DE69625085T2

DE69625085T2 - Konjugate eines polypeptids und eines biologisch verträglichem polymer

Info

Publication number: DE69625085T2
Application number: DE69625085T
Authority: DE
Inventors: Eva Akerblom; Johanna Dalborg; Helena Sandberg; Anna-Lisa Smeds
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2003-07-17
Anticipated expiration: 2016-09-28
Also published as: ZA968139B; EP1258497A3; ATE283351T1; NZ319322A; EP1260582A1; NO981408D0; CA2231801C; ES2238522T3; WO1997011957A1; DK1258497T3; EP1260582B1; PT1260582E; JPH11513378A; DK1260582T3; NO20051950L; EP1258497A2; HU221208B1; ES2187676T3; ATE228531T1; DE69633952T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der in-vivo-Funktion eines rekombinanten Faktor VIII SQ-Polypeptids durch ein Abschirmen exponierter Targets dieses Polypeptids über ein Immobilisieren des Polypeptids an einem gruppenspezifischen Adsorbens, das Anionenaustauscherliganden trägt, welche über eine organisch-chemische Synthese hergestellt wurden, Aktivieren des biokompatiblen Polymers, Konjugieren des so aktivierten biokompatiblen Polymers mit dem immobilisierten Polypeptid und danach Eluieren des Konjugats von dem Adsorbens. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Konjugate eines Polypeptids und eines biokompatiblen Polymers, welche durch das vorliegende Verfahren erhältlich sind, und die Verwendung dieser Konjugate als Medikamente. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft für Konjugate, bei denen das Polypeptid der Faktor VIII mit einer hohen spezifischen Aktivität ist, unter Verwendung von Monomethoxypolyalkylenoxid (mPEG) als dem biokompatiblen Polymer.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist wohlbekannt, dass die in-vitro-Stabilität und die in-vivo-Halbwertszeit von Polypeptiden durch kovalente Befestigung von biokompatiblen Polymeren (im folgenden als Konjugation oder Modifikation bezeichnet) erhöht werden können. Die Modifikation der Polypeptidoberfläche weist ebenfalls den Vorteil auf, dass die von dem Polypeptid gezeigte Immunogenität vermindert wird.
Die Pegylierung, d. h. ein Koppeln verschiedener Polyethylenglycole (PEG) an ein Polypeptid, ist eine Technik, die verbreitet zur Erhöhung der in-vitro-Stabilität und der in-vivo-Halbwertszeit von beispielsweise Proteinen verwendet wird. Bei der Pegylierung wurden über die Jahre hinweg viele Techniken vorgeschlagen. Hier wird auf Zalipsky, S. et al. in Poly(Ethylen Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York (1992) und Katre N. V., Adv. Drug Deliv. Rev., 10, 91-114 (1993) Bezug genommen.
Bei einigen Polypeptiden wurde als eine Folge dieser Konjugation ein Verlust der Aktivität oder Funktion festgestellt, was einen Effekt darstellt, der mit dem Ausmaß der Modifikation verstärkt wird (Inada, Y. et al., Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). Es wurden Verfahren entwickelt, um das Koppeln selektiver zu machen, um dieses Problem zu umgehen. Beispielsweise wurde eine gezielte Mutagenese auf rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) angewendet. Ein spezifisches Target kann durch die Insertion eines Cysteins erzeugt werden (Goodson, R. J. und Katre, N. V., Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993, siehe oben). Ein solcher Weg ist nicht allgemein für therapeutische Proteine anwendbar, da eine Aminosäuresubstitution den ursprünglichen Charakter des Moleküls verändern kann und daher umstritten ist. Alternativ kann das Polymer gegen glycosylierte Stellen eines Proteins, z. B. Faktor IX, wie in der WO 94/29370 (Enzon) offenbart ist, oder Faktor VIII, wie in der WO 94/15625 offenbart ist, gerichtet sein. Dieses beinhaltet jedoch eine Oxidation der Kohlenhydratanteile, was erreicht werden kann, indem das Glycoprotein mit Natriumperiodat oder enzymatisch durch Galactoseoxidase umgesetzt wird. Diese Bedingungen sind oft für das Molekül nachteilig. In diesem besonderen Fall waren die glycosylierten Stellen, die zur Konjugation gedacht waren, an einer Faktor IX-Peptid- Sequenz lokalisiert, welche während der proteolytischen Aktivierung in-vivo entfernt wird. Somit beeinflusst das biokompatible Polymer nicht die Funktion des aktiven Polypeptids.
In der WO 94/13322 (Farmitalia Carlo Erba) wird gezeigt, dass die Pegylierung durchgeführt werden kann, ohne die Funktion gewisser Stellen, die für die Funktion des bestimmten Proteins ("erste Substanz") essentiell sind, zu beeinträchtigen. Dieses wird erreicht, indem die Stellen geschützt werden, indem die erste Substanz mit einer zweiten Substanz, die spezifisch an die Stellen bindet, in Kontakt gebracht wird. Insbesondere wird die Pegylierung durchgeführt, indem das bestimmte Protein an einem Harz mit Liganden mit spezifischer Affinität für das Protein immobilisiert wird. Zweite Substanzen sind beispielsweise komplementäre biologische Moleküle. Beispiele von Paaren, die in der WO 94/13322 offenbart sind, sind Antikörper (erste Substanz) - entsprechendes Antigen (zweite Substanz); spezifischer Inhibitor (erste-Substanz) - Enzym (zweite Substanz); Wachstumsfaktor (erste Substanz) - entsprechender Rezeptor. (zweite Substanz) oder die Umkehrung jedes dieser Paare.
Bei einem Verfahren, das zur pharmazeutischen Produktion gedacht ist, ist es jedoch vorteilhaft, wenn die Verwendung von biologisch komplexen Substanzen bei einem Minimum gehalten werden kann. Dieses beruht hauptsächlich auf den strengen Anforderungen an die Dokumentation über die biochemische Homogenität und die Sicherheit bei der Verwendung dieser Substanzen. Daher wäre die Verwendung von Affinitätsliganden, die durch eine organisch-chemische Synthese erzeugt wurden, vorteilhaft.
Die DE 3717210 betrifft ein Verfahren zur Modifikation von Biopolymeren, vorzugsweise ladungstragenden Biopolymeren, durch ein Immobilisieren des Biopolymers an beispielsweise einem Ionenaustauscheradsorbens, Umsetzen des Biopolymers mit Reagenzien, z. B. Enzymen oder anderen biochemischen Reagenzien, um ein Reaktionsprodukt zu erhalten, und anschließend Desorbieren des Reaktionsprodukts von dem Adsorbens. Das Reaktionsprodukt ist vorzugsweise eine Nukleinsäure, die mit einem Restriktionsenzym gespalten ist. In der DE 3717210 wird der adsorbierte Zustand des Biopolymers verwendet, um das Biopolymer besser den Reagenzien auszusetzen, wodurch die Effizienz der Modifikation erhöht wird. Es gibt keinen Hinweis auf die Abschirmung exponierter Targets noch auf einen Zweck zur Beibehaltung der Aktivität des Biopolymers, die für eine Funktion des Biopolymers in-vivo vorteilhaft wären. Die Erfindung der DE 3717210 ist lediglich darauf gerichtet, Eigenschaften von Biomolekülen wie beispielsweise Nukleinsäuren zu kartieren, den ursprünglichen Charakter durch eine faktische Bearbeitung zu verändern oder die Anzahl von Funktionseinheiten des Makromoleküls zu erhöhen, beispielsweise durch den Einbau radioaktiver Isotope.
Viele Proteine, die für eine therapeutische Anwendung gedacht sind, wurden konjugiert, üblicherweise durch die Verwendung verschiedener Pegylierungstechniken (Francis, G. E. et al., in Stability of Protein Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3, 235-263 (1992); Inada, Y. et al., Trends in Biotechnology, 13, 86- 91 (1995)). Die meisten Beispiele betreffen die intravenöse Verabreichung. Jedoch wurde eine Aufnahme nach subkutaner Verabreichung an Plasma, Lunge, Leber und Milz einiger mPeg-konjugierter Allergene offenbart, und eine Immuntherapie mit mPEG-konjugierten Allergenen, die subkutan verabreicht wurden, hat sich als wirksam erwiesen (Dreborg, S. und Åkerblom, E. B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)). Ebenso wurde eine intramuskuläre Verabreichung in klinischen Versuchen mit Adenosindeaminase verwendet (Hershfield, M. S. et al., New Eng. J. Med. 316, 589-596 (1987). Es wurde ebenfalls behauptet, dass in wenigen Fällen die Pegylierung für den oralen Weg vorteilhaft ist. So wurde die Pegylierung von IgG zur oralen Verabreichung in der EP-A-0 614 373 der Mount Sinai School of Medicine offenbart. Die Pegylierung von Faktor VIII und Faktor IX zur oralen Verabreichung wurde in Sakuragawa et al., Acta Med. Biol., 34(3), 77-84 (1987) und in der japanischen Patentanmeldung Nr. 44509/83 der Nippon Chemifar Company offenbart.
Faktor VIII ist ein Protein, das an der intrinsischen Blutkoagulation teilnimmt. Er ist ein Kofaktor in der Reaktion, wo der Enzymfaktor IXa in Gegenwart eines Phospholipids und von Calciumionen den Proenzymfaktor X in die aktive Form, Faktor Xa, umwandelt, was letztendlich zu einem Fibringerinnsel führt. Der menschliche Faktor VIII wird als ein einkettiges Molekül mit ungefähr 300 kDa synthetisiert und besteht aus den Strukturdomänen A1-A2-B-A3-C1-C2 (Gitschier et al., 1984, Nature 312, Seite 326; Wood et al., 1984, Nature 312, Seite 330; Vehar et al., 1984, Nature 312, Seite 337; Toole et al., 1984, Nature, 312, Seite 342). Das Vorläuferprodukt wird im Golgi- Apparat zu zwei Polypeptidketten mit 200 und 80 kDa verarbeitet, und die zwei Ketten, welche durch ein Metallion(en) zusammengehalten werden, werden im Blut exprimiert (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, Seite 6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, Seite 2979). Die B-Domäne von Faktor VIII scheint entbehrlich zu sein, was die Kofaktorfunktion des Faktors VIII betrifft, während die A- und C-Domänen mehrere Wechselwirkungsstellen für andere Makromoleküle, die eine Rolle in der Hämostase spielen, aufweisen (Sandberg et al., 1993, Thrombos. Haemostas., 69, Seite 1204 und Lind et al., 1995, Eur. J. Biochem., 232, Seite 19).
Der von Willebrand-Faktor (vWf) ist ein multifunktionales polymeres Plasmaprotein, das aus disulfidverknüpften Untereinheiten mit ca. 240 kDa besteht. Die Untereinheiten bilden eine heterogene Population von Multimeren, die einen Bereich an Molekulargewichten von ca. 1 MDa bis 20 MDa aufweisen. Die Funktion des vWf bei der primären Hämostase besteht darin, die Anhaftung der Blutplättchen an der Gefäßwand unter Bedingungen einer hohen Scherrate zu fördern. vWf bindet Faktor VIII ebenfalls fest aber nicht kovalent. In normalem menschlichem Plasma zirkulieren Faktor VIII und vWf in Form von Komplexen miteinander. vWf weist eine wichtige stabilisierende Wirkung auf das Faktor VIII-Molekül auf, indem es das Molekül vor dem Abbau durch Proteasen schützt (Koedam et al., 1987, Doktorarbeit, ICG Printing, Dordrecht, 1986, Seite 83; Hamer et al., 1986, Haemostasis, 1987, 58, Seite 223). Beim Menschen beträgt die in-vivo-Halbwertszeit von Faktor VIII gewöhnlich 10 bis 15 Stunden. Bei vWf-defizienten Patienten sind die verringerten Spiegel an vWf aufgrund einer verschlechterten Freisetzung und einer erhöhten Abbaurate von Faktor VIII von verringerten Spiegeln an Faktor VIII begleitet. Tuddenham et al., 1982, Br. J. Haematol., 52, Seite 259 und Brinkhous et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci 82, Seite 8752 zeigten, dass das Vorliegen von vWf eine wichtige Wirkung auf das Überleben von Faktor VIII in-vivo ausübt. Wenn hämophilen Hunden Faktor VIII infundiert wurde, wurde eine Halbwertszeit von 7 bis 10 Stunden erhalten, während die Halbwertszeit nach Infusion bei vWf-defizienten Hunden ca. 1 Stunde betrug (Brinkhous et al., siehe oben).
Faktor IX ist das Proenzym des Faktors IXa, der oben beschrieben wurde. Er ist eine Serinprotease und ist eines der Vitamin K-abhängigen Koagulationsproteine. Die Molekülmasse beträgt ca. 55 kDa (DiScipio et al., 1977, Biochemistry, 16, Seite 698). Faktor IXa wechselwirkt spezifisch mit anderen Komponenten, die an der Faktor X-Aktivierung beteiligt sind (In: Haemostasis and Thrombosis, 1994, Band 1, dritte Ausgabe, Herausgeber Bloom A. et al.).
Es ist aus den obigen Absätzen ersichtlich, dass Faktor VIII ein Protein mit mehreren Wechselwirkungsstellen ist, die jeweils für eine spezifische Funktion verantwortlich sind. Daher ist es schwierig, Faktor VIII so zu modifizieren, dass die biologische Funktion vollständig beibehalten wird.
Die Pegylierungstechnik wurde vorher auf Proteinmischungen angewendet, die Faktor VIII enthielten. So wurde in der WO 94/15625 (Enzon) offenbart, dass die Pegylierung von Faktor VIII unter Verwendung einer Carbamat(Urethan)-Verknüpfung in einem unbestimmten Modifikationsgrad, der aus einem 100fachen molaren Überschuss von mPEG in Bezug auf Faktor VIII resultiert, die in-vivo-Halbwertszeit bei Mäusen von 13 Stunden auf 55 Stunden erhöhen kann. Herkömmlicherweise wird eine Halbwertszeit in Mäusen von ca. 1 Stunde angenommen. Somit sind 13 Stunden eine ungewöhnlich lange Halbwertszeit in Mäusen. Weiterhin muss berücksichtigt werden, dass bei der extrem niedrigen Reinheit der anfänglichen Faktor VIII-Präparation (20-50 IU/mg Protein) andere Proteine als Faktor VIII während dieser Kopplungsreaktion vorherrschten. Ein wichtiges Protein, das gewöhnlich in Faktor VIII- Präparationen mit geringer Reinheit vorliegt, ist der von Willebrand-Faktor, welcher eine stabilisierende Funktion für Faktor VIII ausübt und ebenfalls gut zu dem Schutz der entsprechenden funktionalen Stelle während des Konjugationsprozesses beitragen könnte. Nach der Konjugation kann mPEG auf jedem der Proteine, die in der Proteinmischung vorliegen, von welcher Faktor VIII normalerweise nur einen sehr kleinen Anteil ausmacht, lokalisiert werden. Die pegylierte Proteinmischung, die Faktor VIII enthielt, wurde zur intravenösen Verabreichung verwendet. Ein gut definiertes Ausgangsmaterial ist jedoch einer der wesentlichen Faktoren, welche die kontrollierten Bedingungen ausmachen, die für die pharmazeutische Produktion benötigt werden.
Andere Polymere sind ebenfalls zur Konjugation mit Faktor VIII verwendet worden. So wurde in dem US-Patent 4,970,300 offenbart, dass eine Dextrankonjugation angewendet werden kann, um die Halbwertszeit von Faktor VIII zu verlängern.
Bei den meisten Kopplungstechniken reagiert das Polymerreagenz mit &epsi;-Aminogruppen von Lysinresten des Polypeptids. Diese sind oft über die gesamte Polypeptidoberfläche hinweg verteilt und können sehr wohl zu einer Konjugation in der Nähe einer funktionalen Stelle führen. Als Folge wird durch ein zufälliges Koppeln oft die Aktivität oder Funktion gestört. Es ist unsere Erfahrung, dass, wenn solche Techniken auf sehr reine Präparationen wie beispielsweise den rekombinanten Faktor VIII ohne B-Domäne mit Koagulationsaktivität angewendet werden, diese Aktivität schon bei einem Modifikationsgrad von ca. 5 mPEG/Faktor VIII-Molekül drastisch verringert wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die spezifische Aktivität konjugierter Polypeptide in einem hohen Ausmaß beibehalten werden kann, indem lediglich das Polypeptid vor der Kopplungsreaktion an einem gruppenspezifischen Adsorbens immobilisiert wird, worauf die Desorption des Konjugats durch herkömmliche Techniken folgt. Dieses ist sehr überraschend, da es früher als wesentlich angesehen wurde, Adsorbentien mit spezifischen Bindungseigenschaften in Bezug auf das fragliche Polypeptid zu verwenden, um einen Schutz gewisser Domänen zu erreichen, die für die biologischen Funktionen wichtig sind.
Der Nutzen der Modifizierung von biokompatiblen Polymeren hängt oft von dem Modifikationsgrad ab. Somit ist gewöhnlich ein hoher Modifikationsgrad, d. h. eine hohe Anzahl an biokompatiblen Polymeren pro Polypeptidmolekül, für einen effizienten Schutz gegenüber einer proteolytischen Aktivität erforderlich. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung, bei welcher die biokompatiblen Polymere selektiver eingeführt werden, wurde die spezifische Aktivität besser beibehalten. So haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass Faktor VIII gegen einen Abbau in einer invitro-Umgebung, von welcher gezeigt wurde, dass sie einen zu einem Abbau führenden Effekt auf dieses Molekül ausübt, effizient geschützt werden kann. Diese Wirkung kann bei einem Modifikationsgrad von nur 4 bis 5 mPEG/Faktor VIII erreicht werden.
Die Verwendung gruppenspezifischer Adsorbentien gemäß der vorliegenden Erfindung ist ökonomisch günstiger im Vergleich zu den Adsorbentien, die im Stand der Technik offenbart wurden. Die Verwendung gruppenspezifischer Adsorbentien wird ebenso die Zulassung der Konjugate als therapeutische Mittel erleichtern.
Das vorliegende Verfahren macht es möglich, die in-vivo-Funktion von rekombinanten Faktor VIII SQ-Polypeptiden zu verbessern, insbesondere indem die pharmakokinetische Funktion einschließlich der Bioverfügbarkeit verbessert wird und indem die Immunogenität, die von den Polypeptiden gezeigt wird, verringert wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der in-vivo- Funktion eines rekombinanten Faktor VIII SQ-Polypeptids durch ein Abschirmen exponierter Targets dieses Polypeptides durch
a) Immobilisieren des rekombinanten Faktor VIII SQ-Polypeptids durch Wechselwirkung mit einem gruppenspezifischen Adsorbens, das Anionenaustauscherliganden trägt, die durch organisch-chemische Synthese hergestellt wurden;
b) Aktivieren des biokompatiblen Polymers;
c) Konjugieren des aktivierten biokompatiblen Polymers mit dem immobilisierten rekombinanten Faktor VIII SQ; und anschließend
d) Eluieren des Konjugats von dem Adsorbens.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck Wechselwirkungsstelle auf verschiedene Stellen, die für die biologische Funktion des bestimmten Polypeptids wesentlich sind.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck exponierte Targets auf äußere Stellen auf dem fraglichen Polypeptid, die für unerwünschte Reaktionen in-vivo anfällig sind. Beispiele für exponierte Targets umfassen antigene Epitope und Stellen für eine proteolytische Spaltung. Gewisse Stellen für die proteolytisehe Spaltung werden jedoch als Wechselwirkungsstellen bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung macht es in einem bislang unerreichbaren Ausmaß möglich, den Einfluss unerwünschter Reaktionen in-vivo, z. B. der proteolytischen Spaltung und möglicherweise der Aggregation, zu verringern, während gleichzeitig die Wechselwirkungsstellen, welche für die biologische Funktion des Polypeptids grundlegend sind, nicht betroffen werden. Dieses wurde im Zusammenhang mit der Anwendung der mPEG-Konjugation auf (rekombinanten) Faktor VIII offenbart. Insbesondere werden durch Immobilisieren des Polypeptids durch Wechselwirkung mit einem gruppenspezifischen Adsorbens, das Liganden trägt, die durch organischchemische Synthese hergestellt wurden, die Wechselwirkungsstellen auf dem Polypeptid von einer Konjugation mit dem biokompatiblen Polymer ausgenommen. Weiterhin sind durch ein Konjugieren des aktivierten biokompatiblen Polymers mit dem Polypeptid an den gewünschten, äußeren Stellen die exponierten Targets vor der Wirkung von beispielsweise Proteasen geschützt.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich Polypeptide auf Proteine und Oligopeptide mit wenigstens 20 Aminosäuren in der Kette. Die Anzahl an Aminosäuren des Polypeptids, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, liegt geeigneterweise in dem Bereich von 30 bis zu 4.500 Aminosäuren und vorzugsweise in dem Bereich von 40 bis zu 3.000 Aminosäuren. Die Polypeptide können aus Säugetieren, insbesondere aus dem Menschen stammen oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Polypeptide, welche gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können, umfassen Polypeptide, die eine Koagulationsaktivität zeigen oder eine unterstützende Funktion bei der Koagulation aufweisen. Die Polypeptide können die volle Länge aufweisen, d. h. die Sequenz der Aminosäuren ist identisch mit der entsprechenden Sequenz, die in Säugetieren im allgemeinen und insbesondere bei Menschen gefunden wird. Die Polypeptide können ebenfalls Deletionsderivate von Polypeptiden mit voller Länge sein, wobei eine oder mehrere Aminosäuren fehlen. Das Polypeptid ist geeigneterweise der Koagulationsfaktor VIII, der von Willebrand-Faktor (vWf) oder eine Kombination von diesen oder der Koagulationsfaktor IX und vorzugsweise der Koagulationsfaktor VIII.
Der Faktor VIII in voller Länge, welcher im menschlichen Plasma vorliegt, weist eine Molekülmasse von ca. 300 kDa auf. Faktor VIII-Konzentrate, die aus menschlichem Plasma stammen, enthalten mehrere fragmentierte vollaktive Faktor VIII-Formen, wie von Andersson et al. (siehe oben) beschrieben wird. Die kleinste aktive Form weist eine Molekülmasse von ca. 170 kDa auf und besteht aus zwei Ketten mit ca. 90 kDa und ca. 80 kDa, welche durch ein Metallion(en) zusammengehalten werden (siehe EP-A-0 197 901). Der biologisch aktive Faktor VIII, der gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, weist daher geeigneterweise eine Molekülmasse im Bereich von ca. 170 kDa bis zu ca. 300 kDa auf.
Die Pharmacia AB aus Stockholm, Schweden, hat ein rekombinantes Faktor VIII-Produkt entwickelt, welches der Form des Plasmafaktors VIII mit 170 kDa in therapeutischen Faktor VIII-Konzentraten entspricht. Das trunkierte rekombinante Faktor VIII- Molekül wird r-VIII SQ genannt und wird durch Ovarienzellen des chinesischen Hamster (CHO) in einem Zellkulturverfahren in serumfreiem Medium erzeugt. Die spezifische Aktivität von r-VIII SQ beträgt ca. 15.000 IU VIII:C pro mg Gesamtprotein. Die Struktur und Biochemie von r-VIII SQ wurden in der WO-A-91/09122 beschrieben, welche der Pharmacia AB übertragen wurde.
In der vorliegenden Erfindung ist Faktor VIII ein Deletionsderivat von Faktor VIII mit voller Länge, das eine Aktivität als Koagulationsmittel aufweist. Insbesondere ist das Deletionsderivat der rekombinante Faktor VIII SQ (r-VIII SQ). In diesem Zusammenhang ist ein Deletionsderivat definiert als ein Koagulationsfaktor VIII, bei welchem die gesamte oder ein Teil der B-Domäne fehlt, während die Aktivität als Koagulationsmittel beibehalten wird. Die verbleibenden Domänen sind geeigneterweise durch einen Aminosäurelinker verknüpft. Beispiele für verschiedene Linkerkonstrukte werden in P. Lind et al., Eur. J. Biochem., Band 232 (1995), Seiten 19-27 angegeben.
Es ist bevorzugt, dass das Endprodukt gut definiert ist. Daher sollte die spezifische Faktor VIII-Aktivität in dem Kopplungsverfahren der vorliegenden Erfindung wenigstens ca. 1.000 IU/mg Gesamtprotein und geeigneterweise wenigstens 2.000 IU/mg Gesamtprotein betragen. Die spezifische Faktor VIII-Aktivität liegt vorzugsweise in dem Bereich von 5.000 bis zu 20.000 IU/mg Gesamtprotein und insbesondere in dem Bereich von 10.000 bis zu 17.000 IU/mg Gesamtprotein.
Die Faktor VIII-Aktivität in dem Kopplungsverfahren kann wenigstens ca. 1.000 IU/ml und geeigneterweise wenigstens 2.000 IU/ml betragen. Die Faktor VIII-Aktivität liegt vorzugsweise in dem Bereich von 5.000 bis zu 50.000 IU/ml und insbesondere von 20.000 bis zu 40.000 IU/ml.
Das biokompatible Polymer der vorliegenden Erfindung kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Homopolymeren, Copolymeren oder Blockcopolymeren von monoalkylverkappten Polyalkylenoxiden. Die biokompatiblen Polymere können gerade oder verzweigt sein. Das monoalkylverkappte Polyalkylenoxid ist geeigneterweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglycol-Homopolymeren und Polypropylenglycol-Homopolymeren. Das biokompatible Polymer ist vorzugsweise ein Polyethylenglycol(PEG)-Homopolymer. Das Molekulargewicht des PEG kann in dem Bereich von ca. 300 bis zu 20.000, geeigneterweise in dem Bereich von 1.500 bis zu 10.000 und vorzugsweise in dem Bereich von 3.000 bis zu 5.000 liegen.
Das biokompatible Polymer sollte an einem Ende eine Endkappe aufweisen, um eine Derivatisierung über Kreuz zu vermeiden. Beispiele für Gruppen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind gerade oder verzweigte niedere Alkoxygruppen, vorzugsweise die Monomethoxygruppe. Ein besonders bevorzugtes biokompatibles Polymer in der vorliegenden Erfindung ist Monomethoxypolyethylenglycol (mPEG).
Andere biokompatible Polymere sind ebenfalls vorstellbar, z. B. Dextran, Polyvinylpyrrolidon und DL-Aminosäuren.
Das biokompatible Polymer muss vor der Kopplungsreaktion aktiviert werden, um die Bildung kovalenter Bindungen zu ermöglichen. Zu diesem Zweck sollte das Ende des biokompatiblen Polymers, das dem Polypeptid gegenüberliegt, eine daran befestigte Hydroxylgruppe aufweisen, die für eine Aktivierung geeignet ist. Es gibt mehrere Wege, das biokompatible Polymer zu aktivieren, die von der Aminosäure abhängen, die zur kovalenten Bindung ausgewählt wurde. Geeignete mPEG-Derivate zur Kopplung an Aminogruppen sind mPEG-Succinimidylsuccinat, nPEG-Succinimidylsuccinamid, mPEG-Succinimidylpropionat, Succinimidylcarbonat von mPEG, Succinimidylester von carboxymethyliertem mPEG, mPEG-Oxycarbonyllimidazol, mPEG-Nitrophenylcarbonate, mPEG-Trichlorphenylcarbonat, mPEG-Tresylat (das Letztare wurde offenbart von Nilsson K., Mosbach K., Methods in Enzymology, Band 104, Seiten 56-69 (1984)), (alle erwähnten Reagenzien werden von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA vermarktet), mPEG-Maleinsäureanhydrid und mPEG-Methylmaleinsäureanhydrid (German, A., Kalindjian S. B., FEB Band 223: 2, Seiten 361-365) und gemischte Anhydride von mPEG-Succinat, mPEG-Essigsäure bzw. mPEG-Propionsäure (Dreborg, S. und Akerblom, E., siehe oben).
Cysteinreste können mit mPEG-Maleimid, mPEG-Vinylsulfon und mPEG-Orthopyridyldisulfid (die von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA vermarktet werden), konjugiert werden. Geeignete Reagenzien im Fall der Konjugation der Guanidinogruppe von Arginin sind mPEG-Derivate von Phenylglyoxal (Zalipski, siehe oben).
Kohlenhydrate müssen zuerst oxidiert werden, so dass Aldehydgruppen vorliegen, und sie können dann mit mPEG-Hydrazid konjugiert werden (Zalipski, siehe oben).
Das Kopplungsverfahren wird bei einem pH durchgeführt, der für die zu konjugierende Aminosäure geeignet ist. Berücksichtigt werden müssen ebenfalls der pH, der für das Polypeptid insgesamt geeignet ist, wie auch die pH-Abhängigkeit der Reaktivität des biokompatiblen Polymers. Daher liegt normalerweise der pH zum Koppeln in dem Bereich von ca. 7 bis ca. 8, wobei die untere Grenze gesetzt wurde, um ein verlängertes Kopplungsverfahren zu vermeiden, und die obere Grenze, um milde Bedingungen für das Polypeptid bereitzustellen. Der obige pH-Bereich ist für eine Konjugation unter der Beteiligung von Lysinen geeignet. Daher haben wir in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung eine Substanz mit FVIII-Aktivität unter derartigen milden Bedingungen konjugiert. pH-Werte außerhalb dieses Bereichs können in gewissen Fällen ebenfalls geeignet sein. So wird eine Konjugation unter Beteiligung von Cysteinen geeigneterweise bei einem pH unter ca. 7 durchgeführt, wogegen Arginine geeigneterweise bei einem pH in dem Bereich von ca. 5,5 bis zu ca. 9,3 konjugiert werden.
Der Kopplungsvorgang sollte bei einer Temperatur über 0ºC, geeigneterweise in dem Bereich von ca. 5 bis zu ca. 40ºC und bevorzugt in dem Bereich von 10 bis zu 30ºC durchgeführt werden. Berücksichtigt werden müssen wieder eine Temperatur, die für das Polypeptid insgesamt geeignet ist, wie auch der Einfluss der Temperatur auf die Reaktivität des biokompatiblen Polymers. In den Beispielen der vorliegenden Anmeldung wurden alle Kopplungsschritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
Das Adsorbens, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in Bezug auf das Polypeptid, das immobilisiert werden soll, gruppenspezifisch. Gruppenspezifische Adsorbentien weisen eine Affinität zu mehreren Polypeptiden auf. Weiterhin binden sie oft weniger stark, und die Elution kann unter milderen Bedingungen durchgeführt werden als mit monospezifischen Adsorbentien, wobei die Letzteren an ein einziges oder eine sehr kleine Anzahl von Polypeptiden binden. Beispiele für geeignete gruppenspezifische Adsorbentien werden in Jansson, J.-C. et al., Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and. Applications, VCH Publishers, Seiten 274- 285 (1989) angegeben. Das Adsorbens der vorliegenden Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es Liganden trägt, die durch organisch-chemische Synthese hergestellt wurden.
Insbesondere sind Liganden, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, Anionenaustauschergruppen, die vorzugsweise stark sind, wie quartäres Aminoethyl (QAE), Trimethylaminoethyl (TMAE) oder quartäres Aminomethyl (Q), wobei quartäres Aminomethyl (Q) besonders bevorzugt ist. Die Liganden können darüber hinaus direkt oder über einen Abstandhalter wie Alkylamin, Hexylamin, Diaminodipropylamin, Ethylaminsuccinamid (Persson & Lagerström, in Packings and stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K. K. Herausgeber, Marcel Dekker Inc. 1990, Seite 754) oder über einen verzweigten Tentakel, an welchem die Liganden befestigt sind (ein geeignetes Beispiel ist FractogelTM EMD, das von Merck in Deutschland hergestellt wird), an die Matrix gekoppelt werden.
Nach dem Kopplungsverfahren wird das konjugierte Polypeptid durch herkömmliche Techniken eluiert. In diesem Zusammenhang ist es wesentlich, dass die physikochemischen Bedingungen berücksichtigt werden, um einen Abbau der konjugierten Polypeptide zu vermeiden. Wenn daher der Kopplungsweg eine konjugierende Bindung beinhaltet, die innerhalb eines gewissen pH-Bereichs labil ist, sollte dieses vermieden werden.
Wenn das Polypeptid auf dem Adsorbens immobilisiert ist, kann das Polypeptid in dem Kopplungsverfahren mit einem löslichen Blockierungsmittel in Kontakt gebracht werden, zu dem Zweck, weitere Stellen von der Konjugation auszuschließen. Ein solches Blockierungsmittel sollte durch organisch-chemische Synthese hergestellt werden und zusätzlich mit irgendeinem der oben identifizierten Liganden konjugiert sein, die an ein Polymer gebunden sind, das ausgewählt ist aus beispielsweise monoalkylverkappten Polyalkylenoxiden, Copolymeren oder Blockcopolymeren von Polyalkylenoxiden, Polyethylenglycol-Homopolymeren oder Polypropylenglycol-Homopolymeren. Das Blockierungsmittel kann ebenfalls Einheiten mit einer spezifischen Affinität für das Polypeptid aufweisen.
Nach der Elution wird das in Kontakt gebrachte lösliche Blockierungsmittel durch Anwenden geeigneter chemischer Bedingungen desorbiert. Wenn beispielsweise das Blockierungsmittel durch hydrophobe Wechselwirkungen adsorbiert wurde, könnte es desorbiert werden, indem die Ionenstärke vermindert wird oder indem einfach die Temperatur gesenkt wird. Das lösliche Blockierungsmittel wird anschließend von dem Konjugat durch Gelpermeationschromatographie unter üblichen Bedingungen abgetrennt.
Die Matrix des Adsorbens in der vorliegenden Erfindung kann irgendein kommerzielles Harz sein, von dem bekannt ist, dass es mit biologischen Molekülen kompatibel ist. Somit kann die Matrix ausgewählt werden aus verschiedenen stark hydrophilen Matrizes, z. B. Agarosematrizes wie beispielsweise einer großen Vielzahl von SepharoseTM-Matrizes, die von Pharmacia Biotech aus Uppsala, Schweden verkauft werden, organischen Polymermatrizes wie z. B. TSK-Gelen, die von der Tosoh Corp. aus Tokyo, Japan verkauft werden, oder hochporösen organischen Polymermatrizes, die von Per Septive Biosystems aus Boston, USA verkauft werden. Membranmatrizes sind ebenfalls geeignet, z. B. SartobindTM, die von Sartorius aus Deutschland verkauft wird, und MemSepTM, die von Millipore aus den USA verkauf wird. Die Matrix ist vorzugsweise eine Agarosematrix. Geeignete Agarosematrizes in der vorliegenden Erfindung sind, neben SepharoseTM, MinileakTM, die von Kem-En-Tec A/S aus Kopenhagen, Dänemark verkauft wird, und Bio-Gel A, das von Bio-Rad aus Brüssel, Belgien verkauft wird. Vorzugsweise ist die Matrix quervernetzt, was einen schnellen Fluss (FF) und dadurch eine hohe Produktionskapazität erlaubt. Insbesondere wird die Chromatographie der vorliegenden Erfindung auf einem Q-SepharoseTM-FF-Gel durchgeführt. Weiterhin können ebenfalls Harze, die aus Copolymeren von Oligoethylenglycol, Glycidylmethacrylat und Pentaerythroldimethacrylat zusammengesetzt sind, wie FractogelTM (von Merck aus Deutschland vermarktet), Cellulose und poröses Glas vorteilhaft verwendet werden.
Die Konjugate aus einem Polypeptid und einem biokompatiblen Polymer, welche durch das vorliegende Verfahren erhältlich sind, sind neu. Mit dem vorliegenden Verfahren kann die Polypeptidaktivität nach der Konjugation bei wenigstens 30% der Aktivität vor der Konjugation, geeigneterweise wenigstens 50% und vorzugsweise wenigstens 70% der Aktivität vor der Konjugation, gehalten werden.
Die Konjugate aus einem Polypeptid und einem biokompatiblen Polymer, welche durch das vorliegende Verfahren erhältlich sind, können als Medikamente verwendet werden. Insbesondere können Konjugate aus dem Faktor VIII, dem von Willebrand- Faktor oder einer Kombination von diesen oder dem Faktor IX und einem biokompatiblen Polymer, das gemäß dem vorliegenden Verfahren erzeugt wurde, als ein Medikament verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft, ein Konjugat von Faktor VIII und einem biokompatiblen Polymer zu verwenden, wobei der Konjugationsgrad in dem Bereich von 1 bis zu 15 monoalkylverkappten PEG/Faktor VIII-Molekül, geeigneterweise in dem Bereich von 2 bis zu 10 monoalkylverkappten PEG/Faktor VIII-Molekül, vorzugsweise in dem Bereich von 3 bis zu 7 monoalkylverkappten PEG/Faktor VIII-Molekül, liegt. In diesem Zusammenhang wird der konjugierte Faktor VIII geeigneterweise durch rekombinante DNA-Technik hergestellt, vorzugsweise ist dieser ein rekombinantes Deletionsderivat des Faktors VIII in voller Länge, das eine Aktivität als Koagulationsmittel aufweist, und insbesondere ein Deletionsderivat des rekombinanten Faktors VIII SQ (r-VIII SQ).
Die konjugierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden geeigneterweise zur subkutanen, intramuskulären, intradermalen oder intravenösen Verabreichung verwendet. Insbesondere kann der konjugierte Faktor VIII zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Hämophilie A und insbesondere zur subkutanen, intramuskulären, intradermalen oder intravenösen Verabreichung eines solchen Medikaments verwendet werden. Weiterhin kann konjugierter vWf zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der von Willebrand-Krankheit und insbesondere zur subkutanen, intramuskulären, intradermalen oder intravenösen Verabreichung eines solchen Medikaments verwendet werden. Der Faktor VIII und der von Willebrand- Faktor, welche beide gemäß dem vorliegenden Verfahren konjugiert wurden, können ebenfalls in Kombination verwendet werden. Ebenso kann konjugierter Faktor IX zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Hämophilie B und insbesondere zur subkutanen, intramuskulären, intradermalen oder intravenösen Verabreichung eines solchen Medikaments verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung der Hämophilie A durch subkutane, intramuskuläre, intradermale oder intravenöse Verabreichung eines Konjugats aus dem Faktor VIII und einem biokompatiblen Polymer, das gemäß dem vorliegenden Verfahren erzeugt wurde.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden nur zu Zwecken der Veranschaulichung angegeben und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie in irgendeiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung, welche durch die angefügten Ansprüche definiert ist, beschränken.

BEISPIEL 1

Herstellung des rekombinanten Faktors VIII

Die Herstellung des rekombinanten Faktors VIII SQ (r-VIII SQ) wurde im wesentlichen durchgeführt wie in dem Patent WO-A-9109122, Beispiel 1 bis 3, beschrieben wird. Eine DHFR-defiziente CHO-Zelllinie (DG44N.Y.) wurde einer Elektroporation mit einem Expressionsvektor, welcher das r-VIII SQ-Gen enthielt, und einem Expressionsvektor, welcher das Dihydrofolatreduktasegen enthielt, unterzögen. Nach Selektion auf Selektionsmedien wurden überlebende Kolonien durch ein Wachsturn in schrittweise ansteigenden Mengen an Methotrexat amplifiziert. Überstände von den resultierenden Kolonien wurden separat im Hinblick auf Faktor VIII-Aktivität hin gescreent. Ein Produktionsklon wurde ausgewählt, und dieser wurde anschließend an ein Wachstum in einer serumfreien Suspension in einem definierten Medium angepasst, und schließlich wurde ein Zellkultivierungsverfahren in großem Maßstab entwickelt. Der Überstand wird nach gewissen Zeitabständen gesammelt und weiter gereinigt wie nachstehend beschrieben wird.
Das konditionierte Medium wurde durch Filtration aufgeklart, der pH wurde eingestellt, und dann wurde das Filtrat auf eine S-SepharoseTM-FF-Säule (Säulenvolumen 3 l) geladen. Nach dem Waschen wurde Faktor VIII mit einem Salzpuffer, der 5 mM CaCl&sub2; und 0,02% TritonTM X-100 enthielt, eluiert. Dieser Kationenaustauschchromatographieschritt wurde bei 2 bis 8ºC durchgeführt. Das Eluat aus dem S-SepharoseTM-FF-Schritt (S-Eluat) wurde bis zur weiteren Reinigung eingefroren.
700 ml des S-Eluats wurden aufgetaut, und die Temperatur wurde auf Raumtemperatur eingestellt. Eine Inaktivierung von Viren wurde durchgeführt, indem für 30 Minuten mit Tri-n-butylphosphat (TNBP) und TritonTM X-100 bei einer Endkonzentration von 0,3% (v/v) bzw. 1,0% (v/v) inkubiert wurde. Eine Immunaffinitätssäule mit monoklonalem Antikörper (mAb) mit einem Volumen von 260 ml wurde mit einem S-Eluatpuffer äquilibriert, welcher die entsprechenden Mengen der Chemikalien zur Inaktivierung von Viren enthielt. Die Faktor VIII-Lösung wurde dann auf die mAb- Säule geladen, welche anschließend gewaschen wurde. Die Elution wurde mit einem Puffer durchgeführt, der 50% Ethylenglycol enthielt.
Eine Q-SepharoseTM-Säule wurde mit einer hohen Konzentration von Natriumchlorid voräquilibriert und dann mit einem Puffer äquilibriert, der dieselbe Zusammensetzung aufwies wie der, mit dem die Immunaffinitätssäule eluiert wurde. Das mAb-Eluat wurde aufgetragen, und die Säule wurde dann mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, worauf ein Waschpuffer mit einer physiologischen Ionenstärke folgte. Die Säule wurde eluiert, indem die Natriumchloridkonzentration auf 0,6 M erhöht wurde. Für die Wäsche und die Elution der Q-Säule wurde kein Detergens verwendet. Eine Butyl- SepharoseTM-4-FF-Säule wurde mit einem Puffer äquilibriert, welcher 50 mM Histidin, 1,4 M NH&sub4;Ac, 50 mM CaCl&sub2; und 0,02% TweenTM 80, pH 6,8, enthielt. NH&sub4;Ac wurde zu dem Q-Eluat bis zu einer Endkonzentration von 1,0 M und TweenTM 80 bis auf 0,02% zugegeben. Diese Lösung wurde auf die Butylgelsäule bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 60 cm/h aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 5 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer gewaschen und dann bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 35 cm/h mit einem Puffer eluiert, welcher 50 mM Histidin, 0,5 M NH&sub4;Ac, 50 mM CaCl&sub2; und 0,02% TweenTM 80, pH 6,8, enthielt. Die Reinheit dieser Präparation war sehr hoch und ergab eine spezifische Aktivität von 12.000 bis 17.000 IU/mg Protein.

Analyse

In den Beispielen 1 bis 8 wurde die Faktor VIII-Aktivität mit einem chromogenen Test (Chromogenix AB aus Mölndal, Schweden) analysiert, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Menge des Faktors VIII wurde spektrophotometrisch bei A280 und durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die Menge an mPEG, das an das Polypeptid gekoppelt war, wurde mit einem Protonen-NMR-Verfahren gemessen (Dreborg, S. und Åkerblom, E. B.; Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)).

BEISPIEL 2 (Vergleichsbeispiel)

Faktor VIII, konjugiert mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat

Die Pufferzusammensetzung des HIC-Eluats, das gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde durch Gelpermeationschromatographie, die auf einer Superose 12-Säule (vermarktet von Pharmacia Biotech aus Uppsala, Schweden) durchgeführt wurde, die vorher mit einem Puffer mit der folgenden Zusammensetzung: 0,25 M Hepes, 4 mM CaCl&sub2;, pH 7,8, äquilibriert wurde, ausgetauscht. Zu Aliquots der r-VIII SQ-Lösung wurden ein 35-, 60- und 100-facher molarer Überschuss (bezogen auf r-VIII) eines gemischten Anhydrids des mPEG-Succinats (MG 3.000) zugegeben. Die Mischungen wurden für 1,5 Stunden in einer rotierenden Vorrichtung bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Um den Überschuss der mPEG-Succinsäure zu entfernen und um die heterogene Population konjugierter r-VIII nach der Größe aufzutrennen, wurde eine Gelpermeationschromatographie durchgeführt, wobei nun eine Superose 6-Säule (vermarktet von Pharmacia Biotech aus Uppsala, Schweden) verwendet wurde. Für jede Kopplungsreaktion wurden die Fraktionen, welche der ersten und zweiten Hälfte des Proteinpeaks entsprachen, getrennt analysiert (in Tabelle I als Pool 1 und Pool 2 bezeichnet). Tabelle I stellt die Ergebnisse des Konjugierens von r-VIII SQ mit dem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat dar. TABELLE I
Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, wurde die spezifische Aktivität von r-VIII selbst bei diesem niedrigen Konjugationsgrad drastisch verringert.

BEISPIEL 3

Faktor VIII, adsorbiert an einen Q-SepharoseTM-FF-Gel während der Kopplung mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat

Reaktive Lysine, die von negativen Ladungen auf dem Faktor VIII-Molekül umgeben waren, wurden vor einer Konjugation mit mPEG durch Adsorption des Faktors VIII an einem Anionenaustauschergel geschützt. Eine Säule, die mit: Q-SepharoseTM-FF (vermarktet von Pharmacia Biotech aus Uppsala, Schweden) gepackt war, welche mit einem Puffer mit der folgenden Zusammensetzung: 50 mM L-Histidin, 0,15 M NaCl, 4 mM CaCl&sub2;, pH 6,5, äquilibriert war, wurde verwendet, um den Faktor VIII zu adsorbieren. Ein HIC-Eluat, das gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde auf die Säule geladen. Um geeignete Bedingungen zur Kopplung mit mPEG zu erhalten, wurde die Säule mit einem Puffer gewaschen, welcher 0,25 M Hepes, 4 mM CaCl&sub2;, pH 7,8, enthielt, bevor das mPEG zugegeben wurde. Das Gel wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, und ein gemischtes Anhydrid von mPEG-Succinat (MG 3.000) wurde zu der Aufschlämmung in einer Menge zugegeben, welche dem molaren Überschuss in Bezug auf Faktor VIII entsprach, wie er in Tabelle II angegeben ist. Die Reaktion wurde bei einer Rotation für 1,5 Stunden inkubiert. Die Säule wurde dann erneut gepackt, und der konjugierte r-VIII wurde mit einem Puffer eluiert, der 50 mM L-Histidin, 0,6 M NaCl, 4 mM CaCl&sub2;, pH 6,8 enthielt. Vier Präparationen wurden durchgeführt, wobei eine konstante Menge an r-VIII SQ pro Gelmenge aufgetragen wurde. Alle Schritte würden bei Raumtemperatur durchgeführt. Tabelle II gibt die Ergebnisse des konjugierten r-VIII SQ an, welcher an einem Q-SepharoseTM-FF-Gel adsorbiert war. TABELLE II
Wie aus Tabelle II ersichtlich ist, wird die spezifische Aktivität des könjugierten r-VIII SQ im Vergleich zu dem in Beispiel 2 konjugierten r-VIII SQ in einem signifikant höheren Ausmaß beibehalten.

BEISPIEL 4

F VIII, adsorbiert an einem Q-SepharoseTM-FF-Gel während der Kopplung mit mPEG-Tresylat

In diesem Beispiel wurden alle Schritte der Adsorption, Kopplung und Elution von r-VIII SQ an Q-SepharoseTM-FF-Gel wie in Beispiel 3 durchgeführt. mPEG-Tresylat (MG 5.000) wurde verwendet, um den Faktor VIII zu konjugieren. Tabelle III gibt die Ergebnisse des konjugierten r-VIII SQ, welcher an Q-SepharoseTM-FF-Gel adsorbiert war, mit mPEG-Tresylat gemäß der Erfindung an. TABELLE III
Die spezifische Aktivität war in diesem Fall etwas niedriger als im Beispiel 3, möglicherweise aufgrund des höheren Molekulargewichts von mPEG.

BEISPIEL 5

Faktor VIII, adsorbiert an einem Tentakelanionenaustauschergel während der Kopplung mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat

Eine Säule, die mit FractogelTM EMD TMAE 650 (vermarktet von Merck) gepackt war, wurde verwendet, um r-VIII SQ zu adsorbieren. Alle Schritte wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt. Tabelle IV gibt die Ergebnisse der Konjugation von r-VIII SQ, das an einem Tentakelanionenaustauschergel adsorbiert war, mit einem gemischten Anhydrid von mPEG-Succinat gemäß der Erfindung an. TABELLE IV

BEISPIEL 6

Thrombinaktivierung von mPEG-konjugiertem Faktor VIII

Die Thrombinaktivierung von konjugiertem r-VIII SQ wurde in einem in-vitro-Test getestet, welcher den Fachleuten wohlbekannt ist. Eine Probe, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurde, was zu einem Derivatisierungsgrad von 4 mPEG/r-VIII SQ führte, wurde getestet. Der konjugierte r-VIII SQ konnte in einer dcsisabhängigen Weise durch menschliches Thrombin aktiviert werden. Anschließend wurde die Inaktivierung verfolgt. In Fig. 1 ist die Kurve der erhaltenen Aktivitätsänderungen gezeigt, wenn 1 NIH-Einheit von Thrombin pro 1 Einheit konjugiertem r-VIII SQ zugegeben wurde. Ein einstufiges Gerinnungsverfahren, das im wesentlichen gemäß Mikaelsson et al., 1983, Blood 62, Seite 1006, durchgeführt wurde, wurde für einen unmittelbaren Test der Proben aus der Reaktionsmischung verwendet. Eine 30-fache Aktivierung wurde innerhalb einer Minute erhalten, worauf die Inaktivierung folgte. Die Aktivierungs-Inaktivierungsmuster, die mit Thrombin erhalten wurden, stimmten mit früher berichteten Untersuchungen über die Faktor VIII-Thrombin-Wechselwirkung überein (Fulcher et al., 1983, Blood, 61, Seite 807, Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, Seite 2979, Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, Seite 505, Rotblat et al., 1985, Biochemistry, 24, Seite 4294).

BEISPIEL 7

Stabilitätstests von mPEGyliertem Faktor VIII in einem Extrakt aus Gewebe von Schweinen

Um den Einfluss der mPEG-Konjugation auf die Stabilität von Faktor VIII in einer Lösung, welche für die subkutane Umgebung repräsentativ ist, auszuwerten, wurde ein in-vitro-Test unter Verwendung eines Gewebeextrakts von Schweinen durchgeführt. Zwei Präparationen von mPEG-konjugiertem Faktor VIII wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und in dem Extrakt inkubiert, und Aliquots wurden nach 0, 2, 4, 6 und 24 Stunden unter Verwendung eines chromogenen Tests im Hinblick auf die Aktivität als Koagulationsmittel analysiert. Während der ersten 6 Stunden entsprach der Konjugationsgrad der verbleibenden Aktivität. TABELLE V
Die Ergebnisse in Tabelle V und Fig. 2 zeigen deutlich, dass die mPEG-Konjugation die Stabilität des Faktors VIII signifikant erhöhte.

BEISPIEL 8

Bioverfügbarkeitsstudie von mPEGyliertem Faktor VIII in Langschwanzmakaken

Um den Einfluss der mPEG-Konjugation auf die in vivo-Stabilität von Faktor VIII auszuwerten, wurde eine pharmakokinetische Untersuchung durchgeführt. Zwei Präparationen von mPEG-konjugiertem Faktor VIII wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt, und deren spezifische Aktivitäten wurden bestimmt, wie in Tabelle VI angegeben ist. Um eine hohe Homogenität des derivatisierten Materials zu erreichen, welches durch das Kopplungsverfahren hergestellt wurde, wurde zweimal eine Fraktionierung jeder Präparation durch Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Eine Superdex 200 PG XK 16/60-Säule (vermarktet von Pharmacia Biotech aus Uppsala, Schweden), die mit 19 mM L-Histidin, 0,31 M NaCl, 3,4 mM CaCl&sub2;, 0,02% Tween 80, pH 7,0, äquilibriert war, wurde verwendet. Eine Volumenreduktion der Faktor VIII-Lösungen vor der zweiten Gelpermeationschromatographie wurde in autoklavierten Centriplus 30-Konzentratoren, Ultrafiltrationsvorrichtungen zur Zentrifugation (Cutoff 30 kDa, vermarktet von Amicon Inc. MA, USA), durchgeführt. Die Lösungen wurden dreimal bei 2.500 · g für 45 Minuten konzentriert. Die vereinigten Fraktionen, die nach der zweiten Gelpermeationschromatographie erhalten wurden, wurden anschließend in einem Puffer verdünnt, welcher sich nach der Endformulierung richtete: 19 mM L-Histidin, 0,31 M NaCl, 3,4 mM CaCl&sub2;, 0,02% Tween 80, 17,5 mM Sucrose, pH 7,0. Die Proteinlösungen wurden schließlich filtriert, indem 0,22 um Millex GV-Filter (vermarktet von Millipore, MA, USA) verwendet wurden, und anschließend in autoklavierte Flaschen gefüllt. Die Lösungen wurden bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert.
Sechs weiblichen Langschwanzmakaken wurden einzelne intravenöse Dosen der Präparation 1 mit 250 IU/kg und einzelne subkutane Dosen der Präparation 1 und der Präparation 2 mit 1.500 IU/kg bei unterschiedlichen Gegebenheiten verabreicht. Alle Lösungen wurden vor der Verabreichung mit Wasser zur Injektion 1 : 1 verdünnt. Die Injektionsstelle zur subkutanen Verabreichung war die linke oder rechte Dorsalregion des Tieres und zur intravenösen Verabreichung die linke bzw. die rechte Vena cephalica. Blutproben wurden von allen Tieren durch Punktion der Oberschenkelvene in Röhrchen, welche Natriumcitrat als Antikoagulans (10% des Gesamtvolumens) enthielten, zu den folgenden Zeiten nach der Injektion abgenommen:
Intravenöse Verabreichung: 0 (Vordosis), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 h.
Subkutane Verabreichung: 0 (Vordosis), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 h.
Eine pharmakokinetische Untersuchung des nicht konjugierten Faktors VIII wurde in einer separaten Studie bei derselben Spezies durchgeführt. Die Dosen, der Verabreichungsweg und die Ergebnisse (Mittelwert (±Standardabweichung (SD))) sind in Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI
I. V. = intravenös
S. C. = subkutan
1) F = AUC (S. C.) X DOSIS (I V.)/AUC (I. V.) X DOSIS (S. C.)
wobei AUC die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeitkurve ist.
Wie aus der Tabelle VI ersichtlich ist, führte die subkutane Verabreichung beider Präparationen des mPEG-konjugierten Faktors VIII zu einer deutlich höheren Bioverfügbarkeit im Vergleich zu der subkutanen Verabreichung des nicht konjugierten r-VIII SQ. Eine statistische Analyse unter Verwendung des Studenten-t-Tests bestätigte, dass der Unterschied signifikant war.

Claims

1. Ein Verfahren zur Verbesserung der in vivo-Funktion des rekombinanten Faktors VIII SQ durch ein Abschirmen exponierter Targets dieses Polypeptids, welches gekennzeichnet ist durch

(a) Immobilisieren des rekombinanten Faktors VIII SQ durch Wechselwirkung mit einem gruppenspezifischen Adsorbens, das Anionenaustauscherliganden trägt;

(b) Aktivieren eines biokompatiblen Polymers;

(c) Konjugieren des aktivierten biokompatiblen Polymers mit außen liegenden Stellen des immobilisierten rekombinanten Faktors VIII SQ; und danach

(d) Eluieren des Konjugats von dem Adsorbens.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die spezifische Aktivität des Faktors VIII SQ vor der Immobilisierung wenigstens 2.000 IU/mg Gesamtprotein beträgt.

3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die spezifische Aktivität des Faktors VIII SQ vor der Immobilisierung in dem Bereich von 5.000 bis zu 20.000 U/mg Gesamtprotein liegt.

4. Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aktivität des Faktors VIII SQ vor der Immobilisierung wenigstens 2.000 IU/ml beträgt.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Aktivität des Faktors VIII SQ vor der Immobilisierung in dem Bereich von 5.000 bis zu 50.000 IU/ml liegt.

6. Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das biokompatible Polymer ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Homopolymeren, Copolymeren oder Blockcopolymeren von mit Monoalkylkappen versehenen Polyalkylenoxiden.

7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das mit Monoalkylkappen versehene Polyalkylenoxid ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglycolhomopolymeren und Polypropylenglycolhomopolymeren.

8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das mit Monoalkylkappen versehene Polyalkylenoxid ein Monomethoxypolyethylenglycol (mPEG) ist.

9. Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Anionenaustauscherliganden ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus quartärem Aminomethyl, quartärem Aminoethyl und Trimethylaminoethyl oder einer Mischung von diesen.