JPS61502095A - 第９因子を発現するベクタ−、該ベクタ−により変換された細胞及び第９因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 第１Ｘ因子を発現するベクター、該ベクターにより変換された細胞及び第■因子 の製造方法本発明は、ヒト第１Ｘ因子または類似分子を産生ずる細胞系の構成に 関する。

第■因子は、血液凝固過程に関与する蛋白である。第■因子は、チモーゲンの形 で合成され、翻訳後に炭化水素鎖に゛付加、アスパラギン酸の水酸化及び１２個 のグルタミン酸のγ−カルボキシーグルタミン酸への転換により修飾される。後 者の修飾は、ビタミンＫに依存している（ベルチナら、１９８１年）。

肝臓が、第■因子の合成部位である。

第■因子は、血友病患者の血中では活性が低いかあるいは存在しない。血友病Ｂ は、もつと頻度の高い形の血友病、即ち、血友病Ａと同様に、出血時間が非常に 長いことが特徴である。これは、劣性伴性体貿の形で遺伝するくベドナーら、１ ９８２年）。

第１Ｘ因子欠損の分子特性は、明らかではない。

第■因子を血友病Ｂ患者に与えると、出血時間は正常に回復する。

現在のところ、第１Ｘ因子の唯一の利用源は、ヒト血漿であるが、場合によって は相応するウシ蛋白を使用することができる。

第■因子製剤は、パイロジ−ニック（発熱を起こす）であることがおり、また、 病原因子または肝炎ウィルスのようなウィルスおよびエイズ（Ａ、１．Ｄ、Ｓ。

）のベクター因子で汚染されている危険性がおる。

このため、極めて純度の高い第１Ｘ因子の製造方法の開発に関心がもたれている 。第１Ｘ因子のＣＤＮＡの分子クローニングおよび特定の宿主細胞中でのその発 現は、前述の危険性や合併症をもたらさない第■因子製剤を得るのに適切な方法 である。

本発明は、第１Ｘ因子のＣＤＮＡのクローニングおよび以下の宿主細胞中で第１ Ｘ因子を発現させるプラスミド因子の開発に関する： １）細菌、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ。

大腸菌）： ２）酵母、特にサツカロミセス・セレビシェ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃ ｅｒｅＶｉＳｉａｅ）　；３）哺乳動物細胞。

各種宿主細胞は、組換えＤＮＡの技術によって、特異抗原により免疫学的に認識 され得る第■因子の蛋白を合成することができる。

本発明は、少な（とも、 一細胞中の第■因子類似蛋白をコードするＤＮＡ配列：ＤＮＡ、ＦＩＸニ ー前記細胞中でこの配列を発現させる諸要素を含むことを特徴とする細胞中筒１ Ｘ因子類似蛋白のクローニング・発現ベクターに関する。

これらベクターは、ざらに、前記細胞中での複製開始点を含み、前記細胞中で発 現する正の選択特性をコードする。

一般に、本明細書の記載において、１゛第■因子類似蛋白」とは、第■因子自体 あるいは同じタイプのインビボ生物活性または関連した活性を有する蛋白を指す ものとするが、特に、おる範囲のアミノ酸に関して第■囚子と同じ構造を有する 蛋白、または第■因子の完全な分子の本来の活性を有する第１Ｘ因子の断片であ ってもよい。

ベクターの諸要素のさらに細かな特徴は、もちろん、宿主細胞に依存している。

上と風回里ユ皇１ 宿主細胞が細菌、例えば、大腸菌である場合、これらベクターの本質的成分は、 １）細菌中での複製開始点； ２）形質転換体の正の選択を可能ならしめる抗生物質耐性を発現する遺伝子； ３）リポソーム固定部位を伴う、調節可能なプロモーターである。

プロモーターならびにリポソーム固定部位の下流には、異種遺伝子挿入のため少 なくとも１つの制限部位があり、本発明の場合、ＣＤＮＡは、調節可能なプロモ ーターならびにリポソーム固定部位の制御下に発現されるはずの第ｔＸ因子また はアナローブをコードする。

ベクターには複製開始点が存在することが、相応する細菌細胞中でベクターを複 製させるのに必須であり、特に大腸菌の場合、プラスミドｐＢＲ３２２の複製開 始点を使用するのが好ましい。このプラスミドｐＢＲ３２２は、事実、使用し得 るプロモーターのうち、λバクテリオファージ、特に、λＰしなる記号で表示さ れる左側の主要なプロモーター（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　１ｅｆｔ−ｈａｎｄ　ｐ ｒｏｍｏｔｏｒ）が好ましいものと思われる。λＰ［はλの早期転写に関与する 強力なプロモーターである。

また、λバクテリオファージの他のプロモーター、特に右側プロモーター（ｒ　 ！Ｑｈｔ−１１ａｎｄ　Ｉ）ｒｏｍｏ［ｏｒ　＞　Ｐ　Ｒ，または二番目の右側 プロモーターＰ′□を使用することも可能である。

リポソーム固定部位、または極めて多様な翻訳の開始配列を使用することが可能 と思われるが、λｃ　ＩＩｒｂｓと呼ばれるλバクテリオファージの蛋白Ｃ■の それを使用するのが好ましい。

後に明らかにされる様に、合成配列、特に配列：ＡＴＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡ ＧＡＴＣＴＡＴＧの全部または一部を使用することも可能である。

ざらに、関与すべきベクターは、例えば、λＮの記号で示されるλのＮ遺伝子に よってコードされた転写抗終結機在下では、ＰＬからの転写は、大多数の停止シ グナルを越えて継続する。

このことは、そのような停止シグナルの存在する異種遺伝子がクローン化された 時起こり得る転写の早期停止により生じる問題を回避する。さらにＰＬからの発 現はＮ十の環境において改善されることが明らかにされている。

しかしながら、この機能の存在は、絶対的に必要なものではない。

異種蛋白の連続大量生産の場合の宿主ベクター系の毒性および不安定性の問題を 回避するため、プロモーターの活性を制御する系を加えることが必要で必る。

異種蛍白合成の温度による制卸は、宿主細菌中にコードされた熱感受性レプレッ サー、例えばＰＬ活性を２８°Ｃで抑えるが４２°Ｃで不活性化されるｃ工８５ ７により、転写段階で行なうのが好ましい。このレプレッサー・は、プロモータ ーＰ、に隣接するオペレーター・ＯＬに作用する。先の場合、熱誘発性発現系の 一部は宿主細菌の不可欠な部分であるが、この系にベクター自体の一部を形成さ れるようにすることが可能である。

以下に記載の、大腸菌中で第１Ｘ因子を発現させるのに使用される特異的ベクタ ー（ｐＴＧ９５１）の場合、抗生物質耐性は、細菌にアンピシリン耐性を与える β−ラクタマーゼの遺伝子（ＡＭｐ　）によって得られるが、別の耐性遺伝子を 使用することもできる。

アンピシリンが培養培地中に存在する場合には、β−ラクタマーゼの遺伝子を発 現する細胞のみが発育し得る。このように、抗生物質耐性が発現ベクターに存在 すれば、このプラスミドを保持する細胞のみが発育可能である。

以下の実施例には、おる種のベクター、特に、大腸菌中で第１Ｘ因子を発現させ るｐＴＧ３２０の製造を記載する。

本発明は、さらに、本発明によるベクターにより既知の方法により形質転換され た細菌、特に大腸菌株に関するものであり、そのうちのあるものについては、実 施例中で再び言及する。

・最後に、本発明は、培養培地で前述のように形質転換された細菌を培養し、生 成した第■因子を回収する第１Ｘ囚子の製造方法に関する。

使用する培地は当業者には既知のものであり、各培養菌株に適用されるものであ る。培養は、好ましくは、形質転換された菌株が耐性を示す抗生物質の存在下に 行う。

第１Ｘ因子は、細胞を破壊した後、アフイニテイカラムクロマ１〜グラフィまた は排除クロマトグラフィでの分離等の既知の方法により精製する。

本発明は当然、他の側面、特に実施例に記載の細菌プラスミドならびにそれらの 変異種および誘導体、および一般に形質転換された細菌の発酵法ならびにそのよ うにして得られた第■因子を包含する。

２）酵母 酵母中の第■因子発現ベクターの成分は、大腸菌中での発現ベクターに使用され るものと類似のものである。

これらのベクターは、 １）酵母中での複製開始点、 ２）調節可能な酵母プロモーター、および転写ターミネータ−１ ３）酵母に適用し得る選択系、 ４）大腸菌中での複製開始点、 ５）大腸菌中での抗生物質耐性発現遺伝子を含んでいる。

酵母中での第１Ｘ囚子発現に使用されるベクター（ｐＴＧ８３４）は二つの複製 開始点を含んでいる。第一の開始点、即ちｐＢＲ３２２のそれは大腸菌中での複 製を可能とし、一方、酵母のプラスミド２μ由来の第二の開始点は、酵母中での プラスミド複製を可能にする。

抗生物質耐性は、大腸菌においてアンピシリン耐性を与え、従って選択マーカー を与えるβ−ラクタマーゼの遺伝子により供与される。

このベクターは、また、ｕｒａ３−酵母での相応する変異を相補する（　ｃｏｍ ｐ　ｌ　ｅｍｅｎｔ　）酵母ＵＲＡ３の遺伝子を含んでいる。最小培地では、こ れは、プラスミド保有細胞を選択する選択系として使用できる。

異種遺伝子発現のプロモーターおよび転写ターミネータ−は、酵母ホスホグリセ ラード−キナーゼ（ｐＫＧ＞の遺伝子に由来する。発現されねばならない異種遺 伝子は、プロモーターとｐＧＫのター携ネーターとの間に位置する単一のＢｇＱ 　Ｉ［部位においてクローン化される。

３）＠乳動物細胞 宿主細胞が動物細胞でおる場合、発現要素は、ウィルスゲノム、例えばＳＶ４０ 　（シミアンウィルス４０、ポリオーマウィルス）またはＢＰＶ　（牛パピロー マウィルス、乳頭腫ウィルス）のようなパポーバビリジエ族のウィルスに最も多 く由来する。しかしながら、アデノウィルスのような他のウィルスを使用するこ とも可能でおる。

本発明によるベクターの発現要素は、ウィルス起源のプロモーターを少なくとも １つ含む。即ち、ＳＶ４０由来ベクターにおいては、後期または初期遺伝子のプ ロモーターを使用することができるが、前記プロモーターは別のウィルスに由来 するものであってもよい。即ち、ＢＰＶ由来ベクターにおいては、単純ヘルペス ウィルスのチミジンキナーゼの遺伝子プロモーターが使用される。

発現を改善するため、本発明によるベクターは、クローン化されたＤＮＡ配列の 末端にイントロンおよびポリアデニル化部位をこの順序を含んでいてもよい。こ こでも、これら諸要素は、ベクターウィルスに由来するものであっても、外因性 であってもよい。即ち、８ＰＶベクターにおいては、ポリアデニル化部位はＳＶ ４０に由来する。使用し得るイントロンのうち、ウサギβ−グロブリン遺伝子の イントロンエが言及されねばならないが、これに限られるものではない。

最後に、自律的発現ベクターは、宿主細胞中において複製されることができねば ならず、該ベクターは、複製開始点、例えばＳＶ４０またはＢＰＶの複製開始点 を含んでいなければならない。ざらに、このベクターは、必要な場合には、ＳＶ ４０に対する抗原Ｔのような前記細胞中でのその維持や複製に必要な蛋白を発現 することができねばならない。

ある場合には、これら要素全てを含むベクターは、大がかりになりすぎ使用し得 なくなることがある。この場合、ベクターの維持および複製に必要な要素のある ものは、別のベクターにより導入するかまたは、ベクター中の相応する部分を除 去可能にすることにより細胞自体に生産させることができる。

ある場合には１１発現ベクター中に宿主細胞中のマーカー、正または負の選択遺 伝子、例えば特定の化合物に対する耐性遺伝子を導入することは興味あることか もしれない。ＢＰＶ構築の場合、この遺伝子は細胞にメトトレキサート耐性を与 えるｄｈｆｒ　（ジヒドロホラートリダクターゼ）をコードする遺伝子である。

この選択遺伝子は、宿主細胞中でのベクターの処置を容易にし、場合によっては 、ベクターの維持を可能ならしめる。

このようにして得られたベクターは、既知の方法により相応する真核細胞を形質 転換するのに使用される。

哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは、例えば、細胞ＤＮＡの場合のウ ィグラー等（１９７８年）記載の方法、プロトプラスト融合法または微量注入法 により行うことができ、ベクターがウィルス形の場合は他の方法が知られている 。

哺乳動物宿主細胞は、種々のものであってよいが、使用されるベクターに適合さ せる。

形質転換されたまたはトランスフェクションされた細胞は、それらの発育を可能 ならしめる適切な培地で培養される。

培養後、細胞を集め、第■因子蛋白は、蛋白および抗原の精製分野において既知 の方法により、単離することができる。

本発明は、また、形質転換された酵母および哺乳動物細胞、これら細胞または酵 母の培養法およびこのようにして得られた第１Ｘ因子等、ならびに少なくとも一 部が細菌、酵母または哺乳動物細胞の培養により得られた第１Ｘ因子類似蛋白に 関する。

本発明のその他の特徴および利点は、以下の実施例および添付図面を参照するこ とにより、ざらに良く理解されよう：添付図面において、 一部１図は、修飾された第■因子のプローブの図を示す。

−第２図は、ＦＩＸｃＤＮＡ挿入の配列決定法を示す。

−第３図は、得られた配列決定を示す。

−第４図は、ｐＴＧ３９７のコード領域および３′非コード領域の２５０個のヌ クレオチドを示す。

−第５図は、Ｍ１３ｔＣ１３１１の調製法を示す。

−第６図は、Ｍ１３ｔｇ３１５の調製法を示す。

−第７図は、ｐＴＧ９０７の調製法を示す。

−第８図は、Ｍ１３ｔｑ９１０の調製法を示す。

−第９図は、ｐＴＧ９０８の調製法を示す。

−第１０図は、ｐＴＧ９０９の調製法を示す。

−第１１図は、ｐＴＧ９４１の調製法を示す。

−第１２図は、ｐＴＧ３２０の調製法を示す。

−第１３図は、ｐＴＧ８３２の調製法を示す。

−第１４図は、ｐＭＯＰの構造を示す。

−第１５図は、りＴＧ３２６の調製法を示す。

以下の図の表題は簡略化されているニ ー第１６図は、細菌発酵産物の免疫沈降物の写真である。

−第１７図は、酵母発酵産物の免疫沈降物の写真でおる。

−第１８図は、培養細菌ＮＩＨ３Ｔ３の発酵産物の免疫沈降物の写真である。

一部１９図は、種々のメトトレキサート濃度で培養した以外の点では第１８図と 同一である。

−第２０図は、抗血清での免疫沈降以外の点では第１９図と同一でおる。

一部２１図は、免疫競合でのしＭＴＫ細胞の培養以外の点では第１８図と同一で ある。

一部２２図は、放射性前駆物との培養以外の点では第１８図と同一である。

以下、実施例を下記の順で示す： ａ）ヒト第■因子に対応するＣＤＮＡクローンの獲得およびファージでのＣＤＮ ＡのクローニングＣ）酵母ベクターでのＣＤＮＡのクローニングｄ）１乳動物細 胞用ベクターでのこのＣＤＮＡのクローニング ｅ）これら種々のベクターによる第１Ｘ因子発現の証明ヒト第１Ｘ因子に対応す るＣＤＮＡクローンの獲得ヒト第１Ｘ因子に対応するＣＤＮＡクローンを得るた め、単一合成オリゴヌクレオチドにより構成されたプローブを用いる。ウシ第１ Ｘ因子のアミノ酸配列のみが知られていることを考慮プると、可能な一つの方法 は、ウシ第■因子のクローンがウシ肝臓ＣＤＮＡバンク中に容易に見い出せるよ うにするオリゴヌクレオチドを構成することであろう。

このウシ第１Ｘ因子クローンは、対応するヒトクローンを得るためヒト肝臓ＣＤ ＮＡバンクにおけるプローブとして使用できるでおろう。

驚くべきことに、合成オリゴヌクレオチドを用いてヒト肝１１ｃＤＮＡバンクか ら第■因子のクロ・−ンを直接得ることができた。これにより、ウシ肝臓ＣＤＮ Ａバンクでの第一・選択を行う必要性を回避できた。この方法は、第■因子ＣＤ ＮＡのクローンを得るため今まで用いられてきたあらゆる方法（チヨー等、１９ ８２年；クラチ等、１９８２年）とは異なる：我々は、必らゆる可能なコドンの 配列替えをカバーする短いオリゴヌクレオチド混合物の代りに、単一の非常に長 いオリゴヌクレオチドプローブを使用した。

肝臓を死後に得、速やかに液体窒素中で冷凍した。トルストシェフ等（１９８１ 年）が記載のように、８Ｍ＠ｌグアニジンで抽出する方法を用いて肝臓５ｑから ＲＮＡを調製した。

このようにして得たＲＮＡは、ポリーＡ含有ＲＮＡに富む抽出物を得るために、 仕様書の指示に従ってポリＵ・セファロース（ファルマシア社）カラムのクロマ トグラフに付した。ポリーＡ配列は、オリゴ（ｄＴ＞を「プライマー」としで使 用することにより逆転写の指標として利用でき、ｃＤＮＡは、１００ｍＭＴｒｉ ｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８゜３）、１０ｍＭＭＣＩＣＱ２．５０ｍＭＫＣＱ、３０ｍＭ メルカプトエタノール、１０μＣｌ／ＩＴｌｆ２オリゴ（ｄＴ）、５０μｑ／戚 ポリ−Ａ−ＲＮＡ、各０．５ｍＭのｄＡ、ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄ　 ＣＴ　Ｐ’、ニワトリ筋芽細胞ウィルスの逆転写酵素（ライフサイエンシズ社） ８０単位を含有する試薬１００μＱを用いて合成した。４２°Ｃで４５分後、反 応を終了させ、ＣＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を３分間１０５℃で加熱することにより 変性させ、素早く水浴に移した。

第二ＤＮＡ鎮の合成の場合には、上記の反応混合物を５倍希釈し、１００ｍＭＨ ＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６，９＞、１００ｍＭＫＣＱ、各２００！ｉＭのｄＡＴ Ｐ、ｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰおよび３２Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性００５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ　）で最終 濃度に調整した。その後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断片）（ベーリ ンガーマンハイム社）１０単位を加え、２５°Ｃで２時間培養する。

二重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓｃＤＮＡ）を、１０ｍＭ丁ｒｉｓ　−ＨＣＱ　（ｐＨ８ ，０＞、１ｍＭＥＤＴＡで飽和したフェノールニクロロホルム（５０：５０）の 等容量で抽出し、エタノールで２度沈澱させる。ポリ−Ａ−ＲＮＡ５μＱからｄ ｓｃＤＮＡ約９７０ｎｇが得られる。３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）、 ３００ｍＭＮａＣＱ、３ｍＭＺｎＣＱ２を含有する反応培地０．１−中でヌクレ アーゼ３１５単位を用いて消化することにより末端をフリーにする。３７°Ｃで １時間後、ＥＤ丁ＡおよびＳＤＰを加えてそれぞれ最終濃度１０ｍＭおよび０． １％とし、反応混合物を６５°Ｃで５分間加熱する。続いて、Ｓｌで消化された ｄｓｃＤＮＡを１００ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＱ（１）Ｈ７，５＞、５ｍＭＥＤＴ Ａ、１００ｍＭＮａＣＱ含有の前もって用意した５−２０％のスクロース勾配に 付し、５Ｗ６０Ｔ　ｉ　Ｏ−ターを用いて３００００　ｐｐｍで１５℃で１６時 間遠心分離する。０．５＋ｎＱの両分を集めた。

ＣＤＮＡの大きざを測定するため、各両分の１μ９を中性アガロースゲル電気泳 動にかけ、各画分の移動度を適当な分子量のマーカーと比較する。１キロベース （１千塩基）を上回るＣＤＮＡを含有する両分を集め、支持体としての大腸菌の ｔＲＮＡ５μｑの存在下に一晩、２倍量のエタノールで沈澱させる。沈澱を０． １ＸＳＳＣ（５ｍＭＮａＣＱ、０．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０＞２ ０μＱに懸濁させる。

ホモポリマー末端要素（約１５個のｄＣＭＰ）を、末端デオキシヌクレオチジル トランスフエラーゼを用いて、ＣＤＮＡの３′末端に付加する（デング等、１９ ８１）。

同様にして、ポリ−ｄＧＭＰ（約１０個のｄＧＭＰ）ホモポリマー末端要素を、 ｐｓｔ工制限酵素であらかじめ消化したＤＢＲ３２２プラスミドの３′末端に付 加する。

ポリーＣｄＣＭＰ末端を有するｃＤＮＡ６０ｒｌ（ｌおよび前面の条件下に調製 されたベクター１μｑを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ　（１１７，５）、１００ｍ ＭＮａＣ９中４２℃で２時間加熱する。組換えプラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｔ ；Ｂ２Ｓ３を形質転換しくマレ−等、１９７７）、形質転換体をテトラサイクリ ン１５μＣＪ／ｍ２含有寒天−ＬＢ平板上で選択する。形質転換体３０，０００ 個が得られ、そのうちの約５０％は、１キロベースを上回るｃＤＮＡ挿入片を含 んでいる。全ての形質転換体を最小量のＬＢ中に平板がら取り、グリセロールの 各等量を加えた後、得られたバンクを一２０℃で保存する。

肝臓により合成された牛蛋白に相応するコード配列の１７５５個のヌクレオチド を、優先的に使用されるコドンを立証するために分析する（マツクギリプライ等 、１９８０：チヤツク等、１９８１参照）。我々は５２個の塩基の配列を選択し た。このオリゴヌクレオチドは以下のように構築される； オリゴヌクレオチドＡ　ｄ（ＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＴ ＡＣＴ＞　、Ｂ　、ｄ　（ＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴ ＣＡ＞　、相補断片Ｃｄ　（ＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴ）は、コーり等（１９ ８２＞により既に記載のように、無機固形支持体上でホスホトリエステル法によ り化学的に合成し、グリシン（１９７８＞により記載のように、）−ＩＰＬｃ″ Ｃ″Ｍ製する。

７ｉ１ＪｊヌクＬ／オチドＢＯ８５ｎｍｏ＋ｅを、６０ｍＭＴｒｉｓ７ＨＣＱ　 （ｐＨ７，８）　、６ｍＭＭｇＣＱ２．６ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＡＴＰ、６ｐｍＯ１８３２ｐ−ＡＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ　）　、Ｔ ａポリヌクレオチドキナーゼ２単位を含有する反応培地１０Ｑ中において３７℃ で３０分間培養する。リン酸化された８５’オリゴマーを１０ｍＭＴｒｉｓ　− ＨＣＱ　（ｐｔ−１７，５）、１ｍＭＥＤＡ中でオリゴヌクレオチドＡおよびＱ Ｑ、　５ｎｍｏｌｅと混ぜ、１００℃まで加熱し、混合物を緩除に冷却して４° Ｃにする。

オリゴヌクレオチドＡおよびＢの反応混合物を、６６ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＱ　 （ｐＨ７，５＞、１００ｍＭＮａＣＱ。

７．５ｍＭｆＶ１ｇＣＱ２．２ｍＭジチオスレイトール、００５ｍＭスペルミジ ン、０．２ｍＭＥＤＴＡ。

Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｔ　ｔリガーゼ４単位を含有する反応混合物５０μΩ中において４ ℃で一晩ライゲートする。得られた５２量体を２０％ポリアクリルアミドゲル電 気泳動によりライゲージ゛ヨン混合物から精製する。

ＩＶ、ヒト肝　ＣＤＮＡバンクの分析 約１００００個のコロニーをテトラサイクリン１０μｇ／戒含有ＬＢ寒天平板上 で一晩発育させる。翌日、細菌コロニーをニトロセロースフィルターに移し、フ ィルターを本質的にはグルンスタイン等（１９７９）が記載のようにコロニーバ イブリプ−ジョンのため準備する。最初のテトラサイタリンを含有する°平板上 の残りの細菌を３７°Ｃで数時間再発前させる。

バイブリプ−ジョンプローブは、５２量体１００ｎ（ｌを”　Ｐ−ＡＴＰでカイ ネイションすることにより調製する。

バイブリプ−ジョンは、５ＸＳＳＣおよび１×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ 、大腸菌ｔＲＮＡ５０μ（ＩＩ／ｍ１２の４０ｍＱ中において４８℃で一晩行な う。翌日、フィルターは４２°Ｃで、６ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳの溶液で数回 洗浄する。フィルターを乾燥し、次いで一晩オートラジオグラフにかける。

結果 牛第■因子のアミノ酸配列（カタヤマ等、１９７９、参照）を分析して、若干縮 重したコドンにより決定されるアミノ酸からなる長い配列゛を見い出す。プロー ブは、このように、４つのコドンによりコードされた４つのアミノ酸（ｔｈｒ　 １ｖａｌ　、ｃ＋Ｉｙ　）　、２ツのコドンによりコードされた１２のアミノ酸 （ｇｌｕ　、ｌｙｓ　、　１）ｈｅ　、　ｇｉｎ　、　ｔｌ／ｒ　、　ａＳｐ　 。

ｃｙｓ　）および１つのコドンによりコードされた１つのアミノ酸（ｔｒｐ　） に相応するウシ第■因子の３６−５２番目のアミノ酸に相応するように構築され た（第１図）。

続いて、ウシプロトロンビンおよびウシフィブリノーゲンの５８５個のコドンを 分析し、ＧＴＧバリンコドンは３８回中２１回用いられていることが明らかとな った。同様に、ＴＴＣＪ５よびＴＧＴは、アミノ酸フェニルアラニンおよびシス ティンの場合におけるその他の縮重コドンによりそれぞれ２倍以上頻繁に使用さ れる。

その他の特に顕著な優先的使用は分析から判明しなかった。しかしながら、ある 種のヌクレオチドがある種のコドンの場合第３位、例えばグリシンおよびスレオ ニンの場合のＧ１でまれに見い出される。

さらに、Ｇ：Ｔ対は、塩基体Ｇ：Ｃよりは、安定性に欠けるが、少なくともコロ ニーバイブリプ−ジョン間の５２量体バイブリプージョンの安定化に寄与するで あろうが、Ａ：Ｃ対は寄与しないであろう。

従って、縮重コドンの第３位でＧもしくはＡが選択されるアミノ酸（ｇｌｕ　、 Ｉｙｓ　、　ｇｌｎ　）のいずれについてもＧが選択された：同様に、アミノ酸 チロシンおよびアスパラギン酸の場合Ａに比してＴｔｆｉ選択された。これらの 状況を考慮（）、選択はスレオニンおよびグリシンの場合Ｍ３位にお【ブるヌク レオチドとして丁またはＧに限定されるが、前に示したように、Ｇはスレオニン のコドンの第３位には比較的まれにしか見い出されない。従って、スレオニンの コドンの１つには丁を選択し、５２量体内の二次構造の問題を避けるため、グリ シンには第３位に丁を選択し、スレオニンの第２コドンの第３位にはＡを選択し た。

旦トｃＤＮＡバンクの選択および第１Ｘ因子クローンの同定５２量体プローブが 形成された時、最初の方法は、ウシ肝ｋＥｃＤＮＡバンクを選択するためにこの ５２量体を使用し、次いでヒト肝臓ＣＤＮＡバンクのためのプローブの形でウシ 第１Ｘ因子ｃＤＮＡのこのＣＤＮＡクローンを使用することであった。この方法 は、ウシおよびヒト蛋白のＮ末端でのアミノ酸配列における既知の相同性を一般 化した仮説に基づいている（ディ・シピオ等、１９７７、参照）。

このアミノ酸配列における種間の相同性に基づいて、ウシ肝臓およびヒト肝臓バ ンクの平行選択を行った。

使用したバイブリプ−ジョンおよび洗浄の条件は、５２量体プローブと第■Ｘ因 子ｃＤＮＡの間の実際の相同性が明らかでなかったため、厳密なものではなかっ た。

ウシＣＤＮＡバンクにおける種々のコロニーは、５２量体プローブでの選択によ り正のシグナルを与えた。ヒト肝臓ＣＤＮＡバンクにおいて、用いられた条件下 でシグナルを与えるコロニーが得られた。この研究がヒト第１Ｘ因子のＣＤＮＡ を単離するために行なわれたという事実を考慮して、その他の分析はウシクロー ンでは行わず、あらゆる試みはヒトクローンについて行なった。

このコロニーがヒト第１Ｘ因子に相応することを立証するため、組換えプラスミ ドをＰＳｔ■で消化し、除去されたＣＤＮＡ挿入片をｍｌ　２ｍＤ８ファージに 移入しくメツシング等、１９８２、参照）、次いでジデオキシヌクレオチドを鎮 ターミネータ−として用いて配列させる。得られた配列は、第３図のヌクレオチ ド１−１８０に相応する。推論されたアミノ酸配列は、該クローンがヒト第■因 子ＣＤＮＡクローンであることを確証している。

クローン（ｐＴＧ３９７）のＣＤＮＡ挿入片の最も完全な配列は、マクサムおよ びギルバートの方法（１９８０）またはサンガーの方法を組合せることにより、 Ｍ１３ｍり９においてサブクローン化された制限セグメントから決定される。配 列決定法を第２図に示す。得られた配列を第３図に示す。

結果の考察 単一オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、２．１Ｋｂの挿入片を含 むヒト第１Ｘ因子クローンを単離することかできた。この２．１Ｋｂ挿入片を第 ２ヒト肝臓ＣＤＮＡバンクを分類するプローグとして使用すると、２．６Ｋｂの 挿入片を含む第１Ｘ因子の別の特定のクローン（ｐＴＧ３９８）が単離される。

ｐＴＧ３９８の５′末端は、第３図のヌクレオチド４８０に位置している。この ことは、ｐＴＧ３９７の３′非翻訳末端が不完全でおり、非翻訳３′完全末端は 約１．７Ｋｂの長さを有することを示唆している。

ｐＴＧ３９７の完全コード領域の配列および３′非コード領域の２５０個のヌク レオチドの配列を第４図に示す。

この配列の７５％以上は、２本鎖で確立された。得られたヌクレオチド配列とク ラチおよびディビーにより示された配列との間には、差異が認められる。この差 は、ヌクレオチド５８１でのトランジション（Ｇ−Ａ＞　、それにょるアラニン のスレオニンへの変換を含んでいる。第１Ｘ囚子の連結ペプチドのアミノ酸配列 決定は、この位置にスレオニンが存在することを確証する。これらのデータは、 他の血清蛋白に関して、第１Ｘ因子が多形性であることを示唆している（クーパ ー、１９７８、参照）。

Ｇ：Ｔ置換コドンの使用およびヌクレオチドプローブにおける可能な二次構造排 除を考慮することにより、単一クローンの配列決定のプローブとして十分に使用 し得ることを示す単一５２量体を得ることができた。選択した５２０体は、４３ １５２のヌクレオチドについてクローン化された配列と一致し、一方、２つの誤 射はＧＥＴ対である。

このことは、先に観察された種間ヌクレオチド配列において一致率が８５％であ ることを反映している。

第１Ｘ因子のＣＤＮＡの一般構造 第１Ｘ因子のＣＤＮＡのヌクレオチド配列の知識は、対応する蛋白のコードされ たアミノ酸配列の推測を用意にする。

ｐＴＧ３８７のＣＤＮＡ挿入部は以下のヒト第１Ｘ因子特性を示す： ａ、第■因子は４１５個のアミノ酸を含む蛋白である。第３図において、ヌクレ オチド１４０−１３８４はヒト第１Ｘ因子をコードする。

ｂ、ヒト第■因子は、付着シグナル配列および前蛋白配列を有する前駆体の形で 合成される。これは、分泌されるべきすべての蛋白に共通の性質である。第１Ｘ 囚子の場合、ヌクレオチド２−７６によってコードされた約２５個のアミノ酸の 標準的シグナル配列かめる。このアミノ酸の疎水性伸長部は、細胞の外側へ蛋白 が分泌される間に通常除去される。ヌクレオチド７７−１３９は、おそら（分泌 後素早く第１Ｘ因子の成熟形で除去される前蛋白配列をコードする（ヌクレオチ ド１４０のチロシンで開始する）。

この前蛋白配列の末端でしばしば見られるように、リジンーアルギニンニ塩基ア ミノ酸構造は、前蛋白配列と成熟第１Ｘ因子の第１アミノ酸との接合部に見い出 される。

Ｃ，第１Ｘ因子の活性形（ＩＸａ）は、第■因子の不活性またはチモーゲンから 、活性筒■因子（ＩＸａ）により二つのペプチド結合の加水分解により産生され る。これらのペプチド結合は、アミノ酸アルギニン−アラニン（ヌクレオチド５ ７２−５７７＞の間およびバリン−バリン（ヌクレオチド６７７−６８２＞の間 に認められる。第■因子の活性化の過程で遊離した３５個のアミノ酸から成る最 も長いペプチドは、活性化ペプチドと称されている。

このように、第１Ｘａ因子は、２つのポリペプチド鎖から成っている：即ち、１ ４５個のアミノ酸から成るＬ鎖（ヌクレオチド１４０−５７４＞および２３５個 のアミノ酸から成るＨ鎖（ヌクレオチド６８０−１３８４）である。第１Ｘａ因 子のＬおよびＨ鎖は、ジスルフィド架橋により維持されている。Ｈ鎖は、典型的 なセリン−プロテアーゼの触媒活性における他の重要な残基と同様に、セリン− プロテアーゼの典型的な活性部位（ｍｅｔ−ｐｈｅ−ｃｙｓ−ａ　Ｉ　ａ−ｇ　 Ｉ　ｙ、ヌクレオチド１１８１−１１９５＞を含んでいる。Ｌ鎖は、ビタミンＫ に依・存する過程によってγ−カルボキシル化されてγ−カルボキシーグルタミ ン酸を生じる１２のグルタミン酸単位を含んでいる（第４図参照）。これは、凝 固過程において、第■ａ因子をＣａ＋＋、膜性リン脂質膜および第■ａ因子に固 定させるのに重要である。

ｄ、４つの炭水化物固定部位を有するウシ第１Ｘ因子と反対に、ヒト第■因子に は、炭水化物が付加し得る部位が２カ所ある。これらの部位は、ともに活性化ペ プチド、即ちヌクレオチド６０８−６１６および６３８−６４６に位置しており 、典型的配列ａｓｎ−ｘ−ｔｈｒ／ｓｅｒを含んでいる。対照的に、ウシ第■因 子は、４つの付着炭水化物を有しており、その構造は最近ミズオ等（１９８３） により決定された。

に必　なりローン　ＩＸ因子とｃＤＮＡの調製（第５．６図参照） １）ＴＧ３９６を制限酵素ＰＳｔＩで消化した。ＣＤＮＡバンクは、ｐＢＲ３２ ２のＰｓｔ工部位テノ末端Ｇ／Ｃを介してクローン化され、ざらにｐＴＧ３９７ の第■因子は、内部のＰＳｔＩ認識部位を含んでいないので、この処置は、ＰＳ ｔ工部位でクローン化し得る末端を有する、第１Ｘ因子に相応する無傷のｃＤＮ Ａ　（２，１Ｋｂ＞を遊離する。第１Ｘ因子ＣＤＮＡ断片は、あらがじめＰＳｔ Ｉで消化されアルカリホスファターゼで処理されたＭ１３ＭＩ）８フアージに常 法により移入される。組換えファージは、Ｅ。

ｃｏ　Ｉ　ｉ　ＪＭ１０３をトランスフェクトするのに使用される。

組換えファージＭ１３ｔ（ｌ１３９７Ｂは、ＦＩＸＣＤＮＡ？ＩＰｔとして用い られ、これについて以下に記載する。

第１Ｘ因子ＣＤＮＡは、ヌクレオチド７−１０上に位置するテトラヌクレオチド 配列ＣＧＣＧ！認識する酵素Ｆｎｕ［）■に対する１つの認識部位を含んでいる 。

Ｍ１３ｔｇ３９７ＢをＰＳｔＩおよびＦｎｕＤＩ［ｔ−消化することにより大き な断片と多数の小さな断片が得られ、これらはＭ１３ＭＰ８におけるＦｎＵＤＩ ［に対する１９カ所の認、識部位に相応する。最も大きな断片は、断片ＦｎｕＤ ＩＩ：ＰＳｔ工に相応する。

この断片は、９つのヌクレオチドと第１Ｘ因子ＣＤＮＡの５′末端のＧ／Ｃ末端 を分離する。Ｇ／Ｃ末端と５′末端とを分離することは、発現ベクター中での第 １Ｘ因子ＣＤＮＡの発現および安定性を増大するのに重要と考えられた。これら ９つのヌクレオチドを除去することにより、シグナル配列のＡＴＧが除去される 。しかしながら、このＡＴＧが翻訳を開始するＡＴＧであることは確かではない 。

Ｆｎｕｏｍにより消化により除去された第■因子部分は、シグナル配列の中にあ り、従って第■因子の活性にとって重要ではない。

第■因子のＦｎｕＤＩ［／ＰｓｔＩ断片の各サイド上に十分な制限酵素部位を得 るために、この断片は、あらかじめＨｉｎｄＩＩおよびＰｓｔＩで消化されたＭ １３ｔＣ１１２０ファージ中でクローン化される。適当な細胞ＪＭＩ０３の形質 転換後、白色組換えゾーンを前述のように同定する。

Ｍ１３の複製物は、白色プレートから！１Ｉｉｌ製され、Ｍ１３ｔｇ３１１１検 体のヌクレオチド配列を分析され、正しい構造が得られたことを確認する。

Ｍ１３ｋＣ１３１１は、ＥＣ０ＲＩおよびＢＱＱＩＩ酵素を組合せ使用すること により、またはＢａＭＨＩとＢＣＩＩ２Ｉ［Ｉを組合せることにより、第１Ｘ因 子のＣＤＮＡを切除することを可能とする。ＢａｍＨＩ−ＢｑＱ　ＩＩで切除さ れた断片の５′末端でのヌクレオチド配列は次の通りである：５’　Ｇ　ＧＡＴ ＣＣＧＴＣＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣ ｏ、。、６．。。

／　−−−−−−−＝−コー拳−＝　−＝　＋　−＋　−−−−＋　＋　＋　＋ 　＋　＋−彎−−−−−−−−）ＣＴＧＣＡ　Ｇ、、、、、、、、Ａ　ＧＡＴＣ Ｔこの配列の下線を引いた部分は、Ｍ１３ｔｇ３９７ＢのＦｎｕＤＩＩ／Ｐｓｔ Ｉ断片に由来する第１Ｘ因子のｃＤＮＡクロー・ン部分を示している。残りのク ローンは、ベクターＭ１３ｔＱ１２０に由来する。この配列の二重に下線を引い た部分は、ＡＴＧ配列の位置を示す。これらは、第１Ｘ因子ｍＲＮＡの翻訳を開 始し得る部位である。

Ｍ１３ｔｇ３１１から容易に切断され得るＢａｍＨ工／ＢｇＱ　ＩＩ断片は、２ つのタイプの発現ベクター中でクローン化され得る。第１のベクタータイプは、 正しい転写のためのシグナル、リポソーム固定部位およびＡＴＧ開始部位を含ん でいる。このベクター中で、第■因子は、融合蛋白の形で発現する。というのは 、翻訳は、その上流のプロモーター上で始まり、第１Ｘ因子配列にお【ブる最初 のＡＴＧコドンに先行する１５個のヌクレオチドにわたり継続するからである。

このために、少なくとも、５個までのアミノ酸が、第１Ｘ囚子のシグナル配列の 末端に融合することとなろう。

第２のベクタータイプは、正しい転写のためのシグナルおよび、必要ならば、リ ポソーム固定部位を含んでいる。

このベクターでは、第■因子ｍＲＮＡの翻訳は、先の配列において示された第１ または、おそらく、第２のＡＴＧで開始する。これら２つのタイプのベクターは 、適切な宿主細胞中に複製開始点および選択手段（抗生物質耐性または栄養要求 相補性）を含んでいる。

細胞が第１Ｘ因子を発現するだけでなく、それを分泌することができるためには 、シグナル配列は、疎水性および親水性アミノ酸断片の存在および分布に関し、 比較的無傷でなければならない。先に示したように、Ｍ１３ｔｑ３９７ＢのＦｒ １ｕＤＩにより消化は、第■因子のシグナル配列のヌクレオチド１−９を除去す る。

前述の第２のタイプのベクターにおいて翻訳が行われるであろう最も近いＡＴＧ は、ヌクレオチド１７−１９に位置しているという事実を考慮すると、これは、 シグナル配列（もし翻訳が、Ｆｒ１ｌＤＩＩにより消化の間に除去されるＡＴＧ で通常開始するならば）がアミノ酸５個分だけ短くなっていることを意味してい る。この５個の付加アミノ酸が第■因子の分泌および／または使用にとって重要 であるかどうかを検討するため、ＦｎＵＤｎによる消化により除去されたヌクレ オチド配列を２つの合成オリゴヌクレオチドを用いて復元する： Ａ）　５’　ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧ　３’オリゴヌクレオチドＡにおいて 下線を引いた配列は、ＦｎｕＤｎによる消化によりファージＭ１３ｔｃ＋３９７ Ｂから最初のヌクレオチドＴが取れて分離した配列に相応する。オリゴヌクレオ チドＢは、オリゴヌクレオチドＡと相補している。オリゴヌクレオチドＡおよび Ｂをバイブリプ−ジョンすると、粘着性ＢａｍＨ工末端を有する次の二重鎖構造 を生じる： ５’　ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧ　３’オリゴヌクレオチドＡおよびＢを、Ｍ １３ｔＣ１３９７Ｂカラ精製され第■因子１：ｃｏ／ＦｎｕＤＩＩのｃＤＮＡ断 片とライゲートする。アルカリホスファターゼで処理し、ＢａｍＨＩにより制限 操作に付したファージＭ１３Ｍｐ７０１をライゲーションのためにさらに加え、 ライゲーションを一晩行なう。最終ライゲーション混合物の一部を用いてＪＭ１ ０３細胞中で形質転換を行なう。゛白色ゾーンを与える組換えファージＭ１３ｔ ｇ３１５のヌクレオチド配列は、その構造が正しいことを確証している。

Ｍ１３ｔｃｘ３１５をＢａｍＨＩで消化すると第■因子ＣＤＮＡ断片を遊離し、 その５′配列は次の通りである：オリゴヌクレオチドＡに相応する配列は、上記 に点線で示しておる。下線を引いた配列は、Ｍ１３ｔｇ３１１の第■因子Ｂａｍ ＨＩ／ＢＱｆ２　ＩＩのｃＤＮＡ断片ノシクナル配チドに相応する。

これらのベクターＭ１３ｔＣ１３１１およびＭ１３ｔ（Ｊ３１５は、下記のクロ ーニング実験における第１Ｘ因子ＣＤＮＡａととして利用できる。

添付図面に示すヌクレオチドの種々の配列は、明示的に本明細書の一部をなすも のと考えるべきであるが、明細書が不必要に冗長とならないように、これ等の配 列についての説明は明細書に詳述しなかった。

１）一般的方法 ａ）細菌株 本発明の範囲内で用いられる細菌株は、次のとおりであるニ ーＴＧＥ９００．即ち、以下の特ｗｉ：５ｕ−Ｆ−ｈｉｓｉ１ｖ　ｂｉｏ（λｃ Ｉ８５７Ｂａｍｌ−ＩＩ）を有する大腸菌株。

−Ｎ６４３８、即ち、以下の特徴：Ｆ−ｈｉｓ　１ｌｖＱａｌ”８ｐｒｏＣ：ｔ ｎｌｏ　Ｉａｃ　ｍ１５（ｃ工８５７Ｂａｍ）−ＩＩ）を有する大腸菌株。

−ＪＭ１０３、即ち、以下の特徴：　（ｌａｃ−ｐｒｏ）ＳｕｐＥ　ｔｈｉ　ｅ ｎｄＡ　５ｂｃＢ１５　５ｔｔＡｒＫ’−ｎＫ”／Ｆ’　ｔｒａＤ３６ｐｒｃＡ Ｂ−１ａｃｉａ　ＩａｃＺ　ｍ１５を有する大腸菌株。

ｂ）酵母株 サツカロミセス・セレビシェ 分離株　ＴＧＹｌｓｐＩ ＴＧＹ２Ｓｐ４ ともにｕｒａ３”−、ｈ　ｉ　５３− ＴＧＹｌｓｐｌは、ＧＦＲＩＢ株（Ｍａｔ　ＨｉＳ３−１１−１５Ｌｅｕ２−３ −１２＞　（フインク等）とＴＧＹｌｏ−１株（Ｍａｔ　ＬＪｒａ　３−２５１ −３７３−３２８）を交雑することにより得られた分離株である。

ＴＧＹｌｏ−１はＦＬ１００株（ＡＴＣ０２２８３＞の同遺伝子型誘導体である 。

前述の株は、入手容易なため使用したが、詳細な説明の過程で述べるいくつかの 必須の特性を示す限りは、他の株を使用できることは言うまでもない。

ｂ）ＤＮＡの調製 プラスミドまたはＭ１３ファージのＤＮＡの調製手法の多くは、イシューホロウ イツツ（１９８１）記載に従って行なうが、使用前にＤＮＡをエタノールで再び 沈澱させることだけが異なる。

大量調製は、上記の刊行物に記載のように行ない、さらＣａＣ９２／臭化エチジ ウム密度勾配により精製した。

止し２旦二三之ｌ迭 制限酵素によりＤＮＡの処理は、特に説明しない限り、各メーカーにニュー・イ ングランド・バイオラブズ、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズおよびベーリ ンガー・マンハイム）指示の条件を用いて行う。

使用するオリゴヌクレオチドは、ニュー・イングランド・バイオラブ社、ハナ・ バイオロジックス社およびワシントン・バイオケミカル社のいずれかから得るか 、コリ等の方法によって合成する。

放射性製品のすべては、アメルシャム・インターナショヤル社から得た。

必要な場合、５′末端のリン酸塩は、制限酵素緩衝液中３７℃で３０分間、細菌 アルカリホスファターゼあるいは　゛仔つシ腸ホスファターゼのいずれかを用い ることにより除去する。

タレノウポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社）を用いる粘着性末端の修 復は、５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＱ（ｐＨ７，８＞　、５ｍＭＭＣ］ＣＱ２． １０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．４ｍＭｄＮＴＳ類、前期酵素および１ ０−２００μｇ／脱ＤＮＡの混合物中で２５℃で１５分間行う。

Ｓ１ヌクレアーゼ（マイルス社）は、２ｔＪ／μｃｌＤＮＡ３０分間使用する。

Ｂａ１３１は、バナヨタトス等の方法（１９８１）に従って使用する。ライゲー ションは、Ｔ４リガーゼＤＮＡ（ベーリンガー・マイハイム社）および１００ｍ ＭＮａＣ９，６６ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５＞、１０ｍＭＭＱＣＱ ２．０．５ｍＭスペルミジン、０．２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＱＴ Ｐ、０．１ｍＭｍ１２ＢｓＡ、５−５０μｃｒ／ｍ＋２ＤＮＡを用い、１５℃（ 別に指示がある場合を除く）で４−２４時間行った。

粘着性末端のライゲーションには、約３０単位／ｒｌｌ１２のりガーゼを使用す る。フリー末端のライゲーションには、約１００単位／戒のりガーゼを使用する 。

各酵素による処理後、ＤＮＡをフェノールで抽出し、オクタノ−ルークロロホル ム（１：８）で２回抽出し、続いてエタノールで沈澱させる。小断片（１００ｂ ｐ）の場合、エタノール沈澱の代りにジエチルエーテルにより３回抽出を行なう 。

必要な場合には、大腸菌または酵母のｔＲＮＡをエキストラクターとして用いる 。分子アダプター（コラボラテイブ・リサーチ、ベセスダ・リサーチラボラトリ ーズ、ニューイングランド・バイオラブズ）は前もってハイブリッド化し、前述 の緩衝液条件を用いるＤＮＡのフリー末端に対して１０−５０倍モル過剰に、Ｔ ４リガーゼ１００単位／ｍｌとともに４℃で１５時間用いる。

非リン酸化「リンカ−（１ｉｎｋｅｒｓ　）　Ｊの挿入は、以乍のように行った 。

リンカ−を１ｍ（１／ｍｆ２の濃度で再びＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒ　ｉ　５− ＨＣＱ　（ｐＨ７，５＞、１ｍＭＮａ−ＥＤＴＡ）にとり、６５℃から４℃に冷 却することにより前もってハイブリッド化する。ライゲーションは、濃度３０ｍ ＭＮａＣＱ、３０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭスペルミ ジン、０．２５ｍＭＡＴＰ、２ｍＭＤＴＴ、０９２ｍＭＮａ２ＥＤＴＡおよび０ ８１ｎ＋ｃ＋／ｍＱウシアルブミン血清の緩衝液中で行なった。一般にライゲー ション（１０−５０μＱ）は、ＤＮＡ末端に対し８０倍モル過剰のリンカ−と標 的ＤＮＡ濃度Ｏ０１μＭを用いて行なう。

リガーゼは、’ｔｏｏ−２００単位／ＩＴｌｆ２の濃度で用い、ライゲーション は、４℃で１６時間行なう。過剰のリンカ−は、スペルミンで沈澱させ、除去す る（ツーブスおよびマクルアー、１９８１）、次いで、ＤＮＡを再び１０ｍＭＴ 　ｒ　ｉ　５−ＨＣＱ　（Ｉ）日７．５＞、１ｍＭＮａ２ＥＤＴ’Ａに取り、バ イブリプ−ジョン緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７゜５）　、５ｍ ＭＮａ２ＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａｃＱ）中に希釈する。再バイブリプ−ジョン は、リンカ−の前バイブリプ−ジョンと同様に行ない、その一部を用いて直接大 腸菌を形質転換する。水洗の原理はラテ等（１９８３）によって記述されている 。

リン酸化されたアダプターを用いる場合、ライゲーション混合物をまずフェノー ル／クロロホルム混液で抽出し、エタノールで沈澱させ、次いで適当な制限酵素 による特異的切断および四酸スペルミンでの沈澱を行なう。

能力細菌細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　＞を準 備し、ダゲルトおよびエールリッヒ（１９７９）記載の方法に従って、プラスミ ドを用いて形質転換するかＭ１３ＤＮＡによってトランスフェクトする。

酵母プラスミドをイト−等（１９８３）のリチウム塩法により酵母中に導入する 。

選択は、前述の分離株の場合、ヒスチジン（４０ｕＱ／ｍ１２）含有合成最小培 地で行う。

衷思■−ユ 細菌での発現ベクターｐＴＧ３２０の調製ｐＴＧ３２０プラスミドの合成は、他 方ではベクタープラスミドｐＴＧ９５１の調製を必要とする。

このプラスミド１）ＴＧ９５１を複合体法により得た。

本出願人によって１９８３年１２月９日に出願されたフランス特許Ｎ（１８３１ ９７７７に詳述されているこのベクターの合成につき、添付図面を参照しつつ簡 単に述べる。

ａ）ｐＴＧ９０８の構築（第７．８．９図）使用される基本プラスミドは、プラ スミドｐＢＲ３２２である：しかしながら、後者は、Ａｍｐ’遺伝子の内部に制 限部位ＰｒＳ工を有する欠点を示す。というのは、同じ性質の部位が後になって １つの制限部位としてクローニングゾーンにおいて用いられるからでおる。従っ て、この制限部位ｐｓｔ工は、アンピシリン耐性遺伝子が制限部位ＰｓｔＩ　（ この部位はインビトロ変異により除去された）をミドｐＵｃ８を用いて消失させ るのがよい。ｐＢＲ３２２は、特にベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社によ り商品化されており、ｐｕｃａは、ビエイラ及びフランスの論文に記載されてい る。

このため、ｐＢＲ３２２の１６６０ｂｐのＰｖｕＩ／ＰｖｕｌＩ断片をプラスミ ドｐｕｃｓの類似のＰＶＬＪＩ／ＰＶｕｌＩ断片と交換する。このプラスミド交 換を行うため、ｐＢＲ３２２およびｐｕｃａを順次ＰＶＵ工、ＰＶＬＩＩ［で処 理し、次いでリガーゼの作用により環状化する。

このようにして、もはやＰ！３を工制限部位を有ざず、かつｐＢＲ３２２に初め は存在していたＮｄｅ工制限部位（第７図には示されていない）をも失ったプラ スミドｐＴＧ９０２を得る。さらに、プラスミドｐＴＧ９０２は、ＰＶＵ［部位 が見い出される配列ｌ　ａｃ　ｉ’に相応する５０ｂｐの断片を保持している。

プロモータＰＬおよびλＮ遺伝子（λフアージ由来で、このλＮ遺伝子は転写抗 終結機能をコードする）をプラスミドｐＫＣ３０から単離し、添付の第７図に示 すように、ｐＴＧ９０２の場合はＥＣ０ＲＩ、Ｓｌ、ＢａｍＨＩ処理し、ｐＫｃ ３０の場合はＰＶＵ工、３１、ＢａｍＨＩ処理してライゲーションし、ｐＴＧ９ ０２に挿入する。

菌株ＴＧＥ９００の形質転換後に得られるプラスミドの１つ、即ちＩ）ＴＧ９０ ６をｐｖｕｌＩ−３ａ　Ｉ　エセグエント次Ｓａｌ工、ヌクレアーゼＳ１、ｐｖ ｕ［およびリガーゼで処理する。このようにしてＤＴＧ９０７を得る。

続いて、［リポソーム固定領域Ｊ　ｃｕｒｂｓ　（これもλファージに由来する ）を、Ｍ１３ｔｇ１１０と名付けられたＭ　１．３フアージでクローン化された 遺伝子＋ａｃｚ’（βガラクトシダー・ゼのα断片）の前にＡｖａＩ／Ｔａｑ■ 断片の形で挿入する。この方法により、ｒｂｓの簡単な機能検査が可能となり、 １ａｃＺ’蛋白の生産、ひいてはＩ　ＰＴＧおよびＸｇａ　ｌの存在下で青色プ レートを得ることができる。これによりまた、所謂ジデオキシ法を用いることに より構築物の配列を速やかに決定することができる。

このようにして、適当な細菌内での選択後、生じたクローンＭ１３ｔｃ＋９１０ を得、その構造を第８図の下部に示す。

Ｍ１３ｔｇ９１０１３℃ジのｃＩ［ｒｂｓ／１ａｃＺ’断片を先に調製したベク タープラスミドｐＴＧ９０７に移入する。このためには、ＥＣ０ＲＩ、［３ａｍ ＨＩおよびＡＶａ工の各部位をＣ［ｒｂＳの上流で除去し、次いで、ＢＱ１■部 位を挿入する。

これらの条件下にｃＩＩｒｂｓはＢにｌ　１．ＩＩ−Ｂｇｌ　Ｍ断片の形で取り 出すことができ、ｐＴＧ９０７のプロモーターＰＬおよびλＮ遺伝子の下流のＢ ａｍＨＩ部位に置くことができる。

Ｍ１３ｔｇ９１０１３℃ジをＥＣＯ工で消化し、３ａ１３１、次いでタレノウポ リメラーゼで処理する。得られた断片を非リン酸化Ｂａ１ｌＩアダプターの存在 下でリガーゼの作用に供す。得られたライゲーション混合物は、受容能力を有す るＪＭ’１０３細胞を形質転換するのに用いる。

次いで、青色プレートを選択する。これらのクローンを分析して、それらがＢＣ ＩＩＩ［部位を含有すること、およびそれらがもはや上流にＥＣ０ＲＩ又はＢａ ｍＨＩ部位を示さないことを確認する。このようにして、Ｍ１３ｔｇ９１２のよ うなりローンを得る。その構造を第９図に示す。

Ｂａ　Ｉ　３１による処理は、１０１ｂｐの削除を引きおこし、その結果Ｅｃｏ Ｒ工、Ｂａｍｔ（Ｉｃり？よびＡＶａ工部位、ならびに１ａｃＡＴＧおよび１ａ Ｃシヤイン一ダルガーノ配列が除去される。導入されたＢｇｌＩＩ部位は、ｃｌ のＡＴＧの上流的１００ｂｐおよびＰｌａＣの下流的１０ｂｐの位置に存在する 。

ｐＴＧ９０７のＢａｍ１−ＩＩ／５ｐｈＩ断片、ＣＩＩｒｂＳｃｌｊよび１ａｃ ７：’を保有する８Ｃ］　ｌ　ＩＩ／Ｈｇ）ａＩ断片、およびリン酸化アダプタ ーをモル比１　：２：１で前ハイブリッド化し、次いでＴ４リガーゼで処理した 。その一部を用いて菌株６１５０の能力細胞を３０℃で形質転換する。

興味ある細胞を、３２１）で標識したｃ［ｒｂｓ／１ａｃＺ′断片を用いて形質 転換体を選択することにより同定し、得られた構造を酵素的制限研究により確認 する。

発現系の諸要素が所望のように働いていることを示す第１の証を得るため、得ら れたプラスミド、即ちｐＴＧ９０８を、ｃ１８５７およびこのプラスミドによっ てコードされるα断片を相補するβ−ガラクトシダーゼのω断片を両方とも有す る宿主菌株Ｎ６４３７に移入する。

得られた形質転換体をＩＰＴＧおよびＸｑａｌを含む皿に置くと、２８℃では白 色を呈し、４２℃で移した場合、約３０分後に青色に変る。

このベクターをＦＩＸのクローンに用いる前に、ヒトーγ−インターフェロン（ ＩＦＮ−γ）のクローンに適応した。

蛋白の性質は重要ではなかったが、ベクターが下図に従って形成された。

ＩＦＮ−γのヌクレオチド配列を制限部位について分析すると、成熟蛋白の初め から８ｂｐ下流にＥＣ０ＲＩ［部位ζ停止コドンから２８５ｂｐ下流に５ａｌＪ ３Ａ部位の存在がＡ断片上で成熟蛋白をコードする全配列を実際に単離すること ができる。バンクから得られたＩＦＮ−γクローンをｐＴＧｌｌと命名する。

ｂ）ｐＴＧ９０９の構築 第１０図には、ｐＴＧ９０９の調製を図示する。

まず、合成アダプター分子を使用すると、ａ）ＥＣＯＲｎとＮｄｅＩ末端の間で 結合が生じ、ｂ）成熟ＩＦＮ−γをコードする配列とを比べて８ｂｐ少ない配列 が導入され、 Ｃ）ＣＩＩｒｂＳの開始コドンＡＴＧが再構築され、成熟ＩＦＮ−γ蛋白をコー ドする配列が、Ｆ−ｍｅｔイニシエーターを除き、融合アミノ酸なしで翻訳され る。

このアダプターは化学的に合成され、その構成は第１０図に示す通りである。

ｐＴＧＩ［をＥＧＯＲＩＩおよび５ａｕ３Ａで消化し、ｐＴＧ９０８をＮｄｅ工 およびＢａｍＨＩで消化する。

適当な断片をゲルで精製し、等モル量のアダプターと混ぜ、前ハイブリッド化し 、ライゲートする。混合物を用いて適格ＴＧＥ９００細胞を形質転換し、「ニッ ク翻訳」され且つ３２ｐで標識したｐＴＧｌｌのｐｓｔＩ挿入片を形質転換とハ イブリッド化することにより、形質転換体を選択する。

１３クローンを選択し、カートグラフ法により検査し、それらの１つが配列決定 法によりｐＴＧ９０９と確認される。

はＩＦＮ−ｒの開始コドンに、もう１つはＴ　ＦＮ−７配列の２２ｂｐ下流にあ る（第１１図参照）。

これら部位間の領域は、ＩＦＮ−γの最初の７個のアミノ酸をコードする領域で あるが、ＮｄｅＩ処理により除去し、第１１図に示す合成オリゴヌクレオチドで 置換した。

この反応は、下流のＮｄｅＩ部位を破壊し、１つの旦旦巴Ｈ工部位を導入するこ とにより上流のＮｄｅ１部位を再構築する。このようにしてベクターｐＴＧ９４ １を得る。

１旦オペロンの翻訳開始領域の配列に基づく合成配列により置換された１）ＴＧ ９４１の誘導体であるＤＴＧ９５１の構築を図示する。この合成ヌクレオチドを ＩＦＮ−γをコードする配列の開始コドンの唯一のＮｄｅＩ部位とＮ遺伝子に挿 入したＣｌａ工部位の間のｔ−１ａＩ部位のレベルでドｐＴ’Ｇ９りＩは、短縮 されたＮ遺伝子を２つ以上含まず（ＮＪ伝子が翻訳される際の停止コドンは新し いｒｂｓ部位のすぐ上流に置かれる＞、ｐＴＧ９０９およびｐＴＧ９４１内に存 在する転写ターミネータ−ｔＬｌおよびｔＲｌが失われている。

ｐＴＧ９５１の合成ｒｂｓ部位は１、開始コドンの直前にＢｇｌ　ＩＩ部位を含 んでおり、従って、Ｂｇｌ　ＩＩで切断し、続いてＤＮＡポリメラーゼエあるい はヌクレアーゼＳ１を用いる種々の操作を行うことにより、ｐＴＧ９５１の誘導 体を形成させることができる。これら誘導体においては、シャインーダルガーノ 配列およびＡＴＧ間の距離や配列は様々でおる。しかしながら、この−ようにし て調製されたプラスミドは、いずれもｐＴＧ９５１自体より優れた活性を示さな い。

主な結果を下表に示す。

］ ｐＴＧ３２０の構成は、第１２図に図示されている。

ｐＴＧ９５１は、プロモーターおよびリポソーム固定部位の下流にクローニング 部位ならびに多くの単一制限部位を含んでいる。合成１ａｃリポソ一ム固定部位 のすぐ下流にＢＣ］ｌＩ［部位がおる。異種遺伝子をこの部位でクローン化する 場合、ざらに単一の輛限部位を導入することができる。これらの部位はその時、 ざらに異種遺伝子を発現させるのに使用することができる。ｐＴＧ９５１は、前 記Ｂａ１■部位の２１塩基対下流に単一のｓａｍＨ工部位を含むヒトインターフ ェロン配列を有しているので、異種遺伝子はこの部位でもクローン化できる。使 用されるＢｇｌ　ＩＩ部位またはＢａ、ｍＨ工部位の選択は、Ｂｇｌ　ＩＩＢａ ｍＨ工の粘着性末端のすぐ下流にイニシエータ−ＡＴＧを有しているべき異種遺 伝子に依存している。もし、第１Ｘ囚子における場合のようにこれが可能でなけ れば、ＢａｍＨ工部位を用いなければならず、蛋白は、ヒトインターフェロンの アミノ酸の５つが融合した形で発現するであろう。

大腸菌での第１Ｘ因子の発現には、ｐＴＧ９５１をＢａｍＨ工およびＰｓｔ工で 消化し、もってＴ−インターフェロン配列の５個のアミノ酸を除去し、Ｍ１３ｔ ｇ３１１由来ＢａｍＨ工／ＰｓｔＩ断片を挿入した。得られたプラスミド、ｐＴ Ｇ３２０の配列は、第１Ｘ因子γインターフエロン融合レベルでは次の通りであ る： ］　ｉ　、　相（イロ 夫塵叢−２ 酵母での第■因子の発現 使用する発現ベヘクターは、プラスミドｐＴＧ８３２である。

プラスミドＤＴＧ８３２の構築は、第１３図に示す。

出発プラスミドは、１）ＢＲ３２２からＰｓｔｌ：およびＮｄｅＩ部位を除去す ることにより得られるプラスミドｐＴＧ９０２である。

ｐＴＧ９０２、およびｔＪｒａ３遺伝子を保持する（ＰｓｔＩ部位を有さない） プラスミドをＨｉｎｄｌｌｌで消化し、消化産物をライゲーションしてプラスミ ドｐＴＧ８０３を得る。

酵母の２μプラスミドをＡｖａｌｉおよび）（ｉ　ｎｄＩｌｌで消化し、末端を タレノウポリメラーゼで処理してフリーにする。この２μＡＶａＩＩ／Ｈｉ　ｎ ｄＩ［Ｉ断片を、Ｓｍａ工で消化したｐＴＧ８０３とライゲートしてプラスミド ｐＴＧ８０７を得る。

Ｕｒａ３遺伝子および２μの複製開始点を、ｐＴＧ８０７の＠　ｉ　ｎｄＩ［Ｉ による消化による単一断片の形で遊離させる。

この断片をタレノウポリメラーゼで処理し、同様に処理したｐＢＲ３２２の）（ ｉｎｄｌ１１部位でクローン化してｐＴＧ８３１を得る。

酵母ホスホグリセラードキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）を変位させ、単一８ＱＩＩ［ 部位をＰＧＫ蛋白翻訳の開始点ＡＴＧに導入する。

ブモーターと酵母ホスホグリセラードキナーゼに相応する゛遺伝子のコード領域 の初めとを含むＨｉ　ｎｄｌＩＩ／Ｓａ　ｌ工断片（２，１５ｋｂ）をＭ’１３ ｍｐ８ベクターの同部位でクローン化した。

前記ホスホグリセラードキナーゼのイニシエーターＡＴＧのレベルでのＢＩＩＩ 部位の作成は、インごトロ変異誘発の常法（ギラムおよびスミス、１９７９、ジ ーン旦。

９９−１０６＞によって行なった このために、配列５’　ＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣ３’の合 成オリゴヌクレオチドを用いて初めの配列５’　ＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴ ＣＴＴＴＡＴＣ３′を変えた。このようにして、イニシエータ−ＡＴＧは、配列 ＡＧＡによる置換のため非機能的になる。

このように変化させたこの遺伝子をプラスミドｐＴＧ８３１でクローン化し、プ ラスミドｐＴＧ８３２を得る。

ネーターを、その末端をタレノウポリメラーゼで処理した後、ｐＴＧ８３２のｐ ｖｕ［部位でクローン化する。得られたプラスミド、ｐＴＧ８３３、をＢｇＩＩ Ｉで消化し、再び環状化して最終発現ベクターｐＴＧ８３４を得る。先に示した ように、このベクターの単−ＢｇＩＩ［部位は、酵母での異種遺伝子発現に利用 できる。Ｍ１３ｔｇ３１５１００ＢａｍＨ工／Ｂｇｌ　ＩＩ消化ＣＤＮＡ断片お よびＭ１３ｔＱ３１５のＢａｍＨＩ消化ＦＩＸＣＤＮＡ断片をクローン化し、そ れぞれＩ）ＴＧ３１８およびｐＴＧ３２４を得るのは、この部位においてである 。

叉ｉ皿一旦 乳動物　胞での　ＩＸ因子の １）プラスミドＩ）ＭＯＰ ＢＰＶウィル・スを２カ所の単一制限部位Ｈｉ　ｎｄＩ［ＩおよびＢａｍＨ工で 限られた２つの部分に分け、２つの断片をそれぞれ「６９％」および「３１％」 と規定する。

本実施例で使用したＢＰＶ由来ベクターをｐＭＯＰと命名する。これは、ＳＶ４ ０のプレコートされたプロモータの制御下でジヒドロ葉酸リダクターゼをコード するｄｈｆｒマーカーをＢＰＶのＢａｍＨＩ部位に導入することにより得られる （第１４図参照）。

ごのｐＭｏＰベクタ・−は、さらに、ルスキーおよびボッチャン（１９８’Ｉ） 記載のプラスミドｐ　Ｍ　Ｌ、　２由来のアンピシリン耐性遺伝子保有ｐＢＲ３ ２２断片を含んでいる。

このベクタープラスミドを、フランス特許ＮＱ８３１５７１６に記載のように、 狂犬病の抗原性蛋白をコードする配列をクローン化するために最初に調製した。

２）プラスミドｐ’ＴＧ１５８ｓＡＬ（第１５図）狂犬病の抗原制蛋白をコード プる遺伝子は、前述のフランス特許に構造が示されているプラスミドｐＴＧ１４ ７に由来する。

この遺伝子をｐＴＧ１４７の部分消化によるＢｃ＋　ｌ　Ｉ［／Ｓａ　Ｉ　Ｉ断 片の形で取り出し、Ｂｇ　Ｉ　ＩＩ／Ｓａ　ｌ　Ｉにより処理されたプラスミド ｐＴＧ３０１の相応する部位の間に導入する。このプラスミドｐＴＧ３０１は、 チミジンキナ含み、ｔｋおよびｐｔｋを保有する単純ヘルペスウィルスのＢ　ａ ｍＨＩ　−Ｂ　ａｍＨＩ断片をｐＢＲ３２２の３　ａｍ）−１工部位に挿入する ことにより得、前記制限処理を行ない、ｔｋ遺伝子を除去する。

ライゲーション産物ｐＴＧ１５６は、その興味ある部位に、チミジンキナ−・ゼ のプロモーターの制御下にある狂犬病遺伝子を含んでおり、この遺伝子にＳＶ４ ０　（Ａ）のポリアデニル化部位が続いている。

グロビンイントロンの導入は、前記フランス特許に構造が記載されているＭ１３ ｔ１４０ファージから、対応するＢｇ　ｌ　ＩＩ／ＢｇＩ　ＩＩ断片の排除後ｐ ＴＧ’１５６のＢＣＩＩ■部位に挿入されるＢＣＩ　Ｉ　ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片 の形で行われる。この排除は、狂犬病遺伝子を除去し、これをｐＴＧ１５６の単 −Ｂｑｌ　Ｉ［部位にＰｔＣｌ’＋４７のＢｇｌ　ｍ／旦旦ユ■断片の形で再導 入する。このようにして、プラスミドＤＴＧ１５８が得られる。

このプラスミドの必須部分は、Ｓａ　ｌ　Ｉ／Ｓａ　Ｉ　Ｉ断片（まれな単−ｐ ＭＯＰ部位の１つ）の形で取り出されねばならず、Ｂａｍ１−（Ｉ部位のレベル でプロモーターの上流にＭ１３ｔｇ１２０１３℃Ｓａ１■部位を含む小ざな断片 を導入する。Ｍ１３ｔｌ　２０＠ＢｇＩ　ＩＩおよびＢ　ａｍｌ−１工で、ｐＴ Ｇ１５８をＢａｍＨ工で消化し、全体を連結し、ｐＴＧｌ　５８ＳＡＬを得る。

３）ベクターの合成（第１５図） ｐＴＧ’１５８およびｐ’ＭＯＰをＳａ！４で消化し、ライゲーションを行なう と、プラスミドｐＴＧ１７２が得られ、これは、ｐＭＯＰのため再生される全要 素の他に、Ｐｔｋプロモーターの制御下にあってβグロビンのイントロンにより 終結する狂犬病遺伝子とポリアデニル化部位とを含んでいる。

第１Ｘ因子発現のために、ｐＴＧｌ　５８ＳＡＬをＢＣＩ　Ｉ　Ｉｆで消化し、 再環状化して、ｐＴＧ３２６を得る。このプラスミドは、哺乳動物細胞内での異 種遺伝子発現に必須な諸要素を全て含んでいる。

０イントロンプロモーターおよびポリアデニル化部位。

単−Ｂｑ　Ｉ　ＩＩ部位は、プロモーターとイントロンとの間に在り、このこと によりそこでクローン化される遺伝子の発現が可能であ。Ｍ１３ｔＣ１３１１由 来ＦＩＸのＢａｍＨ工／ＢｇｌＩ［消化ＣＤＮＡ断片およびＭ１３ｔｇ３１５１ ３℃ＩＸのＢａｍＨ工断片をクローン化し、それぞれｐＴＧ３１７およびｐＴＧ ３２５を得たのは、この部位においてである。

４）寒■ユ旦胛 ａ）細菌での発現 先に示したように、λＰＬプロモーターからの転写は、宿主細胞によりコードさ れた熱不安定性Ｃｌ８５７蛋白により制御される。３０℃でＰＬプロモーターか らの転写は、高い温度（３５℃以上）では熱不安定性Ｃ工８５７蛋白は変性され 、従って、転写の負の制御は、ＰＬから解除される。種々のベクターにより形質 転換されたＴＧ９００大腸菌株の蛋白性発酵産物は、マーキングおよび免疫沈降 により行われる。

第１６図は、３５３−メチオニン（２０μＣｉ／＊）で１分間標識し、抗第１Ｘ 因子ウサギ抗血清で沈降させた蛋白性産物を示す。

沈降線１は、分子量標準に相当する。

沈降線２，３および４は、プラスミドｐＴＧ３２０（第■因子）に相当する。

沈降線５および６は、プラスミドベクターｐＴＧ９５１に相当する。

沈降線４および６は、３０℃での培養物に相当する。

沈降線２，３および５は、３７°Ｃでの培養物に相当する。

沈降線２は、競合因子としての第■因子１０μｑの存在下に免疫沈降を行なう以 外は、沈降線３と同じである。

矢印で示されるように、３７°ＣでのｐＴＧ３２０の誘発は、抗第１Ｘ因子ウサ ギ抗血清により特異的に免疫沈降する蛋白を生じる。この蛋白の見かけの分子量 は、４７０００ダルトンである。使用した抗血清は、精製天然第１Ｘ因子裂品を 用いて調製した。

このことは、非標識精製筒■因子蛋白が免疫沈降段階で４７０００ダルトンの蛋 白（沈降線１）と競合することができることから、確認された。細菌によって生 産された第■Ｘ因子と違って、グルコシル化もγ−カルボキシル化もされないと 言わねばならない。それにもかかわらず、細菌によって生産された第１Ｘ因子は 、天然抗第■因子つサギ玩血清によって認識される。

この構築において産生される第■因子に期待される大きさは、５１３００ダルト ンでおる。これは、第１Ｘ因子のシグナル配列に融合するγインターフェロンの ８個のアミノ酸を考慮している。

細菌性第１Ｘ因子に観察された大きさは、期待された大きさ゛より有意に小ざく 、シグナル配列および前゛蛋白（４６０００ダルトン）が除去された成熟蛋白に より密接に相応している。かくして、第■因子のシグナル配列と前記蛋白配列の 排除に関与する特異的分離機構は、大腸菌において機能的であろう。

サツカロミセス・セレビシェでの第■因子の発現以下の実験を行ない、Ｉ）Ｔ３ ３１８組換えプラスミドを含有する細胞が第■因子を合成するか否かを検討する 。

ｐＴＧ８３４　（ベクター）およびｐＴＧ３１８（第１Ｘ因子）の対数期での培 養を最小培地において対数期の中間まで行なう。各培養につき５ｒｄを取り、蛋 白を３５３メチオニンで３０℃で２０分間標識する。細胞を遠心分離により集め 、プロテアーゼ阻害混合物を含有するＴＧＥＯ８５ｄに懸濁し、ガラスピーズ法 により融解する。遠心分離により分け、細胞エキス中の蛋白をポリアクリルアミ ドＳＤＳゲル電気泳動により分析する。合成蛋白の特徴は第１７図に示す： ・ライン１　ｐＴＧ８３４ ・ライン２　ｐＴＧ３’１８ ・Ｍ　分子量標準 矢印は、ｐＴＧ３１８から得た第■因子において特に強いバンド（分子１５７０ ００ダルトン）の位置を示す。

この蛋白の大きさは、第■因子およびシグナルの成熟形（５０６００ダルトン） が酵母において現われ、第■因子の見かけの分子量に約７０００ダルトンを加え ることが知られている過程であるグリコジル化をうけるならば、期待された大き さと一致する。はぼ類似の分布は、第■因子のシグナルペプチドのＮ末端にざら に５個の付加アミノ酸を有するプラスミドｐＴＧ３２４の場合の蛋白において見 い出される。

他のデータは、組換えプラスミドｐＴＧ３１８およびｐＴＧ３２４を保有する酵 素での第■因子発現を確認しており、細胞エキスのＥＬＩＳＡ分析から得られる 。対照として、プラスミドｐＴＧ８３４保有細胞エキスをもテストし、第１Ｘ因 子の抗原を調製できなかったことが明らかとなった。

これらの実験は、ブラインドで行なった。卯ち、実験者は、ＥＬＩＳ分析を行っ たサンプルの出所も調製物も知らなかった。この分析結果を表１に示す。第■因 子抗原の定量に用いた方法が記載されている。

哺乳動物細胞における第■因子の発現 哺乳動物細胞系をプラスミドｐＭＯＰまたは第■因子を含む誘導体ｐＴＧ３１７ またはｐＴＧ３２５を用い、プラスミドｐＴＧ３２６によって供給された発現ブ ロック中に形質転換する。４種の細胞系を形質転換した。：Ｎｌｌ−１−３Ｔ３ ：　（マウス胚線維芽細胞）ＬＭＴＫ　：（マウス胚線維芽細胞） ＭＤＢＫ　：（ウシ肝臓） ＶＥＲＯ：（サル肝臓） Ｎｌ）−１−３Ｔ３およびＬＭＴＫ細胞については結果が得られており、ＭＤＢ ＫおよびＶＥＲＯについで現在結果が持たれている。

先に示したように、哺乳動物細胞での第■因子発現に使用するベクター（ｐＭＯ Ｐ）は、代謝拮抗物質メトトレキサートの存在下で安定な形質転換体を選択する ことができる。即ち、ＤＮＡをリン酸カルシウムで沈澱させる標準法により細胞 を形質転換させた後、形質転換体をメトトレキサート０．４９／ｒｒ！ｌの存在 下に選択する。形質転換細胞コロニーは、２〜３週間後、顕微鏡を用いず目で見 て検出する。その後、これらのコロニーを単離、培養し、個別に分析する。

３５３−メチオニン標識蛋白と、プラスミドｐＴＧ３１７保有の種々の単離され たＮＩＨ−３Ｔ３細胞コロニーに対する天然抗第■因子ウサギ血清との免疫沈降 の結果を第１８図に示す： 沈降線１：非形質転換３Ｔ３細胞対照 沈降線２：種々のコロニーの混合物 沈降線３：分子量マーカー 沈降線４　：　ｐＴＧ３１７クローン７沈降線５　：　ｐＴＧ３１７クローン１ 沈降線６　：　Ｉ）ＴＧ３１７クローン９沈降線７　：　ｐＴＧ３１７クローン ４沈降線２，４．５および７に示されるように、抗第１Ｘ因子ウサギ抗血清と特 異的に免疫沈降した６２０００ダルトンの蛋白あ非常に強い発現が認められる。

この蛋白の存在の有無は、ＥＬＩＳＡによって分析された細胞エキス中での第■ 因子抗原の検出と相関している。

６２０００ダルトンの蛋白は、使用した電気泳動条イ１下では明瞭なバンドを形 成しない。この糖蛋白は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル」二に特徴的な拡散バ ンドを形成するので、この結果は、Ｄ’ｌ’Ｇ３１７により形質転換され３Ｔ３ 細胞から得られた第１Ｘ因子はグリ］シル化され得ることを示唆（）ている。

この６２０００ダルトンの蛋白が糖蛋白であるかどうかを検討するために、３Ｔ ３．１）ＴＧ３１７、クローン７（以下、３丁３゜３１７．７）の３５８−メチ オニンで標識した細胞エキスをコンカナバリンＡ−セファロース（ファルマシア 社）と培養する。使用した条件下では、糖蛋白はセファロース誘導体に特異的に 吸収される。コンＡ−セファロースと培養後の上澄み中に残る第１Ｘ因子を免疫 沈降法により調べ、コンＡ−セファロースとの培養前に免疫沈降し得る第■因子 の量と比較する。

この様な条件下に、６２Ｃ）００ダルトンの蛋白質は、コン△−セファ０−ス上 での吸着により、３Ｔ３．３１７゜７抽出体から定量的に除去される。

この吸着がコンＡ−セファロ・−スでの蛋白の非特異的吸収に基づくものではな いという事寅は、６２０００ダルトンの蛋白のみが取り出され、あとの蛋白は上 澄みに残ることから立証される１、 ３５Ｓ−メチオニン標識蛋白を免疫沈降法を用いずに分析すると、いずれの場合 においても７２０００ダルトンの蛋白の存在が示され、ＥＬＩＳＡおよび６２０ ００ダルトンの蛋白の免疫沈降により第１Ｘ因子抗原が検出される。この７２０ ００ダルトンの蛋白の同定は確実ではない：しかしながら、形質転換３Ｔ３細胞 中の第１Ｘ因子抗原の存在と明らかに関係している。この蛋白は、おそら＜６２ ０００ダルトンの蛋白の生合成前駆体であろう。ここに記載の実験により、この ７２０００ダルトンの蛋白は、抗第１Ｘ因子ウサギ抗血清により特異的に免疫沈 降することが示されている。

３Ｔ３．３１７゜７におけるメト１〜レキサート耐性は、このプラスミドによっ て生じたジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子の発現に由来する。メト トレキサート濃度が増大すれば、一定割合の細胞はｄｈｆｒ遺伝子のコピー数を 増大することにより応答するでおろう。ｄｈｆｒおよび第■囚子の配列は、プラ スミドｐＴＧ３１７に位置しているので、従って、メトトレキサート量を増加す ることにより、ｄｈｆｒおよび第１Ｘ因子遺伝子の発現を共増幅（ｃｏ−ａｍｐ 　ｌ　ｉ　ｆｙ）することができるものと思われる。この仮説を検証するために 、メトトレキサートを０．４−８μｇ／ｄの種々の濃度で３Ｔ３，３１７．７の 培養物に加える。

これらの濃度で数週間培養後、細胞を前記のように３５３−メチオニンで標識し 、蛋白をＳＦＳポリアクリルアミドゲルで分析する。

第１９図に得られた結果を示す。

第１９．２０図の説明ニ ライン１：３Ｔ３細胞 ライン２　：　ｐＭＯｏによる形質転換３Ｔ３細胞ライン３，４．５および６： メトトレキサートの３丁３゜３１７．７１度（μ！？／ｄ） ライン１：０ ライン２および３：０．４ ライン４，５および６：それぞれ２，４および８μ３第１９図から明らかなよう に、メトトレキサート濃度を増加することにより、分子ａ７２ｏｏｏダルトンの 蛋白合成は有意的に増大する。これらの蛋白は、第一近似で特異的抗血清と免疫 沈降する６２０００ダルトンの蛋白に相当し、第２近似では総細胞エキス中に認 められる７２０００ダルトンの蛋白に相当する。

先の細胞エキスを天然杭用■因子ウサギ抗血清での免疫沈降法により分析する。

結果は、第２０図に示す。確認し得るように、第１９図に認められた７２０００ ダルトンの蛋白は、メト、トレキサート濃度を増大すると強度を増し、天然杭用 １Ｘ因子ウサギ抗血清と特異的に免疫沈降する。

６２０００ダルトンの蛋白の場合、用量と効果の間の関係は必まり明らかではな い。先に示したように、７２０００ダルトンの蛋白が６２０００ダルトンの蛋白 の前駆体でおるならば、６２０００ダルトンの蛋白の場合の用量−効果関係が観 察できなかったことは、おそらく実験条件によるものであろう：例えば、標識期 間は、７２０００ダルトンの蛋白を６２０００ダルトンの蛋白に転換するのに必 要な時間と比べて非常に短い。

第２１図に示す実験において、免疫沈降は、免疫競合因子の形での第１Ｘ因子１ ０μびの存在下または非存在下で行う。結果は、６２０００ダルトンの蛋白が天 然第１Ｘ囚子と特異的に免疫競合していることを示している。７２０００ダルト ンの蛋白のわずかな競合が観察されるが、結果はより一層明白ではない。

第２１図の説明ニ ライン１　：　ＬＭＴＫ細胞エキス ライン２　：　Ｉ）ＴＫｔ−ｊよびｐＴＧ３１７で共形質転換したＬＭＴＫ細胞 エキス ライン３：３Ｔ３細胞 ライン４ニブラスミドで形質転換した３Ｔ３細胞ライン５：分子量マーカー ライン６および７　：３Ｔ３゜３１７．７ライン１〜４．６および７は天然杭用 ■因子ウサギ抗血清と免疫沈降する。ライン７での免疫沈降は、競合因子とじて の天然第■因子１０μ３の存在下に行なう。矢印は、６２０００ダルトンの蛋白 の位置を示す。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での拡散性およびフンＡ−セファロースによる 固着により示唆されるように６２０００ダルトン蛋白が糖蛋白であるかどうかを 検討するため、細胞を３日−マンノース、３Ｈ−ガラクトースおよび３日−グル コサミンの存在下で一晩培養する。これら放射性前駆体の蛋白への取り込みは、 炭水化物鎖付着の指標となる。標識された蛋白は、天然杭用■因子ウサギ抗血清 との免疫沈降により分析される。

第２２自から明らかなように、６２０００ダルトン蛋白は、これらの条件下で標 識され、このことにより付着炭水化物鎖の存在が確認される。

第２２図の説明は次の通りであるニ ライン１〜７：第２０図と同様 ライン８，９および１０：３Ｈ−マンノース、３゛Ｈ−ガラクトースおよび３日 −グルコサミンで標識された細胞 ライン８：３Ｔ３細胞 ライン９　：　ｐＭＯＰで形質転換した３Ｔ３細胞ライン１０：３Ｔ３．３’１ ７゜１ 最後に、第■因子は、大腸菌、サッカミセス・セレビシェおよび３Ｔ３およびＬ ＭＴＫ細胞系細胞塊した。大腸菌では、生産された第■因子蛋白の大きざ（４７ ０００ダルトン）は、シグナル配列および前蛋白の少ない成熟ポリペプチドのそ れと相応する。

細菌的に生産された蛋白のＮ末端アミノ酸配列の決定は、そのような場合が事実 であるかどうかを調べるのに用いることができる。

第■因子の活性に必要な特異的後翻訳的修飾を考慮すると、細菌性産物の修飾は 少なくともそれを、例えば真核性ミクロゾーム膜標本（例えば、肝臓、牌臓また は腎臓）を用いることによりカルボキシル化することができるもの゛と考えるべ きである。

酵母では、第１Ｘ因子産物の大きさく５７０００ダルトン）は、大腸菌で生産さ れたそれよりも明らかに大きい。このことは、酵母内での第１Ｘ因子のグリコジ ル化に基づくものと思われる。

真核細胞では、６２０００ダルトンおよび７２０００ダルトンの２つの蛋白は、 天然杭用■因子ウサギ抗血清と特異的に免疫沈降する。前駆体−生産型の関係が 、これら蛋白間に存在するかもしれない。

、６２０００ダルトン蛋白のＳＤＮポリアクリルアミドゲル上での拡散性、コン Ａ−セファロースへのその固着、および糖蛋白を標識する放射性前駆体のこれら 蛋白への取り込みは、６２０００ダルトンの蛋白が第１Ｘ因子のグリコジル化さ れた形であることを大いに示している。

生物活性のためには、第１Ｘ因子のＮ末端における１２個のグルタミン酸置換基 がＴ−カルボ・キシル化されなければならない。この修飾をもたらす酵素系は操 作が難しく、同時に第■因子を発現するでおろう細胞系はそれ自体この修飾を行 なうものと期待される。

３Ｔ３，３１７．１系に存在する第１Ｘ因子抗原はすべてクエン酸バリウムを吸 収する（ビタミン依存性凝固因子の物理化学的性質、従って一部はγ−カルボキ シグルタミン酸の存在に基づくものと思われる）ことを立証する予備試験は、正 確な修飾が事実起こっていることを示している。

以下の菌株は、パスツール研究所微生物培養物寄託所（ＣＮＧＭ）（２８ｒｕｅ 　ｄｕ　［）ｏｃｔｅｕｒ−Ｒ日に寄託したニ ブラスミドｐＴＧ３２０含有大腸菌：寄託番号ニー４４４プラスミドｐＴＧ３１ ８含有大腸菌：寄託番号ニー４４３プラスミドｐＴＧ３２５含有大腸菌：奇託番 号Ｉ−４４５兵　工 参考文献 ■ベルチナ及びベルトカンプ（１９８１）、゛ヘモスタシス及びトロンボシス″ 、ブルーム及びトーマス編、第９８〜１１０ｍ、チャーチル　リビングストン、 ロンドン（ＢＥＲ丁ＩＮＡ　Ｒ，Ｍ、ｅｔ　ＶｅｌｔｋａｍｐＪ、Ｊ、（１９８ １）、Ｉｎ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓａｎｄ　ｌｈｒｏｍｎｂｏｓｉｓ、Ｂｌｏｏ ｍ　Ａ。。

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Ｏマクサム及びギルバート（１９８０）“′メソツズ　イン　エンザイモロジー ゛６５．４９９〜５５５（ＭＡＸＡＭ　Ａ、Ｍ、ｅｔ　ＧＩＬＢＥＲＴ　Ｗ。

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Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｏｎｄｏｎｌ■ミズオチ、タニグチ、フジカ ワ、チタニ及びコバタ（１９８３）”ジャーナル　オプ　バイオロジカル　ケミ ストリー”　２５８．６０２０−６０２４（ＭＩＺＵＯＣＨＩ　Ｔ、、ＴＡＮＩ ＧＵＣＨＩ　Ｔ。。

ＦＵＪＩＫＡＷＡ　Ｋ、、ＴＩＴＡＮＩ　Ｋ、ｅｔＫＯＢＡＴＡ　Ａ、（１９８ ３＞、Ｊ、Ｂｉｏ！、２９９８　（ＩＳＨ−ＨＯＲ，０ＷＥＩＴ’Ｚ　Ｄ、ｅｔ ＢＵＲＫＥ　Ｊ、Ｆ、（１９８１＞。Ｎｕｃ　Ｉ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９．２ ９８９−２９９８．）■バナヨタトス及びトロング（１９８１）”ヌクレイツク 　７シツズ　リサーチ″９．５６７９〜５６８Ｂ（ＰＡＮＡＹＯ丁ＡＴＯ３Ｎ、 ｅｔ　ＴＲ０ＮＧ　Ｋ、。

（１９８１）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９゜５６７９−５６８８．） ○ツー・ブス及びマクルアー（１９８１）”ヌクレイツクアシツズ　リサーチ″ ９．５４９３〜５５０４（ＨＯＯＰＥＳ　Ｂ、Ｃ，ｅｔ　ＭｃＣＬＵＲＥ　Ｒ。

Ｒ，（１９８１）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９゜５４９３−５５０４． ） ■ダガート及びエーリツヒ゛ジーン″２２〜２８（１９７９）（ＤＡＧＥＲＴ　 Ｍ、ｅｔＦ：ＨＲＬＩＣＨＳ、Ｄ、、Ｇｅｎｅ、２°３−２８（１９７９）、） ■ビエイラ及びメリック″ジーン”■、２５９〜２６８（ＶＩＥＩＲＡ　Ｊ、ｅ ｔ　ＭＥＳＳＩＮＧ　Ｊ。

ヤーナル　オブ　バクテリオロジー”１５３．１．１６３〜１６８（ＩＴＯＭ、 、ＦＵＫＵＤＡ　Ｙ。。

ＭＵＲＡＴＡ　Ｋ、、ＫＩＭＩＪＲＡ　Ａ、（１９８３）。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ　ｉ　ＯＩ。１５３，１，１６３−１６８、） ■ウィグラー及びコル゛′セル″、第１４巻、７２５〜７３１（１９７８）（Ｗ ＩＧＬＥＲｅｔ　Ｃｏ１ｔ、。

Ｑｅｌ　ｌ、ｖｏｌ、１４，７２５−７３１（１９７８）、） ガ　４　Ｇ　℃ 特衣昭６１−５０２０９５　（２４） ２）　Ｍ１３ｍｐ８ｓＰｓｔ　Ｉ ２）　Ｍ１３ｍｐ８ｓ　Ｐｓｔ　Ｉ ＭＩ３ｒｇ３９７８ Ｃ０Ｎ５ＴＲＵＣＴＩＯＮ　ＯＥ　ＰＴＧ９０９ＦＥυ！ＬＬＥＤＥＲεＭＰＬ ＡＣＥＭＥＮＴＣＯＮ５丁ＲＵＣＴＩＯＮ　ＣＩＥ　ＰＴＧ９４１Ｎｏε工 ＦＮ ＰＴＧ９４１ＭｇｔＣｙｓｒｙｒＣｙｓＧｔｎＡｓｐＰｒｏｒｙＰＮｏεＩ　Ｂ Ａｐ＋Ｈ１ Ｍ、Ｗ。

メ１０３′ １閣　ｌｉｄ　ＩＴａ　シ＝　釦　＆＝１　圀　！／４　父　獄　舌 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴｈＥ　！ＮＴＥＲＮＡＴｒＯＩＪＡＬ　５ＥＡＲＣＥｉ　 ＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも ー細胞中の第ＩＸ因子に類似の蛋白をコードするＤＮＡ配列：即ち、ＤＮＡ・Ｆ ＩＸ； −前記細胞中でこの配列を発現させる諸要素を含むことを特徴とする、細胞中で の第ＩＸ因子類似蛋白のクローニング・発現ベクター。 （２）前記細胞中での自律複製開始点を含むことを特徴とする請求の範囲第１項 記載のベクター。 （３）前記細胞中で発現する正の選択特性を含むことを特徴とする請求の範囲第 １項及び第２項のいずれかに記載のベクター。 （４）ＤＮＡ・ＦＩＸ配列の上流に少なくとも１個のプロモーターを含むことを 特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のベクター。 （５）ＤＮＡ・ＦＩＸの配列がリボソーム固定部位を伴う細菌プロモーターによ り促進されることを特徴とする請求の範囲第４項に記載のベクター。 （６）前記プロモーターがλフアージのＰＬプロモーターの全部または一部によ って構成されていることを特徴とする請求の範囲第５項に記載のベクター。 （７）リボソーム固定部位が少なくとも配列：【配列があります】 を含むことを特徴とする請求の範囲第５項または第６項に記載のベクター。 （８）正の選択特性か細菌中で発現する抗生物質耐性という特性であることを特 徴とする請求の範囲第３項乃至第７項のいずれかに記載のベクター。 ９ＤＮＡ・ＦＩＸ配列が酵母プロモーターにより促進され、該ＤＮＡ・ＦＩＸ配 列が酵母ターミネーターにより終結されることを特徴とする請求の範囲第１項〜 第４項のいずれかに記載のベクター。 （１０）前記プロモーター及びターミネーターがＰＧＫプロモーター及びターミ ネーターであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のベクター。 （１１）複製開始点が２μプラスミドの複製開始点であることを特徴とする請求 の範囲第１０項または第１１項に記載のベクター。 （１２）正の選択特性が遺伝子ＵＲＡ３によることを特徴とする請求の範囲第９ 項乃至第１１項のいずれかに記載のベクター。 （１３）ウイルス中の複製開始点を含むことを特徴とする請求の範囲第１項乃至 第４項のいずれかに記載のベクター。 （１４）ＳＶ４０またはＢＰＶ複製開始点を含むことを特徴とする請求の範囲第 １３項に記載のベクター。 （１５）プロモーターが、ＳＶ４０プロモーターの全部または一部により、また は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモーターの全部または一部に より構成されていることを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載 のベクター。 （１６）真核細胞中で発現する標識遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求の 範囲第１３項乃至第１５項のいずれかに記載のベクター。 （１７）ＤＮＡ・ＦＩＸ配列にイントロン及び／またはポリアデニル化部位が続 くことを特徴とする請求の範囲第１３項乃至第１６項のいずれかに記載のベクタ ー。 （１９）ＢＰＶ遺伝子の全部または一部、ならびにウイルスプロモーターの全部 または一部、ＤＮＡ・ＦＩＸ配列、イントロン及びポリアデニル化部位をこの順 序で含む配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１３項乃至第１７項のいずれ かに記載のベクター。 （１９）プラスミドＰＴＧ３２０であることを特徴とする請求の範囲第５項乃至 第８項のいずれかに記載のベクター。 （２０）プラスミドＰＴＧ３１８またはＰＴＧ３２４であることを特徴とする請 求の範囲第９項乃至第１２項のいずれかに記載のベクター。 （２１）プラスミドＰＴＧ３１７またはＰＴＧ３２５であることを特徴とする請 求の範囲第１３項乃至第１８項のいずれかに記載のベクター。 （２２）請求の範囲第１項乃至第８項及び第１９項のいずれかに記載のプラスミ ドにより形質転換された細菌。 （２３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であることを特徴とする請求の範囲第２２項 に記載の細菌。 （２４）請求の範囲第１項乃至第４項、第９項乃至第１２項及び第２０項のいず れかに記載のプラスミドにより形質転換された酵母。 （２５）サツカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）株であることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載の酵母。 （２６）請求の範囲第１項乃至第４項、第１３項乃至第１８項及び第２１項のい ずれかに記載のベクターにより形質転換された哺乳動物細胞。 （２７）細菌、酵母または細胞を請求の範囲第２２項乃至第２６項のいずれかに 従って培養し、産生された第ＩＸ因子類似蛋白を回収することを特徴とする第Ｉ Ｘ因子類似蛋白の製造方法。 （２８）請求の範囲第２７項に記載の方法を用いて得られた第ＩＸ因子類似蛋白 。 （２９）少なくとも一部が細菌、酵母または哺乳動物を培養することにより得ら れた第ＩＸ因子類似蛋白。