JPS63502725A

JPS63502725A - 組換えヒト内皮細胞成長因子

Info

Publication number: JPS63502725A
Application number: JP62502073A
Authority: JP
Inventors: ジエイ，マイケル; バ−ガス，ウイルソン; マ−シア，ト−マス; ドロハン，ウイリアム
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1986-03-03
Filing date: 1987-03-02
Publication date: 1988-10-13
Also published as: DK175807B1; AU7201287A; FI874819A0; KR880700858A; EP0259475A1; DK572487A; JPH09294590A; UA13321A; IE66307B1; AU617086B2; IE870535L; WO1987005332A1; HK1002123A1; NZ219485A; PH24857A; FI874819L; JP3372464B2; KR960002874B1; DK572487D0; JP3273354B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（至）　ヒト内皮細胞成長因子に関する完全なコーディング配列を含むｃＤＮＡクローン。

翰　内皮細胞損傷ｍＲＮＡによシ規定されるヒト内皮細胞成長因子のコーディング配列に対して５′及び３′に位置する未翻訳のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクローン。

０１）許容しうる担体との混合物中で傷のなおりを促進する、治療上有効量のヒト内皮細胞成長因子を含む組成物。

組換えヒト内皮細胞成長因子明細書組換えヒト内細胞成長因子本発明はある蛋白の組換えＤＮＡによシ導ひかれる合成に関する。さらに詳しくは、本発明は内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、その組換えＤＮＡによシ導かれる合成及び内皮細胞損傷及び／又は再生の治療におけるＥＣＧＦの用途に関する。

〔従来の技術〕

本明細書ではｌ”ＥＣＧＦＪと呼ばれる内皮細胞成長因子は、生体外の内皮細胞に関するミトゲンである。内皮細胞の成長は、アンジオゲネシスの方法中の必蚤な工程テアル〔マシアグ（Ｍａｅｉａｇ　）　ｒプログψヘモスタシス・アンド・トロンボ（Ｐｒｏｇ、　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂ、）Ｊヱ：１６７〜１８２　（１９８４）；マシアグ、Ｔ、、フーバー（Ｈｏｏｖｅｒ　）　、　Ｇ、　Ａ、及びワイ７シＬタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　）　、Ｒ，、ｒ　Ｊ、バイオロ、ケム、（Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｔｎ、）Ｊ　２５７　：　５３３３〜５３３６　（１９８２））。

ウシＥＣＧＦはマシアグらにより単離された〔［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ２２５　：　９３２−９３５　（１９８４））。

それはストレプトマイシン硫酸塩沈でん、ゲル排除クロマトグラフィ、位ε酸アンモニウム沈でん及びヘパリン・セファロース・アフイニテイクロマトグラフイを用いた。

このやシ方で精製されたウシＥＣＧＦは、アニオン性等電点及び２０．０００の見掛は上の分子量を有する１本鎖ポリペプチドを生する〔マシアグ向上：シュライバ−（５ｅｈｒｅｉｂｅｒ　）ら［Ｊ、セル・バイオｏ、（ＣｅｌｌＢｌｏｌ、））１０１　：１６２３〜１６２６　（１９８５）；及びシュライバーら「プロシ、ナッル、アカデ、サイ（Ｐｒｏｅ−Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　Ｊ　８２　：　６１３８〜６１４２　（１９８５））。さらに最近では、ヘパリン−セファロースカラムからのウシＥＣＧＦの塩化ナトリウム勾配溶離によシ、又は逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によシ、複数の形のウシＥＣＧＦがバーシス（Ｂｕｒｇｅｓｓ　）ら〔「Ｊ、バイオロ、ケムＪ２６０　：１１３８９〜１１３９２（１９８５））によシ単離された。

アルファーＥＣＧＦ及びベーターＥＣＧＦと呼はれる２種の単離されたポリペプチドは、それぞれ１７，０００及び２０．０００の見掛は上の分子量を有する。

このやり方を用いて、８，５００−のウシ脳抽出物（６，２５Ｘ１０７全単位）に含まれるウシＥ　ＣＧ　ＦＦｉ、合計６−のアルファーＥＣＧＦ（３，０Ｘ１０’単位）及び３ＷｔのベーターＥＣＧＦ　（５，２Ｘ１０器単位）に濃に６される。これは、アルファーＥＣＧＦの９，３００倍の精製及びベーターＥＣＧＦの１ａ３００倍のｗｈである（バーシス、同上）。

最近、ウシＥＣＧＦに対するネズミモノクローナル抗体が生成され（マシアグら、同上）、それは米国特許第４、３６１．５０９号明細書にチンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ　）及びフルヒアー（Ｆｕｌｃｈｅｒ　）によシ記れされたファクター〜１ｉＣのモノクローナル抗体精製に似た方法で、ウシＥＣＧＦを精製するのに有用であろう。

一般に、組換えＤＮＡ技行は周知である。［メンツズ・イン・エンチモロジ−（Ｒｉａｔｈｏｄｇ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　Ｊ（アカデミツク・プレス、二ニー・ヨーク）、１５及び６８巻（１９７９）；１００及び１０１巻（１９８３）及びそれらに引用された参考文献参照（これらのすべては本明ｆｉ１書において参考文献として引用される）。最も普通に用いられる組換えＤＮＡの方法論を具体化する広範囲の技術的な論説は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ｊコールド・スプリング・ハーバ−脅ラボラトリ−（１９８２）に見い出されうる。

種々のポリペプチドについてコーディングする遺伝子は、組換えＤＮＡ媒体例えは細菌性又はウィルス性のベクターにポリペプチドについてコーディングするＤＮＡ７ラグメントを組み入れ、そして適当な宿主を形質転換することにニジクローンされうる。この宿主は代表的にはエツシエリキア・コリ（Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｉａｃｏｌｔ　）　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）菌であるが所望の生成物に応じて真核宿主が用いられうる。組換えベクターを組み込むクローンは単離されそして成長されさらに多量に所望のポリペプチドを生成するのに用いられうる。

三、四のグループの科学者は、真核細胞からメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の混合物を単離しそして一連の酵素的反応を用いてこのｍ　ＲＮ　Ａに対して相袖的−二本鎖ＤＮＡコピーを合成した。第一の反応において、ｍ　ＲＮ　Ａ　Ｆｉ　ＲＮ　Ａに向うＤＮＡポリメラーゼ（又逆転写酵素と呼ばれる）によシー重鐘相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ転写される。逆転写酵素は５’−３’方向にＤＮＡを合成し、プレカーサーどしてデオキシリボヌクレオチド５′−トリホスフェートを用い、そして鋳型及びプライマー鎖を必要とし、その後者は遊離の３′− ヒドロキシル末端を有しなければならない。ｍ　ＲＮ　Ａの鋳型の部分的なコピー又は完全なコピーの何れにせよ、逆転写酵素生成物は、しばしばそれらの３′ 末端において短い部分的に二本鎖のヘアピン（「ループ」）を有する。第二の反応において、これらの「ヘアピン嗜ループ」は、ＤＮＡポリメラーゼに対するプライマーとして働く。予め形成されたＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用において調型としてさらにプライマーとして要求される。ＤＮＡポリメラーゼは、遊離の３′−ヒドロキシル基（それに新しいヌクレオチドが加えられてｓ／　ｓ１方向に鎖を延ばす）を有するＤＮＡｔＪの存在を必要とする。このような連続逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ反応の生成物は、なお一端でループを有する。

そのようにして生成された二軍鎖ＤＮＡのループ又は「折シ重ね点」の頂点は、実質的に一本鎖セグメントである。第三の反応において、この一本鎖セグメントは、−重鎖特異的ヌクレアーゼＳ１によシ開裂されて「プラントエンド」二本ＭＤＮＡセグメントを発生させる。この一般的な方法は、すべてのｍ　ＲＮ　Ａ混合物に適用可能でるシ、そしてブエル（Ｂｕｅｌｌ）ら「Ｊ、パイオロ、ケム、Ｊ２５３：２４８３（１９７８）に記載され−いる。

得られた二本鎖ｅＤＮＡ混合物（ｄｓ−ｅ　ＤＮＡ　）は、少くとも一部は用いられる特別な媒体に応じて、多くの周知の技術の任意の一つによシフローンする媒体にそう人される。種々のそう人法は、［メソッズ・イン・エンチモロジーＪ６８：１６〜１８　（１９８０）及びその引用文献にかなシ詳しく述べられている。

一度ＤＮＡセグメントがそう人されると、クローンする媒体が用いられて適当な宿主を形質転換する。これらのクローンする媒体は、通常、宿主に抗生物質抵抗性の％徴を与える。このような宿主は、一般に原核細胞である。この点において、形質転換又はトランスフェクションされた宿主の二、三のみが所望のｅ　ＤＮＡを含むに過ぎない。すべての形質転換又はトランスフェクションされた宿主のすべてが、遺伝子「ライブラリー」を形成する。この方法によシ生成された全部のｄ　ａ　−ｅ　ＤＮＡライブラリーが、原料として用いられるｍ　ＲＮ　Ａ混合物に存在するコーディング情報の代表的なサンプルを提供する。

もし適当カオリゴヌクレオチド配列が利用しうるならば、それは用いられて下記のやシ方で問題のクローンを同定する。個々の形質転換又はトランスフェクションされり細胞は、ニトロセルロースＰ紙上でコロニーとして成長する。これらのコロニーを溶解し：放出されたＤＮＡを加熱によりＰ紙に固く結合する。１紙を、次に問題の構造遺伝子に相補的なラベルされたオリゴヌクレオチドのグローブとともにインキュベートする。プローブは、それが相補的なｅＤＮＡと交雑し、そしてオートラジオグラフィにより同定される。所望の蛋白に関する構造上の情報のすべてを含むクローンの一つ又は組合せを同定するために、相当するクローンの特徴をめる。問題の蛋白についてコーディングする核酸配列を単離し、そして発現ベクターに再そう入する。発現ベクターは、ｄｓ　−ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａの有効な発現（転写及びし訳）を行わさせる特定の原核又は真核のコントロール要素の統制コントロールの下に、クローンされた遺伝子をおく。従って、この一般的な技術は、少くとも一部のそれらのアミノ撃又はＤＮＡ配列がオリゴヌクレオチドのプローブが利用可能であることについて知られているこれらの蛋白に対してのみ利用可能である。一般にマニアチスら、同上参照。

さらに最近では、問題のエンコードされた蛋白に対して特異的な抗体によシ細菌性コロニー又はファージ・プラークをプロービングすることによシ、特定のクローンを同定する方法が開発された。蛋白生成物の合成が必要なので、この方法は「発現ベクター」クローニング媒体についてのみ用いられる。構造遺伝子は、蛋白の発現をコントロールする調節遺伝子配列に隣接したベクターにそう人される。細胞は、化学的方法又は宿主細胞或いはベクターによシ供給される機能の何れかによシ、溶解され、そして蛋白は特定の抗体及び検出システム例えば酵素イムノアッセイにより検出される。この一つの例は、ヤング（Ｙｏｕｎｇ　）及びデービス（Ｄａｖｉａ　）ｒプロシ拳ナツル・アカデ、サイ、ＵＳＡＪ８０：１１９４〜１１９８（１９８３）並にヤング及びデービス「サイエンス」２２２ニア７８（１９８３）によシ記載されたラムダｇ　ｔ＋ｔシステムである。

〔発明の概要〕

本発明は、容易に利用しうる大量のＥＣＧＦ又はＥＣＧＦフラグメントを提供可能にした。これは、そのデザインがウシＥＣＧＦのアミノ醒配列の知識に基きそしてＥＣＧＦ　ｅＤＮＡと特異的に反応するオリゴヌクレオチドによシ達成される。ＥＣＧＦの生成は、ＥＣＧＦ蛋白をエンコーディングするクローニング媒体の生成に対する組換えＤＮＡ技術の適用並にヒト超厚の他の蛋白が実質的にないＥＣＧＦ蛋白を回収する方法によシ達成される。

従って、本発明はヒト超厚の他の蛋白を実質的に欠くＥＣＧＦ又はその７ラグメン）を提供する。ＥＣＧＦは、宿主細胞又は他の自己複製システムにおいて組換えＤＮＡ技術によシ生成され、そして本質的に純粋な形で提供される。本発明は、さらにＥＣＧＦをエンコーディングするＤＮＡ配列を組み込む複製可能な発現ベクター並にそれによシ形質転換又はトランスフェクションされる自己複製宿主細胞システムを提供する。宿主システムは、通常、原核例えばＥ、コリ又はＢ、ズブチリス又は真核細胞のものである。

ＥＣＧＦｔｌｉ、（ａ）適当な宿主細胞システム中にＥＣＧＦをエンコーディングするＤＮＡ配列を発現しうる複製可能な発現ベクターを生成させ；（ｂ）該宿主システムを形質転換して組換え宿主システムが得られ；（Ｃ）該ＥＣＧＦ二ンコーディングＤＮＡ配列の発現を生じさせる条件下で該組換え宿主システムを維持してＥＣＧＦ蛋白を生成させ；そして（ｄ）該ＥＣＧＦ蛋白を回収することよシなる方法により生成される。好ましくは、ＥＣＧＦエンコーディング複製可能発現ベクターは、ＥＣＧＦｍＲＮＡを代表するｄ＠−ｃＤＮＡ生成物を調製しそしてｄ　ａ　−ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを複製可能な発現ベクターに組み込むことによシ製造される。ＥＣＧＦを回収する好ましい態様は、組換え宿主システムにより発現された蛋白と、ＥＣＧＦに関して特異的な少くとも一つの結合工程を含む試薬組成物とを反応させることを含む。ＥＣＧＦは、損傷の治療又は血管及び他の内皮細胞系構造の再生において治療剤として用いられうる。

第１図は、ｃＤＮ人クローンを生成する酵素反応の一般的な方法を示す。

第２図は、ラムダｇｔｓｔ、にそう人されるＤＮＡフラグメントを含むライプ２リーの生成を示す。

第３図は、ウシのアルファ及びベータＥＣＧＦの部分的アミノ酸配列を示す。

ラインミニウシのアルファＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸配列。

ラインｂ＝ウシのベータＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸配列。かっこ内の部分は、その配列が決定されなかったＮＨ，末端セグメントに相当し：その代ジアミノ酸組成が示される。Ｐｈｅ人５ｎＬｅｎ・・争−で始まる配列は、トリプシン開裂ウシベータＥＣＧＦから決定されたつライｙ　ｅ　１１臭化シアノゲン開裂ウシアルフアＥＣＧＦ（７）アミノ酸配列。

ラインｄ；臭化シアノゲン８裂ウシベータＥＣＧＦのアミノ酸配列。

第４図は、水素結合された塩基対を示す。

第５図は、ヒト内皮細胞成長因子のためのオリゴヌクレオチドのプローブのデザインを示す。

第６図は、ヒトＥＣＧＦ　ｅＤＮＡクローン１及び２９の概略図を示す。開いたリーディング・ボックスは、ヒトベータＥＣＧＦをエンコーディングする開いたリーディング−フレームを示す。ＥｃｏＲ１部位は、ｃＤＮＡライブラリーの構成に用いられる合成オリゴヌクレオチドリンカーに相当する。クローン１の３′ 末端のポリ（Ａ）テールは、Ａ１７によシ示される。

第７図は、ヒトＥＣＧＦ　ｅＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドプローブとの間の同一性を示す。

ラインミニウシのトリプシン−又は臭化シアノゲン開裂ベータＥＣＧＦアミノ酸配列。

ラインｂ：ユニークなオリゴヌクレオチドグローブ。

ラインＣ：ヒトＥＣＧＦ　ｃＤＮＡ配列（ラムダＥＣＧＦクローン１及び２９から決定）。

ラインｄ：ｅＤＮＡ配列分析から導かれたヒトＥＣＧＦアミノ酸配列。

第８図は、ヒ）　ＥＣＧＦの完全なｅＤＮＡ配列を示す。

ＥＣＧＦクローン１及び２９からのｅＤＮＡインサートはＭ１３ｍｐ１８にサブクローンされ、そしてＥＣＧＦエンコーディング開放リーディング・フレーム及びその側面領域は、釦成長停止法によシ配列された。ＥＣＧＩＴ’二ンコーデインコーディング開放リーディングフレーム３′末端の停止コドンは、フレームにおいて、アンダーラインされた配列及びｔｒｍによりそれぞれ示されている。アミノ酸に関する一つの文字の表示が用いられる：Ａ、ａ　ｌ　ａ　；　Ｃ，Ｃｙ　ｓ　：　Ｄ。

Ａｓｐ　；Ｅ、　Ｇｉｎ　；Ｆ、　Ｐｈ＊　；Ｇ、　Ｇｌｙ　；Ｈ，Ｈｉｓ　；　Ｉ、　Ｉｌｅ　；に、　Ｌｙ！Ｉ”。

Ｌ、Ｌｓｕ；Ｍ、Ｍｅｔ；Ｎ、Ａｓｎ；Ｐ、Ｐｒｏ；Ｑ、Ｇｉｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ、　Ｓｅｒ　ｅ、　’ｒ、　Ｔｈｒ　；Ｖ、　Ｖａｌ　；Ｗ、　Ｔｒｐ　；Ｙ、　Ｔｙｒ。

第９図扛、ＥＣＧＦ　ｍＲＮ人のノーザン会プロット分析を示す。ＲＮＡはＺ　２　Ｍホルムアルデヒド及び５０％ホルムアミド中で変性させられそして２−２　Ｍホルムアルデヒドを含む１．２５％アガロースゲル中の電気泳動によυ分画された。これを１０ＸＳＳＰＨによってプロットすることによシジーンスクリーン・プラス（Ｇｅｎｅ　ＳｃｒｅｅｎＰｌｕｇ）（二ニー・イングランド・ニュークリア）に移した。プロットを、２Ｘ　５ＳＰＥ、２０Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）の溶液、イースト・トランスファＲＮＡ（２００ｐｙ／ｍｔ）、０．２％ＳＤＳを含む混合物中で１６時間６５℃でＥＣＧＦクローン１のｓ２ｐをラベルしたニック翻訳プローブへ交雑された。膜を６５℃で２ＸＳＳＰＥ及び０．２チＳＤＳによ９２回、０．２ＸＳＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳによ９２回次々に洗い、風乾しそして増感スクリーンとともにコダックＸＡＲフィルムに１晩露出した。２８８及び１８ＳＲＮＡの転位が示される。

レーン１：１０Ｐｆ　ヒト脳ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ０レーン２：１０μｔヒト成人肝ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ０本明細書で用いられるとき、「ＥＣＧＦＪｈ、ヒトのアンジオゲニツタなプロセスに個有なＥＣＧＦが有するように、生体外で細胞の成長、分化及び転位に影響する能力を有する生活性的な形で、細胞又は無細胞培養システムによシ生成される内皮細胞成長因子又扛その７ラグメントを示す。

ＥＣＧＦの異るアジルは、自然に存在しうる。これらの変異は、同一の生物学的機能の蛋白に対してコーディングする構造遺伝子のヌクレオチド配列における相違によシ特徴付けられよう。単−又は複数のアミノ酸の置換、欠損、付加又は転換を有するアナローブを生成することは可能である。自然のＥＣＧＦの生物学上活性な性質を保つＥＣＧＦの誘導体をもたらすアナローブ並にすべてのこのようなアルレの変異、修飾は、本発明の範囲内に含まれる。

「発現ベクター」は、そのような配列がそれらの発現に影響しうる他の調節配列に結合するとき、そこに含まれたＤＮＡ配列を転写及び翻訳しうるベクターを指す。

これらの発現ベクターは、エピソーム、バクテリオファージとして又は染色体ＤＮＡの拡大部分としての何れかで、宿主生物又はシステム中で複製可能でなければならない。本発明で特に用いられるのに適した発現ベクターの一つの形は、細菌中で通常生存し複製するバクテリオファージ、ウィルスである。この目的に特に望寸しい７アージは、ヤング及びデービス、同上により記述されたラムダｇｔ１゜及びｇｔｔｔファージである。ラムダｇｔｔｔは、そう人されたＤＮＡによシ特定されるポリペプチドを生成しうる一般的な組換えＤＮＡ発現ベクターである。

劣化を最低にするために、ラクトースの合成アナローブ（ＩＰＴＧ）による誘導のときに、異物蛋白又はその部分は原核蛋白Ｂ−ガラクトシダーゼに合成融合される。

蛋白劣化径路に欠けた宿主細胞の使用は、又誘導されたラムダｇ　ｔ１１クローンから生成された新規な蛋白の寿命を増大させる。ラムダｇｔｔｔクローンにおける異物ＤＮＡの適当な発現は、Ｂ−ガラクトシダーゼプロモーター及び翻訳開始コドンに関するそう人されたＤＮＡの適切な配向及びリーディング・フレームに依存するだろう。

組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターの他の形は、プラスミド即ち円形の組込まれていない（染色体外）の二重鎖ＤＮＡループである。同等な機能を果す発現ベクターの任意の他の形は、本発明の方法に用いられるのに適している。

本明細書において開示された組換えベクター及び方法は、広範囲の原核及び真核の生物を含む宿主細胞に用いられるのに適している。原核細胞が、ＤＮＡ配列のクローン化及びベクターの構成に好ましい。例えば、Ｅ、コリに１２株ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）が特に有用である。もち論、他の微生物の株も用いられうる。宿主細胞又はシステムと両立しうる種から誘導された複製及びコントロール配列を含むベクターは、これらの宿主とともに用いられる。ベクターは、形質転換された細胞に表現型選択をもたらしうる特徴とともに、元来複製の元を有している。例えば、Ｅ、コリは、ベクターｐＢＲ３２２を用いて形質転換され、それはアンピシリン及びテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含む〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら［ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　２：９５（１９７７）］。

これらの抗生物質抵抗性遺伝子は、形質転換された細胞を同定する手段を提供する。発現ベクターは、又目的の遺伝子の発現のために用いられうるコントロール要素を含む。Ｅ、コリ中の異物ＤＮＡ配列の発現のために用いられる普通の原核コントロール要素は、バクテリオファージラムダのｐＲ及びｐＬプロモーターとともに、Ｅ、コリのＢ−ガラクトシダーゼ及びトリプトファン＜　ｔｒｐ　）オペロンから誘導されたプロモーター及び調節配列を含む。これらの要素の組合わせは、又用いられる（例えは、ｔｒｐプロモーターとラクトースオペレーターとの融合物であるＴＡＣ）。他のプロモーターも又発見されそして利用され、そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細は、発表されて当業者がそれらを機能的に組合わせそして利用することができる。

原核生物に加えて、真核微生物例えばイースト培養も又用イラれうる。サツカロミセス・セルビシェ（Ｓａｅｅｈａｒｏｍｙｃｅａ　ｃｅｒｖｉｓｉａａ　）　又は普通のペーカーズ・イーストは、真核微生物の中で最も普通に用いられるが、多数の他の菌株も普通に利用される。イースト中の異物ＤＮＡ配列の発現に適したイーストプロモーターは、３−ホスホグリセラートキナーゼ又は他のグルコース分解酵素のためのプロモーターを含む。好適な発現ベクターは、クローンされた遺伝子のｍＲＮＡ転写のポリアデニル化及び停止をもたらす停止シグナルを含む。イーストと両立しうるプロモーター、複製の起源、適切な停止配列を含む任意のベクターは、ＥＣＧＦの発現のために適している。

多細胞生物から誘導された細胞系も又宿主として用いられうる。原則として、を椎動物又は無を椎動物の源からの何れでも、任意のこれら細胞培養は利用可能でちる。

しかし、関心はを椎動物の細胞において最大であシ、そして培養（組織培養）中のを椎動物の細胞の増殖は、最近普通に行われている。このような有用な宿主の例は、ＶＥＲＯｌＨｅＬａ、マウスＣ１２７、チャイニーズ拳ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＷＩ　３８、ＢＨＫ、Ｃ０８−７及びλ１ＤＣＫａ胞系である。このような細胞の発現ベクターは、元来、ＷＥの起源、発現されるべき遺伝子の前にらるプロモーター、ＲＮＡ切シ継ぎ部位（もし必要ならば）そして転写停止配列を含む。

は乳動物の細胞に用いられるため、発現ベクターのコントロール機能（７”ロモーター及びエンハンサ−）は、しばしばウィルス性物質によシ提供される。例えば、普通に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス２そして最もしばしはシミアン（Ｓｉｍｊａｎ）ウィルス４０　（ＳＶ　４０）から誘導される。真核プロモーター例えばネズミメタロチオネイン遺伝子のプロモーター〔パウラキス（Ｐａｕｌａｋｉｓ　）及びハフ　−（Ｈａｍｅｒ）ｒプロン・ナツル・アカデ・サイ、Ｊ８０：３９７〜４０１（１９８３））も又用いられうる。

その上、このようなコントロール配列が宿主システムと両立しうるならば、所望の遺伝子配列と元々結合しているプロモーター又はコントロール配列を利用することが可能であシそしてしばしば望ましい。転写の速度を高めるために、真核エンハンサー配列も構築に加えられうる。これらの配列は、種々の動物細胞又は発がん性のレトロウィルス例えばマウス肉腫ウィルスから得られうる。

複製の起源は、外因性の起源例えばＳＶ４０又は他のウィルス性の起源によシ提供されるものを含むベクターの構築によりもたらされるか、又は宿主細胞の染色体複製メカニズムによシもたらされるかの何れかである。もしベクターが宿主細胞の染色体に組み入れられるならば、後者がしばしば充分である。

宿主細胞は、種々の化学的組成を有するＥＣＧＦを生成しうる。蛋白はその第一のアミノ酸としてメチオニンを有するものが生成される。このメチオニンは、構造遺伝子の起源で元々存在するＡＴＧ開始コドンによシ・又は構造遺伝子のセグメントの前に操作されることによシ存在する。蛋白は、又細胞内又は細胞外で開裂されて、蛋白のアミノ末端で元々見い出されるアミノ酸を生ずる。

蛋白は、それ自体又は異種シグナルペプチドの何れがとともに生成され、シグナルポリペプチドは細胞内又は細胞外の環境で特異的に開裂可能でちる。最後に、ＥＣＧＦは、任意の外来のポリペプチドを開裂し去る必要なしに成熟した形で直接発現によう生成されうる。

組換え宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換された細胞に関する。本明細書で規定された如く、ＥＣＧＦはこの形質転換の結果として生成される。このような細胞により生成されたＥＣＧＦ又はそのフラグメント杜、「租換えＥＣＧＦＪとされる。

下記の方法は、本発明の方法で有用な特定の試剤を生成する多斂の充分に確立された方法の成るものに過ぎない。ｍ　ＲＮ　Ａ混合物を得るための一飲的な方法は、組織サンプルを得るか又は所望の蛋白を生成する細胞を培養するかそしてチャーブウィン（Ｃｈｌｒｇｗｉｎ　）ら［バイオケミストリー（ＢｉｏｃｈｅｍｉＩ！Ｉｔｒｙ　）　Ｊす３：５２９４（１９７９＞により開示された方法の如き方法によりＲＮＡを抽出することである。ｍ　ＲＮ　Ａは、オリゴ（ｄｒ）セルロース又はポリ（Ｖ）セファロースのクロマトグラフィ次いでポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ画分の溶離により、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ含有物質によシ増加される。

上述のポＩＪ（Ａ）含有ｍ　ＲＮ　Ａ増加画分を用いて逆転写酵素を用いて一本鎖相補ｅＤＮＡ　（ａｓ−ｃＤＮＡ）を合成する。ＤＮＡ合成の結果として、ヘアピン・ループは第二の鎖ＤＮＡ合成を開始するＤＮＡの３′末端で形成される。適切な条件下、このヘアピン・ループを用いてＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下ｄｓ−ｅＤＮＡの合成を行なう。

得られたｄｓ−ｅＤＮＡは、多くの周知の技術の任意の一つによシ発現ベクターにそう入される。一般に、方法はマニアテスら、同上並に「メソッゾ・イン・エンチモロジイ」６５及び６８巻（１９８０）及び１００及び１０１巻（１９８３）に見い出される。一般に、ベクターは少くとも１種の制限エンドヌクレアーゼにょ多線状化され、それは少くとも２個のプラント又は結合端を生成するだろう。ｄｓ−ｅＤＮＡは、ベクターそう入部位とりゲート又は結合される。

もし実質的な細胞壁物質を含む原核細胞又は他の細胞が用いられるならば、発現ベクターによる形質転換の最も普通の方法は、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ　）　ｓ　Ｒ，Ｎ、ら「プロシ、ナツル、アカデ、サイ、ＵＳＡＪ６９：２１１０（１９７２）によシ記載された塩化カルシウム予備処理である。もし細胞壁バリヤーなしの細胞が宿主細胞として用いられるならば、トランスフェクションはグラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファン・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　）　ｒウィロロジ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　Ｊ　５２：４５６　（１９７３）により記載されたシん酸カルシウム沈でん法にょシ行われる。細胞にＤＮＡを導入する他の方法例えば被注入、ウィルス感染又はプロトプラスト融合が成功して用いられうる。

細胞は次に選択的媒体上に培養され、そして発現ベクターがエンコードする蛋白が生成される。

ＥＣＧＦに関する一部又は全部のｃＤＮＡを含むクローンは、ＥＣＧＦの部分的アミノ酸配列決定から導かれた特定のオリゴヌクレオチドグローブによシ同定される。

この同定法は、非同義性オリゴヌクレオチドプローブがデザインされてそれが特異的にＥＣＧＦ　ｄａ−ｃＤＮＡに交雑することを必要とする。ＥＣＧＦｅＤＮＡ配列を含むクローンは、”ｐ−ＡＴＰによシオリゴヌクレオチドプロープを放射性ラベルし、ＥＣＧＦ−ｃＤＮＡを含むｅＤＮＡライブラリーの個々のクローンのＤＮＡへ放射性オリゴヌクレオチドプローブを交雑し、そしてオートラジオグラフィーによＪ９雑するクローンの検出及び単離によシ単離される。このようなりローニングシステムは、ヤング及びデービス、同上によシ記載されたラムダｇｔ１□システムに適用可能である。

ＥＣＧＦの全配列を含むクローンは、ＥＣＧＦ％異的オリゴヌクレオチドによる組換えラムダｇｔ、□　ｅ　ＤＮＡライブラリーの最初のスクリーニング中単離されたＥＣＧＦ組換え体のｅＤＮＡインサートをプローブとして用いて同定される。ヌクレオチド配列技術を用いてｃＤＮ人フラグメントにニジエンコードされたアミノ酸の配列を決定する。この情報を用いてウシＥＣＧＦ及びＥＣＧＦの臭化シアノゲン開裂により誘導されるペプチドのアミン末端の周知のアミノ酸配列に対する比較により、推定のＥＣＧＦ　ｅＤＮＡクローンの同定性を決定する。

〔実施例〕

人、全ＲＮＡの生成全ＲＮＡ　（メツセンジャー、リボゾーム及びトランスファー）を、本質的にチャーブウィン、同上（１９７９）に記載されたように新鮮な２日経過したヒトの脳幹がら抽出した。細胞ベレットを５倍容の溶液（４Ｍグアニジンチオシアナート及び２５ｍＭアンチ　７オーム（Ａｎｔｉｆｏｒｍ）　Ａ　（シグマ・ケミカル会カンパニー、セント・ルイス、ミズリー）を含む〕中でホモゲナイズした。

ホモジネートを１０℃で１５分間ツルパル（Ｓｏｒマａｌｌ　）ＧＳＡＳ−ローター中、０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を酢酸の添加によりｐｎｓ、ｏに調節し、そしてＲＮＡが２時間−２０℃で０．７５倍容のエタノールによシ沈でんした。ＲＮＡを遠心分離により集め、そして２ｍＭ（えん酸ナトリウム及び５ｍＭジチオスレイトールを含む７．５Ｍグアニジン塩酸塩中に溶解した。０．５倍容のエタノールを用いて２回の追加の沈でん後、残存するグアニジン塩酸塩を無水エタノールによシ沈でんから抽出した。

ＲＮＡを滅菌水に溶解し、°不溶物質を遠心分離により除きそしてペレットを水によシ再抽出した。ＲＮＡを０．２Ｍ酢酸カリウムに調節しそして１晩−２０℃ で２５倍茶のエタノールの添加によシ沈でんさせた。

Ｂ、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡの生成前述の如く生成された全ＲＮＡ法でんを１０ｍＭＥＤＴＡ及び１’％ＳＤＳを含む２０　ｍＭへペスパツファ−（ｐＨ７，２）に溶解し、１０分間６５℃で加熱し次に２５℃に急速に冷却した。ＲＮＡ溶液を次に等容量の水により希釈し、ＮａＣ１を加えて最終の浸度を３００　ｍＭＮａＣｌとした。２４０　Ａ２６゜単位以内のＲＮＡを含むサンプルを標準の方法を用いてポリ（Ｕ）セファロースのクロマトグラフィにかけた。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを１ｍＭへペスバツファ−（ｐＨ７，２）及び２ｍＭＥＤＴＡを含む７０チホルムアミドによシ溶黙した。溶離液を０，２４Ｍ　ＮａＣ１に調節しそしてＲＮＡを一２０℃で２５倍茶のエタノールによシ沈でんさせた。

Ｃ，ラムダｇ　ｔｔｔ中のｃＤＮＡクローンの構築酵素反応について行われた方法は、第１図に示される。

ｍＲＮＡ（２０μｆ）をプエル（Ｂｕｅｌｌ　）ら、同上及びウィルケンセン（Ｗｉ　１ｋｅｎａｅｎ　）ら「Ｊ、パイオロ、ケム、」２５３：２４８３　（１９７８）に記載された通シに、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼＩによｊ）ｄｓ−ｃＤＮＡヘコピーされた。ｄａ−ｃＤＮＡをセファデックスＧ−５０で脱塩し、そして放出された容量の両分をさらにメーカーの処方に従ってエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ　）　Ｄカラム〔シュライヒアー拳アンド・シュエル（５ｅｈｌｅｌｅｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ　）、キーン、Ｎ）（）で精製した。ｄａ−ｃＤＮＡを８１ヌクレアーゼとのインキュベーションによシブラント末端にした〔リカ（Ｒｉｅｃａ　）ら、［Ｊ、オバロ、ケム、」見上６　：１０３６２（１９８１）］。反応混合物は、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、０．４Ｍ塩化ナトリウム、Ｚ５ｍＭ酢酸亜鉛及び０．１単位の８１ヌクレアーゼ（ｄｓ−ｃ　ＤＮＡ／　ｎｇ当シ）よシなシ、１００　ｐｔの最終反応容量とした。ｄａ−ｅＤＮＡを１時間３７℃でインキュベートし、フェノール：クロロホルムにょシ抽出し次に前述の如くセファデックスＧ−５０で脱塩した。

ｄａ−ｅＤＮＡを次にマニアチスら「モレキュラー・クローニング」同上に記載された反応条件を用いてＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ　）フラグメント及びＥｃｏＲＩメチラーゼによシ処理した。ｅＤＮＡを再び前述の如くセファデックスＧ−５０で脱塩し次にＴ、ＤＮＡリガーゼ（マニアテスら、同上）を用いてｏ、ｓｐりのホスフオリル化ＥｅｏＲＩリンカ−にリグートした。

混合物をＥｃｏＲＩによシ開裂しセしてトリス・ボレートバッファ中の８％アクリルアミドゲルで分画した（マニアチスら、同上）。１キロベースよ）大きい大きさのＤＮＡ　をゲルから溶離しそしてエルチップシカラムに結合することによシ回収し、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１により溶離しそしてエタノール沈でんにより集めた。

第２図に示されるように、ＤＮＡフラグメントは次にＴ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ　！ｊガーゼを用いて開裂されたＥｃｏＲＩ及びホスファターゼにより処理されたラムダｇ　ｔｔｔにそう入された。５．７Ｘ１０’　ファージのライブラリーが生成し、その中の約６５チが組換え７アージでおった。ライブラリーは、Ｅ、コリＹ　１０８８　（５ｕｐＥ　５ｕｐＦ　ｍｅｔＢ　ｔｒｐＲｈａｄＲ”’　ｈｓｄＭ”　ｔｏｎＡ２１　５ｔｒＡ　１ａｃＵ１６９（ｐｒｏＣ：；Ｔｎ５）（ｐＭＣ９））に４２℃でプレートストックを生成することによｐ増巾された。増巾方法はマニアチスら、同上に記載されている。ヤング及びデービス、同上によシ記載されたこの菌株の重要な特徴は、（１）　ｓｕｐ　Ｆ　（Ｓ遺伝子におけるファージアンバー突然変異の要求された抑圧）　、（２）　ｈ＠ｄ　Ｒ−ｈｓｄ　Ｍ−（宿主修飾前異物ＤＮＡの制限を防止するのに必要）そして（３）１ａｃＵ１６９　（ｐｒｏｃ：；Ｔｎ　５　）さらに（４ＮｐＭＣ９）（ファージ及び／又は細胞の成長を阻害しうる異物遺伝子の発現をインデューサーの不存在下抑制するｌａｃ　ｌ含有ｐＢＲ３２２誘導体）を含む。

Ｄ、ＥＣＧＦ配列を含むクローンの同定ＥＣＧＦ　ｅＤＮＡを含む組換えファージに関するライブラリーをスクリーンするために、１．５Ｘ１０’　ファージをＥ、コリＹ１０９０（△１ａｅＵ１６９　ｐｒＡΔ１ｏｎａｒａＤ１３９　ａｔｒＡ　＠ｕｐＦ　（ｔｒｐＣ２２：”、　Ｔｎ　１０　）（ｐＭＣ９））の菌叢にプレートし、そして６時間４２℃でインキュベートした。プレートを１晩冷凍した後、ニトロセルロースフィルターをプレートの上に置いた。

フィルターの位置を針によシマークした。フィルターを１分後除きそして室温で放置して乾燥した。各プレートから、重複したフィルターを前述した通シに作成したが、ただしフィルターを５分間プレートと接触させたままにした。すべてのフィルターを次にマニアチスら、同上に記載された如く父雑のために生成した。

これはα５ＭＮａ　ＯＨ、１，５Ｍ　ＮａＣ１中のＤＮＡの変性、ＩＭ）リス− ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１，５Ｍ　Ｎａ　Ｃ１中の中和及び真空下８０℃２時間にわたるフィルターの加熱を含んだ。

ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーをＥＣＧＦインサートを含むクローンについてスクリーンするために、特定のオリゴヌクレオチドをデザインした。このオリゴヌクレオチドは、ＥＣＧＦのアミノ末端の部分的アミノ酸配列分析に基いた。第３図のラインａ及びｂで示されるように、ウシＥＣＧＦはアルファ及びベータＥＣＧＦと呼ばれる２種として単離され、それはそれぞれのナミノ末端で見い出されるアミノ酸だけが異なる。第３図のラインｂに示されるように、ベータＥＣＧＦはアルファＥＣＧＦより僅かに大きなものである。ベータＥＣＧＦのアミノ末端における正確なアミノ酸配列は未決定であるが、配列は高速原子衝撃質量分析によシ訪導されそしてウシベータＥＣＧＦのアミノ床端トリブチイックペプチドのアミノ酸組成が示される。アミノ末端ブロッキング基はアセチルと思われる。もし未処理のベータＥＣＧＦがトリプシンによシ開裂される力らば、Ｐｈ＊　Ａｓｎ　Ｌｅｕ・・・によシ始まるアルファではないベータＥＣＧＦに見い田される第二のアミノ酸配列が決定される。この配列は、又酸性線維芽細胞成長因子のアミノ末端で見い出される〔トーツス（Ｔｈｏｍａｓ　）　、Ｋ、　Ａ、ら「プロシ、ナツル、アカデ。

ＥＣＧＦのアミノ末端はＡａｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｍｏｏ・　であり（第３図、ライン暴）、そしてアミン末端を欠いたベータＥＣＧＦと同じである。第３図において、ラインＣ及びｄｔｉ、それぞれ臭化シアノゲン開裂ウシアルファ及びベータＥＣＧＦのアミノ酸配列の比較のために示す。

オリゴヌクレオチドのデザインのため、アルファＥＣＧＦアミノ酸１９〜２９に相当するアミノ酸配列１１ｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　が選ばれた。可能なコーディング配列のすべてを含むオリゴヌクレオチドの混合物をデザインするのよシも（遺伝コードの同義性のために）、長いユニークなオリゴヌクレオチドがデザインされた。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、複合ｅＤＮＡ（ジエイエ（Ｊａｙｓ　）ら「ヌクレイツク、アンズ、リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｅ　ＡｅｉｄｓＲｅａｅａｒｃｈ　）　Ｊ　１１　：　２３２５〜２３３５　（１９８３）　）及びゲノム〔ギチャー（Ｇｔｔａｃｈｉｅｒ　）ら「ネイチュア」リーニングするのに成功したプローブであることが既に示されている。３種の基準がＥＣＧＦプローブをデザインするのに用いられた。（１）ジヌクレオチドＣＧを避けた。

この戦略は真核ＤＮＡにおけるＣＧジヌクレオチドの観察された表示不足に基く〔ジョセ（Ｊｅｓｕｓ　）　Ｃ）　「Ｊ、バイオロ、ケム、」υ眠：８６４〜８７５（１９６１）：ｌ。（２）好ましいコドン利用データを可能な限シ用いた。

ヒトコドン利用の最近且包括的な分析はラテ（Ｌａｔｈｅ　）　ｒ　Ｊ、モル、バイオ口、　（Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　Ｊ　１８３　：　１〜１２（１９８５））に見い出された。（３）ＣＧジヌクレオチドの戦略及び好ましいコドン利用が情報価値がないときは、異常な塩基対を認めた。この戦略はｔＲＮＡアンチコドンとｍＲＮＡコドンとの間の相互作用中に生ずるＧ：Ｔ、Ｉ：Ｔ。

Ｉ：Ａ及びＩ：Ｃ塩基対の天然の発生に基く〔クリック（Ｇｒｉｃｋ）、ｒＪ、モル、バイオ口、Ｊ１９；５４８〜５５５（１９６６））。普通のそして異常な塩基対の図を第４図に示す。交雑グローブにおける工（イノシン）の使用は、オーツカ（０ｈｔｓｕｋａ　）らｒＪ、バイオロ、ケム、」幻す−；２６０５〜２６０８（１９８５）によシモデル実験において先ず立証された。ＥＣＧＦに関するヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするのに用いられるオリゴヌクレオチドのデザインで行われた全体の戦略及び選択を第５図に示す。さらに、同じ戦略によシデザインされた２種の他のオリゴヌクレオチドも構築された。

第５図に示された約３０ｐモルのオリゴヌクレオチドをマニアチスら、同上によシ本質的に記載されたｓ２ｐガンマＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとのインキュベーションによシ放射性ラベルをした。前述の如く作成したニトロセルロースフィルターを４２℃で６ＸＳＳＰＥ　（Ｉ　Ｘ　５ＳＰＥ＝０．１８Ｍ　ＮａＣｌ、　０．０１　ＭＮａ　ＨＰ　Ｏａ　ｐＨ７，２，０，００１Ｍ　ＥＤＴＡ　）、２Ｘデンハートの溶液（ＩＸデンハー）−０，０２１各フイコル（Ｆｉｅｏｌｌ　）　ｓ　ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミン）、５チ硫酸デキストラン、１００Ｐｆ／−変性サケ精子ＤＮＡ中で予備交雑した。”Ｐ　ｔラベルしたオリゴヌクレオチドを４時間の予備交雑後に加え、セして交雑を４２℃で１晩続けた。未交雑のプローブを３７℃で２Ｘ　５ＳＰＥ、０．１チＳＤＳの逐次の洗滌によシ除いた。

スクリーンされた１、５Ｘ１０６プラークから、２個のシグナルを示した。これらのクローンを、交雑プローブとして上記のオリゴヌクレオチドを用いる精製サイクルの繰返しによシ精製して均一なものとした。

単離された２個のクローン（ＥＣＧＦクローン１及び２９）をさらに詳しく分析した。ＥｃｏＲＩによる分解により、クローン１及び２９は、それぞれ２２及び０．３ｋｂのｃＤＮＡインサートを示した。クローンされｆｃｅＤＮＡのニック翻訳及びサザーンプロット分析（マニアチスら、同上）における放射性ラベルされたプローブとしてのその次の使用は、クローン１及び２９は関連のある重複したクローンであることを示した。これらの２個のクローンの重複性は、第６図に示される。

クローン１及び２９は、さらに詳しく以下の如く分析された。追加の２個のオリゴヌクレオチドが、ウシＥＣＧＦのアミノ酸配列に基いてデザインされた。これらのオリゴヌクレオチドは、クローン１及び２９を単離するのに用いられるオリゴヌクレオチドのデザインに用いられたのと同じ考え方に基いてデザインされた。これらのオリゴヌクレオチド（ＥＣＧＦオリゴヌクレオチド■及び■）は、第７図に示される。これらの２個のオリゴヌクレオチド及びオリゴ（ｄ　Ｔ　）１１は、前述の如きキネ−ジョン反応において放射性ラベルをされ、そしてサザーンブロツテイング実験において交雑グローブとして用いた。これらの実験の結果は、クローン２９のα３ｋｂｅＤＮＡインサートはＥＣＧＦオリゴヌクレオチドｌ及び■には交雑するがＥＣＧＦオリゴヌクレオチド■又はオリゴ（ｄ　Ｔ　）１ｍには交雑せず；クローン１のＺ２ｋｂｃＤＮＡインサートはオリゴヌクレオチドＩ、　ＩＩ、ＩＩＩそしてオリゴ（ｄ　Ｔ　）１ｍに交雑することを示した。これらのデータ並にクローン１及び２９０次のヌクレオチド配列決定は、クローン１の３′末端がポリ（Ａ）テールで終ることを示した。ウシＥＣＧＦの臭化シアノゲン開裂生成物に基（ＥＣＧＦオリゴヌクレオチド■に対するそしてオリゴ（ｄｔ）ｌｓに対するクローンｌの交雑は、このクローンが、大きな（ｌｋｂよシ大）３′側面配列と同じくアルファ及びベータの両方のＥＣＧＦに関するコーディング配列の残りを含むことを強く示唆していた。

クローン１及び２９からのｅＤＮＡインサートは単離され、Ｍ１３ｍｐ１８にサブクローンされそしてＥＣＧＦをエンコードする開放リーディングフレーム及び側面領域は、鎖成長停止法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）ら「ブロン。

ナツル、アカデ、サイ、ＵＳＡＪ７４：５４６３〜５４６７（１９７７）］によシ配列が示された。これらのクローンのヌクレオチド配列及び核酸配列から導かれたアミノ酸配列を第８図に示す。ヌクレオチド配列を調べるとヒトＥＣＧＦをエンコードする４６５個のヌクレオチドの開放リーディングフレームを明らかにする。ヒトＥＣＧＦの１５５個のアミノ酸が、翻訳停止コドンの側面に位置することが分った。ｅＤＮＡから導かれたヒトベータＥＣＧＦのＮＨ，末端アミノ酸はメチオニンであシ、それは翻訳開始残基として働くものと思われる。初めの１５〜２０個のアミノ末端基の比較的非疎水性とともに、これらのデータは、ヒトベータＥＣＧＦがＮＨ２末端シグナルペプチドなしに合成されることを強く示唆している。

第３及び８図の比較は、トリプシン開裂ウシベータＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸配列並にウシアルファＥＣＧＦのそれは、ラムダＥＣＧＦクローン１及び２９のヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配列と殆んど同じであることを示す。９５％以上の２種の間の全体の同一性が観察される。

ノーザンプロット分析（マニアチスら、同上）は、ＥＣＧＦｍＲＮＡが２８Ｓ７ＲＮＡとともに泳動する単一の分子であることを明らかにしている（第９図）。

２８８γＲＮＡの評価された大きさの変化を考えて、ＥＣＧＦｍＲＮＡの大体の大きさは４．８±１−４ｋｂである。アルファ及びベータの両方のＥＣＧＦの成熟した形をエンコードする配列のすべては、ＥＣＧＦクローン１及び２９（それはともに約２．３ｋｂを含む）内にエンコードされる。従って、これらのデータは、領域５′及び側面に位置するＥＣＧＦエンコーディング配列が極めて大きい（約２５±１．４ｋｂ）を立証する。

クローン１及びクローン２９からのｃＤＮＡインサートは、ＥｅｏＲＩによる分解によシ切除され、そしてＥｅｏＲＩ部位でｐＴＪＣ８でサブクローンされた。

クローン１から形成されたプラスミドは、ｐＤＨ１５と呼ばれ、そしてクローン２９から形成されたプラスミドＦｉｐＤＨ１４と呼ばれた。プラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２に寄託された。

クローン１からのプラスミドのｐＤＨ１５はＡＴＣＣ５３３３６とされ、クローン２９からのプラスミドのｐＤＨ１４はＡＴＣＣ５３３３５とされた。

従って、本実施例は、ヒト起源の他の蛋白を本質的に含まないヒト内皮細胞成長因子を提供する実験的な方法を記載している。

ＥＣＧＦは、培養中の内皮細胞の成長及び増殖に有用性がある。最近、細胞培養の用途のＥＣＧＦは、マシアグら〔［ブロシ、ナツル、アカデ、サイ、Ｊ７６：１１．５６７４〜５６７８　（１９７８））　のプロトコールによりウシの脳から抽出されている。この粗製ウシＥＣＧＦは、ヒトの脳静脈内皮細胞に対してミトグニックであシ［マシアグらｒＪ、バイオロ、ケム、Ｊ　２５７　；　５３３３〜５３３６　（１９８２）　］そして他のものからの内皮細胞についてもそうである。

ＥＣＧＦ及びフィブロネクチンマトリックスによるヘパリンの利用は、安定な内皮細胞クローンの成立を行わせる。生体外のミトゲンとしての使用に関するこの粗製ウシＥＣＧＦの推せんされる濃度は、成長培地１−当シ１５０ミクロタである。

組換えＤＮＡ誘導ヒ）ＥＣＧＦは、それ故、研究の目的でヒト内皮細胞及び他の間葉細胞の生体外の培養において、粗製のウシＥＣＧＦの改良された置換物としての用途を有する。ヒ）ＥＣＧＦは、両方の蛋白のアミノ酸配列における高度の同一性のために、内皮細胞の成長の相乗作用にウシＥＣＧＦと同じか又はそれよりも良いことが予想される。生体外の細胞の分化及び成長ｆｉ−増強する予想される有効な投与量の範囲は、培養培地１−当り５〜１０ｎ２の精製されたＥＣＧＦである。本明細書に示された如き組換えＤＮＡ技術を経るＥＣＧＦの生成及びバーシスら〔「Ｊ、バイオロ、ケム、Ｊ２６０：１１３８９〜１１３９２（１９８５））　により記載された如き次の精製は、ヒトのホメスタチス及びアンジオゲネシスのモデルを発展させるヒト起源の多量の精製生成物（従来任意の量又は純度で入手不可能）を提供するだろう。

組換えＤＮＡから導かれたヒ）ＥＣＧＦは、又組織培養フラスコ又は瓶よシも人工器管上の細胞の成長の増大に有用性があろうこの器管は、装置への内皮細胞の付着を助ける他の分子によりコーティングされていてもいなくてもよい。これらの促進分子は、細胞外マトリックス蛋白（例えばフィブロネクチン、ラミニン又はコラーゲンの一種）、ヒト血清アルブミン、ヘパリン又は他のグリコサミノグリカン又は不活性有機分子を含みうる。内皮細胞は、培地中で有効量のＥＣＧＦを用いてこれらの表面に培養され、最終的に内皮細胞の単層によシ器管をカバーする。この器管は、次に人工器管上に非トロンボゲン表面をもたらし、従って人工器管の植え込みにともなう潜在的に生命をおびやかすトロンボゲンの発生の危険を低下させる。

ＥＣＧＦＦｉ、診断の応用に有用性を有する。シュライ二重抗体イムノアッセイを一発した。このアッセイにおいて、９６大のポリ塩化ビニルプレートをウサギ抗ＥＣＧＦによシコートし、殊シの結合部位を次に１０チ正常ウサギ血消によジブロックした。ＥＣＧＦのサンプルを次に穴に加えそしてインキュベートした。

洗滌後ネズミモノクローナル抗ＥＣＧＦを加えた。インキュベーション及び三、四回の洗滌後、パーオキシダーゼとカップルされたウサギ抗マウスＩｇＧを加えた。反応生成物を、過酸化水素の存在下Ｏ−フ二二レしジアミンの転換後分光測光的に定量した。同様に考えられたイミノアッセイは、内皮細胞の成長に影響する疾患状態のヒトＥＣＧＦレベルをモニターするのに有用であろう。Ｂ製された組換えＤＮＡ誘導ＥＣＧＦは、未知のＥＣＧＦサンプルを定量する標準の試薬として有用であろう。

ＥＣＧＦは、又血管及び他の内皮細胞系構造の再生又は損傷の治療に可能性がある。

本発明は例示的な態様によシ限定されるものと考えられないことは理解されるべきである。本明細書に開示された発明の概念から陥れることなく、他の態様を作成することは可能である。このような態様は、当業者の能力の中にちる。

〔図面の簡単な説明〕

第１図に、ｅＤＮＡクローンを生成する酵素反応の一般的な方法を示し、第２図は、ラムダｇ　ｔｔｔにそう人されるＤＮ人フラグメントを含むライブラリーの生成を示し、第３図は、ウシのアルファ及びベータＥＣＧＦの部分的アミノ酸配列を示し、第４図は、水素結合された塩基対を示し、第５図は、ヒト内皮細胞成長因子のためのオリゴヌクレオチドのプローブのデザインを不し、第６図は、ヒトＥＣＧＦ　ｅＤＮＡクローン１及び２９の概略図を示し、第７図は、ヒトＥＣＧＦ　ｅＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドプローブとの間の同一性を示し、第８図は、ヒ）ＥＣＧＦの完全なｅＤＮＡ配列を示し、第９図は、ＥＣＧＦ　ｍＲＮＡのノーザン拳プロット分析を示す。

真ｐ責（ビ毎にシｊξなし）浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）プリゴＺクレズケ１゛フロｑ−７”のテ゛プ゛Ｉ”）３Ｘ６Ｘ４Ｘ２Ｘ４Ｘ４Ｘ４Ｘ２Ｘ４Ｘ２Ｘ２　璽　２．９５　Ｘ　１０５１　ｘ　２　ｘ　２　ｘ　ｌ　ｘ　４　ｘ　２　ｘ　４　ｘ　１　ｘ　４　ｘ　３　ｘ　１　ｍ　１．５４　ｘ　１０３浄書（内容に変更ｆ−Ｌン浄書（内存に変更なし＠シ１．Ｉ）　＠ｊ　ＩＪＷ　ｍ　ａ　＋、＋　９　−　＼　伽浄書（内容１こ変更なし国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）適当な宿主にヒト内皮細胞成長因子をエンコードするＤＮＡ配列を発現しうる複製可能な発現ペクターを提供し、該宿主を形質転換して組換え宿主が得られ、そして該内皮細胞成長因子をエンコードするｃＤＮＡ配列を発現しうる条件下に該組換え宿主を維持して内皮細胞成長因子を生成させることを含むヒト内皮細胞成長因子を生成する方法。
（２）該内皮細胞成長因子を回収する工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
（３）該発現ペクターがバクテリオフアージである請求の範囲第２項記載の方法。
（４）該バクテリオフアージがラムダｇｔ１０及びラムダｇｔ１１よりなる群の１員てある請求の範囲第３項記載の方法。
（５）該発現ペクターがプラスミドである請求の範囲第２項記載の方法。
（６）該プラスミドがｐＢＲ３２２から誘導される請求の範囲第５項記載の方法。
（７）該発現ペクターのコントロール機能がウイルス性物質により提供される請求の範囲第２項記載の方法。
（８）該ウィルス性物質がウシ乳頭腫ウィルス、エブスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ）ウイルス、アデノウイルス、シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０及びバツキロウイルス（ｂａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）よりなる群の１員である請求の範囲第７項記載の方法。
（９）請求の範囲第２項記載の方法により生成された内皮細胞成長因子。
（１０）自己複製組換えシステム中で内皮細胞生長因子を発現しうる複製可能な発現ペクター。
（１１）請求の範囲第１０項記載のペクターにより形質転換された自己複製組換えシステム。
（１２）該システムが細胞中にある請求の範囲第１１項記載の組換えシステム。
（１３）該システムが細胞のない請求の範囲第１１項記載の組換えシステム。
（１４）Ｅ・コリ（ｏｏｌｉ）、Ｂ・ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、昆虫、イースト及び脊椎動物の細胞よりなる群の１員を形質転換又は感染することにより得られる請求の範囲第１１項記載の組換えシステム。
（１５）真核生物を形質転換することにより得られる請求の範囲第１１項記載の組換えシステム。
（１６）該内皮細胞成長因子の回収が、組換え宿主システムにより発現された蛋白と、内皮細胞成長因子に特異的な少くとも１種の結合蛋白を含む試薬組成物との反応を含む請求の範囲第１項記載の方法。
（１７）ヒト起原の他の蛋白が実質的にないヒト内皮細胞成長因子。
（１８）内皮細胞成長因子のＮＨ２−末端アミノ酸から延在したポリペプチド配列を含む請求の範囲第１７項記載の内皮細胞成長因子。
（１９）ヒト内皮細胞成長因子に関する完全なコーティング配列を含むｃＤＮＡクローン。
（２０）内皮細胞因子ｍＲＮＡにより規定されるヒト内皮細胞成長因子のコーティング配列に対して５′及び３′に位置する未翻訳のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクローン。
（２１）許容しうる起体との混合物中で傷のなおりを促進する、治療上有効量のヒト内皮細胞成長因子を含む組成物。