DE69532889T2

DE69532889T2 - Interleukin-5-spezifische rekombinante antikörper

Info

Publication number: DE69532889T2
Application number: DE69532889T
Authority: DE
Inventors: Spencer John Slough EMTAGE; William Mark Slough BODMER; Singh Diljeet SLough ATHWAL
Original assignee: Celltech Therapeutics Ltd
Current assignee: Celltech R&D Ltd
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2015-06-17
Also published as: US5998586A; AU2680395A; US6316227B1; DE69532889D1; JPH10501697A; NO964808D0; CA2192543C; CA2192543A1; GB9412230D0; HU221641B1; HUT76672A; IL114179A; EP0765392B1; IL114179A0; SK160096A3; CZ292295B6; JP3973682B2; AU694783B2; WO1995035375A1; US20020042089A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Antikörpermolekül (RAM) und insbesondere ein humanisiertes Antikörpermolekül (HAM), das eine Spezifität für humanes Interleukin-5 (hIL-5) aufweist, die Nukleinsäuren, die die variablen Domänen der schweren und leichten Kette des rekombinanten Antikörpers kodieren, ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie und die therapeutische Verwendung des rekombinanten Antikörpers.
In der vorliegenden Anmeldung wird der Ausdruck „rekombinantes Antikörpermolekül" (RAM) zur Beschreibung eines Antikörpers verwendet, der durch ein Verfahren hergestellt wurde, das die Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie betrifft. Der Ausdruck „humanisiertes Antikörpermolekül" (HAM) wird zur Beschreibung eines Moleküls verwendet, das von einem menschlichen Immunglobulin abgeleitet wurde. Die Antigenbindungsstelle kann entweder vollständige variable Domänen, die auf konstante Domänen fusioniert wurden, oder eine oder mehrere hypervariable Regionen (CDRs), die auf geeignete menschliche Gerüstregionen in den variablen Domänen gepfropft wurden, umfassen. Die Abkürzung „MAb" wird verwendet, um einen monoklonalen Antikörper anzuzeigen.
Der Ausdruck „rekombinantes Antikörpermolekül" umfasst nicht nur die vollständigen Immunglobulinmoleküle, sondern auch jegliche Antigen-bindenden Immunglobulinfragmente, wie zum Beispiel Fv-, Fab- und F(ab')₂-Fragmente und alle Derivate davon, wie zum Beispiel einzelkettige Fv-Fragmente.
Natürliche Immunglobuline wurden in Assays, in der Diagnose und in einem beschränkten Ausmaß in der Therapie verwendet. Die Verwendung von Immunglobulinen in der Therapie wurde dadurch behindert, dass die meisten Antikörper mit möglicher Verwendung als therapeutische Mittel MAbs sind, die durch Verschmelzungen von Nagetiermilzzellen mit Nagetiermyelomzellen erzeugt wurden. Diese MAbs sind daher im Wesentlichen Nagetierproteine. Die Verwendung dieser MAbs als therapeutische Mittel im Menschen kann eine unerwünschte Immunreaktion hervorrufen, die als HAMA (Human Anti-Mouse Antibody) Reaktion bezeichnet wird. Die Verwendung von Nagetier-MAbs als therapeutische Mittel in Menschen ist von Natur aus durch die Tatsache eingeschränkt, dass die menschliche Versuchsperson eine Immunreaktion gegen den MAb aufbaut, die ihn entweder vollständig entfernt oder zumindest seine Wirksamkeit verringert.
Es wurde eine Anzahl von Techniken zur Verringerung der antigenen Charakteristiken derartiger nicht-menschlichen MAbs entwickelt. Diese Techniken betreffen im Allgemeinen die Verwendung rekombinanter DNA-Technologie zur Manipulation der DNA-Sequenzen, die die Polypeptidketten des Antikörpermoleküls kodieren. Diese Verfahren werden im Allgemeinen als „Humanisierungs"-Techniken bezeichnet.
Frühere Verfahren zur Humanisierung von MAbs betrafen die Herstellung chimärer Antikörper, in denen einen Antigenbindungsstelle, die die vollständigen variablen Domänen eines Antikörpers umfasst, auf konstante Domänen fusioniert wird, die von einem anderen Antikörper stammen. Verfahren zur Ausführung solcher Chimärisierungstechniken sind in der EP 0120694 (Celltech Limited) und EP 0125023 (Genentech Inc. und City of Hope) beschrieben. Humanisierte chimäre Antikörper enthalten jedoch noch einen signifikanten Teil an nicht-menschlichen Aminosäuresequenzen und können noch eine gewisse HAMA-Reaktion hervorrufen, insbesondere bei Verabreichung über einen längeren Zeitraum [Begent et al., Br. J. Cancer, 62, 487 (1990)].
Eine in der EP-A-0239400 (Winter) beschriebene alternative Methode betrifft das Pfropfen der hypervariablen Region (CDRs) eines Maus-MAbs auf die Gerüstregionen der variablen Domänen eines menschlichen Immunglobulins unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken. Es gibt drei CDRs (CDR1, CDR2 und CDR3) in jeder der variablen Domänen der schweren und leichten Kette. Derartige CDR-gepfropfte humanisierte Antikörper rufen mit weitaus geringerer Wahrscheinlichkeit eine HAMA-Reaktion hervor als humanisierte chimäre Antikörper, angesichts des viel geringeren Anteils an nicht menschlichen Aminosäuresequenzen, die sie enthalten. In Riechmann et al. [Nature, 332 323-324 (1988)] wurde festgestellt, dass die reine Übertragung von CDRs, entsprechend der Definition von Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (1987)] nicht ausreichend war, um für eine zufriedenstellende Antigenbindungsaktivität in dem CDR-gepfropften Produkt zu sorgen. Riechman et al. stellte fest, dass es notwendig war eine Anzahl von Resten, die außerhalb der CDRs lagen, insbesonde re in der zu CDR1 benachbarten Schleife, umzuwandeln. Die Bindungsaffinität der besten erhaltenen CDR-gepfropften Antikörper war jedoch noch signifikant geringer, als diejenige des ursprünglichen MAbs.
In der WO 91/09967 beschreiben Adair et al. schwere und leichte Ketten eines CDR-gepfropften Antikörpers und bestimmte eine Hierarchie von Donorresten.
In der WO 93/16184 beschreiben Chou et al. die Auslegung, Klonierung und Expression humanisierter monoklonaler Antikörper gegen menschliches Interleukin-5. Ein Verfahren zum Auswählen menschlicher Antikörpersequenzen wird vorgeschlagen, die als menschliches Gerüste zur Humanisierung eines Tierantikörpers verwendet werden sollen, umfassend die Schritte des Vergleichens der Sequenzen der menschlichen variablen Domäne mit den Sequenzen der variablen Domäne des zu humanisierenden Tier-MAbs, bezüglich des prozentualen Identitätsanteils, der Sequenzzweideutigkeiten und eines ähnlichen PIN-Regionabstands. Der PIN-Regionabstand ist als die Zahl von Resten zwischen den Cysteinresten, die die Disulfidbrücken innerhalb einer Domäne bilden, definiert. Der menschliche Antikörper mit der besten Kombination dieser Merkmale wird ausgewählt. Es wird ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung, welche Reste der variablen Domäne eines Tier-MAbs zur Humanisierung ausgewählt werden sollten, vorgeschlagen, umfassend das Bestimmen möglicher Minimalreste (Reste, die die strukturellen CDR-Schleifen umfassen, und Reste, die zum Unterstützen und/oder Ausrichten der strukturellen CDR-Schleifen erforderlich sind) und Maximalreste (Reste, die Kabat-CDRs umfassen, strukturelle CDR-Schleifen, Reste, die zum Unterstützen und/oder Ausrichten der strukturellen CDR-Schleifen erforderlich sind, und Reste, die innerhalb von 10 Å einer strukturellen CDR-Schleife liegen und eine für ein Wasserlösungsmittel zugängliche Oberfläche von ungefähr 5 Å² oder mehr besitzen) des monoklonalen Tierantikörpers. Weiterhin wird eine Computermodellierung mit allen möglichen rekombinanten Antikörpern durchgeführt, umfassend die menschliche Antikörpergerüstsequenz, in die Minimal- und Maximalreste eingeschoben worden sind. Die Minimal- und Maximalreste werden, gestützt auf die Kombination ausgewählt, die einen rekombinanten Antikörper mit einer Computermodellstruktur erzeugt, die der des monoklonalen Tierantikörpers am besten entspricht. Der erhaltene humanisierte Anti-IL-5 Antikörper scheint eine wesentliche Menge seiner Affinität für das hIL-5-Molekül verloren zu haben.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein humanisiertes Antikörpermolekül zur Verfügung zu stellen, das eine verbesserte Affinität für das hIL-5-Molekül aufweist.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein RAM gemäß Anspruch 1 zur Verfügung. Das RAM der Erfindung weist eine Affinität für menschliches IL-5 auf und umfasst Antigenbindungsregionen, die von den variablen Domänen der schweren und leichten Kette eines Donorantikörpers mit Affinität für menschliches IL-5 stammen, wobei das RAM eine Bindungsaffinität aufweist, die zu der des Donorantikörpers ähnlich ist.
Der Donorantikörper ist MAb 39D10.
Die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten von MAb 39D10 werden hier nachstehend unter Bezugnahme auf die 1 und 2 spezifisch beschrieben.
Das RAM der vorliegenden Erfindung ist ein Anti-IL-5-Antikörpermolekül mit Affinität für das menschliches IL-5-Antigen, umfassend eine zusammengesetzte schwere Kette, wobei die zusammengesetzte schwere Kette eine variable Domäne, die überwiegend die Gerüstreste der schweren Kette eines Akzeptorantikörpers und die Antigenbindungsreste der schweren Kette eines Donorantikörpers umfaßt, aufweist und wobei die zusammengesetzte schwere Kette Donorreste an den Positionen 31–35, 50–65 und 95–102 umfasst (entsprechend dem Kabat-Nummerierungssystem) [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Bd. I, fünfte Auflage, 1991, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health].
Das Gerüst der zusammengesetzten schweren Kette umfasst zusätzlich Donorreste an den Positionen 23, 24, 27–30, 37, 49, 73 und 76–78 oder 24, 27–30, 37, 49, 73, 76 und 78.
Das RAM der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin eine zusammengesetzte leichte Kette, wobei die zusammengesetzte leichte Kette eine variable Domäne, die überwiegend Gerüstreste der leichten Kette eines Akzeptorantikörpers und Antigenbindungsreste der leichten Kette eines Donorantikörpers umfasst, aufweist und wo bei die zusammengesetzte leichte Kette Donorreste an den Positionen 24–34, 50–56 und 89–97 (entsprechend dem Kabat-Nummerierungssystem) umfasst.
Das Gerüst der zusammengesetzten leichten Kette umfasst zusätzlich Donorreste an den Positionen 22, 68 und 71 oder an den Positionen 68 und 71.
Jedes RAM der Erfindung weist vorzugsweise eine Affinitätskonstante für menschliches IL-5 auf, die größer als 10^–9 M ist.
Der Typ des verwendeten Akzeptorgerüsts weist vorzugsweise die gleiche oder ähnliche Klasse oder Typ auf, wie der Donorantikörper. Praktischerweise weist das gewählte Gerüst die größte Homologie mit dem Donorantikörper auf. Die gamma-Keimbahngerüste der menschlichen Gruppe III werden für die zusammengesetzte schwere Kette und die kappa-Keimbahngerüste der menschlichen Gruppe I werden für die zusammengesetzten leichten Ketten verwendet.
Die konstanten Regiondomänen der RAMs der Erfindung können im Hinblick auf die vorgeschlagenen Funktionen des Antikörpers, insbesondere die Effektorfunktionen, die erforderlich keinen können, ausgewählt werden. Die konstanten Regiondomänen können zum Beispiel menschliche IgA-, IgE-, IgG- oder IgM-Domänen sein. Insbesondere können menschliche konstante IgG-Regiondomänen, besonders vom IgG1- und IgG3-Isotyp verwendet werden, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Verwendungen bestimmt ist und Antikörpereffektorfunktionen erforderlich sind. Alternativ dazu können IgG2- und IgG4-Isotypen verwendet werden, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Zwecke bestimmt ist, und Antikörpereffektorfunktionen, zum Beispiel für das spezifische Binden an menschliches IL-5 und das Neutralisieren seiner biologischen Aktivität, nicht erforderlich sind. Modifizierte menschliche konstante Regiondomänen, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste zur Änderung einer speziellen Effektorfunktion geändert oder deletiert wurden, können ebenfalls verwendet werden. Die konstanten Regiondomänen der RAMs sind vorzugsweise menschliches IgG4.
Die vorstehend und anderswo in der vorliegenden Anmeldung angegebenen Restebezeichnungen sind entsprechend der Kabat-Nummerierung nummeriert [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Band I, fünfte Auflage, 1991, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health]. Daher entsprechen die Restebezeichnungen nicht immer direkt einer linearen Nummerierung der Aminosäurereste. Die tatsächliche lineare Aminosäuresequenz kann weniger oder zusätzliche Aminosäuren als bei der Kabat-Nummerierung aufweisen, was einer Verkürzung der Grundstruktur der variablen Domäne oder einem Einschub in diese entspricht.
An dem Anti-IL-5-Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung können ebenfalls Effektor- oder Reportermoleküle haften. Alternativ dazu können die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung von Immunglobulinmolekülen verwendet werden, in denen das Fc-Fragment oder die CH3-Domäne eines vollständigen Immunglobulins gegen ein funktionales Nicht-Immunglobulinprotein, wie zum Beispiel ein Enzym, ein Zytokin, ein Wachstumsfaktor oder ein Toxinmolekül, ersetzt wurde oder dieses durch eine Peptidbindung daran angelagert wurde.
Daher muss der Rest des Antikörpermoleküls nicht nur Sequenzen von Immunglobulinen umfassen. Zum Beispiel kann ein Gen aufgebaut werden, in dem eine DNA-Sequenz, die einen Teil einer menschlichen Immunglobulinkette kodiert, an eine DNA-Sequenz fusioniert wird, die die Aminosäuresequenz eines Polypeptideffektor- oder Reportermoleküls kodiert.
Weitere Aspekte der Erfindung umfassen DNA-Sequenzen, die für die zusammengesetzte schwere Kette und zusammengesetzte leichte Kette kodieren. Die Klonierungs- und Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die mit den DNA-Sequenzen transformiert sind und die Verfahren zur Herstellung der Antikörpermoleküle, die das Exprimieren der DNA-Seugenzen in den transformierten Wirtszellen umfassen, sind ebenfalls weitere Aspekte der Erfindung.
Die allgemeinen Verfahren, durch die Vektoren synthetisiert werden können, Transfektionsverfahren und Kultivierungsverfahren, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und bilden keinen Teil der Erfindung.
Die DNA-Sequenzen, die die Anti-IL-5-Donoraminosäuresequenzen kodieren, können durch Verfahren erhalten werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind (siehe zum Beispiel die internationale Patentanmeldung Nr. WO 93/16184). Die Anti-IL-5 kodierende Sequenz kann zum Beispiel durch genomisches Klonieren oder durch cDNA-Klonieren von geeigneten Hybridomzelllinien, zum Beispiel die 39D10 Zelllinie, erhalten werden. Positive Klone können unter Verwendung geeigneter Sonden für die erforderlichen schweren und leichten Ketten gescreent werden. Es kann ebenfalls die PCR-Klonierung verwendet werden.
Die für die Akzeptoraminosäuresequenzen kodierende DNA kann auf jede geeignete Weise erhalten werden. Zum Beispiel sind DNA-Sequenzen, die für die bevorzugten menschlichen Akzeptorgerüste, wie zum Beispiel die leichten Ketten der menschlichen Gruppe I und die schweren Ketten der menschlichen Gruppe III, kodieren, für den Fachmann weithin verfügbar.
Zur Herstellung der gewünschten DNA-Sequenzen können die Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet werden. Die Sequenzen können vollständig oder teilweise unter Verwendung von Oligonukleotidsynthesetechniken synthetisiert werden. Die ortsspezifische Mutagenese und Polymerasekettenreaktions- (PCR) Techniken können in geeigneter Weise verwendet werden. Zum Beispiel kann die Oligonukleotid-spezifische Synthese, entsprechend der Beschreibung von Jones et al. [Nature, 321, 522 (1986)] verwendet werden. Ebenfalls kann die Oligonukleotidspezifische Mutagenese einer vorher bestehenden variablen Region, wie zum Beispiel von Verhoeyen et al. [Science, 239, 1534–1536 (1988)] beschrieben ist, verwendet werden. Ebenfalls kann enzymatisches Auffüllen von Oligonukleotiden mit Lücken unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase, wie zum Beispiel von Queen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029–10033 (1989) und die WO 90/07861] verwendet werden.
Jede geeignete Wirtszelle und Vektorsystem kann für die Expression von DNA-Sequenzen, die für das RAM kodieren, verwendet werden. Vorzugsweise werden eukaryotische, zum Beispiel Säugetier, Wirtszellexpressionssysteme verwendet. Geeignet Säugetierwirtszellen umfassen insbesondere CHO-Zellen und Myelom- oder Hybridomzelllinien.
Daher wird entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-IL-5-RAM zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) das Erzeugen eines ersten Operons mit einer DNA-Sequenz, die eine zusammengesetzte schwere Kette, wie vorstehend definiert, kodiert, in einem ersten Expressionsvektor;
(b) gegebenenfalls das Erzeugen eines zweiten Operons mit einer DNA-Sequenz, die eine komplementäre leichte Kette kodiert, die eine zusammengesetzte leichte Kette wie vorstehend definiert sein kann, in dem ersten oder zweiten Expressionsvektor;
(c) das Transfizieren einer Wirtszelle mit dem oder jedem Vektor; und
(d) das Kultivieren einer transfizierten Zelllinie zur Herstellung des RAM.

Alternativ dazu kann das Verfahren die Verwendung von Sequenzen betreffen, die eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere Kette kodieren.
Zur Herstellung von RAMs, die sowohl schwere als auch leichte Ketten umfassen, können die Zellinien mit zwei Vektoren transfiziert werden. Der erste Vektor kann ein Operon enthalten, das eine zusammengesetzte oder komplementäre schwere Kette kodiert, und der zweite Vektor kann ein Operon enthalten, das eine komplementäre oder zusammengesetzte leichte Kette kodiert. Die Vektoren sind vorzugsweise identisch, ausser dass, soweit es die kodierenden Sequenzen und auswählbaren Marker betrifft, es soweit wie möglich sichergestellt wird, dass jede Polypeptidkette gleich exprimiert wird. In einer bevorzugten Alternative kann ein einzelner Vektor verwendet werden, wobei der Vektor die Sequenzen, die sowohl die schwere Kette als auch die leichte Kette kodieren, umfasst.
Die DNA in den kodierenden Sequenzen für die schwere und leichte Kette kann cDNA oder genomische DNA oder beides umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die RAMS umfassen, und Verwendungen derartiger Zusammensetzungen in der Therapie und Diagnose.
Dementsprechend stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine therapeutische oder diagnostische Zusammensetzug zur Verfügung, die ein RAM, entsprechend den vorhergehenden Aspekten der Erfindung, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
Diese Zusammensetzungen können unter Verwendung der RAMs der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel als ganze Antikörper, einzelkettige Fv-Fragmente oder Antikörperfragmente, wie zum Beispiel Fab- oder Fv-Fragmente, hergestellt werden. Derartige Zusammensetzungen weisen Blockierungs- oder antagonistische Wirkungen bezüglich IL-5 auf und können zum Unterdrücken der IL-5-Aktivität verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können entsprechend der üblichen Praxis zur Verabreichung über jeden geeigneten Weg formuliert werden und können im allgemeinen in einer flüssigen Form [zum Beispiel eine Lösung des RAM in einem sterilen physiologisch verträglichen Puffer) zur Verabreichung über beispielsweise einen intravenösen, intraperitonealen oder intramuskulären Weg; in Sprayform, zum Beispiel zur Verabreichung über einen nasalen oder bukkalen Weg; oder in einer zur Einpflanzung geeigneten Form vorliegen.
Die Erfindung stellt ebenfalls den erfindungsgemäßen Antikörper zur Verwendung in einem Therapie- oder Diagnoseverfahren zur Verfügung, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge, vorzugsweise von 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht, eines RAMs, entsprechend den vorhergehenden Aspekten der Erfindung, an eine Versuchsperson oder ein Versuchstier. Die genaue Dosierung und die Gesamtdosis werden entsprechend der beabsichtigten Verwendung des RAMs und dem Alter und der Verfassung des zu behandelnden Patienten variieren. Das RAM kann als Einzel dosis oder auf fortlaufende Art über einen Zeitraum verabreicht werden. Die Verabreichungen können in geeigneter Weise wiederholt werden.
Das RAM entsprechend den vorhergehenden Aspekten der Erfindung kann für jede der therapeutischen Verwendungen, bei denen Anti-IL-5-Antikörper, zum Beispiel 39D10 verwendet wurden oder in Zukunft verwendet werden können, verwendet werden.
IL-5 ist ein primärer Aktivator von Eosinophilen und es wurde gezeigt, dass das Blockieren der Funktion dieses Zytokins mit Antikörpern eine Eosinophilie, die mit bestimmten allergischen Krankheiten verbunden ist, verhindert oder verringert. Daher kann das erfindungsgemäße RAM für diesen Zweck verwendet werden und insbesondere kann es in der Behandlung von Asthma Verwendung finden, wobei erwartet wird, dass es die Anhäufung und Aktivierung von Eosinophilen in asthmatischen Lungen verhindert, wodurch eine bronchiale Entzündung und eine Verengung der Luftwege verringert wird. Für die Verwendung in der Asthmabehandlung kann das erfindungsgemäße RAM vorteilhafterweise ein einzelkettiges Fv-Fragment sein, das als Spray, zum Beispiel zur Verabreichung über den nasalen Weg, formuliert ist.
Ein bevorzugtes Protokoll zum Erhalten eines erfindungsgemäßen Anti-IL-5-Antikörpermoleküls wird im Nachfolgenden ausgeführt. Dieses Protokoll wird ohne eine Beeinträchtigung der Allgemeingültigkeit der Erfindung, wie hier vorstehend beschrieben und definiert wurde, angegeben.
Der monoklonale Rattenantikörper 39D10, der gegen menschliches IL-5 erzeugt wurde, wird als Donorantikörper verwendet. Die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten von 39D10 wurden früher kloniert (WO 93/16184) und das Nukleotid und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieser Domänen sind in den 1 und 2 gezeigt. Die geeigneten variablen Domänen der schweren und leichten Ketten des Akzeptors müssen bestimmt werden und die Aminosäuresequenz muss bekannt sein. Dann wird das RAM ausgehend von der Akzeptorsequenz als Basis gentechnisch hergestellt.
1. Die CDRs
In einem ersten Schritt werden in den CDRs Akzeptorreste durch Donorreste ersetzt. Zu diesem Zweck sind die CDRs vorzugsweise wie folgt definiert:
Die Positionen an denen die Akzeptorreste durch Donorreste in dem Gerüst ersetzt werden sollen, werden dann folgendermaßen, zuerst in Bezug auf die schwere Kette und danach in Bezug auf die leichte Kette gewählt.
2. SCHWERE KETTE
2.1 Donorreste werden entweder an den gesamten Positionen 24, 27 bis 30, 37, 49, 73, 76 und 78 oder an den gesamten Positionen 23, 24, 27 bis 30, 37, 49, 73 und 76 bis 78 der schweren Kette verwendet.
3. LEICHTE KETTE
3.1 Donorpositionen werden entweder an den gesamten Positionen 22, 68 und 71 oder an den gesamten Positionen 68 und 71 verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Anti-IL-5-Antikörpermolekül mit einer Bindungsaffinität, die im Wesentlichen gleich zu der des Donorantikörpers ist. Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 das Nukleotid und die Aminosäuresequenz der schweren Kette von 39D10 zeigt;
2 das Nukleotid und die Aminosäuresequenz der leichten Kette von 39D10 zeigt;
3 die Anordnung der Gerüstregionen der variablen Domäne der schweren Kette von 39D10 mit den Gerüstregionen der variablen Domäne der schweren Kette von der Consensus-Sequenz der schweren Ketten der humanen Gruppe III zeigt;
4 die Anordnung der Gerüstregionen der variablen Domäne der leichten Kette von 39D10 mit den Gerüstregionen der variablen Domäne der leichten Kette von der Consensus-Sequenz der leichten Ketten der humanen Gruppe I zeigt;
5 das Nukleotid und die Aminosäuresequenz der CDR-gepfropften Anti-IL-5 leichten Kette CTIL-5-gL6 zeigt;
6 das Nukleotid und die Aminosäureseugenz der CDR-gepfropften Anti-IL-5 schweren Kette CTIL-5-10gH zeigt;
7 eine Karte des Plasmids pMR14 zeigt;
8 eine Karte des Plasmids pMR15.1 zeigt;
9 die Affinitätskonstanten und die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten eine chimären 39 D10-Antikörpers und des CTIL-5-10gH/gL6-Antikörpers zeigt;
10 eine graphische Darstellung der Neutralisation von IL5 in dem TF1-Assay durch eine Tafel von Antiköpern zeigt;
11 die Ergebnisse eines Konkurrenzassays für Ratten-39D10, einen chimären Antikörper und CTIL-5-10gH/gL6-Antikörper zeigt; und
12 die Wirkung von CTIL-5-10gH/gL6 auf Affen-Eosinophilie zeigt.
BEISPIEL
1. MATERIAL UND VERFAHREN
39D10 ist ein monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen menschliches IL-5 hervorgerufen wird. Die Gene für die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten von 39D10 wurden vorher kloniert (WO 93/16184) und das Nukleotid und vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieser Domänen sind in den 1 und 2 gezeigt. Aufgrund der zur Klonierung der variablen Domäne der schweren Kette von 39D10 verwendeten Strategie sind die ersten fünf Aminosäuren der Gerüstregionen unbekannt. Jedoch war eine schwere Kette verfügbar, die die Signalsequenz und die ersten fünf Aminosäuren des Gerüsts 1 von dem Antikörper YTH 34.5HL enthielt, Riechmann et al. [Nature, 332, 323–327 (1988)].
2. MOLEKULARBIOLOGISCHE VERFAHREN
Die verwendeten molekularbiologische Verfahren waren diejenigen, die in Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Band 1 bis 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] beschrieben sind.
3. AUFBAU DER REKOMBINANTEN GENE DER SCHWEREN UND LEICHTEN KETTE
Schwere Kette
Eine Vh-Region der schweren Kette wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide R3601 und R2155 erzeugt. Die Sequenzen von diesen sind:
Die Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 10 mM Tris-HCI pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl, 50 mM KCl, 0,01 % w/v Gelatine, 0,25 mM von jedem Desoxyribonukleosidtriphosphat, 0,1 μg DNA der schweren Kette von 39D10, 6 pmol R3601 und R2155 und 0,25 Einheiten Taq-Polymerase. Die Reaktionsmischung wurde bei 94 °C 5 Minuten erwärmt und dann wurden zyklisch 94 °C während 1 Minute, 55 °C während 1 Minute und 72 °C während 1 Minute durchlaufen. Nach 30 Zyklen wurde die Reaktion mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform (1:1 v/v), dann mit Chloroform extrahiert, bevor durch die Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol gefällt wurde. Das PCR-Produkt wurde in dem geeigneten Puffer gelöst, mit HindIII und Apal verdaut, auf einem Agarosegel gereinigt und in den Vektor pMR14 (7) ligiert, der ebenfalls mit HindIII und Apal verdaut worden war. Nach der Transformation in E. coli LM1035 wurden über Nacht Kolonien gezüchtet und die Plasmid DNA bezüglich Vh-Einschüben analysiert. Die Nukleotidsequenz der Vh-Region in dem Plasmid, pARH1217, ist in 1 gezeigt.
Leichte Kette
Ein V1 Gen der leichten Kette wurde von dem ursprünglichen V1-Klon, wie in der WO 93/16184 beschrieben, durch PCR mit den Oligonukleotiden R3585 und R3597 erzeugt. Deren Sequenzen sind:
Die PCR wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit den Enzymen BstBI und Sp1I verdaut und nach der Reinigung in pMR15.1 (8) ligiert, das vorher mit denselben Enzymen verdaut worden war.
Nach Transformation von E. coli LM1035 wurde eine Kolonie identifiziert, die ein Plasmid (pARH1215) mit einem V1-Einschub enthielt. Die Nukleotidsequenz des V1-Einschubs ist in 2 gezeigt.
CDR-Pfropfen von 39D10
Leichte Kette
Zum Entscheiden über die für die CDR-Schleifen von 39D10 am besten geeigneten menschlichen Akzeptorgerüste, wurde die Aminosäuresequenz der Gerüste 1–3 von 39D10 mit denjenigen der bekannten humanen kappa leichten Ketten verglichen. Es wurde festgestellt, dass 39D10 zu den leichten Ketten der humanen Gruppe I am weitesten homolog war. Gestützt darauf wurde entschlossen, die Keimbahngerüste der humanen Gruppe I zum CDR-Pfropfen zu verwenden. Die Homologien zwischen diesen Sequenzen sind in 3 gezeigt. Ebenfalls wird die Homologie zwischen den Regionen des Gerüsts 4 von 39D10 und der Consensus-Sequenz der bekannten leichten Ketten der humanen Gruppe I gezeigt. Die Reste in 39D10, die sich von der humanen Consensus-Sequenz unterscheiden, sind unterstrichen. Der Beitrag, den diese Reste zur Antigenbindung liefern könnten, wurde analysiert und es wurden zwei Gene für die CDR-gepfropfte leichte Kette aufgebaut. Diese waren CTIL-5-gL5 und CTIL-5-gL6, wobei in denen, sowie die CDR-Reste, entweder die Reste 22, 68 und 71 beziehungsweise die Reste 68 und 71 ebenfalls von 39D10 waren. Das Nukleotid und die Aminosäuresequenzen von CTIL-5-gL6 sind in 5 gezeigt.
Schwere Kette
Das CDR-Pfropfen der schweren Kette von 39D10 wurde wie für die leichte Kette beschrieben ausgeführt. Es wurde festgestellt, dass die Gerüstregionen von 39D10 am weitesten homolog zu denjenigen der Antikörper der humanen Gruppe II sind und folglich die Consensus-Sequenz der Gerüste der Keimliniengene der humanen Gruppe III zur Aufnahme der CDRs der schweren Kette von 39 D10 verwendet wurde. Wie vorher wurde ebenfalls die Consensus-Sequenz für die Gerüst 4-Regionen der humanen Gruppe III gewählt. Ein Vergleich dieser Sequenzen ist in 4 gezeigt, wobei die Reste in 39D10, die von der humanen Consensus-Sequenz verschiedenen sind, unterstrichen sind.
Eine Analyse der Gerüstreste in 39D10, die die Antigenbindung beeinflussen könnten, wurde ausgeführt und darauf gestützt wurden zwei Gene, CTIL-5-9gH und CTIL-5-10gH aufgebaut, in denen entweder die Reste 23, 24, 27 bis 30, 37, 49, 73 und 76 bis 78 oder die Reste 24, 27–30, 37, 49, 73, 76 beziehungsweise 78 von 39D10 waren. Das Nukleotid und die Aminosäuresequenzen von CTIL-5-10gH sind in 6 gezeigt.
Expression und Bioaktivität der Anti-IL-5-Antikörper
Chimärer (Ratte/Mensch) und CDR-gepfropfter 39D10 wurde zur biologischen Bewertung durch transiente Expression der schweren und leichten Kettenpaare nach Cotransfektion in Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) unter Verwendung von Calciumphosphatfällung hergestellt.
Ein Tag vor der Transfektion wurden halb-konfluente Kolben mit CHO-L761 h-Zellen (Cockett et al., Nucl. Acids. Res., 19, 319–325, 1991) trypsiniert, die Zellen gezählt und T75-Kolben mit jeweils 10⁷-Zellen vorbereitet. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium drei Stunden vor der Transfektion ausgetauscht. Für die Transfektion wurde der Calciumphosphatniederschlag durch Mischen von 1,25 ml 0,25 M CaCl₂, das 50 μg von den jeweiligen Expressionsvektoren der schweren und leichten Kette mit 1,25 ml 2×HBS (16,36 g NaCl, 11,9 gm HEPES und 0,4 g Na₂HPO₄ in 1 Liter Wasser, wobei der pH-Wert mit NaOH auf 7,1 eingestellt wurde) enthielt, und sofortigem Zugeben in das Medium der Zellen hergestellt. Nach 3 Stunden bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator wurde das Medium und der Niederschlag entfernt und die Zellen durch Zugabe von 15 ml 15 % Glycerin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) während 1 Minute abgeschreckt. Das Glycerin wurde entfernt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und während 48–96 Stunden in 25 ml Medium, das 10 mM Natriumbutyrat enthielt, inkubiert. Der Antikörper wurde von dem Kulturmedium durch Binden an Protein A-Sepharose und dem Eluieren davon, gereinigt. Die Antikörperkonzentration wurde unter Verwendung eines humanen Ig-ELISA (siehe nachstehend) bestimmt.
ELISA
Die Antikörperexpression wurde durch Transfizieren von Genpaaren der schweren und leichten Kette in CHO-Zellen und, nach Inkubation während 3 Tagen, durch Messen der Menge an Antikörpern, die sich in dem Kulturmedium ansammelten, durch ELISA bewertet.
Für den ELISA wurden Nunc-ELISA-Platten über Nacht bei 4 °C mit einem F(ab')₂-Fragment eines polykolonalen Ziege-Anti-Mensch-Fc-Fragment-spezifischen Antikörpers (Jackson Immunoresearch, Kennziffer 109-006-098) mit 5 μg/ml in Beschichtungspuffer (15 mM Natriumcarbonat, 35 mM Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 6,9) beschichtet. Nicht beschichteter Antikörper wurde durch 5 mal Waschen mit destilliertem Wasser entfernt. Proben und gereinigte Standards, die quantitativ bestimmt werden sollten, wurden auf näherungsweise 1 μg/ml in Konjugatpuffer (0,1 M Tris-HCl pH-Wert 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2 % v/v Tween 20, 0,2 % w/v Hammersten Casein) verdünnt. Die Proben wurden in den Mikrotitervertiefungen in zweifachen Verdünnungen titriert, was in jeder Vertiefung zu einem Endvolumen von 0,1 ml führte, und die Platten wurden bei Raumtemperatur während 1 Stunde unter Schütteln inkubiert. Nach dem ersten Inkubationsschritt wurden die Platten 10 mal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann während 1 Stunde wie vorstehend mit 0,1 ml eines Maus monoklonalen anti-Mensch kappa (Klon GD12) Peroxidase-konjugierten Antikörpers (The Binding Site, Kennziffer MP135) bei einer Verdünnung von 1 zu 700 in Konjugatpuffer inkubiert. Die Platte wurde wiederum gewaschen und die Substratlösung (0,1 ml) zu jeder Vertiefung gegeben. Die Substratlösung enthielt 150 μl N,N,N,N-Tetramethylbenzidin (10 mg/ml in DMSO), 150 μl Wasserstoffperoxid (30 % Lösung) in 10 ml 0,1 M Natriumacetat/Natriumcitrat, pH-Wert 6,0. Die Platte wurde während 5–10 Minuten entwickelt, bis die Extinktion bei 630 nm näherungsweise 1,0 für den höchsten Standard betrug. Die Extinktion bei 630 nm wurde unter Verwendung eines Plattenlesers gemessen und die Konzentration der Probe wurde durch Vergleich der Titrationskurven mit denen des Standards bestimmt.
Bestimmung der Affinitätskonstanten für Anti-IL-5-Antikörper
Die Affinitäten der chimären und CDR-gepfropften Anti-IL-5-Antikörper wurden unter Verwendung einer biospezifischen Wechselwirkungsanalyse (BIA) bestimmt. Die Antikörper wurden in CHO-Zellen durch Transfektion von Kombinationen aus Genen der schweren und leichten Kette und Reinigung aus den Kulturüberständen auf Protein A-Sepharose hergestellt. Für die Affinitätsmessungen wurde ein polyklonaler antihumaner Fc-Antikörper an den Pharmacia Biosensor-Chip (12150 relative Reaktionseinheiten, RU) gebunden und zum Einfangen von Anti-IL-5 verwendet, das mit 5 μg/ml in 10 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 3,4 mM EDTA, pH-Wert 7,4 über den Chip geleitet wurde. Die bei jedem Durchlauf eingefangene Menge an Anti-IL-5 betrug näherungsweise 1600 RU. Dann wurde rekombinantes menschliches IL-5 in verschiedenen Konzentrationen (0,6 bis 5 μg/ml) in dem vorstehenden Puffer über den Sensorchip geleitet. Nach jedem Durchlauf wurde der Sensorchip mit 100 mM HCl und 100 mM Orthophosphorsäure zum Entfernen von gebundenem IL-5 und Antikörper gereinigt. Die erzeugten Sensorgramme wurden unter Verwendung der verfügbaren Kinetik-Software mit dem BIAcore-Gerät analysiert.
Es wurden die Werte für die Affinitätskonstanten und Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten von zwei Antikörpern, chimärem 39D10 und CTIL-5-10gH/gL6 bestimmt. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass chimäres 39D10 eine äußerst hohe Affinität für humanes IL-5 aufweist und, dass dieser Wert in CTIL-5-10gH/-gL6 reproduziert wurde.
Aktivität von Anti-IL5-Antikörpern in einem in vitro Bioassay
Die Aktivitäten verschiedener CDR-gepfropfter Antikörper wurden mit denen von chimärem 39D10 in einem in vitro Bioassay unter Verwendung von TF1-Zellen verglichen. TF1 ist eine erythroleukämische Zelllinie, die zum Wachstum GM-CSF erfordert. GM-CSF kann durch IL-5 ersetzt werden, in diesem Fall überleben jedoch die Zellen nur und vermehren sich nicht stark. Die Abhängigkeit des Überlebens von IL-5 bedeutet jedoch, dass TF1-Zellen in einem Bioassay zum Vergleichen der Aktivitäten verschiedener Anti-IL-5-Antikörper verwendet werden kann.
Die Neutralisation durch Anti-IL-5-Antikörper wurde unter Verwendung einer konstanten Menge an IL-5 (2 ng/ml) und variablen Mengen an Antikörpern, die mit 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden während 3 Tagen inkubiert wurden, gemessen. Während der letzten 4 Stunden werden die Zellen in Gegenwart von 500 μl/ml Thiazolylblau (MIT) kultiviert. Dieser Farbstoff wird in eine unlösliche purpurrote Form durch Mitochondrien-Enzyme in lebensfähigen Zellen umgewandelt. Das unlösliche Material wurde durch Inkubieren über Nacht nach Zugabe von 100 μl 50 % Dimethylformamid, 20 % SDS pH-Wert 4,7 und gelöst und die Menge an aufgenommenem Farbstoff wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die Gehalte an bioaktivem IL-5, das in Gegenwart der Antikörper zurückblieb, wird von einer Standardkurve ausgehend, die sich auf den Zusammenhang von Farbstoffaufnahme und IL-5-Konzentration bezieht, extrapoliert.
Die Aktivitäten von verschiedenen Kombinationen an schweren und leichten Ketten wurden unter Verwendung des TF1-Bioassays bewertet. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass alle Kombinationen an CDR-gepfropften schweren und leichten Ketten Antikörper erzeugen, die bezüglich des chimären 39D10 gleich wirksam sind. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass weder der Rest 22 in der leichten Kette noch die Reste 23 oder 78 in der schweren Kette für eine 39D10-Spezifität zum optimalen Binden erforderlich sind. Die Kombination mit den weniger 39D10-spezifischen Resten ist daher CTIL-5-10gH/-gL6.
Aktivität von Anti-IL-5-Antikörpern in Konkurrenzassays
Rekombinantes humanes IL-5 wurde auf 1 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt und 100 μl Aliquoten wurden auf Mikrotiterplatten (Costar Amine-Binding-Platten) gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS, das 0,5 % Tween 20 enthielt, gewaschen und jegliche übrigen aktiven Stellen wurden mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS während 30 Minuten blockiert. Dann wurden die Platten abgesaugt und ablaufen gelassen, bis sie trocken waren. Zum Vergleich der relativen Bindungsaktivität des Stammrattenantikörpers (39D10) mit chimären und gepfropften Antikörpern wurden Verdünnungsreihen von jedem Anti-IL-5-Antikörper in PBS/1 % BSA hergestellt und 50 μl zum Verdoppeln der Vertiefungen, unmittelbar gefolgt von 50 μl 39D10-Biotinkonjugat mit 0,125 μg/ml zugegeben. Der Assay wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert und dann zweimal mit PBS gewaschen. Zu allen Vertiefungen wurden Meerrettichperoxidase konjugiert an Streptavidin (1 μg/ml) gegeben und während weiteren 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden vier mal gewaschen und 100 μl Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat wurde zugegeben. Die Farbentwicklung wurde bei 630 nm (Referenz 490 nm) abgelesen und die OD (630–490) wurde gegen log(10) der Antikörperkonzentration aufgetragen.
Bei dem Vergleich der Aktivitäten des 39D10 der Ratte, des chimären 39D10 und CTIL-5-10gH/gL6 in dem vorstehenden Konkurrenzassay wurden die in 11 ge zeigten Ergebnisse erhalten. Alle drei Antikörper konkurrierten gut mit biotinyliertem 39D10 um die Bindung an IL-5, was darauf hinweist, dass die CDR-Schleifen von 39D10 erfolgreich auf die humanen Gerüste übertragen worden sind.
Wirkung des Anti-IL-5-Antikörpers auf Affen-Eosinophilie
Der Anti-IL-5-Antikörper (CTIL-5-10gH/gL6) wurde in einem Affensystem getestet, das die asthmatischen Bedingungen modelliert (siehe Mauser, P.J. et al., Ann. Rev. Respir. Dis., in Druck). Wird CTIL-5-10gH/gL6 eine Stunde vor der Herausforderung mit Ascaris an ansprechende Alten verabreicht, so hemmt es die Lungenwascheosinophilie um 75 % bei einer intravenösen Dosis von 0,3 mg/kg. Dieser Satz Affen spricht nicht übermäßig auf Histamin an, so dass die Wirkungen von CTIL-5-10gH/gL6 auf eine übermäßige Ansprechempfindlichkeit nicht bestimmt werden konnten. Drei Monate nach dieser Einzeldosis wird die Eosinophil-Anhäufung als Reaktion gegen die Herausforderung mit Ascaris noch um 75 % gehemmt.
In der allergischen Maus hemmt CTIL-5-10gH/gL6 die Lungen-Eosinophilie mit 1 mg/kg intraperitoneal.

Claims

Rekombinantes Antikörpermolekül mit einer Affinität für humanes IL-5-Antigen, umfassend a) eine CDR-gepfropfte schwere Kette, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem die Reste 31-35, 50-65 und 95-102 Donor-Reste des monoklonalen Ratten-Antikörpers 39D10 sind, und b) eine CDR-gepfropfte leichte Kette, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem die Reste 24–34, 50–56 und 89–97 Donor-Reste des monoklonalen Ratten-Antikörpers 39D10 sind, wobei die CDR-gepfropfte schwere Kette eine variable Domäne, die überwiegend die Gerüst-Reste der schweren Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers umfaßt, aufweist und die CDR-gepfropfte leichte Kette eine variable Domäne, die überwiegend die Gerüst-Reste der leichten Kette eines humanen Akzeptor-Antikörpers umfaßt, aufweist, wobei gemäß dem Kabat-Numerierungssystem in der CDR-gepfropften schweren Kette die Gerüst-Reste 24, 27–30, 37, 49, 73, 76 und 78 mindestens zusätzlich Donor-Reste des monoklonalen Ratten-Antikörpers 39D10 sind und in der CDR-gepfropften leichten Kette die Gerüst-Reste 68 und 71 mindestens zusätzlich Donor-Reste des monoklonalen Ratten-Antikörpers 39D10 sind.
Rekombinantes Antikörpermolekül gemäß Anspruch 1, weiter umfassend Donor-Reste des monoklonalen Ratten-Antikörpers 39D10 an den Gerüst- Resten 23 und 77 der CDR-gepfropften schweren Kette.
Rekombinantes Antikörpermolekül gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, weiter umfassend Donor-Reste des monoklonalen Ratten-Antikörpers 39D10 an dem Gerüst-Rest 22 der CDR-gepfropften leichten Kette.
Rekombinantes Antikörpermolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die humanen Akzeptor-Reste für die CDR-gepfropfte schwere Kette Reste der schweren Kette der humanen Gruppe III sind, und die Akzeptor-Reste für die CDR-gepfropfte leichte Kette Reste der leichten Kette der humanen Gruppe I sind.
Rekombinantes Antikörpermolekül gemäß Anspruch 4, umfassend die variable Region der schweren Kette, gezeigt in 6 <SEQ ID 28>, und die variable Region der leichten Kette, gezeigt in 5 <SEQ ID 26>.
DNA-Sequenz, welche die variable Domäne der CDR-gepfropften schweren Kette und/oder die variable Domäne der CDR-gepfropften leichten Kette eines Antikörpers gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Antikörpermolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneimittelträger.
Antikörpermolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung für die Therapie oder Diagnose.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Antikörpermoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments für das Verabreichen an einen Menschen oder ein Tier zum Behandeln von Eosinophilie.