DE69633952T2

DE69633952T2 - Konjugate von Faktor IX und einem biologisch verträglichen Polymer

Info

Publication number: DE69633952T2
Application number: DE69633952T
Authority: DE
Inventors: Johanna Röstin; Helena Sandberg; Anna-Lisa Smeds; Eva Akerblom
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2016-09-28
Also published as: DE69633952D1; ZA968139B; ES2238522T3; EP0871649A1; NZ319322A; AU706246B2; ES2187676T3; JP3911023B2; PT871649E; NO981408D0; HU221208B1; EP0871649B1; US6048720A; EP1260582A1; ATE228531T1; PT1258497E; DE69634373D1; CA2231801C; NO321096B1; ATE283351T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der in-vivo-Funktion eines Polypeptids durch Schützen von exponierten Targets des Polypeptids durch Immobilisieren des Polypeptids an einem gruppenspezifischen Adsorptionsmittel, welches Liganden trägt, hergestellt durch organisch-chemische Synthese, Aktivieren des biokompatiblen Polymeren, Konjugieren des so aktivierten biokompatiblen Polymeren an dem immobilisierten Polypeptid und danach Eluieren des Konjugats von dem Adsorptionsmittel. Speziell ist das Polypeptid Faktor IX.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist allgemein bekannt, dass die in-vitro-Stabilität und in-vivo-Halbwertszeit von Polypeptiden erhöht werden kann durch kovalente Bindung von biokompatiblen Polymeren (im nachfolgenden als Konjugation oder Modifikation bezeichnet). Die Modifizierung der Polypeptidoberfläche weist ebenfalls den Vorteil der Senkung der von dem Polypeptid gezeigten Immunogenizität auf.
Die Pegylierung, d. h. die Kupplung von verschiedenen Polyethylenglykolen (PEG) an ein Polypeptid, ist eine Technik, die in breitem Umfang zur Steigerung der in-vitro-Stabilität und in-vivo-Halbwertszeit von zum Beispiel Proteinen zur Anwendung kommt. Bei der Pegylierung sind viele Techniken im Verlauf der Jahre vorgeschlagen worden. Bezug genommen wird hier auf Zalipsky, S. et al. in Poly(Ethylene Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York (1992) und Katre N. V., Adv. Drug Deliv., 10, 91–114 (1993).
Für einige Polypeptide wurde ein Verlust an Aktivität oder Funktion als Folge dieser Konjugation festgestellt, ein Effekt, welcher durch den Grad der Modifizierung zunimmt (Inada, Y. et al., Trends in Biotechnology, 13, 86–91 (1995)). Verfahren wurden entwickelt, um das Kuppeln selektiver zu machen, um dieses Problem zu umgehen. Es wurde zum Beispiel die Site-directed-Mutagenese für rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) angewendet. Ein spezifisches Target kann kreiert werden durch Insertion eines Cysteins (Goodson, R. J. und Katre, N. V. Bio/Technology 8, 344–346 (1990); Katre 1993, siehe oben). Ein solcher Weg ist nicht allgemein für therapeutische Proteine anwendbar, da die Aminosäuresubstitution die ursprünglichen Charakteristika des Moleküls verändern kann, und deshalb ist er fragwürdig. Alternativ kann das Polymer hin zu glykosylierten Stellen eines Proteins gerichtet werden, zum Beispiel Faktor IX, wie in der WO 94/29370 (Enzon) beschrieben. Dies involviert jedoch die Oxidation der Kohlenhydratreste, welche erreicht werden kann durch die Umsetzung des Glykoproteins mit Natriumperiodat oder enzymatisch durch Galaktoseoxidase. Diese Bedingungen sind häufig für das Molekül schädlich.
In diesem besonderen Fall waren die glykolysierten Stellen, welche für die Konjugation beabsichtigt waren, an einer Faktor-IX-Peptidsequenz lokalisiert, welche während der proteolytischen Aktivierung in-vivo entfernt wird. Somit beeinflusst das biokompatible Polymer nicht die Funktion des aktiven Polypeptids.
In der WO 94/13322 (Farmitalia Carlo Erba) wird gezeigt, dass die Pegylierung durchgeführt werden kann ohne Verschlechterung der Funktion von bestimmten Stellen, die für die Funktion des besonderen Proteins essentiell sind ("erste Substanz"). Dies wird erreicht durch das Schützen der Stellen durch das Kontaktieren der ersten Substanz mit einer zweiten Substanz, welche speziell an den Stellen bindet. Besonders wird die Pegylierung durchgeführt durch Immobilisieren des besonderen Proteins auf einem Harz mit Liganden mit spezifischer Affinität zu dem Protein. Zweite Substanzen sind zum Beispiel komplementäre biologische Moleküle. Beispiele von Paarungen, welche in der WO 94/13322 beschrieben sind, sind Antikörper (erste Substanz) – korrespondierendes Antigen (zweite Substanz); spezifischer Inhibitor (erste Substanz) – Enzym (zweite Substanz); Wachstumsfaktor (erste Substanz) – entsprechender Rezeptor (zweite Substanz), oder das umgekehrte von jedem dieser Paarungen.
Bei einem für die pharmazeutische Produktion gewünschten Verfahren ist es jedoch vorteilhaft, wenn die Verwendung von Substanzen mit biologischer Komplexität auf einem Minimum gehalten werden kann. Dies ist primär durch die strengen Anforderungen nach einer Dokumentation bezüglich der biochemischen Homogenität und der Sicherheit bezüglich der Verwendung der Substanzen bedingt. Deshalb wäre die Verwendung von Affinitätsliganden, die durch organischchemische Synthese produziert werden, vorteilhaft.
Die DE 37 17 210 betrifft ein Verfahren zur Modifizierung von Biopolymeren, vorzugsweise ladungstragenden Biopolymeren, durch Immobilisieren des Biopolymeren auf zum Beispiel einem Ionenaustauschadsorbens, das Umsetzen des Biopolymeren mit Reagenzien, z. B. Enzymen oder anderen biochemischen Reagenzien, zum Erhalt eines Reaktionsproduktes und nachfolgendes Desorbieren des Reaktionsproduktes von dem Adsorbens. Das Reaktionsprodukt ist vorzugsweise eine Nukleinsäure, die mit einem Restriktionsenzym gespalten wurde. In der DE 37 17 210 wird der adsorbierte Zustand des Biopolymeren genutzt, um das Biopolymer an Reagenzien besser zu exponieren, wodurch die Effizienz der Modifizierung erhöht wird. Es gibt keinen Hinweis auf das Schützen von exponierten Targets, noch einen Zweck des Erhalts der Aktivität des Biopolymeren, welches bezüglich einer Funktion des Biopolymeren in-vivo von Vorteil wäre. Die Erfindung der DE 37 17 210 zielt bloß auf die Kartierung (Mapping) von Eigenschaften von Biomolekülen, wie Nukleinsäuren, ab, wobei die ursprüngliche Charakteristik verändert wird durch aktuelle Prozessierung oder Steigerung der Anzahl an funktionellen Einheiten des Makromoleküls, wie ein Einbau von radioaktiven Isotopen.
Viele Proteine, welche für den therapeutischen Einsatz beabsichtigt sind, wurden konjugiert, gängigerweise durch die Verwendung von verschiedenen Pegylierungstechniken (Francis, G. E. et al., in Stability of Protein Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3, 235–263 (1992); Inada, Y. et al., Trends in Biotechnology, 13, 86–91 (1995)). Die meisten Beispiele betreffen die intravenöse Verabreichung. Gleichwohl wurde die Aufnahme nach subkutaner Verabreichung an Plasma, Lunge, Leber und Milz von einigen mPEG-konjugierten Allergenen beschrieben, und eine Immunotherapie mit mPEG-konjugierten Allergenen, welche subkutan gegeben wurden, hat sich als wirksam herausgestellt (Dreborg, S. und Åkerblom, E. B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315–365 (1990)). Ebenfalls wurde eine intramuskuläre Verabreichung in klinischen Versuchen von Adenosindeaminase angewandt (Hershfield, M. S. et al., New Eng. J. Med. 316, 589–596 (1987). Von der Pegylierung wurde in einigen wenigen Fällen beansprucht, dass sie für die orale Route vorteilhaft wäre. Somit wurde die Pegylierung von IgG zur oralen Verabreichung in der EP-A-0 614 373 von der Mount Sinai School of Medicine offenbart. Die Pegylierung vom Faktor VIII und Faktor IX zur oralen Verabreichung wurde in Sakuragawa et al., Acta Med. Biol., 34(3), 77–84 (1987) und in der japanischen Patentanmeldung Nr. 44509/83 von Nippon Chemifar Company offenbart.
Der Faktor IX ist das Proenzym des oben beschriebenen Faktors IXa. Es ist eine Serinprotease und ist eines der Vitamin K-abhängigen Koagulationsproteine. Die Molekülmasse beträgt etwa 55 kDa (DiScipio et al., 1977, Biochemistry, 16, S. 698). Der Faktor IXa wechselwirkt speziell mit anderen Komponenten, welche bei der Faktor X-Aktivierung teilnehmen (In: Haemostasis and Thrombosis, 1994, Band 1, dritte Ausgabe, herausgegeben von Bloom A. et al.).
In den meisten Kupplungstechniken reagiert das Polymerreagens mit ε-Aminogruppen von Lysinresten des Polypeptids. Diese werden häufig über die Polypeptidoberfläche verteilt und können sehr gut zu einer Konjugation in der Nähe einer funktionellen Stelle führen. Als eine Folge wird häufig durch statistisches Kuppeln die Aktivität oder Funktion gestört. Es ist unsere Erfahrung, dass wenn solche Techniken bei sehr reinen Präparationen zur Anwendung kommen, wie bei einem B-Domäne-deletierten rekombinanten Faktor VIII mit Koagulanzaktivität, diese Aktivität drastisch schon bei einem Modifizierungsgrad von etwa 5 mPEG/Faktor VIII-Molekül verringert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben herausgefunden, dass die spezifische Aktivität von konjugierten Polypeptiden auf hohem Grad gehalten werden können, lediglich durch Immobilisieren des Polypeptids auf einem gruppenspezifischen Adsorbens vor der Kupplungsreaktion, welche von einer Desorption des Konjugats durch herkömmliche Techniken gefolgt wird. Dies ist ziemlich überraschend, da früher angenommen wurde, dass die Verwendung von Adsorbentien mit spezifischen Bindungseigenschaften in bezug auf das in Frage stehende Polypeptid es sentiell ist, um einen Schutz von gewissen Domänen, welche für die biologischen Funktionen wichtig sind, zu erreichen.
Der Vorteil der Modifizierung biokompatibler Polymere hängt häufig von dem Grad der Modifizierung ab. So ist ein hoher Grad an Modifizierung, d. h. eine hohe Anzahl von biokompatiblen Polymeren pro Polypeptidmolekül, für gewöhnlich für einen effizienten Schutz gegenüber proteolytischer Aktivität erforderlich. Mit der Hilfe der vorliegenden Erfindung, bei der die biokompatiblen Polymere selektiver eingeführt werden, wurde die spezifische Aktivität besser beibehalten.
Die Verwendung von gruppenspezifischen Adsorptionsmitteln gemäß der vorliegenden Erfindung ist wirtschaftlich günstiger im Vergleich zu den Adsorptionsmitteln, die im Stand der Technik beschrieben sind. Die Verwendung von gruppenspezifischen Adsorptionsmitteln wird ebenfalls die Registrierung der Konjugate als therapeutische Mittel erleichtern.
Das vorliegende Verfahren macht es möglich, die in-vivo-Funktion von Polypeptiden zu verbessern, insbesondere durch Verbesserung der pharmakokinetischen Funktion, einschließlich der Bioverfügbarkeit, und durch Reduzieren der durch die Polypeptide gezeigten Immunogenität.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der in-vivo-Funktion eines Polypeptids durch das Abschirmen exponierter Targets von Faktor IX durch

a) das Immobilisieren des Polypeptids durch Wechselwirkung mit einem gruppenspezifischen Adsorptionsmittel, welches Liganden trägt, hergestellt durch organisch-chemische Synthese;
b) das Aktivieren eines biokompatiblen Polymers;
c) das Konjugieren des aktivierten biokompatiblen Polymers an das immobilisierte Polypeptid; und danach
d) das Eluieren des Konjugats vom Adsorptionsmittel.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck Wechselwirkungsstelle auf verschiedene Stellen, die für die biologische Funktion des bestimmten Polypeptids wesentlich sind.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck exponierte Targets auf externe Stellen auf dem betreffenden Polypeptid, welche für unerwünschte Reaktionen in-vivo zugänglich sind. Beispiele für exponierte Targets schließen antigene Epitope und Stellen für eine proteolytische Spaltung ein. Bestimmte Stellen für die proteolytische Spaltung werden somit als Wechselwirkungsstellen bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, zu einem bisher unerreichbaren Ausmaß, den Einfluss von unerwünschten Reaktionen in-vivo zu senken, z. B. proteolytische Spaltung und mögli che Aggregation, während gleichzeitig die Wechselwirkungsstellen, welche für die biologische Funktion des Polypeptids fundamental sind, unbeeinflusst bleiben. Genauer gesagt, werden durch Immobilisierung des Polypeptids durch Wechselwirkung mit einem gruppenspezifischen Adsorbens, welche durch organisch-chemische Synthese hergestellte Liganden tragen, die Wechselwirkungsstellen auf dem Polypeptid von der Konjugation an dem biokompatiblen Polymer ausgeschlossen. Ferner werden durch Konjugieren des aktivierten biokompatiblen Polymers mit dem Polypeptid an den gewünschten externen Stellen die exponierten Targets von der Wirkung von z. B. Proteasen abgeschirmt.
In der vorliegenden Anmeldung beziehen sich Polypeptide auf Proteine und Oligopeptide mit mindestens 20 Aminosäuren in der Kette. Die Anzahl von Aminosäuren des gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Polypeptids liegt geeigneterweise im Bereich von 30 bis 4 500 Aminosäuren, und vorzugsweise im Bereich von 40 bis 3 000 Aminosäuren. Die Polypeptide können vom Säuger-, spezieller menschlichem Ursprung sein und durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt sein. Polypeptide, welche gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können, schließen Polypeptide ein, welche Koagulanzaktivität zeigen oder eine unterstützende Funktion zur Koagulation haben. Die Polypeptide können von voller Länge sein, d. h. die Sequenz an Aminosäuren ist mit der entsprechenden Sequenz identisch, die allgemein in Säugern und im speziellen im Menschen gefunden werden. Die Polypeptide können ebenfalls Deletionsderivate von Polypeptiden mit voller Länge sein, wobei eine oder mehrere Aminosäure fehlen. Das Polypeptid ist geeigneterweise der Koagulationsfaktor IX.
Das biokompatible Polymer der vorliegenden Erfindung kann aus der Gruppe gewählt werden, die aus Hompolymeren, Copolymeren oder Blockcopolymeren von Monoalkyl-verkappten Polyalkylenoxiden besteht. Die biokompatiblen Polymere können gerade oder verzweigt sein. Das Monoalkyl-verkappte Polyalkylenoxid wird geeigneterweise aus der Gruppe gewählt, die aus Polyethylenglykol-Homopolymeren und Polypropylenglykol-Homopolymeren besteht. Das biokompatible Polymer ist vorzugsweise ein Polyethylenglykol (PEG)-Homopolymer. Das Molekulargewicht des PEG kann im Bereich von etwa 300 bis zu 20 000, geeigneterweise im Bereich von 1 500 bis zu 10 000 und vorzugsweise im Bereich von 3 000 bis zu 5 000 liegen.
Das biokompatible Polymer sollte an einem Ende endverkappt sein, um eine Kreuzderivatisierung zu vermeiden. Beispiele für Gruppen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind gerade oder verzweigte Niederalkoxygruppen, vorzugsweise die Monomethoxygruppe. Ein besonders bevorzugtes biokompatibles Polymer in der vorliegenden Erfindung ist Monomethoxypolyethylenglykol (mPEG) Andere biokompatible Polymere sind ebenfalls denkbar, z. B. Dextran, Polyvinylpyrrolidon und DL-Aminosäuren.
Das biokompatible Polymer muss vor der Kupplungsreaktion aktiviert werden, um die Bildung von kovalenten Bindungen möglich zu machen. Für diesen Zweck sollte das Ende des biokompatiblen Polymers, welches dem Polypeptid gegenübersteht, an eine Hydroxylgruppe gebunden sein, die für eine Aktivierung zugänglich ist. Es gibt verschiedene Wege der Aktivierung des biokompatiblen Polymers in Abhängigkeit von der für das kovalente Binden gewählten Aminosäure. Geeignete mPEG-Derivate zur Kupplung an Aminogruppen sind mPEG-Succinimidylsuccinat, mPEG-Succinimidylsuccinamid, mPEG-Succinimidylpropionat, Succinimidylcarbonat vom mPEG, Succinimidylester vom carboxymethylierten mPEG, mPEG-Oxycarbonylimidazol, mPEG-Nitrophenylcarbonate, mPEG-Trichlorphenylcarbonat, mPEG-Tresylat (das letztere ist von Nilsson K., Mosbach K., Methods in Enzymology, Band 104, Seiten 56–69 (1984)) beschrieben worden, (alle erwähnten Reagenzien werden von der Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA, vermarktet), mPEG-Maleinsäureanhydrid und mPEG-Methylmaleinsäureanhydrid (Garman A., Kalindjian S. B., FEB Band 223; 2, Seiten 361–365) und gemischte Anhydride vom mPEG-Succinat, mPEG-Essigsäure bzw. mPEG-Propionsäure (Dreborg S. und Akerblom E., siehe oben).
Cysteinreste können mit mPEG-Maleimid, mPEG-Vinylsulfon und mPEG-Orthopyridyldisulfid (vermarktet von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA) konjugiert werden. Geeignete Reagenzien im Fall der Konjugation der Guanidinogruppe von Arginin sind mPEG-Derivate von Phenylglyoxal (Zalipski, siehe oben).
Kohlenhydrate müssen zuerst oxidiert werden, so dass Aldehydgruppen vorliegen, und dann können sie mit mPEG-Hydrazid (Zalipski, siehe oben) konjugiert werden.
Die Kupplungsprozedur wird bei einem pH durchgeführt, der für die zu konjugierende Aminosäure geeignet ist. Berücksichtigung muss auch der pH-Wert finden, welcher für das Polypeptid als Ganzes geeignet ist, sowie die pH-Abhängigkeit der Reaktivität des biokompatiblen Polymers. Normalerweise liegt der pH-Wert zum Kuppeln im Bereich von etwa 7 bis etwa 8, wobei die untere Grenze so gesetzt ist, dass eine ausgedehnte Kupplungsprozedur vermieden wird, und die obere Grenze so gesetzt wird, dass milde Bedingungen für das Polypeptid herrschen. Der obige pH-Bereich ist geeignet bei der Lysine involvierenden Konjugation. pH-Werte außerhalb dieses Bereiches können in einigen Fällen ebenfalls geeignet sein. Somit werden Konjugationen, die Cysteine involvieren, geeigneterweise bei einem pH-Wert unter etwa 7 durchgeführt, wohingegen Arginine in geeigneter Weise bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 9,3 konjugiert werden.
Die Kupplungsprozedur sollte bei einer Temperatur oberhalb 0°C, geeigneterweise im Bereich von etwa 5 bis etwa 40°C, und vorzugsweise im Bereich von 10 bis 30°C durchgeführt werden. Erneut muss der Temperatur Berücksichtigung geschenkt werden, die für das Polypeptid als Ganzes geeignet ist, sowie dem Einfluss der Temperatur auf die Reaktivität des biokompatiblen Polymers. In den Beispielen der vorliegenden Anmeldung wurden alle Kupplungsschritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Adsorptionsmittel ist gruppenspezifisch in bezug auf das zu immobilisierende Polypeptid. Gruppenspezifische Adsorptionsmittel besitzen Affinität gegenüber mehreren Polypeptiden. Ferner binden sie weniger stark, und eine Elution kann unter milderen Bedingungen als mit monospezifischen Adsorptionsmitteln durchgeführt werden, wobei die letzteren an ein einzelnes oder an eine sehr kleine Anzahl von Polypeptiden binden. Beispiele für geeignete gruppenspezifische Adsorptionsmittel sind in Jansson, J. -C. et al., Protein Purification, Principles. High Resolution Methods, and Applications, VCH Publishers, Seiten 274–285 (1989) angeführt, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Das Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass es Liganden trägt, welche durch organisch-chemische Synthese hergestellt sind. Beispiele für Adsorptionsmittel, welche diese Kriterien erfüllen, sind Chromatographieharze, die allgemein für die Adsorption von Proteinen verwendet werden, z. B. biokompatible Matrizes, an welchen Liganden die anionische und kationische Austauschergruppen, Sulfhydrylgruppen, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie(IMAC)-Gruppen, gerade oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffketten und aromatischen Gruppen gekoppelt worden sind. Brauchbar sind ebenfalls Liganden mit gemischter Funktion, zum Beispiel mit sowohl ionischen als auch hydrophoben Teilen, wie Aminoalkyl- oder Dimethylaminopropylcarbamylpentyl. Ein bevorzugtes Beispiel eines Aminoalkyls ist Aminohexyl. Liganden mit höherer Komplexität sollten ebenfalls verwendet werden, wie Peptide oder Phospholipide, hergestellt durch organisch-chemische Synthese. Für jene im Fachbereich Erfahrenen schließen die Gruppenaffinitätsliganden, welche durch organisch-chemische Synthese hergestellt werden, eine große Vielzahl von Substanzen ein. So haben sich reaktive Triazin-basierte Textilfarbstoffe als Adsorptionsmittel für mehrere Enzyme, wie Kinasen und Hydrogenasen, als brauchbar erwiesen. Ebenfalls sind Zuckerderivate, Nukleotide und Peptide und Analoge davon und hergestellt durch organisch-chemische Synthese brauchbar (Dechow, F. J., Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications, Park Ridge, NJ, USA, S. 440–443 (1989)).
Liganden, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind ferner anionische Austauschgruppen, vorzugsweise starke, wie quaternäres Aminoethyl (QAE), Trimethylaminoethyl (TMAE) oder quaternäres Aminomethyl (Q), stärker bevorzugt quaternäres Aminomethyl (Q). Die Liganden können ferner eng an die Matrix gekoppelt werden, oder mit einem Spacer, wie Alkylamin, Hexylamin, Diaminodipropylamin, Ethylaminsuccinamid (Persson & Lagerström, in Packings and stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K. K., hrsg., Marcel Decker Inc. 1990, S. 754), oder mit einer verzweigten Tentakel, an welche die Liganden gebunden sind (ein geeignetes Beispiel ist Fractogel^TM EMD, hergestellt von Merck von Deutschland).
Nach der Kupplungsprozedur wird das konjugierte Polypeptid durch herkömmliche Techniken eluiert. In diesem Kontext ist es wesentlich, dass physiko-chemische Bedingungen berücksichtigt werden, um einen Abbau der konjugierten Polypeptide zu vermeiden. Wenn somit die Kupplungsroute eine Konjugationsbindung involviert, welche innerhalb eines bestimmten pH-Bereiches labil ist, sollte dieses vermieden werden.
Bei der Kupplungsprozedur, wenn das Polypeptid auf dem Adsorbens immobilisiert wird, kann das Polypeptid mit einem löslichen Blockiermittel kontaktiert werden, und zwar mit dem Zweck der Ausschließung von zusätzlichen Stellen von einer Konjugation. Ein solches Blockiermittel sollte durch organisch-chemische Synthese hergestellt werden, und zusätzlich konjugiert werden an einem beliebigen der oben identifizierten Liganden, gebunden an einem Polymer, gewählt aus z. B. Monoalkyl-verkappten Polyalkylenoxiden, Copolymeren oder Blockcopolymeren von Polyalkylenoxiden, Polyethylenglykol-Homopolymeren oder Polypropylenglykol-Homopolymeren. Das Blockiermittel kann ebenfalls Einheiten tragen, welche eine spezifische Affinität für das Polypeptid aufweisen.
Nach der Elution wird das kontaktierte lösliche Blockiermittel durch Anwendung von geeigneten chemischen Bedingungen desorbiert. Wenn zum Beispiel das Blockiermittel durch hydrophobe Wechselwirkung adsorbiert wurde, könnte es durch Senkung der Ionenstärke desorbiert werden, oder einfach durch Senkung der Temperatur. Das lösliche Blockiermittel wird danach von dem Konjugat durch Gelpermeationschromatographie unter herkömmlichen Bedingungen abgetrennt.
Die Matrix des Adsorptionsmittels in der vorliegenden Erfindung kann jedwedes kommerzielle Harz sein, welches dafür bekannt ist, mit biologischen Molekülen kompatibel zu sein. Somit kann die Matrix aus verschiedenen stark hydrophilen Matrizes, z. B. Agarosematrizes, wie eine große Vielzahl von Sepharose^TM-Matrizes, vertrieben von der Pharmacia Biotech von Uppsala, Schweden, organischen Polymermatrizes wie TSK-GELa, vertrieben von Tosoh Corp. von Tokyo, Japan, oder hochporösen organischen Polymermatrizes, vertrieben von Per Septive Biosystems von Boston, USA, gewählt werden. Membranmatrizes sind ebenfalls geeignet, z. B. Sartobind^TM, vertrieben von Sartorius von Deutschland und MemSep^TM, vertrieben von Millipore aus der USA. Die Matrix ist vorzugsweise eine Agarosematrix. Geeignete Agarosematrizes in der vorliegenden Erfindung sind abgesehen von Sepharose^TM, Minileak^TM, vertrieben von Kem-EnTec A/S von Kopenhagen, Dänemark, und Bio-Gel A, vertrieben von Bio-Rad, von Brüssel, Belgien. Vorzugsweise ist die Matrix quervernetzt, was einen schnellen Fluss (FF) ermöglicht, und dadurch eine hohe Produktionskapazität. Stärker bevorzugt wird die Chromatographie der vorliegenden Erfindung auf einem Q Sepharose^TM-FF-Gel durchgeführt. Ferner können Harze, die aus Copolymeren von Oligoethylenglykol, Glycidylmethacrylat und Pentaerythroldimethacrylat bestehen, wie Fractogel^TM (vermarktet von Merck aus Deutschland), Cellulose und poröses Glas, ebenfalls zum Vorteil eingesetzt werden.
Die Konjugate eines Polypeptids und eines biokompatiblen Polymeren, welche durch das vorliegende Verfahren erhältlich sind, sind neu. Mit dem vorliegenden Verfahren kann die Polypeptidaktivität nach der Konjugation bei mindestens 30% der Aktivität vor einer solchen Konjugation erhalten werden, geeigneterweise bei mindestens 50% und vorzugsweise bei mindestens 70% der Aktivität vor einer solchen Konjugation.
Die Konjugate eines Polypeptids und eines biokompatiblen Polymeren, erhältlich durch das vorliegende Verfahren, können als Medikamente verwendet werden. Insbesondere Konjugate von Faktor IX und eines biokompatiblen Polymers, hergestellt gemäß dem vorliegenden Verfahren, können als ein Medikament verwendet werden.
Ebenfalls kann konjugierter Faktor IX für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Hämophilie B verwendet werden, und insbesondere zur subkutanen, intramuskulären, intradermalen oder intravenösen Verabreichung eines solchen Medikamentes.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind nur zum Zwecke der Veranschaulichung angegeben und sollen in keiner Weise zur Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden, welche in den anhängigen Ansprüchen definiert ist.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Herstellung vom rekombinanten Faktor VIII
Die Herstellung vom rekombinanten Faktor VIII SQ (r-VIII SQ) wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es in dem Patent WO-A-9109122, Beispiel 1–3 beschrieben ist. Eine DHFR-defiziente CHO-Zelllinie (DG44N.Y.) wurde mit einem Expressionsvektor, der das r-VIII SQ-Gen enthielt, und einem Expressionsvektor, der das Dihydrofolat-Reduktase-Gen enthielt, elektroporiert. Nach der Selektion auf selektivem Medium wurden überlebende Kolonien durch das Wachstums in stufenweise zunehmenden Mengen Methotrexat amplifiziert. Der Überstand aus den resultierenden Kolonien wurden einzeln für Faktor VIII-Aktivität gescreent. Ein Produktionsklon wurde gewählt, und dieser wurde anschließend an ein serumfreies Suspensionswachstum in einem definierten Medium angepasst, und schließlich wurde ein Zellkultivierungsprozess im großen Maßstab entwickelt. Überstand wurde nach bestimmten Zeitdauern gesammelt und weiter wie unten beschrieben gereinigt.
Das konditionierte Medium wurde mittels Filtration geklärt, der pH-Wert wurde eingestellt und dann wurde das Filtrat auf eine S Sepharose^TM-FF-Säule geladen (Säulenvolumen: 3 1). Nach dem Waschen wurde der Faktor VIII mit einem Salzpuffer, der 5 mM CaCl₂ mit 0,02% Triton^TM X-100 enthielt, eluiert. Dieser kationische Austauschchromatographieschritt wurde bei 2–8°C durchgeführt. Das Eluat aus dem S Sepharose^TM-FF-Schritt (S-Eluat) wurde bis zur weiteren Reinigung eingefroren.
700 ml des S-Eluats wurden dann aufgetaut, und die Temperatur wurde auf Raumtemperatur eingestellt. Eine Virus-Inaktivierung wurde durchgeführt durch Inkubieren während 30 Minuten mit Tri-n-butylphosphat (TNBP) und Triton^TM-X-100 bei einer Endkonzentration von 0,3% (v/v) bzw. 1,0% (v/v). Eine Immunoaffinitätssäule mit monoklonalem Antikörper (mAb) mit einem Volumen von 260 ml wurde mit einem S-Eluatpuffer, der die entsprechenden Mengen an Virusinaktivierungschemikalien enthielt, äquilibriert. Die Faktor VIII-Lösung wurde dann auf die mAb-Säule gebracht, welche anschließend gewaschen wurde. Die Elution wurde mit einem 50% Ethylenglykol enthaltenden Puffer durchgeführt.
Eine Q Sepharose^TM-Säule wurde bei einer hohen Konzentration von Natriumchlorid voräquilibriert und dann mit einem Puffer der gleichen Zusammensetzung äquilibriert, mit der die Immunoaffinitätssäule eluiert worden war. Das mAb-Eluat wurde aufgebracht, und die Säule wurde dann mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von einem Waschpuffer mit physiologischer Ionenstärke. Die Säule wurde eluiert durch Erhöhen der Natriumchloridkonzentration auf 0,6 M. Es wurde kein Waschmittel für das Waschen und der Eluierung der Q-Säule verwendet. Eine ButylSepharose^TM-4FF-Säule wurde mit einem Puffer äquilibriert, der 50 mM Histidin, 1,4 M NH₄Ac, 50 mM CaCl₂ und 0,02% Tween^TM 80, pH 6,8, enthielt. NH₄Ac wurde dem Q-Eluat bis auf eine Endkonzentration von 1,0 M hinzugesetzt, und Tween^TM 80 auf 0,02%. Diese Lösung wurde auf die Butyl-Gel-Säule mit einer linearen Flussrate von 60 cm/h gebracht. Die Säule wurde dann mit 5 Säulenvolumina an Äquilibrierungspuffer gewaschen und dann mit einer linearen Flussrate von 35 cm/h mit einem Puffer, der 50 mM Histidin, 0,5 M NH₄Ac, 50 mM CaCl₂ und 0,02% Tween^TM 80, pH 6,8, enthielt, eluiert. Die Reinheit dieser Präparation war sehr hoch, wodurch eine spezifische Aktivität von 12 000–17 000 IU/mg Protein erhalten wurde.
Analyse
In den Beispielen 1–8 wurde die Faktor VIII-Aktivität mit einem chromogenen Assay (Chromogenix AB von Mölndal, Schweden) analysiert, wenn nicht anders angegeben. Die Menge an Faktor VIII wurde spektrophotometrisch bei A280 und durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die Menge an mPEG, gekoppelt an das Polypeptid, wurde mittels eines Protonen-NMR-Verfahrens gemessen (Dreborg, S. und Åkerblom, E. B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315–365 (1990)).
BEISPIEL 2 (Vergleichsbeispiel)
Faktor VIII konjugiert mit einem gemischten Anhydrid mit mPEG-Succinat
Die Pufferzusammensetzung des HIC-Eluats, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde durch Gelpermeationschromatographie, ausgeführt auf einer Superose 12-Säule (vermarktet von Pharmacia Biotech von Uppsala, Schweden) ausgetauscht, vorausgehend äquilibriert mit einem Puffer der folgenden Zusammensetzung: 0,25 M Hepes, 4 mM CaCl₂, pH 7,8. Zu Aliquote der r-VIII SQ-Lösung wurde ein 35-, 60- und 100-facher molarer Überschuss (bezogen auf rVIII) eines gemischten Anhydrids von mPEG-Succinat (MW: 3 000) hinzugesetzt. Die Mischungen ließ man 1,5 Stunden auf einem rotierenden Gerät in Raumtemperatur reagieren. Um den Überschuss an mPEG-Bernsteinsäure zu entfernen und um die heterogene Population an konjugiertem rVIII nach der Größe zu trennen, wurde eine Gelpermeationschromatographie durchgeführt, nun unter Verwendung einer Superose 6-Säule (vermarktet von Pharmacia Biotech von Uppsala, Schweden). Von jeder Kupplungsreaktion wurden die Fraktionen, die der ersten und zweiten Hälfte des Proteinpeaks entsprachen, gesondert analysiert, bezeichnet mit Pool 1 und Pool 2 in Tabelle I). Die Tabelle I stellt die Ergebnisse von konjugiertem r-VIII SQ mit dem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat dar.
TABELLE I
Wie aus der Tabelle I ersichtlich wird, wurde die spezifische Aktivität von rVIII dramatisch reduziert, selbst bei einem niedrigen Grad der Konjugation.
VERGLEICHSBEISPIEL 3
Faktor VIII, adsorbiert auf einem Q Sepharose^TM FF-Gel während des Kuppelns mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat
Reaktive Lysine, die durch negative Ladungen auf dem Faktor VIII-Molekül umgeben waren, wurden vor der mPEG-Konjugation geschützt durch Adsorption des Faktor VIII auf einem anionischen Austauschergel. Eine mit Q Sepharose^TM FF (vermarktet von Pharmacia Biotech von Uppsala, Schweden), äquilibriert mit einem Puffer der folgenden Zusammensetzung: 50 mM L-Histidin, 0,15 M NaCl, 4 mM CaCl₂, pH 6,5, wurde verwendet, um Faktor VIII zu adsorbieren. Ein HIC-Eluat, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde auf die Säule gegeben. Um geeignete Bedingungen für die mPEG-Kupplung zu erhalten, wurde die Säule mit einem Puffer, der 0,25 M Hepes, 4 mM CaCl₂, pH 7,8, enthielt, vor der Zugabe des mPEG gewaschen. Das Gel wurde einem Reaktionsgefäß überführt, ein gemischtes Anhydrid von mPEG-Succinat (MW: 3 000) wurde zu der Aufschlämmung in einer Menge, die dem molaren Überschuss in bezug auf Faktor VIII, wie in Tabelle II angegeben, entsprach, hinzugesetzt. Die Reaktion wurde unter Rotation 1,5 Stunden lang inkubiert. Die Säule wurde dann erneut gepackt, und das konjugierte rVIII wurde mit einem Puffer aus 50 mM L-Histidin, 0,6 M NaCl, 4 mM CaCl₂, pH 6,8, eluiert. Vier Präparationen wurden gemacht, bei einer pro Menge Gel geladenen konstanten Menge an r-VIII SQ. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Tabelle II präsentiert die Ergebnisse für das konjugierte r-VIII SQ, adsorbiert auf einem Q Sepharose^TM FF-Gel.
TABELLE II
Wie aus der Tabelle II ersichtlich ist, wird die spezifische Aktivität des konjugierten r-VIII SQ zu einem signifikant höheren Grad im Vergleich zu dem in Beispiel 2 konjugierten r-VIII SQ beibehalten.
VERGLEICHSBEISPIEL 4
FVIII, adsorbiert auf einem O Sepharose^TM FF-Gel während des Kuppelns mit mPEG-Tresylat
In diesem Beispiel wurden alle Schritte der Adsorption, Kupplung und Elution von r-VIII SQ auf Q Sepharose^TM FF-Gel wie in Beispiel 3 durchgeführt. mPEG-Tresylat (MW: 5 000) wurde verwendet, um Faktor VIII zu konjugieren. Die Tabelle III präsentiert die Ergebnisse von konjugiertem r-VIII SQ, adsorbiert auf einem Q Sepharose^TM FF-Gel mit mPEG-Tresylat gemäß der Erfindung.
TABELLE III
Die spezifische Aktivität in diesem Fall war etwas niedriger als in Beispiel 3, wahrscheinlich aufgrund des höheren Molekulargewichtes von mPEG.
VERGLEICHSBEISPIEL 5
Faktor VIII, adsorbiert auf einem anionischen Tentakel-Austauschgel, während des Kuppelns mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat
Eine Säule, die mit Fractogel^TM EMD TMAE 650 (vermarktet von Merck) gepackt war, wurde verwendet, um an r-VIII SQ zu adsorbieren. Alle Schritte wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt. Die Tabelle IV präsentiert die Ergebnisse von der Konjugation von r-VIII SQ, adsorbiert auf einem anionischen Tentakel-Austauschgel, mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat gemäß der Erfindung.
TABELLE IV
VERGLEICHSBEISPIEL 6
Thrombinaktivierung von mPEG-konjugiertem Faktor VIII
Die Thrombinaktivierung von konjugiertem r-VIII SQ wurde in einem in-vitro-Assay getestet, der jenen im Fachbereich Erfahrenen allgemein bekannt ist. Eine Probe, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurde, welche zu einem Derivatisierungsgrad von 4 mPEG/r-VIII SQ führte, wurde getestet. Das konjugierte r-VIII SQ konnte durch menschliches Thrombin in einer Dosisabhängigen Weise aktiviert werden. Eine Inaktivierung erfolgte später. In der 1 ist die Kurve der erhaltenen Aktivierungsänderungen gezeigt, wenn 1 NIH-Einheit von Thrombin pro 1 Einheit konjugiertes r-VIII SQ hinzugesetzt wurde. Ein Ein-Stufen-Verklumpungsverfahren, welches im wesentlichen gemäß Mikaelsson et al., 1983, Blood 62, S. 1006, durchgeführt wurde, wurde zum sofortigen Testen der Proben aus der Reaktionsmischung verwendet. Eine dreißigfache Aktivierung wurde innerhalb einer Minute erhalten, wonach eine Inaktivierung erfolgte. Die mit Thrombin erhaltenen Aktivierungs-Inaktivierungs-Muster waren in Übereinstimmung mit bereits früher berichteten Studien bezüglich der Faktor VIII-Thrombin-Wechselwirkung (Fulcher et al., 1983; Blood, 61, S. 807, Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, S. 2979, Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, S. 505, Rotblat et al., 1985, Biochemistry, 24, S. 4294).
VERGLEICHSBEISPIEL 7
Stabilitätstests von mPEGyliertem Faktor VIII in einem Extrakt von Schweinegewebe
Um den Einfluss der mPEG-Konjugation auf die Stabilität vom Faktor VIII in einer Lösung zu beurteilen, welche repräsentativ für die subkutane Umgebung ist, wurde ein in-vitro-Test unter Verwendung eines Extraktes aus Schweinegewebe unternommen. Zwei Präparationen von mPEG-konjugiertem Faktor VIII wurden so hergestellt, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, und sie wurden in dem Extrakt inkubiert, und Aliquote wurden 0, 2, 4, 6 und 24 Stunden bezüglich der Koagulansaktivität unter Verwendung eines chromogenen Assays analysiert. Während der ersten 6 Stunden korrelierte der Konjugationsgrad mit der verbliebenen Aktivität.
TABELLE V
Die Ergebnisse in Tabelle V und 2 zeigen deutlich, dass die mPEG-Konjugation signifikant die Stabilität vom Faktor VIII erhöhte.
VERGLEICHSBEISPIEL 8
Bioverfügbarkeitsuntersuchung vom mPEGyliertem Faktor VIII in Cynomolgus-Affen
Um den Einfluss der mPEG-Konjugation auf die in-vivo-Stabilität vom Faktor VIII zu evaluieren, wurde eine pharmakokinetische Untersuchung durchgeführt. Zwei Präparationen von mPEG-konjugiertem Faktor VIII wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt, und ihre spezifischen Aktivitäten wurden bestimmt, wie in Tabelle VI angegeben. Um eine hohe Homogenität des durch die Kupplungsprozedur hergestellten derivatisierten Materials zu erreichen, wurde eine Fraktionierung jeder Präparation zweimal mittels Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Eine Superdex 200 PG XK 16/60-Säule (vertrieben von Pharmacia Biotech von Uppsala, Schweden), äquilibriert mit 19 mM L-Histidin, 0,31 M NaCl, 3,4 mM CaCl₂, 0,02% Tween 80, pH 7,0, wurde verwendet. Eine Volumenreduktion der Faktor VIII-Lösungen vor der zweiten Gelpermeationschromatographie wurde in autoklavierten Centriplus 30-Konzentratoren; Zentrifugal-Ultrafiltrations-Gerätschaften (Cut-off 30 kDa, vermarktet von Amicon Inc. MA, USA) durchgeführt. Die Lösungen wurden dreimal bei 2 500 × g 45 Minuten lang konzentriert. Die vereinigten Fraktionen, die nach der zweiten Gelpermeationschromatographie erhalten worden waren, wurden später in einem Puffer, der zu der Endformulierung konform war, verdünnt; 19 mM L-Histidin, 0,31 M NaCl, 3,4 mM CaCl₂, 0,02% Tween 80, 17,5 mM Sucrose, pH 7,0. Die Proteinlösungen wurden schließlich unter Verwendung von 0,22 μm-Millex GV-Filtern (ver marktet von Millipore, MA, USA) filtriert und anschließend in autoklavierte Flaschen gefüllt. Die Lösungen wurden bei –70°C bis zur Verwendung gelagert.
Sechs weibliche Cynomolgus-Affen wurden einzelne intravenöse Dosen der Präparation 1 von 250 IU/kg und einzelne subkutane Dosen von Präparation 1 und Präparation 2 von 1 500 IU/kg bei unterschiedlichen Gelegenheiten verabreicht. Alle Lösungen wurden 1 : 1 mit Wasser zur Injektion vor der Verabreichung verdünnt. Die Injektionsstelle zur subkutanen Verabreichung war im linken oder rechten Dorsalbereich des Tieres, bzw. für die intravenöse Verabreichung in den linken oder rechten kephalischen Venen bzw. V. cephalica. Blutproben wurden von allen Tieren durch Punktion der Femurvene in Röhren, die Citrat als Antikoagulans enthielten (10% des Gesamtvolumens), zu den nachfolgend aufgeführten Zeitdauern nach der Injektion gesammelt:
Intravenöse Verabreichung: 0 (vor der Dosierung), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 h.
Subkutane Verabreichung: 0 (vor der Dosierung), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 h.
Eine pharmakokinetische Untersuchung vom nicht-konjugierten Faktor VIII wurde in einer separaten Studie in den gleichen Spezies durchgeführt. Die Dosen, die Route der Verabreichung und Ergebnisse (Durchschnitt (± Standardabweichung (SD))) sind in der Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI

I. V.: intravenös
S. C.: subkutan

Wie aus der Tabelle VI ersichtlich wird, führte die subkutane Verabreichung von beiden Präparationen des mPEG-konjugierten Faktors VIII zu einer deutlich höheren Bioverfügbarkeit im Vergleich zur subkutanen Verabreichung von nicht-konjugiertem r-VIII SQ. Eine statistische Analyse unter Verwendung des Student-t-Tests bestätigte, dass der Unterschied signifikant war.

Claims

Verfahren zum Verbessern der in vivo Funktion eines Faktors IX durch das Abschirmen exponierter Targets von Faktor IX, umfassend (a) das Immobilisieren von Faktor IX durch Wechselwirkung mit einem gruppenspezifischen Adsorptionsmittel, welches anionische Austauschliganden trägt; (b) das Aktivieren eines biokompatiblen Polymers; (c) das Konjugieren des aktivierten biokompatiblen Polymers mit außen-liegenden Stellen des immobilisierten Faktors IX; und (d) das Eluierung des Konjugats vom Adsorptionsmittels.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das biokompatible Polymer gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homopolymeren, Copolymeren oder Blockcopolymeren aus Polyalkylenoxiden, welche monoalkyl gekappt sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Polyalkylenoxid, welches monoalkyl gekappt ist, gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol-Homopolymeren und Polypropylenglycol-Homopolymeren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin das Polyalkylenoxid, welches monoalkyl gekappt ist, ein Monomethoxy-Polyethylenglycol (mPEG) ist.
Verfahren gemäß eines beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, worin die Anion-Austauschgruppen gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus quaternärem Aminomethyl, quaternärem Aminoethyl und Trimethylaminoethyl oder einer Mischung daraus.