JPH01502080A

JPH01502080A - 組み換えビタミンｋ依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強

Info

Publication number: JPH01502080A
Application number: JP50045588A
Authority: JP
Inventors: フリー，ブルース・イー; フリー，バーバラ・シー; ジョージェンセン，マリア・ジェイ
Original assignee: ニュー・イングランド・メディカル・センター
Priority date: 1986-11-17
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 1989-07-27
Also published as: AU8339187A; WO1988003926A1; EP0289586A1; EP0289586A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えビタミンに依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強 λ見立１１本発明はビタミンに依存性蛋白質に関する。

ビタミンに依存性蛋白質は、その完全な合成のためにビタミンＫを必要とする。

これらの蛋白質には、プロトロンビン、第Ｘ因子、第■因子、プロティンＣ、プロティンＳ１第Ｘ因子およびプロティン・２など（そのある物は血液凝固に関係する）および骨の中に見出されるオステオカルシンおよび骨マトリックスＧｌａ蛋白質が含まれる。一つのグループとして、血液凝固蛋白質は、アミノ酸配列に顕著な相同性を有し、チモーゲンから活性酵素型への函定蛋白分解により活性化される（プロティンＳのみは異なる）、全てのビタミンに依存性蛋白質は、新規メタル結合アミノ酸Ｔ−カルボキシグルタミン酸を有する。

ビタミンに依存性蛋白質中のグルタミン酸残基は、最初に細胞中に存在する時はカルボキシル化されていない。

カルボキシル化は細胞から蛋白質が分泌される前のある時期に生じる。

ビタミンに依存性蛋白質は、肝臓病、ビタミンに欠乏症、およびワルファリンナトリウム（クマリノ）のようなビタミンに拮抗性薬剤の存在下等で、後天的に欠乏する。血友病Ｂは、ｍｌＸ因子の遺伝的欠損を特徴とする病気である。血友病に悩む２５０００人の米国人のうち、約ｌＯ〜１２％は、血友病Ｂである。

先天的または後天的に血液凝固蛋白質の欠損を含む病気の患者の治療は、危険が多くまた高価である。例えば血友病Ｂは現在２種の方法で行われる：即ち、新鮮凍結血永、または正常ヒト直置の部分分画で得られる市販の第Ｘ因子による。後者の方法で得られる第Ｘ因子は、中間的純度のものでしかない。

ヒト第■遺伝子はプラスミド中に多ローン化されており、哺乳類細胞に形質転換されている。しかしながら、発現された第Ｘ因子は血液中で循環しているものに比して、はんの部分的にカルボキシル化されているにすぎない、この部分的カルボキシル化第■因子は、天然の充分にカルボキシル化された第Ｘ因子のもつ充分な活性は持っていない。

ビタミンに依存性蛋白質は、最初に合成される時、成熟蛋白質（例えばプロトロンビン）、該成熟蛋白質の上流で隣接するアミノ酸配列（プロペプチド）から構成されている。蛋白質が粗面小胞体中で合成される時、プレペプチドはプロプロチイン（成熟蛋白質に結合したプロペプチド、例えばプロプロトロンビン）が細胞の小胞体中に分泌される間に開裂される。この分泌に続いて、ガンマカルボキシル化が生じ、そして最終的に、プロペプチドが開裂され、成熟蛋白質が細胞から放出される（本明ａｉ＊において、プレペプチドおよびプロペプチドを一緒にして、プレプロペプチドという）。

発明の概要一般に、本発明は、ヒトビタミンに依存性蛋白質をコードしている第１ＤＮＡ配列と、その５′末端に融合している、前記蛋白質をフードする前記ＤＮＡ配列と天然に結合しているプロペプチドコード配列と同一ではない＠２ＤＮＡ２ＤＮＡ配ＤＮＡ配列を特徴としており、該第２ＤＮＡ配列は蛋白質が組み換え真核細胞内で発現され！二とき、該蛋白質のガンマ−カルボキシル化を促進する能力のあるプロペプチド配列をコードすることのできる天然には存在しないプロペブチトコ−ρ配列である。

（組み換え細胞は、その蛋白質の遺伝子が発現性ベクターを用いて導入されたものである。）好ましい実施態様においては、第２ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列においてタンパク質に天然に結合しているプロペプチドよりもプロトロンビンのプロペプチドに類似しているプロペプチドをコードしている。最も好適には、プロトロンビンのプロペプチド自身をコードしている配列が用いられる。

本発明は、十分なガンマ−カルボキシル化がされておらずそのために低い生物学的活性しか発現しない他の組み換えビタミンに依存性蛋白質とは対照的に、組み換えプロトロンビンは完全にガンマ−カルボキシル化されているという我々の発見に一部基づいている。この違いは、組み換え細胞内において他のビタミンに依存性蛋白質のプロペプチドよりもある作用によって優れたガンマ−カルボキシル化認識部位として働くプロトロンビンのプロペプチドの機能であると我々は考えている。

プレペプチドはガンマ−カルボキシル化されない、それゆえに、本発明に従えば、プレペプチドはその蛋白質又はプロペプチドのいずれかに天然に結合しているもの、又は他の適当なプレペプチドでも良い。

他の好適な実施態様においては、ビタミンに依存性蛋白質は、第■因子：第■因子；プロテインＣニブロチインＳ：第Ｘ因子ニブロチイン２：オステオカルシン：又は骨マトリックスＧｌａ蛋白質である。

ここで用いられる「ベクター」という用語は、異種のＤＮＡ　（天然にはベクター内に存在しないＤＮＡ）を挿入できるプラスミド、ウィルス、コスミド、又は７アージを含んでいる。ベクターは自己複製能力があっても良く、また異種ＤＮＡをクロモソームＤＮＡに組み込むことができても良い。ベクターは通常複製開始点及び少なくとも一つの選択性遺伝子、即ち、容易に検出できるか又はその存在が細胞の増殖に必須である生成物をコードしている遺伝子を有している。ベクターの他の性質は分子生物学の分野の当業者にとっては良く知られている。

また、本発明は、前記のＤＮＡ配列を提供すること；そのＤＮＡを真核細胞、例えばホ乳類、の発現性ベクターに挿入すること：そのベクターを真核、例えばホ乳類、細胞にトランスフェクトすること；及びガンマ−カルボキシル化が改善されたビタミンに依存、性蛋白質を生産するｊこめにその細胞を培養することによってガンマ−カルボキシル化が改善されたヒトのビタミンに依存性蛋白質を生産する方法を特徴とする。

他の態様において本発明は、ヒトのプロトロンビンをコードする精製されｔ−Ｄ　Ｎ　Ａ配列（特にｃＤＮＡ配列）：発現に必要なプレペプチドをコードする領域を含むＤＮＡ配列を特徴とする。ここで「精製された」という用語は、ヒト細胞内でその遺伝子と天然に結合しているＤＮＡから分離されていることを意味している。プロトロンビンをコードしているＤＮＡ配列は、成熟構造蛋白質をコードしているＤＮＡ配列と共にプロトロンビンのプレプロペプチドをコードしているＤＮＡを含んでいる。

プロトロンビンをコードしている配列は、培養真核細胞に挿入されたときそれらの細胞によって完全にガンマ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンの生産に影響を与える発現性ベクターに組み込むことができる。

第１図は、ヒトプロトロンビンのプレプロペプチドのアミノ酸配列である。

第２図は、第１図のアミノ酸配列の一部分をコードしているＤＮＡ配列である。

第３図は、ヒトプロＩ・ロンビンのプレプロペプチドの非翻訳５′末端のＤＮＡ配列である。

第４図は、４種類の異なった抗プロトロンビン抗体と組み換え′プロトロンビンの反応を示したグラフである。

構造第１図はヒトプロトロンビンのプレプロペプチドのアミノ酸配列を示している。

位置−１（Ａｒｇ）のアミノ酸は成熟ヒトプロトロンビンのアミノ末端（Ｎ−末端）に隣接している。位置−３６から位置−１までのプレプロペプチドのアミノ酸配列は以前にデゲン（Ｄｅｇｃｎ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２０Ｂ？（１９Ｒ３））によって明らかにされていた。ヒトプロトロンビンをコードするｃＤＮＡの全部ではないが５′末端の２１個の核酸もデゲンらによって示されている。プレペプチドをコードしている領域を含む完全なｃＤＮＡが発現のために必要である。

第１図に示されるプレプロペプチドはプロペプチド及びプレペプチド、又は“シグナル”ペプチドからなっている。プレペプチドは位置−１から位置−１８の部分であり；プロペプチドは残りの部分（位置−１９から位置−４３）。プロトロンビン構造遺伝子は位置−１から開始される成熟ヒトプロトロンビン蛋白質をコードしている。′プロプロトロンビン”とはそのＮ末端にプロペプチドが結合されているプロトロンビンを意味しており、ぞして“プレプロプロトロンビン”とはそのＮ末端にプレプロペプチドが結合されているプロトロンビンを意味している。

ヒトプロトロンビンのシグナルペプチドの残基−３５から−４３をコードするＤＮＡ配列は第２図に示されている。前記のように、プロトロンビン構造遺伝子及びプレプロペプチドの残基−１から−３６をコードするＤＮＡのＤＮＡ配列は前記のデゲンらにより示されている。

プレプロプロトロンビンをコードしているｃＤＮＡをホ乳類の発現性ベクターにクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）！胞にトランスフェクトした。組み換えプロトロンビンは、完全に活性で完全に（天然に存在するヒトプロトロンビンに比較して）ガンマ−カルボキシル化された形で発現された。その観察された完全なガンマ−カルボキシル化は、ヒト第■因子遺伝子（プレプロ部分を含んでいる）がラットの肝癌細胞（アンソン（Ａ＋＋ｓｏｍ）ら、　３１５　Ｎａｔｕｒｅ　６８３（１９ε５））：ヒト肝癌細胞（デ・う・すＬ）（ｄｅ　Ｉｓ　５ａｌｌｅ）ら、　３１６　Ｎａ１ｒｃ　２６ｇ（１９８５））：マウス繊維芽細胞（アンソン、上記：デ・う・サレ、上記）；ベビーハムスターの腎臓（ブスバイ（Ｂ＋＋５ｂｙ）ら、ηｙＮａｔｕｒｅ　２７１（１９８５））　；及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（カウフマン（Ｋａｉｆｍｓｎ）ら、す±Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｙａ、　９６２２（９１１６））に導入されたときヒト第■因子の発現において（天然に存在するヒト第■因子と比較すると）観察されるものと非常に対照的である。

ビタミンに依存性蛋白質のプロペプチドは該タンパク質をそのグルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化に向かわせる原因となっている。発現された組み換えプロトロンビンは完全にカルボキシル化されていると考えられる。何故ならばプロトロンビンのプロペプチドは効率的に蛋白質をカルボキシル化に向かわせるからである。

これに対して、発現された組み換え第■因子は、プローＭｕ因子のプロペプチドはカルボキシル化に向かわせるのに効率的ではないので、完全にはカルボキシル化されない。

そのＮ末端に改良されたターゲティング（標的に向かわせる）プロペプチド、例えば、プロトロンビンのプロペプチド（第■因子のプロペプチドの代わりに）が結合した第■因子をコードするＤＮＡをホ乳類の発現性ベクターにクローニングし、そして適当な真核細胞にトランスフェクトすると、蛋白質をガンマ−カルボキシル化に向かわせることにおいて置換あるいは改良されＩ；プロペプチドの優れた効率ゆえに、改善されたガンマ−カルボキシル化を実現している第■因子を発現させることができる。

組み換え細胞内における完全にガンマ−カルボキシル化された組み換えヒトプロトロンビンの発現は以下に述べられており、さらに、プロトロンビンのプロペプチド−第■因子ｅＤＮＡの調製についても述べられている。

ヒト肝癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーをアフィニティーで精製された抗プロトロンビン抗体を用いてスクリーニングしＩ；。ある選択されたクローンは制限酵素マツピング及び核酸配列分析により、プロトロンビンｃＤＮＡの３′末端からなる６５０個の塩基対の挿入部分を含んでいることが示された。プロトロンビンの完全なコード配列を得るために、この断片は胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用された。分離された多数の陽性クローンの制限酵素分析は、これらの挿入部分もその５′末端で不完全であることを示した。制限酵素で切断された断片を最も完全な５′配列を含む挿入部分の５′末端から調製し、そしてその断片はライブラリーを再スクリーニングするのに使用しｔ；。数個のクローンが回収され、それらはイニシエターコドンを含む完全な５′末端をコードしていた。完全な長さのプロトロンビンをコードする配列（プロペプチド及びプレペプチドを含んでいる）は２つの重なり合うｃＤＮＡ挿入部分から再構築された。

得られたｃＤＮＡは２．０キロベースの長さで、３′非翻訳領域に約１００−１５０の核酸及び５′非翻訳領域に１２の核酸を含んでいる。５′末端の核酸配列及び対応する予想アミノ酸配列が第３図に示されている。ヒトプロトロンビンのリーダー配列は残基−４３から開始される。

プロトロンビン発現性ベクターｐＭＴ２−ＦＴは、ＳＶ４０の複製開始点、アデノウィルスの主後期プロモーター、プロトロンビンをコードしている領域、ジヒドロ７オレート・レダクターゼをコードしている領域、５ｖ４０の初期ポリアデニル化部位、アデノウィルスのウィルス結合遺伝子、及び大腸菌（Ｅｓｅｂｅｒｉｅｈｉｉ　ｃｏｌｉ）内での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。このべｃｔ　ＢＩＧ（１９８５））によて発表されている。プラスミドｐＭＴ２− ＰＴをジヒドロ７オレート・レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入し、選択培地中での継代培養によってジヒドロ７オレート・レダクターゼ陽性の表現型を示す細胞を選択した。細胞が一面に広がったとき収穫した培養液を抗−全プロトロンビン抗体を用いて競合ラジオイムノアッセイによって測定した。全プロトロンビン抗原は、０．５５μｇ　／　ｍ　１までの種々の濃度でこれらの一次形質移入体によって発現されることが分かっｌ；。同じサンプルをフンフォメーション−特異性の抗体、即ち、金属イオンの存在下でプロトロンビン上に出現する特定の決定基と結合する抗プロトロンビン：Ｃａ（Ｉ［）を用いて測定した。これらの決定基は、金属に誘導されるフンフォメーション変化を受けるためにプロトロンビンが十分にガンマ−カルボキシル化されているとき出現し、それらの存在は凝固活性と密接に関連している。このアッセイを用いて測定されたプロトロンビンの濃度は、全プロトロンビン抗体に対して測定された濃度と等しく、このことは発現されたプロトロンビンの全てがカルボキシル化されており生物学的に活性であることを示している。実際、抗異常グロトロンビン抗体を用いても、　ｄｅｓ−γ−カルボキシ（異常）プロトロンビンは０．０３　Ｈｙｍｎの測定限度以上は検出されなかった。

リエブ？　ン（Ｌｉｅｂｍａａ）ら（＄２１ｉｓｔ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　３１７！（＋９８５））及びボロウスキーＣＢａｒｅｖｓｋｉ）ら（世Ｊ−Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　９２Ｎ（１９Ｂ５））によて発表されている方法に従って、組み換えプロトロンビンが馴化培地からコンフォメーション特異性抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーによって単離された。組織培養上澄液をＣａ（ＩＩ）の存在下で抗プロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）−セファロースのカラムに付した。全てのプロトロンビン抗原がこの方法により培養液から取り除かれ；カラムに結合しなかつｌ；物質中にはプロトロンビン抗原は、抗全グロトロンビン抗原を用いても検出されなかった。結合したプロトロンビンはＥＤＴＡによって溶出され、プロトロンビンは溶田液から定量的に回収された。

精製された組み換えプロトロンビンは２−メルカプトエタノールの存在下でのドデシル硫酸塩ゲルにおいて単一のバンドとして移動した。その電気泳動の移動はヒト血漿から得られたプロトロンビンと同一であった。

組み換えプロトロンビンの凝固活性はプロトロンビン欠乏血漿を直接用いて測定された。既知の濃度の精製された血漿プロトロンビンが検量線を作るのに用いられＩ；。

組み換えプロトロンビンは、表１に示されるように血漿プロトロンビンの凝固活性の９９±４％を有しているこが分かった。

表１　組み換えプロトロンビンの凝固活性およびガンマ−カルボキシル化グルタミン酸凝固活性　Ｔ−カルボキシル化（％）　グルタミンａ（モル）血漿由来プロトロンビン　１００　１０．０組み換えプロトロンビン　９９±４９．９±０．４組み換えプロトロンビンと四種の異なる抗プロトロンビン抗体との相互作用は、競合ラジオイムノアッセイで検討した。抗−全プロトロンビン抗体は、プロトロンビンのカルボキシル化の程度およびコンホーメーションと関係な（プロトロンビンと結合した。予期されたとおり、組み換えプロトロンビン、血漿由来プロトロンビンおよび異常（デスーＴ−カルボキシル化）プロトロンビンは、第４Ａ図に示すとおり、＋ｔｓｌ　ｇ識プロトロンビンをこれらの抗体から等しく置換した。抗−異常プロトロンビン抗体は、デスーＴ−カルボキシル化型のプロトロンビン上のみに存在する抗原決定基に結合した。第４Ｂ図に示すとおり、組み換えプロトロンビンおよび血漿プロトロンビンは、これらの抗体からＩＩＳｌ−標識異常プロトロンビンを置換せず、このことは、組み換え生成物中に痕跡量のデスーＴ−カルボキシル化プロトロンビンも存在しないことを示した。プロトロンビンの異なる金属依存性構造（ｍｅｔａｌ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｏｎｆ。

ｒ　ｍ　ｅ　ｒ　）に特異的な、二種の抗体群がＢｏｒｏｗｓｋｉら、２６１．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８６）に記載されている。抗−プロトロンビン：Ｍｇ　（Ｉ　Ｉ）抗体は、プロトロンビンが充分にカルボキシル化されていて、多くの二価および三価の金属イオンにより誘発される最初の構造変化を受けられる詐り時のみ、プロトロンビン上に発現された抗原決定基に結合する。抗プロトｏ７ビン：　Ｃａ　（１１）４＞Ｘ的抗体は、プロトロンビンが脂質結合部位の発現に伴う第二の構造変化を受けた時露出される抗原決定基に対応する。この変化はＣａ　（ＩＩ）によってのみ行われ、他の殆どの金属イオンによっては行われない、第４Ｃ図および′￥ＢＡＤ図に示したように、組み換えプロトロンビンおよび血漿プロトロンビンは、これらの抗体から１！Ｊ−標識プロトロンビンを等しく置換し、この判定基準からは、組み換えプロトロンビンおよび血漿プロトロンビンが実質的に均等であることを示した。

組み換えプロトロンビンのアミノ末端配列は、自動化エドマン分解で決定した０表■かられかるとおり、組み換えプロトロンビンおよび血漿由来プロトロンビンの最初の１６アミノ酸残基のアミノ酸配列は、等しかった。

特に興味深いのは、不完全なプロセスを受けたプレーもしくはプロベブヂドを示ず第二配列は全く検出されなかった。さらに、標準的配列決定サイクルの間に、ガンマカルボキシル化グルタミン酸誘導体は、フィルターから遊離されず、残基６．７．１４および１６に見出されたグルタミン酸の、この検出不能の程度は、これらの残基の完全ガンマカルボキシル化に一致する。

表■　組み換えプロトロンビンのアミノ末端配列残基　組み換え　血漿プロトロンビン　プロトロンビンＩ　Ａ　ｌ　ａ　６４　Ａ　１　ａ２　Ａ　ｓ　ｎ　３２　Ａ　ｓ　ｎ３　Ｔ　ｈ　ｒ　２４　Ｔ　ｈ　ｒ４　Ｐｈｅ　３６　Ｐｈｅ５　Ｌｅｕ　３１　Ｌｅｕ８　Ｖａｔ　２３　Ｖａ１９　Ａｒｇ　９　Ａｒｇｌｏ　Ｌｙｓ　１９　Ｌｙｓｌｌ　Ｇｌｙ　１６　Ｇｌｙ１２　Ａｓｎ　１５　Ａｓｎ１３　Ｌｅｕ　１８　Ｌｅｕ１４　−　−　（Ｃ；Ｉａ）１５　Ａｒｇ　？　Ａｒｇ組み換えプロトロンビンのＴ−カルボキシル化グルタミン酸の９赤をアルカリ加水分解物のアミノ酸分析で決定した。特製組み換えプロトロンビンは、表Ｉに示したとおり、標準値として血漿由来プロトロンビンの１モル当たりの値を１０モルとしたとき、蛋白質１モルあたり９９±０．４モルのγ−カルボキシル化グルタミン酸を含んでいた。

ｌ良度】溝ｃ　ＤＮＡライブラリーのスクリーニング：　ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、ａｏ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ、１１９４　（１９８３）の λｇｔｌｌベクター中にヒトへバトーマのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ライブラリーを′ Ｈ製し、これをＷｅｔら、３．ＤＮＡ、４３７（１９８４）に記載されたクロモジェニック・イムノｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、プロトロンビン抗原を発現するクローンのスクリーニングを行った。約１００．０００個のプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、３％牛血清アルブミン、０．０２％ナトリウムアジド、および０．５μｇ／ｍｌの免疫アフィニティー法で精製した家兎抗−全プロトロンビン抗体を含有するトリス緩衝塩類液中で、−夜インキュベートした。トリス緩衝塩類液で数回洗浄した後、このフィルターを、３％牛血清アルブミンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した山羊抗−家兎イムノグロブリン（バイオ−ラッド社製、１：１０００希釈）を含むトリス緩衝塩類液中で４時間インキュベートした。さらに洗浄したのち、基質の１−クロロ−２−ナフトール（バイオ−ランド社Ｗりを加えて陽性プラークを検出した。３回の再スクリーニングにより、７個の陽性クローンを単離し、このファージＤＮＡをプレート溶解物から、Ｈｅ　ｌ　ｍ　ｓら、４．ＤＮＡ、３９　（１９８５）に記載された方法でＩＩ製した。ｃＤＮＡ挿入物をＥｃｏＲｌで切断し、制限酵素マフピングによる分析のためサブクローニングした。一つの６５０塩基対の挿入片を、その制限パターンに基づいてプロトロンビンｃＤＮＡの３゛末端と取り敢えず推定した。この推定は、ＭａｘａｍおよびＧｉ　１ｂｅｒｔ、６５＋　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、４９９　（１９８０）の方法による化学的開裂を用いたヌクレオチド配列分析で確認した。

プロトロンビンの完全長コード配列を得るため、シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）２１　（Ｔｏｏｌｅら、３１３．Ｎａｔｕｒｅ、３４２　（１９８４）に記載されている）中のヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーを、Ｂｅｎｔ。

ｎおよびＤａｖｉｓ、１９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ１８０（１９７７）の方法でスクリーニングした。ヒトへバトーマ発現ライブラリーから得られたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入片に由来するプロトロンビンｃＤＮ−Ａのｉｉｉ！ｌｌｉ！フラグメントを、”Ｐ−ｄＣＴＰおよびＦｅｉｎｂｅｒｇら、１３２．Ａｎａｌ、ＢＬｏｃｈｅｍ−，６（１９８３）に記載されたＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いてランダム・ヘキサヌクレオチド・プライミングで、約ＩＯ”ｃｐｍ／ｐｇの比活性に放射標識した一９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，９００５Ｍ塩化ナトリウム、５×デンハーツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、２３．Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ｒｅ５−　Ｃｏｍｍ＋　５４１（１９６６）に記載されている）、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のドデシル硫酸ナトリウムで６８℃１６時間のハイブリダイゼーションに引き続き、３０１１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムて充分に洗浄した。

二つの陽性物をプラーク法で純化し、前記）１ｅ１ｍｓの方法で７１−ジＤＮＡをプレート溶解物から単離した。

ｃＤＮＡ挿入片の所望ｖｉ限フラグメントを適当なＭ１３ベクター中へサブクローンしくＮｏｒｒａｎｄｅｓ、２６、Ｇｅｎｅ、１０１　（１９８３）に記載された一般的方法による）、制限酵素マフピングおよびＳａｎｇｅｒら、７４．Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ−Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ、５４６３　（１９７７）のジデオキシヌクレオチド・チェーンターミネーシＷン法で配列決定を行った。

プロトロンビン　プラスミドの　γ １」生コニ又二−ヱニ［」−完全長のプロトロンビンコード配列は、各挿入片を一つのＨｉｎｄｌ［［部位で消化し、適当なフラグメントをｍｐ　１８にクローニングすることにより、重複した二つのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入片から再構成した。

そして、完全プロトロンビン配列をコードするｌ　ＯｋｂのＥｃｏＲ１フラグメント（プレプロペプチドをコードするＤＮＡも含む）を単離し、Ｔｏｏｌｅら、（１９８６）Ｐ、Ｎ、Ａ−ｉ　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、８３．５９３９に記載されている哺乳類発現ベクター、ｐＭＴ２のＥｃｏＲ１部位に挿入した。得られたプロトロンビン発現プラスミド、ｐＭＴ２−ＰＴは、制限酵素マフピングによりプロトロンビンコード領域をアデノウィルス主後期プロモーターに対して正しい向きに含むことが判明した。

このプロトロンビンｃＤＮＡは第２図に示すプレペプチドコード配列を、前記ｐｅｇｅｎらの第２図に与えられているプロトロンビンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの残り部分に融合して含んでいた。

細己ｔ　、ｎＮＡｐ”転　、および細胞ラインの選択ジヒドロ葉酸還元酵素欠損のチャ′イニーズハムスターの卵巣細胞ライン、ＣＨＯＤＵＫＸ−Ｂｌｌを、ｃｈａｉｓら、７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、４２１６　（１９８０）およびＫａｕｆｒｎａｎら。

１５９、Ｍｏ１．Ｂｉｏ、６０１　（１９８２）に記載されているようにして増殖させ、維持した。細胞を２０μ冨のプロトロンビン発現プラスミド、ｐＭＴ２ −ＰＴで、Ｋａｕｆｍａｎら＊　１９５．Ｍｏ１．Ｂｉｏ、６０１（１９８２）に記載されているようにして、リン酸カルシウム共沈澱法で形質転換した０、形質転換の後に細胞を、１０％熱不活性化ウシつ児血清、５μｇ／履ｌのビタミンに＊　（Ａｑｕａｍｅｐｈｙｔｏｎ、Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｍｅ社）、およびチミジン、アデノシン、デオキシアデノシン、ペニシリンおよびストレプトマイシン（各１０　ｔｚｇ　／−１）を含みヌクレオシドを含まないα−変性イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社）で増殖させた。細胞を２日後にヌクレオシドを除去し、そして透析＊清を用いた点以外は同じ培地（選択培地）で継代した。形質転換細胞は、継代後１０〜１２日後にコロニーが見えるようになるまで、３〜４日毎に選択培地を交換した。これらの初期形質転換体をプールし、コンフルエント状態になるまで選択培地で増殖させた。コンフルエント状態において、１０ｃ■の培養皿は約１−７Ｘ１０フ細胞を培地１（＋＋＋１中に含んていた。フラスコ内のコンフルエントのＪＩｒｌに３〜４日毎に数週間にわたり培地交換をすることにより、大量のコンディシッンド培地を回収した。このコンディジ鳶ンド培地を必要時まで一２０℃で保存した。

白　”および　のヒトプロトロンビンは、血漿からクエン酸バリウム吸着、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー、およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−１６０７（１９７５）およびＭｉｌｅｔｉｃｈら、２５３．Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、６９０８　（１９７Ｂ）により記載された方法による、デキストランセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。異常（デスーＴ−カルボキシル化）ヒトプロトロンビンは、血漿からＤＥＡＥセファセルクロマトグラフィーおよびＢｌａｎｃｈａｒｄら、１０１．Ｊ−Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ。

Ｍｅｄ−２４２（１９８３）に記載された抗プロトロンビンセファロースでのアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製プロトロンビンの蛋白含量は、２８０ｎｍのＡＩ％を１４．４として測定した。プロトロンビンおよび異常プロトロンビンは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ。

Ｔｏ　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ−２１４（１９８０）の方法により、Ｎａ”’ Ｉで沃素標識した。

家兎抗−プロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）抗体は、上記Ｂｌａｎｃｈａｒｄに記載されたようにして、Ｃａ　（ＩＩ）の存在下にプロトロンビン−セファロース上の免疫アフィニティークロマトグラフィーおよびＥＤＴＡでの溶出で精製した。

ＥＤＴＡの存在下でプロトロンビン−セファロースに結合した抗−プロトロンビン抗体は、４Ｍグアニジン塩酸塩で溶出し、抗−全プロトロンビン抗体と命名した。抗−異常プロトロンとン抗体は、Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１０１．Ｊ、Ｌａｂ−ＣＩ　ｉｎ、Ｍｅｄ−２４２（１９８３）に記載されたようにして、デス− γ−カルボキシル化プロトロンビン−セファロースによる連続免疫アフィニティークロマトグラフィーで調製した。抗−ブロトロンビン：Ｍｇ（ＩＩ）および抗 −ブロトロンビン：Ｃａ　（Ｉ　Ｉ）−特異的抗体は、前記Ｂｃｒ　ｏｗｓ　ｋ　ｉの記載した方法に従って、Ｍｇ（ＩＩ）またはＣａ　（Ｉ　Ｉ）の何れか存在下でのプロトロンビン−セファロースによる連続免疫アフィニティークロマトクラフィーおよびＥＤＴＡでの溶出により調製した。

ｉ！オイムノアフセ随抗プロトロンビン抗体からのＩｚＳ■ａｍプロトロンビンの置換は、競合ラジオイムノアッセイを用いて調べた。

抗−全プロトロンビン抗体（１，、ＩＸＩ／１０’Ｍ）をＩｔＳｌ−標識プロトロンビン（１，７Ｘ１／Ｘ　Ｏ”Ｍ）および種々の濃度の競合剤を含む反応混合物に添加した。

全ての成分は１　ｍＭベンズアミジン、０．１％牛血清アルブミン、３纏ＭＥＤＴ、Ａおよび担体としての家兎ガンマグロブリンを含むトリス緩衝塩類液で希釈した。抗−ブロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）抗体（３，４Ｘ１／１０”Ｍ）、抗− プロトロンビン：Ｍｇ　（Ｉ　Ｉ）抗体（１，ＯＸＩ／ＩＯ’Ｍ＞または抗−ブロトロンビン：Ｃａ（ＩＩ）特異的抗体（１，３Ｘ１／１０”Ｍ）は、ＥＤＴＡの代わりに３ｍＭの塩化カルシウムを用いた以外は同じ反応混合物に加えた。抗 −Ｘ　？プロトロンビン抗体（４゜Ｏｘｌ／１０’Ｍ）は、′！ＳＩ−標識異常プロトロンビン（２，８ｘ　１　／１０　”Ｍ）および３ＩＩＩＭのＥＤＴＡを含む同様の混合物に添加した。４℃て一夜インキュベートした後、結合した＋！５１−標識プロトロンビンもしくは異常プロトロンビンは、山羊抗−家兎免疫グロブリンの添加により沈澱させた。形成された沈澱を遠心分離で除去し、ベックマンガンマ５ｏｏｏスペクトロメーターで１１！５Ｈの既知濃度を用いて８準曲線を作成した。

組み換えプロトロンビンの　１組み換えプロトロンビンは、調製培地から、前記Ｂ。

ｒｏｗｓｋｉにより、およびＬ　ｉ　ｅ　ｂ　ｍ　ａ　ｎら、８２゜Ｐｒｏｃ− Ｎａ　ｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、３８７９（１９８５）に記載されたように、コンホメーシ９ンー特異的抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製した。使用した抗体、抗−プロトロンビン：Ｃａ　（Ｉ　Ｉ）は、全屈イオンの存在下でＴ−カルボキシル化プロトロンビン上に発現される抗原決定基に結合する。１０ｍＭ塩化カルシウムおよび０．０２％ナトリウムアジドを含有する調製培地を、抗−プロトロンビン：Ｃａ　（Ｉ　Ｉ）セファロースのカラムに４℃で導入した。１０ｍＭ塩化カルシウムおよび０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス緩衝塩類液で、充分に洗浄した後、このカラムをトリス緩衝塩類液中の１０＋ｍＭ　ＥＤＴＡで溶出した。精Ｍ　８１み換えプロトロンビンの蛋白濃度は、２８０ｎｍのＡ＋％を１４．４として測定した。電気泳動は、　゛ミドゲル上で行った。サンプルはゲル上に負荷する前に、２−メルカプトエタノールを含むサンプルバフファーで５分間１００℃でインキュベートした。泳動後ゲルをコマシーブルー　Ｒ−２５０で染色した。

プロトロンビン凝固アッセイプロトロンビンの活性は、前記ＢＩａｎｅｈａｒｄの記載した、プロトロンビン欠損血漿を用いた二段・階アフセイて測定した。標準曲線を作成するためには、既知濃度のヒトプロトロンビンを用いた。

アミノ末端配自動化エドマン分解は、アプライド・バイオシステムス・モデル４７０Ａ・ガスフェーズ蛋白配列決定装置に、モデル１２０　ＰＴＨアナライザーを取り付けて行った。

組み換えプロトロンビンは、分析前にＲＰ−３００ブラウンリー・ガード・カートリッジ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅｇｕａｒｄ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を用いて、高圧液体クロマトグラフィーで脱塩した。

一カルボキシル化グルタミン　ｒアミノ酸分析は、べ７クマン・モデル１１９ＣＬアミノ酸分析装置に、ベックマン・モデル１２６データシステムを取り付けて実施した。蛋白質は、Ｈａｕｓｃｈｋａ、８０．Ａｎａ　１．Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、、２１２　（１９７７）に記載されたようにして、２Ｍ水酸化カリウム中で１１０℃で２２時間加水分解した。

Ｔ−カルボキシル化グルタミン酸組成は、アルカリ加水分解の後、ニンヒドリン検出システムを用いて自動化アミノ酸分析法て定成熟ヒト第■因子に結合したプロトロンビンのプレプロペプチドからなるハイブリッド分子のコード配列は、ファージベクター中でミエータジェネシスを行い、次のようにして造成した。

列は前記Ｋ　ａ　ｕ　ｒ　ｍ　ａ　ｎらに記載されている。このプラスミドｐＭＴ２−ＩＸを制限酵素Ｐｓｔｌで切断し、得られた２、５ｋｂのフラグメントを標準的方法でゲル精製した。このフラグメントを広く入手可能なファージベクターｍｐ８のＰｓｔ１部位に挿入した。第■因子コード配列をベクター中に所望の向きで含むクローンを、酵素ＥｃｏＲＶおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化したときの２．Ｏｋｂフラグメントの存在で同定した。このベクターをｍｐ８−■と命名した。

プロトロンビンのプレプロ領域のコード配列を含むＣＤＮＡ配列は、ｍｐ１８− ＰＴを制限酵、１Ｈｉｎｄｌｌで切断し、標準的方法で３５０ｂｐフラグメントを単離することにより得られた。Ｍｐ　１　Ｂ−ＰＴは、本明細書に騒に記載したが、Ｊｏｒｇｃｎｓｅｎら＋　Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１゜Ｃｈｅｍ、、１９８７にも記載されている。この３５０１）Ｐフラグメントをｍｐ８１ＸのＨ３ｎｄｌ［［部位に挿入した。この挿入片を第■因子に対して正しい向きに含むクローンは、酵素ＸｈｏｌおよびＢｇ１文での消化を行ったときに１．０ｋｂフラグメントが存在することにより同定した。この第■因子のコード配列のＨｉｎｄｎｌフラグメントを含む構成物は、ｍｐ８−ＰＴ／ＩＸと命名した。

プロトロンビンのリーダー配列をコードする配列から成熟第■因子をコードする配列ヘスプライスするため、０ｏｓｔｒａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０４．４５６に記載された方法で、中間のヌクレオチド配列を合成オリゴヌクレオチドを用いた「ループアウト」ミエータジェネシスで除去した。即ち、ＥｃｏＲ］で切断した一本鎖ｍｐ８−ＰＴ／ＩＸおよび一本鎖ｍｐ１８の間にヘテロ二本鎖を形成した。このヘテロ二本鎖は、突然変異のためのプライマーをアニールさせるための一本鎖部分を含んでいる。一本ｔｆｔｒｎｐ８　ＰＴ／ＩＸを形成するため、大腸菌（ＴＧ　１株）をこのベクターで形質転換し、一つのプラークを拾いあげ、標準的方法で一本鎖テンプレートを調製した。このヘテロ二本鎖の第二鎖のためには、ｍｐ１８を制限酵素ＥｃｏＲ１で直線化した。このヘテロ二本鎖を形成するため、２ｐｇの直線化ｍ　ｐ　１８およびｉ−ｓμｇのｍ　ｐ　８− 　Ｐ　Ｔ　／　ＩＸを最終容量１．５μｍに混合し、ＩＮのＮａＯＨを４μｌ加えて変性させた。

して中和した。変性ＤＮＡ（４０μｌ）を再アニールさせるため、混合物を一夜６８℃でインキュベートし、数時間かけて徐々に室温に冷却した。得られたアニール化ＤＮＡの一部には、所望へテロ二本鎖分子が含まれていた。

適当な突然変異オリゴヌクレオチドのへテロ二本鎖へのアニーリングは、削除すべき一本鎖を含むループを形成した。残っている一本鎖のギャップは、プライマーの延長および末端結合（ライゲージロン）で埋めた。使用した突然変異プライマーは、３１−ｍａｒの、５゛−ＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＧであり、所望のハイブリッドコード配列を与えるために、 −緒にすべき領域に相補する１３塩基のブロックおよび１８塩基のブロックからなるものであった。

このオリゴヌクレオチドは、アブライドーバイオシステムス３８０Ｂ合成装置で合成し、使用前にゲル精製した。

このプライマーをマニアチスらの標準的反応混合物中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′　ホスホリル化し、その２．！１１　（１０ｐｍｏｌ）を４０μｌ　（０，１ｐ　ｍ　ｏ　ｌ　）のへテロ二本鎖混合物と混合した。このアニーリング反応は、６８℃で２．５時間加熱し、徐々に１５℃に冷却することにより行った。このプライマーに、２０ｓＭ　Ｍｇ　Ｃ１ｚ　：　４０ｍＭジチオスレイトール；２１１ＭＡＴＰ、各１ｍＭ（Ｆ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ　：　ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のクレノーフラグメント５単位および０．５単位Ｔ４リガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｓ）を含む８μＩを添加した後、１５℃で４時間インキュベートする間に、このプライマーを延長し、部ｐＦ　マイナス）を形質転換した。

プラークは突然変異させたｍｐ１ｇ鎖を含むＤＮＡで形質転換した大腸菌からのみ得られたが、これはｍ　ｐ　８はアンバー突然変異を有するためである。ＦＡ性プラークからのＤＮＡを大腸菌の形質転換に用いた。一つの陽性プラークを拾い上げ、一本鎖テンプレートをｇ製してＤＮＡの配列を決定した。

さらに、この単離クローンが所望突然変異のみを含み他の突然変異を含まないことを確認するため、制限酵素マフピングを充分に行った。

以上の技術により、成熟第■因子コード配列のアミノ末端に直接隣接するプロトロンビンプレプロ領域をコードする配列（ｐ　ｒ　ｅ　ｐ　ｒ　ｏ　ＰＲ／ＩＸ、）を、所望構成物としてｒＩ！Ｉ５Ｉシた。この配列を哺乳類発現ベクターｐ　Ｍ　Ｔ　２に挿入するためには、ｐｒｅｐｒｏＰＲ／ＩＸは、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いてｍｐ１８ベクターから切り出さ汰ｐＭＴ２のＥｃｏＲ１部位に挿入することができる。クローンは、酵素ＢｇｌｎおよびＥｃｏＲＶで制限消化したとき、６００ｂｐフラグメントが存在することにより同定される。このプラスミドｐＭＴ２−ＰＴ／ＩＸは、前記のとおり、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞を形質転換して、成熟プロセス化第■因子を生産するために使用できる０発現された第■因子はＴ−カルボキシル化されており、生物学的に活性である。

血立旦１他の態様は、請求の範囲内である０例えば、第■因子、プロティンＣ，プロティンＳ５第Ｘ因子、プロティンｚ１オステオカルシン、および骨Ｇｌａマトリックス蛋白質を含めて他のビタミンに依存性蛋白質もそれらのＮ−末端をプロプロトロンビンのプロペプチド配列に結合することができる。結合ＤＮＡを含むベクターはり乳類細胞た形で発現推せることができる。

第■因子はプロトロンビンの完全リーダー配列に結合しているが、本発明の効果である発現される蛋白質の完全カルボキシル化を得るためには、プロプロトロンビンペプチドの／ロペプチド部分をコードしている領域のみが必須であることを理解すべきである。従って、第■因子の完全リーダー配列をコードするＤＮＡでプロトロンビンのリーダー配列をコードするＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ’ｉａ投する代わりに、必要なことは、プロ第■因子ペプチドをコードするＤＮＡをプロプロトロンビンのプロペプチドをコードするＤＮＡで置換することのみである。

ＭｅｆＡｌａ　Ｈ７ｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕのｔｓ　ＳｅｒＰｍ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｒｑ　！；ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ＡｒｇＭｅｆＡｌａ　Ｈ７ｓ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ、−。

５′ ＡＧＣＴＧＡ　ＣＡＣＡＣＴ浄キ（内容に変更なし）０００１　ＯＯＩ　ＯＪ　ＩＤ　０ＯＯＩ　ＯＯｌ　ａＩ　ＬＯｏｏｏｔ　ｏｏｔ　ａｔ　ｔｏ　ａｏｏ’ｔ　ａｏｔ　ｃｕ　ｔ、。

［琵奈”　Ｅ、ｕｑ／ｍｌ　［拍材Ｊ］ア呻ＩＦＩＧ、　４手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８７１０３０１５２、発明の名称組み換えビタミンに依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名　称　二ニー・イングランド・メディカル会センター４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正の対象国際調査報告ＩＮｌ、Ｎ、ｌ１ｌｌＡ・ｌ　Ａ帥ｂ１１ｂ？？〜・：’ＣＴ、’ｊＳ８７１０３０：５ｍｙ＋ａ＋＋ａ＊ｓ°ａｅｅｗａ＋、ａｅ　Ｎｅ、、、、、、、二Ｓε 、　、　Ｏ，Ｏ二５

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトビタミンＫ−依存性蛋白質をコードする第一ＤＮＡ配列と、その５′末端に融合し、前記蛋白質たコードする前記第一ＤＮＡ配列に天然に付随するプロペプチドのコード配列とは同一でない第二ＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ配列であって；前記の天然不存在プロペプチドコード配列は、組み換え真核細胞中で前記蛋白質が発現されるとき、該蛋白質のｒ−カルボキシル化を促進することが出来るプロペプチドをコードすることができるものである：ＤＮＡ配列。
２．第二ＤＮＡ配列が、ビタミンＫ−依存性蛋白質に天然に伴うプロペプチドよりもプロトロンビンのプロペプチドに近いアミノ酸配列を持つプロペプチドをコードする、請求項１記載のＤＮＡ配列。
３．第二ＤＮＡ配列がヒトプロトロンビンのプロペプチドをコードする、請求２項記載のＤＮＡ配列。
４．ビタミンＫ−依存性蛋白質が第ＩＸ因子である請求項１記載のＤＮＡ配列。
５．ビタミンＫ−依存性蛋白質が第ＶＩＩ因子である請求項１記載のＤＮＡ配列。
６．ビタミンＫ−依存性蛋白質がプロテインＣである請求項１記載のＤＮＡ配列。
７．ビタミンＫ−依存性蛋白質がプロテインＳである請求項１記載のＤＮＡ配列。
８．ビタミンＫ−依存性蛋白質が第Ｘ因子である請求項１記載のＤＮＡ配列。
９．ビタミンＫ−依存性蛋白質がプロテインＺである請求項１記載のＤＮＡ配列。
１０．ビタミンＫ−依存性蛋白質がオステオカルシンである請求項１記載のＤＮＡ配列。
１１．ビタミンＫ−依存性蛋白質が骨Ｇｌａマトリックス蛋白質である請求項１記載のＤＮＡ配列。
１２．第一ＤＮＡ配列がプロトロンビンのプレプロペプチドをコードする請求項１記載のＤＮＡ配列。
１３．請求項１記載のＤＮＡ配列を有するベクター。
１４．プロトロンビンのプレペプチドをコードする配列を含む、ヒトプロトロンビンをコードする純化ＤＮＡ配列。
１５．請求項１４記載のＤＮＡ配列を有するベクター。
１６．請求項１記載のＤＮＡ配列を用意し、該ＤＮＡ配列を哺乳類用の発現ベクターに挿入し、該ベクターを哺乳類細胞中に形質転換し、そして該細胞を培養して、ｒ−カルボキシル化の改善されたビタミンＫ−依存性蛋白質を生産させる、ことよりなるｒ−カルボキシル化の改善されたヒトのビタミンＫ−依存性蛋白質の製造方法。