JPH07222589A - プロテインｃの調製方法 - Google Patents
プロテインｃの調製方法Info
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- JPH07222589A JPH07222589A JP6311609A JP31160994A JPH07222589A JP H07222589 A JPH07222589 A JP H07222589A JP 6311609 A JP6311609 A JP 6311609A JP 31160994 A JP31160994 A JP 31160994A JP H07222589 A JPH07222589 A JP H07222589A
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- recombinant
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 組換えタンパク質を製造することのできる細
胞を約３８〜約３９℃の温度でインキュベートすること
により、アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の
組換え宿主細胞において機能的なプロテインＣを高レベ
ルで調製させる方法、および組換えにより調製されたプ
ロテインＣ分子を組換えＡＶ１２宿主細胞にておいて約
３８〜約３９℃の温度で培養することにより、組換えに
より製造されたプロテインＣ分子のγ−カルボキシル化
のレベルを向上させる方法を提供する。 【効果】 この方法により、分子生物学、特に哺乳類の
細胞系において機能的な組換えプロテインＣが高レベル
で製造される。
胞を約３８〜約３９℃の温度でインキュベートすること
により、アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の
組換え宿主細胞において機能的なプロテインＣを高レベ
ルで調製させる方法、および組換えにより調製されたプ
ロテインＣ分子を組換えＡＶ１２宿主細胞にておいて約
３８〜約３９℃の温度で培養することにより、組換えに
より製造されたプロテインＣ分子のγ−カルボキシル化
のレベルを向上させる方法を提供する。 【効果】 この方法により、分子生物学、特に哺乳類の
細胞系において機能的な組換えプロテインＣが高レベル
で製造される。
Description
【０００１】本発明は、分子生物学、特に哺乳類の細胞
系において機能的な組換えプロテインＣを高レベルで製
造する方法に関する。
系において機能的な組換えプロテインＣを高レベルで製
造する方法に関する。
【０００２】タンパク質の多くは、成熟する過程で広範
囲にわたって翻訳後修飾を受ける。ヒトプロテインＣ
(ＨＰＣ)は、ＲＮＡの一次転写体が翻訳される過程で、
もしくは翻訳の直後に、γ−カルボキシル化、β−ヒド
ロキシル化およびグリコシル化される。シリアンハムス
ターＡＶ１２細胞系といったような細胞系の多くは、こ
ういった翻訳後修飾を有効にプロセシングし得ないこと
から、これら細胞系において製造されるプロテインＣ分
子は十分に機能的であるというわけではない。ヒト腎臓
２９３細胞系といったような他の細胞系では、十分に機
能的なプロテインＣ分子が製造されるが、これら細胞系
におけるプロテインＣ分子の発現レベルは幾分低い。本
発明は、通常では十分に機能的な分子を製造することの
ない細胞系において、十分に機能的なプロテインＣの製
造レベルを向上する方法に関する。本発明はまた、通常
でも十分に機能的な分子を製造する細胞系において、プ
ロテインＣ分子の全製造レベルを向上する方法にも関す
る。本発明の方法は、プロテインＣを産生する細胞系
を、３７℃という通常のインキュベーション温度以上の
温度で培養することに関する。
囲にわたって翻訳後修飾を受ける。ヒトプロテインＣ
(ＨＰＣ)は、ＲＮＡの一次転写体が翻訳される過程で、
もしくは翻訳の直後に、γ−カルボキシル化、β−ヒド
ロキシル化およびグリコシル化される。シリアンハムス
ターＡＶ１２細胞系といったような細胞系の多くは、こ
ういった翻訳後修飾を有効にプロセシングし得ないこと
から、これら細胞系において製造されるプロテインＣ分
子は十分に機能的であるというわけではない。ヒト腎臓
２９３細胞系といったような他の細胞系では、十分に機
能的なプロテインＣ分子が製造されるが、これら細胞系
におけるプロテインＣ分子の発現レベルは幾分低い。本
発明は、通常では十分に機能的な分子を製造することの
ない細胞系において、十分に機能的なプロテインＣの製
造レベルを向上する方法に関する。本発明はまた、通常
でも十分に機能的な分子を製造する細胞系において、プ
ロテインＣ分子の全製造レベルを向上する方法にも関す
る。本発明の方法は、プロテインＣを産生する細胞系
を、３７℃という通常のインキュベーション温度以上の
温度で培養することに関する。
【０００３】本明細書で用いる用語を以下のように定義
する。
する。
【０００４】〈アデノウイルスにより形質転換された細
胞系〉アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子産物を発現する細
胞系。
胞系〉アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子産物を発現する細
胞系。
【０００５】〈ヒトプロテインＣ〉ヒトプロテインＣチ
モーゲンおよび活性化ヒトプロテインＣ。
モーゲンおよび活性化ヒトプロテインＣ。
【０００６】〈形成期タンパク質〉ｍＲＮＡの転写体が
翻訳されることにより製造されたポリペプチドであっ
て、翻訳後修飾を受ける前のもの。ただし、グルタミン
酸残基のγ−カルボキシル化、およびアスパラギン酸残
基のヒドロキシル化といったような翻訳後修飾は、ｍＲ
ＮＡの転写体からタンパク質が完全に翻訳される前に開
始されていてもよい。
翻訳されることにより製造されたポリペプチドであっ
て、翻訳後修飾を受ける前のもの。ただし、グルタミン
酸残基のγ−カルボキシル化、およびアスパラギン酸残
基のヒドロキシル化といったような翻訳後修飾は、ｍＲ
ＮＡの転写体からタンパク質が完全に翻訳される前に開
始されていてもよい。
【０００７】〈プロテインＣ活性〉タンパク質分解、ア
ミド分解、エステル分解、および生物学的(抗凝血また
はプロフィブリン分解)活性に関与するヒトプロテイン
Ｃの特性。タンパク質抗凝血活性の試験法は、当業界に
て周知である［すなわち、グリンネル(Ｇrinnell)らの
「バイオ／テクノロジー(Ｂio／Ｔechnology) ５」(１
９８７、１１８９〜１１９２)を参照］。
ミド分解、エステル分解、および生物学的(抗凝血また
はプロフィブリン分解)活性に関与するヒトプロテイン
Ｃの特性。タンパク質抗凝血活性の試験法は、当業界に
て周知である［すなわち、グリンネル(Ｇrinnell)らの
「バイオ／テクノロジー(Ｂio／Ｔechnology) ５」(１
９８７、１１８９〜１１９２)を参照］。
【０００８】〈チモーゲン〉タンパク質分解酵素の酵素
的に不活性な前駆体。ここで使用するプロテインＣチモ
ーゲンは、分泌される１鎖または２鎖の不活性型プロテ
インＣである。
的に不活性な前駆体。ここで使用するプロテインＣチモ
ーゲンは、分泌される１鎖または２鎖の不活性型プロテ
インＣである。
【０００９】本明細書で用いるアミノ酸の略号は全て、
３７、Ｃ.Ｆ.Ｒ.、§１.８２２(ｂ)(２)(１９９０)で詳
述されているように、米国特許商標局が認可したもので
ある。
３７、Ｃ.Ｆ.Ｒ.、§１.８２２(ｂ)(２)(１９９０)で詳
述されているように、米国特許商標局が認可したもので
ある。
【００１０】本発明は、アデノウイルスにより形質転換
された哺乳類の組換え宿主細胞においてプロテインＣの
生産性を増大させる方法に関する。この方法は、アデノ
ウイルスにより形質転換された哺乳類の組換え宿主細胞
を約３８〜約３９℃の温度で培養することから成る。本
発明はまた、アデノウイルスにより形質転換された哺乳
類の組換え宿主細胞において機能的なプロテインＣの生
産性を増大させる方法にも関し、この方法もまた、宿主
細胞を約３８〜約３９℃の温度で培養することから成
る。
された哺乳類の組換え宿主細胞においてプロテインＣの
生産性を増大させる方法に関する。この方法は、アデノ
ウイルスにより形質転換された哺乳類の組換え宿主細胞
を約３８〜約３９℃の温度で培養することから成る。本
発明はまた、アデノウイルスにより形質転換された哺乳
類の組換え宿主細胞において機能的なプロテインＣの生
産性を増大させる方法にも関し、この方法もまた、宿主
細胞を約３８〜約３９℃の温度で培養することから成
る。
【００１１】組換えヒトプロテインＣを製造するのに多
くの細胞系が使用されている。しかし、ヒトプロテイン
Ｃ分子は、広範囲にわたって翻訳後修飾を受けるので、
通常の細胞系のほとんどでは、十分に機能的なプロテイ
ンＣを製造することがないか、もしくは細胞系により十
分に機能的なプロテインＣ分子が製造されても、発現ま
たは分泌レベルは依然としてかなり低いままである。例
えば、シリアンハムスターＡＶ１２細胞系では、通例、
十分な活性に必要である９つ全てのγ−カルボキシグル
タミン酸残基を含有するプロテインＣ分子を産生するこ
とはできない。他方、ヒト胚腎臓２９３細胞にて産生さ
れるプロテインＣ分子は、通例、完全にγ−カルボキシ
ル化およびβ−ヒドロキシル化されているが、これら細
胞系から産生されるヒトプロテインＣのレベルはかなり
低い。
くの細胞系が使用されている。しかし、ヒトプロテイン
Ｃ分子は、広範囲にわたって翻訳後修飾を受けるので、
通常の細胞系のほとんどでは、十分に機能的なプロテイ
ンＣを製造することがないか、もしくは細胞系により十
分に機能的なプロテインＣ分子が製造されても、発現ま
たは分泌レベルは依然としてかなり低いままである。例
えば、シリアンハムスターＡＶ１２細胞系では、通例、
十分な活性に必要である９つ全てのγ−カルボキシグル
タミン酸残基を含有するプロテインＣ分子を産生するこ
とはできない。他方、ヒト胚腎臓２９３細胞にて産生さ
れるプロテインＣ分子は、通例、完全にγ−カルボキシ
ル化およびβ−ヒドロキシル化されているが、これら細
胞系から産生されるヒトプロテインＣのレベルはかなり
低い。
【００１２】普通、哺乳類の細胞培養は３７℃でインキ
ュベートする。ヒトプロテインＣ遺伝子をコードしてい
るプラスミドを含有する、アデノウイルスにより形質転
換されたシリアンハムスターＡＶ１２−６６４細胞系
(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９５９５)を３７℃でインキュベート
した場合、この細胞系では完全にγ−カルボキシル化さ
れたプロテインＣが４０〜５０％しか製造されないこと
から、結果として粗製の培養培地におけるプロテインＣ
の機能性は低いものとなった。これと同じ細胞系を３
８.５〜３９℃でインキュベートした場合、ならし培地
における分泌されたプロテインＣの機能的な抗凝血活性
は上昇した。高温でインキュベートしたこの細胞系から
得られるプロテインＣの分泌率は、３７℃でインキュベ
ートした細胞系から得られる分泌率より約２０〜３０％
低かったが、このような分泌率の低下は、分泌されたプ
ロテインＣの機能性が増大することにより相殺される。
ュベートする。ヒトプロテインＣ遺伝子をコードしてい
るプラスミドを含有する、アデノウイルスにより形質転
換されたシリアンハムスターＡＶ１２−６６４細胞系
(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９５９５)を３７℃でインキュベート
した場合、この細胞系では完全にγ−カルボキシル化さ
れたプロテインＣが４０〜５０％しか製造されないこと
から、結果として粗製の培養培地におけるプロテインＣ
の機能性は低いものとなった。これと同じ細胞系を３
８.５〜３９℃でインキュベートした場合、ならし培地
における分泌されたプロテインＣの機能的な抗凝血活性
は上昇した。高温でインキュベートしたこの細胞系から
得られるプロテインＣの分泌率は、３７℃でインキュベ
ートした細胞系から得られる分泌率より約２０〜３０％
低かったが、このような分泌率の低下は、分泌されたプ
ロテインＣの機能性が増大することにより相殺される。
【００１３】ヒト腎臓２９３細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
５７３)は、アデノウイルス５型のトランスホーミング
遺伝子を含有して発現する形質転換された初代ヒト胚腎
臓細胞である。これらの細胞は、幾つかの重要な遺伝子
産物を発現するのに使用され、また研究用や工業的に多
くのいろいろな実験室で使用されてきた。例えば、ヤン
(Ｙan)の米国特許第４,９８１,９５２号およびバング
(Ｂang)らの米国特許第４,９９２,３７３号は共に、ヒ
トプロテインＣを産生するために２９３細胞系を使用す
ることを開示している。ヒト胚腎臓２９３細胞系は、ヒ
トプロテインＣ遺伝子をコードする発現プラスミドを担
持する場合、完全にγ−カルボキシル化されたヒトプロ
テインＣを分泌する。３７℃で培養した場合、この２９
３細胞系は、比活性が約３５０Ｕ／mgである組換えヒト
プロテインＣを分泌した。(この細胞系から得られるプ
ロテインＣは、もはや完全にγ−カルボキシル化されて
いるので、)これら組換え２９３細胞の発育温度を上げ
ても、分泌されるプロテインＣの機能性を向上する結果
とはならなかった。しかし、３８〜３９℃で発育させた
組換え２９３細胞は、３７℃で発育させた同じ細胞に比
べてプロテインＣの分泌率を増大させることを示した。
本発明の開示目的として、プロテインＣの生産性を増大
させるということは、細胞系からの総プロテインＣ分泌
を増大させるということ、または分泌されたプロテイン
Ｃの機能性を向上させることを意味し得る。
５７３)は、アデノウイルス５型のトランスホーミング
遺伝子を含有して発現する形質転換された初代ヒト胚腎
臓細胞である。これらの細胞は、幾つかの重要な遺伝子
産物を発現するのに使用され、また研究用や工業的に多
くのいろいろな実験室で使用されてきた。例えば、ヤン
(Ｙan)の米国特許第４,９８１,９５２号およびバング
(Ｂang)らの米国特許第４,９９２,３７３号は共に、ヒ
トプロテインＣを産生するために２９３細胞系を使用す
ることを開示している。ヒト胚腎臓２９３細胞系は、ヒ
トプロテインＣ遺伝子をコードする発現プラスミドを担
持する場合、完全にγ−カルボキシル化されたヒトプロ
テインＣを分泌する。３７℃で培養した場合、この２９
３細胞系は、比活性が約３５０Ｕ／mgである組換えヒト
プロテインＣを分泌した。(この細胞系から得られるプ
ロテインＣは、もはや完全にγ−カルボキシル化されて
いるので、)これら組換え２９３細胞の発育温度を上げ
ても、分泌されるプロテインＣの機能性を向上する結果
とはならなかった。しかし、３８〜３９℃で発育させた
組換え２９３細胞は、３７℃で発育させた同じ細胞に比
べてプロテインＣの分泌率を増大させることを示した。
本発明の開示目的として、プロテインＣの生産性を増大
させるということは、細胞系からの総プロテインＣ分泌
を増大させるということ、または分泌されたプロテイン
Ｃの機能性を向上させることを意味し得る。
【００１４】当業者には、本発明が、アデノウイルスに
より形質転換されたヒト胚腎臓細胞系またはアデノウイ
ルスにより形質転換されたシリアンハムスターＡＶ１２
−６６４細胞系の使用に限定されるものではないことは
理解されよう。哺乳類の細胞系の多くは、ヒトプロテイ
ンＣを製造するのに利用できる。例えば、ＨepＧ２細胞
系は、ヒトプロテインＣを製造するのに使用されてきた
ヒト肝細胞系である。またＢＨＫ(ベビーハムスターの
腎臓)細胞系、ＳＡ７細胞系、ＳＶ２０細胞系、ＦＡＺ
Ａ細胞系、およびＭＫ２細胞系も、ヒトプロテインＣを
製造するのに使用されてきた。前文中に挙げた全ての細
胞系がアデノウイルスにより形質転換された細胞系であ
るというわけではないが、当業者には、多くの哺乳類の
細胞系がアデノウイルスにより形質転換して、アデノウ
イルスにより形質転換された特定の細胞系を創製するこ
とができ、これを本発明の方法で使用できるということ
が分かる。
より形質転換されたヒト胚腎臓細胞系またはアデノウイ
ルスにより形質転換されたシリアンハムスターＡＶ１２
−６６４細胞系の使用に限定されるものではないことは
理解されよう。哺乳類の細胞系の多くは、ヒトプロテイ
ンＣを製造するのに利用できる。例えば、ＨepＧ２細胞
系は、ヒトプロテインＣを製造するのに使用されてきた
ヒト肝細胞系である。またＢＨＫ(ベビーハムスターの
腎臓)細胞系、ＳＡ７細胞系、ＳＶ２０細胞系、ＦＡＺ
Ａ細胞系、およびＭＫ２細胞系も、ヒトプロテインＣを
製造するのに使用されてきた。前文中に挙げた全ての細
胞系がアデノウイルスにより形質転換された細胞系であ
るというわけではないが、当業者には、多くの哺乳類の
細胞系がアデノウイルスにより形質転換して、アデノウ
イルスにより形質転換された特定の細胞系を創製するこ
とができ、これを本発明の方法で使用できるということ
が分かる。
【００１５】また本発明が、３８〜３９℃という温度の
みに限定されるものではないことも理解されるべきであ
る。哺乳類の発酵のほとんどは３７℃で行われるが、発
酵温度が約３８℃であると、アデノウイルスにより形質
転換された細胞におけるプロテインＣの産生がより高レ
ベルなものとなることが分かっている。そういった多く
の発酵タンクや温室内では温度が０.５℃程度上下する
ことがあることから、「約」という用語は、規定温度か
ら±０.５℃の範囲内の温度として考えるべきである。
従って、「約」３８℃という用語は、３７.５〜３８.５
℃にまで及び得る。さらに、「約」３９℃という用語
は、３８.５〜３９.５℃にまで及び得る。インキュベー
ション温度が約４０℃に達すると、哺乳類の細胞のほと
んどは十分に発育しない。本発明の方法にとって好まし
い温度は、約３８〜約３９℃に及ぶが、本発明の最も好
ましい態様は、アデノウイルスにより形質転換された細
胞系のインキュベーション温度が約３９℃の場合である
ことが見いだされている。
みに限定されるものではないことも理解されるべきであ
る。哺乳類の発酵のほとんどは３７℃で行われるが、発
酵温度が約３８℃であると、アデノウイルスにより形質
転換された細胞におけるプロテインＣの産生がより高レ
ベルなものとなることが分かっている。そういった多く
の発酵タンクや温室内では温度が０.５℃程度上下する
ことがあることから、「約」という用語は、規定温度か
ら±０.５℃の範囲内の温度として考えるべきである。
従って、「約」３８℃という用語は、３７.５〜３８.５
℃にまで及び得る。さらに、「約」３９℃という用語
は、３８.５〜３９.５℃にまで及び得る。インキュベー
ション温度が約４０℃に達すると、哺乳類の細胞のほと
んどは十分に発育しない。本発明の方法にとって好まし
い温度は、約３８〜約３９℃に及ぶが、本発明の最も好
ましい態様は、アデノウイルスにより形質転換された細
胞系のインキュベーション温度が約３９℃の場合である
ことが見いだされている。
【００１６】当業者はまた、本発明の方法により、プロ
テインＣを高いレベルで発現するクローンをより容易に
選択できるようになることも認識するであろう。例え
ば、細胞系から分泌されるプロテインＣのレベルが向上
すると、粗製の培地におけるその分子をより容易にアッ
セイできるようになることから、最も高いレベルで所望
の産物を発現するクローンを選択するのがより容易にな
る。３９℃で単離したクローンに関する発現レベルの平
均増加は、３７℃で単離したクローンに比べて、約６９
〜９３％も上がる。
テインＣを高いレベルで発現するクローンをより容易に
選択できるようになることも認識するであろう。例え
ば、細胞系から分泌されるプロテインＣのレベルが向上
すると、粗製の培地におけるその分子をより容易にアッ
セイできるようになることから、最も高いレベルで所望
の産物を発現するクローンを選択するのがより容易にな
る。３９℃で単離したクローンに関する発現レベルの平
均増加は、３７℃で単離したクローンに比べて、約６９
〜９３％も上がる。
【００１７】本発明を説明するために以下に実施例を記
載するが、これは本発明を限定しようとするものではな
い。
載するが、これは本発明を限定しようとするものではな
い。
【００１８】
【実施例】実施例 １ ２９３細胞におけるヒトプロテインＣの製造 ヤンの米国特許第４,９８１,９５２号［ここに記載され
た全ての教示は引用によって本明細書に包含される］で
詳述された当業者に周知の技法により、組換えヒトプロ
テインＣ(ｒＨＰＣ)をヒト腎臓２９３細胞にて調製し
た。ヒトプロテインＣをコードしている遺伝子は、バン
グらの米国特許第４,７７５,６２４号［引用によって本
明細書に包含される］に開示され特許請求されている。
２９３細胞にてヒトプロテインＣを発現するのに使用す
るプラスミドは、バングらの米国特許第４,９９２,３７
３号［引用によって本明細書に包含される］に開示され
ているプラスミドpＬＰＣであった。またプラスミドpＬ
ＰＣの構築は、欧州特許公開第０４４５９３９号、およ
びグリンネルらの「Ｂio／Ｔechnology ５」［１９８
７、１１８９〜１１９２］［これらは引用によって本明
細書に包含される］にも記載されている。簡単に言え
ば、プラスミドpＬＰＣを２９３細胞へトランスフェク
ションした後、安定な形質転換細胞を同定して、継代培
養する。最も高い発現レベルを示すクローンに、いろい
ろな名称(例えば、ＣＣ３５およびＣＣ３１−１)を付与
し、標準的な細胞培養条件下に発育させた。あるいはま
た、安定に形質転換された細胞系 ＧＴ−２１を調製す
るのに、プラスミドpＧＴＣを使用した。プラスミドpＧ
ＴＣの構築は、欧州特許公開第０４４５９３９号に開示
されている。３７℃で発育させた後、ヤンの米国特許第
４,９８１,９５２号に記載されている技法により、ヒト
プロテインＣを培養液から分離することができる。その
ようにして調製されたヒトプロテインＣは、不活性化チ
モーゲンの形で使用することができ、または当業者に周
知の手法により活性化することができる。また同じ条件
下、３９℃で、同じクローンを発育させた。結果を表１
に示す。
た全ての教示は引用によって本明細書に包含される］で
詳述された当業者に周知の技法により、組換えヒトプロ
テインＣ(ｒＨＰＣ)をヒト腎臓２９３細胞にて調製し
た。ヒトプロテインＣをコードしている遺伝子は、バン
グらの米国特許第４,７７５,６２４号［引用によって本
明細書に包含される］に開示され特許請求されている。
２９３細胞にてヒトプロテインＣを発現するのに使用す
るプラスミドは、バングらの米国特許第４,９９２,３７
３号［引用によって本明細書に包含される］に開示され
ているプラスミドpＬＰＣであった。またプラスミドpＬ
ＰＣの構築は、欧州特許公開第０４４５９３９号、およ
びグリンネルらの「Ｂio／Ｔechnology ５」［１９８
７、１１８９〜１１９２］［これらは引用によって本明
細書に包含される］にも記載されている。簡単に言え
ば、プラスミドpＬＰＣを２９３細胞へトランスフェク
ションした後、安定な形質転換細胞を同定して、継代培
養する。最も高い発現レベルを示すクローンに、いろい
ろな名称(例えば、ＣＣ３５およびＣＣ３１−１)を付与
し、標準的な細胞培養条件下に発育させた。あるいはま
た、安定に形質転換された細胞系 ＧＴ−２１を調製す
るのに、プラスミドpＧＴＣを使用した。プラスミドpＧ
ＴＣの構築は、欧州特許公開第０４４５９３９号に開示
されている。３７℃で発育させた後、ヤンの米国特許第
４,９８１,９５２号に記載されている技法により、ヒト
プロテインＣを培養液から分離することができる。その
ようにして調製されたヒトプロテインＣは、不活性化チ
モーゲンの形で使用することができ、または当業者に周
知の手法により活性化することができる。また同じ条件
下、３９℃で、同じクローンを発育させた。結果を表１
に示す。
【００１９】
【表１】 いろいろな細胞密度で細胞を発育させ、従って細胞(例
えば、ＣＣ３５)ごとに異なる発現レベルとなったとし
ても、３９℃における分泌の増加％が一貫して認められ
た。
えば、ＣＣ３５)ごとに異なる発現レベルとなったとし
ても、３９℃における分泌の増加％が一貫して認められ
た。
【００２０】実施例 ２ ＡＶ１２−６６４細胞におけるヒトプロテインＣの調製 ヒト胚腎臓２９３細胞ではなく、シリアンハムスターＡ
Ｖ１２−６６４細胞を使用することを除き、実質的に実
施例１の教示に従い、プラスミドpＬＰＣを用いてヒト
プロテインＣを調製した。グリンネルらの「Ｂio／Ｔec
hnology ５」［１９８７、１１８９〜１１９２］に記載
されている技法により、機能的な抗凝血活性を測定し
た。結果を表２に示す。
Ｖ１２−６６４細胞を使用することを除き、実質的に実
施例１の教示に従い、プラスミドpＬＰＣを用いてヒト
プロテインＣを調製した。グリンネルらの「Ｂio／Ｔec
hnology ５」［１９８７、１１８９〜１１９２］に記載
されている技法により、機能的な抗凝血活性を測定し
た。結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (10)
- 【請求項１】 アデノウイルスにより形質転換された哺
乳類の組換え宿主細胞においてプロテインＣの生産性を
増大させる方法であって、アデノウイルスにより形質転
換された哺乳類の該組換え宿主細胞を約３８〜約３９℃
の温度で培養することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 哺乳類の組換え宿主細胞が２９３細胞で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 インキュベーション温度が約３８℃であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 インキュベーション温度が約３９℃であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 インキュベーション温度が約３８℃であ
る、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 インキュベーション温度が約３８.５℃
である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 インキュベーション温度が約３９℃であ
る、請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】 組換えにより調製されたプロテインＣ分
子のγ−カルボキシル化のレベルを向上させる方法であ
って、組換えにより調製された該プロテインＣ分子を組
換えＡＶ１２宿主細胞において約３８〜約３９℃の温度
で培養することを特徴とする方法。 - 【請求項９】 組換えＡＶ１２宿主細胞を約３８℃で培
養する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 組換えＡＶ１２宿主細胞を約３９℃で
培養する、請求項８に記載の方法。
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