JPS63500843A - 組換え繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ８、ＦＧＦをコードするＤＮＡ配列が細菌または哺乳類宿主と和合性の制御配列 に動作可能に連結されている請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列を含み、そし てＤＮＡ配列の発現に有効な組換えベクター。

９、請求の範囲第７項に記載の形質転換細胞を培養することを含む酸性または塩 基性哺乳類ＦＧＦを生産する方法。

１０、請求の範囲第９項に記載の方法で生産されたタンパク。

１１、以下のものを含むタンパクから成る群から選ばれたタンパクの精製ＦＧＦ 　： 第１図の１−４１番のアミノ酸配列を有するクンバク；第１図の７−４１番のア ミノ酸配列を有するタンパク；を有するタンパク； 第２図の１−４１番のアミノ酸配列を有するタンパク；第２図の７−４１番のア ミノ酸配列を有するタンパク；第２図の（−１５）または（−１４）から４１番 のアミノ酸配列を有するタンパク； 第３図の１−１４６番のアミノ酸配列を有するタンパク；第３図の１６−１４６ 番のアミノ酸配列を有するタンパク；第３図の（−９）または（−８）から１４ ６番のアミノ酸配列を有するタンパク； 第４図の１−１４６番のアミノ酸配列を有するタンパク；第４図の１６−１４６ 番のアミノ酸配列を有するタンパク；および 第４図の（−９）または（−８）から１４６番のアミノ酸配列を有するタンパク 。

１２、少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて、請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する傷害修復を仲介するの に有用な組成物。

１３、少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて、請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する血液凝固を制御するの に有用な組成物。

１４、少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて、請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する神経の損傷の回復に有 用な組成物。

１５、少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて、請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する困難なＭｉ織修復の仲 介に有用な組成物。

１６、ヒト検体の充実性腫瘍形成の傾向を予測する方法であって、λＢＢ２また は等価なプローブを用いて、該ヒト由来のゲノム旧ｎｄＩＩＩ　ＤＮＡ分解物に ２．９ｋｂ　ＤＮＡ断片の存在または不在を検出することを包含する方法。

１７、精製または組換え型のヒト塩基性ＦＧＦ　。

明細書 え°　９・ 韮」 本発明は１組織治癒の際に、循環系を形成するために重要な成長因子の組換え生 産に関する。特に２本発明は、ウシおよびヒトの、塩基性および酸性の繊維芽細 胞成長因子（ＦＧＦ）をコードする遺伝子をクローニングし、そして発現させる 。

孜歪負宜景 組織が創傷または火傷のような外傷を受けた場合の修復過程は極めて複雑である が、多数のタンパク因子により仲介されることが知られている。これらの因子は 、破壊された組織を置換するように働く細胞の増殖および分化に必須である。

数多（の候補となる因子は、脳、脳下垂体、および視床下部などのいろいろな組 織の抽出物が培養細胞系の有糸分裂を促進する能力を基準として同定されている 。多数の短縮基がこれらの抽出物中の活性因子に与えられている。これらの活性 因子には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、マクロファージ由来成長因子（ ＭＤＧＦ）　、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、腫瘍脈管形成因子（ＴＡＦ）、内皮 細胞成長因子（ＥＣＧＦ）　、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）　、視床下部由来 成長因子（ＨＤＧＦ）　、　網膜由来成長因子（ＲＤＧＦ）　、およびヘパリン 結合成長因子（）ＩＧＦ）が含まれる。

（例えば＋　Ｈｕｎｔ、　Ｔ−に−＋　Ｊ　Ｔｒａｕｍａ　（１９８４）　２４ 　：　５３９−５４９　；　Ｌｏｂｂ。

Ｒ，Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８４）　２３　：　６ ２９５−６２９９を参照）。

Ｆｏｌｋｍａｎ、　Ｊ、、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８３）　２２１　：　 ７１９−７２５は、創傷治癒に関与する過程の１つ、すなわち血管の形成は、腫 瘍においてヘパリンにより強く影響されることを報告した。このことおよび他の 研究から、ヘパリンが、多数のこのような成長因子活性に関連するタンパクに対 して特異的に結合することは明らかである。従って、ヘパリンが精製手段として 用いられてきた。ヘパリンが正および負に荷電した両方の因子に結合することか ら、成長因子のヘパリンに対する親和性は。

全体のイオン電荷に無関係であることが示されている（ＭａｃｉａＬＴ、、　ｅ ｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２５　：　９３２−９３５　；　 Ｓｈｉｎｇ、　Ｙ、。

ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３　：　１２９６−１２９９ 　：　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、　Ｍ、。

ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８５ ）　８２　：　８０５−８０９）。

ヘパリンに対する結合能力または非結合能力は、いろいろな抽出物における活性 を区別する１つの尺度である。例えば。

ＥＧＦおよびＰＤＧＦはヘパリンに強く結合しない；実際には、　ＥＧＦはヘパ リンに全く結合しない。上述の他の因子は強いヘパリン結合性を示す。しかしな がら、酸性の脳ＦＧＦ　、　ＥＣＧＦ、　ＲＤＧＰおよびＨＧＦ−αは、実際に は、同一因子であると考えられている。同様に、脳下垂体ＦＧＦ　、陽イオン性 の脳ＦＧＦ　、　ＴＡＦおよびＨＧＦ−βも同一タンパクであると考えられてい る（Ｌｏｂｂ、　Ｒ。

Ｒ，ｌ　ｅｔ　ａＬ　（前出））。ヘパリン親和性を用いて精製された１３の内 皮成長因子の要約および比較が、　Ｌｏｂｂ、　Ｒ，、ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌハ堕 （１９８６）幻５１　：　１９２４−１９２８に示されている。

ヘパリン−アフィニティークロマトグラフィーを用いて。

毛細血管内皮に対して強い有糸分裂活性を示す塩基性の繊維芽細胞成長因子が、 ラットの軟骨肉腫（Ｓｈｉｎｇ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ。

前出）およびウシの軟骨（Ｓｕｌｌｉｖａｎ、　ｐ、ｌ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ　Ｂ ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８５）　２６０　：　２３９９−２４０３）から単離さ れている。Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ。

Ａ、、ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＬＩＳＡ）　（１９８ ４）　８１　：　３５７−３６１゜米国特許第４，４４４．７６０号は、　１６ ，６００および１６，８００ダルトンの分子量を有する酸性のウシの脳繊維芽細 胞成長因子の２つの異種型を精製した。Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚおよび協同 研究者らは。

ウシの脳および脳下垂体の両方に塩基性の繊維芽細胞成長因子活性が存在するこ とを示し、そしてヘパリン−アフィニティークロマトグラフィーを他の精製技術 と組合せて、これらのタンパクを精製した（Ｂｏｈｌｅｎ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａ ｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８４）　８１　 ：　５３６４−５３６８　：　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、。

ｅｔ　ａｌ、　（同）６９６３−６９６７）。これらの因子の分子量も、ヒトの 胎盤から単離された同様の因子の分子量のように約１６ｋｄである（Ｇｏｓｐｏ ｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ 　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ（１９８５）　１２８　：　５５４−５６２＞。

ウシの脳下垂体由来の塩基性ＦＧＦに対する完全な配列が決定されている（Ｅｓ ｃｈ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ＋　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（Ｕ ＳＡ）（１９８５）　銭：　６５０７−６５１１）。均一な調製物が得られ、そ して内皮細胞を用いたインビトロ分析で強い有糸分裂活性を示した（塩基性ＦＧ Ｆは、　６０ｐｇ／艷のＨＤ、。を有する）。

酸性ＦＧＦは、約６．０００ｐｇ　／　ｍｌのＨＤ５゜を有する。ウシの脳組織 由来の酸性ＦＧＦのＮ末端配列は、　Ｂｏｈｌｅｎ、　Ｐ、＋　ら、　ＥＭＢＯ Ｊ（１９８５）　４　：　１９５１−１９５６により決定された。Ｇｉｍｅｎｅ ｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ。

Ｇ、らは、ヒトの脳から調製された酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＰ両方のＮ末端 配列を決定し、そしてそれらをウシのＦＧＦの配列と比較した（旦ぢ加１１国吐 ｎ」■口≧匣（１９８６）匡：　５４１−５４８）。彼らの結果は、ここに開示 された結果と一致している。

また、ウシの脳由来の酸性ＦＧＦの全アミノ酸配列が、単離されたタンパクから 決定された（Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ、　Ｇ＋　ｅｔ　ａｌ　＋５ｃｉ ｅｎｃｅ　（１９８５）　２３０　：　１３８５−１３８８　；　Ｅｓｃｈ、　 Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　ＢｉｏｃｈｅｍＵ」虫■Ｒｅｓ　（１凹（１９８５）旦： 　５５４−５６２）。これら２つの決定は、１つのアミノ酸を除いて一致してい る。ここでの多くの研究の後に、ヒトの酸性ＦＧＦの全アミノ酸配列が、その遺 伝子から推定された（Ｊａｙｅ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、印刷中）。

上述のＦＧＦタンパクおよび他の成長因子は、外傷を受けた組織の治癒を促進す る際、明らかに有効である（例えば、　５ｐｏｒｎ。

Ｍ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８３）　２１９　：　１３ ２９−１３３１　；　Ｄａｖｉｄｓｏｎ。

Ｊ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｃ，Ｂ、　（１９８５）　１００　：　１２１９ −１２２７　；　Ｔｔ＋ｏｍａｓ、　Ｋ。

八、＋　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵｓＡ）　 （１９８５）　旦２　：　６４０９−６４１３を参照）。Ｄａｖｉｄｓｏｎら（ 前出）は、特に創傷治癒におけるＦＧＦの有効性を開示している。塩基性ＦＧＦ の天然タンパクは、心筋梗塞の治療に有用であると言われている（Ｓｖｅｔ−Ｍ ｏｌｄａｖｓｋｙ。

Ｇ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ　（１９７７年４月２３日）　９１３　 ；米国特許第４．２９６．１００号および第４，３７８．３４７号）。さらに、 ヒトの塩基性ＦＧＦが、ラット胎児の海馬体神経細胞における神経細胞の生存お よび神経突起の伸長を増大させることが見出されている（Ｗａｌｉｃｋｅ、　Ｐ 、、　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（ １９８６）８３　：　３０１２−３０１６）。このことは、この因子がアルツハ イマー病およびパーキンソン病のような退化神経学的疾病の治療にも有用であり 得ることを示唆している。

従って、これらのＦＧＦタンパクを大量に、かついかなる毒性不純物あるいは怒 染性不純物を含まない形で利用し得ることを保証することが望ましい。治療に用 いるには、このタンパクのヒト型のものが好ましく、そして恐らく必要とされる 。

純粋な調製物を得るには約３５．０００倍に精製しなければならないので、天然 のヒト起源のものを用いることは、明らかに実用的ではない。たとえヒトの死体 が実用的な起源であるとしても、エイズ、肝炎あるいは他の病気の伝染の可能性 があるため完全な精製は、困難である。最近のクロイツフエルトーヤコブ症候群 （Ｐｏｗｅｌｌ−Ｊａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　（１９８５） 旦＝２４４−２４６）の経験からヒトの脳下垂体を起源として用いることはでき ない。従って９組換え技術は、特にこれらのタンパクの生産への応用に適してい る。本発明は、ここに酸性ＦＧＰおよび塩基性ＦＧＦを実用的な量で、かつ純粋 であって、汚染されていない形で得る方法を与える。

光皿ｑ皿丞 本発明は、創傷、骨折、火傷組織、創傷心筋組織、退化神経組織または他の外傷 の治癒を効果的に促進させるのに有用な繊維芽細胞成長因子の合成および操作の 手段を与える。これらの因子をコードする遺伝子のクローニングおよび発現は。

本発明の方法および材料によって与えられる。

ある様相において９本発明は、ウシおよびヒトの、酸性および塩基性のＦＧＦ　 （酸性ｂＦＧＦ、酸性ｈＦＧＦ、塩基性ＢＦＧＦおよび塩基性ｈＦＧＦ）をコー ドする組換えＤＮＡ配列に関する。特に。

これらはヒトまたはウシのゲノム配列を包含する。他の様相において２本発明は 、これらのＤＮＡ配列を有する組換えベクター、このようなベクターを用いて形 質転換され、そしてこれらのＤＮＡ配列を保持する宿主細胞９およびこれらの形 質転換された細胞により生産される組換えタンパクに関する。他の様相において １本発明は２組換え技術を用いたこれらの繊維芽細胞成長因子の生産方法に関す る。

図面の簡単な説明 第１図から第４図は、酸性ｂＦＧＦ、酸性ｈＦＧＦ、塩基性ｂＦＧＦおよび塩基 性ｈＦＧＦをコードするＤＮＡ配列、および推定されたこれらのアミノ酸配列を 表す。第１図ａは、酸性のウシＦＧＦに対する部分配列を表す；第１図すは、こ のタンパクの完全なアミノ酸配列を表す。第２図ａ、第２図すおよび第２図Ｃは 。

それぞれλファージ　λＨＡＧ−９，１、λＨＧ−３およびλＨＡＧ−３に含ま れるヒトの酸性ＦＧＦの遺伝子の３つのエキソンに対応するヌクレオチド配列お よび推定されるアミノ酸配列を表す。

第２図ｄは、　Ｊａｙｅらにより開示された。完全なアミノ酸配列およびヒトの 酸性ＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を表す。

第５図は、酸性ｂＦＧＦのＮ末端配列から設計されたオリゴヌクレオチドプロー ブ８８９／８９０．８９１および８５３−８５６を表す。

第６図は、ゲノムの酸性ｂＦＧＦクローンλＢＡ２およびλＢＡ３に対する挿入 部分の制限地図を表す。

第７図は、ウシの酸性ＦＧＦゲノムプローブ２５０／Ａ１ｕＩのＤＮＡ配列を表 す。

第８図は、酸性ｈＦＧＦゲノムクローンλＲＡＧ−９，１における挿入部分の制 限地図を表す。

第９図は、酸性ｈＦＧＦの部分合成遺伝子、すなわち“合成型−酸性ｈＦＧＦゝ を表す。

第１０図は、塩基性ＦＧＦプローブ１０９７／１０９８を表す。

第１１図は、塩基性ｂＦＧＦ　ｃＤＮＡクローンλＢＢ２の制限地図を表す。

第１２図は、　ＣＶ−１細胞における塩基性ｈＦＧＦの一時的な発現の結果を表 す。

第１３図は、塩基性ｈＦＧＦを構築するためにｈＧＨシグナル配列への融合物と して用いた合成オリゴヌクレオチドを表す。

第１４図は、いくつかの塩基性ｈＦＧＦ組換えクンバクに対するｈＧＨ／ＦＧＦ 融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。

第１５図は、いくつかの酸性ｈＦＧＦ組換えタンパクに対するｈＧＨ／ＦＧＦ融 合連結部におけるアミノ酸配列を表す。

第１６図は、第１５図のタンパクのいくつかの部分をコードするために用いたＤ ＮＡ配列を表す。

第１７図は、ヒトの塩基性ＦＧＦをコードする遺伝子の地図を表す。

壮圀ｐス恭方迭 Ａ、　、°、　己が” ２つの異なったウシ（および類似のヒト）繊維芽細胞成長因子は、他の人々によ り均一にまで精製され、そして部分的にあるいは完全に配列決定されている。両 回子は、ウシの脳および副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞、ヒトの膝静脈内皮細 胞、ウシの副腎皮質細胞、顆粒膜細胞および脈管平滑筋細胞などの培養細胞を用 いたインビトロ分析において有糸分裂活性を示す。これらの細胞培養を用いるイ ンビトロ分析は。

Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、＋ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　 （１９８５）　１２２　：　３２３−３３２；およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃ ｚ、　Ｄ、、ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）９７　：　１６７７ −１６８５によって述べられている。ごく最近、別のインビトロ分析が、　Ｅｓ ｃｈら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８５） ８２　：　６５０７−６５１１　；およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、 ＋　ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ（１９８６）’１２７　：　１２１− １３６により報告された。精製された塩基性ｂＦＧＦは、ニワトリの未尿膜分析 においてインビボで脈管形成能があることが示されている（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏ ｗｉｃｚ、　Ｄ、ホルモンンバクおよびペプチドＸＩＩ　：　２０５−２３０（ アカデミツクプレス））。精製された酸性ｂＦＧＦは、同じ分析においてインビ ボで脈管形成能があることが示されている（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ、Ａ、、　ｅｔ ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（前出））。

ウシの脳下垂体の塩基性ＦＧＦは、完全に配列決定されており、それを第３図に 示す；ゲノムおよびｃＤＮＡからここで決定されたヒトのＦＧＦの配列を第４図 に示す。−次配列は、１４６個のアミノ酸を含んでおり９図中の“１”番のプロ リン残基で始まっている。この−次配列は、　Ｇｉｍｉｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ 　ら、　ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　（前出）により報 告された。天然のウシのタンパクのＮ末端配列、およびＥｓｃｈ、　Ｐｒｏｃ　 Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（前出）により報告された天然クンバクの全配列と 一致している。より大きな分子量を有するヒトの塩基性ＦＧＦは、ヒトＡｃａｄ 　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８６）　８３　：　２４４８−２４５２．により 報告されている。ヒトおよびウシのＤＮＡにおいて、第３図および第４図の上流 側配列を元のＡＴＧ開始コドンまで翻訳することは、第３図および第４図におい て残基１で示されるプロリンの上流側のアミノ酸を含む、各タンパクの別の型の ものも生産され得ることを示す。これらのＤＮＡには、　ＡＴＧを含め９つの上 流側コドンが存在する。遺伝子が真核系で発現する場合、　ＡＴＧによりコード されるメチオニンが、プロセッシングを受けることはかなり確かである。遺伝子 が組換えによって細菌系で発現する場合、このようなプロセッシングは、起こす 得る場合も、起こり得ない場合もある。従って、タンパクの長い型のものは、さ らに８つのアミノ酸ブロー配列または合計１５４個のアミノ酸を含む。５Ｋ−１ （ＥＰ−１細胞から単離された。この伸長したＦＧＦは、そのＮ末端がブロック されていることも示されている（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、 （前出））。

上述のインビトロ分析においてＦＧＦ活性を有し、そして第３図（１４６個のア ミノ酸型）に示されているウシの脳下垂体の塩基性ＦＧＦと類似していると推定 されるＮ末端配列を有するタンパクも、ウシの脳、副腎、黄体、網膜、腎臓、お よびヒトの胎盤から単離されている。これらの組織のあるものから得られた天然 のタンパクは、不均一である一推定される１５個のＮ末端アミノ酸を欠く第２の 型は、活性を保持している（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　ｏ、Ｉ　Ｍｅｔｈ 　Ｅｎｚ　（１９８６）＋印刷中）。従って。

ウシおよびヒトの塩基性ＦＧＦは、３つの型が存在するーこれらは第３図および 第４図に成熟型として示されている。ここに示されている推定の成熟型配列のう ち、長い型はＮ末端にさらに８個のアミノ酸を含んでおり、短い型は１５個のア ミノ酸を欠いている。従って、天然で生産される“長い（ｌｏｎｇ）”塩基性Ｆ ＧＦは、１５４個のアミノ酸を含み、“基本型（ｐｒｉｍａｒｙ）”塩基性ＦＧ Ｆは、１４６個のアミノ酸を含み、そして“短い（ｓｈｏｒｔ）”塩基性ＦＧＦ は、１３１個のアミノ酸を含んでいると考えられている。これらのＦＧＦは、非 常に多くの塩基性アミノ酸残基（リジン、アルギニン、ヒスチジン）を含んでお り、従って中性ｐＨＯ下で陽イオン性であるので、“塩基性”　ＦＧＦと呼ばれ る。

あるタンパクが前述の分析でＦＧＦ活性を有し、ヘパリンに結合し、中性ｐｕＯ 下で陽イオンであり、そしてウシの血清アルブミン（もし適当なら）、あるいは ウシ（またはヒト）のＦＧＦもしくはそれの合成ペプチドまたは天然ペプチドに 対する他の抗体に結合した。アミノ末端配列（ｔｙｒＩｏ）　ＦＧＦ　（１−１ ０）の合成類似体を用いて調製された抗体と免疫的に反応する場合、このタンパ クをここでは塩基性ＦＧＦと定義する。Ｂａ１ｒｄ＋Ａ、ら、　Ｒｅ　ｕｌａｔ ｏｒ　Ｐｅ　ｔｔｄｅｓ　（１９８５）　１０　：　３０９−３１７を参照され たい。

酸性ＦＧＦは、他の人々によりウシの脳から単離され、そして始めの３４個のア ミノ酸残基が決定されている。ウシおよびヒトの酸性ＦＧＦに対する。ここでの 遺伝子のクローニングにより、酸性ｂＦＧＦに対してアミノ酸配列１−３４に付 加的なアミノ酸配列が第１図ａに示したように推定され、そして第２図ａに示さ れるように、酸性ｈＦＧＦの部分配列が得られた。以下に記述される多くの研究 により、酸性ｂＦＧＦに対する完全なアミノ酸配列が、第１図すに示すように、 　Ｅｓｃｈら、ｌゆ劇」見」±ｆｉＲｅｓ　Ｃｏｍｍ　（前出）、およびＧｉｍ ｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ、　Ｇ、１　ら＋　５ｃｉｅｎｃｅ（前出）、により 開示された。大部分のこの研究の結果として２酸性ｈＦＧＦに対する完全なコー ド配列が、第２図すに示されるように、マキアゲ（Ｍａｃｉａｇ）グループによ り決定された。

この酸性タンパクはまた２つの活性型が知られており、第１の型は図の“１″番 のフェニルアラニン残基で始まる１４０アミノ酸配列を有しており、そして第２ の型はアミノ酸７−１４０に対応する短い型である。ウシおよびヒトのタンパク ば。

いずれもＮ末端伸長型で存在し得る。図の”１”番のアミノ酸に対するコドンの 上流側のＤＮＡの（括弧で示す−１５のＡＴＧ開始コドンへ戻る）翻訳によって 、伸長したタンパクの付加的配列が示される。塩基性ＦＧＦの場合のように、Ｎ 末端のメチオニンは、遺伝子が細菌で発現する場合にはあり得ないが。

真核発現宿主ではほとんど確実にプロセッシングされる。従って、上述の塩基性 ＦＧＦのように、天然の酸性タンパクは。

３つの型で存在し得る：１つは、切形型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）　ＦＧＦ。

すなわち１３４個のアミノ酸を含む“短い”酸性ＦＧＦ；１つは。

Ｎ末端伸長型、すなわち１５４個のアミノ酸を含む“長い型”：そして残りの１ つは９図の“１″番の残基で始まる１４０個のアミノ酸を含む“基本型”酸性Ｆ ＧＰ　ｏ　Ｂｕｒｇｅｓｓ、　ｗ、ｎ、、ら、　（印刷中）により、ウシの脳の 長い型はアセチル残基でブロックされていることが示された。これらのタンパク は、不均衡な数の酸性アミノ酸残基、すなわちグルタミン酸およびアス、パラギ ン酸を含んでおり、従って中性ｐＨＯ下で陰イオンである。

あるタンパクがインビトロ分析でＦＧＦ活性を示し、ヘパリンに結合し、中性ｐ Ｈの下で陰イオンであり、そしてヒトまたはウシの酸性ＦＧＦあるいはそれの合 成ペプチドまたは天然ペプチドに対して調製された抗体と免疫的に反応する場合 、このタンパクをここでは酸性ＦＧＦと定義する。

酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦは、上述のタンパク、または第１図〜第４図に示 されるアミノ酸配列を有するクンバクを示すために、ここで用いられる。もちろ ん、これらの定義は。

示された特定の配列に限定されるものでなく、前述のインビトロおよび免疫的分 析によって測定した生物学的活性、および中性ｐＨＯ下でのそれぞれの陰イオン 性または陽イオン性が変化しない限り、アミノ酸残基の欠失、付加または交換の ような、偶然の変化あるいは計画的に誘導した変化を含むタンパクを包含する。

もちろん、修飾型は若干変化した定量的活性および特異性を有し得る。

“精製した”または“純粋の”とは、天然の状態で見られる９通常それに付随す る物質を含まないものを意味する。従って１例えば“純粋の”酸性ｈＦＧＦは、 ヒトの脳または脳下垂体における本来の環境下で通常付随している物質を含んで いない酸性ｈＦＧＦを意味する。もちろん、′純粋”の酸性ｈＦＧＦは。

グリコシド残基のような、それと共有結合によって結合している物質を含み得る 。

“動作可能に連結した”とは、成分がその通常の機能を果たすように位置してい る連結部を意味する。従って、コード配列に動作可能に連結した。制御配列また はプロモーターは。

このコード配列の発現に効果的である。

“制御配列”とは、ＤＮＡ配列、あるいは所望のコード配列に適切に連結した場 合、このような配列に適合した宿主においてその発現を有効にし得る配列を意味 する。このような制御配列には、少なくとも原核および真核宿主におけるプロモ ーターが含まれるが、任意に転写終止シグナルも含まれる。

発現を効果的にするのに必要な他の因子または補助的な他の因子もまた同定され 得る。ここで用いられるように、“制御゛配列”とは、単に、用いられる特定の 宿主において発現を効果的にするのに要求されるどのようなりＮＡ配列をも意味 する。

“細胞”または“細胞培養”、もしくは“組換宿主細胞”または“宿主細胞”と は、内容から明らかであるので、しばしば互換性をもって用いられる。これらの 用語は、直接の対象細胞を包含するが、もちろん、その子孫をも包含する。偶然 の変異あるいは環境の変化により、必ずしもすべての子孫が親細胞と正確に同一 でないことが理解されている□。しかしながら、このような変化した子孫は、そ の子孫が初めの形質転換細胞に与えられた性質に関連した性質を保持している限 り、これらの用語に包含される。この場合９例えばこのような性質は１組換えＦ ＧＦを生産する能力であり得る。

Ｂ、二瓜町記載 朋途盈よ丈投与 本発明は成長因子タンパクをコードするＤＮＡを提供する。

成長因子タンパクは、傷の治癒を促進するのに有効であり。

そして、さらに成長因子タンパクに特異的な阻害剤の設計を行うために充分な量 が純粋に提供され得る。精製された成長因子は一般に、血管新生や治癒を促進す るために、傷ついた組織に局所的に適用される。適当な対象としては、米傷、骨 折、成形外科で扱われるような外科的擦過傷、または治療を要する他のものがあ る。これら因子の適用は治癒を促進するので、それらはまた、感染の危険を減少 させる。

ＦＧＦが血管の新生を促進するということにおいて価値がある適応症には、骨折 、靭帯および股の治療、脱炎、および滑液嚢炎のような筋骨格の状態；火傷、切 傷、裂傷、褥庶、および糖尿病患者に見られるような遅治癒性潰瘍のような皮膚 の状態；および虚血症および心筋梗塞症時の組織治療時、が包含される。

入手可能な賦形剤および担体を用い組換え技術により生産される成長因子の処方 は、当該分野で既知の標準的な方法により調製される。このタンパクは、所望で あれば、制御された放出システムの一部として、ローション、ゲル、または抗生 物質のような付加的な活性成分を有する軟膏、として処方され得る。

表面の障害に関して最も適当である局所的な投与においては１例えば、０．１〜 １．０％溶液を用いる標準的な局所的処方が採用される。そのような溶液は患部 に、１日あたり３〜６回適用される。もちろん軟膏または他の処方物の濃度は、 傷の程度および患者の性質に依存する。はとんどの処方（プロトコル）において は、用量は時間が経過して傷跡が残る可能性が減少するにつれて減じられる。例 えば、第３度の火傷のような最も重症の傷は典型的には１０％組成物で処置され る。

しかし−治癒が始まると、用量は傷が治癒するにつれて徐々に約０．１％または それ以下にまで下げられる。ＢＳＡを担体・としたＥＧＦの局所的処方は、　Ｆ ｒａｎｋｌｉｎ、　Ｊ、ｏ、ｌ　ら、　Ｐｌａｓｔｉｃ　ａｎｄＲｅｃｏｎｓｔ ｒｕｃ　Ｓｕｒ　（１９７９）　６４　：　７６６−７７０．に開示されている 。

骨および組織の治療には、投与は局所的になされることが好ましいが、皮下注入 または標的の近傍に直接的に移入した遅延放出性の処方によることができる。外 科手術は骨の損傷のような状況に対しては必要と存ることもあり得るので、直接 的な注入が有利である。遅延放出型は、　Ｈｙｄｒｏｎ　（Ｌａｎｇｅｒ。

Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７６）　２６３　：　７９７−７９９ ）またはＥｌｖａｘ　４０Ｐ（Ｄｕｐｏｎｔ）（Ｍｕｒｒｙ、　Ｊ、Ｂ、、　ｅ ｔ　ａｌ、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　（１９８３）　１９　：　７４３−７４７）のよ うなポリマーに処方され得る。他の持続的放出系は。

Ｈｓｘｅｈ＋　Ｄ−Ｓ−Ｔ、’　ら、　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ　（１９８３） 　７２　：　１７−２２により示唆されている。本発明では望ましくはないが、 特に上皮成長因子の処方がＢｕｃｋｌｅｙ、　Ａ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８５）斂：　７３４０−７３４４に示唆されて いる。

局所的投与で、持続的な放出の送達については、処方物中のＦＧＦ濃度は、状態 の程度および該ポリマーからのＰＧＰの放出速度を含む多くの因子に依存する。

一般的に、その処方は。

Ｂｕｃｋｌｅｙら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（前出） ）により記載されているように、ホルモンが血清レベルの約１００倍、または９ 組織濃度の１０倍の、定常的な局部的濃度を達成するように構成される。５〜５ ０ｎｇ／ｇ湿潤重量の組織中のＦ　Ｇ　ｐ　ｔ７４度（６０ｎｇ／ｇ湿潤重量で のＥＧＦに比べて）を基準として、１時間あたり５０〜５０００μｇ　ＦＧＦの 放出が許容され得る。もちろん。

その初期濃度は傷の程度に依存する。

ＦＧＦは、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αまたはＴ ＧＦ−β）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２）、および ／または血小板由来成長因子（ＰＤ、ＧＦ）のような他の成長因子と、協奏的に 、そして共働的にも働き得ると期待される。さらに、骨の治療に関しては特に、 それは副甲状腺ホルモンの拮抗薬と共働して働き得る。なぜなら、副甲状腺ホル モンは骨の再吸収を促進するからである。従って、所望の組織の治療をより効果 的に達成するために１本発明のｐｃｐが前述の因子の１もしくはそれ以上と同じ 組成でもしくは同じ処方で投与される実施態様もまた９本発明の組成物および投 与処方内に包含される。

ＦＧＦは、軸索の成長、神経再生、および神経単位の生存を促進させることに効 果的であるので、それは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のようなある 種の神経性の疾患。

筋萎縮性側索硬化症、および神経系の一般的老化の処置；そしてを髄および末梢 神経の外傷に有効であり得る。

これらの症状に対して薬剤を投与するときには、傷の治癒に関連して上に述べた 処方と同様の処方で注入することによるのが好ましい。この薬剤はまた。移植に 先立ち本発明のＦＧＦ調製物で培養物を処理することによる移植治療のときのよ うに、細胞培養物の注入という手段を用いて送達され得る。さらに、このＦＧＦ は髄液に直接注入され得、または、系統的に適用され得る。系統的処方は一般に 当該技術分野で既知であり、緩衝液または生理学的食塩水、または他の適当な賦 形剤中での処方を包含する。用量レベルは、傷を治癒させ得る程度のレベルであ る。しかし９組織培養または体外移植組織の維持については、それは、血清また は培地の０．１〜１．Ｏｎｇ／ｍ１．で供給され得る。

ＦＧＦタンパクも、外科手術中に損傷した組織の再形成および治療を促進させる ことにおいて、特に有用である。この用途のために、外科用ステープルとして用 いるポリマー中にＦＧＦタンパクを埋めこむことが有用であり得る。このタンパ クはこのように、ステープルにより行われる機械的縫合を生物学的に補うことが でき、そして、治療した組織における“自然の”治癒過程を増大させ促進させる ことができる。

さらに、ここで述べているＦＧＦタンパクにより供給されるような脈管形成刺激 により、インビトロにおける１組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およ びコラゲナーゼの放出が起こる　（Ｇｒｏｓｓ、　Ｊ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、　 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８３）８０　：　２６ ２３−２６２７）　、従って９本発明のＦＧＦタンパクもまた。

これらの酵素に応答する状況の処置に有用である。急性な状況（発作または心臓 発作に関連する血液凝固物が存在するような状況）では、塞栓症を形成する慢性 的傾向に対する処置のために、凝固物を溶解するために大用量のｔＰＡを直接投 与することが必要であり得るが、血流のｔＰＡの適当なレベルを維持するために ＦＧＦを投与することが望ましいかもしれない。

従って、この症状に対して、筋肉内または皮下注射のような従来の方法を用いて 、薬剤の系統的投与を行うことが好ましい。

本発明は、上記の症状に関連した用途に、純粋なＦＧＦ成長因子の実際的な量を 提供する。４つの特異的な内皮成長因子が例示されており、その各々は３つの形 （ウシの酸性および塩基性ＦＧＦ、およびそれらのヒトに相当するもの）につい て明らかに活性がある。酸性および塩基性因子はいずれも、ここで述べているよ うに、製型、基本型、そして矩型で発現すると考えられる。製型のＮ末端メチオ ニンは、真核細胞系において該タンパクが生産されると切り離されること、そし て。

続くアミノ酸残基が転写後におそらくアセチル化により誘導されると考えられる 。

種々の型のＦＧＦは認識されるシグナル配列を持たないが。

それは何らかの方法で分泌されているに違いない。なぜなら。

それを産生じている細胞の外の、膜結合受容体で２作用するからである。従って 、たぶん認識される構造分泌経路によっては分泌されないので、その分泌は、細 胞溶解による。またはエキソサイトシス（開口分泌）によるような他の方法で達 成される。ＦＧＦが自然に誘導されるほとんどの組織においては、そして多くの 哺乳類の発現系においては、そのような放出は９通常に用いられているＡ２３１ ８７　（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）のようなカルシウムイオノフオアでのエキソサ イトシスを行うことにより達成され得る。インビトロの状態においては、カルシ ウムイオノフオアは＋　１　ｍＭ　ＣａＣ１ｚの存在下で１〜１０μ門となるよ うに培地に加えられる。マクロファージまたは卓球に由来する発現系では、リボ ポリ多ＩＪｉ　（ＬＰＳ）を１０μｇ／ｍｌで添加するような、または大腸菌エ ンドトキシン（Ｄｉｒｃｏ）　（３００ｎｇ／−）を加えるような他の活性化法 が効果的であることが示されている。これらの刺激は、マクロファージ由来の類 似因子インターロイキン１を放出することが示されている（Ｍａｒｃｈ＋Ｃ−Ｊ 、、　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１５　：　６４１−６４７ ）。これらの手法もまた。以下で述べるように、付加的なシグナル配列なしで細 胞内で生産されると９組換えにより生産されるＦＧＦタンパクを放出させるのに 採用され得る。細胞内で産生したタンパクの放出を起こさせる刺激には、ホルボ ールエステルおよびトリグリセリドが包含される。

遺１日」吐収 例示したＦＧＦをコードしている配列がここで得られるような一般的な戦略は以 下のようである。ウシの酸性ＦＧＦの既知のＮ末端配列を、ファージに連結した ウシのゲノムライブラリーとともに使用するための一連のプローブを設計するの に用いた。プローブにハイブリダイズしたファージ組換体をライブラリーより単 離し、“天然の”プローブを得るために。

Ｍ１３クローニングベクターにクローニングするのに適したより小さな断片にま で分解した。これにより、ウシの酸性タンパクの一部分に相当する２５０ｂｐの 配列を含む旧３プローブが得られた。このプローブは、これらの種の中の塩基性 型の遺伝子を得るためだけでなく、ウシとヒトの両起源の酸性型に対し完全にコ ードしている配列を回収するための中心である。

簡単には、ファージにクローン化した選抜された酸性ｂＦＧＦ遺伝子断片のＡ１ ｕＩ分解により得られた断片を、ショットガン法でＭ１３にクローン化した。適 当なプローブＤＮＡにハイブリダイズされた２５０ｂｐ断片を選抜し、配列決定 した。上記のものを２５０／Ａｌｕｌと表すが、それをｐＢＲ３２２に転写し、 そしてウシの脳、視床下部、あるいは脳下垂体のｃＤＮＡライブラリーを探索す るため（イントロンで中断されていない完全な酸性ｂＦＧＦ配列を得るため）、 およびヒトのゲノムライブラリーを探索するため（ヒトの酸性ＦＧＰゲノム配列 の最初のエキソンを得るため）、に用いた。酸性ＦＧＦをコードしているヒト遺 伝子の中央部および第三番目のエキソンを、以下の実施例に記述のように、オリ ゴマーのプローブを用いて得た。これらのプローブを１合成したヒトの酸性ＦＧ Ｆ遺伝子をもとにして設計した。加えて、この同じ２５０ｂｐの断片を、酸性型 よりもむしろ塩基性型に相応するＤＮＡを変えるために、入手可能なアミノ酸配 列の情報を有効に利用して、塩基性型のプローブを設計するのに用いた。それゆ え、酸性型ｂＦＧＦのＮ末端をコードしている配列と塩基性型のｂＦＧＦのアミ ノ酸配列との狂゛較をもとにして設計した修飾プローブを、塩基性型ｂＦＧＦ　 ｃＤＮＡに対して、同じウシの脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーを探索す°るため に用いた。回収されたウシのクローンを２次いでヒトの塩基・性型ＦＧＦをコー ドしているＤＮＡをコードするゲノム配列を回収するために、ヒトのゲノムおよ びｃＤＮＡライブラリーを探索するのに用いた。選択的には、ウシのｃＤＮＡク ローンλＢＢ２を。

塩基性型ＦＧＦタンパクのヒト型をコードするものにＤＮＡ配列を変換させるた めに変異させた。酸性型および塩基性型の両ＦＧＦに対して、下記のｃＤＮＡク ローンおよびゲノムクローンは。

このような哺乳類のライブラリーから類似のコード配列を得るために９種々の種 から調製したＤＮＡライブラリーを探索すを与えることもある。脳下垂体、脳、 視床下部、あるいは腎臓のような種々の組織から調製したｃＤＮＡライブラリー もこのようにして選抜され得る。

一匹Ｌ１伝ｌ］と１狐 このクローン化したゲノムあるいはｃＤＮＡ配列は、適当な発現系で発現され得 る。もちろん、ここで開示したＤＮＡに対しても、それらを回収するための前述 のプロトコルを繰り返す必要はなく、従来の化学合成法が適当に用いられ得る。

このことは、ＤＮＡを調節することにより、あらゆる所望の形のタンパクを得る ことを可能にする。ｃＤＮＡ配列は、バクテリア。

酵母、あるいは真核細胞を含むどのような宿主にでも適した適当な制御を供給し 得る。ヒトの酸性ＦＧＦのゲノム配列の再構築を、３つのエキソンを含む３つの 寄託されたλファージから得ることができる。イントロンを含むゲノム配列は、 真核細胞の制御配列、および転写物のスプライシングが可能な真核細胞宿主を用 いて発現させ得る。ワタシニアをもとにした発現も用い得る。典型的な制御配列 ＤＮＡ５および宿主を以下の０．１６節で与えている。

特に、完全長のＦＧＦをコードする完全なりＮＡは９例えば。

酸性あるいは塩基性ＦＧＦＯ長型、製型型、あるいは矩型のどれでも得るために １組換え方法および合成方法を組合せて用いながら構築され得る。異種のシグナ ル配列をこれらに融合することも可能であり、所望形態でタンパクを得るために 。

開裂部位に対するシグナル配列の既知の関係を考慮に入れることも利用可能であ る。細胞内で産生された形態のタンパクは細胞溶解により得られる。あるいは細 胞からのそれらタンパクの遊離は、上で述べたように刺激され得る。細胞に関係 した形態、もしくは分泌されシグナル配列に融合されると推定される形態（この 形態は、Ｃ）ＩＱ細胞のような哺乳類細胞と和合可能な制御系を利用する）の発 現系は、特に好ましい。

また、ワタシニアをもとにしたシステムがより好ましい。このシステムは、感染 しやすい細胞中にて、安定な、あるいは一時的な発現に使用可能である。

このように産生された組換えＦＧＦタンパクを２次いで、天然起源からＦＧＦを 精製するために用いられる方法と同様の方法で精製する。しかし、このタンパク は出発材料の極めて大部分を占めているので、精製はかなりＮ単である。

炙形ユ ヒトのゲノムＤＮＡは、遺伝子の第二のエキソンの領域に多形性があることがす でに示されている。この多形性の存在は。

ＦＧＦが腫瘍により分泌されるので、充実性腫瘍になる傾向を予想させる。そし て、多形性は腫瘍への滋養物の流れを保つ血管の成長を促進するので、それらが 生存するためにおそらく必要である。

ば、血液サンプルから従来の方法により得られ、そしてポリアクリルアミドゲル 上でサイズによる分離に供され、そして標準的なサザンプロット操作を用いて探 索される。効果的なプローブは、以下で述べるλＢＢ２への２．１ｋｂの挿入か ら得られた１、４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片である。このようなプローブあるいはそ れと同等物を、単離されたヒ）　ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩ［分解物を含むゲルにハ イブリダイズさせるべく用いると、２．７ｋｂの断片が通常検出される。いくつ かの個体では、付加的な２．９ｋｂ断片も見い出される。これらの断片は、第１ ７図に示すように、エキソン２の周辺の遺伝子領域に地図化される。

検査した３つの個体のうちで、２つは２．７ｋｂ断片だけを示した。１つは２． ７断片および２．９ｋｂ断片の両方を示した。ハイブリダイゼーションの強度は ９両断片を持つ個体が両対立形質を含むことを示した。このことは、マウス／ヒ トハイブリッド細胞系由来のＤＮＡのサザンプロット分析により得られた結果に よって、支持される。このようなハイブリッド（ここでは１つの染色体のみが転 写される）では、２つの断片のうちの１つだけが各基に現れる。

Ｃ０豆１１℃机汰 細胞の形質転換、ベクターの構築、メツセンジャーＲＮＡの抽出、　ｃＤＮＡラ イブラリーの調製などに用いる技術の大部分は。

当該分野で広〈実施されている。そして、はとんどの従業者は、特異的条件およ び方法を記載している標準資料に通じている。しかしながら９便宜上、以下の節 にその概要を示す。

Ｃ，１，ｌおよび　′配置 原核生物および真核生物の両方の系を用いて、　ＦＧＦをコードする配列を発現 し得る；原核生物の宿主は、もちろん、クローニングに最も便利である。最も顯 繁に使われる原核生物は、大腸菌のいろいろな株で代表される；しかしながら、 他の微生物の株も使用し得る。宿主に適合した種より導かれる複製部位９選択可 能なマーカーおよび制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる；例えば、 大腸菌は、典型的には。

ｐＢＲ３２２の誘導体、すなわちＢｏｌｉｖａｒ、らＧｅｎｅ　（１９７７）　 ２　：　９５゜によって大腸菌種より誘導されたプラスミドの誘導体、を用いて 形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐 性の遺伝子を含んでいる。従って、所望のベクターを構築する際に保持され得る かあるいは分解され得るような、複数の選択可能なマーカーを与える。一般に用 いた原核生物制御配列（ここでは、リポソーム結合部位配列に加えて、任意にオ ペレーターを伴った。転写開始のためのプロモーターを含むと定義される）は、 β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター 系（Ｃｈａｎｇ。

ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）　１９８　：　１０５６）およびトリ ゛ブトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８０）　８　：　４０５７）およびラ ムダ由来のＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔ ａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ＋　Ｎａｔｕｒｅ　（細菌に加え、酵母のような真核微生 物も宿主として、用いられ得る。数多くの他の株または種を一般に利用し得るに もかかわらず、サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実験用菌株、ベーカー酵母（Ｂａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓ ｔ）が最もよく用いられる。例えば、　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｍｅｔｈ 　Ｅｎｚ（１９８３）　１０１　：　３０７の、２μの複製起点、または他の酵 母の適合した複製起点（例えば、　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、　ｅｔ　ａｌ＋　Ｎ ａｔｕｒｅ　（１９７９）２Ｂ２　：　３９．　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ、　Ｇ、、 　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）　１０　：１５７およびＣ１ａｒｋｅ 、　Ｌ、　ｅｔ　ａｔ、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）　１０１　：　３００ を参照）を用いるベクターが用いられ得る。酵母ベクターに対する制御配列は、 解糖酵素の合成に対するプロモーター（）ｌｅｓｓ。

ｅｔａｌ、ＪＡｄｖＥｎｚｍｅＲｅ　（１９６８）　７　：　１４９　；　Ｈｏ １ｌａｎｄ、　ｅｔａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９７８）　１７　： 　４９００）を含む。当該分野に既知の他のプロモーターには、３−ホスホグリ セレートキナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、Ｊ　Ｂｉ ｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８０）　２５５　：２０７３）が含まれる。転写が増殖 条件および／または遺伝的背景により制御されるという付加的利点を有する他の プロモーターとしては、アルコール脱水素酵素２．イソチトクロームＣ２酸性リ ン酸氷解酵素、窒素代謝に関連する分解酵素、アルファー因子系、マルトースお よびガラクトース利用に応答する酵素に対するプロモーター領域がある。また、 ターミネータ−配列は、コード配列の３゛末端に存在することが望ましいと考え られている。このようなターミネータ−は、酵母由来の遺伝子においてコード配 列に続＜３゛未翻訳領域に見い出される。

もちろん、多細胞生物由来の真核生物の宿主細胞培養中で。

ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることも可能である。例えば、　Ａ ｘｅｌら、　４，３９９，２１６を参照されたい。これらの系は、イントロンを スプライシングし得るという付加的な利点を有し、従って、直接用いることによ ってゲノム断片を発現させ得る。有用な宿主細胞系列には、　ＶＥＲＯおよびＨ ｅＬａ細胞、そしてチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。

このような細胞に対する発現ベクターには、普通１例えば、サルウィルス４０　 （ＳＶ４０）由来の初期および後期ブロモはポリオーマ、アデノウィルス２．ウ シの乳頭腫ウィルスまたはトリの肉腫ウィルス由来のプロモーターのようなウィ ルスプロモーターなどの、＠乳類の細胞に適合するプロモータｉおよび制御配列 が含まれる。制御可能なプロモーター、　ｈＭＴＩＩ　（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、 　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　７９７−８０２） もまた使用し得る。哺乳類の細胞宿主系における形質転換の一般的な様相は、　 Ａｘｅｌ　（前出）により記述されている。現在では。

“エンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）”領域も発現を最適化する際に重要である ことは明らかである；これらは、一般に、非コード１）ＮＡ領領域おけるプロモ ーター領域の上流側または下流側に見られる配列である。必要に応じて、ウィル スを起源として。

複製起点を得ることができる。しかしながら、染色体への組込みが、真核生物に おけるＤＮＡ複製における共通の機構である。

Ｃ１２，壓ｊ■Ｌ艮 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適した標準的技術を用いること により、形質転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９７２ ）　６９　：　２１１０）によっで記述されたような塩化カルシウムを用いたカ ルシウム処理。

またはＭａｎｉａｔｉｓら、′−クローニング：　の　き（１９８２）コールド スプリングハーバ−プレス、　Ｐ、　２５４．およびＨａｎａｂａｎ。

Ｄ、、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）　１６６　：　５５７−５８０に よって記述されたようなＲｂＣ１！法は、原核生物または実質的な細胞壁障害を 有する他の細胞に対して用いられ得る。このような細胞壁を持たない哺乳類細胞 に対してはｒ　Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎｄｅｒ　Ｅｂｎ　ｎ敬ｎ］（１９７Ｂ ）　５２　：　５４６）のリン酸カルシウム沈澱法、が用いられ得るが、任意に はＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、らＣｅＩＩ　（１９７９）　１６　：　７７７−７８５ により修正された方法が用いられ得る。酵母への形質転換は。

Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７５　：　１０４ −１０９の方法または旧ｎｎ１Ｂｎ＋Ａ、ら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　 ５ｅｔ（ＵＳＡ）　（１９７８）　７５　：　１９２９）の方法に従って実施し 得る。

Ｃ・　３・五久叉二皇盪築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクターの構築には、当該分野に 既知の標準的な連結技術および制限酵素技術を採用する。単離されたプラスミド 、ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドを所望の形に、切断し、整え、そし て再連結する。

ベクターを形成するＤＮＡ配列は、数多くの供給源から利用し得る。もとになる ベクターおよび制御系は、一般に、構築の際に配列の大部分として用いられる。

利用可能な“宿主”ベクター上に見い出される。典型的な配列は、上記の節Ｃ０ １、に示されている。適切なコード配列に対して、最初の構築は９通常、　ｃＤ ＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーから適当な配列を回収するこ とである。しかしながら、この配列が開示されれば、それぞれのヌクレオチド誘 逗体から出発して、インビトロで全遺伝子配列を合成し得る。例えば。

５００〜１０００ｂｐというかなりの長さの遺伝子に対する全遺伝子配列は、そ れぞれに重複した相補オリゴヌクレオチドを合成し、そして一本積の重複してい ない部分をデオキシリボヌクレオチド３リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼを 用いて充填することにより、調製し得る。この方法は、配列が既知であるい（つ かの遺伝子の構築において成功裏に用いられた。例えば、　Ｅｄｇｅ、　Ｍ、Ｄ 、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２　ｓ　７５６　；　Ｎａｍｂａｉｒ 、　Ｋ。

Ｐ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３　：　１２９９　ＨＪａｙ、 　Ｅｒｎｅｓｔ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ加（１９８４）匠：　６３１１を参照されたい 。　゛記述されたようなホスホトリエステル法、あるいはＢｅａｕｃａｇｅ＋Ｓ 、Ｌ、、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｓ　（１９ ８１）　２２　：　１８５９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、Ｄ、、およびＣ ａｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｍ、Ｈ，、Ｊ　Ａｍ　ＣｈｅｒｈｌＳｏｃ　（１９８１） 　１０３　：　３１８５によって記述されたようなホスホアミダイト法のいずれ かによって調製される。また、この合成オリゴヌクレオチドは市販の自動オリゴ ヌクレオチド合成装置を用いて調製し得る。アニーニング前のリン酸化（ｋｉｎ ａｓｉｎｇ＞あるいはラベルのためのリン酸化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）は＋　５０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６＞　、　１０ｍＭ　ＦＩｇＣｈ、５ｍＭジチオスレ イトール、１〜２ｍＭ　ＡＴＰ＋　１．７ｐｍｏｌｅγ３２ｐ−ＡＴＰ　（２， ９ｍＣ５／ｍｍｏｌｅ）、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの存 在下で、過剰量２例えば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いることに よって行われる。

所望のベクターの成分が利用可能な場合には、それらを標準的な制限方法および 連結方法を用いて切断し、そして連結し得る。

部位特異的なりＮＡの切断は、当該分野に既知の条件下で。

適当な１つの制限酵素（または複数の制限酵素）を用いて処理することにより行 われるが、特別なものでは、これらの市販の制限酵素の生産者によって指定され た条件下において行われる。例えば、ニューイングランドバイオラボの製品カタ ログを参照されたい。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２ ０μｌの緩衝液中で、１単位の酵素によって切断する；実施例においては、典型 的には、過剰量の制限酵素を用いてＤＮＡ基質を確実に完全分解する。変更する ことも可能であるが、約３７℃にて約１〜２時間にわたってインキュベーション し得る。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホルムで抽出すること により、タンパクを除去する。

さらに、引き続いてエーテル抽出を行い得る。エタノールを用いて沈澱させるこ とにより、水層から核酸を回収する。必要に応じて、標準的な技術を用いてポリ アクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を行うことにより、切断され た断片を大きさによって分離し得る。大きさによる分離に関する一般的な記述は 、ル１加世ｓ　ｉｎ　Ｅｎ、ひμｍ旦ｌ　（１９８０）　亜＝４９９−５６０に 見い出される。

制限酵素で切断した断片は、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ） の存在下で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの端な末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）に することが可能である。インキュベーションは、５０ｍＭ１−リス（ｐＨ７，６ ）　、　５０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ。

６ｍＭＤＴＴおよび０．１〜ｌ　ｍＭ　ｄＮＴＰ中、２０〜２５℃にて１５〜２ ５分間にわたって行う。クレノー断片は、５゛一本積の突出部分を充填するが、 たとえ４つのｄＮＴＰが存在しても、突出した３゛一本積を元に戻す（ｃｈｕｗ 　ｂａｃｋ）。必要に応じて、突出部分の性質によって受ける制限内で、唯一の ｄＮＴＰ、または選択されたｄＮＴＰを与えることにより９選択的に修復し得る 。クレノー断片で処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ タノール沈澱させる。適当な条件下で、Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１で 処理することにより、どのような一本鎖部分をも加水分解し得る。

連結は、１５〜５０μｌの容量で、以下の標準的な条件および温度の下で行う： 例えば、２０ｍＭトリス−ＣＩ　（ｐＨ７’、５）　、　１０ｍＭＭｇＣ１ｚ、 　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　３３／Ｊｇ／ｍｅ　ＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５０ｍＭ　Ｎ ａＣ１，そして（“粘着末端”の連結に対しては）０°Ｃにて４０μＭ　ＡＴＰ 、　０．０１〜０．０２　（ワイス）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、あるいは（ “平端な末端”の連結に対しては）１４℃にて１　ｍＭ　ＡＴＰ、０．３〜０． ６（ワイス）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ。分子間の“粘着末端”の連結は１通 常、　３３〜１００μｇ　７〜ｌの全ｐ　Ｎ　Ａ？ａ度（５〜１１００ｎの全末 端濃度）で行う。分子間の“平端な末端”の連結は。

１μＨの全末端濃度で行う。

“ベクター断片”を用いたベクターの構築においては、５゛リン酸を除去し、ベ クターの自己連結を防ぐため、一般にベクター断片を細菌アルカリホスファター ゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスファクーゼ（ＣＩＰ）で処理する。分解 は、約１０ｍＭ）リス−〇Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中、ｐＨ８にてベクター１ｐ ｇあたり、約１単位のＢＡＰまたはＣＩＰを６０℃にて、約１時間にわたって用 いることによって行う。核酸断片を回収するために。

調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させる。あるい は、別の制限酵素で分解し、不要な断片を分離することによって二重に分解され ているベクターにおいても再連結を防止し得る。

配列の修正を必要とする。　ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクター上の部 分に対しては９部位特異的なプライマーによって導かれる突然変異誘発を用い得 る（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ、、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｍ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８２）　１０　：　６４８７−６５００およびＡｄ ｅｌＩｌｌａｎ、　Ｊ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、韮（１９８３）　２　：　１８３ −１９３）。これは、突然変異させるべき一本積ファージＤＮＡに対して、限ら れた不一致以外は、相補的であって、所望の変異を示す合成オリゴヌクレオチド のプライマーを用いて行う。簡単に言えば、この合成ヌクレオチドをプライマー として用い、ファージに相補的なりＮＡ鎖の合成を導き、そして得られた部分的 に。

あるいは全体が二本鎖のＤＮＡを、ファージを補助する宿主細菌に形質転換させ る。形質転換した細菌の培養液を上層寒天に注ぎ、ファージを含む単一細胞から プラークを形成させる。

理論的には、新しいプラークの５０％は、一本積として変異型を有するファージ を含み；５０％はもとの配列を有する。得られたプラークをリン酸化した合成プ ライマーとハイブリダイゼーションさせた後、正確に一致するものは結合し得る が。

もとのＤＮＡ鎖と一致しないものは結合が阻止されるのに十分な、洗浄温度で洗 浄する。次いで、プローブとハイブリダイズするプラークを選択し、培養し、そ してＤＮＡを回収する。

Ｃ０４，」Ｉじ１臣 以下に示した構築において、プラスミド構築に対する正しい連結は、まずＭ、　 Ｃａ５ａｄａｂａｎ博士から提供された大腸菌株ＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂ ａｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８０）　１３８ 　：１７９−２０７）または他の適当な宿主をライゲーション混合液で形質転換 することによって確認する。好結果の形質転換体は。

アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性または他の抗生物質耐性により選択す るか、あるいは当該分野に既知のプラスミド構築の方法に依存した他のマーカー を用いて選択する。

この形質転換体由来のプラスミドは、　Ｃｌｅｗｅ１１．　Ｄ、Ｂ、らＰｒｏｃ Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９６９）　６２　：　１１５９ の方法に従って。

また任意にクロルアンフェニコール増幅（Ｃ１ｅｈｅ１１．Ｄ、Ｂ、、　ＪＢａ ｃｔｅｒｉｏｌ　（１９７２）　１１０　：　６６７）を行った後、調製される 。いくつかの小規模のＤＮＡ調製法が一般に用いられる（例えば。

７　：　１５１３−１５２３）。単離されたＤＮＡは、制限処理によって分析さ れ、および／またはＳａｎｇｅｒ、　Ｆ、らＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ ｃｉ（ＵＳＡ）　（１９７７）　７４　：　５４６３のジデオキシヌクレオチド 法であって、さらにＭｅｓｓｉｎｇらＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（ １９８１）　９　：　３０９によって記述されているようなジデオキシヌクレオ チド法。

あるいはＭａｘａｍら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０ ）６５　：　４９９）の方法によって塩基配列を決定する。

Ｃ０５，劃ｊ」」（飼１土 ここで、クローニングおよび原核生物の発現に用いた宿主株は、以下のとおりで ある： クローニングおよび塩基配列の決定に対して、そしてほとんどの細菌のプロモー ターの制御下における構築物の発現に対して、　ＭＣ１０６１，Ｉｔ）１１．　 ＲＲＩ、　Ｃ６００ｈｆ１．　Ｘ８０３．　ＨＢＩＯＩ、　ＪＡ２２１およびＪ ＭＩＯＩのような大腸菌株を用いた。

Ｄ、尉汰 以下の実施例は１本発明を例証することを意図したものであって２本発明を限定 することを意図したものではない。図示したＦＧＦ配列をコードするＤＮＡは、 まずウシのゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして中枢プローブを得２ 次いで、付加的なりＮＡの修復を行うことによって得られる。しかしながら、中 枢プローブの配列が、現在、既知であり、従って、インビトロで科学的に構築し 得るので、この方法を繰り返す必要はない。さらに、４つの図示した配列を保持 する次崖■上 ２５０／八ｌｕｌブローフ゛の　；　ｂＦＧＦ”ツムＤＮＡ　０）Ｈ０制図示し た酸性ＦＧＦタンパクに対する完全なコード配列を得るために、ウシの２５０ｂ ｐ　Ａｌｕｌゲノム断片をプローブとじて用いてヒトおよびウシの両方のライブ ラリーを調べた。２５０／Ａｌｕｌと呼ばれるこのプローブは、以下のようにし て得た。

ウシの酸性ＦＧＦの残基１〜３４に対するＮ末端アミノ酸配列は既知である。コ ドンの選択性（Ａｎｄｅｒｓｏｒ＋＋　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、　ＰｒｏｃＮａｔ ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＩＪＳＡ）　（１９８３）　８０　：　６８３８−６ ８４２　；　Ｊａｙｅ、　Ｍ。

ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８３）　旦：　２３２５− ２３３５）に基づき。

自動合成機およびホスホアミダイトカップリング試薬を用いて、３つの長いプロ ーブを調製した。このヌクレオチドプローブの配列を第５図に示す。プローブ８ ９１は、アミノ酸１−１６に対応する４Ｂ−ｍａｒである；プローブ８８９およ び８９０は、アミノ酸１８−３４に対応する５１−ｍｅｒであり、２４位のアル ギニンに対するコドンを除いて等しい２つのオリゴヌクレオチドの５０；５０混 合物として用いた。これらのプローブは９部分的なＭｂｏＩ分解物として調製し 、　ＢａｍＨＩで処理したファージベクター。

シャロン２ｇ　（Ｗｏｙｃｈｉｋ、　Ｒ，Ｆ、＋　ｅｔ　ａｌ＋　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８２）１０　：　７１９７−７２１０＞にクロ ーニングした。これらのプローブは。

Ｆｒ１ｔｚ　Ｒｏｔｔｍａｎ博士（ケースウェスターンリザーブ）から提供され たウシのゲノムライブラリーをスクリ・−ニングするのに用いた。

ハイブリダイゼーションは、　［ｌ１ｌｒｉｃｈ、　Ａ、ら　ＥＭＢＯＪ　（１ ９８４）３　：　３６１−３６４によって述べられた方法の変法を用い、フィル ター上に複製された変性ＤＮＡに関して行った；そして洗浄条件は、　ｈｏｏｄ 、　Ｗ、１．ら　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）　３１２　：　３３０−３３７の 洗浄条件に従った。プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝 液には、２０％ホルムアミド、５×デンハ一トｍｅ　（１００ｘデンハート溶液 は、２％ウシ血清アルブミン。

２％ポリビニルピロリドン、２％フィコルに等しい）；６×ＳＳＣ（２０ｘ　Ｓ ＳＣは、３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸ナトリウムに等しい）；５０ｍＭリ ン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）　：　１００．ｃｒｇ　／−二シン精子ＤＮＡが 含まれていた；ハイブリダイゼーション緩衝液には、さらに１０％デキストラン 硫酸および約１０’　”１１０６ｃｐ／−のリン酸化されたプローブ８９１また は８８９／８９０が含まれていた。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリ ダイゼーションは、４２℃にてそれぞれ１時間および１６時間にわたって行った 。次いで、フィルターを１　ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで２２℃にて１５分間、 ２度洗浄し、その後Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で５５℃にて１０分間、１ 度洗浄した。洗浄後、これらのフィルターは、増感紙を用いて１日、感光した。

スクリーニングされたウシのゲノムライブラリーには９両方のプローブにハイブ リダイズした１０６個の組換え体の中。

５０個のファージが含まれていた。これらの５０個のファージは。

さらにプローブ８５３−８５６の混合物でスクリーニングされた。

このスクリーニングにおいて、プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼー ション緩衝液には、６ＸＳＳＣ，ｌｘデンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、　０． ０５％ピロリン酸ナトリウムおよび１００μｇ／−サケ精子ＤＮＡが含まれてい た；ハイブリダイゼーション緩衝液には、さらに１０Ｓ＝１０’ｃｐｍ／−のプ ローブが含まれていた。プローブ８５３−８５６は、１６の配列からなる４つの プールであって、６４個（全体）の１７−ｍａｒの各々はアミノ酸７−１２に対 応しており、ホスホトリエステル法を用いて合成される。しかしながら、５０個 のクローンのうち４６個は、より短いプローブにさらにハイブリダイズさせた。

このハイブリダイゼーションは、６５℃から３５℃の間で１６時間にわたって行 った。そして５０℃にてテトラメチルアンモニウムクロリドを用いる。塩基組成 に依存しない洗浄法を採用した（Ｗｏｏｄ、　Ｗ。

１、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８５）　 ８２　：　１５８５−１５８８）　。

確実にハイブリダイズする２つのファージ（λＢＡ２およびλＢＡ３　）を選択 し、ファージ挿入部分の制限地図を第６図に示されているように作製し、そして 第１図ａに示されるように部分的に配列決定した。この推定されたアミノ酸配列 を。

天然のウシの酸性ＦＧＦタンパクのＮ末端３４残基に対して公表されているアミ ノ酸配列と比較したところ、これらのクローンは正確であった。コード配列の性 質から、アミノ酸残基１−４１（第１図ａに示されている）は、これらのクロー ンにコードさていることは明らかである；直後のヌクレオチドは、イントロンを 表しているようである。このイントロンの長さは。

現在のところ、明らかではないが、完全な酸性ｂＦＧＦコード配列は、これらの λＢＡ２およびλＢＡ３　ＤＮＡ上に存在し得る。しかしながら、このタンパク に対する完全なコード配列を得るために必要な他のＤＮＡは、“ウオーキング（ ｗａｌｋｉｎｇ）″技術にλＢＡ２またはλＢＡ３を用いて、同一の遺伝子ライ ブラリーから得ることが可能である。Ｎ末端残基より上流側のコドンは、指摘さ れた１５アミノ酸のプロ配列または、先に考察したような単離された“基本”型 に比較して、Ｎ末端において１５個のアミノ酸（Ｎ末端のメチオニンが開裂する 場合は、１４個のアミノ酸）だけ伸長した天然のタンパクの“長”型をコードす ると考えられている。

２５０／Ａ１ｕＴプローブを調製するために、λＢＡ２をＡ］ｕＴで部分的に分 解し１Ｍ１３へのショットガンクローニングを行った（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、 、　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９　：　２６９−２７６）　、 　Ｍ１３プラークをプローブ８５３−８５６および８８９／８９０と２通りにハ イブリダイズさせた。両方のプローブにハイブリダイズするファージの配列を決 定した。得られた２５０ｂｐ　Ａ１ｕＩプローブは、対応する推定アミノ酸配列 とともに第７図に示す：第６図のλＢＡ２およびλＢＡ３の挿入部分の位置は、 プローブ８８９／８９０および８９１の部位と一致する。２５０／Ａｌｕｌプロ ーブは。

酸性ｂＦＧＦタンパクのＮ末端部分と一致する。

尖旌桝又 ｂＦＧＦ　ｃＤＮＡＯＵ 酸性ｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を回収するために２５０／Ａ１ｕＩプロ ーブを用いる。Ｈｕｙｎｈ＋　ｖ、Ｔ、ＩらＤＮＡクローニング　′ｒ：１朋東 手肚！　（ＩＲＬプレス、オックスフォード、　１９８４）のλｇｔｌ。

ベクダ一を用いてウシの脳下垂体、脳または視床下部のｍＲＮＡからｃＤＮＡラ イブラリーが得られる。得られハイブリダイジングクローンにより、酸性ｂＦＧ Ｆをコードする全配列を回収する。

他の哺乳類由来の類似ｍＲＮＡを用いて構築された同様のｃＤＮＡライブラリー を、２５０／Ａｌｕｌプローブを用いて調べて９例えば。

ラット、ヒツジ、ウシ、ネコ１　イヌ、ウマまたはブタの塩基性ＦＧＦが得られ る。

大施冊主 散設ｈＦＧＦゲノムＤＮＡのｈ管１１ Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ　（Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ且（１９７ ８）　１．５　：　１１５７−１１７４）のヒト胎児の肝臓のゲノムライブラリ ーをヒトの配列の起源として用いた。ニックトランスレーションした２５０／Ａ ｌｕｌプローブを用いてこのライブラリーを調べた。プレハイブリダイゼーショ ン／ハイブリダイゼーションの条件は、４０％ホルムアミドを用いること以外は 実施例１のプローブ８８９／８９０および８９１に対する条件と同一であった。

ハイブリダイゼーションは、４２℃にて１６時間にわたって行った。次いで。

フィルターを室温にて１　ｘｓｓｃ、　ｏ、ｔ％ＳＤＳで洗浄し、そしてハイブ リダイズしたクローンを培養したところ、λＨＡＧ−９，１と呼ばれるものは、 所望の酸性ｈＦＧＦ配列を含んでいた。このクローンの部分的な制限地図を第８ 図に示す；ヌクレオチド〕　およびアミノ酸配列に関する情報は、第２図ａに示 す。アミノ酸１−４１をコードするヌクレオチド配列を同定し得る；この配列に は、ゲノム酸性ｂＦＧＦにおけるように、イントロンが続いていた。酸性ｈＦＧ Ｆおよび酸性ｂＦＧＰのアミノ酸配列は、５位、２１位および３５位において異 なっている。

ヒトの酸性ＦＧＦをコードするＤＮＡは、これに対応する単離されたウシのタン パクのＮ末端の上流に、さらに１５個のコドンを含んでいる。これらのコドンは 、ウシのタンパクのＮ末端の延長部分と高い相同性を有するアミノ酸配列をコー ドする。この翻訳配列は、第２図ａの括弧内に示されている。ウシのＤＮＡと比 較すると、−３位、−６位、−９位および一１２位のコドンにはヌクレオチド置 換が存在するが、翻訳されたタンパクは存在しない。−１０位のコドンにおける ヌクレオチド置換によって、ウシのタンパクのＴｈｒ残基はヒトのタンパクでは Ｉｌｅ残基となる。ウシの酸性ＦＧＦと同様に、このＮ末端延長部分は、プロ配 列または単離された“基本”型タンパクの“長”型を表し得るが、このいずれか はメチオニンの開裂に依存して、１４もしくは１５のアミノ酸のＮ末端延長部分 を含んでいる。

ヒトの酸性ＦＧＦをコードするゲノムＤＮＡのエキソンであって、中間エキソン 、およびＣ末端をコードするエキソンに対応するヌクレオチド配列を含むλフア ージクローンも得た。

上述のλＢＡＧ−９，１とともに、これらのファージは完全なタンパクコード配 列を与える。

Ｗｙａ＋ａｎ、　Ａ、Ｒ，らＰｒｏｃ　Ａｃａｄ　Ｎａｔｌ　Ｓｃｉ　（ＬＩＳ Ａ）　（１９８５）　８２　：２Ｂ８０−２８８４によって述べられているよう に調製したヒトのゲノムライブラリーから中間エキソンを有するファージを得た 。

これは、ヒトのゲノムを５ａｕ３ＡＩで部分分解し、得られた断片をλシャロン ３０ファージのポリリンカー領域のＢａｍＨ１部位へ挿入することによって調製 されるライブラリーである。この挿入部分は、容易に除去され得るので、ライブ ラリー中の２つのＥｃｏＲＩ制限部位の間に位置している。

このゲノムライブラリーは、２つのオリゴヌクレオチドをプローブとして調べら れた。これらのオリゴヌクレオチドは。

次の実施例４に記述され、第９図に示されているようにヒトの合成酸性ＦＧＦ遺 伝子を構築するために用いられていた。この図で“３”および“４”と示された オリゴヌクレオチドが。

プローブとして用いられたものである。λＨＧ−３と呼ばれる。

回収されたファージのコード領域を第２図すに示すこのコード配列は、　Ｊａｙ ｅ配列のアミノＨ４２４８をコードするが、塩基性ＦＧＦタンパクをコードする 遺伝子のエキフン／イントロン境界に対応している。

同様に、第３のエキソンは、上述のように調製されたシャロン−４＾におけるＬ ａｗｎ、ら（前出）のマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のヒトゲノムライブラリ ーから得られた。そして、第９図に示されている合成遺伝子の“６”および“７ ”をラベルしたオリゴヌクレオチドをプローブとして、この第３のエキソンを調 べた。λＨＡＧ−３と呼ばれる１回収されたλフアージクローンは９部分的に配 列決定されており、その結果を第２図Ｃに示す。この配列情報から、λＨＡＧ− ３挿入部分中にＣ末端エキソン配列の存在することが確かめられる。

前述の３つの挿入部分は、再結合させることにより完全なヒトの酸性ＦＧＦゲノ ム配列を再構築し得るが、これはＥｃｏＲＩによって各ファージを切断してこの 挿入断片を取り出し、そして得られた断片を連結して遺伝子を再構築することに よってなし得る。このゲノム配列を用いれば、以下の実施例７においてｃＤＮＡ 配列について述べた方法に類似した方法により。

発現ベクターを構築し得る。特に、この再構築された遺伝子は１合成型−酸性ｈ ＦＧＦ　ＮｃｏＩ　（平端（ｂｌｕｎｔ））　／ＨｉｎｄＩ［Ｉ　（平端（ｂｌ ｕｎｔ））について述べた方法と同様の方法により、　ＥｃｏＲＩ（平端（ｂｌ ｕｎｔ））断片として挿入し得る。

尖隻旦↓ ｈＦＧＦコード配置の８゜制 ヒトの脳下垂体、胸部癌腫、脳、脳幹、　５Ｋ−ＨＥＰ−１または視床下部のｍ ＲＮＡから、実施例２においてウシのｍＲＮＡに対して述べたようなＨｕｙｎｈ の方法によって調製されたｃＤＮパライブラリ−を、実施例３におい了述べた条 件下で２５０／ＡｌｕＩをプローブとして用いて調べ、酸性ｈＦＧＦをコードす るｃＤＮＡを得る。第１のエキソンを含むスプライシングされていないｃＤＮＡ は、胸部癌腫のライブラリーから得られた。

別の方法として、　Ｊａｙｅ、　Ｍ、ら５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）、印刷中 、によって得られたｃＤＮＡ配列の情報（第２図ｄ参照）を酸性ｈＦＧＦをコー Ｙする遺伝子の合成のガイドとして用いた。Ｊａｙｅらによって報告されたｃＤ ＮＡクローンは、ヒトの脳幹由来のメツセンジャーＲＮＡを用いて得られ、酸性 ｈＦＧＦをコードするが、この酸性ｈＦＧＦの推定されるアミノ酸配列は第２図 すに示されている。

実施例３において述べたゲノムλ　）ＩＡＧ−９，１クローンを用いて遺伝子の ５”部を得た。この部分を調製するために、　１．９ｋｂＢａｍ旧断片をλ）Ｊ ＡＣ−９，１から単離し、そしてｐＵｃ１３中へサブクローニングしてｐＣＢＩ −１０１を得た。次いで、この中間体プラスミドをＮｃｏＩ　／　ＢａｍＨＩで 切断し、そして成熟６基本”型の酸性ｈＦＧＦの最初の２５個のアミノ酸ととも に、プロ配列の１５個のアミノ酸に対するコドンを含むｎ５ｂｐ断片を５％ポリ アクリルアミドゲルを用いて単離した。主配列の開始点から−１５のアミノ酸に おいて開始コドンを形成していると考えられるＡＴＧを含むＮｃｏ　Ｉ部位の位 置は、第９図に示されている。この図は合成遺伝子を図示したものである。

コード配列の残りの部分は、第９図における１〜２０番の合成オリゴヌクレオチ ドを用いて合成された。各オリゴヌクレオチドの合成は、簡便な自動化技法を用 いて行う。オリゴヌクレオチドは、　Ｊａｙｅら（上記）によって報告されたも のと２つの例外を除いて同一のヌクレオチド配列を与えるように設計した：オリ ゴヌクレオチド４および１４は、星印によって示されるように、コドン６６のア ラニンをコードするＧＣＣをＧＣＴに変更することによって、コドン６７まで拡 がっているＮｃｏ　１部位をこわすように構築した；さらに、オリゴヌクレオチ ド１９および２０は、　ＴＧＡ終結コドンに続く旧ｎｄＩ［ＩおよびＥｃｏＲＩ 切断部位を付加するように修飾した。前記の変化は、いずれもコードされたアミ ノ酸配列に影響を与えない。

標準反応条件を用いて５μｇの各オリゴヌクレオチド（＃１および＃２０を除く ）をリン酸化し、１０個の異なる相補的オリゴヌクレオチド対（１＋１１．　２ ＋１１．など）をアニーリングし１次いで１０個のオリゴヌクレオチド対を３つ の断片に連結することによって１合成オリゴヌクレオチドを連結し、第９図に示 される配列を得た。これらの断片は、標準条件下で１４リガーゼを用いて連続的 に形成される。断片Ａを得るために、対１／１１を対２／１２と連結し２次いで 対３／１３と連結し。

さらに対４／１４と連結させる。断片Ｂは、対５／１５を対６／１６と連結し２ 次いで対７／１７に連結させることによって形成する。断片Ｃは、対８／１８を 対９／１９と連結し９次し）でこの生成物を対１０／２０と連結させることによ って得られる。３つの連結した副断片（Ａ＝　１４４ｂｐ、　Ｂ＝　１０Ｂｂｐ およびＣ＝１０６ｂｐ）は、ゲル電気泳動を用いて精製し９次いで標準条件下で Ｔ４リガーゼを用いてＢおよびＣを混合することによって連続的に連結し、その 後Ａを添加する。最終反応液は、フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させる 。エタノール沈澱物は。

５％アクリルアミドゲルで電気泳動し、３５８ｂｐ断片Ａ＋Ｂ＋Ｃを溶出させる 。この断片は、第９図に示されるように、　ＢａｍＨ１／［１ｃｏＲ１部位に及 んでおり、そしてその配列は、この断片をＭ１３ｍｐｌ≦中ヘサブク口中へング することによって、ジデオキシ配列決定法を用いて、確かめられる。

コード配列を完成させるために２合成３５８ｂｐ　Ｂａｍ）ＩＩ／ＥｃｏＲＴ断 片をファージまたはポリアクリルアミドゲルから単離し。

その末端を必要に応じてリン酸化し、そしてｐｃＢＩ−１０１由来の１１８ｂｐ ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片に連結する。酸性ｈＦＧＦをコードする。

得られた部分合成ヌクレオチド配列を第９図に示し、そして合成型−酸性ｈＰＧ Ｆと名付ける。

もちろん、酸性、ＦＧＦの“基本”型および“短”型が、ＡＴＧ。

開始コドンから始まり、そして最適な制限部位を含む、付加的な構築物をも構築 し得る。

（以下余白） 次ｌｌ引足 ｄ　性ｂＦＧＦのゲノムおよびｃＤＮＡクローンの回収次いで２５０／Ａ１ｕＩ プローブを用いて、対応する塩基性ｂＦＧＦ配列を得るために適当なプローブを 設計した。Ｅｓｃｈ、　Ｆ、、　ら（前出）が見出した。酸性ｂＦＧＦのアミノ 酸４−２９が塩基性ｂＦＧＦ配列のアミノ酸１３−３８と整列しているという利 点が得られた。

プローブは、塩基性ｂＦＧＦの残基１８−３６および酸性ｂＦＧＦの残基９−２ ７に基づいて設計したが、どちらの領域も１９アミノ酸残基のうち１４個が相同 的である。

プローブ１０９７および１０９８は、この領域をコードするように設計されてい る４０−ｍａｒであり、自動合成装置で、ホスホアミダイト法を用いて調製した 。これらのプローブは第１０図に示されている；それらは塩基性配列のアミノ酸 ２３−３１の領域で重複している。これらのプローブを設計する際、　２５０／ Ａｌｕｌ配列を用いたが、そのアミノ酸配列は同一であった。またコードされた 配列においては、必要な変化を与えるための最小限のヌクレオチドの相違が含ま れていた。

実施例２において述べたようなＨｕｙｎｈ、　Ｖ、Ｔ、の方法により得られたウ シの脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーをプローブ１０９８でスクリーニングした。

ハイブリダイゼーションに対する適切な条件は、サザンプロットにゲノムＤＮＡ 　（実施例１）を用いて次のように決定した。

もちろん、プローブ１０９７および１０９８は、それほど厳しくない条件の下で 酸性ＦＧＦをコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションし得ることが期 待された。ザザンブロント分析を行ったところ、５５℃の洗浄温度でプローブ１ ０９７および１０９８にハイブリダイゼーションする酸性ｂＦＧＦをコードする ことが知られているゲノムの配列は、６５℃ではハイブリダイゼーションできな かった（プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液および条 件は、実施例１におけるプローブ８８９／８９０および８９１に対するものと同 様であった）。従って、６５℃という洗浄温度を選んだ。この温度では、Ｅｃｏ ＲＩ分解物における１０ｋｂ断片およびＰｓｔＩ分解物における３、４ｋｂ断片 がプローブ１０９７および１０９８にハイブリダイゼーションした。

ｃＤＮＡライブラリーを６５℃の洗浄温度を用いて上述のようにプローブで調べ たところ、ＥｃｏＲＩリンカ−を有する２、１ｋｂ　ｃＤＮＡを表す、λＢＢ２ と名付けられた単一クローンが回収された。

このファージの制限地図を第１１図に示す。λＢＢ２における挿入部分の副断片 を、配列決定を行うためにＭ１３に移した。１．４ｋｂＥｃｏＲＩ分解副断片は 、ウシの塩基性ＦＧＦの（完全な“−次”配列の）アミノ酸１−１４６をコード することがわかった。Ｎ末端コドンより上流側の配列は、９アミノ酸のプロ配列 あるいは活性を保持してる天然のタンパクのＮ末端伸長“長”型のいずれかをコ ードすると考えられている。Ｎ末端の伸長部分は、単に８つの残基しか含み得な いが、これはもちろんメチオニンが翻訳後のプロセッシング中に切断されるかど うかに依存している。塩基性ｂＦＧＦをコードするこの副断片の部分は。

第３図に示されている；位置１を始まりとするアミノ酸の番号付けは、単離され た“−次”タンパクのＮ末端に対応している。上流側の９コドンは、括弧内に翻 訳されている。この伸長部分が天然の活性タンパクの必須部分を表している可能 性は、肝細胞から調製されたヒトの塩基性ＦＧＦの、より分子量が大きな型によ って示唆されている（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（前出））。

次いで１．４ｋｂの副断片をニックトランスレーションし、そして塩基性ｂＦＧ Ｆゲノム配列に対する実施例１の方法と同様に。

構築されたウシのゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。

１．４ｋｂの塩基性ｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ断片は、ラット、ブタ、ある いはウシ、ネコ、イヌ、ウマあるいはネズミを起源とするような、別の補乳類の ｃＤＮＡライブラリーをプローブで調べ、上記の種の配列であって、塩基性ｂＦ ＧＦをコードする配列を得るためにも用いられる。

尖施汎ｌ ヒトの口　性ＦＧＦのゲノム クローンおよびｃＤＮＡクローンの８゜制ヒトの腎臓のｍＲＮＡから調製された λｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーを、ウシの１．４ｋｂ塩基塩基性副査用いて調 べた。プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液には、　４ ０％ホルムアミド、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）　、５　ｘデンハー ト溶液、５ＸＳＳＣ，および５０μｇ／−ニシン精子ＤＮＡが含まれていた；ハ イブリダイゼーション緩衝液には、さらに。

１０％硫酸デキストランおよび１０’〜１０’　ｃｐｍ／−のプローブが含まれ ていた。３つのクローンを単離し、そして特徴を調べるために１つを選択した。

このクローンは、λＫＢ７と呼ばれ。

約１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を含んでいた。この断片を部分的に配列決定した ところ、推定のアミノ酸配列とともに、第４図に示したデータが得られた。配列 決定されたコード領域によって。

図中に示したアミノ酸１−５０が推定された；下流側に直ちに続く配列は、スプ ライシングされていないｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを表しているようであり、こ のことはイントロンが、塩基性ＦＧＦ遺伝子において、ウシおよびヒトの酸性Ｆ ＧＦ遺伝子におけるアミノ酸４１の後のイントロンに対して相同的な位置に存在 することを示している。λＫＢ７クローンも、示した製型の９アミノ酸のＮ末端 の伸長部分をコードする上流側のＤＮＡを与える。

付加的なゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを。

上述のヒトの腎臓のλｇｔｌＯライブラリーに対して用いた条件と正確に同じハ イブリダイゼーション条件下で、　１．４ｋｂ塩基性ｂＰＧＦをコードする同じ 断片を用いてスクリーニングした。

さらに４つのクローンを得たが、それらの間では、第４図に示すような単離され た塩基性ｂＦＧＦに対応すｌ完全な１４６アミノ酸のタンパクをコードする。上 述のλＫＢ７に含まれている９つの上流側のコドンは、ウシの塩基性ＦＧＦクロ ーンにおいて翻訳された上流側のコドンと完全に相同的な配列へ翻訳するが、コ ドン−８には発現しないヌクレオチド置換がある。

この翻訳されたＮ末端の伸長部分を第４図の括弧内に示す；そしてこの伸長部分 は、上述のように、Ｎ末端の伸長した活性タンパクのプロ配列または付加的なア ミノ酸を表し得る。

より詳細には、　Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｍ、ら（前出）によって記述されたように３ 周製した。λシャロン４Ａにおけるヒトのゲノムライブラリーに由来する２つの 確実にハイブリダイゼーションするクローンを７ＭＧ４およびλＭＧＩＯと名付 けた。７ＭＧ４は、アミノ酸（−９’）−５１をコードし；λＭＧＩＯは、アミ ノ酸８６−１４６をコードする。このことは、３つのエキソンのうち第３のエキ ソンが遺伝子の成熟型タンパクをコードする領域内に含まれることを示している 。（エキラン／イントロン境界の位置は、ウシの配列との相同性によって決定し た。）　Ｅ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈから得た。λシャロン２８における少し異なった ゲノムライブラリーは、第２の成熟型タンパクのエキソンを含み、アミノ酸５ｉ −ｓｓをコードするλ［ｌＴ１を与えた。最終的には、上述のようにλｇｔｌｏ で調製したヒト胎児の肝臓のライブラリーから得られたｃＤＮＡクローン、すな わちλＨＦＬＩは、アミノ酸５６−１４６をコードする。そしてこのことから関 連のあるイントロン／エキラン接合点の位置が確認される。

塩基性ｂＦＧＦおよびｈＦＧＦは２つのアミノ酸が相違しているだけである。位 置１１２においてウシのタンパクがセリンを有するのに対し、ヒトのタンパクは スレオニンを有する。また位置１２８においては、ウシのタンパクがプロリンを 有するのに対し、ヒトのタンパクはセリンを有する。これらの相違は。

各々の場合の単一のヌクレオチドの相違によるものである；従って、ウシのｃＤ ＮＡを以下に述べるように突然変異を導く部位により１便宜的に修飾してヒトの タンパクをコードし得るが、実際には、標準的な部位特異的変異技法を用いてこ れらのコドンを変更した。実施例５のλＢＢ２クローンをＥｃｏＲＩで分解し、 そしてｂＦＧＦタンパクをコードする部分にまで及ぶ１．４ｋｂの領域をＭ１３ ｍｐ８のＥｃｏＲ１部位に連結した。インビトロ変異を３つのオリゴヌクレオチ ドの存在下で実施した：“共通”プライ７−＋　１７−ｍｅｒ　；変異１６−ｍ ｅｒ、　５’−ＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧ−３’。

これはコドン１１２のコード配列を変更する；そして、変異１７−ｔｒｕｅｒ、 　５’−ＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＡＧ−３’、これはコドン１２日の配 列を変更する。変異させたファージは、さらにインビトロでプライマーによって 導かれる変異を２度行い、変異２５−ａ＋ｅｒ、　５’−ＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡ ＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧ−３’を用いて翻訳終結コドンより３４ｂｐ下 流側に旧ｎｄｌｌＩ部位を創造した。得られた変異ＤＮＡは。

ジデオキシ配列決定法により配列決定を行い、所望の変異が生じたことを確認し た。そして、　ＦＧＦコード領域に及ぶ約６３０ｂｐの断片を旧ｎｄＩＩＩで切 断し、そしてｐＵｃ１３へ連結して中間体プラスミドｐＪＪ１５−１を得た。

もちろん、塩基性ＦＧＦの３つの既知のＮ末端修飾体のうちのいずれをもコード するコード領域の修飾型は、やはり標準的合成技術を用いることによって調製し 得る。

ス］ｌ硼１ ベタ　−の　および でのＦＧＦの６　な ＦＧＦをコードするｃＤＮＡクローンは、上のＣ，１節で述べたように１種々の 宿主中で組換えタンパクを生産するために、最も都合よく用いられる。しかし、 ＠乳動物系での発現は、その宿主が９本来生産されるタンパクで見られるプロセ ッシングに類僚した翻訳後プロセッシングを行い得る場合、およびｃＤＮＡ配列 あるいはゲノム配列のいずれの配列を用いたとしても、宿主がイントロンのプロ セッシングをも行い得る場合には、有利である。

それゆえ、全長ｃＤＮＡあるいはゲノムＦＧＦをコードするクローンは、以下に 述べる宿主ベクターにより例示されるような（しかしこれに限定されないが）宿 主ベクターに挿入するために、調製される。

このベクターを構築するために、このクローン化されたＦＧＦをコードする挿入 断片は、ＥｃｏＲＩで（挿入断片自体がＥｃｏＲＩ部位を含むなら２部分分解に よる）切断されるか、また１よ他の適当な酵素で切断され、ＥｃｏＲＩリンカ− または必要であれば他の適当なリンカ−が付けられる。そしてこの挿入断片は。

ベクターの 居坏１ このプラスミドｐＨ５１は、哺乳動物宿主中での挿入ＤＮＡの発現に適している 。このプラスミドは＋　ｐ８４Ｈ（Ｋａｒｔｎ、　Ｆｌ、Ｉ　ａｔａｔ、　Ｎａ ｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　２９７−８０２）からの８４０ｂｐのｈ ＭＴ−ＩＩ配列を含む。この配列は、ｈＭＴ−ＩＩ遺伝子の−７６５の位置のＨ ｉｎｄＩＩ［部位から、＋７０のＢａｍ旧開裂部位にわたっている。ｐＨ５１を 構築するために、プラスミドｐ８４ＨをＲａｍ旧で完全なまでに分解し、末端の ヌクレオチドを除去するべくエキソヌクレアーゼＢＡＬ−３１で処理し２次いで Ｈｉｎｄｌｌｉで分解した。所望のＢ４０ｂｐ断片をｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ、 　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　（１９Ｂ２）　１９　：　２５９−２６８） に連結した。このｐＵｃ８は旧ｎｄＩＩ［および旧ｎｃＩＩの分解により。

開いている。この連結混合物は、大腸菌ＨＢＩＯＩをＡｍｐ”に形質転換するた めに用いられた。ｐＨ５１と名付けられた１つの候補プラスミドは単離され、グ イデオキシ配列法により、配列決定された。ｐＨ５１は、好都合な制限部位を含 むポリリンカーの上流側に、ｈＭＴ−ｎ制御配列を含む。

使用可能な宿主プラスミドｐ）ＩＳＩは、メタロチオネインプロモーターのほか に、付加的な制御要素を含有させて、さらに改変され得る。特に、　ＳＶ４０の ようなウィルス系のエンハンサ−要素だけでなく、ｈＧＨのような他のタンパク の３゛非翻訳領域に結合した終結シグナルも包含され得る。

ウィルスエンハンサ− ＭＴ−ｎプロモーターに動作可能に連結された状態にあるＳＶ４０エンハンサ− を含む一対の宿主発現ベクターは、　ｐＨ５１のＭＴ−■プロモーター配列の前 方にある旧ｎｄＤ１部位に、　１１２０ｂｐの５Ｖ４０ＤＮＡ断片を挿入するこ とにより、構築された。このＳＶ４０　ＤＮＡ断片は、　ＳＶ４０の複製起点ま で及び、　５１７１番目のヌクレオチドから５２４３番目のヌクレオチド（起点 ）と、１０７−２５０番目のヌクレオチドの７２ｂｐ反復構造とを含んでおり、 そして後期ウィルスｍＲＮＡの５”末端を含む起点側の１０４６番目のヌクレオ チドにまで至る。この１１２ＱｂｐからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片は、　ＳＶ４０ 　ＤＮＡ　（Ｂｕｃｈｍａｎ、Ａ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖ ｉｒｕｓｅｓ、２ｄ　ｅｄ　（Ｊ、Ｔｏｏｚｅ。

ｅｄ、）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１）＋ｐｐ、　７９９−８４１）の旧ｎｄｍによ る分解から得られ、増幅のためにｐＢＲ３２２にクローン化される。このクロー ニングベクターを旧ｎｄｌＩ［で切断し、そしてこの１１２０ｂｐのＳＶ４０　 ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により単離し、そしてｐＨ５１（これは旧ｎｄｎｌ により分解し。

ＣＩＰ処理した）に連結した。得られたベクター（これは、　ｐ）ＩＳＩ−ＳＶ 　（９）およびｐＨ５ｌ−３Ｖ（１０）と名付けられた）は、それぞれ反対方向 に、ＭＴ−ｎプロモーターを生じる断片を含む。ｐＨ３ｌ−３Ｖ　（９）では、 エンハンサ−は、　５’ｍＲＮＡの転写開始部位から約１６００ｂｐのところに あり、また反対方向には、このエンハンサ−は、５°０ＩＲＮＡの転写開始部位 からは、およそ９８０ｂｐのところにある。両方向とも動作可能であるが、エン ハンサ−配列が転写開始部位に近い方向では、より高いレベルの発現を示す。

転写開始部位の２５０−４００ｂｐ上流側にエンハンサ−を厚りことを避けるこ とは、最適であると考えられている。

サラに、　ＭＴプロモーターのＴＡＴＡボックスの５′−末端から上流側に、そ れぞれ、　１９０ｂｐ、　２５０ｂｐおよび３ｓｏｂｐに、ＳＶ４０エンハンサ −の３゛末端を置いたベクターが構築された。この構築は、ヒ）ＭＴプロモータ ー上流側の制御領域の地図化に基づいてなされた。このことは、Ｋａｒｉｎ、　 Ｍ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）３０８　：　５１３−５１９に記述され ている。全ての構築物は９重金属による制御のための反復部位を含む配列を保持 している。しかし、　１．９０ｂｐと２５０ｂｐとに分離した構築物は、これら の部位からさらに上流側にあるグルココルチコイドによる制御のための配列を保 持していない。

コレらノヘクター（コれは、　ｐＨＳ’−５Ｖ１９０．　ｐ）Ｉｓ’−３Ｖ２５ ０およびｐｕｓ’−５Ｖ３６０と名付けられた）は、以下のように調製される： 全での構築物は、メタロチオネインプロモーターおよび上流領域を含む配列の長 さ以外は一致している。このプロモーターおよび上流領域は、　ｐＨ５１から切 断された断片として供される。

ｐｕｓ’−５Ｖ１９０に対し、　ｐＨ５１がＳａｃ　ＩＩで分解され、平滑化さ れ。

そしてＫｐｎｌリンカ−に連結される。次いで、このＤＮＡは、ＭＴ−■制御配 列の適当な部分を遊離させるために、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで分解される。

同様に、　ｐＨｓ’−５Ｖ２５０では、　ｐＨ５１がＨｇａ　Ｉで分解され、平 滑化され、　ＫｐｎＩリンカ−に連結された後＊　ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎｌで 分解される。ｐＨＳ”−５Ｖ３６０に対して、最初の分解においてＤｄｅＩが用 いられる。

このＳＶ４０エンハンサ−を含む中間ベクターは、　ＳＶ４０の旧ｎｄｌＩ［／ Ｋｐｎｌ断片（これは、　５１７１番目の位置から２９４番目の位置にまで及ん でおり９また。　Ｋｐｎ１部位から５０ｂｐのところにエンハンサー要素を含ん でいる）を、　Ｋｐｎｌ／ＨｉｎｄＩ［［で分解されたｐｕｃ−は、ポリリンカ ー領域に、順番に旧ｎｄｎ１．　ＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩの３つの好都合な制 限部位を含む）。この完成したベクターは、上で記述のように調製されるＫｐｎ Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片を、　ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩで分解されたｐＵｃ−ＳＶに挿 入することにより、得られる。

それゆえ、先に改変された全てのベクターは、　ＳＶ４０のエンハンサ−要素を 利用している。もちろん、他のウィルスのエンハンサ−であれば、同様の方法で 用いられるだろう。

転亙■持配剋 転写終結制御配列を供与するために、このコード配列、およびヒト成長ホルモン の３”非翻訳配列を表すＤＮＡをｐＨ５１に連結した。この中間ベクターは、　 ｈＧＨコード配列に代えてこのベクターに続けて連結されたコード配列に対し、 　ｈＧＨ３’　非翻訳配列を供与し得る。

このゲノム配列をコードするｈＧＩ（を、Ｂａｍ旧およびＥｃｏＲＩで分解し、 続いてポリアクリルアミドゲル精製することにより＋　ｐ２．６−３　（ＤｅＮ ｏｔｏ、　ｅｔ　ａｌ＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１） １９：３７１９）から単離した。このＢａＩＩＩ■は最初のエキソンの５゛末端 で切断する。ＥｃｏＲＩは機能遺伝子の３′位で切断する。この単離された断片 をｒ　ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで分解されたｐＨ３１に連結した。この連結混合 物を大腸菌ＭＣ１０６１のＡｍｐ”に形質転換した。成功した形質転換体は、制 限分析により選抜し、所望のプラスミドｐＭＴ−ｈＧＨｇを含む株をさらに増殖 させて、多量のプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＨ５ｌ−ＳＶ（９）またはｐＨ５ｌ−ＳＶ（１０）を構築するためではあるが 。

ｐＨ３１を代用するために、先に記述の方法と同様の方法で、　ＭＴプロモータ ーの制御下にあるｈＧＨ遺伝子を含み、　ＳＶ４０エンハンサ−と動作可能に連 結され、そしてそれぞれ、　ｐＨＧＨｇ−ＳＶ（９）およびｐｈＧＨｇ−ＳＶ　 （１０）と名付けられた一対ノヘクター（ｐＭＴ−ｈＧ）Ｉｇ）を得た。その連 結混合物は大腸菌１０６１をＡｍｐＲに形質転換するために用いられた。そして 適切な構造が確認された。

ベタ　−の 次いで１合成の酸性ｈＦＧＦに適応する宿主ベクターとして。

ｐｈＧＨｇ−ＳＶ（１０）を用いた。ｐｈＧＨｇ−３Ｖ　（１０）をＢａｍ旧お よびＳｍａ　Ｉで分解し、クレノーで平滑化し、そしてｈＧＨコード配列を切断 するためにＣＥＰで処理した。この開かれたベクターをＮｃｏＩ　（平滑末端） 　／ＥｃｏＲＩ（平滑末端）合成の酸性ｈＦＧＦ断片に連結し、所望の発現ベク ターｐａｈＦＧＦ−ＳＶ　（１０）を得た。ここで１合成の酸性ｈＦＧＦ断片の Ｎｃｏ１部位は再生されている。

同様に、上で記述の残留ＦＧＦをコードする断片をｐｈＧＨｇ−ＳＶ（１０）に 連結して、ウィルスエンハンサ−、ＭＴ−ＩＩｎプロモーターよびｈＧＨ３’非 翻訳領域の制御下にて、これらのコード配列を含む類似ベクターを調製する。例 えば、実施例６のｐＪＪ　１５−１からの５ｏｏｂｐまでのＮｃｏＥ　（平滑末 端）　／）Ｉｉｎｄｎ［（平滑末端）断片を、ＢａｍＨＩ（平滑末端）　／Ｓｍ ａＩで分解したｐｈＧＨ−５Ｖ　（１０）にうまく挿入して、　ｐＪＪ１６−２ を得る。

さらに、　ｐＨ５１，および上で記述のような、Ｓｖエンハンサ−の種々の配置 を含むべく改変されたｐＨ５１を包含するこれらの配列の発現を得るために、他 の宿主ベクターが用いられてもよい。挿入は、この宿主ベクターのＢａｍＨＩ　 ／　ＥｃｏＲＩ分解を用いての、類似の方法による。また、酸性または塩基性Ｆ ＧＦの“長い”形態、“基本の”形態あるいは“短い“形態のいずれをもコード するべく改変されたＤＮＡも用いられ得る。

これらのベクターは、以下で論じる目的のために、一般的にｐＭＴ−ＦＧＦと呼 ばれる。

゛　の　え　によるＦＧＦＯ生− チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋｌ細胞を、Ｆ１２培地およびＤＭＥ 培地の１：１混合物から構成される培地上で、１２％ウシ胎児血清とともに生長 させた。このコンピテント細胞は。

ｐＭＴ−ＦＧＦおよびｐＳＶ２　：　ＮＥＯ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　ｐ、、　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｍｏｌ卸ｙ」肌■（１９８２）　１　：　３２７−３４１）Ｔ ：共形質転換した。ｐｓＶ２　：ＮＥＯは、ネオマイシン類似体Ｇ４１８に耐性 を与える機能遺伝子を含む。この形質転換では、　５００μｇのｐＳＶ２−ＮＥ Ｏおよび５μｇのｐＭＴ−ＦＧＦを、　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、＋　ら、超旦（１ ９７９）　１６　：　７７７−７８５、の、プロトコルに従って、リン酸カルシ ウム−ＤＮＡ共沈澱物中で、１６ｎデイシユの細胞に適用した。それとともに。

これらをＤＮＡに４時間さらした後、１５％グリセロールで２分間“ショック” を加えた。１日後、　Ｇ４１８耐性コロニーのプールを与えるために、この細胞 を１■／ｄの６４１８にさらした。

これらの耐性コロニーはＦＧＦ生産のために分析され１次いでクローン化され得 る。

成功した形質転換体（これらはまたｐＭＴ−ＦＧＦの安定な遺伝形質を有する） を、クローン単離体の精製のため、低密度でプレート上にまく。これらの単離体 の少量を、　ＦＧＦ生産をうまく分析するために、　１０−’？の塩化亜鉛にさ らした後、多孔プレート上で生長させる。ＦＧＦの定量は通常の方法を用いて。

適当なＦＧＦタンパクに対し調製される抗血清に対して、標準的なＥＬＩＳＡま たはラジオイムノアッセイにより行われる。所望のＦＧＦを大量に生産するクロ ーン分離体が選抜される。

適当な条件下にてＦＧＦを生産するべく示される細胞を、１０％のウシ胎児血清 で補足された基本培地に１７１０集密度でまき、−夜インキユベートし１次いで 、ｌＸｌ０−’Ｍ〜３　Ｘｌ０−’Ｈの濃度範囲の塩化亜鉛を加えることにより 、　ＦＧＦの生産を誘導する。２　ＸＩＯ”’Ｍ　ＺｎＣＩｚの最適の誘導条件 下で、７〜１０日間にわたりＦＧＦのレベルが上昇する。

特定の実験では、実施例６のｐＪＪ１５−１に由来のヒト塩基性ＦＧＦをコード する約５００ｂｐのＮｃｏｌ（平滑末端）　／ＨｉｎｄｌｌＩ　（平滑末端）断 片を含むｐＭＴ−ＦＧＦを用いて、　ＣＨＯ細胞が形質転換された。上に記述の ように、　ｐＭＴ−ＦＧＦのこの特別な形（上ではｐＪＪ１６−２と名付けた） を得るために、この断片をＢａ＋ｎ）ＩＩ　（平滑末端）　／Ｓｍａｌで分解さ れたｐｈＧＨ−ＳＶ（１０）に挿入した。このベクター（ｐＳＶ−ｎｅｏおよび ｐＨｓｌ−ＭＴ）で、この細胞を共形質転換した。６４１８選抜の後、このプー ルされた耐性コロニーは、１０６細胞当たり約５００ｐｇのヒト塩基性ＦＧＦを 生産した。

生産されたＦＧＦＯ量は、ヘパリン−セファロースを用いて。

溶解した細胞から塩基性ｔｃｐをアフィニティー精製により定量し、続いて組織 培養中の内皮細胞の生長促進のための分析を行った。このヘパリンアフィニティ ー精製は、以下に記述の方法のような標準的な方法により、達成される。この方 法は９例えば、　５ｕｌｌｉｖａｎ＋　Ｒ，＋　ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ 　（１９８５）２６０　：２３９９−２４０３　、あるいはＳｈｉｎｇ＋　ら、 　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）２２３　：　１２９６−１２９９である。また 、活性の分析はＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、、　ら。

Ｊ　Ｃｅ旦」社社１（１９８５）　１２２　：　３２３−’３３２　、あるいは Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ。

Ｄ９．ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）９７　：　１６７７−１６ ８５に記述のように行われる。

５００μｇ／１０６細胞のレベルで生産する先のプールを１次いで。

誘発物質としての１００μＭ　ＺｎＣ１□とともに１０μＭ　ＣｄＣ１，の存在 下にて生長させることにより、カドミウム耐性体を選抜した。耐性クローンのプ ールを１次いで、上で記述のように分析した。５．６μｇ／１０’細胞の生産レ ベルが１回の分析で見出された。

望むなら、　ＦＧＦがこの溶解した細胞から得られ、そして天然タンパクに対す る先に述べた方法によるか、または当業者に公知の他の標準方法により、精製さ れ得る。

さらに、先に論じたように、前述の構築物により生産されるＦＧＦタンパクの分 泌は、カルシウムイオノフオアや他の適当な刺激剤によって開始されるエキソサ イトシスにより、達成され得る。ＣＩＯ細胞により生産されるタンパクが、特に 。

ＬＰＳやホルボールエステルの刺激により、放出されるということは期待できな いものの１例えば、　ＣＨＯ細胞に代えて１組換え宿主としてマクロファージ由 来の細胞系を用いることにより、このような分泌が行われ得る。また、以下に例 示するようなｈＧｌｌ由来のシグナル配列を与えるために、その構築を変えるこ とにより２通常の構築経路を用いる分泌も、　ＣＨＯや他の哺乳動物細胞の宿主 を用いて行われるだろう。もちろん。

分泌を生じることは、タンパク精製作業がずっと簡単になるので有利である。

合成した酸性ｈＦＧＦの部分合成配列を含むｐＭＴ−ＦＧＦベクターでのトラン スフェクションにより、成熟した基本型の１４０アミノ酸の上流側にある１４ア ミノ酸の前部領域を含む“長い型”　ＦＧＦの生産が行われるだろう。それによ り５処理されたＭｅｔ残基はまた。アセチル基のようなブロッキング基と置き換 えられてもよい。プロセッシングはまた。咄乳動物細胞中で行われ、その結果成 熟型になる。しかし、最初のＭｅｔを欠き、アセチル化されたＮ末端アラニン残 基を有するリーダー配列を含む長い型のものが２分裂促進因子としての活性を有 することがわかっている。

いずれの場合にも、　ＦＧＦは、ヘパリン／セファロースに適し、酸性ＦＧＦに は１．２Ｍ　ＮａＣ１でそして塩基性ＦＧＦには２Ｍ　ＮａＣ１で溶出すること により、一部精製される。この溶出物は、　５ＤＳ−ＰＡＧＥ、および内皮細胞 や３Ｔ３細胞に対する分裂促進活性により、酸性または塩基性ＦＧＦの存在につ いて分析される。

次崖■エ ヒトＦＧＦに対するワクシニアベクター基本のｈＦＧＦをコードする配列は、Ｂ ａｍ旧およびＳｍａ　１でｐｈＧ）ｌ−ｓｖ（１０）　（前出）を分解し、クレ ノーを用いて平滑化し、そしてｐＪＪ１５−１からこのＦＧＦにわたる約５００ ｂｐのＮｃｏｌ　（平滑末端）／旧ｎｄｎｊ（平滑末端）断片を挿入することに より、　ｈＧＨから３”非翻訳領域と共に供給された。得られたプラスミド、　 ｐＪＪ１６−２は、上に記述の発現ベクターとして直接用いられ得る。

しかしながら、基本のｂＦＧＦをコードする領域およびｈＧＨｐｏｌｙＡ付加シ グナルを含むＮｃｏ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片（約１．１ｋｂ）を、５％アクリ ルアミドゲル上で精製し、溶出し、クレノーで平滑化し、そしてＳｍａｌで分解 したホスファターゼ化ｐＧｓ２０に連結した（Ｍａｃｋｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ 　Ｖｔｒｏｌ　（１９８４）４９　’：　８５７−８６４）　、得られたプラス ミド（ｐＪＶｌ−１と命名された）は、大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅された。そ してこのプラスミドＤＮＡは、セシウムクロライド濃度勾配を用い単離された。

実施例４で合成された合成の酸性ｈＦＧＦ　ＤＮＡ断片も、ワクシニアの一時的 な発現ベクターｐＧｓ２０の中に連結される。第５図に示される合成の酸性ｈＦ ＧＦ遺伝子は、　ＮｃｏｌおよびＥｃｏＲＩで切断され、クレノーで平滑化され 、そしてＳｍａ　Ｉで切断されたホスファターゼ化ｐＧｓ２０に連結される。得 られたプラスミドの調製物は、セシウムクロライド中で平衡状態に遠心分離する ことにより精製され、　ｐＪＶｌ−２と命名された組換えプラスミドが回収され る。

このｐＪＶｌ−’１ベクターおよびｐＪＶｌ−２ベクターは、　Ｃｏｃｈｒａｎ 、　Ｍ。

Ａｏ、ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８５ ）　８２　：　１９−２３によって記述されるように、ワクシニアに感染するＣ Ｖ−１細胞に形質転換される。

ｐＪＶｌ−１またはｐＧｓ２０にトランスフェクトされたＣＶ−１細胞は。

５ＯＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーを用いる基本のＦＧＦを生産するため に１分析された。この結果は、第１２図に示される。

レーン１およびレーン２は、それぞれｐＪＶｌ−１およびｐＧｓ２０でトランス フェクトされた細胞の培地である。レーン３およびレーン４は、対応する細胞溶 解産物のサンプルであり、レーン５およびレーン６は、以下のこと以外は、レー ン３およびレーン４と同じである。溶解産物のサンプルを、　０．６Ｍ塩化ナト リウムの存在下にてヘパリンセファロースに結合し、１０１リン酸塩、　ｐＨ７ ，４／１．１Ｍ塩化ナトリウムで洗い、そして同じ緩衝液中で２Ｍ塩化ナトリウ ムを用いてカラムから溶出した（この溶出物は、ゲル上に載せる前にＴＣＡで沈 澱させた）。

レーン７は、１４６アミノ酸型にて＋　２５１でラベルされた基本のＦＧＦであ る。レーン５中の約１８ｋｄの所のバンド（これはＦＧＦの標準よりも少し高い 分子量をもっている）によると、ウシ配列のその“長い”型が１組織から得られ た“基本の”タンパクよりも多く形成されていることがわかる。

レーン５およびレーン６に示すように調製されたサンプル（ＴＣＡ沈澱を除く） も、ウシの脳の毛細管内皮細胞の分裂促進活性について検査された（実施例９参 照）。ｐＧｓ２０サンプルには活性は全くなかったが、　ｐＪＶｌ−１サンプル は、　２０ｐｇ　ＰＧＦ／μｌに相当する活性を含んでいた。

人見拠工 ＦＧＦに・するインビトロ＼ この分析は、　Ｅｒｃｈら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳ Ａ）　（１９８５）８２　：　６５０７−６５１１　：およびＧｏｓｐｏｄａｒ ｏｗｉｃｚら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ（１９８５）１２２　：　３２ ３−３３２に記述のように実質的に行われた。

簡単に言うと、ウシの脳の毛細管内皮細胞は、　１０％ウシ血清で補われたＤＭ ＥＭの存在下で維持された。複数の単層が、０．９％塩化ナトリウム、　０．０ １Ｍリン酸ナトリウム、　ｐＨ７，４，０，０５％トリプシン、そして０．０２ ％ＥＤＴ＾を含む溶液に、室温にて２〜３分間さらすことによって、解離された 。この細胞を集めた後、それらを、　ＤＭｔＪおよび１０％ウシ血清中に再懸濁 させ。

そして細胞懸濁液のアリコートをコルターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒｃｏｕｎ ｔｅｒ）で計測した。この細胞を、２ｍｆｆｉＤＭＥＭに１０％ウシ血清を加え た全体を含む各皿に、３５龍皿あたり２Ｘ１０’細胞の初期密度で植えつけた。

６〜１２時間後、２通り作成したプレート１セントをトリプシン処理し、そして 細胞を計測してプレート化効果を測定した。

ＦＧＦ活性について検査され得るサンプルのアリコートを。

０．５％ＢＳＡを加えたＤＭＥＭを用いて１：２．１：４．そして１：８に希釈 し、そして、この希釈液の１０μｌを３通りの検査プレートに０日目および２日 目に加えた。４日目に、各サンプル液に対する３通りのプレートをトリプシン処 理し．そしてこの細胞密度をコルターカウンターにより測定した。

ＦＧＦＯ組換え型は，　ＣＨＯ細胞またはＣＶ−１細胞の培地中では見出されな かったので，このＦＧＦをコードするＤＮＡ配列も。

組換えＦＧＦタンパクの分泌を起こすために．異種シグナル配列に連結される。

次いで，この融合した配列は，ワクシニアで感染させたｃｖ−ｉ細胞中での一時 的な発現および・分泌を生じるようなワクシニアにもとづくベクターに連結され るか，またはＣＨＯ細胞での発現および分泌のためのベクターにもとづ＜　ｐＨ ５１に連結される。

ヒトの成長ホルモンからのシグナル配列を．コード配列全部を含む８００ｂｐの 旧ｎｄＩＩ［断片として，　Ｍａｒｔｉａｌ．　Ｊ．Ａ．＋　ら。

Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９７９）２０５　：　６０２−６０７．のｃＤＮＡベクタ ーｃｈＧ　１８００／ｐＢＲ３２２から得た。Ｎａｅｌ制限部位は，部位特異的 な突然変異によって。

２６番目のアミノ酸シグナルをコードするＤＮＡの３゛位にすぐに配置される。

その結果，　Ｎａｅｌによる次の開裂は，このシダナル配列のＣ末端でのアラニ ン残基に対するコドンのすぐあとに平滑末端を有する断片になる。要約すると、 この旧ｎｄｌＩ［断片をＭ１３ｍｐ１９に連結し、そしてプライマー：　５’　 −ＡＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＣ−３’を用いて突然変異させる。

そして、この突然変異した配列は２回収され、ＢａｍＨＩおよびＮａｅＩで分解 されてシグナル配列を含む断片を与える。

（β−ラクタマーゼのシグナル配列の正しく合わせた型も。

類似の構築物中に用いられるだろう　（Ｌｉｎｇａｐｐａ、　Ｖ、Ｒ，＋　ら。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８４）　８１　： 　４５６−４６０）　、）基本のｈＦＧＦの４つの型をコードするＤＮＡは、上 に記述の改変されたλ８８２クローンからの一定のＣ末端断片、および可変的な 合成のＮ末端部分をそれぞれ含む部分的に合成された断片として供給される。こ のＣ末端の位置に対し、この改変されたλＢＢ２クローンは　３１非翻訳領域の 旧ｎｄＩ［１部位に及ぶ３７７ｂｐの割断片を得るために、　１ｈａＩおよび旧 ｎｄｎｌで分解される。このＨｈａＩは、開始メチオニンコドンから１２２ｂｐ 下流側を切断する。Ｈｈａ１部位から上流側の欠けている部分は１合成ｐオリゴ ヌクレオチドを用いて供給される。

この合成オリゴヌクレオチドは、第１３図に示される。それらは１合成の酸性ｈ ＦＧＰの産生に関連して上述された方法と１１（ＩＩの方法で合成され、そして 連結される。この個々のオリゴヌクレオチドは、標準の自動核酸合成器を用いて 合成され。

アニーリングされる。そしてこの２重鎖部分は、その３′末端にｔｌｈａ１部位 を含む適切な全体の上流側部分を形成するように。

連結される。次いで、これらの合成の上流側断片は、完全なＦＧＰ遺伝子を得る ように、　Ｔ４リガーゼを用いて、下流側のＨｈａＩ／Ｈｉｎｄｎ［断片に連結 された後、　ｈＧＨシグナル配列をコードする領域を加えるために、ｈＧＨＢａ ｍＨＩ−ＮｄｅＩ断片に連結される。

この合成の上流側部分によってコードされるｈＧＨ／基本のＦＧＦタンパクの結 合は、第１４図に示される。タンパクＡは。

再構築された上流側部分および連結されたＣ末端コドンを含む。このＣ末端コド ンは、それゆえ、−９〜１４６のアミノ酸（第４図に示す）をコードしている。

つまり、このコドンは。

ヒトＦＧＦの長い型をコードするアミノ酸全部である。タンパクＢは、−９位の Ｎ末端メチオニンがアラニン残基によって置き換えられていること以外は、同じ 配列を含む。タンパクＣは、第４図の１２−１４６のアミノ酸をコードしている 。そして。

タンパクＤは、このタンパクの１６−１４６のアミノ酸、つまりヒトの基本のＦ ＧＦの“短い”型をコードしている。この短い型は分裂促進活性を示すことが既 に知られている。

第１４図も、　ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　ｃ、、　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｆｏｃｈｅｎ ＋　（１９８３）１３３　：１７−２１によって示された規則によれば、直接の 発現産物に対する予測されたシグナル配列の開裂部位（太い矢印）を示す。

構築を完全にするために、第１４図で示されるｈＧＨシグナル配列に融合された ４つのタンパクをコードする断片は、ＢａｍＨＩ（部分）　／ＨｉｎｄＩ［［配 列として増幅するため、キャリアープラスミドｐＵｃＱ中に挿入される。正しい 構築はグイデオキシシーケンス法により確立される。この配列断片を確認するＢ ａｎ＋１（１（部分）／）ｌｉｎｄＩ［Ｉは９次いで、キャリアープラスミドか ら削除され、クレノーにより平滑化され、そしてｐＧｓ２０　（前述）のＳｍａ １部位に連結される。連結された組換えプラスミドは。

上に記述のように、ワタシニアに感染したＣＶ−１細胞中で発現される。

同様に、構築物は、同じ発現系での分泌のために、酸性ｈＦＧＦから作られる。

このＦＧＦをコードする配列は９合成された酸性のす、ＦＧＦ　ＤＮＡ断片から 誘導され、修飾されて、第１５図におけるタンパクＥ、　ＰおよびＧを生産する 。第１５図は５第２図すの一１５残基から１４０残基に及ぶ酸性ＦＧＦの長い型 、第２図すの１〜１４０残基によって表される基本型、そして、その図の７〜１ ４０残基に及ぶ短い型のｈＧＨ／酸性ＦＧＦタンパク結合領域を表す。全ては、 この図に示されているように、このＦＧＦのアミノ末端に少しの変化をもたらす 。

これらのＦＧＦをコードする配列を構築するために、このＮＣ０Ｉ／ＥｃｏＲＩ の合成の酸性ＦＧＦを、　ＮｃｏＩ部位にて、クレノーにより平滑化し、そして ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩで分解されたＭ１３ｍｐ１９に連結する。得られたファー ジは、オリゴヌクレオチド：　５’−ＧＴＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡ Ｔ−３”で突然変異を誘発され、それゆえ、グリシンに対するコドンのすぐ前に 、第９図の核酸位置６２にてＳｍａＩ部位を作る。このグリシンは、主要な酸性 ｈＦＧＦの残基６である。Ｓｍａ　ＩおよびＥｃｏＲｌを有する突然変異された 断片の分解により、　４１４ｂｐの断片が生じ、この断片は、第１５図中のタン パクＧのように示される組換え型をコードするＤＮＡを得るために、ＢａｍＨＩ ／ＮａｅＩ　ｈＧＨシグナルをコードする断片に直接連結される。または、この 断片は２合成したオリゴヌクレオチド（第１６図に示される）にまず連結され１ 次いで、第１５図のＥおよびＦと命名されるペプチドをコードする配列を得るた めに、ＢａｍＨＩ／Ｎａｅｌ断片に連結される。

ヒト塩基性ＦＧＦに対して先に述べた方法に全く類似の方法にて、このシグナル 配列を進行させる酸性ＦＧＦのＤＮＡ断片を。

ｐＧｓ２０中に配置し、そしてワタシニアに感染したＣＶ−１細胞中にトランス フェクトして、酸性ＦＧＦの分泌型の一時的な発現を分析する（この処理された タンパクの予期されるシグナル開裂部位を、　ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅからも推測 されるように、第１５図の太い矢印により指示する）。

このＦＧＦ配列は、伝統的なシグナル配列を含んでおらず。

したがって構築条件下にてシグナルの仮定的な機構により。

・　それらの配列自体の分泌を生じさせる性能を有することは。

注目されるべきである。正常な細胞質タンパクに外来シグナル配列を融合するこ とにより、それらの分泌を生じ得るかどうかということは、当該技術分野からは 明らかでない（ｍａｌＥシグナル配列に融合されるβ−ガラクトシダーゼは、細 菌中ではべりプラズムに達しないことが示された。しかし、　Ｌｉｎｇａｐｐａ 。

Ｖ、Ｒ，、ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（前述）は、β−ラ クタマーゼシグナルに融合されるβ−グロビンが、インビトロでイヌの肺臓のミ クロソームにより処理され、そしてこの処理されたタンパクが、トリプシンの分 解から保護されることを示している）。

この連結されたシグナル／ＦＧＦをコードする配列も、上述されたＭＴ−ｎプロ モーターを含む宿主ベクターの中に挿入され得、そしてＣ）１０細胞中で発現さ れ得る。

実施■旦 ＦＧＦの細菌での ＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列（これはイントロンによって分断されていない ）も、細菌系にて発現可能である。発現のために都合のよい宿主ベクターはｐＫ Ｔ５２であり、それは、“ｔｒｃ　”プロモーターおよびそれに続（ＡＴＧ開始 コドンを含んでいる。

この“ｔｒｃ　”プロモーターは、　ｔｒｐプロモーターの上流部分および下流 部分、オペレーターを含む部分、　ｌａｃプロモーターの領域、を含む。このプ ロモーターを含むｐＫＴ５２は、　ｐＫＫ２３３−２の簡単な操作により構築さ れた。それは、　Ａｍｍａｎ＋　Ｅ、ｌら。

釦匹（１９８５）並：　１８３−１９０により、記述されている。ｐＫＫ２３３ −２は、ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　ＩＦで分解され、　ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ で満たされ、そして所望のベクターを得るべく再連結された。

ｐＫＴ５２は、所望のｔｒｃプロモーターおよび下流側のＡＴＧ開始コドンに加 えて、下流側のＮｃｏＩ部位、　Ｐｓｔ１部位、および旧ｎｄｌ［Ｉ部位を含む 。

発現ベクターを構築するために、このＦＧＦをコードするｃＤＮＡは、ＥｃｏＲ Ｉまたは他の適当な酵素で分解すること、単離すること、およびもし必要ならば 、適当な断片を修飾することにより、得られる。この３゛末端は、ある都合のよ い制限酵素部位にて終止コドンの下流側を切断し、そしてＰｓｔＩリンカ−また は旧ｎｄＩ［Ｉリンカ−を与えることにより、　ｐＫＴ５２中に導入するために 、調製される。この５゛末端は、このコード配列の内側の部位にて切断し、そし てこの欠けているコドンおよびＮｃｏＩ部位を合成りＮＡを用いて与えることに よるか、または変異操作によって適当に配置されたＮｃｏ　Ｉ部位を供給するこ とにより。

調製される。得られるＮｃｏＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍまたはＮｃｏＩ／Ｐｓｔｌ断 片は。

次いで、　Ｎｃｏ１／ＨｉｎｄｎＩで分解されるｐＫＴ５２か、またはＮｃｏＩ ／ＰｓｔＩで分解されるｐＫＴ５２に連結され、読み枠中にて、この＾ＴＧ開始 コドンとともに、　ＦＧＦをコードするｃＤＮＡを供給する。このＮｃｏＩ　／ 　Ｈｉｎｄ　ｍを境界とする合成の酸性ｈＦＧＦ　ＤＮＡは、この方法で直接に 挿入される。同様のベクターは、ヒトの塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡを用い て構築される。

細菌での発現では、得られた発現ベクターは大腸菌ＭＣ１０６１または他の適当 な宿主細胞を４ｍ　ｐ　Ｒに形質転換するために用いられ１次いで形質転換され た細胞は、　０．０．が０．２〜０．５になる３〜５時間の間、１ｍＨのＩＰＴ Ｇを含むＭ９培地上で生長される（ＩＰＴＧは、　ｌａｃオペレーターによって 制御される制御配列に対する標準の誘導物質である）。次いで、細胞を集め、細 胞破砕または５％トリクロロ酢酸での処理により溶菌し、そしてこの細胞抽出物 を、所望のＦＧＦについて分析する。ＦＧＦは、天然タンパクに対して用いられ る方法、または当該技術分野に既知の他の操作によって、抽出物から精製され得 る。

実ｍヱ の菌′を　′佳　るＦＧＦのゞ 傷害の修復を促進するＦＧＦ活性を、対照としてのＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ らの方法（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８４） 　８１　：　６９６３−６９６７）により、ウシの脳下垂体から精製した純粋な 塩基性ＦＧＦを用い分析した。分析され得る対照のＦＧＦは、　Ｄａｖｉｄｓｏ ｎ、　Ｊ、Ｍ、＋ら、　Ｊ、Ｃ，Ｂ、　（１９８５）皿：　１２１９−１２２７ の手順によれば、ネズミへのポリビニルアルコールスポンジの皮下注入に通用さ れた。代わりの方法として、ゴルテソクスホローファイバーも。

用いられ得る（Ｇｏｏｄｓｏｎ、　Ｗ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｌ釦孤」照（１９ ８２）翌：　３９４−４０１）。

標準的な手法では、全部で４匹のネズミを、それぞれ、２つの同一の処理をした スポンジで処理した。このスポンジは。

ヘパリンセファロースビーズによる処理、スポンジあたり５μｇのＦＧＦを用い てヘパリンセファロースビーズに結合されたＦＧＦによる処理、または溶液中に て５μｇ　ＦＧＦで処理を施す、のいずれかであった。このスポンジを、６日後 に回収し。

そして、傷害修復を示している肉芽組織について組織構造的に調べた。

ＦＧＦを含むスポンジは、高い量の肉芽組織を示した。そして、この肉芽組織は 、スポンジの場合には、ヘパリンセファロースビーズのまわりに集まっていた。

このスポンジのところでは、　ＦＧＦは、これらのビーズに結合して供給された 。

同様の結果により、　ＦＧＦが天然源によるかまたは組換え体によるものか、そ してＦＧＦが塩基性か酸性かについて観察される。

１９８５年９月９日またはそれ以前に、出願人は、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）＋　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　ＭＤ、　ＵＳΔ、にλファージのλＢ八へ、λＢＡ３．λＲＡＧ−９，１ ，λＢＢ２．およびλＫＢ−７を寄託した。これらは、＾ＴＣＣ受託番号４０１ ９５．４０１９４．４０１９７．４０１９６　。

および４０１９８をそれぞれ割り当てられた。これらの寄託は。

特許目的のための培養菌寄託に関するＡＴＣＣの承認のもとで与えられるような 状況下にてなされた。１９８６年９月１２日またはそれ以前に、λＢＢ２　（Ａ ＴＣＣ４０１９６）およびλＨＡＧ−９，１（ＡＴＣＣ４０１９７）の寄託条件 は、微生物の寄託に対する国際的な承認（ブダペスト条約）に関するブダペスト 条約で明記された条件に適合するように変えられた。１９８６年９月１２日また はそれ以前に。

λＨＧ−３およびλＨＡＧ−３と命名されたλファージは、ブダペスト条約の条 件下でＡＴＣＣに寄託され、　ＡＴＣＣ受託番号４０２５７および４０２５８を 、それぞれ割り当てられた。寄託された株の有用性は、その特許法に従って、い かなる政府の権威の下で許された権利にも違反して、その発明を実施するための ライセンスとして解釈されるべきではない。

（以下余白） ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ ＨＡＣｌＡｌ３　５ＥＬＩ 會ＮＣｏｘ　ｓｐｗ　Ｆ　ｆＧ、　９ 今べ→蹟寸ＧＦ ＦＩＧ、Ｊ２ Ｄ　、、、ＱＥＧＳＡｌ）ＩＦＫＤＰに１．。

！ ←ｈにＨＩ鳴芥性ｈＦＧＦ→ ＦＩＧ、　１４ ＜ト ＣＪｌ、Ｉ 間際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１８７９ 工、Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｕｂｊｅｃセ　Ｍａヒ七ｅ【ａｓ 、ｃｌ、４３５７６８．　１７２．３．　２４３．　３１７；　５３６／２７７ 　５３０／３９９；　５１４／２′“−°“１°“ｌ″″””ＰＣ？／ＵＳ８６ ７０１８フ９

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．酸性または塩基性哺乳類ＦＧＦをコードする単離されクローン化された組換 え，または合成ＤＮＡ配列。
2. ２．以下のものを含有するタンパクから成る群から選ばれたＦＧＦタンパクをコ ードする請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列； 第１図ａの１−４１番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第１図ａの７−４１ 番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第１図ａの（−１５）または（−１４） から４１番のアミノ酸配列を含有するタンパク； 第２図ａの１−４１番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第２図ａの７−４１ 番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第２図ａの（−１５）または（−１４） から４１番のアミノ酸配列を含有するタンパク； 第３図の１−１４６番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第３図の１６−１４ ６番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第３図の（−９）または（−８）から １４６番のアミノ酸配列を含有するタンパク； 第４図の１−１４６番のアミノ酸配列を含有するタンパク；第４図の１６−１４ ６番のアミノ酸配列を含有するタンパク；および 第４図の（−９）または（−８）から１４６番のアミノ酸配列を含有するタンパ ク。
3. ３．酸性または塩基性ＦＧＦをコードするヒトまたはウシゲノムＤＮＡを有する 請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．ＦＧＦをコードするＤＮＡの上流側に，そして動作可能に連結された異質の シグナル配列をコードするＤＮＡをさらに含む請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ 配列。
5. ５．発現に対する制御配列に動作可能に連結されている請求の範囲第１項に記載 のＤＮＡ配列。
6. ６．前記制御配列がヒトＭＴ−ＩＩプロモーター，ＳＶ４０由来のウイルスのエ ンハンサー，ワクシニア由来の制御配列，およびｈＧＨ由来の転写終止シグナル のうちの少なくとも一種を含む請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ配列。
7. ７．請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ配列で形質転換された組換え宿主細胞。
8. ８．ＦＧＦをコードするＤＮＡ配列が細菌または哺乳類宿主と和合性の制御配列 に動作可能に連結されている請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列を含み，そし てＤＮＡ配列の発現に有効な組換えベクター。
9. ９．請求の範囲第７項に記載の形質転換細胞を培養することを含む酸性または塩 基性哺乳類ＦＧＦを生産する方法。
10. １０．請求の範囲第９項に記載の方法で生産されたタンパク。
11. １１．以下のものを含むタンパクから成る群から選ばれたタンパクの精製ＦＧＦ ： 第１図の１−４１番のアミノ酸配列を有するタンパク；第１図の７−４１番のア ミノ酸配列を有するタンパク；第１図の（−１５）または（−１４）から４１番 のアミノ酸配列を有するタンパク； 第２図の１−４１番のアミノ酸配列を有するタンパク；第２図の７−４１番のア ミノ酸配列を有するタンパク；第２図の（−１５）または（−１４）から４１番 のアミノ酸配列を有するタンパク； 第３図の１−１４６番のアミノ酸配列を有するタンパク；第３図の１６−１４６ 番のアミノ酸配列を有するタンパク；第３図の（−９）または（−８）から１４ ６番のアミノ酸配列を有するタンパク； 第４図の１−１４６番のアミノ酸配列を有するタンパク；第４図の１６−１４６ 番のアミノ酸配列を有するタンパク；および 第４図の（−９）または（−８）から１４６番のアミノ酸配列を有するタンパク 。
12. １２．少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて，請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する傷害修復を仲介するの に有用な組成物。
13. １３．少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて，請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する血液凝固を制御するの に有用な組成物。
14. １４．少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて，請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する神経の損傷の回復に有 用な組成物。
15. １５．少なくとも１つの薬学的に受け入れられる賦形剤と混ぜて，請求の範囲第 １０項または第１１項に記載のＦＧＦの有効量を含有する困難な組織修復の仲介 に有用な組成物。
16. １６．ヒト検体の充実性腫瘍形成の傾向を予測する方法であって，λＢＢ２また は等価なプローブを用いて，該ヒト由来のゲノムＨｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡ分解物 に２．９ｋｂ　ＤＮＡ断片の存在または不在を検出することを包含する方法。
17. １７．精製または組換え型のヒト塩基性ＦＧＦ。