DE69532940T2

DE69532940T2 - Verfahren zur Herstellung modifizierter Immunoglobuline mit verminderter Immunogenität der variablen Domänen eines Antikörpers der Maus, Zusammensetzungen, die diese enthalten

Info

Publication number: DE69532940T2
Application number: DE69532940T
Authority: DE
Inventors: Rolando Perez Rodriquez; Josefa Lombardero Valladares; Cristina Maria Mateo De Acosta Del Rio
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2015-06-28
Also published as: CA2153135A1; DK0699755T3; JPH08280387A; EP0699755B1; EP0699755A2; US5712120A; DE69532940D1; ES2220918T3; CU22615A1; JP3238049B2; CA2153135C; CN1279168C; CN1133886A; EP0699755A3; PT699755E; ATE265531T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere ein Verfahren, um modifizierte Immunglobuline mit einer verringerten Immunogenität von variablen Domänen eines Antikörpers der Maus zu erhalten, und diese enthaltende Zusammensetzungen.
EINSCHLÄGIGER STAND DER TECHNIK
Das Immunsystem baut Antikörper auf, die sich mit einem sehr weiten Bereich von Antigenen mit einer hohen Avidität und Spezifität verbinden und Starter-Effektor-Mechanismen auslösen. Antikörper wurden in der Medizin als diagnostische und therapeutische Mittel verwendet, und mit dem Erscheinen neuer Technologien wurde deren Möglichkeit immer weiter verbessert.
Die Hybridom-Technologie ermöglichte die Abtrennung von Zellinien, die Antikörper mit einer einzigen Spezifität ausscheiden (Köhler G., Milstein C (1975) Nature (London) 256, 495–497), und die Gentechnologie ermöglichte die Konstruktion eines Bereichs von aus Hybridomen technisch erzeugten Antikörpern.
Die technische Erzeugung von Antikörpern wird durch die Struktur ihrer Domänen erleichtert und kann durch den Erwerb oder Verlust einiger ihrer Eigenschaften die Verwendbarkeit vieler Antikörper weiter verbessern. Die Antigen bindenden Eigenschaften des Antikörpers liefern die Erkennungsfunktion, und diese kann an einen oder mehrere aus einer Anzahl von Effektoren gebunden werden. Die Kombination dieser beiden Merkmale muß dann gegenüber den Kriterien der Wirksamkeit, Spezifität und Immunogenität getestet werden.
Monoklonale Antikörper erzeugende Hybridome wurden am einfachsten von immunisierten Nagern erhalten. Gegenwärtig erfolgt die Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper der Maus in großem Umfang für die Abbildung und Behandlung der Malignität, für die prophylaktische Verabreichung zum Schutz vor einem toxischen Schock, zur Modifizierung von Abstoßungsvorgängen von Implantaten und zur Abschwächung akuter entzündlicher Reaktionen.
In den meisten Fällen, in denen für die Therapie Antikörper von Nagern verwendet wurden, wurde bei den Empfängern eine Immunreaktion ausgelöst, die sich gegen den Antikörper richtete. Diese Reaktionen haben die Dauer und Wirksamkeit der Therapie eingeschränkt.
Die Entwicklung ähnlicher Reagenzien aus Humanquellen war enttäuschend, obwohl einige Möglichkeiten existieren, wobei zum Beispiel SCID-hu-Mäuse, die in vitro Immunisierung, rekombinatorische Banken oder irgendeine nützliche Kombination davon verwendet wurden. Da bereits viele gut gekennzeichnete monoklonale Antikörper von Nagern zur Verfügung stehen, die in einer Klinik verwendet werden könnten, falls die Immunreaktion aufgehoben werden kann, hat die Produktion technisch erzeugter Antikörper viel Aufmerksamkeit erzielt.
Technisch erzeugte Antikörper wurden gestaltet, daß sie möglichst viele fremdkörperbedingte Sequenzen durch äquivalente Human-Sequenzen auszutauschenen. Zu den gentechnisch erzeugten Antikörpern gehören chimäre Antikörper, bei denen Segmente von Immunglobulinen von verschiedenen Spezies miteinander verbunden sind.
Zuerst wurden chimäre Antikörper konstruiert, die die variablen Regionen vom Nager enthielten, die mit konstanten Domänen vom Menschen vereinigt waren.
Insbesondere sind chimäre Maus/Human-Antikörper für die Immuntherapie sehr nützlich, für die sie im Vergleich mit ihren Gegenstücken der Maus die gleiche Spezifität, jedoch eine geringere Immunogenität zeigen sollten. Die folgenden Dokumente beschreiben die Technologie der chimären Antikörper: Lobuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4220–4224 (1989); US-Patent 4,816,567; die Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02671, am 7. Mai 1987 veröffentlicht; die EP-Veröffentlichung Nr. 255,694, am 10. Februar 1988 veröffentlicht; die EP-Veröffentlichung Nr. 274,394, am 13. Juli 1988 veröffentlicht; die EP-Veröffentlichung Nr. 323,806, am 12. Juli 1989 veröffentlicht; die Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/00999, am 9. Februar 1989 veröffentlicht; die EP-Veröffentlichung Nr. 327,000, am 9. August 1989 veröffentlicht; die EP-Veröffentlichung Nr. 328,404, am 16. August 1989 veröffentlicht; und die EP-Veröffentlichung Nr. 332,424, am 12. September 1989 veröffentlicht.
Es ist bemerkenswert, daß selbst der Austausch der konstanten Regionen durch Human-Äquivalente deren Immunogenität nicht wirksam verringern kann. Noch bei etwa der Hälfte der Empfänger stellte sich eine Immunreaktion auf die variablen Regionen vom Nager ein. Danach wurden die Antikörper vom Nager extensiv manipuliert, damit sie Human-Antikörpern noch mehr ähneln.
Eine weitere Verringerung der Immunogenität von chimären Antikörpern wurde erreicht, indem nur die die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDR) vom monoklonalen Antikörper vom Nager auf Framework-Regionen (FR) vom Menschen gepflanzt wurden, bevor diese anschließend mit einer geeigneten konstanten Domäne vereinigt wurden (Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986)). Dieses Verfahren, um die CDR-Verpflanzung zu vollziehen, führt oft zu unvollständig humanisierten Antikörpern, das bedeutet, daß der resultierende Antikörper entweder Affinität verloren hat, oder daß bei einem Versuch, seine ursprüngliche Affinität zu erhalten, eine Anzahl von Framework-Resten der Maus die entsprechenden Reste des gewählten Human-Frameworks ersetzt hat (Winter, Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 239,400; Riechmann et al., Nature 332: 323–327 (1988)).
Es wurde eine Anzahl von Strategien mit der Aufgabe entwickelt, eine Mindestanzahl von Resten für die Übertragung zu identifizieren, um eine vorteilhafte Bindungsaffinität mit den geringsten möglichen Folgen für die Immunogenität zu erreichen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß jede dieser Strategien bei der Wiederherstellung der Stammaffinität nur bedingt erfolgreich war.
Die Eigenschaften in bezug auf die Ligandenbildung eines Antikörper-Kombinationsortes werden primär von der Struktur und der relativen Natur der CDR bestimmt, obwohl festgestellt wurde, daß auch einige benachbarte Framework-Reste an der Antigenbindung beteiligt sind (Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59: 439–473 (1990)). Folglich kann die genaue Spezifität eines Antikörpers erhalten bleiben, wenn seine CDR-Strukturen und einige benachbarte Reste, deren Wechselwirkung untereinander und deren Wechselwirkung mit dem Rest der variablen Domänen exakt erhalten bleiben können.
Ein weiteres Verfahren zum Humanisieren eines Antikörpers wurde von Padlan vorgeschlagen (Padlan, Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 0 519 596 A1; Padlan, Molecular Immunology 28: 489–498 (1991)). Es basiert auf der Tatsache, daß die Antigenität eines Proteins von der Natur seiner Oberfläche abhängt, und eine Anzahl der für ein Lösungsmittel zugänglichen Reste in der variablen Region eines Nagers durch Reste von einem Human-Antikörper ausgetauscht werden. Die Stellen dieser Reste werden durch eine Prüfung der Strukturen des Human-Antikörpers KOL und des Antikörpers J539 der Maus durch hochauflösende Röntgenstrahlen identifiziert. Eine Auswahl der HumanOberflächenreste wird erreicht, indem die Antikörper-Untergruppe mit der größten Homologie identifiziert wird.
Die Natur der Proteinoberfläche ist für deren Erkennung und Internisierung durch Antigen-Processing-Zellen, insbesondere durch Antigen-spezifische B-Zellen, wichtig. Außerdem stellt die Erkennung spezifischer linearer Sequenzen durch T-Zellen ebenfalls ein wichtiges Element bei der Immunogenität von Proteinen dar.
Einige Gruppen haben automatisierte computergesteuerte Verfahren zur Identifizierung von Sequenzmerkmalen und Strukturdeterminanten entwickelt, die bei der MHC-Restriktion von Antigen-Peptiden für Helfer-T-Zellen eine Rolle spielen (Bersofsky et al., J. Immunol. 138: 2213–2229 (1987), Elliott et al., J. Immunol. 138: 2949–2952 (1987), Reyes et al., J. Biol. Chem. 264: 12854–12858 (1989)). Unter Anwendung dieser Algorithmen war es möglich, vorhergesagte, einer T-Zelle präsentierte Peptide zu identifizieren.
Die Analyse von Antikörpern mit einer bekannten Atomstruktur gab einen Aufschluß über die Zusammenhänge zwischen der Sequenz und der dreidimensionalen Struktur von Antikörper bindenden Orten (Chothia et al., J. Biol. Chem. 196: 901–917 (1987)). Diese Zusammenhänge beinhalten, daß außer bei der dritten Region in den VH-Domänen bindende Ortsschleifen eine aus der geringen Anzahl der Konformationen der Hauptkette aufweisen: "kanonische Strukturen". Die kanonische Struktur, die in einer bestimmten Schleife erzeugt wird, wird durch deren Größe und das Vorhandensein bestimmter Reste an den Schlüsselstellen sowohl in der Schleife als auch den Framework-Regionen bestimmt.
Ein weiterer Teilsatz von Framework-Resten wurde als "Vernier"-Zone definiert, die die CDR-Struktur und die Feinabstimmung für die Anpassung an ein Antigen regeln kann (Foot et al., J. Mol. Biol. 224: 487–499 (1992)). Es hat sich gezeigt, daß Substitutionen dieser Reste wichtig sind, um in den Antikörpern mit einer CDR-Verpflanzung die Affinität wiederherzustellen, so daß die Vernier-Zone eine einleuchtende Konsequenz für die Gestaltung von humanisierten Antikörpern ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist folglich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Maßnahme für die Umwandlung eines monoklonalen Antikörpers einer Säugetierart in einen monoklonalen Antikörper einer anderen Art anzugeben. Eine weitere Aufgabe besteht darin, potentielle T-Epitope in der Sequenz von variablen Regionen vorherzusagen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, die für die Spezifität oder Immunogenität von Spezies verantwortlichen Aminosäurereste innerhalb der Sequenz des monoklonalen Antikörpers zu identifizieren, der für die T-Immunogenität verantwortlich ist. Eine weitere Aufgabe besteht darin, die Aminosäurereste in den T-Epitopsequenzen einer Spezies vernünftig durch die einer zweiten Spezies auszutauschen, so daß die Antikörper der ersten Spezies in der zweiten Spezies nicht immunogen sind. Eine weitere Aufgabe besteht darin, nur in den Framework-Regionen der schweren und der leichten Kettten und nicht in den die Komplementarität bestimmenden Regionen einen Austausch vorzunehmen; die zu der Vernier-Zone gehörenden Aminosäuren und die an den kanonischen Strukturen beteiligten können ebenfalls nicht ausgetauscht werden. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, neue DNA-Sequenzen bereitzustellen, die den Austausch von Aminosäureresten beinhalten. Eine weitere Aufgabe besteht darin, einen Vektor bereitzustellen, der die DNA-Sequenzen für den geänderten Antikörper enthält. Eine weitere Aufgabe besteht darin, einen eukaryotischen oder procaryotischen Wirt bereitzustellen, der mit einem Vektor transformiert ist, der die DNA-Sequenz für den modifizierten Antikörper enthält:
Es wird ein einzigartiges Verfahren offenbart, um Aminosäurereste in für T-Zellen antigenen Sequenzen zu identifizieren und auszutauschen, das die Immunglobulin-Antigenität einer ersten Säugerart in die einer zweiten Säugerart überführt. Das Verfahren ändert gleichzeitig die Immunogenität und bewahrt die Ligandenbindungseigenschaften ganz genau. Ein vernünftiger Austausch jener Aminosäurereste in für T-Zellen antigenen Sequenzen der variablen Regionen, die nicht an der dreidimensionalen Struktur beteiligt sind, hat keinen Einfluß auf die Ligandenbindungseigenschaften, ändert jedoch die Immunogenität deutlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Deduzierte Aminosäuresequenz von (a) VK und (b) VH vom R3-Antikörper einer Maus. Die CDR sind unterstrichen.
2 und 3: Analyse der Modifizierung der variablen Regionen der schweren und der leichten Ketten des Antikörpers IOR-R3.
A: Sequenz der variablen Region des monoklonalen Antikörpers IOR-R3 der Maus.
B: Sequenz der variablen Region von Human-Immunglobulin mit der stärksten Homologie.
C: Sequenz der modifizierten variablen Region von IOR-R3.
Schattierung: Vorhergesagte für T-Zellen antigene Sequenzen.
Unterstrichene Aminosäurereste: Aminosäuren, die an der tertiären Struktur beteiligt sind.
Fettdruck: die Komplementarität bestimmende Regionen. Eingerahmte Aminosäurereste: vorgeschlagener Austausch.
Die Beschreibung ist sowohl für schwere als auch leichte Ketten die gleiche.
4: Molekülmodell der variablen Region von mAb R3, als Band dargestellt. VH befindet sich rechts und ist dunkler als VL. Das Modell zeigt die Seitenkette von Resten von der Maus, die mutiert wurden, um die vorhergesagten amphipatischen Segmente zu humanisieren.
5: Nachweis der Bindung des chimären und mutierten R3 an EGF-R durch RRA. Die Antigenbindungsaktivität wurde bei unterschiedlichen Konzentrationen eines gereinigten R3 von der Maus (-.-), von chimärem R3 (+) und mutiertem VHR3/muR3VK (*) untersucht und als CPM des gebundenen ¹²⁵I-EGF gegenüber dem Logarithmus der Konzentration jedes Antikörpers grafisch aufgetragen. (Die Konzentration von IgG wurde durch ELISA mengenmäßig erfaßt.)
6: Immunisierung von Affen mit R3 von der Maus, chimärem R3 und mutiertem R3.
Ordinate: Absorption bei 405 nm.
Abszisse: Anzahl der Tage für das Auffangen von Blut.
Die ELISA erfolgte wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Pfeile zeigen den Zeitpunkt der intravenösen Injektion von 2 mg jedes mAb. Die angewendete Serumverdünnung betrug 1/10.000.
7 und 8: Analyse zur Modifizierung der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers IOR-T1.
A: Sequenz der variablen Region des monoklonalen Antikörpers IOR-T1 der Maus.
B: Sequenz der variablen Region von Human-Immunglobulin mit der stärksten Homologie.
C: Sequenz der modifizierten variablen Region des Antikörpers IOR-T1.
Die Symbole sind die gleichen wie in 2. Die Beschreibung ist sowohl für die schweren als auch für die leichten Ketten die gleiche.
9 und 10: Analyse der Modifizierung der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers IOR-CEA1.
A: Sequenz der variablen Region des monoklonalen Antikörpers IOR-CEA1 der Maus.
B: Sequenz der variablen Region von Human-Immunglobulin mit der stärksten Homologie.
C: Sequenz der modifizierten variablen Region des Antikörpers IOR-CEA1.
Die Symbole sind die gleichen wie in 2. Die Beschreibung ist sowohl für die schweren als auch für die leichten Ketten die gleiche.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das gleichzeitig die Immunogenität eines monoklonalen Antikörpers von Nagern vermindert, wobei dessen Ligandenbindungseigenschaften in ihrer Gesamtheit erhalten bleiben. Da die Antigenität von Immunglobulin vom Vorhandensein von für T-Zellen antigenen Peptiden in seiner Sequenz abhängt, kann die Immunogenität eines fremdkörperbedingten oder allogenen Antikörpers verringert werden, wenn die in den für T-Zellen antigenen Sequenzen enthaltenen Reste ausgetauscht werden, die sich von denen unterscheiden, die gewöhnlich in Antikörpern einer anderen Säugerart vorkommen.
Der Austausch von Resten schließt jene nicht ein, die an den kanonischen Strukturen oder der Vernier-Zone beteiligt sind. Dieser vernünftige Austausch der Reste hat keinen Einfluß auf die Strukturdeterminanten oder auf die Kontakte zwischen den Domänen, somit sollten als Folge der Änderungen, die auf die Framework-Reste der variablen Region begrenzt sind, die Ligandenbindungseigenschaften nicht beeinflußt werden.
(1) Analyse der Homologie der variablen Regionen
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die verfügbaren Sequenzdaten für die variablen Domänen von Human-Antikörpern aus, die von Kabat et al., "Sequences of proteins of Immunological Interest", 5. Auflage, Bethesda, Maryland; National Inst. of Health, 1994, zusammengestellt worden sind.
Im ersten Schritt werden die variablen Domänen irgendeiner schweren oder leichten Kette einer ersten Tierart, zum Beispiel der Maus, mit den entsprechenden variablen Domänen einer zweiten Tierart, zum Beispiel dem Menschen, verglichen. Diese Erfindung soll eine antigene Veränderung eines Antikörpers irgendeiner Tierart ermöglichen.
Der Vergleich erfolgt nach einem automatisierten-computergesteuerten Verfahren (PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi). Dann werden die variablen Regionen vom Menschen mit der größten Homologie Rest für Rest mit den entsprechenden Regionen der Maus verglichen. Dies definiert auch die Human-Untergruppe, der jede Sequenz der Maus am stärksten ähnelt.
(2) Vorhersage der T-Epitope
Im zweiten Schritt werden die beiden homologen Sequenzen der variablen Region, Maus und Mensch, für die Vorhersage der T-antigenen Sequenzen analysiert.
Der Algorithmus AMPHI (Bersofsky et al., The Journal of Immunology 138: 2213–2229 (1987)) sagt α-Helix-Sequenzen voraus. Der Algorithmus SOHHA sagt das Band der Helix-Hydrophobie vorher (Elliott et al., J. Immunol. 138: 2949–2952 (1987)). Diese Algorithmen sagen die der T-Zelle präsentierten Fragmente antigener Proteine vorher.
(3) Analyse der Verminderung der Immunogenität
Jene Reste im Framework der Maus, die sich von ihrem Human-Gegenstück unterscheiden, werden durch die Reste ausgetauscht, die in dem Human-Gegenstück vorhanden sind. Dieses Umschalten (Ersetzen) erfolgt nur mit den Resten, die in den T-antigenen Sequenzen.
Schließlich kann der Austausch jener Reste, die für die kanonischen Strukturen verantwortlich sind, oder jener, die an der Vernier-Zone beteiligt sind, einen signifikanten Einfluß auf die tertiäre Struktur ausüben. Folglich können sie in diesem Austausch nicht inbegriffen sein. Eine weitere Information über den Einfluß des vorgeschlagenen Austauschs auf die tertiäre Struktur oder den Bindungsort kann durch das Molekülmodell der variablen Regionen erhalten werden.
Das Molekülmodell kann mit dem Arbeitsplatz Silicon Graphics Iris 4D, der mit UNIX läuft, und unter Verwendung des Programmpaketes für die Molekülmodellbildung "QUANTA" (Polygen Corp.) erstellt werden.
(4) Verfahren zur Konstruktion und Expression des geänderten Antikörpers
Folgende Verfahren werden angewendet, um rekombinante DNA-Sequenzen herzustellen, die die CDR einer ersten Säugetierart, gewöhnlich ein Tier, zum Beispiel mAb von der Maus, sowohl leichte als auch schwere Ketten, in eine zweite Säugetierart, vorzugsweise der Mensch, einführen, wobei Frameworks erscheinen, die verwendet werden können, um bei Zellen eines Säugers eine Transfektion für die Expression eines rekombinanten Antikörpers vorzunehmen, der weniger immunogen ist und die Antigen-Spezifität des monoklonalen Antikörpers des Tiers hat.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Konstruktion und Expression des modifizierten Antikörpers, welches umfaßt:

a.-) Mutagenese und Zusammenstellung der Domänen der variablen Region, einschließlich der CDR- und FR-Regionen. Es wird vorzugsweise das PCR-Mutageneseverfahren (Kamman et al., Nucleic Acids Res. 17: 5404–5409 (1989)) angewendet, um diese Änderungen an unterschiedlichen Positionen einzuführen.
b.-) Herstellung und Expression eines Vektors, der eine variable Region und die entsprechende konstante Region vom Menschen enthält, der nach der Transfektion in Zellen zur Ausscheidung von Protein führt, das für die Affinitäts- und Spezifitätsbestimmungen ausreicht.
c.-) Co-Transfektion der Expressionsvektoren der schweren und leichten Kette in geeigneten Zellinien.

Nach etwa zwei Wochen werden die Zellüberstände durch ELISA auf die Erzeugung von Human-IgG analysiert. Dann werden die Proben nach irgendeinem Verfahren auf Human-IgG analysiert, das sich an bestimmte Antigene binden kann.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zum Einführen von CDR von monoklonalen Antikörpern von einem Tier in Frameworks an, deren Natur anscheinend die von Human-Immunglobulin ist, so daß der entstehende rekombinante Antikörper entweder schwach immunogen oder nicht-immunogen ist, wenn er dem Menschen verabreicht wird. Die rekombinanten Immunglobuline werden vorzugsweise als Eigenproteine erkannt, wenn sie für therapeutische Zwecke verabreicht werden. Dieses Verfahren macht die rekombinanten Antikörper als therapeutische Mittel vorteilhaft, da sie entweder schwach immunogen oder nicht-immunogen sind, wenn sie dem Menschen verabreicht werden.
Es wird ferner in Betracht gezogen, daß die Erfindung die rekombinante Umwandlung irgendeines monoklonalen Antikörpers vom Tier in einen rekombinanten, human erscheinenden monoklonalen Antikörper einschließt, indem dieser mit einer geeigneten Framework-Region versehen wird.
Die Erfindung soll die Umwandlung von Immunglobulin von irgendeinem Tier in human erscheinendes Immunglobulin einschließen. Es ist ferner beabsichtigt, daß das human erscheinende Immunglobulin entweder leichte χ- oder λ-Ketten enthalten kann, oder irgendeiner der folgenden Isotypen von schweren Ketten (α, δ, ε, γ und μ) sein kann.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, den Umfang der Erfindung jedoch nicht einschränken.
BEISPIEL 1: DNA-Sequenzanalyse der variablen Region des monoklonalen Antikörpers R3 der Maus
Cytoplasmische RNA wurde aus etwa 10⁶ Hybridomzellen R3 (Rezeptor für den antiepidermalen Wachstumsfaktor) extrahiert, wie es bei Faloro et al. (Faloro, J. et al., Methods in Enzymology 65: 718–749, 1989) beschrieben ist.
Die cDNA-Synthesereaktion bestand aus 5 μg RNA, 50 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MgCl₂, 25 pMolen des Primers CG2AFOR (5' GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') für die variable Region der schweren Kette oder des Primers CK2FOR (5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') für die variable Region der leichten Kette, jeweils 250 μM von dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 15 E Ribonuclease-Inhibitor (RNA guard, Pharmacia) bei einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die Proben wurden für 10 Minuten bei 70°C erwärmt und innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten langsam auf 37°C abgekühlt. Dann wurden 100 Einheiten MMLV-Umkehrtranskriptase (BRL) zugegeben, und das Inkubieren bei 37°C wurde für 1 Stunde fortgesetzt.
Dann wurden die VH und VK cDNA mittels PCR amplifiziert, wie es bei Orlandi et al. (Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–3837, 1989) beschrieben ist. Für die PCR-Amplifikation von VH bestanden die DNA/Primer-Gemische aus 5 μl cDNA, 25 pMolen des Primers CG2AFOR (5' GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') und des Primers VH1BACK (5' AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3').
Für die PCR-Amplifikation von VK bestanden die DNA/Primer-Gemische aus 5 μl cDNA und 25 pMolen des Primers CK2FOR (5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') und des Primers VK10BACK (5' TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA 3'). Diesen Gemischen wurden jeweils 2,5 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 5 μl Bestandteile des 10× Puffers Thermolase und 1 Einheit Thermolase (IBI) bei einem Endvolumen von 50 μl zugesetzt. Die Proben wurden 25 Wärmezyklen aus 30 Sekunden bei 94°C; 30 Sekunden bei 50°C; 1 Minute bei 72°C und für 5 Minuten einer letzten Inkubation bei 72°C ausgesetzt. Die amplifizierten VH und VK DNA wurden mit dem Genreinigungs-Kit Prep. A (BioRad) gereinigt.
Die gereinigten VH und VK cDNA wurden in den Vektor M13 geklont. Danach wurde die Sequenz der Klone nach der Didesoxy-Methode analysiert, wobei T7 DNA Pol (Pharmacia) verwendet wurde. Siehe 1.
BEISPIEL 2: Konstruktion von chimären Genen
Wir haben die cDNA mittels PCR reamplifiziert, wobei der Primer VH1BACK (5' AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3') und der Primer VH1FOR (5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3') für VH und der Primer VK3BACK (5' GACATTCAGCTGACCCA 3') und der Primer VK3FOR (5' GTTAGATCTCCAGTTTGGTGCT 3') für VK verwendet wurden. Die amplifizierten cDNA wurden mit PstI und BstEII für das VH-Gen oder PvuII und BglII für das VK-Gen digeriert. Die Fragmente wurden in M13-VHPCR1 (mit PstI und BstEIII digeriert) oder in M13-VKPCR1 (mit PvuII und BclI digeriert) geklont. Einzelheiten der Vektoren sind bei Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–3837, 1989 aufgeführt. Die M13VHPCR-R3 und M13VKPCR-R3 enthaltenden V-Gen-Inserts wurden direkt durch Sequenzanalyse identifiziert.
Das VH-Gen wurde mit dem Promotor der schweren Kette von Ig, geeigneten Spleißorten und den Signalpeptid-Sequenzen durch Aufschluß mit HindIII und BamHI aus den Vektoren M13 ausgeschnitten und in einen Expressionsvektor (pSVgpt) geklont. Dann wurde eine konstante Region von Human-IgG1 (Takahashi, N. et al., Cell 29: 718–749, 1982) als BamHI-Fragment zugesetzt. Die entstandene Konstruktion war R3VH-pSVgpt. Die Konstruktion des R3VK-pSVhyg war im wesentlichen die gleiche, außer daß das Gen gpt durch das Hygromicin-Resistenzgen ausgetauscht worden war und eine konstante Region der χ-Kette vom Menschen hinzugefügt worden war (Hieter, P. A. et al., Cell 22: 197–207, 1980).
BEISPIEL 3: Modifizierung der Sequenzen der variablen Domäne des monoklonalen Antikörpers IOR-R3 der Maus, um die vorhergesagten für T-Zellen antigenen Sequenzen zu humanisieren
Die Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Ketten von R3 wurden auf die für T-Zellen antigenen Sequenzen analysiert. Das erfolgte unter Anwendung des Computer-Algorithmus AMPHI, der die Segmente der Sequenzen mit einer Länge von elf Aminosäuren mit einer amphipatischen Helix-Struktur vorhersagt, das heißt, mit einer hydrophoben Seite und einer hydrophilen Seite, die sich mit den Molekülen MHC II bindet.
Innerhalb der Sequenz der variablen Domäne der schweren Kette wurden fünf Segmente vorhergesagt, die (unter Anwendung der Numerierung nach Kabat) wie folgt sind:

1. FR1 zwischen den Aminosäuren 3–13.
2. FR1 zwischen den Aminosäuren 8–20.
3. FR2 und CDR2 zwischen den Aminosäuren 39–55.
4. FR3 zwischen den Aminosäuren 74–84.
5. FR4 und CDR3 zwischen den Aminosäuren 100c–110.

2 zeigt die Sequenzen, die der schweren Kette entsprechen.
Diese Sequenz der Maus wird mit den Immunglobulin-Sequenzen verglichen, die in der GeneBank und der Datenbank EMBL enthalten sind. Die Sequenz der variablen Region vom Menschen mit der größten Homologie wird bestimmt, und es wird auch die Human-Untergruppe definiert, der die Sequenz von der Maus am stärksten ähnelt. In diesem Fall war die gefundene Human-Sequenz fötales Immunglobulin, das als HUMIGHVA bezeichnet wird, wobei diese variable Region eine Homologie von 75 mit den FR-Regionen von Immunglobulin R3 der Maus aufweist.
Beide Sequenzen der variablen Region, Mensch und Maus, werden dann Rest für Rest verglichen, und es werden jene Reste in den FR-Regionen, die nicht an der Vernier-Zone oder den kanonischen Strukturen beteiligt sind, ausgewählt. Folglich können diese durch jene Reste an der gleichen Position in der Human-Sequenz ausgetauscht werden.
Schließlich wird diese Analyse durch eine Computermodellbildung des Bindungsorts verbessert. Bei diesem Molekülmodell ist es möglich, den Austausch zu definieren, der die tertiäre Struktur des Bindungsortes stört.
Für die schwere Kette des R3 der Maus schlagen wir sechs Austauschvorgänge vor:

1. LEU durch VAL in der Position 11
2. VAL durch LYS in der Position 12

Es ist möglich, mit nur diesen zwei Austauschvorgängen die amphipatische Helix aufzubrechen und folglich das vorhergesagte T-Epitop in der FR1 vorherzusagen.

3. SER durch THR in der Position 75
4. THR durch SER in der Position 76
5. ALA durch VAL in der Position 78
6. THR durch ARG in der Position 83.

In diesem Fall wird mit den in der FR3 vorgeschlagenen Austauschvorgängen diese humanisiert.
Die für T-Zellen antigene Sequenz in der FR2 enthält zwei PRO, der in den meisten antigenen Orten der Helix ein sehr seltener Aminosäurerest ist, deshalb schlagen wir vor, daß sie kein echtes T-Zell-Epitop ist.
Bei der FR4 erscheint in der Position 108 THR, die bei einigen Human-Immunglobulinen in der gleichen Position vorhanden ist, nur der Rest 109 (LEU) ist beim Menschen sehr selten, abgesehen von diesem punktuellen Unterschied ist der größte Teil des vorhergesagten T-Zell-Epitops human, auf dieser Basis muß er nicht modifiziert werden.
In 3 ist die Analyse der leichten Kette von R3 der Maus gezeigt.
In dieser Sequenz wurde nur eine amphipatische Helix vorhergesagt, zwischen den Resten 52–63, dies entspricht CDR2 und FR3, und in dieser Region existiert zwischen den Sequenzen von der Maus und dem Menschen nur ein punktueller Unterschied, in der Position 63. Es wird kein Austausch vorgeschlagen, da diese leichte Kette der Maus im Menschen nicht-immunogen sein sollte (siehe Molekülmodellbildung).
BEISPIEL 4: Molekülmodellbildung von mAb R3 VK und VH
Ein Modell der variablen Regionen von mAb R3 der Maus wurde mit dem Molekülmodellbildungsprogramm QUANTA/CHARm 4.0 (Molecular Simulations Inc., 1994) erstellt, das mit dem 150 MHz Arbeitsplatz Silicon Graphics Indigo Extreme läuft. Die VK- und VH-Frameworks wurden getrennt vom Fab 26–10 (Jeffrey, P. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10310, 1993) bzw. Fab 36–71 (Strong, R. K. et al., Biochemistry 30, 3739, 1993) erstellt. Fab 26–10 und mAb R3 haben in den VK-Frameworks eine Homologie von 92% und in der gesamten VK-Region eine Homologie von 88%. Die VH-Frameworks von Fab 36–71 und mAb R3 haben eine Homologie von 85%.
Die Koordinaten wurden der Brookhaven Protein-Datenbank (Einträge 1IGI und 6FAB) entnommen. Die Frameworks von Fab 36–71 wurden den Frameworks von Fab 26–10 angepaßt, wobei nur die Reste zusammenpaßten, von denen festgestellt wurde, daß sie oft an der Schnittstelle zwischen den leichten und schweren variablen Regionen beteiligt sind (Chotia, C. et al., J. Mol. Biol. 186, 651, 1985). Dann wurden die VH-Domäne von Fab 26–10 und die VK-Domäne von Fab 36–71 beseitigt, womit das erforderliche Hybrid zurückblieb. Es wurden Austauschvorgänge an der Seitenkette durchgeführt, wobei dem Verfahren der maximalen Überlappung gefolgt wurde (Snow, M. E. et al., Proteins 1, 267, 1986), und falls möglich mit anderen Kristallstrukturen verglichen wurde.
Die hypervariablen Regionen der variablen leichten (VL) Domäne vom R3 (L1, L2 und L3) wurden erstellt, wobei die gleichen Konformationen der Hauptkette wie in Fab 26–10 erhalten blieben, da die entsprechenden CDR in beiden Antikörpern stark homolog sind und zu den gleichen kanonischen Strukturgruppen gehören (Chotia, C. et al., Nature 342, 877, 1989). In der VH-Domäne von mAb R3 gehört CDR H1 zur kanonischen Strukturgruppe 1, wie in Fab 36–71, so daß die Drehwinkel der Hauptkette des Stammoleküls erhalten blieben. CDR H2 entspricht der kanonischen Strukturgruppe 2, und die Konformation der Hauptkette für diese Schleife wurde dem Fv-Fragment 4D5 (ganzes 1FVC) entnommen wurde, das aus anderen stark aufgelösten Strukturen ausgewählt wurde, da seine Schleifenbasis H2 gut mit dem Framework von Fab 36–71 übereinstimmt. Bei allen vorstehend genannten Schleifen wurden Vergleiche mit anderen CDR aus der Datenbank vorgenommen, um die Seitenketten zu orientieren.
Für das Modellieren von CDR H3, die im mAb R3 14 Aminosäuren lang war, wurde für die Probennahme für die Konformation eine Hochtemperatur-Moleküldynamik angewendet (Bruccoleri, R. E. et al., Biopolymer 29, 1847, 1990). Zuerst wurde die gesamte Struktur ohne CDR H3 einer Energieminimierung unterzogen, wobei die Reste H-94 und H-103 fixiert blieben und für die Atome der Hauptkette Harmoniebeschränkungen von 10 kcal/(Molatom A²) angewendet wurden. Dann wurde eine Schleife mit einer willkürlichen Konformation konstruiert, wobei ab den beiden bereits fixierten Aminosäuren begonnen wurde. Jene Reste in der Nähe des Frameworks wurden angeordnet, wobei andere Kristallstrukturen in Betracht gezogen wurden, und der obere Teil der Schleife wurde mit einer längeren Konformation aufgebaut, womit starke sterische Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls vermieden wurden. Für die nächsten Modellierungsschritte konnten sich nur die CDR H3 und die benachbarten Seitenketten in einem Abstand von 5A⁰ bewegen. Zuerst wurde eine Energieminimierung durchgeführt, und dann wurde für 150 Pikosekunden eine Moleküldynamik bei 800 K durchgeführt. Die Schrittzeit für den Versuch wurde bei 0,001 Pikosekunden festgelegt, und die Koordinaten wurden alle 100 Schritte gesichert. Die 120 Konformationen mit der niedrigsten Energie aus diesem Dynamikversuch wurden herausgelöst und einer Energieminimierung unterzogen, bei der sich alle Atome in der Struktur bewegen konnten. Es wurden einige Konformationen mit einer geringen Energie erhalten, und die mit der niedrigsten Energie wurde bei den anschließenden Analysen verwendet. Unterschiede zwischen der Mausvariante und der humanisierten Variante des Antikörpers R3 wurden einzeln modelliert, um deren möglichen Einfluß auf die Konformation der CDR zu untersuchen.
Aminosäureaustauschvorgänge in den Positionen 11, 12 (FR1) und 83 (FR3) in der variablen Region der schweren Kette sind ausreichend weit von den Grenzen von CDR-FR entfernt und sollte keinen Einfluß auf die Bindungsaffinität haben. Der Rest SER 75 zeigt nach außen, folglich scheint der Austausch durch THR für das Bindungsvermögen nicht wichtig zu sein. Demgegenüber ist THR 76 von der Oberseite des Moleküls her zugänglich und kann an der Wechselwirkung mit dem Antigen beteiligt sein. Der Austausch von THR 76 durch SER ist jedoch eine erhaltende Veränderung, die möglicherweise zu keinen wesentlichen Veränderungen der Bindungsaffinität führt.
Der Austausch von ALA 78 durch VAL sollte keine sterischen Umgruppierungen erfordern. VAL 78 kann jedoch ILE 34 nach vorn "schieben" (H!). Im allgemeinen sollten die vorgeschlagenen Punktmutationen gemäß der computergestützten Untersuchung der Molekülmodellbildung die Bindungsaffinität nicht beeinflussen (4).
Die gleichen Analysen erfolgten in der variablen Region der leichten Kette von IOR-R3, die Molekülmodellbildung zeigt, daß es nicht erforderlich ist, in dieser Region irgendwelche Änderungen vorzunehmen.
BEISPIEL 5: Konstruktion einer mutierten variablen Region der schweren Kette von R3 durch PCR-Mutagenese
Die Änderungen der Aminosäuren der mutierten variablen Region der schweren Kette wurden durch PCR-Mutagenese konstruiert (Kammann, M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4220–4224, 1989).
Kurz zusammengefaßt: zwei Amplifikationen durch PCR: das Reaktionsgemisch war: 0,5 μl des VH-Überstandes der einsträngigen DNA, die in M13 geklont war, 25 pMole mutagene Primer Oligo 1 oder 2, 25 pMole mutagene Primer Oligo 3 oder 4 (siehe die nachstehenden Primer-Sequenzen). Diesen Gemischen wurden jeweils 2,5 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 5 μl Bestandteile des 10× Vent Poiymerase-Puffers (NEB) und 1 Einheit Vent DNA-Polymerase (NEB) bei einem Endvolumen von 50 μl zugesetzt. Die Proben wurden 12 bis 15 Wärmezyklen aus 30 Sekunden bei 94°C; 30 Sekunden bei 50°C; 1 Minute bei 75°C; und mindestens einer Inkubation bei 75°C für 5 Minuten unterzogen. Die Produkte beider PCR wurden in einer zweiten PCR verbunden, wobei nur die Primer auf der Außenseite (3 und 4) verwendet wurden. Die amplifizierte VH DNA wurde mit dem Genreinigungs-Kit Prep. A (BioRad) gereinigt.
Für die Änderungen in der FR1 in Form von LEU 11 und VAL 12 durch VAL bzw. LYS wurden folgende Primer verwendet:
Primer 1: 5' GAAGCCCCAGGCTTCTTCACTTCAGCCCCAGGCTG 3'.
Primer 3: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'.
Diese Primer werden in einer PCR kombiniert.
Primer 2: 5' CAGCCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCA 3'.
Primer 4: 5' ACTGGCCGTCGTTTTAC 3'.
Diese Primer werden in einer PCR kombiniert.
Dann werden die Produkte beider PCR in einer PCR kombiniert, wobei die Primer 3 und 4 verwendet werden.
Für die Änderungen in der FR3, SER 75, THR 76, VAL 78 und THR 86 durch THR, SER, VAL bzw. ARG wurden folgende Primer gestaltet:
Primer 1: 5' GCAGAGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTAGACTGTGCTGGTGGATTCGTCTACCGT 3'.
Primer 3: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'.
Diese Primer werden in einer PCR kombiniert.
Primer 2: 5'ACGGTAGACGAATCCACCAGCACAGTCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACTCTGC 3'
Primer 4: 5' ACTGGCCGTCGTTTTAC 3'.
Diese Primer werden in einer PCR kombiniert.
Dann werden die Produkte beider PCR in einer PCR kombiniert, wobei die Primer 3 und 4 verwendet werden.
Nach der Mutagenese wurden die VH-Gene in Expressionsvektoren (pSVgpt) geklont, womit die Plasmide R3 mut VH-pSVgpt erhalten wurden.
BEISPIEL 6: Transfektion von DNA in NSO-Zellen
4 μg R3VH-pSVgpt und 8 μg R3VK-pSVhyg (chimär) oder R3 mutierter VH-pSVgpt und R3VK-pSVhyg der Maus wurden durch Aufschluß mit PvuI linearisiert. Die DNA wurden miteinander gemischt, mit Ethanol gefällt und in 25 μl Wasser gelöst. Etwa 10⁷ NSO-Zellen (Myelom-NSO der Ratte ist eine kein Ig ausscheidende Zellinie) wurden bis zum teilweisen Zusammenfließen gezüchtet, durch Zentrifugieren gewonnen und in einer Elektroporationskuvette zusammen mit der aufgeschlossenen DNA erneut in 0,5 ml DMEN suspendiert. Nach 5 Minuten auf Eis erhielten die Zellen einen einzigen Impuls von 170 V mit 960 μF (Gene-Pulser, Bio-Rad) und blieben weitere 30 Minuten auf Eis. Dann wurden die Zellen in 20 ml DMEN plus 10% fötales Kälberserum gegeben und konnten sich für 24 Stunden wiederherstellen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen in eine Platte mit 96 Vertiefungen verteilt und es wurde selektiv Medium aufgebracht, die transfektierten Klone waren 14 Tage später mit dem bloßen Auge erkennbar.
BEISPIEL 7: Mengenmäßige Erfassung der IgG-Produktion
Das Vorhandensein des Human-Antikörpers im Medium der Vertiefungen, die die transfektierten Klone enthielten, wurde durch ELISA gemessen. Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit Human-IgG-Antikörpern der Ziege (für die schwere Kette spezifisch) (Sera-Lab) ausgestrichen. Nach dem Waschen mit PBST (mit Phosphat gepufferte Salzlösung, die 0,02% Tween 20 enthielt, pH = 7,5), wurden jeder Mikrotitervertiefung für 1 Stunde bei 37°C 20 μl Kulturmedium, in 100 μl PBST verdünnt, aus den die Transfektanten enthaltenden Vertiefungen zugesetzt. Dann wurden die Vertiefungen geleert, mit PEST gewaschen, und es wurden jeweils mit Peroxidase konjugierte Antikörper der Ziege für die Human-χ-Region (für die leichte Kette spezifisch) (Sera-Lab) zugesetzt und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, danach wurden die Vertiefungen geleert, mit PBST gewaschen und es wurde Substrat-Puffer zugesetzt, der o-Phenylendiamin enthielt. Die Reaktionen wurden nach wenigen Minuten unterbrochen, indem Schwefelsäure zugesetzt wurde, und es wurde die Absorption bei 492 nm gemessen.
BEISPIEL 8: Radioliganden-Verdrängungsassays des EGF-Rezeptors
Die Bestimmung der Affinitätskonstante des ¹²⁵I-EGF, der sich über R3 der Maus an seinen Rezeptor bindet, chimär und durch Aufbrechen von T-Antikörper-Epitopen mutierte, erfolgte durch eine homogene Radiorezeptoranalyse (RRA) mit einer Mikrosomenfraktion der Human-Plazenta (Macias, A. et al., Interferon y Biotecnologia 2: 115–127, 1985).
Diese chimären und durch Aufbrechen von T-Antikörper-Epitopen mutierten wurden nach dieser Technik auf ihre Fähigkeit analysiert, sich mit dem EGF-R zu verbinden (5). Beide Antikörper waren mit der gleichen Affinität wie der ursprüngliche Antikörper der Maus an den EGF-R gebunden (10^–9 M), womit sich bestätigt, daß die exakten variablen Regionen der Maus geklont worden waren und der neue Antikörper-Isotyp die Bindung nicht beeinflußte. Die Änderungen im mutierten Antikörper beeinflußten sogar die Bindung an das Antigen nicht.
BEISPIEL 9: Immunisierung von Affen Cercopithecus aethiops mit den chimären und mutierten VH-Antikörpern der Maus
Drei Behandlungsgruppen mit zwei Affen Cercopithecus aethiops in jeder Gruppe wurden mit R3 mAb der Maus, dem chimären R3-Antikörper bzw. dem mutierten VH R3-Antikörper, immunisiert. Alle drei Gruppen wurden am Tag 0, 14, 28 und 42 subkutan mit 2 mg Antikörper immunisiert, der in 5 mg Aluminiumhydroxid adsorbiert worden war.
Vor der ersten Immunisierung und eine Woche nach jeder Immunisierung wurde allen in der Gruppe Blut entnommen, und das Serum wurde aus jeder Probe erhalten und bei –20°C aufbewahrt. Der Titer der Antikörper für R3 mAb der Maus wurde durch ein ELISA-Verfahren bestimmt.
Costar-Platten (Inc, stark bindend) wurden mit dem monoklonalen Antikörper R3 der Maus mit einer Konzentration von 10 μg/ml in Bicarbonat-Puffer (pH = 9,6) ausgestrichen und über Nacht inkubiert. Danach wurden die Platten mit PBST gewaschen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem gleichen Puffer blockiert, der 1% BSA enthielt.
Der Waschschritt wurde wiederholt, und es wurden 50 μl/Vertiefung der verschiedenen Serumverdünnungen zugesetzt. Nachdem zwei Stunden bei 37°C inkubiert worden war, wurden die Platten erneut gewaschen und 1 Stunde bei 37°C mit alkalisch phosphatiertem, konjugiertem, gesamtem Ziege-Anti-Human- oder für die Anti-Human-IgG Fc-Region spezifischem Antiserum (Sigma, Inc.) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBST wurden die Vertiefungen mit 50 μl Substrat-Puffer (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat, in Diethanolamin-Puffer verdünnt (pH = 9,8)) inkubiert. Absorption bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät (Organon Teknika, Inc.)
Es wurde eine starke IgG-Reaktion auf den R3-Antikörper der Maus erhalten, als dieser Antikörper als Immunogen verwendet wurde. Eine geringere, jedoch noch meßbare IgG-Reaktion (1/10.000) auf den Antikörper R3 der Maus wurde erreicht, wenn die Affen mit dem chimären Antikörper immunisiert worden waren, das steht zu den Ergebnissen im Gegensatz, die mit der mutierten Vh-Version erhalten worden waren (6). Mit dem mutierten Antikörper VH R3 war nach zwei Immunisierungen keine Reaktion meßbar, und nach vier Immunisierungen wurde eine geringe Reaktion (1/10.000) gemessen.
BEISPIEL 10: Modifizierung der Sequenzen der variablen Domäne des monoklonalen Antikörpers IOR-T1 der Maus, um die vorhergesagten für T-Zellen antigenen Sequenzen zu humanisieren
Die Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Ketten von IOR-T1 wurden auf die für T-Zellen antigenen Sequenzen analysiert.
In der variablen Domäne der schweren Kette wurden 3 Segmente vorhergesagt, diese sind:

1. FR1 zwischen den Aminosäuren 2 bis 21.
2. FR1, CDR1, FR2 zwischen den Aminosäuren 29 bis 43.
3. FR4, CDR3 zwischen den Aminosäuren 97 bis 111.

7 zeigt einen Vergleich mit der Human-Sequenz mit der stärksten Homologie und den vorgeschlagenen Austausch, der 5 in der FR1, 2 in der FR2 und 2 in der FR4 lautet.
Das gleiche Verfahren mit der leichten Kette (8) ergab die folgenden für T-Zellen antigenen Segmente:

1. FR3 zwischen den Aminosäuren 60 bis 65.
2. FR3, CDR3 zwischen den Aminosäuren 79 bis 90.
3. CDR3 zwischen den Aminosäuren 93 bis 95A.

Nach der Analyse haben wir 5 Austauschvorgänge in der FR3 an den Positionen 60, 63, 83, 85 und 87 vorgeschlagen.
BEISPIEL 11: Modifizierung der Sequenzen der variablen Domäne des monoklonalen Antikörpers IOR-CEA1 der Maus, um die vorhergesagten für T-Zellen antigenen Sequenzen zu humanisieren
Die Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Ketten von IOR-CEA1 wurden auf für T-Zellen antigene Sequenzen analysiert.
In der variablen Domäne der schweren Kette wurden zwei Segmente vorhergesagt, diese sind:

1. FR1 zwischen den Aminosäuren 1 bis 16.
2. CDR3 und FR4 zwischen den Resten 96 bis 110.

9 zeigt einen Vergleich mit der Human-Sequenz mit der stärksten Homologie und die vorgeschlagenen Austauschvorgänge, die 7 in der FR1 und 2 in der FR4 sind.
Die gleiche Analyse mit der leichten Kette (10) ergab folgende für T-Zellen antigene Segmente:

1. FR1 zwischen den Aminosäuren 1 bis 14.
2. CDR2-FR3 zwischen den Aminosäuren 55 bis 70.
3. FR3-CDR3-FR4 zwischen den Resten 74 bis 100.

Nach der Analyse haben wir 4 Austauschvorgänge in der FR1 an den Positionen 9, 10, 11 und 13, 11 Austauschvorgänge in der FR3 an den Positionen 58, 60, 63, 70, 75, 76, 78, 81, 83, 85 und 87 und einen Austausch in der FR4 an der Position 100 vorgeschlagen.
BEISPIEL 12: Analyse der amphipatischen Segmente in den variablen Regionen von Immunglobulin-Gruppen
Das Programm AAAPHI wurde als Teilprogrammroutine in ein Programm aufgenommen, das zum Ablesen und Verarbeiten von Immunglobulin-Sequenzen von der Kabat-Datenbank geschrieben worden war. Bei der Verarbeitung der Sequenzen wurden folgende Umgruppierungen vorgenommen:

– nicht definierte Aminosäuren vom Typ GLX (möglicherweise GLN oder GLU) wurden als GLN definiert (sowohl GLN als auch GLU haben ähnliche Hydrophilie-Indizes: –0,22 bzw. –0,64).
– nicht definierte Aminosäuren vom Typ ASX (möglicherweise ASN oder ASP, mit Hydrophilie-Indizes von –0,60 und –0,77) wurden als ASN definiert.
– andere nicht definierte Aminosäuren (Leerräume oder "fremde" Symbole in den Sequenzen wurden als XXX (unbekannt) definiert. Das Programm AMPHI ordnet diesen Aminosäuren einen Hydrophilie-Wert von 0,0 zu.

Sequenzen mit mehr als 5 unbekannten Aminosäuren (XXX) waren in der Analyse nicht enthalten.
Nach dieser vorläufigen Analyse wurde jede Sequenz mit dem Programm AMPHI verarbeitet, und die Ergebnisse sind für jede Immunglobulin-Gruppe in Form von Tabellen aufgeführt.
In den Tabellen I bis VI ist die Analyse für sechs Gruppen der schweren Kette der Maus gezeigt. "Vorwiegend amphipatische Regionen" (PAR) konnten bei jenen definiert werden, die in mehr als 90% der Sequenzen der variablen Region vorhanden waren, die zu jeder Gruppe gehören. Beim Vergleich des Frameworks 1 (FR1) kann zum Beispiel für die Gruppen I und II eine PAR zwischen den Aminosäureresten 11 und 16 definiert werden, demgegenüber haben die Gruppen III und IV im allgemeinen von der ersten Aminosäure bis zur dreißigsten keine amphipatischen Regionen. In den Gruppen IV und VI konnten kleinere PAR von 12 bis 14 bzw. 12 bis 15 Resten definier werden.
Die Humanisierung der PAR würde die Immunogenität bei Patienten verringern. Die Anhäufung von amphipatischen Regionen in den Frameworks der variablen Region von Immunglobulin unterstützt die Universalität des vorgeschlagenen Verfahrens, das heißt, diese vorhergesagten T-Zell-Epitope durch wenige Punktmutationen zu humanisieren.

Claims

Verfahren zum Modifizieren eines Antikörpers, umfassend: Vergleichen der Framework-Aminosäuren einer variablen Domäne einer ersten Säugetierart mit den Framework-Aminosäuren von variablen Domänen einer zweiten Säugetierart, Bestimmen einer Untergruppe der zweiten Säugetierart, der die erste Säugetierart am besten entspricht, Auswählen eines Antikörpers aus dieser Untergruppe, dessen Framework-Sequenz der Framework-Sequenz der ersten Säugetierart am ähnlichsten ist, Identifizieren der Aminosäurereste der ersten Säugetierart, die sich von den Aminosäureresten des Frameworks der ausgewählten zweiten Säugetierart unterscheiden und die innerhalb der Antigen-Sequenzen für T-Zellen in der variablen Region des ausgewählten Antikörpers liegen, Auswählen der Aminosäurereste, die nicht in den die Komplementarität bestimmenden Regionen liegen und nicht direkt an den kanonischen Strukturen oder der Vernier-Zone beteiligt sind, Austauschen der Aminosäurereste im Framework der ersten Säugetierart, die sich von den Aminosäureresten der zweiten Säugetierart unterscheiden, durch die entsprechenden Aminosäurereste der so identifizierten ähnlichsten zweiten Säugetierart und Gewinnen des modifizierten Antikörpers.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Säugetierart die Maus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Säugetierart der Mensch ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine oder mehrere konstante Domänen der schweren Kette, die konstante Domäne der leichten Kette oder sowohl konstante Domänen der schweren Kette als auch der leichten Kette des Antikörpers der ersten Säugetierart durch die entsprechende konstante Domäne des Antikörpers der zweiten Säugetierart ersetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein modifizierter chimärer Antikörper mit verminderter Immunogenität aus einem Antikörper mit einer variablen Region der schweren Kette, die in 2, Teil A gezeigt ist, und einer variablen Region der leichten Kette, die in 3, Teil A gezeigt ist, erhalten wird, indem folgende Punktmutationen in den Framework-Regionen der schweren Kette vorgenommen werden: schwere Kette: FR1: LEU durch VAL in der Position 11, VAL durch LYS in der Position 12, FR3: SER durch THR in der Position 75, THR durch SER in der Position 76, ALA durch VAL in der Position 78, THR durch ARG in der Position 83.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein modifizierter chimärer Antikörper mit verminderter Immunogenität aus einem Antikörper mit einer variablen Region der schweren Kette, die in 7, Teil A gezeigt ist, und einer variablen Region der leichten Kette, die in 8, Teil A gezeigt ist, erhalten wird, indem folgende Punktmutationen in den Framework-Regionen der schweren und der leichten Kette vorgenommen werden: schwere Kette: FR1: LYS durch GLN in der Position 3, VAL durch LEU in der Position 5, GLN durch GLU in der Position 6, LYS durch GLN in der Position 13, LYS durch ARG in der Position 19, FR2: THR durch ALA in der Position 40, GLU durch GLY in der Position 42, FR4: THR durch LEU in der Position 108, LEU durch VAL in der Position 109, leichte Kette: FR3: ASP durch ALA in der Position 60, THR durch SER in der Position 63, LEU durch PHE in der Position 83, GLU durch VAL in der Position 85, PHE durch TYR in der Position 87.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein modifizierter chimärer Antikörper mit verminderter Immunogenität aus einem Antikörper mit einer variablen Region der schweren Kette, die in 9, Teil A gezeigt ist, und einer variablen Region der leichten Kette, die in 10, Teil A gezeigt ist, erhalten wird, indem folgende Punktmutationen in den Framework-Regionen der schweren und der leichten Kette vorgenommen werden: schwere Kette: FR1: PRO durch VAL in der Position 2, LYS durch GLN in der Position 3, LEU durch VAL in der Position 5, GLU durch GLN in der Position 6, GLY durch ALA in der Position 9, ASP durch GLU in der Position 10, GLU durch GLY in der Position 15, FR4: THR durch LEU in der Position 108, LEU durch VAL in der Position 109, leichte Kette: FR1: LYS durch SER in der Position 9, PHE durch THR in der Position 10, SER durch LEU in der Position 1 1, THR durch ALA in der Position 13, FR3: VAL durch ILE in der Position 58, ASP durch SER in der Position 60, THR durch SER in der Position 63, ASP durch GLU in der Position 70, ILE durch VAL in der Position 75, SER durch ILE in der Position 76, VAL durch LEU in der Position 78, GLN durch ASP in der Position 81, LEU durch PHE in der Position 83, GLU durch THR in der Position 85, PHE durch TYR in der Position 87, FR4: ALA durch GLN in der Position 100.
Chimärer Antikörper mit einer variablen Region der schweren Kette, die in 2, Teil A gezeigt ist, und einer variablen Region der leichten Kette, die in 3, Teil A gezeigt ist, der mit folgenden Punktmutationen in den Framework-Regionen der schweren Kette modifiziert ist, um die Immunogenität zu vermindern: schwere Kette: FR1: LEU durch VAL in der Position 11, VAL durch LYS in der Position 12, FR3: SER durch THR in der Position 75, THR durch SER in der Position 76, ALA durch VAL in der Position 78, THR durch ARG in der Position 83.
Chimärer Antikörper mit einer variablen Region der schweren Kette, die in 7, Teil A gezeigt ist, und einer variablen Region der leichten Kette, die in 8, Teil A gezeigt ist, der mit folgenden Punktmutationen in den Framework-Regionen der schweren und der leichten Kette modifiziert ist, um die Immunogenität zu vermindern: schwere Kette: FR1: LYS durch GLN in der Position 3, VAL durch LEU in der Position 5, GLN durch GLU in der Position 6, LYS durch GLN in der Position 13, LYS durch ARG in der Position 19, FR2: THR durch ALA in der Position 40, GLU durch GLY in der Position 42, FR4: THR durch LEU in der Position 108, LEU durch VAL in der Position 109, leichte Kette: FR3: ASP durch ALA in der Position 60, THR durch SER in der Position 63, LEU durch PHE in der Position 83, GLU durch VAL in der Position 85, PHE durch TYR in der Position 87.
Chimärer Antikörper mit einer variablen Region der schweren Kette, die in 9, Teil A gezeigt ist, und einer variablen Region der leichten Kette, die in 10, Teil A gezeigt ist, der mit folgenden Punktmutationen in den Framework-Regionen der schweren und der leichten Kette modifiziert ist, um die Immunogenität zu vermindern: schwere Kette: FR 1: PRO durch VAL in der Position 2, LYS durch GLN in der Position 3, LEU durch VAL in der Position 5, GLU durch GLN in der Position 6, GLY durch ALA in der Position 9, ASP durch GLU in der Position 10, GLU durch GLY in der Position 15, FR4: THR durch LEU in der Position 108, LEU durch VAL in der Position 109, leichte Kette: FR1: LYS durch SER in der Position 9, PHE durch THR in der Position 10, SER durch LEU in der Position 1 1, THR durch ALA in der Position 13, FR3: VAL durch ILE in der Position 58, ASP durch SER in der Position 60, THR durch SER in der Position 63, ASP durch GLU in der Position 70, ILE durch VAL in der Position 75, SER durch ILE in der Position 76, VAL durch LEU in der Position 78, GLN durch ASP in der Position 81, LEU durch PHE in der Position 83, GLU durch THR in der Position 85, PHE durch TYR in der Position 87, FR4: ALA durch GLN in der Position 100.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen modifizierten chimären Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 10.
Verwendung eines modifizierten chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 8 bis 10 für die Herstellung eines auf Tumoren gerichteten Medikamentes.