CN101678066B - 稳定用于冷冻储藏的重组蛋白液体溶液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稳定用于冷冻储藏的重组蛋白本体溶液的方法，其包括提供部分纯化的具有至少100mM单价盐浓度的重组蛋白溶液，和以足以使溶液在冷冻后具有-56℃或更高玻璃转化温度的量向所述溶液中加入碳水化合物。

Description

稳定用于冷冻储藏的重组蛋白液体溶液的方法

本申请要求2007年4月26日提交的，临时专利申请60/926,698的权益，其公开内容引入作为参考。

发明领域

本发明涉及重组蛋白液体溶液、优选本体溶液的冷冻和储藏。

发明背景

在细胞培养物中生产重组蛋白通常包括一系列的纯化步骤，通过这些步骤从重组宿主细胞和/或相关培养基中回收所需的蛋白产品。许多重要的重组蛋白采用大工业规模进行生产。对药物蛋白而言，例如，为了获得所需水平的产品纯度，使用一个以上的纯化步骤并不罕见。

在最终纯化以用于制剂之前，储藏已初始纯化过但未最终纯化的重组蛋白的本体溶液可能是必需的。例如，重组发酵反应的含蛋白产物可在亲和柱或离子交换柱中初始纯化。在最初通过柱后，蛋白产物仅是部分纯化的，溶液仍然包含例如细胞培育残留物和其他蛋白的污染物。在最终配制形成药物产品之前，本体溶液必须进一步处理以得到满意纯度的蛋白。

通常，用于从首次通过纯化处理中回收蛋白的溶液，例如洗脱缓冲液，是高盐溶液。对于柱洗脱液，需要高盐浓度来从柱上释放蛋白。因此，从首次通过纯化处理中回收的“本体”溶液可能包含具有高浓度单价盐的溶液，该单价盐通常是氯化钠，但也可能是氯化钾或其他盐。

由于溶液的高盐浓度和非常低的蛋白浓度，对重组蛋白“本体”溶液的储藏提出了独特的挑战。理想地，蛋白储藏在低于玻璃转化温度下以确保稳定，因为在玻璃态时，在制药期间蛋白的失活和变性非常缓慢。另一方面，溶液中高浓度盐的存在往往会降低其玻璃转化温度，并且在具有高盐浓度和低蛋白浓度的溶液中，需要非常低的温度来实现这种状态。

出于成本和效率原因，但同时需要保持蛋白的稳定性和活性，需要在较高温度下冷冻储藏大体积量的本体溶液。

发明概述

本发明是稳定用于冷冻储藏的重组蛋白液体溶液的方法，其包括：提供重组蛋白的溶液，其中所述溶液具有至少100mM的单价盐浓度，例如NaCl和/或KCl；以足以使溶液在冷冻后具有-56℃或更高玻璃转化温度的量向所述溶液中加入碳水化合物，和冷冻用于储藏的所述溶液。

本发明还提供重组蛋白的液体溶液，将其稳定化以便冷冻储藏，该溶液包括足以使溶液在冷冻后具有-56℃或更高玻璃转化温度的量的碳水化合物。

附图说明

图1显示了向重组因子VIII本体溶液中加入碳水化合物，并且带有或不带有本文中描述的其他辅料对保持重组蛋白活性的影响。四种不同的制剂指定为F1、F2、F3和F4。在冷冻和在-30℃下储藏后在所示的不同时间点测定因子VIII的活性，直至24周。在加入碳水化合物前，除了如本文所述进行稀释的F3，本体溶液包括约600mM NaCl、10mM CaCl₂、20mM咪唑和0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)。以时间对凝固能力(IU/mL)作图。

图2显示了在冷冻和在-70℃和-30℃储藏后图1所示的但是不含稳定化辅料的实验中所用的本体因子VIII溶液的重组因子VIII活性的损失。标示“LN₂至-70℃”表示在储藏于-70℃前样品在液氮中冷冻，“LN₂至-30℃”表示在储藏于-30℃前样品在液氮中冷冻。“EVA至-70℃”表示样品在聚合物储藏包中冷冻并储藏于-70℃。

优选实施方案的描述

重组蛋白的液体溶液可以包含使用亲和层析、离子交换色谱或类似方法从重组细胞培养物中获得的任何重组蛋白的溶液。在优选的实施方案中，溶液是本体溶液，其包括部分纯化的溶液。在所有实施方案中，液体溶液是高盐溶液，优选水溶液。

重组蛋白包括，例如但不限于，凝血因子、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、肽类激素、趋化因子、细胞因子、生长因子、酶类、血蛋白类如血红蛋白、α-1-抗胰蛋白酶，纤维蛋白原、人血清白蛋白、凝血酶原/凝血酶、抗体、血液凝固和/或凝血因子，和其生物学活性片段；如因子V、因子VI、因子VII、因子VIII和其衍生物，例如B-域缺失的因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、菲莱彻(Fletcher)因子、菲茨杰拉德(Fitzgerald)因子和von Willebrand因子；乳蛋白质类例如酪蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、α-1抗胰蛋白酶、蛋白因子、免疫蛋白，和其生物活性片段；和抗体，包括单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体，和其他能于重组细胞培养物中产生的抗体变异分子。

当前优选的重组蛋白是重组因子VIII，本文应用的因子VIII包括因子VIII工程改造的的变体，如因子VIII的B-域缺失的变体。

在本发明意义上“本体”溶液包括部分但未完全纯化的重组蛋白的液体溶液，其包括至少100mM的单价盐。单价盐优选为通常用于从纯化柱上洗脱重组蛋白的NaCl。然而，NaCl可以被KCl全部或部分地替换。本体溶液也可以包括不同量的其他盐，如包括氯化钙在内的二价盐。

“部分但未完全纯化”是指液体溶液已经经过至少一次纯化步骤，但液体溶液仍然包含大量的残留杂质，在最终产品制剂之前需要至少一次进一步的纯化步骤。例如，重组因子VIII的“本体”溶液在最终制剂之前必须进一步纯化，在因子VIII和其他蛋白质的情况下该纯化可以包括冻干法。

液体溶液包括至少100mM单价盐，优选100mM NaCl，更优选至少300mMNaCl，更优选至少500mM NaCl，更优选至少560mM NaCl和再更优选至少600mM NaCl。重组蛋白的本体溶液在初始的纯化步骤后具有如此高单价盐浓度并不罕见。

在本发明进一步的实施方案中，液体溶液包含100-200mM NaCl、100-300mMNaCl、200-300mM NaCl、100-400mM NaCl、100-500mM NaCl、100-600mM NaCl、100-800mM NaCl、300-500mM NaCl、300-600mM NaCl、300-800mM NaCl、400-600mM NaCl、400-800mM NaCl、500-600mM NaCl、560-700mM NaCl和500-800mM NaCl。

本发明的“本体”溶液特征还在于其非常低的蛋白浓度。在本发明的实施方案中，本体溶液中重组蛋白的浓度可以低至0.0001微摩尔、0.001微摩尔或0.01微摩尔。在本发明的实施方案中，本体溶液中重组蛋白的浓度可以高达10微摩尔、1微摩尔或0.1微摩尔。在这些上下限度任意组合内的任何浓度的蛋白质都是本发明意义上的“本体”溶液的具体实施方案。

在冷冻前向液体溶液中加入碳水化合物，其量足以使溶液在冷冻后具有-56℃或更高的玻璃转化温度，更优选至少-34℃，或任何介于其间的用整数或分数表示的温度。高盐、低蛋白本体溶液的标准玻璃转化温度基本上低于-56℃，例如，-60至-70℃。提高玻璃转化温度至-56℃所需加入的碳水化合物的量需要将蛋白浓度作为一个因素加以考虑。更高的蛋白浓度往往会自身提高本体溶液的玻璃转化温度。作为另外的因素，碳水化合物的量不应过多地增加溶液的粘度，且优选保持粘度低于约9.0cp。溶液的电导系数会通过加入碳水化合物而改变，优选地，保持低于约39mS/cm。

在本发明的上下文中，冷冻溶液是指冷冻本体液体溶液，并且要区别于包含不同技术考虑的冷冻干燥。

碳水化合物可以为药物制剂中通常使用的类型的碳水化合物，包括糖类和二糖、寡聚糖和多糖。实例包括右旋糖酐、环糊精、壳聚糖、淀粉、透明质酸、纤维素、棉子糖、麦芽糖、乳糖、水苏糖和其组合。优选的实例是批准用于注射的碳水化合物，包括蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、右旋糖酐，或其组合。药用级的碳水化合物能够从许多供应商那里购买到。

可以容易地确定冷冻中为了保护溶液所需要的碳水化合物的精确量，例如通过示差扫描量热法，并且该精确量取决于特定的蛋白和特定的碳水化合物。基于液体溶液的重量，一般优选的碳水化合物的量是8-25％(w/w)。

在本发明的具体实施方案中，基于液体溶液的重量，碳水化合物的量是约8-15％、12-20％、16-20％、15-25％和20-25％(w/w)。

来源于初始纯化(例如洗脱)的其他成分可以存在于本体溶液中，包括表面活性剂(例如吐温80或聚乙二醇辛基苯基醚)、氯化钙或咪唑。其他辅料可以加入到液体溶液中。如下面的制剂所示，附加表面活性剂可以作为赋形剂加入。氨基酸(例如甘氨酸)可以作为另外的赋形剂加入。

实施例

使用示例性的重组蛋白、重组因子VIII举例说明本发明。重组因子VIII通过本领域已知方法生产，例如US专利号5,576,194；5,804,420；和5,733,873中所描述的。在优选的实施方案中，在哺乳动物细胞中，在大规模的发酵反应器内于不含血清和/或不含蛋白的培养基中生产重组因子VIII。优选通过重组细胞将重组因子VIII分泌到介质中。

通过宿主细胞表达重组因子VIII(全长)并通过膜吸附色谱从净化的组织培养物液体中纯化。膜吸附器处理通过结合和洗脱从细胞培养物液体中分离和浓缩重组因子VIII(通常如Suck等，J.Biotechnology，121：361-367，2006中所述)。洗脱液分成四批并且将每批转移到无菌瓶中(每瓶400mL)。除了因子VIII和残留的杂质外，洗脱液(本体溶液)含有约600mM NaCl、10mM CaCl₂、20mM咪唑和0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。洗脱液中重组因子VIII的浓度为大约0.067微摩尔。

随后，在室温下以如下表1中制剂1、2、3和4所示的量将碳水化合物或碳水化合物的组合，连同其他所示的辅料加入到每个瓶子中。

表1

制剂1	制剂2	制剂3	制剂4
				8％蔗糖3％甘氨酸	15％蔗糖	10％羟乙基淀粉8％海藻糖80ppm吐温	15％右旋糖酐8％海藻糖80ppm吐温

表1中所有成分以基于溶液重量的重量百分比表示。碳水化合物和其他辅料从商业上获得。从每个新鲜制备的批次中取样。使用标准凝固分析评价制剂(1)、(2)、(3)和(4)样品的因子VIII的活性。

制剂3由相同的洗脱液制备，但是使用含20mM咪唑和10mM CaCl₂的缓冲液稀释以降低一半的NaCl浓度。实施该稀释液以检测本发明方法对具有较低的、但仍然相对高的单价盐浓度的溶液的适用性。

使用差示扫描量热仪测定每个样品的玻璃转化温度(杜邦调试的差示热扫描仪)。制剂1、2、3和4显示的玻璃转化温度分别是-56℃、-52.1℃、-34.9℃和-35.5℃，在每种情况下，玻璃转化温度显著高于没有添加碳水化合物时观察到的玻璃转化温度(对于不含碳水化合物的同样的本体溶液测定的温度在-60和-70℃之间)。制剂的粘度系数为：制剂1：1.8428cP；制剂2：3.1089cP；制剂3：6.8076cP；和制剂4：7.2123cP。这些制剂的导电率是：制剂1：27.8mS/cm；制剂2：25.57mS/cm；制剂3：21.05mS/cm；和制剂4：32.1mS/cm。

通过在不同时间点对因子VIII活性的凝固分析测定，发现所有的制剂在-80、-30、-18和-14℃下冷冻储藏至24周后是稳定的，没有显著的活性损失。

如图1所示，本发明的全部四种制剂在-30℃储藏至24周后仍保持因子VIII的凝固活性基本上在初始水平。

如图2所示，在没有加入辅料的情况下，溶液在-30℃储藏仅一天之后，基本上丧失了所有的因子VIII的凝固活性。

Claims (18)

1.一种稳定用于冷冻储藏的重组蛋白液体溶液的方法，包括： 

a.提供重组蛋白液体溶液，其中所述溶液包含至少100nmM的NaC1和／或KCl浓度和0.0001-1.0微摩尔的重组蛋白浓度； 

b.以足以使溶液在冷冻后具有-56℃或更高玻璃转化温度的量向所述溶液中加入碳水化合物； 

c.冷冻所述溶液；和 

d.在冷冻所述溶液而不冷冻干燥所述溶液的温度下储藏所述溶液。 

2.如权利要求1所述的方法，其中重组蛋白液体溶液包含本体溶液。 

3.如权利要求1所述的方法，其中溶液包含至少100mMNaCl浓度。 

4.如权利要求1所述的方法，其中基于溶液的重量，加入8-25％重量的碳水化合物。 

5.如权利要求1所述的方法，其中碳水化合物选自蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、右旋糖酐和它们的组合。 

6.如权利要求2所述的方法，其中本体溶液包含至少300mM的NaCl浓度。 

7.如权利要求2所述的方法，其中本体溶液包含至少600mM的NaCl浓度。 

8.如权利要求1所述的方法，其中重组蛋白是因子Ⅷ或其衍生物。 

9.如权利要求1所述的方法，其中玻璃转化温度在-56℃和-35℃之间。 

10.如权利要求1所述的方法，进一步包括在冷冻前向溶液中加入氨基酸和／或表面活性剂。 

11.一种用于制备重组蛋白的药物制剂的方法，所述方法包括： 

a提供重组蛋白的本体液体溶液，其中所述本体液体溶液包含至少100mM的NaCl和／或KCl浓度和0.0001-1.0微摩尔的重组蛋白浓度； 

b.以足以使所述本体液体溶液在冷冻后具有-56℃或更高玻璃转化温度的量向所述本体液体溶液中加入碳水化合物； 

c.冷冻所述溶液； 

d.在冷冻所述溶液而不冷冻干燥所述溶液的温度下储藏所述溶液； 

e.融化所述溶液； 

f.纯化所述溶液以获得重组蛋白的纯化溶液；和 

g.将从所述纯化溶液获得的重组蛋白配制成药物制剂。 

12.如权利要求11所述的方法，其中基于所述本体液体溶液的重量，加入8-25％重量的碳水化合物。 

13.如权利要求11所述的方法，其中碳水化合物选自蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、右旋糖酐和它们的组合。 

14.如权利要求11所述的方法，其中本体液体溶液包含至少300mM的NaCl浓度。 

15.如权利要求11所述的方法，其中本体液体溶液包含至少600mM的NaCl浓度。 

16.如权利要求11所述的方法，其中重组蛋白包含因子Ⅷ或其衍生物。 

17.如权利要求11所述的方法，其中玻璃转化温度在-56℃和-35℃之间。 

18.如权利要求11所述的方法，其进一步包括在冷冻前向本体液体溶液中加入氨基酸和／或表面活性剂。