DE69425809T2 - Methoden zur Herstellung von Protein C - Google Patents
Methoden zur Herstellung von Protein CInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft Molekularbiologie, insbesondere Verfahren zur Herstellung von großen Mengen an funktionellem rekombinantem Protein C in Säugerzellinien.
- Viele Proteine unterliegen während der Reifung einer ausgiebigen posttranslationalen Modifikation. Humanes Protein C (HPC) wird entweder während oder bald nach der Translation des primären RNA Transkripts ycarboxyliert, β-hydroxyliert und glycosyliert. Viele Zellinien, wie die syrische AV12 Hamsterzellinie sind nicht zur effizienten Ausführung dieser posttranslationalen Modifikationen fähig und daher sind die in diesen Zellinien gebildeten Protein-C-Moleküle nicht voll funktionsfällig. Andere Zellinien, wie die humane 293 Nierenzellinie bilden voll funktionsfähige Protein-C-Moleküle, aber die Expressionsmengen der Protein-C-Moleküle in diesen Zellinien sind etwas niedrig. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung der Produktionsmenge an voll funktionsfähigem Protein C in den Zellinien, die normalerweise keine voll funktionsfähigen Moleküle bilden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Erhöhung der Menge der Gesamtproduktion an Protein-C-Molekülen in den Zellinien, die normalerweise voll funktionsfähige Moleküle bilden. Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen die Kultivierung der Protein-C-bildenden Zellinien bei Temperaturen, die höher liegen, als die herkömmliche Inkubationstemperatur von 37ºC.
- Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke wie unten definiert.
- Adenovirus-transformierte Zellinie - eine Zellinie, die das E1A Genprodukt eines Adenovirus exprimiert.
- Humanes Protein C - Humanes Protein C Zymogen und aktiviertes humanes Protein C.
- Entstehendes Protein - das bei der Translation eines mRNA Transkripts gebildete Polypeptid vor allen posttranslationalen Modifikationen. Jedoch können posttranslationale Modifikationen, wie γ-Carboxylierung der Glutaminsäurereste und Hydroxylierung von Asparaginsäureresten, auftreten, bevor ein Protein vollkommen von einem mRNA Transkript übersetzt ist.
- Protein-C-Aktivität - jede Eigenschaft von humanem Protein C, die für die proteolytischen, amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnungshemmenden oder profibrinolytischen) Aktivitäten verantwortlich ist. Verfahren zum Test auf gerinnungshemmende Aktivität eines Proteins sind in der Technik gut bekannt, nämlich beispielsweise in Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192.
- Zymogen - ein enzymatisch inaktiver Vorläufer eines proteolytischen Enzyms. Protein-C-Zymogen, wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf sekretierte, inaktive Formen, sowohl einkettig als auch zweikettig, von Protein C.
- Alle Aminosäureabkürzungen, die in dieser Beschreibung verwendet werden, sind die vom Amerikanischen Patent- und Markenamt anerkannten, wie sie in 37 C. F. R. § 1.822 (b) (2) (1990) angegeben sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Bildung von Protein C in einer Adenovirus-transformierten rekombinanten Säugerwirtszelle. Das Verfahren umfaßt die Kultivierung einer Adenovirus- transformierten rekombinanten Säugerwirtszelle bei einer Temperatur zwischen 38ºC und 39ºC. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erhöhung der Bildung von funktionellem Protein C in einer Adenovirus- transformierten rekombinanten Säugerwirtszelle, das gekennzeichnet ist durch die Kultivierung der Wirtszelle bei einer Temperatur zwischen 38ºC und 39ºC.
- Es wurden viele Zellinien zur Herstellung von rekombinantem humanem Protein C verwendet. Da jedoch das humane Protein-C-Molekül einer ausgiebigen posttranslationalen Modifikation unterliegt, produzieren die meisten herkömmlichen Zellinien entweder kein voll funktionsfähiges Protein C, oder falls von einer Zellinie ein voll funktionsfähiges Protein C gebildet wird, bleiben die Expressions- oder Sekretionsmengen relativ niedrig. Beispielsweise kann die syrische AV12 Hamsterzellinle im allgemeinen keine Protein C-Moleküle bilden, die alle neun γ-Carboxyglutaminsäurereste enthalten, die für die volle Aktivität erforderlich sind. Andererseits sind Protein-C- Moleküle, die in humanen embryonalen 293 Nierenzellinien gebildet werden, im allgemeinen vollkommen γ-carboxyliert und β-hydroxyliert, wobei die Produktionsmengen an humanem Protein C in diesen Zellinien relativ niedrig sind.
- Normalerweise werden Säugerzellkulturen bei 37ºC inkubiert. Wenn die Adenovirus-transformierte AV12- 664 Zellinie vom syrischen Hamster (ATCC CRL 9595), die ein Plasmid enthält, das für das humane Protein C Gen kodiert, bei 37ºC inkubiert wird, bildet die Zellinie Protein C, das nur zu 40% bis 50% voll γ-carboxyliert ist, was zu einer geringen Funktionalität des Protein C im rohen Kulturmedium führt. Wenn dieselbe Zellinie bei 38,5ºC bis 39ºC inkubiert wird, wird die funktionelle gerinnungshemmende Aktivität des sekretierten Proteins im konditionierten Kulturmedium erhöht. Die Sekretionsrate des Proteins C aus dieser bei der erhöhten Temperatur inkubierten Zellinie ist etwa 20% bis 30% geringer als die Sekretionsrate bei 37ºC, obwohl diese Abnahme der Sekretionsrate durch die Erhöhung der Funktionalität des sekretierten Protein C ausgeglichen wird.
- Humane 293 Nierenzellen (ATCC CRL 1573) sind transformierte primäre emryonale humane Nierenzellen, die das transformierende Gen des Adenovirus 5 enthalten und exprimieren. Diese Zellen wurden zur Expression von mehreren wichtigen Genprodukten verwendet und wurden von mehreren Laboratorien sowohl der Wissenschaft als auch der Industrie verwendet. Beispielsweise beschrieben Yan, US 4 981 952 A und Bang et al., US 4 992 373 A beide die Verwendung der 293-Zellinie zur Herstellung von humanem Protein C. Die humane embryonale 293 Nierenzellinie sekretiert vollkommen γ-carboxyliertes humanes Protein C, wenn sie ein Expressionsplasmid enthält, das für das humane Protein C Gen kodiert. Wenn sie bei 37ºC inkubiert wird, sekretiert diese 293-Zellinie rekombinantes humanes Protein C mit einer spezifischen Aktivität von etwa 350 E/mg. Die Erhöhung der Wachstumstemperatur dieser rekombinanten 293 Zellen führt zu keiner Erhöhung der Funktionalität des sekretierten Protein C (da das Protein C von dieser Zellinie bereits vollkommen γ-carboxyliert ist). Jedoch zeigen die bei 38ºC bis 39ºC angezogenen rekombinanten 293-Zellen eine Erhöhung der Sekretionsrate von Protein C im Vergleich zu denselben Zellen, die bei 37ºC angezogen wurden. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung kann eine Erhöhung der Protein-C- Produktion entweder eine Erhöhung der gesamten Protein-C-Sekretion der Zellinie oder eine Erhöhung der Funktionalität des sekretierten Protein C bedeuten.
- Der Fachmann versteht, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung der Adenovirus- transformierten humanen embryonalen Nierenzellinie oder der Adenovirus-transformierten AV12-664 Zellinie des syrischen Hamsters beschränkt ist. Es sind mehrere Säugerzelllinien für die Herstellung von humanem Protein C verfügbar. Beispielsweise ist die HepG2 Zellinie eine humane Leberzellinie, die zur Bildung von humanem Protein C verwendet wurde. Die BHK (Baby Hamster Kidney) Zellinie, die SA7 Zellinie, die SV20 Zellinie, die FAZA Zellinie und die MK2 Zellinie wurden ebenfalls alle zur Bildung von humanem Protein C verwendet. Obwohl nicht alle in dem vorangehenden Satz aufgeführten Zellinien Adenovirus-transformierte Zellinien sind, erkennt der Fachmann, daß viele Säugerzellinien mit dem Adenovirus transformiert werden können, um eine spezifische Adenovirus-transformierte Zellinie zu erzeugen, die dann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.
- Bevorzugte Temperaturen für das erfindungsgemäße Verfahren reichen von 38ºC bis 39ºC, während die am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gefunden wird, wenn die Inkubationstemperatur der Adenovirus-transformierten Zellinie 39ºC beträgt.
- Der Fachmann erkennt auch, daß das erfindungsgemäße Verfahren es einem erlaubt, leichter die Klone auszuwählen, die hohe Mengen an Protein C exprimieren. Beispielsweise ist es einfacher, da die Menge an aus einer Zellinie sekretiertem Protein C erhöht ist, auf das Molekül im rohen Medium zu testen, und daher ist es einfacher den Klon auszuwählen, der die größte Menge des gewünschten Produkts exprimiert. Die durchschnittliche Zunahme der Expressionsmengen für Klone, die bei 39ºC isoliert wurden, reicht von etwa 69% bis 93% im Vergleich zu Klonen, die bei 37ºC isoliert wurden.
- Die folgenden Beispiele werden als Mittel zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt und sollen nicht als Beschränkung hiervon aufgefaßt werden.
- Rekombinantes humanes Protein C (rHPC) wird in humanen 293 Nierenzellen durch Techniken hergestellt, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie die, die in Yan, US 4 981 952 A beschrieben sind, wobei die gesamte Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Das für humanes Protein C kodierende Gen ist in Bang et al. US 4 775 624 A beschrieben und beansprucht, wobei die gesamte Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Das zur Expression von humanem Protein C in 293-Zellen verwendete Plasmid ist das Plasmid pLPC, das in Bang et al. US 4 992 373 A beschrieben ist, wobei die gesamte Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Die Konstruktion von Plasmid pLPC ist auch in der EP 0 445 939 A und Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192 beschrieben, deren Beschreibungen hiermit eingeführt sind. Kurz gesagt wird das Plasmid pLPC in 293 Zellen transfiziert, dann werden stabile Transformanden identifiziert und subkultiviert. Die Klone, die das höchste Maß an Expression zeigen, erhalten verschiedene Bezeichnungen (beispielsweise CC35 und CC31-1) und werden unter Standardzellkulturbedingungen angezogen. Alternativ dazu wird das Plasmid pGTC zur Erzeugung der stabil transformierten Zellinie GT-21 verwendet. Die Konstruktion von Plasmid pGTC ist in EP 0 445 939 A beschrieben. Nach dem Wachstum bei 37ºC kann das humane Protein C durch die Techniken von Yan, US 4 981 952 A aus der Kulturflüssigkeit isoliert werden. Das so hergestellte humane Protein C kann in der nicht aktivierten Zymogenform verwendet werden oder kann durch Verfahren aktiviert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Dieselben Klone werden auch unter denselben Bedingungen bei 39ºC angezogen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I gezeigt. Tabelle I Auswirkung der Wachstumstemperatur auf die Menge an Protein C, die von 293-Zellen sekretiert wird
- Sogar wenn die Zellen bei verschiedenen Zelldichten angezogen werden, was zu verschiedenen Expressionsmengen pro Zelle führt (beispielsweise CC35), beobachtet man den beträchtlichen prozentualen Anstieg der Sekretion bei 39ºC.
- Es wird unter Verwendung von Plasmid pLPC humanes Protein C im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 1 hergestellt, außer daß AV 12-664 Zellen vom syrischen Hamster anstelle der humanen embryonalen 293 Nierenzellen verwendet werden. Die funktionelle gerinnungshemmende Aktivität wird durch die Techniken von Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192 gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II angegeben.
- Temperatur Einheiten / Milligramm
- 37ºC 216 ± 62
- 39ºC 460 ± 19
Claims (10)
1. Verfahren zur Erhöhung der Bildung von Protein C in einer Adenovirus-transformierten rekombinanten
Säugerwirtszelle, gekennzeichnet durch Kultivierung der Adenovirus-transformierten rekombinanten Säugerwirtszelle bei
einer Temperatur zwischen 38ºC und 39ºC.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die rekombinante Säugerwirtszelle eine 293 Zelle ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Inkubationstemperatur 38ºC beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Inkubationstemperatur 39ºC beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Inkubationstemperatur 38ºC beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Inkubationstemperatur 38, 5ºC beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Inkubationstemperatur 39ºC beträgt.
8. Verfahren zur Erhöhung der Menge an γ-Carboxylierung eines rekombinant hergestellten Protein-C-Moleküls,
gekennzeichnet durch Kultivierung des rekombinant hergestellten Protein-C-Moleküls in einer rekombinanten
AV12 Wirtszelle bei einer Temperatur zwischen 38ºC und 39ºC.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die rekombinante AV12 Wirtszelle bei 38ºC kultiviert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die rekombinante AV12 Wirtszelle bei 39ºC kultiviert wird.
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