DE69213714T2

DE69213714T2 - Herstellung enzymatischer aktiver glukocerebrosidase von rekombinanten zellen

Info

Publication number: DE69213714T2
Application number: DE69213714T
Authority: DE
Inventors: Debra A. Wayland Ma 01778 Barngrover; Michael L. Acton Ma 01720 Hayes; James R. Cambridge Ma 02142 Rasmussen
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1991-01-21
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2012-01-18
Also published as: EP0568647B1; IL100715A0; IL100715A; CA2099876C; IL157458A0; CA2099876A1; DE122011000008I1; IL157458A; EP0568647A1; DE69213714D1; WO1992013067A1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Proteinen (wie Glucocerebrosidase) in Zellkulturen unter Verwendung von Rekombinationsverfahren und insbesondere Verfahren, die eine hohe Expressions- und Sekretionsrate der Proteine in stabilisierte Umgebungen ermöglichen.

Technischer Hintergrund

Gaucher-Syndrom ist eine genetische Erkrankung, von der gezeigt worden ist, daß sie auf einem Fehlen an Glucocerebrosid-β-glucosidase (GCR) beruht. Bei der häufigsten Form der Erkrankung (Typ I) führt das zu einer Anhäufung von Glucocerebrosid in Phagocyten hauptsächlich der Leber, der Milz und des Knochenmarks der betroffenen Patienten. Brady, R. O., et al. (1966) J. Clin. Invest. 45, S. 1112- 1115. GCR kann aus menschlichem Placentagewebe isoliert werden; Pentchev und Brady (1975) U.S.-Patent 3910822. Die Verfügbarkeit von menschlichem Placentagewebe ist jedoch höchst begrenzt, was die Anzahl der Patienten beschränkt, die mit Enzym aus dieser Quelle behandelt werden könnten.
Das Gen für GCR ist kloniert. Sorge, J., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 7289-7293 und (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, S. 3567 und Ginns, U.S.-Patentanmeldung Nr. 137796, eingereicht am 23. 12. 87. Dies erlaubt theoretisch die unbeschränkte Herstellung des Enzyms, wobei in großen Mengen gezüchtete rekombinante Zellen verwendet werden. Verfahren zur Herstellung von Proteinen in Säugerzellen im Großmaßstab sind in Übersichten zusammengestellt. Kaufman, R. J., (1987) Genetic Engineering 9, S. 155-198 (J. Setlow, Hgb.) Plenum Press, New York. Die Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung von Mikroträgern und Säugerzellkultur ist beschrieben. Van Wezel, A. B., und van der Velden-de Groot, C. A. M., (1978) Process Biochemistry, März, S. 6-8. Die Zellen wurden auf Mikroträgern in Zellkulturmedium gezüchtet, und die Kultur wurde mechanisch gerührt und geschwenkt, um den notwendigen Sauerstoff bereitzustellen. Zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Tollwut wurde das Zuchtmedium entfernt, und die Zell-überzogenen Mikroträger wurden in Virenkulturmedium resuspendiert. Mehrfache Ernten wurden erhalten, indem das virenhaltige Medium alle 4 bis 5 Tage geerntet und durch frisches Medium ersetzt wurde. Die Herstellung eines sezernierten rekombinanten Proteins durch eine Säugerzellkultur wurde berichtet, bei der ein Kulturmedium für das Wachstum der Zellen und dann ein zweites Medium, das ein als Zellschutzmittel wirkendes nicht toxisches Polymer enthielt, während der Proteinherstellung verwendet wurden. Das Produktionsmedium wird zur fortlaufenden Proteinherstellung ständig entfernt und erneuert. Gray, P. P., et al. (1988) WO-Patent Nr. 8800967.
Es gibt zwei mögliche Probleme, die die Herstellung von GCR in Zellkultur einschränken können. Das erste ist, daß das Enzym üblicherweise nicht sezerniert wird, sondern in das Lysosom, eine intrazelluläre Organelle, gelenkt wird. Da es keine physiologischen Beschränkungen der Menge an intrazellulärem Protein gibt, die eine Zelle enthalten kann, ist dies möglicherweise hinderlich bei der Entwicklung eines kostengünstigen Verfahrens. Das zweite mögliche Problem ist, daß GCR nicht stabil bei 37ºC, der zur Säugerzellkultur in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) oder PBS + 1 mM Dithiothreitol (DTT) nötigen Temperatur. Humphreys, J. D., und Ihler, G. J., (1980) J. Lab. Clin. Med. 96, S. 682-692. Würde das Enzym durch Säugerzellen sezerniert, bräuchte man Verfahren zur Stabilisierung seiner Aktivität bei 37ºC. Die gewählten Verfahren müßten mit der Aufrechterhaltung einer hohen Zellebensfähigkeit und - produktivität kompatibel sein und dürften die folgende Reinigung des Enzyms aus dem extrazellulären Medium nicht übermäßig stören. Hohe Glycerinspiegel (20-50%) sind zur Stabilisierung des Placentaenzyms bei seiner Reinigung verwendet worden (Pentchev und Brady, op. cit.). Dieses Verfahren kann aber nicht bei Säugerzellkultur verwendet werden, da hohe Glycerinspiegel für Säugerzellen toxisch sind. Hohe Spiegel an Rinderserumalbumin (100 mg/ml) (Humphreys und Ihler, op. cit.) stabilisieren bekanntlich das Protein, stören aber die Reinigung des Proteins. Es ist auch gezeigt worden, daß die Stabilität von freier GCR erhöht wird, wenn sie in hämolysierten wiederverschlossenen Erythrocyten eingeschlossen ist. Dies stört aber ebenfalls die Reinigung. Humphreys und Ihler, op. cit.
Die reduzierende Verbindung Dithiothreitol (DTT) wird häufig als Stabilisator bei der Reinigung intrazellulärer Proteine, gewöhnlich bei einem pH-Wert von > 7,5, eingesetzt, da die Reaktionsgeschwindigkeit bei einem alkalischen pH-Wert größer ist. Creighton, T. E., (1984) Methods in Enzymology 107, S. 305-329. DTT reduziert jedoch Cystin zu Cystein, so daß Proteine mit Disulfidbrücken wohl nicht durch DTT stabilisiert werden. Beispielsweise inaktiviert die Anwesenheit von DTT während der Enzymisolation das α- Fetoprotein. Wu, J. T., et al. Abstract: XVth Annual Meeting ISOBM. Die Anwesenheit von DTT stellte sich auch als toxisch für Zellen in Zellkultur heraus. Beispielsweise zeigte die Verwendung von DTT in der Kultur cystinotischer Fibroblasten, daß DTT in einer Konzentration von 0,1 mM verwendet werden konnte. Höhere Spiegel (> 1,0 mM) waren jedoch für die Zellen aufgrund der Stimulation der Atmung toxisch. Goldman et al. (1970) Lancet, S. 811. Bettger et al. beschrieben die Verwendung von DTT in Serum-freiem Medium für die Zucht menschlicher diploider Fibroblasten in der sehr niedrigen Konzentration von 6,5 x 10&supmin;³ mM und fanden heraus, daß der Nutzen nur geringfügig war. Bettger, W. J. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, S. 5588-5592. Trivedi et al. beschrieben die Verwendung von 1 mM DTT in Hepatocytenkulturen, um die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid zu verstärken, und fanden heraus, daß DTT die Proteinkonzentration der Zellen nicht beeinflußte. Die Zellen wurden jedoch nie länger als 48 Stunden lang mit DTT kultiviert. Trivedi, L. S., et al. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 264, S. 67-73. DTT in einer Konzentration von 20 mM ist eingesetzt worden, um das Überleben von einer Strahlung ausgesetzten Zellen zu vergrößern. Die Zellen wurden jedoch nicht länger als eine Stunde DTT ausgesetzt, und man nimmt an, daß die Schutzwirkung von DTT durch die Sauerstoffverarmung der Kultur zustande kommt, ein Zustand, der nicht mit der Langzeitlebensfähigkeit der Zellen kompatibel ist. Biaglow, J. E. (1982) Advances in Exp. Medicine and Biology, Bd. 157 Hyperthermia, Bicher, H. I., und Bruley, D. F., Hgb., Plenum Press, NY, S. 147-175. Pentchev hat zwar herausgefunden, daß DTT zur Stabilisierung von GCR in den letzten (zellfreien) Schritten der Enzymreinigung verwendet werden kann (Pentchev und Brady, op. cit.), jedoch deuten die o. g. Zitate darauf hin, daß die Verwendung von DTT in wirksamen Konzentrationen (≥ 1,0 mM) die Lebensfähigkeit der zur Herstellung von GCR verwendeten Zellkulturen bedroht.
Verschiedene Forscher haben den Zusammenhang zwischen der Konzentration gelösten Sauerstoffs in einer Hybridomzellkultur und der Antikörper-Produktivität der Hybridomzellen untersucht. Reuveny et al. fanden, daß die Verringerung der Sauerstoffkonzentration auf 25% der Luftsättigung (was 0,05 mM entspricht) die Ausbeute an monoklonalen Antikörpern durch Verlängerung der Zellebensfähigkeit vergrößert. Reuveny, S., et al. (1986) J. Immunolog. Meth. 86 S. 53-59. Die Wirkung hängt jedoch anscheinend von der untersuchten Hybridomlinie ab, da Miller et al. Sauerstoffkonzentrationen zwischen 0,1 bis 100 %iger Luftsättigung untersuchten und als optimale Sauerstoffkonzentration für die Antikörperproduktion 50% (0,1 mM) fanden. Dagegen fand MacMichael, daß sich die Produktivität bei Sauerstoffkonzentrationen unter 2,48 mg/l (0,08 mM) verringerte. Miller, W. M., et al. (1987) J. Cell Physiol. 132, S. 524-530. MacMichael, G. J. (1989) Amer. Biotech. Lab. Januar, S. 44-47. In allen zitierten Arbeiten bewirkte Sauerstoff eher eine Vergrößerung der lebensfähigen Zellpopulation, so daß die Menge an hergestelltem Antikörper zunahm, als eine höhere Stabilität des Antikörpers. Die Wirkung des pH-Wertes auf die Hybridomproduktivität wurde ebenfalls untersucht. MacMichael untersuchte den Bereich von 6,8 bis 8,1 und fand die größte Produktivität zwischen 7,2 und 7,4. MacMichael, op. cit. Andere Forscher fanden für eine andere Hybridomzellinie einen optimalen pH-Wert von 6,8-6,9; Maiorella, B., et al. (1989) ACS National Fall Meeting, Miami. In beiden Fällen wurde angenommen, daß die pH-Änderung eher die spezifische Produktivität der Zellinien ändert, als daß sie das Protein stabilisiert. Als optimaler pH-Wert für Zellkultur wird 7,4 angesehen. Dieses Optimum schwankt geringfügig (zwischen 7,0 und 7,7) für normale und transformierte Zellinien. Freshney, R. I. (1987) Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, S. 69.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiver Glucocerebrosidase, umfassend:
(i) das Kultivieren rekombinanter Zellen, die die für die Herstellung von Glucocerebrosidase codierende DNA-Sequenz enthalten, in einem zum Zellwachstum geeigneten Kulturmedium;
(ii) das Ersetzen eines erheblichen Teils des Kulturmediums durch ein Produktionsmedium, das sich eignet für das Am-Leben-erhalten der Zellen und zur Sekretion und Stabilisierung der Glucocerebrosidase;
(iii) das Produzieren- und Sezernieren-lassen von Glucocerebrosidase in das Produktionsmedium;
(iv) das Entfernen und Sammeln des Produktionsmediums, das die sezernierte Glucocerebrosidase enthält und in Schritt (iii) erhalten wird; und
(v) das Reinigen der Glucocerebrosidase aus dem in Schritt (iv) gesammelten Produktionsmedium.
Zu dem Produktionsmedium kann ein breites Spektrum an Zusammensetzungen, die für die Zellen nicht toxisch sind, zugegeben werden, um die GCR zu stabilisieren. Es können Zusammensetzungen, die Thiole wie Dithiothreitol, Glutathion, 1,3-Mercaptoglycerin, Cysteamin, Liponsäure, Liponsäureamid und Thioglycolat oder Proteine wie Serum oder Serumalbumin enthalten, zugegeben werden. Der pH-Wert oder die Konzentration an gelöstem Sauerstoff können eingestellt werden, oder eine Kombination dieser stabilisierenden Bedingungen kann verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung eines Proteins, umfassend:
(i) das Kultivieren rekombinanter Zellen, die die für die Herstellung des Proteins codierende DNA-Sequenz enthalten, in einem zum Zellwachstum geeigneten Kulturmedium;
(ii) das Ersetzen eines erheblichen Teils des Kulturmediums durch ein Produktionsmedium, das zum Am-Leben-erhalten der Zellen und zur Sekretion und Stabilisierung des Proteins geeignet ist, das Dithiothreitol im Bereich von ungefähr 0,5-2 mM enthält, dessen Konzentration an molekularem Sauerstoff auf weniger als 0,06 mM und dessen pH- Wert auf unter 7 eingestellt wird;
(iii) das Produzieren- und Sezernieren-lassen des Proteins in das Produktionsmedium;
(iv) das stetige Entfernen und Sammeln des Produktionsmediums, das das sezernierte Protein enthält und in Schritt (iii) erhalten wird, wobei das Produktionsmedium stetig ersetzt wird; und
(v) das Reinigen des Proteins aus dem in Schritt (iv) gesammelten Produktionsmedium.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Zellkulturmedium, umfassend:
(i) Zellen, die Glucocerebrosidase sezernieren können; und
(ii) eine nicht-toxische Verbindung, die Glucocerebrosidase stabilisiert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorstehenden Merkmale der Erfindung lassen sich anhand der folgenden genauen Beschreibung, zusammen mit den beiliegenden Beispielen, besser verstehen. Es zeigt:
Fig. 1 ein Diagramm, welches die Wirkung des Donor- Kälberserumspiegels auf den r-GCR-Spiegel im Medium, s. Beispiel 1, beschreibt;
Fig. 2 ein Diagramm, worin die r-GCR-Spiegel im Medium gegen den pH-Wert bei DCS-Konzentrationen von 1%, 5% und 10%, siehe Beispiel 1, aufgetragen sind;
Fig. 3 ein Diagramm, worin die r-GCR-Spiegel im Medium gegen die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei DCS-Konzentrationen von 1%, 5% und 10%, siehe Beispiel 1, aufgetragen sind;
Fig. 4 eine zeichnerische Darstellung, welche Wirkung DTT auf die GCR-Produktion, siehe Beispiel 2, hat;
Fig. 5 ein Diagramm, worin die r-GCR-Spiegel im Medium gegen den pH-Wert in Gegenwart von 0 bis 0,5 mM DTT, siehe Beispiel 2, aufgetragen sind;
Fig. 6 eine zeichnerische Darstellung, welche Wirkung 1 mM DTT auf die Produktion und die spezifische Aktivität von GCR, siehe Beispiel 3, hat;
Fig. 7 eine zeichnerische Darstellung, welche Wirkung BSA auf die GCR-Produktion, siehe Beispiel 4, hat;
Fig. 8 ein Diagramm, worin die r-GCR-Spiegel im Medium gegen den pH-Wert in Gegenwart von BSA, siehe Beispiel 4, aufgetragen sind;
Fig. 9 eine zeichnerische Darstellung, welche Wirkung der pH-Wert auf die Konzentration und die spezifische Aktivität von GCR, siehe Beispiel 5, hat;
Fig. 10 ein Diagramm, worin die Konzentration und die spezifische Aktivität von GCR in zwei Zellinien, siehe Beispiel 6, verglichen werden.

Eingehende Beschreibung der Erfindung Allgemeines

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, wie Glucocerebrosidase (GCR) zur Verfügung, wobei rekombinante Zellen, die die für die Herstellung des Proteins in einer Zellkultur codierende DNA-Sequenz enthalten, in einem zum Zellwachstum geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden.
Nach dem Wachsen der Zellkultur wird ein erheblicher Teil des Kulturmediums entfernt und durch ein Produktionsmedium ersetzt, das zum Am-Leben-erhalten der Zellen und zur Sekretion und Stabilisierung des Proteins geeignet ist. Nach Expression und Sekretion des Proteins in das Produktionsmedium wird das Produktionsmedium entfernt und gesammelt. Das Protein wird dann aus dem Produktionsmedium gereinigt. Wahlweise kann ein erheblicher Teil des Produktionsmediums stetig entfernt, gesammelt und ersetzt werden, um die stetige Sekretion und Produktion des Proteins zu ermöglichen. Das gesammelte Protein kann dann durch die zur Gewinnung reinen Proteins erforderlichen Verarbeitungs- und Reinigungsschritte gereinigt werden.
Es können zum Produktionsmedium Zusammensetzungen gegeben werden, die das Protein stabilisieren. Dies können sein: Thiol-haltige Verbindungen wie Dithiothreitol, Glutathion, 1,3-Mercaptoglycerin, Cysteamin, Liponsäure, Liponsäureamid und Thioglycolat oder Proteine wie Serum oder Serumalbumin. Der pH-Wert und die Konzentration an gelöstem Sauerstoff können eingestellt werden, oder es kann eine Kombination dieser stabilisierenden Bedingungen verwendet werden.

Glucocerebrosidase

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf die Herstellung von Glucocerebrosidase (GCR) aus Säugerzellkultur im Großmaßstab angewendet werden. Die Erfindung kann dadurch eine Quelle für im Großmaßstab hergestellte Mengen an gereinigter GCR bereitstellen, die zur Ersatztherapie bei der Behandlung des Gaucher-Syndroms verwendet wird.
Rekombinante Zellen, die GCR erzeugen, lassen sich durch eine Reihe von Schritten entwickeln, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Diese beinhalten die Konstruktion eines Plasmids, das die für GCR codierende DNA, verschiedene Enhancer und Plasmidreplikationselemente und möglicherweise selektierbare Marker oder amplifizierbare Gene enthält. Dann wird das Plasmid in eine geeignete Säugerwirtszelle transfiziert. Die Zellinien, die Protein besonders effizient exprimieren, können durch Expression des Proteins in einem Selektionsmedium und durch Untersuchen der intrazellulären GCR-Protein- oder -mRNA-Spiegel selektiert werden. Die Produktivität der Zellen kann durch schrittweises Erhöhen des Selektionsmittels verstärkt werden, wenn in dem Plasmid ein amplifizierbarer Marker enthalten ist. Die besondere Form des zur Herstellung von GCR verwendeten Expressionssystems stellt keinen Teil der Erfindung dar.
Sind die rekombinanten Zellen entwickelt, können sie durch eine Anzahl von im Fachgebiet wohlbekannten Techniken kultiviert werden. Diese beinhalten Suspensions-, Mikroträger-, Rollflaschen- oder Hohlfaserkulturen, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugt werden die Zellen auf Mikroträgern gezüchtet, bei denen das Medium leicht von den Zellen getrennt werden kann und die sich auf große Volumen vergrößern lassen. Die verwendeten Mikroträger müssen das Wachstum der Zellen unterstützen und und können aus mehreren im Fachgebiet bekannten, wie Kollagen-beschichtetem Dextran, DEAE-subtituiertem Dextran, Gelatine oder Polystyrol, ausgewählt werden. Die Mikroträger werden am besten in Suspension gehalten, bevorzugt unter Verwendung eines niedrigscherenden Schüttelverfahrens, beispielsweise von 250 ml-Rotiergefäßen (Bellco) , die einen aufgehängten Magnetrührstab und ein Teflonpaddel haben.
Während der Wachstumsphase kann das Medium regelmäßig ausgetauscht werden, um die verbrauchten Nährstoffe zu ersetzen und die erzeugten Abfallprodukte zu entfernen. Das läßt sich leicht durch Beenden des Schüttelns, Absetzenlassen der Mikroträger, Entfernen von 80% des Zellkulturmediums und dessen Ersetzen mit der gleichen Menge an frischem Medium durchführen. Das verwendete Kulturmedlum kann eines von mehreren, in Fachgebiet wohlbekannten sein. Es kann Tierserum oder andere wachstumsfördernde Gemische enthalten. Bevorzugt können die Zellen in diesem Kulturmedium eine hohe Dichte in dem Reaktor (> 5 x 10&sup6; Zellen/ml verwendetes Medium) ereichen. Ist eine geeignete, bevorzugt hohe Zelldichte erreicht, wird das Kulturmedium gegen ein Produktionsmedium ausgetauscht, das Verbindungen enthält, die die sezernierte GCR stabilisieren und die Zellen in einem lebensfähigen, langsam wachsenden oder nicht wachsenden produktiven Zustand erhalten. Die Konzentrationen der verwendeten Additive müssen derart sein, daß sie die Zellebensfähigkeit und -produktivität erhalten, aber nicht die spätere Reinigung übermäßig stören. Da die Zellen in einem stationären, langsam wachsenden oder nicht wachsenden Zustand erhalten werden, können größere Mengen an Additiven, die vielleicht üblicherweise das Wachstum der Zellen stören, verwendet werden.
Thioltitrationen unter Verwendung von Dithionitrobenzoat zeigten, daß die Anwesenheit mindestens eines Thiols auf Glucocerebrosidase für die Enzymaktivität erforderlich ist. Das deutete darauf hin, daß Bedingungen, die Thiole stabilisieren, möglicherweise GCR in Zellkultur stabilisieren. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung stellte sich heraus, daß Bedingungen, die Thiole stabilisieren, wie die Zugabe einer Thiol-haltigen Zusammensetzung oder die Verringerung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff oder die Änderung des pH-Wertes, die Aktivität von GCR in Zellkultur stabilisieren.
In dem Produktionsmedium ist zur optimalen Stabilisierung von GCR der bevorzugte Dithiothreitol- (DTT-) Spiegel 0,5-2 mM, während der optimale pH-Wert des Produktionsmediums unter 7,0 und bevorzugt unter 6,6 sein kann. Die untere pH-Wertgrenze wird von der pH-Wertempfindlichkeit der besonderen verwendeten Zellen bestimmt. Der hier verwendete pH-Wert wird als neuartig angesehen, da er niedriger als der gewöhnlich in Zellkultur verwendete ist. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff muß niedrig gehalten werden, bevorzugt unter 0,06 mM. Gewöhnlich wird die Reduktionsfähigkeit von DTT bei hohem pH-Wert verstärkt, und es wird ein pH-Wert von 8,1 empfohlen. Cleland, W. W. (1964) Biochemistry 3, S. 480. In diesem Verfahren wird aber bei der Herstellung von GCR die stabilisierende Wirkung von DTT durch einen niedrigen pH-Wert verstärkt. Andere reduzierende Zusammensetzungen, die zu dem Produktionsmedium zugegeben werden können, um die Aktivität von GCR zu stabilisieren, beinhalten Thiole wie Glutathion, 1,3-Mercaptoglycerin, Cysteamin, Liponsäure, Liponsäureamid und Thioglycolat oder Proteine wie Serum oder Serumalbumin.
Werden die Zellen durch ein Verfahren kultiviert, das ein leichtes Trennen von Zellen und Medium erlaubt (wie mit Mikroträger- oder Hohlfaserkultur), kann diese Trennung regelmäßig durchgeführt werden, und das konditionierte Medium, das das Produkt enthält kann entfernt und durch frisches Produktionsmedium ersetzt werden. Alternativ kann die Trennung stetig durch Perfusion erfolgen.
Wird eine Suspensionskultur verwendet, können die Zellen und das Medium aus dem Reaktor entfernt und durch ein geeignetes Verfahren getrennt werden, beispielsweise durch kontinuierliche Zentrifugation, Zentrifugation oder Hohlfasern. Die Zellen können dann wieder in frischem Erhaltungsmedium verdünnt und, falls erwünscht, zur stetigen Produktion in den Reaktor zurückgegeben werden.
Die Erfindung läßt sich zur Herstellung von GCR im Großmaßstab für die klinische Verwendung bei der Behandlung des Gaucher-Syndroms verwenden. Zusätzlich läßt sich die Erfindung auf andere Proteine anwenden.

BEISPIELE

Beispiel 1

Es wurden GCR-Expressionsvektoren hergestellt, welche unter der Kontrolle des SV40-Promotors, des Adenovirus- Promotors oder des RSV-LTR-Promotors Glucocerebrosidasecodierende DNA-Sequenzen enthielten. Zudem enthielten sie ein amplifizierbares Gen wie Dihydrofolatreduktase, Adenosindesaminase oder Ornithindecarboxylase oder andere auf eine Weise, daß das amplifizierbare Gen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors oder verbunden mit dem GCR-Gen exprimiert wurde. Hierzu wurden dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet; siehe Übersicht von Kaufman, R. J. (1987) Genetic Engineering 9, S. 155-198. Bei einem Beispiel wurde ein GCR-Expressionsvektor konstruiert, bei dem das für GCR codierende Gen unter der Kontrolle des frühen Promotors des SV40-Enhancers stand; U.S.-Patentanmeldung Nr. 455507, eingereicht 22. Dezember 1989 (Fig. 7). Der GCR-Vektor wurde dann in DG44-Mutantenzellen des Chinesischen Hamsters transfiziert, bei denen die Dihydrofolatreduktase fehlerhaft ist (G. Urlaub et al. (1986) Som. Cell Molec. Genet. 12 S. 555-666). Dazu wurde das Lipofectin -Transfektionsverfahren, wie vom Hersteller (BRL, Gaithersburg, MD) beschrieben, verwendet. Nach der Transfektion wurde das Transfektionsmedium entfernt und 24 Stunden lang durch ein nicht selektives Medium ersetzt. Dieses Medium wurde dann durch ein selektives Medium, α- MEM (ohne Nucleotide) ersetzt. Zellkolonien, die in dem selektiven Medium wuchsen, wurden geerntet, und es wurden Aliquote mit 0,05M Natriumcitrat-Puffer, pH-Wert 6,2, der 12,0 g/l Natriumcholsäure und 12,0 ml/l 1-Butanol enthielt, lysiert. Die intrazellulären GCR-Spiegel wurden in den lysierten Proben unter Verwendung des fluorogenen Substrats 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid gemessen. Suzuki, K., Methods in Enzymol. (1978) 50, S. 478-479. Zellkolonien, die hohe intrazelluläre GCR-Spiegel enthielten, wurden vermehrt und schrittweise mit steigenden Methotrexatmegen bis zu 10,0 mM amplifiziert.
Eine Zellinie, II 15B, wurde an diesem Punkt mit einer Anfangsdichte von 1 x 10&sup5; Zellen/ml in eine Mikroträgerkultur in einem Kulturmedium überimpft, das aus Basismedium plus 1%, 5% oder 10% Donorkälberserum (DCS) bestand. Für dieses Beispiel wurden ab Tag 3 und danach alle 48 Stunden 80% des Mediums ausgetauscht. Die in dem extrazellulären Medium vorhandenen GCR-Aktivitätseinheiten sowie der pH-Wert und der gelöste Sauerstoff wurden anhand täglicher Proben überprüft. Die Zellwachstumsraten waren bei den Kulturen mit 10% und 5% Serum ähnlich. Höhere GCR- Aktivitätsspiegel (gemessen mit dem 4-MU-Test) wurden bei höheren Serumspiegeln (Fig. 1), niedrigerem pH-Wert (Fig. 2) und weniger gelöstem Sauerstoff (Fig. 3) gefunden. Insbesondere ist der erwünschte pH-Wert niedriger als 6,8 und für diese Zellen vorzugsweise zwischen 6,4 und 6,6, während die erwünschte Konzentration an gelöstem Sauerstoff unter 0,06 mM liegt.

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 verwendete II 15B-Zellinie wurde in Mikroträger-Rotiergefäße in ein Kulturmedium aus einem Basismedium plus 5% oder 10% DCS überimpft, wobei die gleichen Verfahren wie bei Beispiel 1 verwendet wurden. Nachdem die Zellen eine Dichte von 8 x 10&sup6; Zellen/ml erreichten, wurde die Produktionsphase eingeleitet, indem das Kulturmedium entfernt ünd durch das Basismedium allein ersetzt wurde. Das Medium wurde alle 24 Stunden ausgetauscht (80%), und schrittweise steigende Mengen (0 bis 0,5 mM) Dithiothreitol wurden in das Basismedium gegeben. Der gelöste Sauerstoff wurde bei unter 0,06 mM gehalten, indem die Sauerstoffkonzentration in dem Gasraum des Reaktors überwacht wurde. Der in dem extrazellulären Medium gefundene Enzymaktivitätsspiegel (gemessen mit dem 4-MU-Test) ist in Fig. 4 als Funktion der steigenden DTT-Mengen dargestellt.
Ausgewählte Proben wurden außerdem auf Gesamt-GCR- Protein mit einem polyklonalen ELISA-Test untersucht. Sie zeigten einen gleichmäßigen Spiegel der GCR-Proteinsekretion von 1,64 ± 0,25 mg/l. Also stellte die in dem Medium gemessene höhere Enzymaktivität eine größere Stabilität des sezernierten Enzyms dar. Diese höhere Aktivität korrelierte nicht nur mit höheren DTT-Spiegeln, sondern auch mit niedrigerem pH-Wert, wie in Fig. 5 dargestellt. Der bevorzugte pH-Wert für eine hohe Enzymaktivität war unter 6,6.

Beispiel 3

Die in Beispiel 1 verwendete II 158-Zellinie wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie bei Beispiel 1 in einen getrennten Satz von Mikroträger-Rotationsgefäßen und ein aus Basismedium plus 10% DCS bestehendes Kulturmedium überimpft. Nachdem die Zellen eine Dichte von 1 x 10&sup7; Zellen/ml erreicht hatten, wurden die Kulturen in ein Produktionsmedium überführt, das 1,0 mM DTT enthielt. Während der Herstellungsphase wurde der pH-Wert immer unter 6,8 und in der Regel unter 6,6 gehalten. Der gelöste Sauerstoff wurde unter 0,06 mM gehalten. Täglich wurden 80% geerntet und neu zugesetzt, und die GCR-Spiegel in dem extrazellulären Medium wurden in täglichen Proben mit dem 4-MU-Aktivitätstest und einem polyklonalen ELISA-Test überprüft.
Figur 6 zeigt, daß die Produktivität der Zellen 30 Tage lang aufrechterhalten werden konnte und daß die spezifische Aktivität der GCR in dem extrazellulären Medium gewöhnlich mehr als 25 IE/mg betrug. Zehn Liter Erntemedium von diesen Kulturen wurden in zwei Chromatographieschritten gereinigt, mit einer Gesamtausbeute von 22 mg Protein (BCA), das eine spezifische Aktivität von 42 IE/mg Protein hatte.

Beispiel 4

Die in Beispiel 1 verwendete II 15B-Zellinie wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens und Kulturmediums, wie bei Beispiel 1, in einen getrennten Satz von Mikroträger-Rotationsgefäßen überimpft. Nachdem die Zellen eine Dichte von 8 x 10&sup6; Zellen/ml erreicht hatten, wurden die Kulturen in ein Produktionsmedium überführt, das 5,75 g/l Rinderserumalbumin enthielt. Die Albuminkonzentration wurde nach 7 Tagen auf 11,5 g/l erhöht. Der Spiegel an aktivem Enzym, pH-Wert und gelöster Sauerstoff wurde in täglichen Proben überprüft. Der gelöste Sauerstoff wurde wie in Beispiel 1 unter 0,06 mM gehalten.
Der Spiegel an aktivem Enzym ist in Fig. 7 als Funktion der Albuminkonzentration und in Fig. 8 als Funktion des pH-Wertes dargestellt. Ausgewählte Proben wurden auch mittels eines polyklonalen ELISA-Tests analysiert. Sie zeigten, daß das GCR-Protein in einer konstanten Menge (1,41 ± 0,3 mg/l) produziert wurde. Das deutet darauf hin, daß die in den Ernten beobachtete höhere Aktivität aufgrund höherer Stabilität des Enzyms bei niedrigerem pH- Wert und höherem Albuminspiegel zustande kam. Der bevorzugte pH-Wert lag unter 6,6.

Beispiel 5

Die in Beispiel 1 verwendete II 15B-Zellinie wurde mit einer Anfangsdichte von 5 x 10&sup5; Zellen/Gefäß in t-25- Plastikgefäße überimpft. Die Zellen wurden mit Kulturmedium mit pH-Wert 6,6 überschichtet, das 10% FBS enthielt und alle 48 Stunden ausgetauscht wurde, bis in den Gefäßen Konfluenz vorlag. Das Kulturmedium wurde dann entfernt und durch frisches Kulturmedium ersetzt, das auf 5 verschiedene pH-Werte von 6,2 bis 7,2 titriert worden war. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt. Die Menge an vorhandenem GCR-Protein wurde mittels eines polyklonalen ELISA- Tests und die vorhandene GCR-Aktivität mit dem 4-MU-Test bestimmt. Die Menge an erzeugtem GCR-Protein wurde durch den pH-Wert nicht beeinflußt (Fig. 9), jedoch die spezifische Aktivität, was zu einer höheren Aktivität bei niedrigerem pH-Wert führte. Die maximale Aktivität wurde mit einem anfänglichen pH-Wert von 6,2-6,7 erzielt.

Beispiel 6

Ein zweiter GCR-Expressionsvektor wurde konstruiert, wie in der U.S.-Patentanmeldung 455507, eingereicht am 22. Dezember 1989, beschrieben (Fig. 9). In diesem stand die Transkription des GCR-Gens unter der Kontrolle eines Konstrukts aus dem hauptsächlichen späten Promotor des Adenovirus und dem SV40-Enhancer. Mit dem Vektor wurden DG44- CHO-Zellen transfiziert, und GCR-exprimierende Zellen wurden wie in Beispiel 1 entwickelt. Eine als IV 7A bezeichnete Zellinie wurde wie in Beispiel 1 in Mikroträgerkultur übrimpft, wobei das Kulturmedium 10% DCS enthielt. Nachdem eine Zelldichte von 5 x 10&sup6; Zellen/ml erreicht worden war, wurden die Kulturen in ein Produktionsmedium überführt, das 1 mM DTT enthielt. Tägliche Proben wurden für die GCR- Analyse mittels des 4-MU-Tests und eines polyklonalen ELISA-Tests sowie zur Analyse des pH-Wertes und der Konzentration an gelöstem Sauerstoff entnommen. Das konditionierte Medium wurde wie in Beispiel 1 täglich geerntet (80%) und durch frisches Medium ersetzt. Der pH-Wert wurde unter 6,6 gehalten, und der gelöste Sauerstoff wurde unter 0,06 mM gehalten. Die Produktivität wurde mit der der bei den Beispielen 1-3 verwendeten II 15B-Zellinie verglichen (Fig. 10). Obwohl die beiden Zellinien unterschiedliche Enzymmengen (mg/l) produzierten, war die spezifische GCR- Aktivität in Gegenwart von 1 mM DTT die gleiche. Das deutet darauf hin, daß die GCR-Aktivität in dem extrazellulären Medium nicht von dem gewählten Vektor oder der produzierten GCR-Menge abhing.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung biologisch aktiver Glucocerebrosidase, umfassend:

(i) ein Kultivieren rekombinanter Zellen, welche die DNA-Sequenz enthalten, die kodiert für die Herstellung von Glucocerebrosidase, in einem zur Zellkultur geeigneten Kulturmedium;

(ii) ein Ersetzen eines erheblichen Teils des Kulturmediums durch ein Produktionsmedium, das die Zellebensfähigkeit sicherstellt sowie für die Sekretion und zur Stabilisierung von Glucocerebrosidase geeignet ist;

(iii) ein Produzieren- und Sezernieren-lassen von Glucocerebrosidase in das Produktionsmedium;

(iv) ein Entfernen und Sammeln des Produktionsmediums aus Schritt (iii), das die sezernierte Glucocerebrosidase enthält; und

(v) ein Reinigen der Glucocerebrosidase aus dem in Schritt (iv) gesammelten Produktionsmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Entfernens und Sammelns des Produktionsmediums stetig erfolgt und den Schritt des stetigen Ersetzens des Produktionsmediums beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Produktionsmedium eine Thiol-haltige Zusammensetzung enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Thiol-haltige Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe Dithiothreitol, Glutathion, 1,3-Mercaptoglycerin, Cysteamin, Liponsäure, Liponsäureamid und Thioglycolat.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Thiol-haltige Zusammensetzung in dem Produktionsmedium Dithiothreitol ist und die Konzentration von Dithiothreitol in dem Produktionsmedium von 0,5-2 mM reicht.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Konzentration an molekularem Sauerstoff in dem Produktionsmedium auf unter 0,06 mM gehalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der pH-Wert des Produktionsmediums auf unter 7 eingestellt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der pH-Wert des Produktionsmediums von 6,2-6,7 reicht.

9. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Produktionsmedium ein Protein beinhaltet.

10. Verfahren zur Herstellung und Stabilisierung eines Proteins, umfassend:

(i) Kultivieren rekombinanter Zellen, die die DNA-Sequenz enthalten, welche kodiert für die Herstellung des Proteins, in einem zum Zellwachstum geeigneten Kulturmedium;

(ii) Ersetzen eines erheblichen Teils des Kulturmediums durch ein Produktionsmedium, das die Zellebensfähigkeit sicherstellt und für die Sekretion sowie zur Stabilisierung des Proteins geeignet ist, das ungefähr 0,5-2 mM Dithiothreitol enthält und bei dem die Konzentration an molekularem Sauerstoff unter 0,06 mM gehalten und der pH-Wert auf unter 7 eingestellt wird;

(iii) Herstellen- und Sezernieren-lassen des Proteins in das Produktionsmedium;

(iv) Stetiges Entfernen und Sammeln des Produktionsmediums, welches das sezernierte Protein enthält und das in Schritt (iii) erhalten worden ist, sowie stetiges Ersetzen des Produktionsmediums; und

(v) Reinigen des Proteins aus dem in Schritt (iv) gesammelten Produktionsmedium.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der pH-Wert des Produktionsmediums von 6,2-6,7 reicht.

12. Zellkulturmedium, umfassend:

(i) Zellen, die Glucocerebrosidase sezernieren können; und

(ii) eine Zusammensetzung, die für die Zellen nicht toxisch ist und Glucocerebrosidase stabilisiert.

13. Zellkulturmedium nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung eine Thiol-haltige Verbindung enthält.

14. Zellkulturmedium nach Anspruch 13, wobei die Thiol- haltige Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe Dithiothreitol, Glutathion, 1,3-Mercaptoglycerin, Cysteamin, Liponsäure, Liponsäureamid und Thioglycolat.

15. Zellkulturmedium nach Anspruch 14, wobei die Thiol- haltige Verbindung Dithiothreitol ist und die Konzentration von Dithiothreitol in dem Kulturmedium von 0,5-2 mM reicht.

16. Zellkulturmedium nach Anspruch 12, wobei die Konzentration an molekularem Sauerstoff in dem Zellkulturmedium auf unter 0,06 mM gehalten wird.

17. Zellkulturmedium nach Anspruch 12, wobei der pH-Wert auf unter 7 eingestellt wird.

18. Zellkulturmedium nach Anspruch 17, wobei der pH-Wert von 6,2-6,7 reicht.

19. Zellkulturmedium nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung ein Protein beinhaltet.