DE69738138T2

DE69738138T2 - Induktion von immunologischer Toleranz gegen einen therapeutischen Antikörper durch Varianten des therapeutischen Antikörpers

Info

Publication number: DE69738138T2
Application number: DE69738138T
Authority: DE
Inventors: Herman Waldmann; Lisa Kim Gilliland; Masahide Tone; Mark Raymond Frewin; Louise Walsh
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2017-02-21
Also published as: US8440190B2; JP2000506723A; ES2294793T3; JP4574750B2; GB9603507D0; US20020048578A1; US20060018898A1; WO1997031024A1; CA2246715A1; DE69738138D1; EP0970127B1; AU723366B2; AU1885197A; CA2246715C; EP0970127A1; NZ331299A; ATE373016T1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung modifizierter Antikörper zur Induzierung immunologischer Toleranz in Menschen oder Tieren.
Antikörper oder Immunoglobuline umfassen zwei schwere Ketten, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, und zwei leichte Ketten, wobei jede leichte Kette durch Disulfidbindungen mit der jeweiligen schweren Kette verbunden ist. Jede schwere Kette verfügt an einem Ende über eine variable Domäne, der mehrere konstante Domänen folgen. Jede leichte Kette verfügt an einem Ende über eine variable Domäne und an dem anderen Ende über eine konstante Domäne, wobei die variable Domäne der leichten Kette nach der variablen Domäne der schweren Kette und die konstante Domäne der leichten Kette nach der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet ist. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind nicht direkt in das Binden des Antikörpers an Antigen involviert.
Die variablen Domänen von jedem Paar leichter und schwerer Ketten bilden die Antigenbindungsstelle. Die variablen Domänen der leichten und schweren Ketten haben dieselbe allgemeine Struktur; jede Domäne umfaßt vier Strukturregionen, deren Sequenzen relativ konserviert sind, verbunden durch drei komplementätsbestimmende Bereiche (CDRs). Die CDRs werden nahe bei den Strukturregionen gehalten. Die CDRs benachbarter variabler Domänen leichter und schwerer Ketten tragen zusammen zur Bildung der Antigenbindungsstelle bei.
Hintergrund der Erfindung
Antikörper, die auf speziell ausgewählte Antigene gerichtet sind, sind zur Behandlung verschiedenster Zustände verwendet worden. Beispielsweise sind Campath-1 monoklonale Antikörper (mAb) erfolgreich zur Induzierung der Remissionen bei Lymphom- und Leukemiepatienten und zur Behandlung von Rheumatoidarthritis und Vaskulitis verwendet worden. Das Zielantigen, CD52 (auch als CDw52 bezeichnet; siehe z. B. Xia et. al., 1991), ist ein GPI- verankertes Glycoprotein von Lymphozyten und Monozyten (und Teilen des männlichen Fortpflanzungssystems). Es verfügt über eine außergewöhnlich kurze Peptidsequenz von 12 Aminosäuren und ein einzelnes, komplexes, N-gebundenes Oligosaccharid an Asn3 (Hale et. al., 1990; Xia et. al., 1991). CD52 ist ein gutes Target für das Antikörper-vermittelte Abtöten und ist daher ein effektives Zelloberflächenmolekül für die verschiedensten therapeutischen Regime, in denen die Reduktion der Lymphozyten ein Ziel ist (z. B. Entfernung von Zellen aus Spenderknochenmark zur Verhinderung der Graft-versus-host-Krankheit, Behandlung von Leukämie und Lymphom und Immunosuppression).
Mehrere Ratten-Anti-human-CD52-Campath-1-mAb wurden durch die Fusion der Y3-Ratten-Myelomlinie mit Milzzellen aus einer mit humanen T-Lymphozyten immunisierten Ratte erzeugt (Hale et. al., 1983). Obgleich die klinische Wirksamkeit der Ratten-Campath-1-mAb regelmäßig demonstriert worden ist, zeigten viele Patienten eine Anti-Antikörper-Antwort (Antiglobulin-Antwort) gegen das xenogene Protein, die die Wiederbehandlung mit dem therapeutischen Antikörper verhinderte. Die Antikörpertherapie ist oftmals durch die Antiglobulinantwort eingeschränkt. Die antiidiotypische Komponente (Anti-Id; die gegen die AbV-Regionen und insbesondere die Ab-Bindungsstelle gerichtet ist) inhibiert die Bindung des Ab an sein Target, während sowohl die Anti-Id- als auch die anti-isotypische Komponente (gerichtet gegen die konstanten Regionen) die Antikörperclearance beschleunigen. Das Hauptaugenmerk ist auf die neutralisierende Wirkung der Antiglobulinantwort gerichtet. Wie Antiglobulinantworten im allgemeinen, interferieren Anti-Id-Antworten mit der klinischen Wirksamkeit eines therapeutischen Ab durch die Bildung von Ab-Aggregaten, die schnell aus dem Körperkreislauf geklärt werden, was die Chance auf eine Interaktion mit dem Targetantigen verringert. Leider enthalten die meisten Antiglobulinseren anti-Id-Antikörper. Dies ist bei einer Vielzahl therapeutischer mAb demonstriert worden und wird besonders nach wiederholten Behandlungen deutlich.
Zur Reduktion der Immunogenität des Ratten-IgG2b-Campath-1-Antikörpers, YTH34-5, wurden die Genfragmente, die VL und VH kodieren, durch "CDR-Transplantation" der Nagetier-hypervariablen Regionen auf humane Strukturregionen humanisiert (Jones et. al., 1986; Reichmann et. al., 1988). Dies wurde durch das Spleißen der CDR-Sequenzen, die den Ratten-Campath-1-Antikörper kodieren, auf eine Sequenz, die die humane Strukturhauptkette kodiert, bereitgestellt durch die kristallographisch gelösten Myelomproteine NEW (für VH) und REI (für VL), durchgeführt. Das resultierende Protein hatte einen niedrigen Antigenbindungstiter und die Modellierung der humanisierten V-Region zeigte, daß der Rest 27 in der VH-Struktursequenz für die Konservierung der Schleifenstruktur von CDR1 entscheidend war. Dieser Rest wurde aus dem in NEW (Ser) zu finden Rest wieder in den Ratten-Rest Phe umgewandelt, was zur Wiederherstellung der Antigenbindung führte. Während der Modellierung wurde auch eine weitere Veränderung vorgeschlagen (NEW-Rest Ser zum Ratten-Rest Thr). In Funktionsassays hatte diese Substitution jedoch keine Wirkung auf die Antigenbindung, die Doppelmutante (Ser27 zu Phe27 und Ser30 zu Thr30) exprimierte jedoch das meiste Protein und wurde daher zur Produktion therapeutischer humanisierter Campath-1-Ab, bezeichnet mit Campath-1H (Reichmann et. al., 1988; EP 0 308 404 ) verwendet. Da viele humane VH-Strukturen Threonin an Position 30 aufweisen, wurde diese Veränderung nicht als ein weiteres Risiko für die Immunogenität des Antikörpers angesehen. Humanisierte VL und VH wurden dann genetisch mit den konstanten Regionen leichter Ketten bzw. schwerer Ketten eines Menschen fusioniert. Kurz gesagt, besteht der humanisierte Campath-1-Antikörper aus humanen Resten an allen Positionen außer denen, die die 3 CDRs der leichten Kette, die 3 CDRs der schweren Kette und die Reste Phe27 und Thr30 in VH der schweren Kette kodieren.
In klinischen Versuchen wurde herausgefunden, daß die humanisierte Version (Campath-1H) viel weniger immunogen ist als der Ratten-IgG2b-Campath-1-Antikörper. Die Humanisierung verringert die Immunogenität des Nagetier-mAb, obgleich sowohl der Idiotyp als auch der Allotyp eines humanisierten mAb noch immer ein Target für humorale Antworten sein kann. Tatsächlich ist in einigen Allotyp-angepaßten Empfängern von Campath-1H eine Sensibilisierung auf den Idiotyp dokumentiert worden (Isaacs et. al., 1992; Lockwood et. al., 1993). Diese Antworten waren durch die Gegenwart von anti-Id in den Seren der Patienten erkennbar. Ein Patient erzeugte Hochtiter-Anti-Id, das mit der gesamten Gruppe des CD52-mAb kreuzreagierte.
Eine Strategie zur weiteren Verringerung der Immunogenität von Campath-1H könnte die Retransplantation der 6 CDR-Schleifen auf genau festgelegte humane Keimbahn-Strukturregionen sein. Der Großteil der humanisierten V-Regionen nutzte bisher umgeordnete V-Gene als Akzeptorstruktursequenz. Dies war der Fall, wo Campath-1H als Struktursequenzen aus Myelomproteinen zur Bereitstellung von Akzeptorsequenzen sowohl für VH als auch VL verwendet wurden. Umgeordnete V-Gene enthalten oftmals somatische Mutationen, die im Verlauf der Affinitätsreifung erworben werden. Diese werden für das Individuum, aus dem die umgeordneten Gene stammen, einzeigartig sein und können daher in einem anderen Individuum als fremd angesehen werden. Es besteht jedoch die Möglichkeit, daß die Retransplantation (Regrafting) neue idiotypische Epitope, gebildet durch die Gelenkregionen, die CDR-Reste und neue Strukturreste umfassen, einführen wird. Ferner kann die Humanisierung allein das Problem der Anti-Id-Antworten nicht lösen, da die menschliche Bevölkerung ausgezüchtet ist und es unwahrscheinlich ist, daß alle Patienten einen gegebenen humanisierten mAb tolerieren. Selbst in konstanten Antikörperregionen gibt es viele verschiedene Allele, die allotypische Marker tragen, an denen natürlich vorkommende Antiglobulinantworten demonstriert werden können. Das Problem ist für V-Regionsegmente noch komplexer, die im Vergleich zu konstanten Regionen sowohl im Allotyp als auch im Haplotyp einen höheren Variationsgrad zeigen.
Ein anderer Ansatz ist die Induzierung von Toleranz für die potentiellen Fremdpeptide, die in der Campath-1H-V-Region enthalten sind. Wir wissen, daß die Antiglobulinantwort selbst eine B-Zellenantwort ist, die CD4+T-Zellen-abhängig ist. Isaacs und Waldmann (1994) demonstrierten, daß Mäuse, die aus CD4+T-Zellen abstammten, nicht auf einen fremden zellbindenden mAb reagieren konnten (Ratte-Anti-Maus-CD8-mAb). Die CD4+T-Zell-Depletion wurde durch Erwachsenen-Thymektomie in Kombination mit der Verabreichung eines depletierenden CD4-mAb durchgeführt.
In diesen Mäusen wurde die Reaktion auf einen nachfolgend verabreichten mAb oder SRBC gemessen. Mäuse, denen es an CD4+T-Zellen mangelte, gaben weder eine Antiglobulin- noch eine Anti-SRBC-Antwort, was zeigt, daß die Anti-Ig-Antwort, wie die Anti-SRBC-Antwort, klassischerweise CD4+T-Zellen-abhängig ist. Zur Erzeugung von T-Zellhilfe und zum Erhalt der geeigneten T-Zellenantwort, muß der verabreichte Ab als ein Proteinantigen prozessiert und wahrscheinlich im Kontext eines MHC-Moleküls der Klasse II durch eine geeignete Antigen-präsentierende Zelle präsentiert werden. Daher können zur Verringerung der Immunogenität einer humanisierten V-Region zwei Hauptstrategien angewandt werden. (1) Wir können das Antikörpermolekül selbst "inaktivieren", wobei Strategien zur Eliminierung aller potentiellen T-Helfer-Epitope übernommen werden, oder (2) wir können alle potentiellen T-Helfer-Epitope auf eine Weise präsentieren, die bei diesen Epitopen anstelle von Reaktivität Toleranz induziert.
"Silencing" (Inaktivierung) des Antikörpermoleküls:

a) In der Theorie mögen wir fähig sein, den Antikörper selbst zu inaktivieren, so daß das Immunsystem Fremddeterminanten nicht erkennen wird. Dies wäre möglich, wenn wir die VL- und VH-Aminosäuresequenzen auf Motive scannen könnten, die an MHC-Klasse-II-Moleküle binden können. Wenn wir so einen Schlüsselrest(e) in einem potentiellen Klasse-II-Peptid identifizieren könnten, der/die nicht in die Antikörperspezifität oder -affinität involviert ist/sind, dann könnte(n) dieser/diese durch ortsgerichtete Mutagenese an einen Rest(e), der/die eine Assoziation mit Klasse-II-Molekülen nicht erlaubt/erlauben, verändert werden. T-Helfer-Peptide sind nicht zufällig, und jedes Protein verfügt nur über eine begrenzte Anzahl an Peptiden, die an MHC-Klasse-II-Moleküle und auch an T-Zell-Antigenrezeptoren binden können. Dies ist derzeit jedoch nicht möglich, da Klasse-II-Bindungspeptide bisher nicht ausreichend als durch das Scannen von Proteinsequenzen zu identifizieren charakterisiert worden sind. Dies ist zum Teil dem heterogenen Wesen von Klasse-II-Peptiden zuzuschreiben. Natürlich prozessierte Peptide, isoliert aus MHC-Klasse-II-Molekülen, sind im allgemeinen größer, längenvariabel und verfügen im Vergleich zu prozessierten Peptiden, isoliert aus MHC-Klasse-I-Molekülen, über zwei gezackte Enden an C- und N-Termini. Während Klasse-I-abgeleitete Peptide meistens eine einheitliche Länge von 8–9 Aminosäureresten aufweisen, verfügen MHC-Klasse-II-assoziierte Peptide über 12–24 Aminosäuren (Rudensky et. al., 1991; Hunt et. al., 1992; Rudensky and Janeway, 1993). Klasse-I-abgeleitete Peptide verfügen über Sequenzmotive mit spezifischen Ankerresten an bestimmten Positionen, durch die sich ihre Seitenketten in die Bindungstaschen der Peptidbindungsfurche einfügen können, und die Peptidbindungsfurche ist an beiden Enden geschlossen. Im Gegensatz dazu sind Klasse-II-Peptide in einer verlängerten Konformation gebunden, die über beide Enden einer "offenen" Antigenbindungsfurche herausragt; eine hervortretende nicht-polare Tasche, in die sich eine Ankerpeptidseitenkette nahe einem Ende der Bindungsfurche einfügt (Brown et. al., 1993).
b) Andere Strategien, die zum "Inaktivieren" des Antikörpers übernommen werden könnten, wären, wenn wir Klasse-II-Peptid-Bindungsmotive vorhersagen könnten. Beispielsweise könnte eine die Insertion einer Protease-Spaltstelle in irgendein potentielles Klasse-II-Epitop umfassen, um so die Chance auf den Peptidabbau zu erhöhen, bevor sie im Zusammenhang mit Klasse II präsentiert werden können. Alternativ kann die Insertion von Motiven in eine V-Region wie Gly-Ala-Wiederholungen den Abbau der V-Region in Peptide, die mit Klasse- II-Molekülen assoziieren könnten, inhibieren. In einem System wurde gezeigt, daß EBNA1-Gly-Ala-Wiederholungen ein cis-wirkendes Inhibierungssignal erzeugten, das die Antigen-prozessierung während der MHC-Klasse-I-beschränkten Präsentation störte, wodurch die CTL-Erkennung inhibiert wurde (Levitskaya et. al., 1995). Obgleich jeder dieser Ansätze für die Zukunft in gewisser Weise von Bedeutung sein könnte, basieren auch sie auf der Vorhersage potentieller MHC-Klasse-II-Peptide aus einer Proteinsequenz humanisierter VL- und VH-Regionen und sind daher durch unzureichende Kenntnisse über Consensusmotive für Klasse-II-Peptide eingeschränkt.

Induktion von Toleranz gegen T-Helferepitope
Statt auf ausreichende Kenntnisse über Klasse-II-Peptid-Motive richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf die Induktion von Toleranz gegen therapeutische Antikörper. 1986 beschrieben Benjamin et. al. und Cobbold et. al. die unerwartete Fähigkeit eines zellbindenden mAb: während es möglich war, Toleranz gegen die Fc-Region (Anti-Isotyp-Toleranz) zu induzieren, blieb der Idiotyp unter äquivalenten Bindungen antigen. Überdies konnte relativ leicht Toleranz gegen einen nicht-zellbindenden mAb induziert werden, wohingegen ein zellbindender mAb als stark immunogen angesehen wurde.
Isaacs und Waldmann (1994) verwendeten in einer Vorstudie nicht-zellbindende "Mischmolekül"-Derivate eines zellbindenden Ab zur Induktion von Toleranz gegen die Wildtypform. Der zellbindende Antikörper war ein Anti-CD8-mAb in einem Mausmodell. Die nicht-zellbindenden Derivate wurden durch Paarung der relevanten L- und H-Ketten mit einer irrelevanten H- bzw. L-Kette erzeugt. Die relevante H-Kette, gepaart mit einer irrelevanten L-Kette, wurde durch Grenzwertverdünnungsklonen des ursprünglichen Hybridoms, das eine Myelom-Leichtkette (aus dem Y3-Fusionspartner) sowie die spezifische Anti-CD8-H- und L-Ketten exprimierte, erhalten. Es wurde eine Variante des Hybridoms, das die Myelom-L-Kette und die spezifische Anti-CD8-H-Kette, aber nicht die Anti-CD8-L-Kette exprimierte, erhalten. Auf diese Weise wurde auch ein Klon, der nur die relevante L-Kette exprimiert, erhalten. Dieser Klon wurde dann an ein Hybridom, das eine irrelevante Spezifität (Antihuman CD3) exprimiert, fusioniert, und es wurde eine Variante ausgewählt, die die relevante Anti-CD8-L-Kette mit der irrelevanten Anti-CD3-H-Kette exprimierte. Da Proteine vor der T-Zellen-Präsentation zu Peptiden prozessiert werden, können T-Zellen ungeachtet ihrer Partnerkette Helferpeptide aus Antigen-spezifischen H- und L-Ketten "sehen". In diesem Fall gab es keinen Vorteil für die Toleranzinduktion unter Verwendung nicht-zellbindender Mischmolekülderivate eines therapeutischen mAb in vivo im Vergleich zu einer Isotypangepaßten Kontrolle, was darauf schließen läßt, daß sich in dem verwendeten Mausstamm die meisten (oder alle) Helferepitope in der konstanten Region befanden.
In der Praxis wäre die Verwendung dieser "Mischmoleküle" Antigen-spezifischer und irrelevanter Immunoglobulinketten für die Humantherapie nicht machbar, da die irrelevanten H- und L-Ketten selbst einige Helferepitope tragen würden, was die Fähigkeit zum Erhalt von Toleranz gegen die relevanten H- und L-Ketten komplizierter machen würde. Ebensowenig würde man erwarten, die B-Zellen, die idiotype Determinanten, gebildet durch die Kombination der relevanten H- und L-Ketten des Antikörpers, "sehen", zu tolerieren.
Campath-1 ist ein zellbindender mAb, und daher wäre ein effektives Tolerogen zur Verwendung damit, wie eine nicht-zellbindende Form des therapeutischen mAb, von Vorteil. Selbiges gilt für andere therapeutische Antikörper, die über Zellbindungseigenschaften verfügen, und nicht zellbindende Varianten davon.
Die Erfindung
Die Erfindung liefert daher (i) einen Antikörper, wie in Anspruch 1 spezifiziert, der eine modifizierte Version eines therapeutischen Antikörpers mit Affinität für ein Zelloberflächenantigen ist, wobei der Antikörper im Vergleich zu dem therapeutischen Antikörper aufgrund einer Modifikation oder Modifikationen am Antikörpermolekül eine reduzierte Affinität für das Antigen aufweist, wobei der Antikörper mindestens ein Epitop umfaßt, das ebenfalls in dem therapeutischen Antikörper vorliegt und in dem vorgesehenen Patienten eine Immunantwort auslöst, für die Herstellung eines Medikaments, das eine Immuntoleranz für den therapeutischen Antikörper auslöst.
Bevorzugt ist die Affinität des modifizierten Antikörpers für das Antigen auf 50% oder weniger der Affinität des therapeutischen Antikörpers für das Antigen reduziert. Stärker bevorzugt ist die Affinität auf 10% oder weniger, oder auf 1% oder weniger der Affinität des therapeutischen Antikörpers reduziert. Die Affinität muß ausreichend reduziert sein, damit der Antikörper gemäß der Erfindung als ein Tolerogen in bezug auf den therapeutischen Antikörper agieren kann. Der Ausdruck "nicht-zellbindende Variante" wird hierin zur Bezeichnung von Antikörpern gemäß der Erfindung verwendet, obgleich die Antikörper gemäß der Erfindung noch über etwas Bindungsaffinität für das Zelloberflächenantigen verfügen können.
Die Fähigkeit des modifizierten Antikörpers Immuntoleranz für einen therapeutischen, zellbindenden Antikörper auszulösen, beruht darauf, daß in dem nicht-zellbindenden Antikörper mindestens ein Epitop vorliegt, das ebenfalls in dem therapeutischen Antikörper vorliegt, der eine Immunantwort in dem vorgesehenen Patient auslöst.
Der nicht-zellbindende Antikörper toleriert bevorzugt anti-idiotypische Antworten, zumindest die hypervariablen V-Domänenregionen des therapeutischen Antikörpers und bevorzugt auch die Strukturregionen. Daher verfügt der tolerisierende Antikörper wünschenswerterweise über eine Aminosäuresequenz, die der des therapeutischen Antikörpers in diesen Regionen ähnelt. Bevorzugt besteht zwischen den variablen Domänen des nicht-zellbindenden Antikörpers und des therapeutischen Antikörpers eine Aminosäuresequenzidentität von > 90% oder > 95% oder > 99%. Am stärksten bevorzugt sind die Unterschiede auf alle Aminosäuresubstitution(en) beschränkt, die die Antigenbindungsaffinität in dem nicht-zellbindenden Antikörper ausreichend reduzieren muß/müssen.
Bevorzugt löst auch der nicht-zellbindende Antikörper Toleranz für die konstanten Regionen des therapeutischen Antikörpers aus. Daher ähneln die konstanten Domänen des nicht-zellbindenden Antikörpers denen des therapeutischen Antikörpers, mit einer Aminosäuresequenzidentität von > 90% oder > 95% oder > 99%. Am stärksten bevorzugt sind die konstanten Domänen des nicht-zellbindenden Antikörpers und des therapeutischen Antikörpers identisch und daher allotypisch übereinstimmend.
Die Offenbarung nutzt ferner Fragmente eines hierin beschriebenen Antikörpers, wobei die Fragmente Toleranz auslösen können. Solche Fragmente umfassen einwertige und zweiwertige Fragmente wie Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Fragmente. Auch enthalten sind Einkettenantikörper. Die bevorzugten Merkmale solcher Fragmente sind die hierin in bezug auf die nicht-zellbindenden Antikörper gemäß der Erfindung beschriebenen. Die nicht-zellbindenden Fragmente können mit den entsprechenden therapeutischen Antikörperfragmenten oder mit therapeutischen Antikörpermolekülen verwendet werden.
Die reduzierte Bindungsaffinität der nicht-zellbindenden Antikörper kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. In der hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsform reduziert eine Veränderung der CDRs, die eine oder zwei oder mehr Aminosäuresubstitutionen umfassen, die Bindungsaffinität. Alternativ können Aminosäuresubstitutionen in anderen Teilen des Antikörpermoleküls zur Reduktion der Bindungsaffinität verwendet werden. Bekanntermaßen beeinflussen Aminosäuresubstitutionen in den Strukturregionen signifikant die Bindungsaffinität (Reichmann et. al., 1988). Eine andere Alternative außerhalb des durch die anhängenden Ansprüche definierten Umfangs der Erfindung ist eine einwertige Form des therapeutischen Antikörpers. Einwertige Antikörper weisen im Vergleich zu ihren zweiwertigen Gegenstükken reduzierte Bindungsaffinität auf. Einwertige Formen können zum Beispiel Fab-Fragmente oder einkettige Antikörper oder irgendwelche anderen genetisch hergestellten Antikörperfragmente, die eine einzelne Bindungsstelle behalten, sein. Einwertige Varianten können auch durch Mutation des Cysteinrestes, der an der Disulfidbrückenbildung (H-H) beteiligt ist (z. B. cys→ser oder cys→ala) erzeugt werden. Die Reduktion der Bindungsaffinität eines einwertigen Antikörpers kann im Vergleich zu seinem zweiwertigen Gegenstück zum Auslösen von Toleranz ausreichen. Bevorzugt kann der einwertige Antikörper Fc-Rezeptoren oder den Bestandteil des Komplementsystems Clq oder beide nicht binden. Eine oder beide dieser Eigenschaften kann/können durch geeignete Mutationen eingeführt werden (siehe z. B. Morgan et. al., WO 94/29351 , veröffentlicht am 22. Dezember 1994, und Winter et. al., EP 0 307 434 B1 ).
Die nicht-zellbindenden Antikörper können daher eine von mehreren Arten von Antikörpern sein, einschließlich genetisch hergestellter Antikörper. Überdies werden die Antikörper im allgemeinen eine Abstammungsmischung bilden. Beispielsweise können sie chimär, z. B. humane konstante Regionen mit variablen Rattendomänen; oder humanisiert oder CDR-gepfropft oder anderweitig umgeformt sein (siehe z. B. Cabilly et. al., US-Patent Nr. 4,816,567 ; Cabilly et. al., Europäisches Patent Nr. 0 125 023 B1 ; Boss et. al., US-Patent Nr. 4,816,397 ; Boss et. al., Europäisches Patent Nr. 0 120 694 B1 ; Neuberger, M. S. et. al., WO 86/01533 ; Neuberger, M. S. et. al., Europäisches Patent Nr. 0 194 276 B1 ; Winter, US-Patent Nr. 5 225 539 ; Winter, Europäisches Patent Nr. 0 239 400 B1 ; Queen et. al., US-Patent Nr. 5,585,089 ; Queen et. al., Europäisches Patent Nr. 0 451 216 B1 ; Adair et. al., WO 91/09967 , veröffentlicht am 11. Juli 1991; Adair et. al., Europäisches Patent Nr. 0 460 167 B1 und Padlan, E. A. et. al., Europäisches Patent Nr. 0 519 596 A1 . Siehe auch Newman, R. et. al., Biotechnology, 10: 1455–1460 (1992), das sich mit primatisierten Antikörpern befaßt, und Huston et. al., US-Patent Nr. 5,091,513 ; Huston et. al, US-Patent Nr. 5,132,405 ; Ladner et. al., US-Patent Nr. 4,946,778 und Bird, R. E. et. al., Science. 242: 423–426 (1988), das sich mit einkettigen Antikörpern befaßt). Campath-1H wird als humanisiert betrachtet, obgleich er zwei Aminosäuresubstitutionen in den Strukturregionen enthält.
Idealerweise kommt der modifizierte Antikörper dem therapeutischen Antikörper, auf dem er basiert, so nahe wie möglich. Die Verabreichung einer solchen "Minimalmutante" vor der Injektion des zellbindenden therapeutischen mAb kann zum Tolerantmachen gegen alle T- und die meisten B-Zellepitope in dem therapeutischen mAb verwendet werden. Klassische Experimente zeigen, daß die Toleranz effektiver durch T-Zellen als durch B-Zellen aufrechterhalten wird. Da jedoch die meisten B-Zellantworten, einschließlich die Anti-Id-Antwort, T-Zellhilfe erfordern, auch wenn eine B-Zelle auf ein gegebenes Antigen anspricht, wird die Antikörperproduktion durch das Stadium der Responsivität der T-Zellen bestimmt (Chiller et. al., 1971). Daher wird bevorzugt eine nicht-zellbindende Variante mit minimalen Unterschieden, die zur ausreichenden Reduktion ihre Affinität für das Zelloberflächenantigen notwendig sind, damit sie als ein Tolerogen verwendet werden kann, verwendet. Unter Verwendung von Techniken wie Röntgenstrahlenkristallographie, Computermodellierung und ortsgerichtete Mutagenese, und ebenso genetischer Verfahren wie Phagendisplay, ist es möglich, geeignete nicht-zellbindende Varianten für jeden zellbindenden therapeutischen Antikörper zu gestalten.
Der modifizierte Antikörper liegt bevorzugt in biologisch reiner Form vor und ist wünschenswerterweise zu mindestens 95% (bezogen auf das Gewicht) frei von anderen biologischen Materialien.
Wie hierin verwendet, ist unter dem Ausdruck "Zelloberflächenantigen" ein Antigen zu verstehen, das auf Zelloberflächen, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich auf Zelloberflächen zu finden ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "therapeutischer Antikörper" auf einen Antikörper, der Menschen oder Tieren für die gewünschte Wirkung, insbesondere bei der Be handlung einer Krankheit, verabreicht werden kann. Solche therapeutischen Antikörper werden im allgemeinen monoklonale Antikörper und im allgemeinen genetisch hergestellt sein.
In den anhängenden Figuren:
Zeigt 1 die Campath-1H-Schwerketten-Minimalmutantenkonstrukte, hergestellt wie in den Beispielen beschrieben.
Zeigt 2 die PCR-Mutagenesestrategie zur Herstellung der Mutantenkonstrukte aus 1.
Zeigt 3 pGEM9zf, enthaltend die Wildtyp-Campath-1H-Schwerkette, und die Substitution von Mutantenfragmenten in der schweren Kette.
Zeigt 4 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines einwertigen nicht-zellbindenden therapeutischen Antikörpers.
Verwendung rationalen Designs zur Erzeugung einer "Minimalmutante"
In einer Ausführungsform zur Herstellung einer nicht-zellbindenden Variante eines therapeutischen mAb werden Aminosäurereste, die in das Binden an das Targetantigen involviert sind, identifiziert. Bezogen auf die Anzahl an Resten, die die VL- und VH-Domänen umfassen, sind die, die direkt in Interaktionen mit dem Antigen involviert sind, eher wenige (Novotny et. al., 1983). Und obgleich die Ab-Bindungsstelle aus bis zu 6 hypervariablen Schleifen besteht, können 1 oder 2 dieser Schleifen in der Interaktion dominierend sein. Kann/können ein Schlüsselrest oder -reste identifiziert werden, kann/können dieser/diese durch ortsgerichtete Mutagenese in einen Rest, der die Antigenbindung reduzieren wird (reduzieren oder aufheben), umgewandelt werden. Da diese Reste am wahrscheinlichsten innerhalb der hypervariablen Schleifenstrukturen und nicht in der Struktursequenz, die diese Schleifen stützt, zu finden sein werden, werden kleine Veränderungen die Gesamtstruktur des Ab nicht signifikant auseinander brechen.
Modellaufbau von Ag-Bindungsstellen zur Definition von Schlüsselresten für die Mutagenese:
Da die konstanten Regionen und variablen Regionen von Ab-Molekülen sehr ähnliche Sequenzen und Strukturen aufweisen, sind unter Verwendung relativ weniger gelöster Kristallstrukturen allgemeine Prinzipien hinsichtlich der Ab-Struktur definiert worden. Heute befinden sich ungefähr 50 Strukturen von Ab-Fragmenten in der Brookhaven-Protein-Datenbank, und von diesen sind 20% auf eine Auflösung von 2,0 Angström oder besser verfeinert worden. Da die Strukturwissensbasis steigt, wird die vergleichende Ab-Modellierung (Modellierung durch Homologie) zuverlässiger, da die Auswahl an strukturellen Matrizes größer ist. Variable Regionen (VL und VH) unterschiedlicher Ab-Strukturen können als eine strukturelle Matrize kombiniert werden, nachdem ihre am stärksten konservierten Reste überlagert wurden. Darm werden Seitenkettenkonformationen überdeckter Reste modelliert. Die CDR-Schleifen werden durch die Identifikation strukturell ähnlicher Schleifenmatrizes (oftmals verfügen Schleifen mit derselben Länge und ähnlicher Sequenz über ähnliche Hauptkettenkonformationen) modelliert. Diese CDR-Sequenzen fallen oftmals in kanonische Schleifenmotive (ausschließlich H3 verfügen zwischen 50 und 95% Maus-VL (kappa) und -VH über Schleifensequenzen, die mit den klassischen kanonischen Motiven übereinstimmen). Die kanonischen Schleifenhauptketten können dann auf das Modell der Struktur gespleißt werden, und die CDR-Seitenkettenkonformationen können basierend auf den Konformationen der Reste, die an den entsprechenden Stellen in anderen Schleifen derselben kanonischen Struktur zu finden sind, modelliert werden. Schließlich wird das Modell oftmals unter Verwendung von Computerprogrammen, die störende stereochemische Hindernisse minimieren, verfeinert.
Die vergleichende Modellbildung wird mit steigender Größe der Strukturdatenbank mehr und mehr verwendet, wodurch mehr strukturelle Matrizes zur Verfügung stehen. Auch die höhere Anzahl verfügbarer Computerprogramme stellt sicher, daß die Modelle immer genauer werden. Beispielsweise kam die gelöste Kristallstruktur von Campath-1H sehr nahe an die Struktur, die durch Molekülmodellierung vorhergesagt wurde, heran. Aus den Modellierungsdaten konnten wir vorhersagen, daß die in den Beispielen beschriebenen Mutationen 1 und 2 wahrscheinlich eine schädigende Wirkung auf das Binden an CD52 haben werden. Die Kristallstruktur bestätigte diese Vorhersagen und sagte auch vorher, daß Mutation 3 die Bindung an CD52 unterbrechen würde.
Es ist klar, daß zur Erzeugung einer nicht-zellbindenden Version eines therapeutischen Ab wünschenswerterweise mit einer gelösten Kristallstruktur, bevorzugt co-kristallisiert mit Antigen, gestartet wird, so daß der/die Schlüsselkontaktrest(e) für einen Rest(e), der/die die Antigenbindung zerstört/zerstören, identifiziert und substituiert werden können. In vielen Fällen könnte jedoch ein gutes Molekülmodell die notwendigen Informationen liefern. Ist das Molekülmodell von schlechter Qualität (zum Beispiel, wenn in der Datenbank die geeigneten strukturellen Matrizes nicht exisiteren), werden CDR-Austauschexperimente (wie in den Beispielen beschrieben) Informationen darüber liefern, auf welche CDRs man sich für die Mutation konzentrieren muß. Alanin-Scanning-Mutagenese (die jeden Rest sequentiell zu Ala mutiert) durch diese Regionen kann den/die Schlüsselrest(e), involviert in die Antigenbindung, identifizieren (Cunningham and Wells, 1989). Wenn ein einzelner Rest an Ala geändert wird, was die Bindung verringert aber nicht zerstört, kann diese Position für drastischere Mutationen targetiert werden (zum Beispiel eine Substitution, die einen Ladungsunterschied erzeugt), um so nach Bedarf die Bindung weiter zu reduzieren.
Alternative Verfahren zum Erhalt nicht-zellbindender Versionen therapeutischer Antikörper umfassen Gentechniken wie Phagendisplay unter Verwendung fehlerauslösender PCR (Gram et. al., 1992) und Cycling von V-Regiongenen (z. B. als sFv-Konstrukte) durch einen bakteriellen Mutatorstamm (z. B. mutD5)(Low et. al., 1996). Solche Genverfahren können leistungsfähige Screeningsystemen liefern.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen weiter beschrieben. Obgleich das spezielle Beispiel für Campath-1H in diesem Dokument gegeben ist, ist die Erfindung nicht auf Antikörper, die auf Campath-1H basieren, beschränkt. Es wird ersichtlich, daß andere zellbindende therapeutische Antikörper, speziell die, die in wiederholten Dosen gegeben werden, unter Verwendung dieser Strategie verbreitet stärker akzeptiert werden.
BEISPIELE
A. Erzeugung einer "Minimalmutante"
Wir haben ein Verfahren erfunden, mit dem bestimmt werden kann, welche der CDR-Schleifen des humanisierten Campath-1-mAb die wichtigsten für das Binden an CD52 sind. Es wurden genetisch die Mutanten VL oder VH konstruiert, in denen jede der 6 hypervariablen Regionen (wie von Kabat et. al (1987) unter Verwendung von Aminosäuresequenzanordnungen der V-Regionen in den Proteindatenbanken definiert) individuell für die entsprechende CDR aus der V-Region, die während der Humanisierung die humane VL- oder VH-Akzeptorsequenz bereitstellte (REI bzw. NEW), ausgetauscht wurde. Die hergestellten V- Regionen wurden als Fab-Fragmente in E. coli unter Verwendung des pHEN-Vektors exprimiert (Hoogenboom et. al., 1991). In diesem System wurde die peIB-Leader-Sequenz zur direkten Proteinexpression an Periplasma verwendet, wo die Assoziation der L-Kette und der abgestumpften H-Kette stattfindet (Hoogenboom et. al., 1991). Bei der Untersuchung dieser Fab-Fragmente hinsichtlich der Bindung an das immobilisierte CD52 wurde herausgefunden, daß der Austausch von (VH) CDR2 von NEW durch das humanisierte Campath-1-Fab die Bindung an CD52 vollständig zerstörte. Das Auswechseln von (VH) CDR3 reduzierte die Bindung an CD52 um das 8-fache, während das Auswechseln von (VH) CDR1 und (VL) CDR3 die Bindung um das 3-fache reduzierte. Keine Veränderung der Bindung wurde detektiert, wenn (VL) CDR1 oder (VL) CDR2 ausgewechselt wurden. Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß (VH) CDR2 einen oder mehrere Schlüsselrest(e), die für die Antigenbindung notwendig sind, enthielt. DNA, die die "Wildtyp"-H-Kette von humanisiertem Campath-1 kodiert (Reichmann et. al., 1988) wurde als PCR-Matrize für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Diese Schwerkettensequenz kodiert humanes Protein an allen Positionen, außer den drei VH-CDR-Regionen und den Positionen 27 und 30 der ersten Strukturregion. Wir konzentrierten uns auf die H2-Schleife in VH CDR2 zur Erzeugung von Mutationen, die die Bindung des Ab an CD52 aufheben würden. H2 ist die tatsächliche Schleifenstruktur (Chothia und Lesk, 1987), die in dem VH CDR2 aus 19 Aminosäuren, das gemäß der Definition von Kabat als "hypervariabel" bezeichnet wird (Kabat et. al., 1987), zu finden ist (siehe 1). Bekannt ist, daß wenige Schlüsselreste in den Schleifen- und/oder Strukturregionen relativ wenige CDR-Schleifenkonformationen bestimmten und kanonische Schleifenmotive für einen Großteil der CDR, einschließlich VHCDR2 identifiziert worden sind (Chothia und Lesk, 1987). Da die Schleifenstrukturen aus der β-Barrelstruktur der V-Region zur Herstellung von Kontakt mit Antigen herausragen, hätten die Mutationen in der Schleife die größte Chance zur Zerstörung der Antigenbindung, während die Ab-Struktur konserviert wird. Im allgemeinen begrenzten wir die Veränderung der H2-Schleife außer der H-Ketten-mut6, die eine zusätzliche Mutation in dem Rest unmittelbar vor H2 enthielt, wie nachstehend ausführlich erörtert.
Zusammenfassung der Minimalmutantenkonstrukte der Campath-1H-Schwerkette (1)

Mutation 1 ist ein einzelner Ladungsunterschied an Rest 52b von Lys zu Asp. Aus der Molekülmodellierung des Campath-1H-Ab wurde vorhergesagt und von der Kristallstruktur gestützt, daß die Seitenkette dieses Restes aus der Ag-Bindungstasche in Richtung des Antigens herausragt. Da davon ausgegangen wurde, daß die positive Ladung von Lys mit den negativ geladenen Phosphatgruppen des GPI-Ankers von CD52 interagiert, kann es sein, daß diese einzelne Mutation die Antigenbindung zerstören wird.
Mutation 2 ist ein einzelner Ladungsunterschied an Rest 52a von Asp zu Lys. Aus der Molekülmodellierung des Campath-1H-Ab wurde vorhergesagt, daß diese Veränderung die Antigenbindung beeinträchtigen könnte.
Mutation 3 ist ein einzelner Ladungsunterschied an Rest 53 von Lys zu Asp. Aus der Kristallstruktur des Campath-1H-Ab wird deutlich, daß ein Großteil dieser Restseitenkette lösungsmittelzugänglich ist und daher in die Interaktion mit den negativ geladenen Phosphatgruppen des GPI-Ankers von CD52 involviert sein kann, wie bei Mutation 1.
Mutation 4 ist eine Doppelmutation, die die jeweiligen Substitutionen der Mutanten 1 und 3 (Lys52b und Lys53 zu Asp) umfaßt.
Mutation 5 ist eine Dreifachmutation, die die jeweiligen Substitutionen der Mutanten 1, 2 und 3 (drei Ladungsunterschiede: Asp52a zu Lys; Lys52b und Lys53 zu Asp) umfaßt.
Mutation 6 ist eine Dreifachmutation, die die jeweiligen Substitutionen der Mutanten 1 und 2 (zwei Ladungsunterschiede Asp52a zu Lys; Lys52b zu Asp) und eine weitere Mutation von Arg52 zu Ala umfaßt. Es ist gezeigt worden, daß Rest 52 zwischen drei unterschiedlichen Campath-1-Abs mit hoher, geringer und mittlerer Affinität unterscheidet und daher direkt in die Affinitätsmaturierung involviert sein kann. Dies wiederum läßt auf eine Rolle bei der Antigenbindung schließen.

Für jede dieser Schwerkettenmutationen wurde(n) die Veränderung(en) auf Oligonucleotidprimern 1B und 2A (2) kodiert. PCR wurde unter Verwendung eines 5'-Primers, der an die Leader-Sequenz bindet und eine Upstream-HindIII-Stelle (Primer 1A) enthält, und des Primers 1B zur Erzeugung eines 200-bp-Fragments an "Wildtyp"-Campath-1-Schwerketten-DNA durchgeführt. Dem ähnlich wurde unter Verwendung von Primer 2B (der an CH1 bindet und eine BstXI-Stelle enthält, gefolgt von einer EcoRI-Stelle) und Primer 2A ein 440-bp-Fragment erzeugt. Diese Fragmente wurden gelgereinigt und dann in einer einzelnen PCR-Reaktion vereinigt. Primer 1A und Primer 2B wurden nach dem ersten Kreislauf zugegeben (wodurch 2 Stücke überlappender DNA vor der Amplifikation binden konnten). Nach der PCR wurden die Fragmente gelgereingit und mit HindIII und EcoRI aufgeschlossen und zur Verifizierung von Sequenz in Zwischensequenzierungsvektoren (PUCK 9 oder pGEM3zf) transferiert. Durch eine einmal vorhandene PstI-Stelle in der Campath-1H-VH und eine einmal vorhandene BstXI-Stelle in der CH1-Region konnten die Mutanten-V-Regionen (und ein Teil der CH1-Sequenz) als PstI-BstXI-Fragmente isoliert werden, so daß die Mutation(en) in sechs verschiedenen DNA-Kassetten, flankiert von PstI- und BstXI-Stellen, kodiert werden konnte(n). Zur Erzeugung der Mutanten-Campath-1H-Schwerketten wurde das ursprüngliche Schwerkettenkonstrukt (in dem Zwischenvektor pGEM9zf) mit PstI und BstXI geschnitten und das Fragment wurde entfernt. Die verbleibende DNA (die die Campath-1H-Schwerketten-Leader-Sequenz und die V-Region stromaufwärts der PstI-Stelle plus die CH1-Region stromabwärts der BstXI-Stelle, gefolgt vom Gelenk (hinge), CH2, CH3 in pGEM9zf kodiert) wurde gelgereinigt (3). Dann wurden Ligierungen eingestellt, in denen jede der DNA-Kassetten, die die oben beschriebenen Mutation(en) enthielt, mit der gelgereinigten pGEM9zf/PstI-BstXI geschnittenen Campath-1H-Schwerketten-DNA verbunden war. Diese sechs mutagenisiert Campath-1H-Schwerketten wurden dann durch Digerieren mit HindIII und Gelreinigung isoliert, gefolgt von der Ligierung in den HindIII geschnittenen Säugerexpressionsvektor pBAN-2. Dieser Vektor wird aus dem pNH316-Vektor, der einen Neomycinselektierbaren Marker enthält, unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors und der starken Human-β-Actin-Promotor/Polyadenylierungssignale zur Expression des gewünschten Genproduktes abgeleitet (Page and Sydenham, 1991). Als diese Fragmente in eine einzelne HindIII-Restriktionsstelle eingeführt worden waren, wurde die Ausrichtung jedes Fragments durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Campath-1H-Leichtkettenkonstrukt zur Co-Transfektion:
DNA, die die humanisierte "Wildtqyp"-Campath-1H-Leichtkette kodiert (humane Sequenz an allen Resten, außer den drei CDRs in der V-Region) wurde aus einem Zwischenvektor als ein HindIII-bis-EcoRI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde gelgereinigt und dann in den HindIII-EcoRI geschnittenen. Säugerexpressionsvektor pRDN-1 ligiert. Dieser Vektor wurde aus dem pLD9-Vektor abgeleitet, der einen "außer Funktion gesetzten" Dihydrofolatreduktase-(dhfr-)-selektierbaren Marker (das Enhancer-Element des SV40-Promotors ist entfernt worden, damit sich die Genexpressionsstärken in Gegenwart von Methotrexat erhöhen konn ten) und die starken Human-β-Actin-Promotor/Polyadenylierungssignale zur Expression des gewünschten Genproduktes (Page und Sydenham, 1991) enthält.
Co-Transfektion von Campath-1H-Leichtketten-DNA und Mutanten-Schwerketten-DNA:
Das Expressionssystem, das zur Erzeugung hoher Konzentrationen an humanisiertem Campath-1H-Ab in der Vergangenheit verwendet wurde, ist das verbreitet verwendete Säugerexpressionssystem mit Genamplifikation unter Verwendung von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), denen es an Dihydrofolatreduktase (dhfr) mangelt, und die Verwendung starker β-Actin-Promotoren zur Selektion und Amplifikation der gewünschten Genprodukte (Page und Sydenham, 1991).
Die folgenden Transfektionen (TF) wurden durchgeführt:

TF1: Pseudo ("leer” pRDN-1 plus "leer" pBAN-2)
TF2: nur Leichtkette (Leichtkette/pRDN-1 plus "leer" pBAN-2)
TF3: Leichtkette/pRDN-1 plus H-Kettenmutante 1/pBAN-2
TF4: Leichtkette/pRDN-1 plus H-Kettenmutante 2/pBAN-2
TF5: Leichtkette/pRDN-1 plus H-Kettenmutante 3/pBAN-2
TF6: LeichtkettelpRDN-1 plus H-Kettenmutante 4/pBAN-2
TF7: Leichtkette/pRDN-1 plus H H-Kettenmutante 5/pBAN-2
TF8: Leichtkette/pRDN-1 plus H-Kettenmutante 6/pBAN-2
TF9: Leichtkette/pRDN-1 plus H-Ketten-"Wildtyp"/pBAN-2

DNA (20 μg Leichtkette/pRDN-1 plus 20 μg Schwerkette/pBAN-2) wurde in einer sterilen Eppendorf-Pipette gemischt, ethanolgefällt und es wurde zweimal mit 70%igem Ethanol gespült. Die DNA-Pellets wurden in steriler Tris-EDTA resuspendiert.
Für jede Transfektion wurde die DNA mit 60 μl 20 mM HEPES (pH 7,4) in einem 5-ml-Polystyrolröhrchen verdünnt. In einem anderen Röhrchen wurden 120 μl DOTAP liposomales Transfektionsreagens (Boehringer Mannheim) mit 80 μl 20 mM HEPES (pH 7,4) verdünnt. Dann wurde das DNA/HEPES dem verdünnten DOTAP zugegeben, vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur 15 min stehengelassen. Das Kulturmedium (IMDM + 5% FKS + HT) wurde aus einem T75-Kolben angesaugt, der dhfr-defiziente CHO-Zellen enthielt, die bei ungefähr 50%iger Konfluenz wuchsen. Das DNA/DOTAP wurde dann zusam men mit 10 ml frischem Kulturmedium in den Kolben gegeben. Der Kolben wurde 24 h bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Das DNA/DOTAP wurde dann aus dem Kolben angesaugt und den Zellen 15 ml frisches Kulturmedium zugegeben. Nach weiteren 24 h wurde die Selektion durch die Entfernung des Kulturmediums und Zugabe des Selektionsmediums (IMDM + 5% dialysiertes FKS + 1 mg/ml G418) initiiert. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert, und wenn notwendig wurde frisches Selektionsmedium zugegeben. Die Kulturüberstände wurden dann durch ELISA auf die Gegenwart von Antikörper wie nachstehend beschrieben, getestet.
Detektion von sekretiertem Ab in Transfektionsüberständen durch ELISA:
Mikrotiterplatten wurden mit 50 μl/Loch Antihuman-Ig-Fc (Sigma, Katalognummer 1-2136) in PBS mit 2,5 μg/ml über Nacht bei 4°C beschichtet. Der Beschichtungs-Ab wurde entfernt und die Platten durch die Zugabe von 100 μl/Loch Blockierungspuffer (PBS + 1% BSA + 5% FKS + 1% wärme-inaktiviertem, normalem Kaninchenserum (NRS)) über Nacht bei 4°C blockiert. Die Transfektionsüberstände wurden für mindestens 1 h bei Raumtemperatur zugegeben (50 μl/Loch). Die Löcher wurden mit PBS/0,5% Tween-20 (PBS/Tween) gewaschen. Biotinyliertes Schaf-Antihuman-Ig (Amersham, Katalognummer RPN 1003), verdünnt 1/5000 in Blockierungspuffer, oder biotinylierte Ziegen-Antihuman-kappa-Leichtkette (Sigma, Katalognummer B-1393), verdünnt 1/1000 in Blockierungspuffer, wurden für 1 h bei Raumtemperatur zugegeben (50 μl/Loch). Die Löcher wurden mit PBS/Tween gewaschen und 50 μl/Loch ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma, Katalognummer E-2886) wurden für 30 min bei Raumtemperatur zugegeben. Die Löcher wurden noch einmal gewaschen und 100 μl/Loch des Substrats o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma, Katalognummer P-7288) wurden zugegeben. Eine Farbveränderung wurde bei 492 nm unter Verwendung eines Multiskan Plus-Mikrotiterplatten-Lesegerätes gemessen.
Detektion der Bindung an Campath-1-Antigen durch ELISA:
Mikrotiterplatten wurden mit 50 μl/Loch Anti-Maus-Ig-Fc (Sigma, Katalognummer M-4280) in PBS mit 2,5 μg/ml über Nacht bei 4°C beschichtet. Der Beschichtungs-Ab wurde entfernt und die Platten durch die Zugabe von 100 μl/Loch Blockierungspuffer (PBS + 1% BSA + 5% FKS + 1% wärme-inaktiviertem NRS) über Nacht bei 4°C blockiert. Das gereinigte rekombinante Campath-1-Ag-Fusionsprotein (eine Sequenz, die die CD52-Peptidhauptkette kodiert, fusioniert an eine Sequenz, die Maus-CH2- und -CH3-Domänen kodiert, und gerei nigt auf einer Protein-A-Säule) wurden dann mit 4 μg/ml in jedes Loch (50 μl/Loch) in PBS über Nacht bei 4°C gegeben. Die Löcher wurden dann mit PBS/Tween gewaschen, und die Transfektionsüberstände wurden für mindestens 1 h bei Raumtemperatur zugegeben (50 μl/Loch). Die Löcher wurden mit PBS/Tween gewaschen und biotinyliertes Schaf-Antihuman-Ig (Amersham, Katalognummer RPN 1003), verdünnt 1/5000 in Blockierungspuffer, wurde für 1 h bei Raumtemperatur zugegeben (50 μl/Loch). Die Löcher wurden mit PBS/Tween gewaschen und 50 μl/Loch ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma, Katalognummer E-2886) wurden für 30 min bei Raumtemperatur zugegeben. Die Löcher wurden noch einmal gewaschen und 100 μl/Loch des Substrats o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma, Katalognummer P-7288) wurden zugegeben. Eine Farbveränderung wurde bei 492 nm gemessen.
Bewertung nicht-bindender Mutanten durch ELISA:
In ELISA-Assays bindet gereinigter "Wildtyp"-Campath-1H-Ab stark ein rekombinantes Campath-1-Ag-Fusionsprotein. Für einen Vergleich zur Bewertung nicht-zellbindender Antikörper kann die Konzentration des Wildtyp-Ab heruntertitriert werden, bis die Bindung genau detektierbar ist. Dies kann als "1-Ab-Bindungseinheit" bezeichnet werden. Eine geeignete nicht-bindende Mutante des Wildtyps wird bei einem Vielfachen dieser Konzentration, z. B. dem 100-fachen oder 1.000-fachen oder bevorzugt dem 10.000-fachen dieser Konzentration an Wildtyp-Campath-1H-Ab keine detektierbare Bindung zeigen.
Bewertung nicht-bindender Mutanten in vivo:
Es wird ein alternatives Verfahren, daß zur Bewertung des Nichtbindungspotentials angewendet werden kann, beschrieben. Da wir wissen, daß der Wildtyp-Campath-1H-Ab eine starke Antiimmunoglobulinantwort in transgenen Mäusen, die humanes CD52 exprimieren, auslöst (siehe nächster Abschnitt für Details über diese Mäuse), können gereinigte, deaggregierte Präparate der Mutanten in vivo zur Bewertung, ob sie immunogen sind, verwendet werden. Kann eine Antiglobulinantwort bei Dosen zwischen 1 μm und 1 mg deaggregierter Mutante pro Maus nicht detektiert werden, ist dies ein gutes Anzeichen dafür, daß die Mutante CD52 nicht binden kann.
B. In-vivo-Modelle für Toleranzinduktion:
Zum Testen der Fähigkeit der Minimalmutanten von Campath-1H gegen den Wildtyp-Campath-1H-Ab in vivo zu tolerisieren werden transgene Mäuse verwendet. Beispielsweise können transgene Mäuse, die humanes CD52 hinter einem Maus-CD2-Promotor zur Simulation der Expression von CD52 auf T-Zellen exprimieren, verwendet werden.
Zur Erzeugung solcher Mäuse kann ein genomisches 2,8-kb-Fragment, enthaltend die 2 Exons des humanen CD52-Gens, sowie eine 4,5-kb-Upstream- und 3'-flankierende Sequenz des humanen CD2-Gens in das Genom transgener Mäuse eingeführt werden. Es wird angenommen, daß 3' an dem humanen CD2-Gen starke Kontrollregionen vorliegen, die die hohen Konzentrationen und eine gewebespezifische Expression des Gens bestimmen (Greaves et. al., 1989). Durch dieses Verfahren wurden vier CD52/CBA-Stämme etabliert, die das Transgen übertrugen. Tatsächlich wurde durch die Analyse der Färbung des peripheren Blutes ihrer Nachkommen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und 2-Farb-Färbung gezeigt, daß die Zellen, die Maus-CD3 exprimieren (T-Zellen) auch humanes CD52 exprimierten. Diese Mäuse wurden zur Homozygotie gezüchtet, und mehr als 95% ihrer T-Zellen exprimieren hohe Konzentrationen an humanem CD52 auf der Zelloberfläche.
Die Mäuse produzieren eine ausgeprägte Antiglobulinantwort (Titer von 1/1000 oder größer) gegen Wildtyp-Campath-1H bei Dosen von 1 bis 10 mg/Maus. Diese Antiglobulinantwort umfaßt eine Anti-Id-Komponente, wenn die CDR-Schleifen eine Rattensequenz sind. Die Wirksamkeit der Minimalmutanten gegen die folgende Provokation des Wildtyp-Campath-1H-Ab zu tolerisieren, kann folgendermaßen bewertet werden:

1. Intravenöse Verabreichung einer Einzeldosis (0,5 bis 1 mg/Maus, Tag 0) von jeder nicht-zellbindenden Mutante oder des irrelevanten Kontroll-Ab (deaggregiert durch Ultrazentrifugation), gefolgt von der Provokation mit 1 bis 10 mg Wildtyp-Campath-1H-Ab bei 4 bis 6 Wochen. Schwanzblutungen 10 Tage nach der Provokation wurden durch ELISA auf Campath-1H-Anti-Id-Spezifität getestet.
2. Intravenöse Verabreichung mehrer Dosen (0,5 bis 1 mg/Maus) der deaggregierten nicht-zellbindenden Mutante oder des Kontroll-Ab über 2 Monate vor der Provokation mit 1 bis 10 mg Wildtyp-Campath-1H-Ab. Schwanzblutungen 10 Tage nach der Provokation wurden durch ELISA auf Campath-1H-Anti-Id-Spezifität getestet. In beiden Fällen ist der irrelevante Kontroll-Ab ein Isotyp-angepaßter, nicht-zellbindender Ab in Mäusen wie Campath-9, der ein humanisierter Anti-CD4-Ab ist (Gorman et. al., 1991).

C. Wie die Strategie an die Humantherapie angepaßt werden kann:
Eine gewisse Menge (z. B. 500 mg) der nicht-zellbindenden Form des therapeutischen Antikörpers würde einem Patienten, der die Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper erwartet, verabreicht. Bevorzugt ist der verabreichte nicht-zellbindende Antikörper frisch deaggregiert (zum Beispiel mittels Passage durch einen feinen Filter). Später (zum Beispiel 7 Tage) würde die Wildtypform des therapeutischen Antikörpers verabreicht, wobei während dieser Zeit die T-Zellen und B-Zellen tolerisiert werden würden.
1:). Weitere Betrachtungen:

1. Es sollte leichter sein, gegen eine Minimalmutante als gegen HGG oder Mischketten-Ab-Moleküle zu tolerisieren.

In den Toleranzmodellen von Benjamin et. al. (1986) wurde die Toleranz gegen polyklonales HGG in Mäusen nach der Depletion von CD4+T-Zellen, aber auch unter Verwendung von deaggregiertem Material induziert. Es wurde herausgefunden, daß Toleranz gegen diese löslichen Proteine relativ leicht erreicht werden kann. Auch in der Arbeit von Isaacs und Waldmann (1994) wurde den nicht-zellbindenden Mischketten-Ab-Molekülen (irrelevante und antigenspezifische H- und L-Ketten) während der Toleranzinduktion CD4-Ab gegeben, oder nicht-zellbindende Formen als Tolerogene selbst nach ihrer Deaggregation verwendet.
In unserem modifizierten Ansatz zum Auslösen von Toleranz unter Verwendung einer Minimalmutante wird die Fremdheit des Proteins geringer als die von polyklonalem HGG oder der Mischketten-Ab-Moleküle in Mäusen sein. In Fällen, wo der therapeutische mAb humanisiert ist, bestehen nur die CDR-Schleifen (und in einigen Fällen einige Strukturpositionen) aus Nagersequenz. Daher ist es möglich mit einer deaggregierten Minimalmutante in Abwesenheit eines CD4-mAb zu tolerisieren. Aber auch wenn die CD4-Verabreichung erforderlich war, war ein humanisierter, therapeutischer CD4 verfügbar (CAMPATH-9; Gorman et. al., 1991). Die Studien an transgenen Tieren sollten auf diese Details gerichtet sein.

2. Erzeugung einer einwertigen Form der Minimalmutante (4). Diese Option liegt außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und ist nur zur Veranschaulichung enthalten.

Bisher betrachteten wir die Toleranzinduktion unter Verwendung einer Minimalmutante, die im wesentlichen dem therapeutischen Wildtyp ähnelt, außer minimale Restveränderungen, die die Antigenbindung unterbrechen werden. Zudem schlagen wir eine einwertige Form vor, die auch signifikant kleiner ist als die Minimalmutante.
In einer Ausführungsform ist die einwertige Form ein Einketten-Fv [gebildet durch VL, einen kurzen Peptidlinker (wie denen in Huston et. al., 1991) und der mutierten VH], das genetisch mit der Sequenz fusioniert ist, die das Gelenk-CH2-CH3 von Human-IgG1 kodiert. Dieses Konstrukt wird in Verbindung mit einer abgestumpften schweren Kette (nur Gelenk-CH2-CH3; Routledge et. al., 1991) exprimiert, so daß ein Protein exprimiert wird, das im wesentlichen aus einer einzelnen Ab-Bindungsstelle und einer funktionalen IgFc-Domäne besteht. Es wird davon ausgegangen, daß die Immunogenität der verschiedenen Peptidlinker in Anbetracht ihrer kleinen Größe (im allgemeinen 14 bis 18 Reste lang) und Abundanz kleiner Reste (z. B. Gly und Ser), die die Linker bilden, vernachlässigbar ist. Eine beliebte Wahl ist der 15-Reste-Linker (Gly4Ser)₃, in dem die Serinreste der Peptidhauptkette extra Hydrophilie verleihen (um so deren Einschiebung zwischen die variablen Domänen während des Faltens zu inhibieren) und der andererseits frei von Seitenketten ist, die das Domänenfalten verkomplizieren könnten (Huston et. al., 1988).
SFv sind in Sängerzellen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Antikörper exprimiert worden und es ist gezeigt worden, daß sie sich durch funktionale Aktivität in die korrekte Konformation für die Antigenbindung falten (Gilliland et. al., 1996). Der Fc-Teil ist eine bevorzugte Besonderheit, der eine Serumhalbwertszeit sicherstellen soll, die mit der der Minimalmutante und des therapeutischen Wildtyp-Ab vergleichbar ist, während Einwertigkeit sicherstellt, daß die Bindung an CD52 aufgrund der sinkenden Avidität stark reduziert wird. Wir haben bereits in den CDR-Austauschexperimenten (Abschnitt A1) gezeigt, daß der Campath-1-Ab in einwertiger Form schlecht an CD52 bindet. Neben der Verringerung der Avidität des Moleküls kann die kleinere Größe ein Vorteil sein: in klassischen Toleranzexperimenten wurde herausgefunden, daß, je kleiner das Molekül, um so besser löste es Toleranz aus (Parish und Ada, 1969; Anderson, 1969; Miranda et. al., 1973). Durch die Kombination von Einwertigkeit mit einer nicht-zellbindenden Mutante kann ein überaus wirksames Tolerogen erhalten werden.
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Claims

Verwendung eines Antikörpers, bei dem es sich um eine modifizierte Version eines therapeutischen Antikörpers handelt, wobei der therapeutische Antikörper eine Affinität für ein Oberflächenantigen und der Antikörper im Vergleich zu dem therapeutischen Antikörper aufgrund einer oder mehrerer Modifizierungen am Antikörpermolekül eine reduzierte Affinität für das Antigen aufweist, wobei (a) zwischen den konstanten Domänen des Antikörpers und den konstanten Domänen des therapeutischen Antikörpers eine Sequenzidentität von > 90% besteht, (b) die Modifikation eine Veränderung an mindestens einer der Antikörperbindungsstellen (CDR = Complementarity Determining Region) umfasst und (c) der Antikörper mindestens ein Epitop umfasst, das ebenfalls in dem therapeutischen Antikörper vorliegt und in dem vorgesehenen Patienten eine Immunantwort auslöst, für die Herstellung eines Medikaments, das eine Immuntoleranz für den therapeutischen Antikörper auslöst.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der zwischen den Strukturregionen der variablen Domänen des Antikörpers und den Strukturregionen des therapeutischen Antikörpers eine Aminosäuresequenzidentität von > 90% besteht.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der die Strukturregionen der variablen Domänen des Antikörpers die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen wie die Strukturregionen des therapeutischen Antikörpers.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Veränderung durch genetische Manipulation einer Nukleinsäurecodierung für die CDR erreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Affinität für Antigen auf maximal 50% der Affinität des therapeutischen Antikörpers reduziert ist.
Verwendung nach Anspruch 1 bis 5, wobei es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der therapeutische Antikörper eine Affinität für CD52 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem therapeutischen Antikörper um einen humanisierten Campath-1-Antikörper handelt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Modifizierung eine Veränderung an (VH) CDR2 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Modifizierung eine einfache oder doppelte Aminosäuresubstitution in (VH) CDR2 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die konstanten Domänen des Antikörpers die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen wie die konstanten Domänen des therapeutischen Antikörpers.