DK175795B1 - Rekombinant eller syntetisk DNA-sekvens, der koder for et FGF-protein, vektor, der indeholder DNA-sekvensen og en rekombinant værtscelle, der indeholder DNA-sekvensen eller vektoren - Google Patents

Description

1 DK 175795 B1 »

Opfindelsen angår DNA-sekvenser, som koder for fibroblast-vækstfaktorer (FGF) samt rekombinant-vektor, som indeholder DNA-sekvensen og rekombinant værtscelle transformeret med DNA-sekvensen.

5 Helingsprocessen efter at væv har været udsat for læsion, såsom sår eller forbrænding, er meget kompleks, men den vides at blive medieret af et antal proteinfaktorer. Disse faktorer er væsentlige for vækst og differentiering af de celler, som tjener til erstatning af det ødelagte væv. Der er 10 blevet identificeret et antal kandidatfaktorer på basis af forskellige vævsekstrakters evne, såsom fra hjerne, hypofyse og hypothalamus, til at stimulere mitosen af dyrkede cellelinier. De aktive faktorer i disse ekstrakter er blevet navngivet med talrige forkortede navne, herunder blodpladeafledt 15 vækstfaktor (PDGF), makrophagafledt vækstfaktor (MDGF), epi-dermalvækstfaktor (EFG), tumorangiogenesefaktor (TAF), en-dothelcellevækstfaktor (ECGF), fibroblastvækstfaktor (FGF), hypothalamusafledt vækstfaktor (HDGF), nethindeafledt vækstfaktor (RDGF) og heparinbindingsvækstfaktor (HGF). (Se f.eks.

20 Hunt, T.K., Trauma (1984) 2£:S39-S49, Lobb, R.R., et al., ' Biochemistry (1984) 23: 6295-6299).

Folkman, J. , et al.. Science (1983) 221:719-725, har rapporteret, at en af de processer, som er involveret i sårheling, nemlig dannelsen af blodkar, påvirkes indgående i 25 tumorer af heparin. Af denne og andre undersøgelser fremgår det, at heparin binder specifikt til det protein(er), som er forbundet med et antal af disse vækstfaktoraktiviteter, og derfor er heparin blevet anvendt som et oprensningsværktøj.

Det har vist sig, at affiniteten af vækstfaktorer for héparin 30 ikke afhænger af den samlede ionladning, idet både positivt og negativt ladede faktorer bindes (Maciag, T., et al.. Science (1984) 225:932-935, Shing, Y. , et al., Science (1984) 223:1296-1299, Klagsbrun, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) (1985) £2:805-809)- Evnen til at binde eller ikke binde 35 til heparin er et mål for differentiering mellem aktiviteter i forskellige ekstrakter. F.eks. binder EGF og PDGF ikke stærkt til heparin. Faktisk binder EGF overhovedet ikke til

Η 1 I

I I DK 175795 B1 I

I I

heparin. De andre ovennævnte faktorer udviser stærk heparin- I

binding. Det menes imidlertid, at den sure hjerne-FGF, ECGF, I

B RDGF og HGF-α faktisk er den samme faktor. Det menes ligele- B

des, at hypofyse-FGF, kationisk hjerne-FGF, TAF og HGF-β er B

5 det samme protein (Lobb, R.R., et al. (se ovenfor)). En over- I

sigt og sammenligning af 13 endothel vækst faktorer, som er I

blevet oprenset ved anvendelse af heparinaffinitet, er be- B

I I skrevet af Lobb, R., et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:1924- I

I 1928. I

10 Onder anvendelse af heparinaffinitetskromatografi B

er basiske fibroblastvækstfaktorer, som udviser en potent mi- B

togenaktivitet over for kapillær endothel, blevet isoleret B

fra rottechondrosarcom (Shing, Y. , et al., se ovenfor) og fra B

B kvægbrusk (Sullivan, R., et al., J, Biol. Chem. . (1985) B

I 15 260:2399-2403). Thomas, K.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci I

I (USA) (1984) 81:357-361, beskrivelsen til US patent nr. I

B 4444760, har oprenset to heterogene former af en sur kvæg- B

hjernefibroblastvækstfaktor med molekylvægte på 16600 og B

16800 dalton. Gospodarowicz og medarbejdere har påvist til- B

20 stedeværelsen af basiske fibroblastvækstfaktoraktiviteter i B

både kvæghjerner og hypofyser og oprenset disse proteiner un- I

der anvendelse af heparinaffinitetskromatografi sammen med fl andre oprensningsfremgangsmåder (Bohlen, P., et al., fl I Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) £1:5364-5368, Gospodaro- fl 25 wicz, D. , et al. (samme sted) 6963-6967). Disse faktorer har fl

også molekylvægte på ca. 16 kD ligesom en lignende faktor, I

der isoleres fra humanplacenta (Gospodarowicz, D., et al., fl I Biochem. Biophys. Res. Comm. (1985) 128:554-562). fl fl Bohlen et al rapporterede også om isoleringen af fl fl 30 basisk hjerne-FGF fra menneskehj.erne og en delvis karakteri- fl fl sering, herunder en delvis amino-terminal aminosyresekvens fl

I (FEBS Letters, 1985, Vol. 85, side 177-185). I

B Den fuldstændige sekvens for basisk FGF, der hidrø- fl

B rer kvæghypofyser, er blevet fastlagt (Esch, F., et al., B

I 35 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:6507-6511). Der blev B

B opnået homogene præparationer, og de udviste potent mitoge- B

3 DK 175795 B1 naktivitet i in vitro analyser med endothelceller (basisk FGF har en ED50 på 60 pg/ml).

Sur FGF har en ED^q på ca. 6000 pg/ml. En N-terminalsekvens af sur FGF, der stammer fra kvæghjernevæv, er 5 fastlagt af Bohlen, P., et al., EMBQ J. (1985) 4:1951-1956. Gimenez-Gallego, G., et al., har fastlagt den N-terminale sekvens for både sur og basisk FGF fremstillet fra humanhjerne og sammenlignet dem med kvægsekvenserne hos kvæg (Bio-chem. Biophys. Res. Comm. (1986) 135:541-548). Deres resulta-10 ter er i overensstemmelse med dem ifølge nærværende beskrivelse. Den fuldstændige aminosyresekvens for kvæghjerneaf-ledt, sur FGF er også blevet bestemt ud fra det isolerede protein (Gimenez-Gallego, G., et al. Science (1985) 230:1385-1388, Esch, F. , et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1985) 15 133:554-562). Disse to bestemmelser er i overensstemmelse med undtagelse af én enkelt aminosyre. Efter udførelse af en stor del af det foreliggende arbejde er den fuldstændige aminosyresekvens for sur human-FGF blevet fastlagt ud fra genet (Jaye, M., et al., under trykning).

20 De ovenfor beskrevne FGF-proteiner og andre vækst faktorer er tydeligt nok virkningsfulde til fremme af helingen af væv, som er blevet udsat for en læsion (se f.eks.

Sporn, M.B., et al-, Science (1983) 219:1329-1331, Davidson, J.M., et al., J. C. B. (1985) 100:1219-1227, Thomas, K.A., et 25 al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:6409-6413). Davidson, et al., (se ovenfor) har især beskrevet FGF1 s virkning ved sårheling. De naturlige basiske FGF-proteiner er blevet påstået at være anvendelige ved behandling af myokar-dieinfarkt (Svet-Moldavsky, G.J., et al., Lancet (23. april j 30 1977) 913, beskrivelserne til US patent nr. 4296100 og nr.

4378347) . Ydermere har basisk human-FGF vist sig at øge neuronoverlevelsen og neuritforlængelsen i føtale hippocampale rotteneuroner (Walicke, P., et al., Proc. Natl. Sci. (USA) (1986) 83:3012-3016), hvilket indicerer, at denne faktor må- 35 ske også kan være anvendelig ved behandling af degenerative

DK 175795 B1 I

neurologiske sygdomme, såsom Alzheimers sygdom og Parkinsons H

sygdom. H

Det vil derfor være ønskeligt at sikre rådighed I

over disse FGF-proteiner i store mængder og i en form, som er I

5 fri for toksiske eller infektiøse urenheder. Der foretrækkes H

humanformen af dette protein, og det er måske påkrævet ved H

terapeutisk anvendelse. Tydeligvis kan praktisk anvendelighed H

ikke opnås ud fra naturlige humankilder, idet opnåelse af en I

ren præparation involverer en oprensning på ca. 35.000 gange. I

10 Selv hvis menneskekadavere ellers var en praktisk kilde, I

ville fuldstændig oprensning være afgørende på grund af mu- I

ligheden for overførelse af AIDS, hepatitis eller anden syg- I

dom. Nylige forsøg med Creutzfeld-Jacob syndrom (Powell- I

Jackson et al., Lancet (1985) i_i :244-246) udelukker an- H

15 vendelse af humanhypofyser som kilde. Derfor er rekombinant- H

fremgangsmåder særlig egnede til anvendelse ved produktion af H

disse proteiner. Ifølge opfindelsen tilvejebringes der midler I

hvorved basisk FGF kan opnås i praktiske mængder og i ren H

ukontamineret form. H

20 Ifølge opfindelsen tilvejebringes der redskaber til H

syntese og manipulation af fibroblastvækstfaktorer, som er H

anvendelige til fremkaldelse af accelereret heling af sår, H

knoglebrud, forbrændt væv, skadet myokardiavæv, degenereret H

nervevæv og andre traumer. Der tilvejebringes kloning og eks- H

25 pression af de gener, som koder for disse faktorer. H

I et aspekt angår opfindelsen isolerede og klonede H

rekombinante eller syntetiske DNA-sekvenser, som koder for et H

FGF-protein, der omfatter aminosyresekvensen, der er nummere- I

ret som 16-146 i figur 4. Disse indbefatter navnlig human- H

30 eller kvæggenomsekvenser. I et yderligere aspekt angår opfin- I

delsen en DNA-sekvens, der koder for human basisk FGF og H

hvilken kan opnås ved screening af et eller flere DNA- I

biblioteker for en sekvens der hybridiserer, i en præhybridi- I

serings/hybridiseringspuffer der indeholder 40% formamid, 5 I

35 mM natriumphosphat, 5x Denhardts opløsning (0,1% kvægserutnal- I

bumin, 0,1% polyvinylpyrolidon; 0,1% Ficoll) , 5x SSC (0,75 Μ I

5 DK 175795 B1

NaCl, 0,075 M Na-citratj , 50 μ9/π\1 sildesperm-DNA, hvor hy- bridiseringspufferen også omfatter 10% dextransulfat ved pH 6,5, til det 1,4 kb basiske fragment, der koder for kvæg-FGF opnået ved EcoRl fordøjelse af . λΒΒ2 (deponeret som ATCC 5 40196), og isolering af den hybridiserede sekvens. I andre aspekter angår opfindelsen rekombinant-vektorer, som bærer disse DNA-sekvenser, værtsceller, der er transformeret med disse vektorer, og som huser disse DNA-sekvenser.

10 Kort beskrivelse af tegningerne

Figurerne 1-4 viser de kodende DNA-sekvenser og de afledte aminosyresekvenser for sur bFGF, sur hFGF, basisk bFGF og basisk hFGF. Figur la viser den delvise sekvens af sur kvæg-FGF. Figur lb viser den fuldstændige aminosyrese- 15 kvens af dette protein. Figurerne 2a, 2b og 2c viser nukleo-tidsekvensen og den afledte aminosyresekvens, som svarer til de tre exoner af sur human-FGF-gen, som er indeholdt i λ pha-gen, XHAG-9.1, kHG-3 henholdsvis kKAG-3. Figur 2d viser den fuldstændige aminosyresekvens og den cDNA-sekvens som koder 20 for sur human-FGF, som beskrevet af Jaye et al.

Figur 3 viser nukleotid- og aminosyresekvensen for basisk kvæg-FGF

Figur 4 viser nukleotid- og aminosyresekvensen for basisk human-FGF.

25 Figur 5 viser oligonukleotidproberne 889/890, 891 og 853-856, som er konstrueret ud fra den N-terminale sekvens af sur bFGF.

Figur 6 viser restriktionskort af indføjelserne for de genome sure bFGF-kloner λΒΑ2 og λΒΑ3 .

30 Figur 7 viser DNA-sekvensen af sur kvæg-FGF-genome proben 250/AluI.

Figur 8 viser de basiske FGF-prober 1097/1098 og dele af aminosyre- og nukleotidsekvensen af sur kvæg-FGF og basisk kvæg-FGF.

35 Figur 9 viser et restriktionskort for den basiske bFGF cDNA-klon λΒΒ2.

I DK 175795 B1 I

i 6 I

Figur 10 viser resultaterne af kortvarig ekspressi- H

on af basisk hFGF i CV-1 celler. I

Figur 11 viser et kort over det gen, som koder for H

basisk human-FGF. H

I I

Fremgangsmåde til udøvelse af opfindelsen H

Η A. Fibroblastvækstfaktorer H

I To forskellige kvæg- (og analoge human-) fi- H

10 broblastvækstfaktorer er blevet oprenset til ensartethed af H

I andre og delvis eller fuldstændig sekvenseret. Begge faktorer H

besidder raitogenaktivitet i in vitro analyser under anvendel- H

se af dyrkede celler, såsom kvæghjerne- og binyrebarkafledte H

H

H kapillærendothelceller, human-navleveneendothelceller, kvæg- H

15 binyrebarkceller, granulosaceller og celler fra glatte kar- H

muskler. Der er blevet beskrevet in vitro analyser med benyt- H

I telse af disse cellekulturer af Gospodarowicz, D., et al., H

I J. Cell Physiol. (1985) 122:323-332, og af Gospodarowicz, D., I

I et al., J. Cell Biol. (1983) £7:1677-1685. For nylig er der I

20 blevet beskrevet alternative in vitro analyser af Esch et H

I al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:6507-6511, og af I

Gospodarowicz, D. , et al., J. Cell Physiol. (1986) 127:121- Η

Η 13 6. Oprenset basisk bFGF har vist sig at være angiogent I

in vivo i en chorioallantoiskyllingemembrananalyse. (Gospoda- H

25 rowic2, D., i Hormonal Proteins and Peptides XII:205-230 I

(Academic Press) . Oprenset sur bFGF har vist sig at være an- . H

giogen in vivo i samme analyse (Thomas, K.A., et al.,

I Proc. Natl. Acad. Sci. (se ovenfor). I

Basisk kvæghypofyse-FGF er blevet fuldstændigt se- H

30 kvenseret og er vist i figur 3. Human-sekvensen, som er fast- H

lagt ifølge nærværende beskrivelse, fra genom- og cDNA er I

vist i figur 4. De primære sekvenser indeholder 146 aminosy- ! I

H rer og begynder med prolinenhederne, der er nummereret som I

"1" i figurerne, og er i overensstemmelse med den sekvens, I

35 der er rapporteret for N-terminus af naturligt kvægprotein af

Giminez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (se I

» 7 DK 175795 B1 ovenfor) og med den sekvens, som er rapporteret for hele det naturlige protein af Esch, Proc. Natl. Acad. Sci. (se ovenfor) . Der er blevet beskrevet et basisk human-FGF med højere molekylvægt fra human-hepatomacellelinie, SK-Hep-1, af Sulli-5 van, R.J., et al., J. Cell Biol. (1985) 101:108a, og af

Klagsbrun, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. . (USA) (1986) £3.:2448-2452. Translation af opstrømssekvenserne ifølge figurerne 3 og 4 tilbage til en ATG-s tart codon i både human- og kvæg-DNA viser, at det er sandsynligt, at der også produceres 10 en yderligere form af hvert protein, som indeholder aminosy- rerne opstrøms det prolin, der er vist som enhed l i figurerne 3 og 4. Der er ni opstrøms codoner i DNA'erne indbefattende ATG. Det er rimelig sikkert, at methioninen, som kodes af ATG, vil blive bearbejdet når genet udtrykkes i eukaryote sy-15 stemer. En sådan bearbejdning kan eller kan ikke foregå når genet udtrykkes rekombinant i bakteriesystemer. Den lange form af proteinet indeholder således en yderligere pro-sekvens på 8 aminosyrer eller et total på 154 aminosyrer. Det er også blevet vist, at dette forlængede FGF, når det isole-20 res fra SK-HEP-l-celler, er blokeret ved N-terminus (Klags brun, M., et al., (se ovenfor)).

De proteiner, som udviser FGF-aktivitet i ovennævnte in vitro analyser og deler en lignende formodet N-j terminalsekvens med den basiske kvæghypofyse-FGF, der er vist i 25 i figur 3 (formen med 146 aminosyrer) , er også blevet isole ret fra kvæghjerne, binyrer, corpus luteum, nethinde, nyrer og fra humanplacenta. Det naturlige protein, som opnås fra visse af disse væv, er heterogent - en anden form, der mangler den formodede N-terminaldel på 15 aminosyrer, bibeholder 30 aktiviteten. (Gospodarowicz, D., Meth. Enz. (1986) under trykning). Det menes derfor, at basiske kvæg- og human-FGF'er eksisterer i tre former nemlig de, der er anført som modne former i figurerne 3 og 4, længere former, der indeholder 8 yderligere aminosyrer ved N-terminus, og kortere former, som 35 mangler 15 aminosyrer af de viste formodede modne sekvenser.

Det menes således at være naturligt produceret "lang" basisk

DK 175795 B1 I

FGF indeholdende 154 aminosyrer, "primær" basisk FGF indehol- I

dende 146 aminosyrer og "kort" basisk FGF indeholdende 131 I

aminosyrer. Disse FGF'er benævnes "basisk" FGF, idet de inde- I

holder et stort antal basiske aminosyreenheder (lysin, argi- I

5 nin, histidin), og de er derfor kationer ved neutralt pH. I

Et protein defineres ifølge nærværende beskrivelse I

som basisk FGF, hvis det udviser FGF-aktivitet i ovennævnte I

analyser, binder til heparin, er en kation ved neutralt pH og I

reagerer immunologisk med antistoffer, der er fremstillet un- I

10 der anvendelse af en syntetisk analog af den aminoterminale I

sekvens [tyr·1·0] FGF (1-10) konjugeret til kvægse rumalbumin I

(om nødvendigt) eller til andre antistoffer, der er frembragt I

mod kvæg (eller human) -FGF eller syntetiske eller naturlige I

peptider heraf. Se Baird, A., et al., Regulatory Peptides I

15 (1985) 10:309-317. I

Andre har isoleret sur FGF fra kvæghjerne, og de

første 34 aminosyreenheder er blevet fastlagt. Kloning heri I

af gener for sur kvæg- og human-FGF har tilladt afledning af I

aminosyresekvenser ud over 1-34 for sur bFGF, som vist i fi- I

20 gur la, og der er blevet opnået en delvis sekvens for sur I

hFGF, som vist i figur 2a. Efter meget af det arbejde, som er I

beskrevet nedenfor, blev den fuldstændige aminosyresekens for I

sur bFGF beskrevet af Esch, et al., Bio- I

chem. Biophys. Res. Comm. (se ovenfor) og af Gimenez-Gallego, I

25 G., et al.. Science (se ovenfor), som den er vist i figur lb. I

Efter meget af det foreliggende arbejde er den fuldstændige I

kodesekvens for sur hFGF også blevet fastlagt af Maciag- I

gruppen, som den er vist i figur 2b. I

Det sure protein har også to kendte aktive former I

30 en med en sekvens på 140 aminosyrer, som begynder ved pheny- I

lalaninenheden, der er nummereret "1" i figurerne, og en an- I

den kortere form, som svarer til aminosyrerne 7-140. Både I

kvæg- og human-proteiner kan også forekomme i N- I

terminalforlængede former. Translation af DNA opstrøms codo- I

35 nen for aminosyren, der er nummereret som "1" i figurerne ί I

(tilbage til ATG startcodonen ved -15, som er vist i paren- I

i 9 DK 175795 B1 tes), repræsenterer den yderligere sekvens af det forlængede protein. Som det er tilfældet med basisk FGF, bliver det N-terminale methionin næsten sikkert bearbejdet af i eukaryote ekspressionsværter, selv om det ikke bliver det, hvis genet i 5 udtrykkes i bakterier. Derfor kan det naturlige sure protein ligesom det basiske FGF, der er beskrevet ovenfor, eksistere i tre aktive former: en afkortet, dvs. "kort" sur FGF indeholdende 134 aminosyrer, en N-terminalforlænger, dvs. "lang" form indeholdende 154 aminosyrer, og den anden "primær" sur 10 FGF indeholdende 140 aminosyrer, som begynder ved den enhed, der er nummereret som "1" i figurerne. Det er blevet vist af Burgess, W.H., et al., (under trykning), at den lange kvæg-hjerneform blokeres af en acetylenhed. Disse proteiner indeholder et uforholdsmæssigt antal sure aminosyreenheder, dvs.

15 glutamin- og asparaginsyrer, og proteinerne er derfor anioner ved neutral pH.

Et protein defineres ifølge nærværende beskrivelse som sur FGF, hvis det udviser FGF-aktivitet i in vitro analyser, binder til heparin, er en anion ved neutralt pH og er 20 immunologisk reaktiv med antistoffer, der er fremstillet mod sur human- eller kvæg-FGF eller mod syntetiske eller naturlige peptider heraf.

Sur FGF og basisk FGF anvendes således i nærværende beskrivelse til at betegne ovennævnte proteiner eller protei-25 ner med de aminosyresekvenser, der er repræsenteret af de, som er vist i figurerne 1-4. Selvfølgelig er disse definitioner ikke begrænset til de viste specifikke sekvenser, men indbefatter proteiner, som indeholder tilfældige eller bevidste inducerede forandringer, såsom deletioner, additioner el-30 ler udskiftning af aminosyreenheder, så længe den biologiske aktivitet, som måles ved ovennævnte in vitro og immunologiske analyser, og respektive anionisk eller kationisk egenskab ved neutral pH ikke ændres. Selvfølgelig kan modificerede former besidde svagt ændret kvantitativ aktivitet og specificitet.

35 Udtrykket "oprenset" eller "ren" refererer til et materiale, som er fri for stoffer, der normalt ledsager det, Η

I DK 175795 B1 I

I 10 I

li I

når det findes i dets naturlige tilstand. "Ren" sur hFGF re- I

I fererer således f.eks. til sur hFGF, som ikke indeholder ma- I

I terialer, der normalt er forbundet med dets in situ omgivelse I

i humanhjerne eller -hypofyse. I

5 Udtrykket "operabelt forbundet" refererer til en I

sammenstilling, hvor komponenterne er konfigureret således, I

at de udfører deres almindelige funktion. Styresekvenser el- I

I ler promotorer, som er operabelt forbundet til en kodese- I

kvens, er således i stand til at bevirke ekspression af kode- I

I 10 sekvensen. I

I Udtrykket "styresekvens" refererer til en DNA- I

sekvens eller sekvenser, som, når de ligeres passende til den I

H ønskede kodesekvens, er i stand til at bevirke dets ekspres- I

I sion i værter, der er kompatible med disse sekvenser. Disse ;

I 15 styresekvenser indfatter mindst promotorer i både prokaryote I

I og eukaryote værter og evt. transkritionstermineringssigna- I

H ler. Der kan også identificeres yderligere faktorer, som er fl

nødvendige eller hjælper til ved bevirkning af ekspression. I

Som det anvendes i nærværende beskrivelse refererer udtrykket I

20 "styresekvenser" simpelthen til en hvilken som helst DNA- H

sekvens, som kræves for at bevirke ekspression i den bestemte I

anvendte vært. M

I i Udtrykkene "celler" eller "cellekulturer" eller I

I j "rekombinante værtsceller" eller "værtsceller" anvendes ens- I

| 25 betydende, som det vil fremgå af beskrivelse. Disse udtryk I

H | indbefatter den umiddelbare subjektcelle og selvfølgelig den- I

nes afkom. Det skal forstås, at ikke al afkom er fuldstændig I

identisk med modercellen på grund af tilfældige mutationer I

eller forskelle i omgivelserne. Et sådant ændret afkom er

30 imidlertid indbefattet af disse udtryk, så længe afkommet bi- I

beholder de egenskaber, som vedrører de, der er tildelt den I

oprindeligt transformerede celle. I det foreliggende tilfælde I

kan en sådan egenskab f.eks. være evnen til at producere re- I

H kombinant-FGF. I

I 35 I

11 DK 175795 B1 B. Generel beskrivelse

Anvendelse og indgivelse

ifølge opfindelsen tilvejebringes der DNA-5 sekvenser, som koder for vækstfaktorproteiner, der er anvendelige ved fremme af sårheling, og som yderligere kan tilføres i tilstrækkelig rene mængder til at tillade udformning af inhibitorer, som er specifikke for disse. De oprensede væksthormonfaktorer påføres almindeligvis topikalt til det lædere-10 de væv for at stimulere vaskularisering og heling. Passende I

substrater er forbrændinger, sår, knoglebrud, kirurgiske afskrabninger, såsom de fra plastikkirurgi, eller andet, som kræver heling. Fordi anvendelse af disse faktorer fremmer helingen, reducerer de også muligheden for infektion.

15 Angivelser, hvor FGF er af værdi ved fremme af neo- vaskularisering, indbefatter skeletmuskelforhold, såsom knoglebrud, ledbånd og senereparation, tendonitis og bursitis, hudforhold, såsom forbrændinger, sår, flænger, liggesår og langsomt helende ulcus, såsom de, der ses hos diabetikere, og 20 ved vævsreparationer under ischia og myokardieinfarkt.

Formulationer af de rekombinant fremstillede vækstfaktorer under anvendelse af tilgængelige excipientser og bærerer fremstilles i overensstemmelse med standardfremgangsmå- i der, som er kendt af fagfolk inden for området. Proteinerne 25 kan formuleres som lotions, geler, som del af et kontrolleret frigørelsessystem, eller salver med yderligere aktive bestanddele, såsom antibiotika, hvis det.ønskes.

Til topikal anvendelse, som er den mest passende med hensyn til overfladelæsioner, benyttes standard topikale-30 formulationer under anvendelse af f.eks. 0,1-10% opløsninger.

Disse opløsninger vil blive påført 3 til 6 gange daglig på det påvirkede område. Koncentrationen af salven eller anden formulation afhænger selvfølgelig af sværheden af såret og personens natur. I de fleste protokoller nedsættes dosis med 35 tiden for at nedsætte muligheden for ar. F.eks. behandles de mest svære sår, såsom trediegradsforbrændinger, almindeligvis i

I DK 175795 B1 I

I 12 I

med en 10 % sammensætning, men når helingen begynder nedsæt- I

H tes dosis progressivt til ca. 0,1 % eller lavere som såret I

heler. En topikal-formulation af EGF under anvendelse af BSA I

som bærer er beskrevet af Franklin, J.D., et al., Pia- I

I 5 Stic and Reconstruct Surq. (1979) £4:766-770. I

Til reparation af knogler og væv er indgivelsen I

H fortrinsvis lokal, men ved hjælp af subkutan implantering el- I

ler formulation med langsom frigørelse, som er implanteret I

direkte proximal målet. Der kan kræves operation til forhold I

10 såsom knogleskader, hvilket således gør implantering direkte I

praktisk. Former med langsom frigørelse kan formuleres i po- I

H lymerer, såsom Hydron (Langer, R. , et al., Nature (1976) I

263:797-799) eller Elvax 40P (Dupont) (Murray, J.B., et al., I

In Vitro (1983) 3^:743-747). Andre systemer med længerevaren- I

H 15 de frigørelse er blevet foreslået af Hsieh, D.S.T., et al I

J. Pharm. Sci (1983) 72:17-22), og en formulation specielt I

for epidermalvækstfaktor, men som ikke foretrækkes i nærvæ- I

rende opfindelse, er blevet foreslået af Buckley, A., I

H Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 132:7340-7344. I

20 Som ved topikal indgivelse til længerevarende fri- I

gørelse afhænger koncentrationen af FGF i formulationen af et I

antal faktorer indbefattende tilstandens alvorlighed og ha- I

H stigheden af FGF-frigørelse fra polymeren. Almindeligvis kon- I

strueres formulationerne til opnåelse af en konstant lokal I

25 koncentration på ca. 100 gange serumhormonniveauet eller 10 I

H gange vævskoncentrationen, som beskrevet af Buckley et al I

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (se ovenfor)) . På basis af en I

FGF-koncentration i vævet på fra 5 til 50 ng/g vådvægt (sam- I

menlignelig med EGF ved 60 ng/g vådvægt) accepteres en fri- I

H 30 gørelse på fra 50 til 5000 ng FGF per time. Den initielle I

H koncentration afhænger selvfølgelig af hvor alvorligt såret I

I

H Det forventes, at FGF kan virke samvirkende og end- I

H og synergistisk med andre vækstfaktorer, såsom epidermal I

35 vækstfaktor (EGF), de transformerende vækstfaktorer (TGF- I

eller TGF- ) , insulinlignende vækstfaktorer (IGF-1 og IGF-2) I

I 13 « DK 175795 B1 og/eller den blodpladeafledte vækstfaktor (PDGF). Den kan ydermere især ved knogleheling virke synergistisk med antagonister af parathyroidhormon, idet parathyroidhormon fremmer L knogleresorption. Der er derfor også med kompositionerne og 5 indgivelsesprotokollerne indbefattet udførselsformer, hvor FGF indgives i samme komposition som eller i samme protokol som én eller flere af ovennævnte faktorer, og således er mere virkningsfuld ved opnåelse af den ønskede vævsheling.

Idet FGF er virkningsfuld ved fremme af neuritfrem-; 10 vækst, nerveregenerering og neuronal overlevelse, er det an vendelig til behandling af visse neurologiske sygdomme, såsom Alzheimers og Parksinsons syge, amyotropisk lateralsklerose og almindelig ældning af nervesystemet, såvel som traumatisk kvæstelse af rygmarven og periferinerver.

15 Indgivelse af medikamentet til disse indikationer gøres fortrinsvis ved implantering i formulationer svarende til de, som er beskrevet ovenfor i forbindelse med sårheling. Medikamentet kan også afgives ved hjælp af implanterede cellekulturer som i transplantationsterapi ved at behandle kul-20 turerne før transplantering med FGF-præparationerne. Ydermere kan FGF injiceres direkte i spinalvæsken eller kan påføres systemisk. Systemiske formulationer er almindelig kendt inden for fagområdet og indbefatter formulation i puffer eller fysiologisk saltopløsning eller andre passende excipienser. Do-25 sisniveauerne svarer til de ved sårheling. Ved vævskultur eller eksplantationsopretholdelse kan det imidlertid tilføres som 0,1-10 ng/ml serum eller dyrkningsmedium.

FGF-proteiner er særlig anvendelige også til biståelse af gendannelse og heling af væv, der traumatiseres 30 under operation. Til denne anvendelse kan det være nyttigt åt indstøbe FGF-proteinerne i polymerer, som anvendes som operationsstifter. Proteinerne er således i stand til biologisk supplering af den mekaniske sutur, som bevirkes af stifterne, og til at forstærke og støtte den "naturlige" helingsproces i 35 de reparerede væv.

Μ

I DK 175795 B1 I

I I

Det har ydermere vist sig, at angiogent stimuli, I

såsom de der tilvejebringes af de omtalte PGF-proteiner, re- I

suiterer i frigørelse af vævsplaminogenaktivator (tPA) og I

kollagenase in vitro (Gross, J.L., et al., I

I 5 Proc.'Watl. Acad. Sci. USA (1983) 80:2623-2627). FGF- I

proteinerne er derfor anvendelige ved behandling af forhold,

som reagerer over for disse enzymer. Medens det i akutte si- I

tuationer kan være nødvendigt, (såsom tilstedeværelse af en I

blodprop forbundet med slagtilfælde eller hjerteanfald) at I

10 indgive store doser tPA direkte for at opløse kroppen, kan I

indgivelse af FGF til opretholdelse af passende tPA-niveauer

H i blodstrømmen være ønskelige ved behandling af kronisk ten- H

H dens til dannelse af embolia. Til denne angivelse foretrækkes I

der derfor systemisk indgivelse af medikamentet under anven- I

15 delse af traditionelle midler, såsom intramuskulær eller in- I

travenøs injektion. H

Der tilvejebringes praktiske mængder af rene FGF- I

vækstfaktorer til anvendelse i forbindelse med ovennævnte an- I

H givelser. Basiske faktorer forventes at forekomme i lange, I

20 primære og korte former, som beskrevet i nærværende beskri- I

H velse. Det forventes, at den N-terminale methionin af de lan- I

ge former bearbejdes af, når proteinet produceres i eukaryote I

systemer, og at den efterfølgende aminosyrerest derivatise- I

H res, muligvis ved acetylering efter translationen. I

25 Idet FGF i dets forskellige former ikke har en gen- I

H kendelig signalsekvens, må den på en eller anden måde blive ' I

H secerneret, idet den virker uden for de celler, som produce- I

rer den ved en membranbunden receptor. Idet den muligvis ikke I

H secerneres ved den kendte konstitutive secerneringsvej, udfø-

30 res dens secernering derfor på andre måder, såsom ved celle- I

lyse eller ved exocytose. For de fleste væv, hvorfra FGF er I

naturlig afledt, og for mange pattedyrsekspressionssystemer I

H kan en sådan frigørelse opnås ved at sikre exocytose med en I

calciumionophor, såsom den almindelig benyttede A23187 (Cal- I

35 Biochem), som under in vitro forhold sættes til dyrk- I

ningsmediummet ved 1-10 M i nærværelse af 1 mM CaCl2 · For I

15 DK 175795 B1 ekspressionssystemer, der hidrører fra makrophager eller tno-nocyter, har andre aktiveringsmetoder vist sig at være virkningsfulde, såsom tilsætning af lipopolysaccharid (LPS) ved 10 g/ml eller tilsætning af E. coli endotoxin (Difco) (300 5 ng/ml). Disse stimulatorer har vist sig at frigøre den analoge faktor interleukin-1 fra makrophager, som beskrevet af March, C.J., et al., Nature (1985) 315:641-647. Disse teknikker kan også benyttes ved frigørelse af rekombinant fremstillede FGF-proteiner, når de produceres intracellulært uden 10 tilføjede signalsekvenser, som beskrevet nedenfor. Yderligere stimulatorer til frigørelse af intracellulært producerede proteiner indbefatter phorbolestere og triglycerider.

Gen-generhvervelse 15 Den generelle strategi hvorved de illustrerede FGF-

kodende sekvenser opnås er som følger. Den kendte N-terminale sekvens af sur kvæg-FGF anvendes til udformning af en serie prober til anvendelse med et genomisk kvægbibliotek, der er ligeret i en phag. Phagrekombinanter som hybridiserer til 20 proberne isoleres fra biblioteket og fordøjes til' mindre fragmenter, som er egnede til kloning i M13 kloningsvektorer, for på den måde at opnå en "naturlig" probe. Dette resulterede i en M13 probe indeholdende en 250 bp sekvens, som svarer til en del af det sure kvægprotein. Denne probe er central 25 for indvinding af gener for de basiske former i disse arter. I

Kort fortalt blev de fragmenter, som opnås ved Alul fordøjelse af et udvalgt surt bFGF-genfragment, som er klonet i phagen, shotgun-klonet i M13, og et 250 bp fragment, som hybridiserede til passende probe DNA, blev udvalgt og sekven-30 seret. Ovennævnte, som betegnes 250/AluI, blev overført til pBR322 og anvendt til at udforme prober til den basiske form, ved at tage fordel af den tilgængelige aminosyresekvensinfor-mation til ændring af DNA'et, så det svarer til den basiske snarere end den sure form. Den modificerede probe, som er de-35 signet på basis af en sammenligning af den N-terminale kodesekvens af sur bFGF og aminosyresekvensen af basisk bFGF,

I DK 175795 B1 I

I I

I blev anvendt til probering af det samme kvæghypofyse cDNA-

I bibliotek for basiske bFGF-cDNA. Den indvindende kvægklon I

I blev derpå anvendt til at probe humangenom- og cDNA- I

I biblioteker for at indvinde den genomsekvens, som koder for I

5 basisk human-FGF-kodende DNA. Alternativt blev kvæg-cDNA- I

I klonen λΒΒ2 mutageniseret for at omdanne DNA-sekvénsen til I

I en, som koder for human-formen af det basiske FGF-protein. ! I

I cDNA- og genomiske kloner, som beskrevet nedenfor, er anven- I

I delige ved probering af DNA-biblioteker, som er fremstillet I

I 10 fra forskellige arter, til opnåelse af analoge kodesekvenser j I

I fra disse pattedyrsbiblioteker. Ydermere er genomklonerne i j I

I

stand til ekspression i pattedyrssystemer og kan give bedre i

I resultater end de tilsvarende cDNA'er. cDNA-biblioteker, som I

I er fremstillet fra forskellige væv, såsom hypofyse, hjerne, I

15 hypothalamus eller nyrer, kan også screenes på denne måde. I

Ekspression af FGF-qener I

De klonede genom- eller cDNA-sekvenser kan udtryk- I

kes i passende ekspressionssystemer. For de omtalte DNA'er I

20 behøves ovennævnte protokol til indvinding af disse selvføl- I

gelig ikke at blive gentaget, men der kan passende anvendes I

traditionelle kemiske syntesefremgangsmåder. Dette tillader I

justering af DNA'et til opnåelse af enhver ønsket form af I

proteinet. cDNA-sekvenser kan tilvejebringes med passende

25 styring, som er egnet til enhver vært, indbefattende bakte- I

rie-, gær- eller eukaryote celler. Genomsekvenser, som inde-

holder introner, kan udtrykkes under anvendelse af eukaryote I

styresekvenser og eukaryote værter, som er i stand til at I

sammensplejse transkripterne. Der kan også anvendes vaccinia- I

30 baserede ekspressionssystemer. Der er anført eksempler på I

styresekvens DNA'er og værter i nedennævnte, afsnit C.l. I

Der kan navnlig konstrueres fuldstændig DNA, som I

koder for hellængde basisk human-FGF, f.eks. under anvendelse I

H af en kombination af rekombinant og syntetiske fremgangsmåder I

35 til opnåelse af enhver af de lange, primære eller korte for- I

mer af basisk human-FGF. Der kan også sammensmeltes heterolo- I

17 DK 175795 B1 ge signalsekvenser til disse, og ved at tage fordel af de kendte forhold mellem signalsekvens og spaltningssted opnås proteinet i den ønskede form. Intracellulært fremstillede former af proteinet kan opnås ved cellelyse, eller dets fri- 5 gørelse fra cellerne kan stimuleres, som beskrevet ovenfor.

Der foretrækkes navnlig ekspressionssystemer for enten de celleforbundne eller de formodede secernerede (sammensmeltede med signalsekvens) former, som anvender styresystemer, der er ! kompatible med pattedyrsceller, såsom CHO-celler. Der fore- 10 trækkes også vacciniabaserede systemer, som kan anvendes til stabil eller kortvarig ekspression i modtagelige celler.

De således fremstillede rekombinante basisk human- FGF-proteiner oprenses derpå på en måde, som svarer til den, der anvendes ved oprensning af FGF fra naturlige kilder, men 15 oprensningen er betragtelig simplere, idet proteinerne udgør en meget større del af udgangsmaterialet, i i Polymorfi

Det har også vist sig, at humangenom DNA udviser 20 polymorfi i området med genets anden exon. Tilstedeværelse af polymorfi er en forudsigelse af tendensen til faste tumorer, idet FGF secerneres af disse, og muligvis er nødvendig for deres overlevelse, idet det fremmer vækst af blodkar, som holder næringsmidler strømmende til tumoren.

25 For at fastlægge polymorfien opnås genomt human-DNA

ved hjælp af traditionelle fremgangsmåder fra f.eks. en blodprøve og udsættes for størrelsesadskillelse på polyacryla-midgeler og proberes under anvendelse af standard Southern-blot-fremgangsmåder. En virkningsfuld probe er 1,4 kb EcoRI-30 fragmentet, som opnås fra 2,1 kb indføjelsen i λΒΒ2, som er beskrevet nedenfor. Når en sådan probe eller dens ækvivalent anvendes til at hybridisere til geler, som indeholder Hin-dlll-fordøjelse af det isolerede human-DNA, påvises almindeligvis et 2,7 kb fragment. I nogle individer findes også et 35 yderligere 2,9 kb fragment. Disse fragmenter kortlægges til det område af genet, som omgiver exon 2, som vist i figur 11. ;

DK 175795 B1 I

Af tre afprøvede individer udviste to kun 2,7 kb B

fragmentet og en udviste både 2,7 og 2,9 kb fragmenterne. Hy- B

bridiseringsintensiteten viste, at individet med begge frag- B

menter indeholder begge alleler, hvilket støttes af de resul- I

5 tater, som opnås ved Southern-blot-analyse af DNA fra mu- I

se/human-hybridcellelinier. I disse hybrider, hvor kun ét B

kromosom overføres, fremkommer kun ét af de to fragmenter i B

hver linie. B

10 C. Standardfremganqsmåder B

De fleste af de teknikker, som anvendes til at H

transformere celler, konstruere vektorer, ekstrahere messen- B

ger RNA, fremstille cDNA-biblioteker og lignende, anvendes B

vidt udbredt inden for fagområdet, og de fleste udøvere er B

15 fortrolige med standardmaterialemidler, som beskriver speci- B

fikke forhold og procedurer. De følgende afsnit kan imidler- B

tid for nemheds skyld tjene som en retningslinie. B

C.l. Værter og styresekvenser B

20 Der kan anvendes både prokaryote og eukaryote sy- B

stemer til udtryk af FGF-kodende sekvenser. Prokaryote værter B

er selvfølgelig mest egnede til kloningsprocedurer. Prokaryo- B

ter er oftest repræsenteret ved forskellige stammer af B

E. coli. Der kan imidlertid også anvendes andre mikrobielle B

25 stammer. Der anvendes plasmidvektorer, som indeholder repli- B

kationssteder, selekterbare markører og styresekvenser, der B

hidrører fra en art, der er kompatible med værten. F.eks. B

transformeres E. coli typisk ved anvendelse af derivater af B

pBR322, der er et plasmid, som er afledt fra en E. coli art B

30 af Bolivar, et al., Gene (1977) 2:95. pBR322 Indeholder gener I

for ampicillin- og tetracyclinresistens og tilvejebringer så- B

ledes flere selekterbare markører, som enten kan bibeholdes B

eller ødelægges ved konstruktion af den ønskede vektor. Al- B

mindelig anvendte prokaryote styresekvenser, som er defineret B

35 i nærværende beskrivelse til at indbefatte promotorer til B

transkriptionsinitiering, evt. med en operator, sammen med B

19 DK 175795 B1 ribosombindingsstedsekvenser, indbefatter de almindelig an-' vendte promotorer, såsom -lactamase- (penicillinase) og lactose (lac)-promotorsystemer (Chang, et al., Nature (1977) 198:1056) og tryptophan (trp)-promotorsystemet (Goeddel, et 5 al., Nucleic. Acids Res. (1980) £:4057) og den lambda-afledte Pjj-promotor og N-gen-ribisombindingssted (Shimatake, et al.,

Nature (1981) 292:128).

Ud over bakterier kan der som værter også anvendes eukaryote mikrober, såsom gær. Laboratoriestammer af Saccha-10 romyces cerevisiae, bagegær, er den mest anvendte, selv om et antal andre stammer eller arter er almindelig tilgængelige.

Der kan f.eks. anvendes vektorer, som benytter 2 replika- tionsorigin ifølge Broach, J.R., Meth. Enz. (1983) 101:307 eller andre gærkompatible replikationsoriginer (se f.eks.

15 Stinchcomb, et al., Nature (1979) 282:39, Tschumper, G., et al., Gene (1980) 10:157 og Clarke, L. , et al., Meth. Enz.

(1983) 101:300). Styresekvenser til gærvektorer indbefatter promotorer til syntese af glycolytiske enzymer (Hess, et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1986) , Holland, et al., Bioche- 20 mistry (1978) £7:4900). Yderligere promotorer, som er kendt inden for fagområdet, indbefatter promotoren for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem.

(1980) 255:2073). Andre promotorer, som besidder den yderligere fordel af transkription, som er styret af vækstforhold 25 og/eller genetisk baggrund, er promotorområderne for alkohol-dehydrogenase 2, isocytochrom C, syrephosphatase, nedbrydende enzymer, der er forbundet med nitrogenmetabolisme, alfa-faktorsyfetemer og de enzymer, som er ansvarlige for maltose-og galactoseudnyttelse. Det menes også, at terminator-30 sekvenser er ønskelige ved 3' enden af kodesekvenserne. Disse terminatorer findes i det 3' utranslaterede område efter kodesekvenserne i gærafledte gener.

Det er selvfølgelig også muligt at udtrykke de gener, som koder for polypeptider, i eukaryote værtscellekultu-35 rer, der hidrører fra multicellulæreorganismer. Se f.eks.

Axel, et al., 4399216. Disse systemer besidder den yderligere

DK 175795 B1 I

fordel af evnen til at udskære introner og kan således anven- I

des direkte til at udtrykke genomfragmenter. Anvendelige I

værtscellelinier indbefatter VERO og HeLa celler og kinesisk I

j hamterovarie (CHO) -celler. Ekspressionsvektorer til disse I

5 celler indbefatter almindeligvis promotorer og styrese- I

kvenser, der er kompatible med pattedyrsceller, såsom f.eks. I

de almindelig anvendte tidlig og sene promotorer (engelsk: I

early and late promoters) fra Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, I

et al.. Nature (1978) 273:113) eller andre virale promotorer, I

10 såsom de der hidrører fra polyoma, Adenovirus 2, kvægpapillo- I

mavirus eller aviær sarcomavirus. Der kan også anvendes den I

kontrollerbare promotor, hMTII (Karin, M., et al.. Nature I

(1982) 299:797-802). Almindelige aspekter ved pattedyrscelle- I

værtssystemtransformationer er blevet beskrevet af Axel (se I

15 ovenfor) . Det viser sig nu, at også "forstærker"-områder er I

vigtige ved optimering af ekspressionen. Disse er almindelig- I

vis sekvenser, som findes opstrøms eller nedenstrøms promo- I

torområdet i de ikke-kodende DNA-områder. Replikationsorigin I

kan, hvis det behøves, opnås fra viruskilder. Intregrering i I

20 kromosomet er imidlertid en almindelig mekanisme for DNA- I

replikering i eukaryoter. I

C.2. Transformationer I

Afhængig af den anvendte vært udføres transformati- I

25 on ved anvendelse af standardfremgangsmåder, som er passende I

for disse celler. Der kan anvendes calciumbehandling under I

anvendelse af calciumchlorid, som beskrevet af Cohen, S.N., I

Proc- Natl. Acad- Sci. (USA) (1972) 69:2110, eller RbCl2- I

fremgangsmåden, som er beskrevet af Maniatis, et al., Molecu- I

30 lar Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor I

Press, p. 254, og af Hanahan, D., J. Mol. Biol. (1983) I

166:557-580, til prokaryoter og andre celler, som indeholder

væsentlige cellevægsbarrierer. Til pattedyrsceller uden disse ' I

cellevægge kan der anvendes calciumphos- I

35 phatpræcipitationsfremgangsmåden ifølge Graham og van der Eb, I

virology (1978) 52:546, evt. som den er modificeret af I

21 DK 175795 B1

Wigler, M., et al., Cell (1979) 16^777-785. Transformationer i gær kan udføres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Beggs, J.D., Nature (1978) 275;104-109 eller ifølge Hin- nen, A. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929.

5 C. 3. Vektorkonstruktion

Konstruktion af egnede vektorer, som indeholder de i ønskede kode- og styresekvenser, sker under benyttelse af standardligations- og restriktionsfremgangsmåder, som er vel-10 forstået af fagfolk inden for området. Isolerede plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserede oligonukleotider spaltes, forsynes med haler og religeres i den ønskede form.

De DNA-sekvenser, som udgør vektorerne, er tilgængelige fra et antal kilder. Rygradsvektorer og syresystemer 15 findes almindeligvis på tilgængelige "vært"-vektorer, som anvendes til de fleste af de sekvenser, der er under konstruktion. Typiske sekvenser er anført i afsnit C.l. ovenfor. For de relevante kodesekvenser kan initiel konstruktion være og er almindeligvis et spørgsmål om at generhverve de passende 20 sekvenser fra cDNA- eller genome DNA-biblioteker. Når denne sekvens er afsløret, er det imidlertid muligt at syntetisere hele gensekvensen in vitro ved at begynde fra de individuelle nukleotidderivater. Der kan fremstilles hele gensekvensen for gener af betydelig længde, f.eks. 500-1000 bp, ved at synte-25 tisere individuelle overlappende komplementære oligonukleoti-; der og ifylde enkeltstrengede ikke-overlappende dele under anvendelse af DNA-polymerase i nærværelse af deoxyribonukleo-tidtriphosphater. Denne fremgangsmåde er blevet vellykket anvendt ved konstruktion af adskillige gener af kendt sekvens.

30 Se f.eks. Edge, M.D., Nature (1981) 292:756, Nambair, K.P., et al.. Science (1984) 223:1299, Jay, Ernest, J. Biol. Chem.

(1984) 259:6311.

Der fremstilles syntetiske oligonukleotider ved enten phosphotriesterfremgangsmåden, som er beskrevet af Edge, 35 et al., Nature (se ovenfor) og Duckworth, et al.,

Nucleic Acids Res. (1981) 9:1691 eller phosphoramiditfrem-

I DK 175795 B1 I

I I

H gangsmåden, som beskrevet af Beaucage, S.L., og Caruthers, I

I M.H., Tet. Letts. (1981) 2_2:1859 og Matteucci, M.D., og Ca- I

ruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 :3185, og de kan I

H fremstilles ved anvendelse af kommercielt tilgængelige auto- H

H 5 matiserede oligonukleotidsynteseapparater. Kinasebehandling I

H af enkeltstrenge før reassociering eller til mærkning opnås I

H ved anvendelse af et overskud, f.eks. 10 enheder polynu- I

kleotidkinase til 1 nmol substrat, i nærværelse af 50 mM I

Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 1-2 mM ATP, I

10 1,7 pmol y32P-ATP (2,9 mCi/mmol) , 0,1 mM spermidin og 0,1 mM I

I EDTA. I

H Når komponenterne af de ønskede vektorer på denne H

måde er tilgængelige, kan de udskæres og ligeres under anven- H

delse af standardrestriktions- og ligationsfremgangsmåder. I

15 Stedspecifik DNA-spaltning udføres ved behandling H

med det passende restriktionsenzym (eller enzymer) under for-

hold, som er almindeligt forstået af fagfolk inden for områ- H

det, og hvor detaljerede oplysninger er specificeret af for- H

handlerne af disse kommercielt tilgængelige restriktionsenzy- i H

20 mer. Se f.eks. New England Biolabs Produkt Katalog. Alminde- H

ligvis spaltes ca. 1 g plasmid eller DNA-sekvens med en en- zymenhed i ca. 20 1 pufferopløsning. I nærværende eksempler anvendes almindeligvis et overskud af restriktionsenzym for

at sikre fuldstændig fordøjelse af DNA-substratet. Inkubati- H

25 onstider på fra ca. 1 til 2 timer ved ca. 37°C er brugbare, I

H selv om der kan tolereres variationer. Efter hver inkubation I

H fjernes protein ved ekstraktion med phenol/chloroform og kan I

H følges af etherekstraktion, og nukleinsyrerne indvindes fra I

de vandige fraktioner ved præcipitaiton med ethanol. Hvis det H

30 ønskes, kan der udføres størrelsesadskillelse af de spaltede H

fragmenter ved hjælp af polyacrylamidgel- eller agarosegele- H

lektroforese under anvendelse af standardfremgangsmåder. En H

I almen beskrivelse af størrelsesadskillelse findes i H

I Methods in Enzymolpqy (1980) 65^:499-560. I

I 35 Restriktionsspaltede fragmenter kan gøres stumpen- H

dede ved behandling med det store fragment af E. coli DNA po- H

DK 175795 B1 23 lymerase I (Klenow) i nærværelse af de fire deoxynukleo-tidtriphosphater (dNTP'er) under anvendelse af inkubationstider på fra ca. 15 til 25 min ved fra 20 til 25°C i 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT og 0,1-1,0 mM 5 dNTP'er. Klenow-fragmentet udfylder ved 5' enkeltstrengede fremspring men tykker fremstikkende 3' enkeltstrenge tilbage, selv om de fire dNTP'er er til stede. Hvis det ønskes, kan selektiv reparation udføres ved kun at forsyne med en af eller udvalgte dNTP'er inden for de begrænsninger, som er dik-10 teret af fremspringets natur. Efter behandling med Klenow ek-straheres blandingen med phenol/chloroform og ethanolpræcipi-teres. Behandling med SI nuklease eller BAL-31 under passende forhold resulterer i hydrolyse af enhver enkeltstrenget del.

Der udføres ligationer i 15-50 1 voluminer under 15 følgende standardforhold og temperaturer: f.eks. 20 mM Tris-C1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 g/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl og enten 40 M ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheder T4 DNA-ligase ved 0°C, (til ligation af "klæbrig ende") eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheder T4 DNA-ligase ved 14°C (til li-20 gation af "stump ende"). Intermolekylære ligationer af "klæbrige ender" udføres almindeligvis ved 33-100 g/ml totale DNA-koncentrationer (5-100 nM total endekoncentration). Intermolekylære stumpendeligationer udføres ved 1 M total en-dekoncent ration.

25 Ved vektorkonstruktion under anvendelse af "vektor

fragmenter" behandles vektorfragmentet almindeligvis med bakterie et alkalisk phosphatase (BAP) eller kalveintestinal alkalisk phosphatase (CIP) for at fjerne 5' phosphat og forhindre vektorens selv ligation. Fordøjeiserne udføres ved pH 8 i 30 ca. 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA under anvendelse af en enhed I

BAP eller CIP per mg vektor ved 60°C i ca. 1 time. For at indvinde nukleinsyrefragmenterne ekstraheres præparationen med phenol/chloroform og ethanolpræcipiteres. Religation kan alternativt forhindres i vektorer, som er blevet dobbeltfor-35 døjet ved yderligere rescriktionsenzymfordøjelse og ad- I

skillelse af uønskede fragmenter.

I DK 175795 B1 I

I I

I For de dele af vektorerne, som hidrører fra cDNA H

I eller genom-DNA, som kræver sekvensmodifikationer, kan der

I anvendes stedspecifik primerrettet mutagenese (Zoller, M.J., I

I og Smith, M. , Nucleic Acids Res. (1982) 1£: 6487-6500 og I

I 5 Adelman, J.P., et al., DNA (1983) 2:183-193). Dette udføres I

I ved at anvende et syntetiske primeroligonukleotid, som er H

komplementær med det enkeltstrengede phag DNA, som skal muta- I

geniseres, med undtagelse af begrænset fejlparring, som re- I

I præsenterer den ønskede mutation. Kort fortalt anvendes det , I

10 syntetiske oligonukleotid som en primer til at dirrigere syn- H

H tese af en streng, som er komplementær med phagen, og det re-

suiterende delvise eller fuldstændige dobbeltstrengede DNA H

transformeres ind i en phag-støttende (engelsk: phag- H

supporting) værtsbakterie. Kulturer af den transformerede H

15 bakterie udplades i topagar, hvilket tillader plaquedannelse H

fra enkeltceller, som huser phagen. I

Teoretisk vil 50 % af det nye plagues indeholde I

phagen, der som en enkeltstreng har den muterede form. 50 % I

H Vil besidde den oprindelige sekvens. De resulterende plaques I

H 20 vaskes efter hybridisering med kinasebehandlet syntetisk pri-

mer ved en vasketemperatur, som tillader binding af et eksakt H

' modstykke, men hvorved fejlparringerne med den oprindelige I

streng er tilstrækkelige til at forhindre binding. Plaques I

som hybridiserer med proben opsamles, dyrkes og DNA- H

25 indvindes. I

C.4. Verifikation af konstruktion H

ved de nedenfor anførte konstruktioner bekræftes H

korrekt ligation af plasmidkonstruktionen ved først at trans- I

30 formere E. coli stamme MC1061, der er opnået fra Dr. M. Casa- I

I daban (Casadaban, M. , et al., J. Mol. Biol. (1980) 138:179- I

207) eller en anden passende vært med ligationsblandingen.

Vellykkede transformanter udvælges ved ampicillin-, tetra- I

cyclin- eller anden antibiotikaresistens eller ved anvendelse I

H 35 af andre markører afhængig af fremgangsmåden ved plasmid- I

konstruktionen, som det forstås inden for fagområdet. Plasmi- I

25 DK 175795 B1 der fra transformanterne fremstilles derpå i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Clewell, D.B., et al.,

Proc. Natl. Acad- Sci. (USA) (1969) 62:1159, evt. fulgt af chloramphenicolamplifikation (Clewell, D.B, J. Bacteriol.

5 (1972) 110:667). Der anvendes almindeligvis adskillige mini DNA-præparationer, se f.eks. Holmes, D.S.,. et al.,

Anal Biochem. (1981) 114:193-197 og Birnboim, H.C., et al.,

Nucleic. Acids Res. (1979) 2:1513'1523· Det isolerede DNA

analyseres ved restriktion og/eller sekvenseres ved anvendel-10 se af dideoxynukleotidfremgangsmåden ifølge Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1977) 74:5463, som yderligere er beskrevet af Messing, et al., Nucleic Acids Res.

(1981) 9:309 eller ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Maxam, et al., Methods in Enzymoloqy (1980) 65:499.

15 C. 5. Eksempler på værter Værtsstammer, som anvendes ved kloning og prokaryo-tisk ekspression i nærværende beskrivelse, er som følger:

Til kloning og sekvensering og til ekspression af 20 konstruktionen under styring af de fleste bakteriepromotorer anvendes E. coli stammer, såsom MC1061, DH1, RR1, C6O0hfl, K803, HB101, JA221 og JM101.

D. Illustrativ fremgangsmåde 25 De efterfølgende eksempler har til hensigt at illu strere opfindelsen. Det DNA, som koder for de illustrerede FGF-sekvenser, opnås initielt ved at screene et kvæggenom-bibliotek og opnå en central probe, fulgt af generhvervelse af yderligere DNA. Det vil imidlertid ikke være nødvendigt at 30 gentage denne fremgangsmåde, idet sekvensen af den centrale probe nu er kendt og således kan konstrueres kemisk in vitro.

Ydermere er de bakteriophager, som huser de fire illustrerede sekvenser, deponeret hos American Type Culture Collection.

35

I DK 175795 B1 I

I 26 I

Eksempel 1 I

Konstruktion af 250/AluI probe; Fremstilling af sur bFGF ge- I

nom-DNA I

I 5 I

Et 250 bp Alul kvæggenomfragment anvendes til at probe både _ I

human- og kvægbiblioteker for at opnå fuldstændige kodese- I

kvenser for de illustrerede sure FGF-proteiner. Denne probe, I

som betegnes 250/AluI, opnås som følger. I

10 Den N-terminale aminosyresekvens for resterne 1-34 I

af sur kvæg-FGF er kendt. Der fremstilles tre lange prober I

baseret på codonvalg (Anderson, S., et al. , I

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1583) 80:6838-6842, Jaye, Μ., I

I et al., Nucleic Acids Res. (1983) 11: 2325-2335) under anven- I

15 delse af en automatik synteseapparat og et phosphoramidit- I

H koblingsreagens. Sekvenserne for disse nukleotidprober er I

vist i figur 5. Probe 891 er en 48-mer, der svarer til amino- I

syrerne 1-16. Proberne 889 og 890 er 51-mer, der svarer til I

H aminosyrerne 18-34, og de anvendes som en 50-50 blanding af I

20 de to oligonukleotider, som er identiske med undtagelse af I

codonen for arginin i position 24. Proberne anvendes til at j I

screene et kvæggenombibliotek, der er opnået fra Dr. Fritz I

Rottman, Case Western Reserve, og som er blevet fremstillet I

H som en delvis Mbol-fordøjelse og som er klonet i BamHI- I

25 behandlet phagvektor Charon 28 (Woychik, R.F., et al., I

Nucleic Acids Res. (1982) 10:7197-7210). I

Hybridisering udføres på denatureret DNA, som er I

replikeret på filtre under anvendelse af en modifikation af I

den fremgangsmåde, som er beskrevet af Ullrich, A., et al., I

30 EMBO J. (1984) 3:361-364, og vaskeforholdende svarer til de I

I ifølge Wood, W.I., et al., Nature (1984) 312:330-337. Præ- I

hybridiserings/hybridiseringspufferen indeholdt 20% formamid, I

5x Denhardts opløsning (lOOx Denhardts er lig med 2% kvægse- I

rumalbumin, 2% polyvinylpyrolidon; 2% Ficoll) , 6x SSC (20x I

35 SSC er lig med 3 M NaCl, 0,3 M Na-citrat) , 50 mM na- I

H triumphosphat, pH 6,8, 100 g/ml sildesperm-DNA. Hybridise- I

27 DK 175795 B1 ! ringspufferen indbefattede yderligere 10% dextransulfat og f : ca. 105-105 cpm/ml kinasebehandlede prober 891 eller 889/890.

Præhybridiseringen og hybridiseringen blev udført ved 42°C i i i 1 time henholdsvis 16 timer. Filterne blev derpå vasket 2 5 gange i 15 min med lx SSC, 0,1% SDS ved 22°C fulgt af en 10 min vask i lx SSC, 0,1% SDS ved 55°C. Efter vask blev filterne udsat i 1 dag under anvendelse af forstærkende skærme.

Det screenede kvæggenombibliotek indeholdt 50 pha-ger ud af 106 rekombinanter, som hybridiserede med begge pro-10 ber. Disse 50 phager blev yderligere screenet med blandinger af proberne 853-856. I denne screening indeholdt præhybridi-serings/hybridiseringspufferen 6x SSC, lx Denhardts, 0,1% SDS, 0,05% Na-pyrophosphat og 100 g/ml laksesperm-DNA. Hy-bridiseringspufferen indeholdt yderligere 105-106 cpm/ml pro-15 be. Proberne 853-856 er 4 puljer af 16 sekvenser af hver af de 64 (total) 17-merer, som svarer til aminosyrerne 7-12, og som syntetiseres under anvendelse af phospho-triesterfremgangsmåden. 46 Af de 50 kloner hybridiserede imidlertid yderligere til de kortere prober. Denne hybridise-20 ring blev udført ved mellem 65°C i 35°C i 16 timer, og der blev anvendt den vaskefremgangsmåde, der er uafhængig af basesammensætningen, under anvendelse af tetramethylammo-niumchlorid ved 50°C (Wood, W.I., Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) (1985) 82:1585-1588) .

25 Der blev udvalgt to positivt hybridiserende phager (λΒΑ2 og λΒΑ3), og phagindføjeiserne blev restriktionskortlagt, som vist i figur 6, og delvis sekvenseret, som vist i I figur la. Sammenligning af den afledte aminosyresekvens med I den, der er offentliggjort for de 34 enheder af N-terminus af 1 30 naturligt surt kvæg-FGF-protein bekræfter, at disse kloner er rigtige. Fra kodesekvensens natur fremgår det, at aminosyre-enhederne 1-41 (som vist i figur la) kodes i disse kloner.

Umiddelbart synes efterfølgende nukleotider at repræsenterer en intron. Længden af denne intron er for tiden uvis, men det 35 er muligt, at den fuldstændige sur bFGF-kodende sekvens ligger på disse λ3Α2 og λΒΑ3 DNA'er. Ethvert yderligere DNA, som

I DK 175795 B1 I

I I

kræves for at opnå den fuldstændige kodesekvens af dette .pro- I

tein, kan imidlertid opnås fra samme genbibliotek under an- I

vendelse af λΒΑ2 eller λΒΑ3 i "walking"-fremgangsmåder. Codo- I

nerne før N-terminalenheden menes at kode for den anførte 15 I

5 aminosyrers prosekvens eller, som omtalt ovenfor, den "lange"

form af det naturlige protein, der er forlænget med 15 amino- I

syrer ved N-terminus (eller med 14 hvis det N-terminale I

methionin fraspaltes) i sammenligning med den isolerede "pri- I

H mære" form. I

10 For at fremstille 250/AluI proben blev λΒΑ2 delvis I

fordøjet med Alul og shutgonklonet i M13 (Messing, J., et I

H al.. Gene (1982) 19^269-276). M13 Plagues blev hybridiseret I

in duplo med 853-856 og 889/890. De phager, som hybridiserede H

· til begge prober, blev sekvenseret. Den resulterende 250 bp I

15 Alul probe er vist i figur 7 sammen med den tilsvarende af- H

ledte aminosyresekvens. Dens lokalisering på λΒΑ2- og λΒΑ3- H

indføjelserne ifølge figur 6 svarer til stedet for proberne I

H 889/890 og 891. 250/AluI Proben svarer til den N-terminale I

del af det sure bFGF-protein.

I 20 I

Eksempel 2 I

Generhvervelse af basisk bFGF-genom- og cDNA-kloner

250/AluI-proben blev dernæst anvendt til at designe I

25 passende prober til opnåelse af de tilsvarende basiske bFGF- I

sekvenser. Der blev gjort fordel af den opdagelse ifølge I

Esch, F., et al. , (se ovenfor), at aminosyrerne 4-29 af sur I

bFGF er på linie med aminosyrerne 13-38 af den basiske bFGF- I

sekvens. Proberne blev udformet på basis af de basiske bFGF- I

30 enheder 18-36 og de sure bFGF-enheder 9-27, hvilke områder er I

homologe for 14 af de 19 aminosyrer. I

Proberne 1097 og 1098, der er 40-merer, som er ud- I

formet til at kode for dette område, blev fremstillet ved at I

anvende phosphoramiditfremgangsmåden på et automatisk synte- I

35 seapparat. Proberne er vist i figur 8. De overlapper i områ- I

det med aminosyrerne 23-31 af den basiske sekvens. Ved ud- I

29 DK 175795 B1 formning af proberne blev 250/AluI-sekvensen anvendt, når aminosyresekvensen var den samme, og når den var forskellig, blev den inkorporeret minimale nukleotidforskelle for at bevirke den krævede forandring af kodesekvensen.

5 Kvæghypofyse cDNA-biblioteket, der er opnået ved anvendelsen af XgtlO vektor ifølge Huynh, V.T. [DNA cloning techniques: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, (1984)], blev screenet med 1098. Korrekte forhold til hybridisering blev fastlagt ved anvendelse af genom-DNA (eksempel l) til 10 Southern blot, som følger:

Det var selvfølgelig forventet, at proberne 1097 og 1098 ville krydshybridisere med det DNA, som koder for sur FGF under forhold med lav stringens. Southern blot analyse i viste, at genomsekvenser, som er kendt til at kode for sur 15 bFGF, og som hybridiserede til 1097 og 1098 ved vasketempera-turer på 55°C, fejlede i at hybridisere ved 65°C (præhybridi-sering/hybridiseringspuffer og forhold var som for proberne 889/890 og 891 i eksempel 1). Derfor blev der valgt en vasketemperatur på 65°C. Ved denne temperatur hybridiserede et 10 20 kb fragment fra en EcoRI-fordøj else og et 3,4 kb fragment fra en Pstl-fordøjelse til proberne 1097 og 1098.

Når cDNA-biblioteket blev proberet som ovenfor ved anvendelse af en vasketemperatur på 65 C blev der indvundet en enkelt klon, der betegnes λΒΒ2, og som repræsenterer et 25 2,1 kb c DNA med EcoRI - linkere. Et restriktionskort af denne phag er vist i figur 9. Underfragmenter af indsættelsen i λΒΒ2 blev overført til M13 til sekvensering, og et 1,4 kb EcoRI-fordøjet underfragment viste sig at kode for aminosy-rerne 1-146 (den fuldstændige "primære" sekvens) af basisk 30 kvæg-FGF. Sekvensen opstrøms N-terminalcodonen menes at kode for enten en ni aminosyres pro-sekvens eller for en N-terminaludvidet "lang" form af det naturlige protein, som bibeholder aktiviteten. Den N-terminale udvidelse kan indeholde kun 8 enheder selvfølgelig afhængig af hvor vidt methionin 35 spaltes fra under posttranslationel bearbejdning. Delen af dette underfragment, som koder for basisk bFGF, er vist i fi-

I DK 175795 B1 I

I 30 I

gur 3. Aminosyrenummereringen, som begynder ved position 1, I

svarer til N-terminus af det isolerede "primære" protein. De

ni opstrøms codoner er vist translateret i parantesen. Mulig- I

heden for, at denne udvidelse repræsenterer en intregreret I

5 del af det naturlige aktive protein foreslås ved den højere I

molekylvægtform af basisk human-FGF, som fremstilles ud fra I

hepatomaceller ifølge Klagsbrun, et al., I

Proc. Natl. Acad. Sci (se ovenfor). I

1,4 kb Underfragmentet translateres derpå enkelt- I

10 strenget (engelsk: nick translated) og anvendes til at scree- I

ne et kvæggenombibliotek, som er konstrueret på samme måde I

som det ifølge eksempel 1 for basiske bFGF genomsekvenser. I

Det 1,4 kb basiske bFGF-kodende cDNA-fragment an- I

vendes også til at probere alternative pattedyr-cDNA- I

H 15 biblioteker, såsom de fra rotte, svin eller kvæg, kat, hund, I

hest eller murine kilder til opnåelse af de sekvenser, der H

koder for basisk FGF, fra disse arter. I

Eksempel 3 H

I 20 I

Fremstilling af basiske human-FGF-genom- og cDNA-kloner I

Et XgtlO cDNA-bibliotek, som er fremstillet ud fra I

H humannyre mRNA, blev også proberet under anvendelse af det I

1,4 kb basiske kvægsubfragment. Præhybridise- I

25 rings/hybridiseringspufferen indeholdt 40 % formamid, 5 mM I

Na-phosphat, pH 6,5, 5x Denhardts, 5x SSC og 50 g/ml silde- I

sperm DNA. Hybridiseringspufferen indbefattede også 10% dex-

transulfat og 104-105 cpm/ml probe. Der blev isoleret tre I

kloner, og en blev udvalgt til karakterisering. Denne klon, I

H 30 som betegnes λΚΒ7, indeholdt et EcoRI-fragment på ca. 1,4 kb, I

som blev delvis sekvenseret til at give de data, som er vist I

H i figur 4 sammen med den afledte aminosyresekvens. Det se- I

kvenserede kodeområde tillader udledelse af aminosyrerne 1- I

H 50, der er vist i figuren. Den fortsatte sekvens umiddelbart I

H 35 nedenstrøms synes at repræsentere cDNA-kopien af et ikke- I

H splejset mRNA, hvilket indikerer, at der forekommer en intron I

31 DK 175795 B1 j i det basiske FGF-gen i en position homolog med intronen ef ter aminosyre 41 i de sure kvæg- og human-FGF-gener. λΚΒ7 , Klonen.tilvejebringer også opstrøms DNA, som koder for den N- terminale udvidelse på 9 aminosyrer af den viste lange form.

5 Yderligere genom- og cDNA-biblioteker blev screenet under anvendelse af den samme 1,4 kb basiske bFGF-kodende fragment under præcis de samme hybridiseringsforhold, som be-i nyttes for ovennævnte humannyre- λgtlO-bibliotek. Der blev j opnået fire yderligere kloner, som tilsammen koder for hele 10 proteinet på 146 aminosyrer, som svarer til de isolerede basiske bFGF, som er vist i figur 4. De ni opstrøms codoner, som er indbefattet i ovennævnte λΚΒ7, translateres til,en sekvens, der har fuldstændig homologi med de translaterede opstrøms codoner i den basiske kvæg-FGF-klon, selv om der er en .

15 tavs nukleotidsubstitution i codon -8. Denne translaterede N-terminale udvidelse er vist i parentesen i figur 4 og kan som ovenfor repræsentere en pro-sekvens eller en yderligere ami-nosekvens af et N-terminalt udvidet aktivt protein.

Mere detaljeret blev to positivt hybridiserende 20 kloner fra et humangenombibliotek i λ Charon 4A, der er fremstillet som beskrevet af Lawn, R.M., et al., (se ovenfor), betegnet λΜΰ4 og XMG10. >.gMG4 Koder for aminosyrerne (-9)-51.

AmGIO Koder for aminosyrerne 86-146, som repræsenterer den tredie af de tre exoner, som er indeholdt i genets modne pro-25 teinkodende område. (Lokalisering af exon/introngrænser blev fastlagt ved homologi med kvægsekvensen). Et lidt anderledes genombibliotek i λ Charon 28, som var opnået fra E. Fritsch, gav λΗΤΙ, som indeholder den anden modne proteinexon, som koder for aminosyrerne 51-85. Til slut XHFLl, der er en cDNA-30 klon, som var opnået fra humanføtalleverbiblioteket, der er fremstillet i XgtlO, som beskrevet ovenfor, og som koder for aminosyrerne 56-146, hvilket bekræfter lokaliseringen af det relevante intron/ exonforbindelsespunkt.

Der er kun to aminosyreforskelle mellem basisk bFGF 35 og hFGF, nemlig ved position 112, hvor kvægproteinet har Ser og humanproteinet har Thr, og ved position 128, hvor kvægpro-

I DK 175795 B1 I

teinet har Pro og humanproteinet har Ser. Disse forskelle er I

resultatet af en enkelt nukleotidforskel i hvert tilfælde. I

Derfor kan kvæg cDNA passende modificeres ved steddirrigeret I

mutagense, som beskrevet nedenfor, til at kode for humanpro- I

5 teinet, og der anvendes faktiske standard stedspecifikke mu- I

tageneseteknikker til at ændre disse codoner. λΒΒ2 Klonen I

I ifølge eksempel 2 fordøjes med EcoRI, og 1,4 kb området, der I

spænder over den bFGF-proteinkodende del, ligeres i EcoRI- I

: stedet af M13mp8. In vitro mutagenesen blev udført under til- I

10 stedeværelse af tre oligonukleotider: en "universal" primer, I

en 17-mer; den mutagene 16-mer 5'-GAAATACACCAGTTGG-3’, som I

ændrer kodesekvensen ved codon 112, og den mutagene 17-mer I

5'-ACTTGGATCCAAAACAG-3', som ændrer sekvensen ved codon 128. I

Den mutageni serede phag blev også udsat for en anden runde I

15 in vitro primerrettet mutagenese for at skabe et Hindlll-sted I

34 bp nedenstrøms translationstermineringscodonen under an- I

vendelse af den mutagene 25-mer, 5'- I

TTTTACATGAAGCTTTATATTTCAG-3'. Det resulterende muterede DNA I

blev sekvenseret ved dideoxysekvensering til bekræftelse af, I

20 at den ønskede mutagenese var foregået, og et fragment på ca. I

630 bp, som strækker sig over FGF-kodeområdet, blev udskåret I

med Hindlll og ligeret i pUC13 til opnåelse af det interme- I

diære plasmid pJJ15-l. I

Selvfølgelig kan modificerede former af den kodese- I

25 kvens, som koder for enhver af de tre kendte N-terminale mo- I

difikationer af basisk FGF, også fremstilles ved anvendelse I

af standardsyntesefremgangsmåder. j

Eksempel 4 I

Konstruktion af ekspressionsvektorer og stabil eks-

pression af FGF i pattedyrsceller I

De cDNA-kloner, som koder for FGF, anvendes mest H

passende til at frembringe de rekombinante proteiner i en I

35 lang række værter, som anført ovenfor i afsnit C.l. Ekspres- ;

sion i pattedyrssystemer foretrækkes imidlertid, idet værten I

33 DK 175795 B1 er i stand til en posttranslationel bearbejdning, der er ana-I log til den, som det naturligt fremstillede protein gennem- i går, og der kan enten anvendes cDNA eller genomsekvenser, idet værten også er i stand til at bearbejde introner.

5 Der fremstilles således et fuldlængde cDNA eller en genom klon, som koder for FGF, til indsættelse i en værtsvektor, som er illustreret ved de, der er beskrevet nedenfor.

Til konstruktion af vektorerne udskæres den klonede FGF-kodende indføjelse med EcoRI (ved delvis fordøjelse, hvis 10 indsættelsen i sig selv indeholder EcoRI-steder) eller et andet passende enzym, forsynes med EcoRI- eller andre passende linkere om nødvendigt, og indsættes dernæst i en egnet værts- vektor, såsom pHSl, eller dens derivater, som beskrevet ne denfor.

15

Konstruktion af værtsvektorer pHSl

Plasmid pHSl er egnet til ekspression af indsat DNA 20 i pattedyrsværter. Det indeholder 840 bp af hMT-II sekvensen af p84H (Karin, M., et al., Nature (1982) 299:297-802), som spænder fra Hindlll-stedet ved position -765 af hMT-II-genet til BamHI-spaltningsstedet ved base + 70. Ved konstruktion af pHSl fordøjes plasmid p84H til fuldstændighed med BamHI, be-25 handles med exon nuklease BAL-31 for at fjerne terminal-nukleotider og fordøjes dernæst med Hindlll. Det ønskede 840 bp fragment ligeres i pUC8 (Vieira, J., et al., Gene (1982) 19^259-268), som er blevet åbnet med Hindlll- og HincII-fordøjelse. Ligationsblandingen anvendes til at transformere 30 E. coli HB101 til AmpR, og et kandidatplasmid, som betegnes pHSl, isoleres og sekvenseres ved dideoxysekvensering. pHSl Indeholder hMT-II styresekvenser opstrøms for en polylinker, som indeholder passende restriktionssteder.

Det brugbare værtsplasmid pHSl kan yderligere modi-35 ficeres til at indeholder yderligere styreelementer ud over metallothioninpromotorer. Navnlig kan forstærkerelementer af

I DK 175795 B1 I

I 34 I

virussystemer, såsom SV40, indbefattes, såvel som termine- I

ringssignaler, der er forbundet med 3' utranslaterede områder I

H af andre proteiner, såsom hGH. I

5 v i rus fors tærke re I

Et par værtsekspressionsvektorer, der indeholder I

SV40-forstærkeren i operabel binding til MT-il-promotoren, I

konstrueres ved at indsætte et 1120 bp SV40 DNA-fragment i I

H Hindlll-stedet før MT-II-promotorsekvensen i pHSl. SV40 DNA- I

10 fragmentet spænder over SV40-replikationsorigin og indbefat- I

ter nukleotid 5171 til nukleotid 5243 (ved origin), den I

dublikérede 72 bp gentagelse fra nukleotid 107-205 og fort- I

sætter gennem nukleotid 1046 på den side af origin, som inde- I

holder 5' enden af sene virale mRNA'er. Dette Hindlll 1120 bp I

15 fragment opnås fra en Hindm-fordøjelse af SV4Q DNA (Buch- I

man, A.R., et al., DNA Tumor viruses 2. udg. (J. Tooze, ed.), I

Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981), p. 799-841) I

H og klones i pBR322 til amplifikation. Kloningsvektoren skæres I

med Hindlll, og det 1120 bp SV40 DNA-fragmentet isoleres ved I

20 gelelektroforese og ligeres i Hindlll-fordøjet, CIP-behandlet I

pHSl. De resultende vektorer, som benævnes pHSl-SV(9) og I

pHSl-SV(10), indeholder fragmentet i modsatte orienteringer I

H før MT-II-promotoren. I pHSl-SV(9) er forstærkeren ca. 1600 I

bp fra 5' mRNA startstedet. I den modsatte orientering er den I

25 ca. 980 bp fra 5' mRNA startstedet. Begge orienteringer er I

H virksomme, men den orientering hvor forstærkersekvenserne er I

H proksimal startstedet, tilvejebringer højere ekspressionsni- I

veau. Det menes, at de deletioner, som placerer forstærkeren I

250-400 bp opstrøms transkriptionsstarten, er optimale. I

H 30 Der konstrueres yderligere vektorer som placerer I

SV40-forstærkerens 3' terminus 190 bp, 250 bp henholdsvis 360 I

bp opstrøms 5' enden af MT-promotorens TATA-boks. Konstrukti- I

H onerne var baseret på kortlægning af opstrøms regulatoriske I

H områder af human-MT-promotorer, som er beskrevet af Karin, I

35 M., et al., Nature (1984) 308:513-519. Alle konstruktionerne I

bibeholdt de sekvenser, som indeholdt de dobbelte steder til I

35 DK 175795 B1 regulering med tungmetaller, men de konstruktioner med 190 bp og 250 bp adskillelserne bibeholdt ikke sekvensen for gluco-corticoidregulering, som er yderligere opstrøms disse steder.

Disse vektorer, som betegnes pHS'-SV190, pHS'-SV250 5 og pHS1-SV360, fremstilles som følger. Alle konstruktionerne er identiske med undtagelse af længden af den sekvens, som indeholder metallothioninpromotoren og opstrømsområdet, der tilføres som et fragment, som er udskåret fra pHSl.

For pHS'-SV190 fordøjes pHSl med SacII, stumpendes 10 og ligeres til Kpnl-linkere. DNA'et fordøjes derpå med EcoRI og Kpnl for at afspalte den passende del af MT-II styresekvenserne. For pHS'-SV250 fordøjes pHSl på samme måde med Hgal, stumpendes, ligeres til Kpnl-linkere og fordøjes med EcoRI og Kpnl. For pHS'-SV350 anvendes Ddel ved den initielle 15 fordøjelse.

En overgangsvektor, som indeholder SV40-forstærkeren, fremstilles ved at indsætte Hindlll/Kpnl-fragmentet fra SV40 (som strækker sig fra position 5171 til position 294, og som indeholder forstærkerelementet 50 bp fra 20 Kpnl-stedet) i KpnI/Hindlll fordøjet pUC19 til opnåelse af pUC-SV (pUC19 indeholder tre passende restriktionssteder i polylinkerområdet, i rækkefølge Hindlll, Kpnl og EcoRI). De endelige vektorer opnås ved at indsætte Kpnl/EcoRI-fragmenterne, som er fremstillet som beskrevet ovenfor, i 25 Kpnl/ EcoRI-fordøjet pUC-SV.

Alle ovennævnte modificerede vektorer gør således fordel af SV40-forstærkerelementet. Der kan selvfølgelig på analog måde anvendes andre virusforstærkere.

30 Transkriptionstermineringssekvenser

For at tilvejebringe transkriptionstermineringssty-resekvenser blev DNA, som repræsenterer kodesekvensen og den 3' utranslaterede sekvens af humanvæksthormon, ligeret i pHSl. Den intermediære vektor kan tilvejebringe den hGH 3' 35 utranslaterede sekvens til kodende sekvenser, der efterføl-

I DK 175795 B1 I

I I

gende ligeres i vektoren i stedet for den hGH-kodende se- I

kvens. I

De genome sekvenser, som koder for hGH, isoleres I

fra p2.6-3 (DeNoto, et al.. Nucleic Acids Res. (1981) I

5 _19:3719) ved fordøjelse med BamHl, som skærer ved 5' enden af I

den første exon, og EcoRl, som skærer ved 3' af det funktio- I

nelle gen, fulgt af polyacrylamidgeloprensning. Det isolerede I

fragment isoleres i BamHI/EcoRI-fordøjet pHSl, og ligations-

blandingen transformeres i E. coli MC1061 til AmpR. Vellykke- H

H 10 de transformanter screenes ved restriktionsanalyse, og en H

stamme, som indeholder det ønskede plasmid, pMT-hGHGg, blev H

yderligere dyrket til fremstilling af mængder af plasmid DNA. I

På samme måde, som beskrevet ovenfor for konstruk- H

I tion af pHSl-SV(9) eller pHSl-SV(lO), med ved at erstatte I

15 pHS1 med pMT-hGHg, blev der opnået et par vektorer, som inde- H

holder hGH-genet under styring af MT-promotoren og operabelt I

bundet til SV40-forstærkeren, og som betegnes phGHg-SV(9) I

henholdsvis phGHg-SV(10). Ligationsblandingen blev anvendt H

til at transformere E. coli 1061 til AmpR, og de korrekte I

H 20 konstruktioner blev verificeret. I

Konstruktion af ekspressionsvektorer I

phGHg-SV(lO) Blev derpå anvendt som en værtsvektor I

til at rumme Syn-sur hFGF. phGHg-SV(lO) fordøjes med BamHl og I

25 Smal, stumpendes med Klenow og behandles med CIP for at ud- I

skære hGH-kodesekvensen. Denne åbne vektor ligeres til Ncol I

H (stump)/EcoRl (stump) Syn-sur hFGF-fragment til opnåelse af

den ønskede ekspressionsvektor pahFGF-SV(lO), hvori Ncol- I

stedet af Syn-sur hFGF-fragmentet genskabes. I

30 På samme måde ligeres de resterende FGF-kodende I

fragmenter, som beskrevet ovenfor, i phGHg-SV(lO) til frem- I

stilling af analoge vektorer, som indeholder disse kodese- I

kvenser under styring af viralforstærkere, MT-II-promotoren I

og hGH 3' utranslaterede områder. F.eks. indsættes ~ 500 bp I

35 Ncol (stump) /Hindlll (stump) fragmentet fra pJJ15-l ifølge : I 1 37 DK 175795 B1 i i i eksempel 6 passende i BamHI (stump) /Smal-fordøjet phGH-SV(10) til opnåelse af pJJ16-2.

Der kan ydermere anvendes andre værtsvektorer til opnåelse af ekspression af disse sekvenser indbefattende pHSl 5 og pHSl, som er modificeret til at indeholde de forskellige i ; konfigurationer af SV-forstærkeren, som beskrevet ovenfor.

Indsættelsen sker på analog måde ved anvendelse af Bam-HI/EcoRI-fordøjelse af værtsvektoren. Der kan også benyttes DNA, som er modificeret til at kode for enhver af de "lange", 10 "primære" eller "korte" former af sur eller basisk FGF.

Disse vektorer betegnes under et pMT-FGF til de formål, der er beskrevet nedenfor.

FGF-produktion af pattedyrrekombinanter 15 Kinesisk hamsterovarie(CHO)-Kl-celler dyrkes på et medium, som består af en 1:1 blanding af F12-medium og DME-rnedium med 12 % føtalt kalveserum. De kompetente celler blev co-transformeret med pMT-FGF og pSV2:NEO (Southern, P., et al., J- Mol. Appl. Genet. (1982) 1^:327-341). pSV2:NEO Inde- 20 holder et funtionelt gen der giver resistens mod neomycinana-logen G418. Ved transformationen sættes 500 ng pSV2-NEO og 5 g pMT-FGF til en 16. mm skål med celler i et calciumphosphat-DNA-co-præcipitat i overensstemmelse med protokollen ifølge wigler, M. , et al.. Cell (1979) 1^:777-785, med indbefatning

25 af 2 min "chock" med 15% glycerol efter 4 timers udsættelse I

for DNA. 1 Dag senere blev cellerne udsat for 1 mg/ml G418 for at tilvejebringe en pulje af G418-resistente kolonier, som blev analyseret for FGF-produktion, og dernæst kunne klones ud.

30 Vellykkede transformant er, som også besidder en stabil nedarvning af pMT-FGF, udplades ved lav tæthed til oprensning af klonisolater. Små mængder af disse isolater dyrkes i multibrøndeplader efter udsættelse for 10"4 M zinkchlo-rid til passende analyse af FGF-produktion. FGF-35 Bestemmelserne udføres ved standard ELISA eller radioimmun-analyser mod antisera, som er frembragt mod det passende FGF-

DK 175795 B1 I

38 I

protein under anvendelse af standardfremgangsmåder. Der ud- I

vælges de klonisolater, som producerer store mængder af det I

ønskede FGF. I

De celler, som har vist sig at producere FGF under I

5 passende forhold, udsås ved 1/10 sammenløb i basismedium sup- I

pieret med 10 % føtalt kalveserum, inkuberes natten over og I

induceres derpå for FGF-produktion ved tilsætning af zinkch- I

I lorid i koncentrationsområdet på fra 1 x 10“4 M til 3 x ΙΟ"4 I

1 M. FGF-niveauerne stiger i 7-10 dage under optimale induce- I

10 ringsforhold, 2 x 10’4 M ZnC^. I

I et særligt forsøg blev CHO-celler transformeret I

under anvendelse af pMT-FGF, der indeholder det tilnærmelses- I

vise 500 bp Ncol(stump)/Hindlll(stump)-fragment, som koder I

for basisk human-FGF, og som hidrører fra pJJ15-l ifølge ek- I

15 sempel 6. Dette fragment indsættes i BamHi(stump)/Smal- I

fordøjet phGH-SV(lO), som beskrevet ovenfor, til opnåelse af I

denne bestemte form af pMT-FGF (som ovenfor benævnes som

pJJ16-2). Cellerne cotransformeres med denne vektor, pSV-neo I

og pHSl-MT. Efter G418-udvælgelse producerer de sammenblande- I

20 de resistente kolonier ca. 500 pg basisk human-FGF per ίο6- I

celler. I

Den producerede FGF-mængde bestemmes ved affini- I

tetsoprensning af det basiske FGF fra lyserede celler under I

anvendelse af heparin-sepharose, fulgt af undersøgelse for I

25 vækstforøgelse af endothelceller i vævskultur. Heparinaffini- I

tetsoprensningen udføres ved hjælp af standardfremgangsmåder, I

såsom de, der f.eks. er beskrevet af Sullivan, R., et al., I

J- Biol. Chem. (1985) 260: 2399-2403, eller af Shing, et al., I

Science (1984) 223:1296-1299, og aktivitetsundersøgelsen ud- I

30 føres under anvendelse af de fremgangsmåder, der er beskrevet I

af Gospodarowicz, D., et al., J. Cell Physiol. (1985) I

122:323-332, eller Gospodarowicz, D., et al-, J. Cell Biol. I

(1983) 97:1677-1685. : I

De ovennævnte puljer, der producerer ved et niveau j I

35 på 500 pg/10^-celler, blev udvalgt for cadmiumresistens ved I

at dyrke dem i nærværelse af 10 M CdCl2 med 100 M ZnCl2 som I

39 DK 175795 B1 induktionsmiddel. Puljer af resistente kloner blev derpå analyseret, som beskrevet ovenfor. Der blev fundet produktionsniveauer på 5,6 ng/l06-celler i en-analyse.

Hvis det ønskes, kan FGF opnås fra de lyserede cel-5 ler og oprenses i overensstemmelse med de fremgangsmåder, der er beskrevet ovenfor for det naturlige protein, eller ved andre standardfremgangsmåder, som er kendt inden for fagområdet .

Som omtalt ovenfor kan sekretion af FGF-proteiner, 10 som produceres af ovennævnte konstruktioner, ydermere opnås ved exocytose, der er initieret af en calciumionophor eller et andet passende stimuleringsmiddel. Idet det ikke forventes, at de proteiner, som produceres af CHO-celler specifikt vil frigøres ved LPS eller phorbolesterstimulering, kan denne 15 sekretion bevirkes ved f.eks. at erstatte CHO-cellerne med cellelinier, der hidrører fra makrophag, som rekombinante værter. Ved at ændre konstruktionen således, at der tilvejebringes en signalsekvens, såsom den, som er eksemplificeret nedenfor, og som hidrører fra hGH, kan sekretionen under an-20 vendelse af normale konstitutive veje også bevirkes under anvendelse af CHO- eller andre pattedyrscelleværter. Bevirknin-gen af sekretion har selvfølgelige visse fordele, idet proteinoprensningsopgaven bliver meget enklere.

•Transfektion med en pMT-FGF-vektor, som indeholder 25 den delvis syntetiske Syn-sur hFGF-sekvens, vil resulterer i produktion af "lang" FGF, som indeholder proområdet på 14 aminosyre opstrøms de 140 aminosyrer af den modne primære form. Den bearbejdede Met-enhed kan også erstattes med en blokeringsgruppe, såsom acetyl. Bearbejdningen kan også fore-30 komme i pattedyrsceller og resultere i den modne form. Det er imidlertid fastlagt, at den lange form, som indeholder ledersekvensen minus den initierende Met og med den nu acetylerede N-terminale alaninenhed, er aktiv som en mitogen.

Ved enhver begivenhed oprenses FGF delvis ved at 35 blive ført igennem heparin/sepharose og elueret med 1,2 M NaCl for sur FGF og 2 M NaCl for basisk FGF. Eluatet analyse-

I DK 175795 B1 I

I 40 I

I res for tilstedeværelse af sur eller basisk FGP ved SDS-PAGE I

og for mitogenaktivitet på endothel- eller 3T3-celler. I

I Eksempel 5 I

I 5 I

Konstruktion af vacciniavektorer til human- I

FGF og kortvarig ekspression i CV-l-celler I

Basisk hFGF-kodende sekvenser tilvejebringes med I

det 3' utranslaterede område fra hGH ved at fordøje phGH- I

10 SV(10) (se ovenfor) med BamHl og Smal, stumpende det med Kle- I

now og indsætte det ca. 500 bp Ncol (stump)/Hindlll (stump) - I

fragment, som spænder over FGF fra pJJl5-l. Det resulterende I

plasmid pJJ16-2 kan anvendes direkte som en ekspressionsvek- I

tor, som beskrevet ovenfor. I

15 NcoI/EcoRI-Fragmentet (ca. 1,1 kb), som indeholder I

det kodende område for basisk bFGF og hGH polyA additionssig- I

nalet, blev imidlertid oprenset på en 5% acrylamidgel, elue- I

I I

ret, stumpendet med Klenow og ligeret i Smal-fordøjet, I

phosphatasebehandlet pGS20 (Mackett, et al., J. Virol. (1984) I

20 _49:857-864) . Det resulterende plasmid, som betegnes pJVl-l, I

blev amplificeret i E. coli MC1061, og plasmid DNA blev iso- I

leret ved anvendelse af cesiumchloridgradient. I

pJVl-l Og pJVl-2 vektorerne transformeres i CV-l- I

celler, der er inficeret med vaccinia, som beskrevet af Coch- I

25 ran, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82^:19- I

I

H CV-l-celler, der er transficeret med pJVl-l eller I

pGS20, analyseres for produktion af basisk hFGF under anven- I

delse af SDS-PAGE-autoradiografi. Resultaterne er vist i fi- I

30 gur 10. Banerne 1 og 2 viser medium fra celler, der er trans- I

H ficeret med pJVl-l henholdsvis pGS20, banerne 3 og 4 viser I

H prøver af de korresponderende cellelysater, og banerne 5 og 6 I

H viser det samme som banerne 3 og 4 med den undtagelse, at ly- I

satprøverne er bundet til heparinsepharose i nærværelse af ! I

35 0,6 M NaCl, vaskes med 10 mM phosphat, pH 7,4/1,1 M NaCl og ' I

elueret fra søjlen med 2 M NaCl i samme puffer. (Eluaterne I

41 DK 175795 B1 blev præcipiteret med TCA før det blev udsat på gelen) . Bane 7 viser ^^i-mærket basisk FGF i formen med 146 aminosyrer.

Båndet ved ca. 18 kd i bane 5, som har en svagt højere molekylvægt end FGF-standarden, viser at den "lange" form af 5 kvægsekvensen dannes frem for det "primære" protein, som opnås fra væv.

De prøver, der er fremstillet som beskrevet for banerne 5 og 6 (med undtagelse af TCA-præcipitationen), blev også afprøvet for mitogenaktivitet på kvæghjernekapillæren-10 dothelceller. (Se eksempel 6) . Der var ingen aktivitet til stede i pGS20-prøven, men pJVl-i-prøven indeholdt en aktivitet, som svarede til 20 pg FGF/ 1.

Eksempel 6 15

In vitro analyse for FGF

Analysen blev udført i det væsentlige som beskrevet af Esch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:6507- 6511, og af Gospodarowicz et al., J. Cell Physiol. (1985) 20 122:323-332.

Kort fortalt opretholdes kvæghjernekapillæren-dothelceller i nærværelse af DMEM suppleret med 10 % kalveserum. Monolag dissocieres ved udsættelse for en opløsning indeholdende 0,9 % NaCl, 0,01 M natrimphosphat, pH 7,4, 0,05 % 25 trypsin og 0,02 % EDTA i 2-3 min ved stuetemperatur. Efter at cellerne var samlet blev de resuspenderet i DMEM og 10 % kalveserum, og en delprøve af cellesuspensionen blev talt i en Coulter-tæller. Cellerne blev udsået ved en inltiel tæthed på 2 x 104-celler per 35 mm skål, og hver skål indeholdt et to-

30 tal på 2 ml DMEM samt 10 % kalveserum. 6 Til 12 timer senere I

blev en gruppe på dobbelte plader trypsinbehandlet, og cellerne blev talt for at fastlægge udpladningsvirkningen.

De delprøver af prøven, som skulle afprøves for FGF-aktivitet, blev fortyndet 1:2, 1:4 og 1:8 med DMEM samt 35 0,5 % BSA, og 10 1 af fortyndingerne blev sat til tredobbelte analyseplader på dag 0 og 2. På dag 4 blev de tredobbelte

I DK 175795 B1 I

I I

plader for hver prøvefortynding trypsinbehandlet og celle- I

tæthederne fastlagt ved Coulter counter. I

Eksempel 7 I

I 5 I

Bakterieekspression af FGF I

cDNA-sekvenser, som koder for FGF, og som ikke er I

afbrudt af introner, kan udtrykkes i bakteriesystemer. En I

passende værtsvektor til ekspression er pKT52, som indeholder I

10· "tre"-promotoren fulgt af en ATG-startcodon, "tre"-Promotoren I

H indeholder opstrømsdelene af trp-promotoren og nedenstrøms- I

operatorindeholdende områder af lac-promotoren. pKT52, som I

indeholder denne promotor, blev konstrueret ved en simpel ma- I

nipulation af pKK233-2, som beskrevet af Amman, Ξ., et al., I

15 Gene (1985) £0:183-190: pKK233-2 Blev fordøjet med EcoRI og I

Pvu2, udfyldt med dATP og dTTP og religeret til opnåelse af I

H den ønskede vektor. I

pKT52 Indeholder ud over den ønskede tre-promotor I

H og nedenstrøms ATG-startcodonen nedenstrøms Ncol-, PstI- og I

I 20 Hindlll-steder. I

H Til konstruktion af ekspressionsvektorer opnås det I

H FGF-kodende cDNA ved udskæring med EcoRI eller en anden pas- I

H sende enzymfordøjelse og isolering, samt om nødvendigt modi- I

H ficering af det passende fragment. 3’ Enden fremstilles til I

25 indsættelse i pKT52 ved at skære nedenstrøms termineringsco- I

H donen ved ethvert passende restriktionssted og tilføje PstI- I

eller Hindlll-linkere. 5' Enden fremstilles ved at skære ved I

et sted i kodesekvensen og tilføje de manglende codoner og et I

H Ncol-sted under anvendelse af syntetisk DNA eller ved at til- I

H 30 vejebringe et passende lokaliseret Ncol-sted ved mutagense. I

Det resulterende Ncol/Hindlll- eller NcoI/PstI-fragment lige- I

res derpå i NcoI/Hindlll-fordøjet pKT52 eller NcoI/PstI- I

fordøjet pKT52 for at tilvejebringe det FGF-kodende cDNA i I

læseramme med ATG-startcodonen. I

H 35 Til bakterieekspression anvendes de resulterende I

ekspressionsvektorer til at transformere E. coli MC1061 eller I

43 DK 175795 B1

_ I

andre passende værtsceller til Amp , og de transformerede |

celler dyrkes dernæst på M9 medium indeholdende i mM IPTG i J

3-5 timer til en O.D. på 0,2-0,5. (IPTG er et standardinduk- ; tionsmiddel til styresekvenser, der er reguleret af lac- | 5 operatoren). Cellerne høstes derpå, lyseres ved ultralydbe- j handling eller behandling med 5 % trichloreddikesyre, og cel- ! leekstrakterne analyseres for det ønskede FGF. FGF kan oprenses fra ekstrakterne ved fremgangsmåder, som anvendes til det naturlige protein, eller ved andre fremgangsmåder, som er 10 kendt inden for fagområdet. i

Eksempel 8

Virkning af FGF ved fremme af sårheling 15 FGF-virkningen ved fremme af sårheling blev analy seret ved anvendelse af naturligt basisk FGF, der var oprenset fra kvæghypofyser i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Gospodarowicz et al, som en kontrol (Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:6963-6967). Det kontrol 20 bFGF, som skal analyseres, blev anvendt ved den subkutane im plantation af polyvinylalkoholtamponer i rotter i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Davidson, J.M., et al., j J. C. B. (1985) 100:1219-1227. Som et alternativ kan der også ' anvendes gortex hulfibre (Goodson, W.H., et al., 25 J. Surg. Res. (1982) 33:394-401).

Ved standardproceduren modtog et total på fire rotter hver to identisk behandlede tamponer. Tamponerne var en- i ten ikke-behandlet, behandlet med heparinsepharosekugler, behandlet med FGF bundet til heparinsepharosekugler under an-30 vendelse af 5 g FGF per tampon, eller behandlet med 5 g FGF i opløsning. Tamponerne blev fjernet efter 6 dage og undersøgt histologisk for granuleringsvæv, som er en indikation på sårheling.

De tamponer, som indeholdt FGF, udviste en højere 35 grad af granulering, som var centreret rundt om heparinsepha-

I DK 175795 B1 I

I 44 I

I rosekuglerne i de tilfælde, hvor FGF i tamponerne var tilført I

I som bundet til disse kugler. I

I Der observeres lignende resultater hvad enten FGF I

I hidrører fra naturlige eller rekombinante kilder. I

I 5 Den 9. september 1985 eller før deponerede ansøge- I

I ren λphagen λΒΑ2, λΒΑ3, λ3Β2 og λΚΒ-7 hos American Type Cul- I

I ture Collection (ATCC) , Rockville. MD. , USA, og de blev til- I

I delt ATCC deponeringsnumrene 40195, 40194, 40196 henholdsvis I

40198. Disse deponeringer blev udført under forhold ifølge I

I 10 ATCCs aftale vedrørende deponering af kulturer til patent- I

I formål. Den 12. september 1986 eller før blev deponeringsfor- I

I hold for λΒΒ2 (ATCC 40196) omformet til at passe til de, som

er specificeret under Budapest Traktaten vedrørende interna- I

I tional Recognition of the Deposit of Microorganisms (Budapest I

I 15 Traktaten). Tilgængeligheden af de deponerede stammer skal I

H ikke opfattes som en licens til udøvelse af opfindelsen i I

strid med de rettigheder, som gives under enhver regerings- I

myndighed i overensstemmelse med dennes patentlove.

Claims (9)

1. Isoleret, klonet rekombinant- eller syntetisk DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et FGF-protein 5 der omfatter aminosyresekvensen, der er nummereret som 16-146 i figur 4.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for et FGF-protein, der omfatter aminosyresekven- 10 sen, der er nummereret som 1-146 i figur 4.

3. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den koder for et FGF-protein, der omfatter aminosyresekvensen, der er nummereret som (-9) eller (-8) til 146 i figur 4. 15

4. DNA-sekvens ifølge et vilkårligt af krav 1 til 3, der koder for et FGF-protein, hvilkets aminosyresekvens består af: - aminosyresekvensen, der er nummereret som 1-146 i figur 4, 20. aminosyresekvensen, der er nummereret som 16-146 i figur 4, eller - aminosyresekvensen, der er nummereret som (-9) eller (-8) til 146 i figur 4.

5. DNA-sekvsens der koder for human basisk FGF og hvilken kan opnås ved screening af et eller flere DNA-biblioteker for en-sekvens der hybridiserer, i en præhybridise-rings/hybridiseringspuffer der indeholder 40% formamid, 5 mM natriumphosphat, 5x Denhardts opløsning (0,1% kvægserumalbu-30 min, 0,1% polyvinylpyrolidon; 0,1% Ficoll) , 5x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Na-citrat), 50 pg/ml sildesperm-DNA, hvor hy- bridiseringspufferen også omfatter 10% dextransulfat ved pH 6,5, til det 1,4 kb basiske fragment, der koder for kvæg-FGF, opnået ved EcoRl fordøjelse af λΒΒ2 (deponeret som ATCC 35 40196), og isolering af den hybridiserede sekvens. I DK 175795 B1 I I 46 I

6. DNA-sekvens ifølge et vilkårligt af krav 1-5, I kendetegnet ved, at den yderligere omfatter DNA, I som koder for en heterolog signalsekvens opstrøms for og ope- I I rabelt bundet til det DNA, der koder for FGF. I I I

7. DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af krav 1-6, I kendetegnet ved, at den er operabelt bundet til I ekspressionsstyresekvenser. I

8. Rekombinant-vektor, som indeholder, og som er effektiv til I ekspression af, DNA-sekvensen ifølge et vilkårligt af krav 1- I 7,kendetegnet ved, at den DNA-sekvens, der koder I H for FGF, er operabelt bundet til styresekvenser, som er kom- patible med bakterie- eller pattedyrværter. I

15 I

9. Rekombinant værtscelle, kendetegnet ved, at den ♦ I H er transformeret med DNA-sekvensen ifølge krav 7 eller vekto- I H ren ifølge krav 8. I