DE69403484T2 - Prüfungskit - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Testverfahren und einen Testkit zur Verwendung bei der Bestimmung der Spiegel von Arzneimittelsubstanzen in unextrahiertem Blut in Gegenwart von spezifischen Bindungsproteinen. Dieser Test ist besonders geeignet zur Bestimmung der Blutspiegel von Immunophilin-bindenden Arzneimitteln, beispielsweise Cyclosporine, Rapamycine oder FK506 Verbindungen.
• Cyclosporine umfassen eine Klasse strukturell unterschiedlicher, cyclischer, poly-N- methylierter Undecapeptide, die im allgemeinen mehr oder weniger starke immunsuppressive, antiinflammatorische, antivirale und/oder antiparasitäre Aktivität besitzen. Das erste identifizierte Cyclosporin war der Pilzmetabolit Cyclosporin A, oder Ciclosporin, dessen Struktur in The Merck Index, 11. Ausgabe, Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, USA (1989) unter der Listennummer 2759 angegeben ist. Später identifizierte Cyclosporine sind die Cyclosporine B, C, D und G, die ebenfalls in The Merck Index unter der Listennummer 2759 angegeben sind. Eine große Anzahl an synthetischen Analoga sind ebenfalls bekannt und repräsentative Beispiele sind in EP-A 0 296 123, EP-A 0484 281 und GB-A 2 222 770 beschrieben.
• Rapamycin ist ein Makrolidimmunsuppressivum, das von Streptomyces hygroscopicus gebildet wird und das sich in einer Vielzahl von Anwendungen als pharmazeutisch brauchbar erwisen hat, insbesondere als Immunsuppressivum zur Verwendung bei der Behandlung und Verhinderung der Organtransplantatabstoßung und den Autoimmunerkrankungen. Die Struktur von Rapamycin ist in R. Kesseler et al., 1993, Helv. Chim. Acta 76: 117 angegeben. Es wurde eine große Anzahl an Rapamycinderivaten synthetisiert, einschließlich beispielsweise bestimmte Acyl- und Aminoacyl-Rapamycine (US-A 4 316 885, US-A 4 650 803 und US-A 5 151 413), 27- Demethyl-Rapamycin (WO-A 92 14737), 26-Dihydro-Rapamycin (US-A 5 138 051), bestimmte Pyrazolderivate (US-A 5 164 399), bestimmte Alkoxyesterderivate (US-A 5 233 036) und 40-Oalkylierte Derivate (WO-A 94 09010). Rapamycin und dessen strukturell ähnliche Analoga und Derivate werden in dieser Beschreibung zusammen als "Rapamycine" bezeichnet.
• FK506 ist ein Makrolidimmunsuppressivum, das von Streptomyces tsukubaensis Nr 9993 gebildet wird. Die Struktur von FK506 ist im Anhang zum Merck Index unter A5 angegeben. Es ist ebenfalls eine große Anzahl an verwandten Verbindungen bekannt, die die Grundstruktur und die immunologischen Eigenschaften von FK506 aufweisen. Diese Verbindungen sind in einer großen Anzahl an Veröffentlichungen beschrieben worden, beispielsweise in EP-A 0 184 162, EP-A 0 315 973, EP-A 0 323 042, EP-A 0 423 714, EP-A 0 427 680, EP-A 0 465 426, EP-A 0 474 126, WO-A 91 13889, WO-A 91 19495, EP-A 0 484 936, EP-A 0 532 088, EP-A 0 532 089, WO-A 93 5059 und dergleichen. Diese Verbindungen werden in dieser Beschreibung kollektiv als "FK506 Verbindungen" bezeichnet.
• Aufgrund ihrer extrem brauchbaren pharmazeutischen Eigenschaften, finden Cyclosporine (und insbesondere Cyclosporin A und G), Rapamycine und FK506 Verbindungen eine breite Anwendung bei beispielsweise der Verhinderung der Transplantatabstoßung und der Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Jedoch weisen diese Verbindungen bei höheren Dosierungen Nebenwirkungen auf und daher muß ihre Konzentration im Blut innerhalb bestimmter therapeutischer Bereiche gehalten werden. Bioverfügbarkeiten und metabolische Umwandlungsraten scheinen patientenspezifisch zu sein und daher ist die Dosierung patientenspezifisch. Es ist daher notwendig, die Konzentration dieser Immunsuppressiva im Blut in regelmäßigen Intervallen zu überwachen.
• Es wurden bestimmte Testverfahren auf der Grundlage von Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) entwickelt, diese sind aber entweder umständlich in der Anwendung oder nicht spezifisch genug. Für Cyclosporin A und FK506 wurden spezifische monoklonale Antikörper entwickelt und Testverfahren, die auf den zur Verfügung gestellten Antikörpern basieren. Jedoch erfordern alle bisher bereitgestellten Testverfahren, daß die Blut- oder Plasmaprobe zuerst mit einem Lösemittel (wie Methanol) extrahiert werden muß, das dann durch Verdampfung oder Verdünnung entfernt wird. Der Antikörper wird dann zur Probe gegeben und es wird eine Analyse mittels Radioimmunassay (RIA) durchgeführt. Das auf dem spezifischen monoklonalen Antikörper basierende Testverfahren funktioniert gut, aber der erforderliche Extraktionsschritt und die anschließende Entfernung des Lösemittels können dazu führen, daß der Test weniger empfindlich und weniger genau wird, wenn man nicht sorgfältig ist. Daher muß der Test durch geschulte Techniker durchgeführt werden und ist ein zeitaufwendiges Verfahren.
• Somit besteht durch die Bedeutung der Cyclosporine, Rapamycine und FK506 Verbindungen als Pharmazeutika ein Bedarf für einfache, empfindliche Tests zur Bestimmung ihrer Konzentrationen im Blut.
• Demnach liefert die Erfindung ein Testverfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Immunophilin-bindenden Pharmazeutikums im Blut, gekennzeichnet durch Zugabe eines Bindungskompetitors, der das Pharmazeutikum aus den immunsupprimierenden Immunophilinkomplexen im Blut verdrängt, Zugabe eines Rezeptors, der an das Pharmazeutikum aber nicht signifikant an den Bindungskompetitor bindet, Abtrennung des Rezeptor-Pharmazeutikum-Komplexes aus der Probe und Bestimmung der Menge an Pharmazeutikum.
• Es wurde festgestellt, daß ein Teil einer im Blut vorkommenden Cyclosporin-, Rapamycin- oder FK506-Verbindung in Form eines Pharmazeutikum-Immunophilinkomplexes vorliegt. Falls das Pharmazeutikum mittels eines Bindungskompetitors aus dem Komplex verdrängt wird, ist es nicht notwendig, die Blutprobe mittels Methanol zu extrahieren und daher werden die Nachteile, die mit einer Methanolextraktion und Methanolentfernung verbunden sind, beseitigt. Das entstehende Testverfahren liefert genaue Ergebnisse, ist einfach und ein überraschender Durchbruch beim Testen von Cyclosporinen, Rapamycinen oder FK506- Verbindungen. Beispielsweise ist das Testverfahren zur Detektion von Konzentrationen bis hinab zu 0,7 ng (Cyclosporin A)/ml (aus Gesamtblut) mit einem Variationskoeffizienten von weniger als 30 % fähig. Dies ist viel besser als der Cyclosporin A Test, der im Handel erhältlich ist.
• Immunophiline sind eine Familie von intrazellulären Bindeproteinen, die Cyclosporine, Rapamycine oder FK506 Verbindungen binden. Man kennt derzeit zwei unterschiedliche Immunophilinfamilien, Cyclophiline, die an Cyclosporine binden, und Macrophiline, die an Rapamycine und FK506 Verbindungen binden. Die Strukturen von bestimmten Immunophilinen sind in Walkinshaw et al., 1992, Transplantation Proceedings, 24, 4(2), 8-13 beschrieben. Spezifische Beispiele sind Cyclophilin A und Macrophilin 12 (oft bekannt als FKBP-12).
• Die Menge des Bindungskompetitors, die zur Verdrängung des Pharmazeutikums aus dem Immunophilin-Pharmazeutikum-Komplex verwendet wird, variiert von Pharmazeutikum zu Pharmazeutikum und von Bindungskompetitor zu Bindungskompetitor. Jedoch kann in jedem Fall leicht ein optimaler Bereich bestimmt werden, indem das Testverfahren bei mehreren Konzentrationen (einschließlich einer Nullkontrolle) des Pharmazeutikums und mehrerer Konzentrationen des Bindungskompetitors ausgeführt wird. Die Proben werden dann zwei oder dreimal verdünnt und die Verfahren werden erneut bei jeder Verdünnung durchgeführt. Die Empfindlichkeiten der Tests werden dann verglichen und die Konzentrationen des Bindungskompetitors, die eine verringerte Empfindlichkeit ergeben, werden verworfen.
• Der erkennende Rezeptor, der an das Pharmazeutikum bindet, kann jede bestimmte Bindungsverbindung sein, wie sie in herkömmlichen Tests verwendet wird, beispielsweise polyklonale, monoklonale oder rekombinante Antikörper, Antikörperfragmente oder molekular geprägte Polymere (wie sie beispielsweise beschrieben wurden von Vlatakis et al., (1993) Nature 361: 645), vorzugsweise ist ein monoklonaler Antikörper.
• Nachdem das Pharmazeutikum aus dem Pharmazeutikum-Immunophilin-Komplex freigesetzt ist, kann die Menge des an den Rezeptor gebundenen Pharmazeutikums mittels jedes Testverfahrens bestimmt werden, vorzugsweise mit einem auf einem monoklonalen Antikörper basierenden Test, beispielsweise einem kompetitiven Test, der die Fähigkeit des Pharmazeutikums mißt, um die Bindung an den Antikörper oder den Rezeptor zu konkurrieren, oder einem nicht-kompetitiven Test. Ein kompetitiver Test verwendet vorzugsweise beispielsweise ein markiertes Pharmazeutikum (Marker) als Kompetitor für den Antikörper in Gegenwart oder Abwesenheit der Testprobe. Der Marker kann mit einer Markierung markiert werden, die zur Bereitstellung eines geeigneten Signals fähig ist, beispielsweise ein radioaktives, fluoreszierendes, lumineszentes oder kolorimetrisches Signal, wie es in der Technik bekannt ist. Alternativ dazu kann der Kompetitor für den Rezeptor ein unmarkiertes Pharmazeutikum (wahlweise das immunogene Pharmazeutikum-Protein-Konjugat, das zur Erzeugung des Antikörpers verwendet wird) sein, das auf der Oberfläche der Testkammer beschichtet vorliegt, beispielsweise in einem Enzym-gebundenen Immunosorbenttest (ELISA) oder in einem System, wo der Antikörper für das Pharmazeutikum selbst markiert ist. Der Antikörper oder Rezeptor kann frei in der Testlösung oder beschichtet auf die Wand der Testkammer vorliegen, was vom verwendeten Testsystem abhängt. In einem kompetitiven Test ist das Signal (beispielsweise die Markermenge, die an den Antikörper oder Rezeptor gebunden ist) umgekehrt proportional zur Menge des Pharmazeutikums in der Testprobe. Standardlösungen, die bekannte Konzentrationen des Pharmazeutikums enthalten, können zur Standardisierung des Tests verwendet werden, wie es gewöhnlich der Fall ist.
• Wenn ein Rezeptor erwähnt wird, der an das Pharmazeutikum aber nicht signifikant an den Bindungskompetitor bindet, ist gemeint, daß das Ausmaß der Rezeptorkreuzreaktivität zwischen Pharmazeutikum und Bindungskompetitor nicht ausreichend ist, um die Empfindlichkeit des Tests signifikant zu beeinflussen. Das genaue Maß an Kreuzreaktivität zwischen dem Bindungskompetitor und dem Pharmazeutikum (und/oder dem Bindungskompetitor und dem Marker in einem kompetitiven Test), das tolerierbar ist, variiert natürlich etwas in Abhängigkeit der relativen Affinität des Bindungskompetitors zum Immunophilin verglichen zum Pharmazeutikum: Je höher die Affinität ist, desto geringer ist die erforderliche Konzentration zur Verdrängung des Pharmazeutikums und desto größer ist die Rezeptorkreuzreaktivität, die daher ohne Beeinflussung der Genauigkeit des Tests toleriert werden kann. In der Praxis wird die Signifikanz der Kreuzreaktivität am besten durch den Vergleich von Standardkurven mittels unterschiedlicher Mengen an Bindungskompetitor gemessen, wobei nach dem Erreichen der minimalen Konzentration an Bindungskompetitor zur Verdrängung des Pharmazeutikums die Standardkurven sich nicht signifikant unterscheiden sollten, wenn die Bindungskompetitorkonzentration bis zur höchsten Menge erhöht wird, die im Test verwendet werden soll, wobei gezeigt wird, daß jede Kreuzreaktivität mit dem Antikörper im Zusammenhang mit dem Test nicht signifikant ist (falls eine Kreuzreaktivität mit dem Antikörper auftreten sollte, tendiert die Anwesenheit von hohen Konzentrationen an Bindungskompetitor dazu, die beobachtete Messung anwachsen zu lassen, da der Test Arzneimittel plus Bindungskompetitor messen würde). Die Signifikanz jeder Variation zwischen Standardkurven in Gegenwart und Abwesenheit des Bindungskompetitors kann mittels statistischer Standardverfahren ermittelt werden, beispielsweise mit einem T-Test. Als Richtlinie sollte jedoch die Rezeptorkreuzreaktivität zwischen dem Pharmazeutikum und dem Bindungskompetitor beispielsweise unter 1 % vorzugsweise unter 0,1 % liegen, wie dies in einem kompetitiven Test in Puffer gemessen wird, da der Bindungskompetitor gewöhnlich in einer viel höheren Konzentration vorliegt, als das Pharmazeutikum in der Testprobe.
• In einem Aspekt der Erfindung ist das Pharmazeutikum ein Cyclosporin und der Bindungskompetitor ist ein Cyclosporinanalogon, das an Cyclophilin bindet. Vorzugsweise ist der Bindungskompetitor [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin, das in EP-A 0 296 123 beschrieben ist, und das kompetitiv an Cyclophilin A bindet. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Cyclosporin-spezifischer, monoklonaler Antikörper, wie er beispielweise in WO-A 86 2080 beschrieben ist. Beispiele für Cyclosporine sind die Immunsuppressiva Cyclosporin A und Cyclosporin G und die anti-HIV-Replikationsverbindung [Melle&sup4;]-Ciclosporin, die in EP-A 0 484 281 beschrieben ist.
• Wenn ein kompetitiver Test zur Messung eines Cyclosporins verwendet wird, kann der Kompetitor für den Rezeptor ein an die Wand der Testkammer gebundenes Cyclosporin sein (beispielsweise ein Cyclosporin-Protein-Konjugat, wie es in WO-A 86 2080 beschrieben ist), der ein markiertes Cyclosporin (ein Marker), beispielsweise (i) ein radioaktiv markiertes Cyclosporin, beispielsweise tritiertes Dihydrocyclosporin A oder (ii) ein markiertes Derivat von [Thr²]-Ciclosporin, [(DLys)&sup8;]-Ciclosporin oder [O-2-Hydroxyethyl(D)-Ser&sup8;]-Ciclosporin, beispielsweise ein Derivat mit einer Markierung, die zur Bereitstellung eines fluoreszierenden, lumineszenten oder kolorimetrischen Signals fähig ist, beispielsweise ein Dansyl- oder Biotinylderivat, wie [ε-N-Biotinyl(D)Lys&sup8;]-Ciclosporin oder [O-(2-Biotinoyloxyethyl)Thr²]- Ciclosporin. Solche markierten Cyclosporine werden im allgemeinen hergestellt, wie dies in WO-A 86 2080 beschrieben ist, oder durch Verwendung einer der zahlreichen Kits zur Markierung von Verbindungen, die im Handel beispielsweise von Sigma oder Amersham erhältlich sind.
• Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Messung der Cyclosporinmengen umfaßt die Beschichtung der Wand einer Testkammer (beispielsweise einer Mikrotiterplatte) mit einem Ciclosporin-spezifischen monoklonalen Antikörper (beispielsweise durch Beschichten der Kammer mit einem Ziege-anti-Maus Antikörper und anschließende Bindung der Fc Region des Ciclosporin-spezifischen monoklonalen Antikörpers an den Ziege-anti-Maus Antikörper, so daß die Bindungsregion des Ciclosporin-Antikörpers frei ist). Die zu testende Probe (beispielsweise Blut von einem Patienten), der Bindungskompetitor (beispielweise [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]- Ciclosporin) und der markierte (beispielsweise Biotin-markiert) Cyclosporinmarker (beispielsweise [O-(2-Biotinoyloxyethyl)Thr²]-Ciclosporin) werden dann zusammen in der Testkammer kombiniert und für eine festgelegte Zeit inkubiert. Die Inkubationszeit ist eine Zeit, die ausreicht, um die Bindung des Antikörpers an das Pharmazeutikum und den Marker zu erlauben, beispielsweise zumindest eine Stunde, vorzugsweise mindestens zwei Stunden. Dann wird die Testkammer gewaschen. Die Menge an gebundenem Marker wird durch herkömmliche Mittel in Abhängigkeit von der verwendeten Markierung gemessen, wobei eine Biotinmarkierung beispielsweise durch einen im Handel erhältlichen Test mit Streptavidin (ein bakterielles Protein mit einer hohen Affinität zu Biotin) erkannt werden kann, das an ein Enzym, beispielsweise Meerrettichperoxidase gebunden ist, die ein Substrat unter Bildung eines fluoreszierenden, lumineszierenden oder kolorimetrischen Signals spaltet.
• In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das Pharmazeutikum eine FK506 Verbindung, beispielsweise FK506, und der Bindungskompetitor ist eine Verbindung, die an Makrophilin 12 bindet. Es kann jede geeignete Makrophilin 12 bindende Verbindung verwendet werden, die zur Verdrängung der FK506 Verbindung fähig ist. Rapamycin konkurriert mit FK506 um die Bindung an Makrophilin 12 und wird vorzugsweise als Bindungskompetitor verwendet. Geeignete Antikörper für die FK506 Verbindung können zur Detektion verwendet werden, vorzugsweise spezifische Antikörper, wie sie beispielsweise in EP-A 0 293 892 beschrieben werden. Wenn ein kompetitiver Test verwendet wird, kann der Kompetitor für den Antikörper eine FK506 Verbindung sein, die an die Testplatte gebunden ist oder vorzugsweise ein markiertes FK506 Derivat, beispielsweise ein radioaktiv markiertes Derivat, beispielsweise ein tritiertes FK506 oder ein anders markiertes Derivat, beispielsweise POD-FK506 (beschrieben als POD-markiertes FR-900506 in EP-A 0 293 892).
• In einem dritten Aspekt der Erfindung ist das Pharmazeutikum ein Rapamycin, beispielsweise Rapamycin oder das 40-O-Hydroxyethyl-Rapamycin der WO-A 94/09010, und der Bindungskompetitor ist eine Verbindung, die an Makrophilin 12 bindet. Es kann jede geeignete Makrophilin 12 bindende Verbindung verwendet werden, die zur Verdrängung des Rapamycins fähig ist. FK506 konkurriert mit Rapamycin um die Bindung an Makrophilin 12 und wird vorzugsweise als Bindungskompetitor verwendet. Der Rezeptor ist vorzugsweise ein Rapamycin-spezifischer monoklonaler Antikörper. [Anmerkung: Monoklonale Antikörper, die für ein Rapamycin selektiv sind, wurden in der Literatur nicht beschrieben. Es wurde jedoch ein hoch selektiver Antikörper mittels der Köhler-Milstein Standardtechniken hergestellt, worin das Antigen ein immunogenes Konjugat von Rapamycin ist, beispielsweise ein Rapamycin, das über eine der Hydroxylgruppen des Rapamycins an ein immunogenes Protein gebunden ist, vorzugsweise der Hydroxylgruppe, die am Cyclohexylrest des Rapamycins hängt (Position 40 von Rapamycin) oder der Hydroxylgruppe, die der Position 28 am Rapamycin entspricht. Das Rapamycin wird an das Protein gebunden, indem man zuerst ein Rapamycin herstellt, das eine aktivierte Kupplungsgruppe trägt, und dann die Kupplung des aktivierten Rapamycins an das Protein durchführt. Die aktivierte Kupplungsgruppe ist eine Gruppe, die zur direkten Reaktion mit einem Protein unter Bildung einer kovalenten Bindung fähig ist, ohne daß ein Kupplungsreagenz erforderlich ist (beispielsweise Carbodiimidreagenzien), um die Reaktion mit dem Protein zu ermöglichen, bewirken oder fördern. Beispielsweise wird 40-O-aktiviertes Rapamycin mittels Bernsteinsäureanhydrid in Gegenwart von DMAP und Pyridin unter Bildung des Rapamycinhemisuccinats (40-O-(3-Carboxy)propanoyl-rapamycin) O-acyliert, das dann mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von EDC, Et&sub3;N und CH&sub2;Cl&sub2; unter Bildung von Succinimidooxysuccinylrapamycin (40-O-(3-Carboxy)propanoylrapamycin-N- hydroxysuccinimidester) aktiviert wird. 28-O-aktiviertes Rapamycin wird analog unter Verwendung eines vorangehenden Schutzes am 40-Hydroxy und einer anschließenden Bindung an das Protein unter Bildung des 28-O-gebundenen immunogenen Konjugats hergestellt, das dann zur Herstellung eines Antikörpers verwendet werden kann, der eine unterschiedliche Spezifität zu dem aufweist, der mit dem 40-O-gebundenen Konjugat erhalten wurde, beispielsweise hoch empfindlich gegenüber Unterschieden in der Cyclohexylregion von Rapamycinist. Wenn ein kompetitiver Test verwendet wird, kann der Kompetitor für den Antikörper ein Rapamycin sein, das an die Testplatte gebunden ist, oder vorzugsweise ein markiertes Rapamycin, beispielsweise ein fluoreszenzmarkiertes Rapamycin sein, das beispielsweise durch die Umsetzung eines wie oben beschriebenen aktivierten Rapamycins mit einer markierten Gruppe, wie Biotin oder Dansyl, oder durch radioaktive Markierung des Rapamycins, beispielsweise durch Tritieren des Rapamycins, hergestellt wurde.
• Das erfindungsgemäße Testverfahren hat den Vorteil, daß es schnell und einfach mittels bioanalytischer Standardausrüstung unter Bildung von genauen und reproduzierbaren Ergebnissen ausgeführt werden kann. Es kann auch Gesamtblut verwendet werden, ohne daß eine Extraktion erforderlich ist.
• Die Erfindung liefert auch einen Testkit, der zur Detektion der Menge eines Immunophilin-bindenden Pharmazeutikums im Blut geeignet ist, wobei der Kit einen Bindungskompetitor, der das Pharmazeutikum aus den Pharmazeutikum-Immunophilin- Komplexen im Blut verdrängt, und einen Antikörper, der an das Pharmazeutikum, aber nicht signifikant an den Bindungskompetitor bindet, umfaßt.
• Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der gegenüber dem Pharmazeutikum spezifisch ist.
• Falls das Pharmazeutikum ein Cyclosporin ist, kann der Bindungskompetitor ein Cyclosporinanalogon sein, das an Cyclophilin bindet. Vorzugsweise ist der Bindungskompetitor [Thr², Leu³, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin. Vorzugsweise ist der Antikörper ein Ciclosporinspezifischer monoklonaler Antikörper, wie er in WO-A 86 2080 beschrieben ist.
• Falls das Pharmazeutikum eine FK506 Verbindung oder ein Rapamycin ist, kann der Bindungskompetitor jeweils Rapamycin oder FK506 sein, oder ein Analogon hiervon, das an Makrophilin 12 bindet. Jeder geeignete Antikörper für eine FK506 Verbindung oder Rapamycinverbindung kann verwendet werden, vorzugsweise spezifische Antikörper, wie sie beispielsweise oben für Rapamycin hergestellt wurden oder in EP-A 0 293 892 beschrieben sind.
• Der Kit kann ferner einen geeignet markierten Marker, einen Standard und Gebrauchsanleitungen enthalten. Die Markierung für den Marker kann jede geeignete Markierung sein, beispielsweise eine radioaktive, fluoreszierende oder kolorimetrische Markierung. Wo es sich anbietet, können die Komponenten des Kits in lyophilisierter Form vorliegen.
• Schließlich liefert die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine neue Verwendung für eine Immunophilin-bindende Verbindung als Immunophilinbindungskompetitor in einem Testkit oder einem Verfahren zur Messung von Blutspiegeln einer anderen Immunophilin-bindenden Verbindung, beispielsweise die Verwendung von [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin in einem Testkit oder Verfahren zur Messung von Blutspiegeln eines Cyclosporins, die Verwendung von Rapamycin in einem Testkit oder Verfahren zur Messung von Blutspiegeln einer FK506 Verbindung und die Verwendung von FK506 in einem Testkit oder Verfahren zur Messung der Blutspiegel eines Rapamycins.
• Nun werden Beispiele der Erfindung beschrieben, welche die Erfindung nicht beschränken sollen. Der Fachmann erkennt, daß Veränderungen in den genauen Konzentrationen von Reagenzien und Reaktionsbedingungen toleriert werden können, solange die Veränderungen von Test zu Test gleich sind. Andere Testsysteme, die einen Bindungskompetitor zur Freisetzung eines Pharmazeutikums von einem Immunophilin-Pharmazeutikum-Komplex verwenden, liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, denn nach einer Befreiung des Pharmazeutikums aus dem Immunophilin-Pharmazeutikum-Bindungskomplex kann es natürlich auf jede herkömmliche Weise gemessen werden.
Beispiel 1 - Cyclosporin A Test
• Kalibrierungsproben: 16 µg Cyclosporin A werden zu 1 ml 70 % V/V wäßrigem Ethanol gegeben und bei 4ºC gelagert. 50 µl der Cyclosporin A Lösung werden in 1 ml Humanblut (erhalten vom Blutspendezentrum Basel) unter Bildung einer Cyclosporin A Konzentration von 800 ng/ml verdünnt. Die Kalibrierungsproben der Konzentrationen 400 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,2 ng/ml, 3,1 ng/ml, 1,6 ng/ml, 0,8 ng/ml und 0,4 ng/ml werden dann durch aufeinanderfolgendes Verdünnen von 500 µl der Cyclosporin A Lösung in 1 ml Humanblut hergestellt. Eine Blutprobe ohne Cyclosporin A wird als Nullprobe hergestellt.
• Konditionierte Mikrotiterplatten: Jede Vertiefung von mehreren Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wird mit 100 µl Ziege-anti-Maus Antikörper (GaM IgG Fc unkonjugiert, Pierce 31170) beschichtet, der auf 10 µg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt wurde. Die Mikrotiterplatten werden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Ziege-anti-Maus Antikörper wird verworfen und 200 µl einer Blockierungslösung (2 g Rinderserumalbumin in 100 ml PBS gelöst) werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatten werden bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert und dann in einem Plattenwaschgerät mittels 3 x 300 µl einer PBS/Tween 20 Lösung (0,5 g Tween 20 in 1 Liter PBS) gewaschen. Die konditionierten Mikrotiterplatten werden bei 4ºC gelagert.
• Antikörperplatte: 1 ml einer PBS/Tween 20 Lösung wird zu einem Gläschen eines für Cyclosporin A spezifischen, monoklonalen Antikörpers in lyophilisierter Form gegeben. Der Antikörper ist in WO-A 86 2080 beschrieben und bildet einen Teil des im Handel erhältlichen Sandimmun -Kits. Die Antikörperlösung wird dann 1:10 mit PBS/Tween 20 Lösung verdünnt und 100 µl werden in ausgewählte Vertiefungen einer konditionierten Mikrotiterplatte gegeben. 100 µl PBS/Tween 20 Lösung werden in die verbleibenden Vertiefungen pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird über Nacht bei 4ºC inkubiert.
• Cyclosporinmarker: Ein Gläschen, das 1 ml eines radioaktiven dihydrierten Cyclosporin A in 96 % V/V wäßrigem Ethanol enthält, erhält man aus dem im Handel erhältlichen Sandimmun -Kit.
• Kompetitorlösung: 4,2 mg [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin, das wie in EP-A 0 296 123 beschrieben hergestellt wurde, werden in 1 ml Methanol gelöst und bei 4ºC gelagert.
• 125 µl jeder Kalibrierungsprobe (einschließlich der Nullkontrolle) werden in die Vertiefung einer nicht-konditionierten Mikrotiterplatte pipettiert. 125 µl der zu testenden Blutproben werden in jede der verbleibenden Vertiefungen pipettiert. 100 µl PBS/Tween 20 Lösung und 25 µl Cyclosporinmarker werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatte wird für 5 Minuten geschüttelt und dann bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. 3 µl der Kompetitorlösung werden in jede Vertiefung gegeben, die Mikrotiterplatte wird für 5 Minuten geschüttelt und die behandelten Kalibrierungsproben und die behandelten Blutproben werden über Nacht bei 4ºC inkubiert.
• Die Antikörperplatte wird dreimal mit 300 µl PBS/Tween 20 Lösung gewaschen und 100 µl der behandelten Kalibrierungsprobe oder der behandelten Blutprobe werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatte wird für 3 Stunden bei 4ºC inkubiert und dann dreimal in 300 µl PBS/Tween 20 Lösung gewaschen. 100 µl von in 100 ml Wasser gelöstem 1 g Natriumdodecylsulfat werden zu jeder Vertiefung gegeben, die Mikrotiterplatte wird für 5 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. 100 µl Lösung aus jeder Vertiefung werden dann mittels eines Packard 2000CA Flüssigscintillationsanalysegeräts analysiert.
• Aus den Ergebnissen, die von den Kalibrierungsproben erhalten wurden, wird eine Kalibrierungskurve erstellt. Die Kurve wird als Prozentsatz der Antikörper-Marker-Bindung verglichen zur Nullprobe dargestellt, die gegen den log der Cyclosporin A Konzentration aufgetragen ist.
• Der Variationskoeffizient für die Ergebnisse beträgt weniger als 30 % über einen Bereich von 0,7 ng Cyclosporin A/ml Blut bis 400 ng Cyclosporin A/ml Blut. Dieser Arbeitsbereich zeigt die hohe Genauigkeit, die sogar bei sehr niedrigen Konzentrationen erhalten werden kann.
• Die Beständigkeit des Tests wird durch Wiederholung bestätigt. 100 ng und 400 ng Cyclosporin A werden jeweils in 1 ml Humanblut rekonstituiert, um Konzentrationen von 100 ng/ml und 400 ng/ml zu erhalten. Jede Probe wird viermal mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Konzentration analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Genauigkeit
• Für 100 ng/ml beträgt das Mittel über alles 97,6 ng/ml, was eine mittlere Abweichung von 2,4 % ergibt. Für 400 ng/ml beträgt das Mittel über alles 417,6 ng/ml, was eine mittlere Abweichung von 4,4 % ergibt.
• Die Ergebnisse zeigen ein hohes Maß an Genauigkeit, das beständig erhalten wird.
Beispiel 2 - FK506 Test
• Mikrotiterplattenpräparation: Jede Vertiefung wird mit 100 µg/ml Ziege-anti-Kaninchen Antikörper in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) beschichtet. Die Mikrotiterplatten werden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Ziege-anti-Kaninchen Antikörper wird verworfen und 200 µl einer Blockierungslösung (2 g Rinderserumalbumin in 100 ml PBS gelöst) werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatten werden bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert und dann in einem Plattenwaschgerät mittels 3 x 300 µl einer PBS/TWEEN 20 Lösung (0,5 g Tween 20 in 1 Liter PBS) gewaschen. Die Mikrotiterplatten werden bei 4ºC gelagert.
• Einhundert µl Kaninchen-anti-FK506 Antikörper, der 1000 fach in PBS/Tween 20 Lösung verdünnt wurde, wird in jede Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatte wird bei 4ºC über Nacht inkubiert.
• Kalibrierungsproben: FK506 wird entweder in Rumangesamtblut oder in PBS/Tween 20 auf 200 ng/ml, 20 ng/ml und 2 ng/ml verdünnt. Eine Blutprobe ohne FK506 wird als Nullprobe hergestellt.
• Kompetitorlösung: Mit Tritium markiertes FK506 wird verdünnt, um 10000 cpm in 25 µl zu erhalten.
• Test: 125 µl der Kalibrierungsprobe in Gesamtblut oder in Puffer werden zu 100 µl PBS/Tween 20 gegeben und gemischt, der 50, 10, 1 und 0 µg/ml Rapamycin enthält. 25 µl der Kompetitorlösung werden in jede Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatte wird für 3 h bei 4ºC inkubiert und dann dreimal mit 300 µl PBS/Tween 20 gewaschen. 100 µl von in 100 ml Wasser gelöstes 1 g Natriumdodecylsulfat wird zu jeder Vertiefung gegeben und die Mikrotiterplatte wird für 5 Minuten und dann für 15 Minuten bei 37ºC geschüttelt. 100 µl Lösung aus jeder Vertiefung werden dann mit einem Packard 2000CA Flüssigscintillationsanalysegerät analysiert.
• Ergebnisse: Der Test mittels Proben in Puffer ergibt ähnliche Standardkurven mit unterschiedlichen Rapamycinkonzentrationen als Verdrängungsmittel. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Kaninchen-anti-FK506 Antikörper nicht mit Rapamycin kreuzreagiert.
• Der Test mittels Proben in Gesamtblut ergibt ein sehr niedriges Signal, wenn kein Rapamycin als Verdrängungsmittel verwendet wird, da FK506 an die in Gesamtblut enthaltenen Bindungsproteine gebunden ist und nicht für die Reaktion mit dem Antikörper verfügbar ist. Wenn Rapamycin als Bindungskompetitor für Makrophilin zugegeben wird, sind die erhaltenen Standardkurven ähnlich zu denen, die in Puffer erhalten wurden.

Claims (12)

1. Testverfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Immunophilin-bindenden Pharmazeutikums im Blut, gekennzeichnet durch die Zugabe eines Bindungskompetitors, der das Pharmazeutikum aus den Immunosuppresivum-Immunophilinkomplexen im Blut verdrängt, die Zugabe eines Rezeptors, der an das Pharmazeutikum aber nicht signifikant an den Bindungskompetitor bindet, Abtrennung des Rezeptor-Pharmazeutikum-Komplexes aus der Probe und Bestimmung der Menge an Pharmazeutikum.

2. Testverfahren nach Anspruch 1, worin das Immunophilin-bindende Pharmazeutikum Ciclosporin ist, der Bindungskompetitor [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin ist und der Rezeptor ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Testverfahren nach Anspruch 1, worin das Immunophilin-bindende Pharmazeutikum FK506 ist, der Bindungskompetitor Rapamycin ist und der Rezeptor ein monoklonaler Antikörper ist.

4. Testverfahren nach Anspuch 1, worin das Immunophilin-bindende Pharmazeutikum Rapamycin oder 40-Hydroxyethylrapamycin ist, der Bindungskompetitor FK506 ist und der Rezeptor ein monokloner Antikörper ist.

5. Testkit, der zur Detektion der Menge an Immunophilin-bindendem Pharmazeutikum im Blut geeignet ist, wobei der Kit umfaßt einen Bindungskompetitor, der das Pharmazeutikum aus den Pharmazeutikum-Immunophilin-Komplexen im Blut verdrängt und einen Rezeptor, der an das Pharmazeutikum aber nicht signifikant an den Bindungskompetitor bindet.

6. Testkit nach Anspruch 5, worin das Immunophilin-bindende Pharmazeutikum Ciclosporin ist, der Bindungskompetitor [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin ist und der Rezeptor ein monoklonaler Antikörper ist.

7. Testkit nach Anspruch 5, worin das Immunophilin-bindende Pharmazeutikum FK506 ist, der Bindungskompetitor Rapamycin ist und der Rezeptor ein monoklonaler Antikörper ist.

8. Testkit nach Anspuch 5, worin das Immunophilin-bindende Pharmazeutikum Rapamycin oder 40-Hydroxyethylrapamycin ist, der Bindungskompetitor FK506 ist und der Rezeptor ein monokloner Antikörper ist.

9. Verwendung einer Immunophilin-bindenden Verbindung als Immunophilinbindungskompetitor in einem Testkit oder Verfahren zur Messung des Blutspiegels einer anderen Immunophilin-bindenden Verbindung.

10. Verwendung nach Anspruch 9 von [Thr², Leu&sup5;, D-Hiv&sup8;, Leu¹&sup0;]-Ciclosporin in einem Testkit oder Verfahren zur Messung des Blutspiegels eines Cyclosporins.

11. Verwendung nach Anspruch 9 von Rapamycin in einem Testkit oder Verfahren zur Messung des Blutspiegels einer FK506 Verbindung.

12. Verwendung nach Anspruch 9 von FK506 in einem Testkit oder Verfahren zur Messung des Blutspiegels von einem Rapamycin.