium (z. B. A. tumefaciens, A. rubi. A. rhizogenes), Mycoplasma oder Sprioplasma, vorzugsweise gegen Infektionen in Tabak, Bohnen, Erbsen, Sojabohnen, Spanischem Flieder, Bananen, Nelken, Zwiebeln, Oliven, Gladiolen, Reis, Früchten (z. B. Birnen, Äpfeln, Pfirsichen), Walnüssen, Kreuzblütlern, Citrusgewächsen, Zuckerrohr, Kürbissen, Mais, Kartoffeln, Chrysanthemen, Alfalfa, Tomaten, Himbeeren, oder Ulmen. Die Zusammensetzung wird gemäß Verfahren, die der Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, rezeptiert und verteilt.

Referenzen

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Die Erfindung wird nun durch Verweis auf bestimmte spezifische Beispiele erläutert, die hierin nur zum Zwecke der Erläuterung bereitgestellt werden.

BEISPIELE

Material und Verfahren

Bakterien.

P. aeruginosa PAO1 (Zhou, X. et al., 1997) und P. aeruginosa AC869, ein Stamm, der 3,5-Dichlorbenzoat abbaut (Chatterjee, D.K. und Chakrabarty, A.M., 1982) wurden von Dr. S. E. George aus dem National Health and Environmental Effects Research Laboratory, USEPA, Reseaeh Triangle Park, NC erhalten. P. aeruginosa 9086-1 NMR, eine nicht- mucoide Revertante eines mucoiden Stammes, der aus dem Speichel eines Patienten mit Cvstischer Fibrose isoliert worden war und verschiedene mucoide antibiotikaresistente Stämme von P. aeruginosa, die aus dem Speichel von chronisch infizierten Patienten mit Cystischer Fibrose isoliert worden waren, wurden von Dr. G. Pier, Channing Laboratorium, Harvard Medical School, Boston, MA erhalten. Pseudomonas aeruginosa H103, ein PAO1- Stamm (Hancock, R.E.W. und Carey, A.M., 1979) und H636, ein Protein F-defizienter Stamm, der aus H103 abgeleitet worden war (Woodruff, W.A. und Hancock, R.E.W., 1988) wurden von Dr. R.E.W. Hancock, Department of Microbiology, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada erhalten. Die Pseudomonas aeruginosa- Stämme 17. AM, 47 AL, 77 AM, 82 AM, 82 AM-NMR, PA0579 und 20 AL wurden von Dr. G. Pier, Channing Laboratorium, Harvard Medical School, Boston, MA erhalten. Die Pseudomonas aeruginosa-Stämme PA0579, 17107 und 19676 wurden von Dr. Niels Hoiby, Danish Cystic Fibrosis Center, Department of Clinical Microbiology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, Dänemark erhalten. Pseudomonas aeruginosa-82AM-NMR ist eine spontane nicht-mucoide Revertante der Stammes 82 AM.
Staphylococcus aureus: MRSA#1, MRSA#2, MRSA#988, MRSA#6052 wurden alle aus dem Staphylococcus-Laboratorium (Statens Serum Institut, Artillerivej 5, 2300 Copenhagen, DÄNEMARK) erhalten.
Enterococcus faecium VRE BM 4147 von A, E. faecalis VRE V583 von B, E. gallinarum VRE BM 4174 von C-1 (wie in Dutka-Malen, S. et al., 1995 beschrieben) wurden von Dutka- Malen erhalten.
Klinische Isolate von Klebstella pneumoniae wurden von dem Department of Microbiology (Statens Serum Institut, Artillerivej 5, 2300 Copenhagen, DÄNEMARK) erhalten.
Alle Bakterienstämme wurden bei -80ºC bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

Labornährmedien und Antibiotika.

Luria-Nährmedium (L-Nährmedium) wurde mit 10 g Trypton (Difco, Detroit, MI), 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt (Difco, Detroit, MI), 1 ml 1 N NaOH in 1 l destilliertem Wasser hergestellt. L-Agar wurde mit L-Nährmedium, das 12% (w/v) Bacto-Agar (Difco, Detroit, MI) enthielt, hergestellt. Die Stämme wurden bei 37ºC in L-Nährmedium angezogen und auf L-Agar ausgestrichen.
Ampicillin, Piperacillin und Methicillin wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Ceftazidim (Glaxo-Welcome, UK) wurde aus einer Krankenhausapotheke erhalten. Alle Phospholipide wurden von Avanti Polar-Lipids, Inc. (Alabaster, AL) bezogen.

Verfahren

Jedes der untersuchten Phospholipide und die individuellen Bestandteile in den Phospholipiden wurden bei ihren Konzentrationen, die in DPPS mit 1 mg/ml vorliegen, untersucht. Die Phospholipide wurden durch Behandlung mit Ultraschall in L-Nährmedium für 5 Minuten in einem Ultraschall-Wasserbad bei Zimmertemperatur hergestellt und dann für 4 Stunden bei 37ºC in einem Wasserbad mit Umwälzpumpe inkubiert. Dann wurde jegliches ungelöste Material bei 12.000 · g für 10 Minuten bei 4ºC abzentrifugiert und der Überstand wurde als Quelle der gelösten Verbindung verwendet. Die Überstände wurden dann mit den Bakterien beimpft und die Kulturen wurden mit Belüftung für 18 Std. bei 37ºC vor dem Ausstreichen auf Luria-Agar inkubiert. Die Platten wurden für 24 Stunden bei 37ºC vor der Zählung inkubiert.

Bestimmung der MPPA-Konzentrationen

Um die Menge an MPPA in Suspension zu bestimmen, wurden MPPA-Überstände (30 uL) und L-Nährmedium ohne zugefügtes MPPA (30 uL) in 0,45 ml Aliquoten von 8,9 N H&sub2;SO&sub4; gelöst und 25 Minuten auf 210ºC erhitzt. Nachdem die Proben für 5 Minuten abgekühlt waren, wurde H&sub2;O&sub2; (6 Tropfen) jeder Probe zugegeben, und die Proben wurden dann für 30 Minuten auf 210ºC erhitzt. Der durch dieses Hydrolyseverfahren freigesetzte anorganische Phosphor wurde wie bei Chen et al., 1956 beschrieben bestimmt. In Kontrollexperimenten wurden im wesentlichen 100% des anorganischen Phosphors bekannter Mengen von MPPA mit diesem Verfahren nachgewiesen. Die Konzentration an · anorganischem Phosphor im L-Nährmedium wurde von der Gesamtkonzentration an anorganischem Phosphor im jedem MPPA-Überstand subtrahiert, um die Konzentration an anorganischem Phosphor in MPPA zu erhalten. Alle Proben wurden dreimal durchgemessen. Die Konzentration von MPPA in jedem Überstand wurde aufgrund der Konzentration an anorganischem Phosphor in MPPA in dem Überstand und dem prozentualen Anteil an anorganischem Phosphor am Gewicht von MPPA berechnet. Überstände, die aus MPPA- Suspensionen mit Konzentrationen von 570 ug/ml, 1 mg/ml und 2 mg/ml hergestellt wurden, wurden auf Phospholipidphosphat hin untersucht. Die Konzentration an MPPA in jedem der Überstände wird in Tabelle 1 gezeigt. Bei allen Konzentrationen verblieben etwa 40 und 50% der Menge in der Suspension zurück.

Bestimmung der cfu

Die Koloniebildende Einheit (cfu) wurde durch serielle Verdünnung und Ausstreichen bestimmt. Die Platten wurden bei 37ºC 18 Std. inkubiert und manuell gezählt.

Die Messung von Calcium und Magnesium im L-Nährmedium

Die Calciumkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Beckman SYNCHRON EL-ISE Elektrolytsystems bestimmt. Diese Elektrode mißt gleichzeitig die Calcium-, Natrium-, Kalium- und Chloridkonzentrationen. Die Magnesiumkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Beckman SYNCHRON-CX-7-Autoanalysegerätes bestimmt. Die Daten werden in den Tabellen 21 und 22 gezeigt.

Beispiel 1: Wirkung von Phospholipiden auf gramnegative Bakterien

Wirkung von DPPS gegen Pseudomonas aeruginosa PAO1

Der MIC-Wert von Ampicillin gegen P. aeruginosa PAOI in L-Nährmedium beträgt 2 mg/ml. Eine Suspension von DPPS (1 mg/ml) wurde wie vorher beschrieben hergestellt und wurde mit P. aeruginosa PAO1 (5 · 10&sup4; cfu/ml) beimpft. Eine zweite Suspension von DPPS in L-Nährmedium, das 200 ug/ml Ampicillin enthielt, wurde ebenfalls mit P. aeruginosa PAO1 auf die gleiche Weise beimpft. Als Kontrollen wurde ein L-Nährmedium, das weder Ampicillin noch DPPS enthielt, und ein L-Nährmedium, das Ampicillin (200 ug/ml) enthielt, mit P.aeruginosa PAO1 beimpft. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wuchs P. aeruginosa PAO1 zu Konzentrationen von etwa 10¹&sup0; cfu/ml im L-Nährmedium, im L-Nährmedium, das DPPS in Suspension enthielt und im L-Nährmedium, das Ampicillin enthielt. Im Gegensatz dazu wuchs P. aeruginosa PAO1im L-Nährmedium, das DPPS in Suspension und Ampicillin enthielt, nicht (Tabelle 2). Daher schien DPPS in Suspension ein Verstärker der Ampicillinaktivität gegen P. aeruginosa. PAO1 darzustellen:

Wirkung von DPPS gegen Klebstella pneumoniae

Die Wirkung von DPPS bei der antibiotischen Aktivität von Ampicillin gegen K. pneumoniae wurde mit 11 Klebsiella-Stämmen untersucht, die alle klinische Isolate mit unterschiedlichen MIC-Werten (im Bereich von 3 ug/ml bis 128 ug/ml Ampicillin) waren. Das Wachstum von Klebsiella wurde durch (Bestimmung der) CFU im L-Nährmedium mit und ohne DPPS (1 mg/ml), durch Zugabe von seriellen Verdünnungen von Ampicillinkonzentrationen in Abhängigkeit von dem MIC-Wert des Stammes (von 0-1.024 ug/ml) aufgezeichnet. Als Kontrollen wurde L-Nährmedium ohne Ampicillin und DPPS verwendet. Für alle 11 Stämme wurde die Steigerung der antibiotischen Aktivität bestätigt. Repäsentative Ergebnisse des Stammes mit dem niedrigsten MIC-Wert (3002) und dem höchsten MIC-Wert (30924) werden in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, wird ein Stamm von K. pneumoniae, der relativ empfindlich gegen Ampicillin ist, sogar noch empfindlicher, wenn DPPS dem Medium zugegeben wird. Tabelle 4 zeigt die sogar noch größere Wirkung bei einem Stamm, der gegen Ampicillin relativ resistent ist.

Bestimmung der optimalen Struktur eines Ampicillin-Verstärkers

Verschiedene Bestandteile von DPPS wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Aktivität von Ampicillin (200 mg/ml) gegen P. aeruginosa PAO1 zur verstärken. Jeder der Überstände wurde aufgrund seines Gewichtes in DPPS bei 1 ug/ml hergestellt. Die untersuchten Verbindungen waren Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA, 0,88 mg/ml), der das C3-Serin fehlt, Palmitinsäure (PA, 0,68 mg/ml), Dipalmitoylglycerin (DPG, 0,75 mg/ml), Glycerin (0,12 mg/ml), Glycerin-3-phosphat (G3P, 0,49 mg/ml) Glycerophosphorylserin (GPS, 0,32 mg/ml) und Phosphorylserin (PS, 0,2 mg/ml).
Wie in Tabelle 5 gezeigt wird besaß nur DPPA eine verstärkende Aktivität, die der vergleichbar war, die vorher mit DPPS beobachtet wurde. Da mit DPG keine verstärkende Aktivität beobachtet wurde, weist dies auf die Bedeutung des Phosphats hin. Da darüber hinaus GPS keine verstärkende Aktivität besaß, wurde die Bedeutung der Fettsäuren deutlich. Als Unterstützung für dieser Ansicht war die einzige andere Verbindung, die überhaupt eine, wenn auch schwache, verstärkende Aktivität besaß, Palmitinsäure (Tabelle 5).
Überstände, die aus verschiedenen anderen Phospholipiden hergestellt worden waren, wurden ebenfalls auf verstärkende Aktivität hin untersucht. Die untersuchten Phospholipide waren Monomyristylphosphatidsäure (MMPA, 0,53 mg/ml), die eine Myristinsäure (C14) am C1- Atom des Glyceringerüstes enthält, Monopalmitoylphosphatidsäure (MPPA, 0,57 mg/ml), die eine Palmitinsäure (C16) am C1-Atom des Glyceringerüstes enthält, Dilauroylphosphatidsäure (DLPA, 0,74 mg/ml), die eine Laurinsäure (C12) am C1-Atom und eine Laurinsäure am C2-Atom des Glyceringerüstes enthält und Dicaproylphosphatidsäure (DCPA, 0,51 mg/ml), die eine Caprylsäure (C6) am C1-Atom und eine Caprylsäure am C2- Atom des Glyceringerüstes enthält. Die verstärkenden Aktivitäten von MPPA und MMPA waren größer als die von DPPA, welche größer war als die von DPPS und DLPA, welche die gleichen verstärkenden Aktivitäten besaßen. DCPA, das in L-Nährmedium vollständig löslich ist, besaß keine verstärkende Aktivität (Tabelle 6). Deshalb erhöhte sich durch die Entfernung des Serins aus DPPS, um DPPA zu bilden, die verstärkende Aktivität des Phospholipids 100- fach, und durch zusätzliche Entfernung einer Palmitinsäure vom C2-Atom des Glycerinrestes von DPPA, um MPPA zu bilden, erhöhte sich die verstärkende Aktivität zusätzlich 100-fach. Die Abnahmen der Kettenlänge der Fettsäure in MPPA von einem C16-Gerüst zu einem C14- Gerüst, um MMPA zu bilden, hatte keine erkennbare Wirkung auf die Fähigkeit, die Aktivität von Ampicillin zu steigern (Tabelle 6). Die Reduzierung der Fettsäurenkettenlänge von C16 in DPPA zu C12 in DLPA verminderte jedoch die Ampicillin-verstärkende Aktivität 100- fach, und eine weitere Reduzierung auf C6, um DCPA zu bilden, hob alle verstärkende Aktivität auf (Tabelle 6). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Serin für die Ampicillin-verstärkende Aktivität in vitro nicht notwendig ist, dass Lysophospholipide, d. h. Phospholipide mit nur einer Fettsäure anstatt zweier, aktivere Verstärker als ihre Ausgangs-Phospholipide darstellen, und dass Phospholipide Fettsäuren mit Gerüstlängen von mehr als 6 Kohlenstoffatomen besitzen müssen, um die Aktivität von Ampicillin zu verstärken.
Sowohl DPPS als DPPA tragen negative Ladungen. Um zu bestimmen, ob die negative Ladung wichtig für die ampicillin-verstärkende Aktivität ist, wurden Überstände, die unter Verwendung von Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Monoplamitoylphosphatidylcholin (MPPC) hergestellt worden waren, auf ihre Ampicillin- verstärkende Aktivität gegen P. aeruginosa PAO1 hin untersucht. Weder MPPC noch DPPC hatten irgendeine erkennbare Ampicillin-verstärkende Aktivität (Tabelle 7), was nahe legt, dass die negative Nettoladung von DPPS als auch von MPPA wichtig ist.

Bestimmung der Wirkung von Impfmaterial auf die Wirkung von DPPS und MPPA

Vorinkubierte DPPS-Überstände wurden mit 10², 10³, 10&sup4;, 10&sup5; oder 10&sup6; cfu/ml P. aeruginosa PAO1 bei Anwesenheit von 200 ug/ml Ampicillin beimpft und wie vorher beschrieben behandelt. Die vorinkubierten DPPS-Überstände waren bis zu einer Impfmenge von 10&sup5; cfu/ml bei der Steigerung der Aktivität von Ampicillin wirksam, die Impfmenge von 10&sup6; cfu/ml wuchs jedoch langsam bei Anwesenheit von Ampicillin (Tabelle 8).
Vorinkubierte Überstände, die unter Verwendung von 570 ug/ml MPPA in L- Nährmedium hergestellt worden waren, wurden mit 5,3 · 10³, 5,3 · 10&sup4;, 5,3 · 10&sup5;, 5,3 · 10&sup6; oder 5,3 · 10&sup7; cfu/ml P. aeruginosa PAO1 bei Anwesenheit von 200 ug/ml Ampicillin beimpft und wie vorher beschrieben behandelt. Die vorinkubierten MPPA-Überstände waren bis zu einer Impfmenge von 5,3 · 10&sup6; cfu/ml bei der Steigerung der Aktivität von Ampicillin wirksam (Tabelle 9).
Dies weist darauf hin, dass es eine Konkurrenz zwischen den Bakterien und den Phospholipiden um Etwas in dem Medium gibt, so dass je mehr Bakterien vorliegen, umso mehr Phospholipid benötigt wird. Dies stellt kein Problem dar, da, wie in Tabelle 1 gezeigt, je mehr Phospholipid zugegeben wird, desto mehr in Suspension verbleibt. Wie in Beispiel 3 gezeigt werden wird, konkurrieren die Bakterien und die Phospholipide um das Calcium und das Magnesium, die im L-Nährmedium vorliegen.

Bestimmung des MIC-Wertes und des MBC-Wertes von Ampicillin bei Anwesenheit von MPPA

In dieser Untersuchung ist die minimale hemmende Konzentration (MIC) definiert als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Mittel, z. B. Ampicillin, die das Wachstum um mehr als eine Größernordnung relativ zu der unbehandelten Anzucht vermindert und die minimale bakterienabtötende Konzentration (MBC) als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Mittels, z. B. Ampicillin, die um eine Größenordnung niedrigere cfu/ml als beim Beimpfen ergibt. Vorinkubierte Überstände, die unter Verwendung von 570 ug/ml MPPA in L-Nährmedium hergestellt worden waren und Ampicillin in Konzentrationen von 10, 20, 40, 60, 80, 100 und 200 ug/ml enthielten, wurden mit P. aeruginosa PAO1 (3,5 · 103 cfu/ml) beimpft und zur Bestimmung des MIC- und des MBC-Wertes untersucht. Der MBC- Wert, der durch die Abtötung des Impfmaterials beurteilt wurde, wurde als 40 ug/ml Ampicillin bestimmt (Tabelle 10) und der MIC-Wert, der durch eine deutliche Hemmung des Wachstums bestimmt wurde, wurde als 20 ug/ml bestimmt (Tabelle 10). Daher erniedrigte MPPA den MIC-Wert von Ampicillin 100-fach von 2 mg/ml zur 20 ug/ml, und es erniedrigte den MBC-Wert von Ampicillin 100-fach von 4 mg/ml zu 40 ug/ml.

Wirkung von MPPA auf andere P. aeruginosa-Stämme

Protein F scheint das Haupt-Porin von P. aeruginosa zu sein und es wurde vorgeschlagen, dass β-Lactamantibiotika über Protein F eindringen (Woodruff, W.A. und Hancock, R.E.W., 1988). Protein F-defiziente Mutanten besitzen MIC-Werte, die für β- Lactamantibiotika höchstens dreimal höher sind als die des elterlichen Wildtyps. P. aeruginosa H6363, eine Protein F-defiziente Mutante und sein Elternstamm P. aeruginosa H103 (Hancock, R.E.W. und Carey, A.M., 1979) wurden auf die MPPA-Steigerung der Ampicillinaktivität hin untersucht. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, war H636 resistenter gegen Ampicillin (200 ug/ml) als sein Elterstamm H103; bei Anwesenheit von MPPA tötete jedoch Ampicillin das ganze H636-Impfmaterial ab (Tabelle 11). Daher scheint es so, dass MPPA Protein F nicht benötigt, um die Aktivität von Ampicillin zu verstärken.
Die Wirkungen von MPPA zeigen sich auch bei dem Umweltisolat AC869, das Kohlenwasserstoffe abbaut. Vier schleimartige, antibiotikaresistente (Ampicillin, Carbenicillin, Piperacillin, Ciprofloxacin, usw.) Stämme von P, aeruginosa, die vor Kurzen aus dem Speichel von chronisch infizierten Patienten mit Cystischer Fibrose (17 AM, 47 AL, 77 AM, 82 AM) isoliert worden waren, wurden auf die MPPA-Steigerung der Ampicillinaktivität hin untersucht. Überraschenderweise hemmten die MPPA-Überstände (570 ug/ml) das Wachstum aller vier Stämme (Tabelle 11). Eine nicht-mucoide Revertante eines dieser Stämme (82 AM NMR) wurde ebenfalls untersucht. MPPA hemmte das Wachstum von 82 AM NMR ebenso (Tabelle 11). MPPA steigerte die Aktivität von Ampicillin auf diese Stämme nicht (Tabelle 11), was nicht überrascht, da Ampicillin auf nicht-wachsende Bakterien nicht wirkt.
PA0579, ein Cystischer Fibrose-Stamm und 9086-1 NMR, eine nicht-mucoide Revertante eines Cystischer Fibrose-Stammes wuchsen bei Anwesenheit von MPPA, und wurden bei Anwesenheit von MPPA und Ampicillin wie der Kontrollstamm PAO1 abgetötet (Tabelle 11).

Steigerung der Wirkung von Piperacillin und Ceftazidim durch MPPA

Da MPPA die Wirkungen von Ampicillin bei Cystischen Fibrose-Stämmen, die bei Anwesenheit von MPPA langsam wachsen, nicht steigerte, wurde die verstärkende Wirkung von MPPA auf die Aktivität von Piperacillin (Tabelle 12) untersucht. MPPA steigerte die Aktivität von Piperacillin gegenüber allen untersuchten Stämmen (Tabelle 12). Im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wurden mit zwei zusätzlichen Cystischen Fibrose- Stämmen bei der Verwendung von MPPA und Ceftazidim (Tabelle 13) beobachtet. Die Stämme 17107 und 19676 sind resistent gegen Ceftazidim. MPPA steigerte auch die Aktivität von Ceftazidim gegen diese Stämme (Tabelle 13).

Wirkung von MPPA auf das Wachstum

Die P. aeruginosa-Stämme 17 AM (Tabelle 11), 47 AL (Tabelle 11), 77 AM (Tabelle 11), 82 AM (Tabelle 11), 82 AM-NMR (Tabelle 11), 17107 (Tabelle 13) wurden alle im Wachstum durch die Anwesenheit von MPPA ohne Antibiotika gehemmt. Diese zeigt, dass MPPA alleine bereits eine bakteriostatische Wirkung gegen bestimmte gramnegative Bakterien besitzen könnte.
Der Grund für dieses Ergebnis ist derzeit unbekannt; es ist jedoch bekannt, dass die Mehrzahl von P. aeruginosa-Stämmen, die aus Patienten mit Cystischer Fibrose isoliert wurden, sehr wenige O-Seitenketten auf ihren Lipopolysacchariden (LPS) besitzen. Da MPPA mit P. aeruginosa um Calcium und Magnesium konkurriert (siehe Beispiel 3, unten), und da LPS in der äußeren Membran von P. aeruginosa durch zweiwertige Kationen stabilisiert wird, ist es möglich, dass MPPA bei der Konkurrenz um Calcium und Magnesium wirksamer ist, wenn das LPS auf gramnegativen Bakterien keine O-Seitenketten besitzt.

Beispiel 2: Wirkung von Phospholipiden auf grampositive Bakterien

Wirkung von MPPA mit Antibiotika gegen S. aureus

Da viele antibiotikaresistente grampositive Bakterien zur Zeit die Ursache von vielen im Krankenhaus erworbenen Infektionen sind, wurde MPPA auf Methicillin-verstärkende Aktivität gegen drei Methcillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus, die aus infizierten Patienten isoliert worden waren, hin untersucht. Überraschenderweise tötete MPPA alleine alle drei Stämme ab (Tabelle 14).

Wirkung von MPPA auf das Wachstum

Die Daten in Tabelle 15 zeigen auch, dass MPPA alleine als antimikrobielles Mittel wirkt. Sowohl der Methacillin-resistente Staphylococcus als auch der Vancomycin-resistente Enterococcus werden durch das Lipid abgetötet, obwohl dass Anzuchtmedium ein gutes Wachstumspotential für die Bakterien bereitstellt, wie man dadurch sieht, dass S. aureus bis zu 7,0 · 10&sup9; und Enterococcus bis zu 4,0 · 10&sup8; hochwächst.

Wirkung von DPG und DPPA auf das Wachstum

Andere Lipide, wie DPG und DPPA hatten bei den verwendeten Konzentrationen keine Wirkung auf das Wachstum grampositiver Bakterien (Tabelle 16). Man könnte vermuten, dass höhere Dosen verwendet werden sollten, oder dass nur eine Fettsäurekette für die antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien erforderlich ist.

Wirkung von DPPC und MPPC auf das Wachstum

DPPC und MPPC wurden auf ihre antimikrobielle Aktivität gegen Methycillinresistenten S. aureus und Vancomycin-resistenten Enterococcus gallinarum hinuntersucht. In beiden Fällen hatte DPPC keine antimikrobielle Aktivität, wogegen MPPC beide Mikroorganismen abtötete (Tabellen 17 und 18). Hier ist von Interesse, dass sowohl MPPA als auch MPPC gegen grampositve Bakterien wirksam sind, wogegen nur MPPA gegen gramnegative Bakterien wirksam ist. Wie unten gezeigt wird, scheint es so, dass MPPA auf gramnegative Bakterien wirkt, indem es Calcium und Magnesium bindet. Von MPPC würde man nicht annehmen, dass es diese Kationen bindet, da es nicht negativ geladen ist. Daher scheint es so, dass Phospholipide auf gramnegative und grampositive Bakterien über unterschiedliche Mechanismen wirken.

Beispiel 3: Hinweise auf den Mechanismus in gramnegativen Bakterien

Chelatierung von Calcium und Magnesium

Es ist bekannt, dass Phospholipide eine Affinität für Calcium und Magnesium besitzen (Gennis, R.B., 1989) und es wurde vorgeschlagen, dass beide von Bedeutung für die Membranstabilität sind. Um zu bestimmen, ob MPPA Calcium binden kann und dadurch PAO1 empfindlich gegenüber Ampicillin machen kann, wurden verschiedene unterschiedliche Experimente durchgeführt. Zuerst wurde die Zugabe von Calciumchlorid (mit Endkonzentrationen von 200 uM und 400 uM) zu mit MPPA (570 ug/ml) vorinkubierten Überständen durchgeführt. Während MPPA die Aktivität von Ampicillin gegen P. aeruginosa PAO1 noch steigerte, wenn die Calciumkonzentration auf 200 uM erhöht wurde, ging die. MPPA-Steigerung der Aktivität von Ampicillin verloren, wenn die Calciumkonzentration auf 400 uM erhöht wurde (Tabelle 19). Zweitens wurde die. Zugabe von MPPA bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml, die Inkubation bei 37ºC für 4 Stunden, die Abzentrifugation von jeglichem ungelösten MPPA und dann die Zugabe von 400 uM Calcium durchgeführt. Bei der Zugabe von Calcium bildete sich eine sichtbarer weißer Niederschlag, was vermuten läßt, dass sich ein Calcium-Phospholipidkomplex gebildet hatte. Unter diesen Bedingungen war die Aktivität von Ampicillin gegen P. aeruginosa immer noch steigert (Tabelle 19).
Die Zugabe von Magnesium kehrte die MPPA-Steigerung der Aktivität von Ampicillin nicht in gleichen Ausmaß wie Calcium um (Tabelle 20). Das heißt, P. aeruginosa wurde bei Anwesenheit von MPPA, Ampicillin und zusätzlichen 200 uM Magnesium immer noch abgetötet und wuchs nicht bei Anwesenheit von MPPA, Ampicillin und zusätzlichen 400 uM Magnesium (Tabelle 20). Die Daten der Tabelle 20 legen nahe, dass MPPA sowohl Calcium als auch Magnesium bindet und dadurch die äußere Membran von P. aeruginosa destabilisiert (zusammengefaßt in Hancock, R.E.W. 1997, Nikaido, H. 1996 und Vaara, M. 1992). Zur Unterstützung dieser Ansicht wurde gefunden, dass, wenn die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen in MPPA-Überständen bestimmt wurden, MPPA die Konzentration von Calcium 4-5-fach (Tabelle 21) und Magnesium zwischen 10- und 20-fach (Tabelle 22) in Abhängigkeit der Konzentration an MPPA im Überstand verminderte.

Beispiel 4: Wirkung von MPPA gegen Augenhornhautinfektionen in Mäusen

Augenhornhautinfektionen in Mäusen wurden unter Verwendung des Modells, das durch Preston et al., 1995 beschrieben wurde, durchgeführt. Kurzgefasst wurden männlichen CD-1-Mäusen, die von den Charles River Breeding Laboratories (Wilmington, MA) bezogen wurden, intraperitoneale Injektionen von 0,2 ml einer Lösung, die 6,7 mg Ketaminhydrochlorid und 1,3 mg Xylazin enthielt, verabreicht. Nachdem die Mäuse betäubt worden waren, wurden drei 1 mm-lange Kratzer in das Hornhautepithel und das Oberflächenstroma jeder Maus mit einer 27er Nadel gemacht. Eine Kultur von P. aeruginosa PAO1, die bei 37ºC in L-Nährmedium über Nacht angezogen und mit frischem L- Nährmedium gewaschen worden war, um extrazelluläre Produkte zu entfernen, wurde verwendet, um die Mäuse zu infizieren. Jede Maus wurde sofort in das zerkratzte Auge mit 5 · 10&sup7; cfu P. aeruginosa PAO1 (5 ul einer Kultur von 1 · 10¹&sup0; cfu/ml) beimpft. Dreissig Minuten später wurden die zerkratzten Augen eines Satzes an Mäusen mit 5 ul sterilem L- Nährmedium gewaschen, die zerkratzten Augen eines zweiten Satzes an Mäusen wurde mit 5 ul sterilen L-Nährmedium, das MPPA (570 ug/ml Überstand) enthielt, gewaschen, die zerkratzten Augen eines dritten Satzes an Mäusen wurden mit 5 ul sterilem L-Nährmedium, das Ampicillin (500 ug/ml) enthielt, gewaschen und die zerkratzten Augen eines vierten Satzes an Mäusen wurde mit 5 ul sterilen L-Nährmedium, das MPPA (570 ug/ml Überstand) und Ampicillin (500 ug/ml) enthielt, gewaschen. Die Waschungen wurden zweimal in 5- stündigen Intervallen wiederholt und die gesamte Serie an drei Waschungen pro Tag wurde für 4 Tage wiederholt, zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse auf Infektionen und Hornhautundurchsichtigkeit hin beurteilt. Wie in Tabelle 23 gezeigt wird, führte die Waschung mit MPPA und Ampicillin zu weniger Augeninfektionen als die Waschung mit jeder Verbindung alleine oder mit sterilem L-Nährmedium. Tabellen Tabelle 1. Tabelle 2. Tabelle 3. Tabelle 3. (Fortsetzung) Tabelle 4. Tabelle 5. Tabelle 5. (Fortsetzung) Tabelle 6. Tabelle 7. Tabelle 7. (Fortsetzung) Tabelle 8. Tabelle 9. Tabelle 10. Tabelle 10. (Fortsetzung) Tabelle 11. Tabelle 11. (Fortsetzung) Tabelle 12. Tabelle 13. Tabelle 13. (Fortsetzung) Tabelle 14. Tabelle 15. Tabelle 16.

Tabelle 17.

Wirkung von DPPC und MPPC auf das Wachstum von S. aureus MRSA#988

Phospholipid (Konzentration (mg/ml)) 18 Std. cfu/ml

Ohne 7.6 · 10&sup9;
DPPC (1000) 6.6 · 10&sup9;
MPPC (675) 4.0 · 10¹
Impfmaterial 5.0 · 10&sup4; cfu/ml

Tabelle 18.

Wirkung von DPPC und MPPC auf das Wachstum von Enterococcus gallinarum VRE MB4174 von C-1

Phospholipid (Konzentration (mg/ml)) 18 Std. cfu/ml

Ohne 5.8 · 10&sup8;
DPPC (1000) 1.1 · 10&sup9;
MPPC (675) < 10
Impfmaterial 1.8 · 10³ cfu/ml Tabelle 19.
a Die Kulturen wurden mit 1,5 · 10&sup4; cfu/ml beimpft Tabelle 19. (Fortsetzung)
a Die Kulturen wurden mit 1,5 · 10&sup4; cfu/ml beimpft
b Dem 2 mg/ml-Überstand wurde Calciumchlorid (400 uM) zugegeben. Es bildete sich ein zweiter Niederschlag, der durch Zentrifugation vor dem Beimpfen entfernt wurde. Tabelle 20.
a Magnesium wurde als Magnesiumchlorid zugefügt.
b Die Kulturen wurden mit 3,1 · 10³ cfu/ml beimpft Tabelle 21.
a Nach der Zentrifugation verbleibendes Ca&spplus;&spplus;, die Gesamt-Ca&spplus;&spplus;-Konzentration wunde unter Verwendung eines Beckman SYNCHRON EL-ISE-Elektrolytsystems gemessen. Die Natrium-, Kalium-, und Chloridkonzentrationen blieben konstant bei 103 mM beziehungsweise 7,5 mM und 94 mM.

Tabelle 22.

Magnesiumkonzentrationen in den Überständen des L-Nährmediums, das MPPA enthielt.

Zugefügtes MPPA (mg/ml) Verbleibendes Mg&spplus;&spplus; (uM)a

Ohne 225
0.10 200
0.57 29
2.0 13
a Nach der Zentrifugation verbleibendes Mg&spplus;&spplus;, die Gesamt-Mg&spplus;&spplus;-Konzentration wurde unter Verwendung eines Beckman SYNCRON-CX-7-Autoanalysegeräts gemessen.

Tabelle 23.

Wirkung von MPPA auf Augeninfektionen mit P. aeruginosa PAO1 in Mäusen.

Behandlung # Infiziert/# Beimpft

Ohne 6/6
Ampicillin 6/6
MPPA 4/6
MPPA + Ampicillin 3/6
MPPA-Konzentration 570 ug/ml
Ampicillinkonzentration 500 ug/ml
Die Infektionen der Mäuse wurden 4 Tage nach der Beimpfung beurteilt. Eine Maus wurde als infiziert angesehen, wenn das Auge relativ zu einem normalen Auge getrübt erschien.

Claims

1. Kombination von

a) einer Substanz mit der allgemeinen Formel (I):

worin Z einen Phosphor- oder Schwefeloxysäurerest darstellt;

einer der Reste R&sub1; und R&sub2; eine Hydroxygruppe und der andere der Reste R&sub1; und R&sub2; einen gesättigten oder ungesättigten Fettsäurerest mit mindestens 7 C-Atomen darstellt und R&sub3; ein Wasserstoffatom darstellt; und

b) einem antimikrobiellen Wirkstoff zur Verwendung als Medikament.

2. Kombination nach Anspruch 1, wobei der antimikrobielle Wirkstoff ausgewählt ist aus den folgenden Klassen: β-Lactamen, Vancomycin und deren Arzneistoffe der zweiten Generation, Monobactamen, Tetracyclinen, Chloramphenicol, Aminoglycosiden, Polymyxinen, Erythromycinen, Lincomycinen, Sulfonamiden, Trimethroprim, Chinolonen, Novobiocin, Pyrimethamin und Rifampin.

3. Kombination nach Anspruch 1 oder 2, worin Z

ist.

4. Kombination nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R&sub1; oder R&sub2; ein Fettsäurerest mit 12, 13, 14, 15 oder 16 Kohlenstoffatomen ist.

5. Kombination nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R&sub2; eine Hydroxygruppe darstellt.

6. Verwendung einer Kombination gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Medikaments mit einem synergistischen antimikrobiellen Effekt zur Behandlung eines Tieres mit einer bakteriellen Infektion.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Infektion mit Brandwunden, Ulcus cruris oder Akne in Zusammenhang steht.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Substanz als Paste formuliert ist.

9. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Infektion mit einer Augeninfektion, Periodontitis, Otitis, Mundinfektion oder Halsinfektion in Zusammenhang steht.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Substanz als Flüssigkeit formuliert ist.

11. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Infektion mit einer Lungeninfektion in Zusammenhang steht.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Substanz als Inhalationsdampf formuliert ist.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, wobei das Tier ein Säuger ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Tier ein Mensch ist.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, wobei das Tier ein Nutztier ist.