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CN104764883A - 一种检测环孢霉素a浓度的免疫分析方法和试剂盒 - Google Patents

一种检测环孢霉素a浓度的免疫分析方法和试剂盒 Download PDF

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CN104764883A
CN104764883A CN201510148799.3A CN201510148799A CN104764883A CN 104764883 A CN104764883 A CN 104764883A CN 201510148799 A CN201510148799 A CN 201510148799A CN 104764883 A CN104764883 A CN 104764883A
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ciclosporin
csa
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吴冯波
史小娟
乜永艳
钱芸琦
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SHANGHAI YUNZE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法，该免疫分析方法采用环孢霉素C为竞争分子定量检测样品中的环孢霉素A浓度。本发明还提供了一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析试剂盒。采用本发明的方法检测环孢霉素A，可以使用亲合性较低的抗环孢霉素A抗体获得显著改善的分析灵敏度，检测结果准确度高，精密性好。

Description

一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法和试剂盒
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体地，是一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法和试剂盒。
背景技术
环孢霉素A(Cyclosporine A，CsA)是一种由11个氨基酸组成的亲脂性环状化合物，其作为一种高效的免疫抑制剂，被广泛应用于抑制器官移植病人的免疫排斥反应，也常用于治疗牛皮癣、遗传性皮炎、坏疽性脓皮病、荨麻疹、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
自80年代初期CsA应用于临床以来，CsA在移植排异治疗中发挥了重大作用，在全球范围内推动了器官移植术的发展。尽管CsA的使用往往伴有多种不良反应，至今全球仍有数十万例患者使用CsA抑制移植后的排异反应。
由于不同患者对CsA的吸收和代谢往往表现出很大的个体差异(Hamwi A,Salomon A,Steinbrugger R,et al,Cyclosporine Metabolism in Patients After Kidney,Bone Marrow,Heart-Lung,and Liver Transplantation in the Early and LatePosttransplant Periods,Am J Clin Pathol.,2000；114:536-543)，即使使用相同的药物剂量，不同患者的CsA血药浓度也常差异显著；由于CsA的肝、肾毒性及其狭窄的治疗剂量范围，CsA的药效与药毒均与血药浓度密切相关，因此，准确检测CsA的血药浓度对于控制CsA的药毒性和发挥CsA的抗排斥作用均具有重要参考价值。
目前，检测CsA血药浓度的方法主要有高压液相色谱法(HPLC)和多种免疫检测方法(王燕,卜雯婷,李鹏飞，等；常用免疫抑制剂人血中定量监测方法研究进展，中国临床药理学与治疗学，2011,16:830-836)，如：放射免疫分析法、微粒子化学发光法、荧光偏振法、酶联免疫分析法和酶放大免疫分析法。HPLC法能准确检测CsA原药和多种CsA代谢产物的浓度，但由于CsA紫外吸收微弱，通常需要萃取以浓缩血药，操作繁琐，不宜用于常规的临床检测，因此免疫检测是目前临床常用的检测方法。
CsA的免疫检测可使用抗CsA多克隆抗体和单克隆抗体。抗CsA多克隆抗体不可避免地存在与多种CsA代谢物较大程度的交叉反应，使用多克隆抗体的免疫分析方法检测的是CsA原药及其多种CsA代谢物的浓度。血液中不同CsA代谢物的免疫抑制活性差别很大，往往显著低于CsA原药，因此基于多克隆抗体的免疫分析方法检测的血药浓度与CsA药效的相关性不够明确，而只有使用更特异的抗CsA单克隆抗体才可望将CsA代谢物的交叉反应降至低水平；因此，抗CsA单克隆抗体是建立CsA检测方法的首选。
为获得临床检测所需要的抗CsA单克隆抗体，国内外多个研究机构和高校在CsA免疫原合成、抗体制备上做了大量工作(戴晓雁,黄文才,刘一超；环孢菌素A免疫抗原合成进展,精细化工,2000,17,441-444；Paprica P.A,MargaritisA.and Petersen N.O；Preparation of Novel Cyclosporin A Derivatives,BioconjugateChem.1992,3,32-36)，但这些工作多停留上免疫原或CsA衍生物合成的层面上，没有获得能满足CsA临床检测要求的单克隆抗体，其中亲合性不足是抗CsA抗体研制的主要障碍，其原因主要是含有CsA的免疫原对免疫动物T淋巴细胞功能强烈的抑制作用，该作用减弱了T淋巴细胞对B淋巴细胞的抗原呈递作用，降低了T淋巴细胞分泌淋巴因子的能力，从而抑制了免疫动物的体液免疫功能，降低了其B细胞产生高亲合性抗体的能力；因此，尽管CsA的血药浓度通常在200ng/ml-400ng/ml的较高水平，对于缺少高亲合性抗CsA抗体的试剂研发工作者来说，建立足够灵敏的CsA检测方法仍然是一个严峻的挑战。
发明内容
本申请的发明人在对建立CsA检测方法的长期研究中意外发现，以结构与CsA有微小区别的环孢霉素C(CsC)作为竞争分子建立CsA的免疫检测方法，可以显著地改善CsA的分析灵敏度，从而可以使用亲合性较低的抗CsA单克隆抗体实现灵敏的CsA检测。
因此，本发明的第一个目的在于建立一种灵敏的全血CsA检测方法，其特点是以CsC为竞争分子，可以使用亲合性较低的抗CsA单克隆抗体实现灵敏的CsA检测。
本发明的第二个目的在于提供一种检测CsA浓度的免疫分析试剂盒。
为了实现上述技术目的，本发明采用了如下的技术方案：
根据本发明的第一个方面，一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法，采用环孢霉素C为竞争分子定量检测样品中的环孢霉素A浓度。
根据本发明，所述方法包括以下步骤：
A)制备环孢霉素A-蛋白免疫原；
B)合成环孢霉素C-蛋白复合物，将其包被微孔，使微孔表面带有环孢霉素C分子；
C)标记抗环孢霉素A单克隆抗体；
D)以微孔表面的环孢霉素C-蛋白复合物为竞争分子，以标记的抗环孢霉素A单克隆抗体为检测试剂，通过竞争免疫分析定量检测样品中环孢霉素A浓度。
根据本发明，所述步骤A)中所述的环孢霉素A-蛋白免疫原的制备包括以下步骤：
A)通过光化学反应使环孢霉素A与4-苯甲酰苯甲酸连接，从而在环孢霉素A分子上引入羧基；
B)以EDCI或EDCI-NHS活化环孢霉素A分子上引入的羧基；
C)将活化后的环孢霉素A与蛋白载体偶联，获得环孢霉素A-蛋白免疫原。
根据本发明，所述的蛋白载体选自：各种动物来源的血清白蛋白、血清γ-球蛋白、甲状腺球蛋白，卵清蛋白、或钥孔血蓝蛋白。
根据本发明，所述步骤C)中所述的环孢霉素C-蛋白复合物的合成包括以下步骤：
A)将丁二酸酐与环孢霉素C反应，使环孢霉素C羧基化；
B)通过EDCI或EDCI-NHS将羧基化的环孢霉素C与载体蛋白交联。
根据本发明，所述步骤D)中所述标记抗环孢霉素A单克隆抗体的标记物选自：酶、放射性同位素、荧光物质、化学发光物质或稀土离子。
根据本发明的优选实施例，所述标记物为Eu3+离子。
根据本发明，所述通过竞争免疫分析定量检测样品中环孢霉素A浓度包括以下步骤：
A)使用样品前处理试剂处理样品；
B)在包被有环孢霉素C-蛋白的微孔内加入上述处理后的环孢霉素A校准品或样品，以及标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，形成免疫复合物；
C)洗涤除去未结合的标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，检测微孔表面免疫复合物中标记的抗环孢霉素A单克隆抗体产生的信号；
D)根据上述步骤获得的校准曲线和各样品信号强度，对样品中环孢霉素A进行定量。
根据本发明，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂。
根据本发明的第二个方面，一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括：包被有环孢霉素C-蛋白复合物的固相微孔板，铕离子标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，环孢霉素A校准品，洗涤液，分析缓冲液，荧光增强液，样品前处理试剂。
根据本发明，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂。
根据本发明，所述全血溶解剂选自：皂素、吐温、Triton、SDS等表面活性剂中一种或几种的组合，或尿素、盐酸胍、蛋白水解酶等蛋白变性剂中一种或几种的组合，所述全血沉降剂选自：二价金属离子的甲醇-乙二醇混合溶液，或二价金属离子的DMSO-乙二醇混合溶液，或二价金属离子-乙二醇混合溶液。
根据本发明的优选实施例，所述全血溶解剂含0.5％-2％(w/v)的皂素，所述全血沉降剂含10mM-100mM硫酸锌，70％-90％(v/v)甲醇，10％-30％(v/v)乙二醇。
本发明的有益效果如下：
1)以CsC作为竞争分子建立CsA的免疫检测方法，由于抗CsA单克隆抗体结合CsC的亲合性弱于CsA，样品中微量的CsA便可有效抑制抗体与CsC的结合，使CsA的检测灵敏度得以显著改善；
2)基于本发明所述方法可显著改善CsA的检测灵敏度，因此可以使用亲合性较低的抗体建立检测方法，这对于难以获得高亲合力抗体的免疫抑制剂的检测，具有很高的实用价值；
3)本发明所述方法以CsC作为竞争分子建立CsA的免疫分析方法，可以利用CsC环状结构支链上的活泼羟基，通过丁二酸酐法简单、有效地使其羧基化，反应产物结构单一，转化率高，使CsC-蛋白复合物的制备变得简单、可控；而传统的CsA羧基化方法需要在强烈的光化学反应条件下才能完成，且反应产物成份复杂。
附图说明
图1为环孢霉素A(CsA)结构式。
图2为环孢霉素C(CsC)结构式。
图3为羧基化后的环孢霉素C的LC-MS质谱图。
图4为羧基化后的环孢霉素A的LC-MS质谱图。
图5为基于CsC-BSA、CsA-BSA包被的CsA-TRFIA校准曲线及其精密度图。
图6为以CsC为竞争分子的CsA-TRFIA与ABBOTT CsA-CMIA试剂测量47份临床标本的相关性图。
图7为以CsA为竞争分子的CsA-TRFIA与ABBOTT CsA-CMIA试剂测量47份临床标本的相关性图。
具体实施方式
本发明涉及的缩略词说明：
CsC：环孢霉素C；
CsA：环孢霉素A；
IgG：γ-球蛋白；
BSA：牛血清白蛋白；
KLH：钥孔血蓝蛋白；
CsC-BSA：环孢霉素C-BSA复合物；
CsA-BSA：环孢霉素A-BSA复合物；
DMF：N,N二甲基甲酰胺；
EDCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)；
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)；
MES：2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic acid)；
Sulfo-NHS：N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-Hydroxysulfo succinimide)；
TSA缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 7.60)，含0.9％NaCl，0.05％NaN3；
PBS：磷酸盐缓冲液；
TRFIA：时间分辨荧光免疫测定(Time-resolved fluorescence immunoassay)；
DTPAA-Eu：二乙三胺五乙酸双环酐-铕(Diethylenetriaminepentaacetic aciddianhydride-Eu3+)；
BBa：4-苯甲酰苯甲酸(4-Benzoylbenzoic acid)；
NaN3：叠氮化钠，一种防腐剂。
本发明涉及的术语说明：
所述的免疫原指能刺激机体免疫细胞产生免疫应答的物质。
所述的CsA为小分子，其本身不具有免疫原性，但其与蛋白质复合后可获得刺激机体产生抗CsA抗体的能力，具有免疫原性。
所述的CsC是一种CsA的结构类似物，其与CsA在结构上的主要差别在于CsC的氨基酸环状结构支链上带有一个羟基(-OH)(图1和图2)，这种微小的结构差别使CsC与抗CsA单克隆抗体的亲合力显著低于CsA与抗CsA单克隆抗体的亲合力。
所述的CsC-蛋白复合物指通过化学方法使CsC与蛋白质偶联制得的复合物；本发明中，制备该复合物的目的是通过蛋白质对微孔表面的吸附实现CsC在微孔表面的固定。
所述的包被，指通过CsC-蛋白复合物对微孔表面的吸附实现CsC在微孔表面固定的过程。
所述的标记抗CsA单克隆抗体，指使用示踪物质与抗CsA单克隆抗体连接的过程；所述的示踪物质包括但不限于酶、放射性同位素、荧光物质、化学发光物质或稀土离子。
所述的竞争免疫分析指样品待测物与固定量的同种或结构类似的待测物共同竞争结合限量的抗待测物抗体，以实现样品待测物检测的免疫分析方法。
本发明所述的采用环孢霉素C作为竞争分子检测环孢霉素A浓度的免疫分析试剂盒，其主要组份包括环孢霉素C-蛋白复合物包被的微孔板、标记的抗环孢霉素A抗体、样品前处理试剂、校准品和分析缓冲液。
其中，所述的环孢霉素C-蛋白复合物包被的微孔板采用以下方法制备：通过丁二酸酐法使CsC的侧链羟基羧基化(生成环孢霉素C-半琥珀酸)，以EDCI或EDCI-NHS法使羧基化的CsC与载体蛋白交联。得到的环孢霉素C-蛋白复合物可通过物理吸附法固定于疏水的微孔表面，也可以通过蛋白所带的多种官能团，如-COOH，-NH2，-OH等，以化学连接方式结合于其它固相载体(如磁微球)表面。
其中，所述的抗环孢霉素A抗体可以是完整的抗体分子或保留完整抗体结合能力的抗体片段，可以是多克隆抗体或单克隆抗体；为降低交叉反应，优选单克隆抗体。
所述环孢霉素A免疫原的制备方法，包括如下步骤：
A)在300W碘镓灯照射下使CsA的-OH与BBa发生光化学反应，生成带羧基的CsA-BBa；
B)以EDCI或EDCI-NHS法将活化的CsA-BBa与载体蛋白偶联，形成具有免疫原性的CsA-蛋白复合物。
其中，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂，其作用是溶解血液细胞，释放蛋白所结合CsA。所述全血溶解剂由表面活性剂组成；所述全血沉降剂由含二价金属离子的有机溶剂组成，或由尿素、盐酸胍、蛋白水解酶等蛋白变性剂中一种或几种组成。
其中，所述的校准品指含有已知CsA浓度的均质全血溶液，用以对样品CsA浓度进行定量；以全血为基质配制校准品可以降低校准品与样品二者基质差异(组份、pH、粘度等)对检测的影响。全血可以是抗凝的人全血或动物全血，经冻融使细胞破裂，成为均质溶液。
其中，所述的分析缓冲液由蛋白质、表面活性剂、防腐剂、抗干扰试剂组成，其作用在于为免疫反应提供一合适的介质，缓解样品中多种干扰成份(类风湿因子、异嗜性抗体)对检测的影响。
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明；应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
以下实施例中，除特别注明外，所涉及的％为质量体积比(w/v)。
实施例1包被用CsC-BSA蛋白复合物的制备
1.1羧基化环孢霉素C
取环孢霉素C 35mg溶于1ml二氯甲烷，加入丁二酸酐12mg，4-二甲氨基吡啶5.9mg，三乙胺8μl，室温下搅拌反应24小时。负压抽干，去除有机溶剂，用3ml二氯甲烷溶解残留物。以0.1M稀盐酸洗涤二次，收集有机相；再用饱和NaCl溶液洗涤一次。移取有机相至试剂瓶内，以无水硫酸钠充分干燥后，回收有机相，减压旋干，得到灰白色羧基化的环孢霉素C(环孢霉素C-半琥珀酸)约33.7mg。
羧基化后的环孢霉素C的LC-MS质谱图如图3所示，图3中丰度最大的峰对应为目标产物环孢霉素C-半琥珀酸，分子量为1318.2,与目标产物的理论分子量一致；制备的CsC-COOH纯度约96.5％。
1.2环孢霉素C羧基活化
取实施例1.1制备的环孢霉素C-半琥珀酸33mg溶于1ml DMF，加入9mgEDCI和14mg的NHS，室温下搅拌反应6小时。加入0.1N盐酸洗涤1次。取有机相用饱和NaCl溶液洗涤2次。取有机相负压旋干，溶解于0.5ml DMF中。
1.3 CsC-BSA偶联
称取100mg BSA溶于10ml 0.1M PBS(pH8.0)中，加入1ml甲醇。将实施例1.2中获得的环孢霉素C羧基活化产物滴加到该蛋白溶液中，室温下磁力搅拌反应16小时。0.45微米滤器过滤，产物经超滤或透析纯化，得到CsC-BSA复合物。
实施例2包被用CsA-BSA蛋白复合物的制备
2.1羧基化环孢霉素A
于15ml石英试管内加入60mg CsA和12mg 4-苯甲酰苯甲酸(BBa)，以6ml丙酮溶解后，持续通入氮气鼓泡20分钟。开启碘镓灯灯管(300W,灯管距离试管10cm)，在磁搅拌和氮气环境下反应8小时。以三氯甲烷：甲醇(体积比85：15)为展开剂，在制备硅胶板上层析分离纯化CsA-BBa产物。加入3ml DMF洗涤，过滤，取有机相负压旋干，得到浅灰色固体23.5mg。
羧基化后的环孢霉素A的LC-MS质谱图如图4所示，图4中丰度最大的峰对应为目标产物CsA-BBa，分子量为1429.2，与目标产物的理论分子量一致；制备的CsA-BBa纯度约72.8％。
2.2 CsA羧基的活化
取实施例2.1中得到的环孢霉素A羧基化产物(CsA-BBa)15mg溶于1mlDMF中，加入10mg EDCI和50mg NHS，室温下搅拌反应1小时。
2.3 CsA-BSA偶联
称取60mg BSA加入到10ml 0.1M PBS(pH8.0)中，加入1ml甲醇。滴加实施例2.2中获得的经活化的环孢霉素A到BSA溶液中，室温下磁搅拌反应16小时。以0.45微米滤器过滤，交联后产物经过超滤或透析纯化，得到CsA-BSA复合物。
实施例3 CsA-KLH免疫原的制备
参照实施例2所述方法，以KLH替代BSA，制备CsA-KLH免疫原。
实施例4基于CsC-BSA或CsA-BSA包被微孔的CsA-TRFIA
4.1检测原理
以CsC-BSA为包被物，以铕离子标记的抗环孢霉素A单克隆抗体为标记物的CsA-TRFIA检测原理：
在CsC-BSA包被的微孔内依次加入经处理后的环孢霉素A校准品或待测样品和铕离子(Eu3+)标记的抗环孢霉素A抗体，校准品或样品中的CsA与微孔表面的CsC竞争结合限量的抗CsA单克隆抗体，于微孔内表面形成免疫复合物；洗涤除去未结合的铕离子标记抗体，免疫复合物上的Eu3+经解离增强后形成稳定的荧光配合物，以荧光强度对CsA浓度建立标准曲线，通过校准曲线确定样品中CsA浓度。
为作对比，以CsA-BSA代替CsC-BSA，按上述原理建立以CsA为竞争分子的CsA-TRFIA。
4.2组成
以CsC-BSA为包被物，以铕离子标记的抗环孢霉素A单克隆抗体为标记物的试剂盒包括如下组分：
1)包被有CsC-BSA的微孔板：CsC-BSA包被浓度为1μg/ml-10μg/ml；
2)检测抗体：铕离子标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，工作浓度为0.4μg/ml-2μg/ml；
3)环孢霉素A校准品：EDTA抗凝的人全血配制，各点浓度约0ng/ml、40ng/ml、150ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml；
4)洗涤液：0.05M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，含0.9％氯化钠、0.05％吐温-20、0.05％叠氮化钠；
5)分析缓冲液：0.05M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，含0.9％氯化钠、0.1％吐温-20、0.05％叠氮化钠、0.5％BSA；
6)荧光增强液：含4mg/L的4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮(β-NTA)、4mg/L三辛基氧化磷、1g/L的Triton X-100和17g/L邻苯二甲酸氢钾和0.6％(v/v)的冰乙酸的水溶液；
7)样品前处理试剂：含1％皂素的全血溶解剂、含50mM硫酸锌的甲醇(70％，v/v)和乙二醇(20％，v/v)混合液组成的全血沉降剂。
4.3试剂盒各组分的制备
4.3.1CsC-BSA包被板的制备
取实施例1制备的CsC-BSA，以0.01M的PBS(pH7.4)稀释至5μg/ml，200μl/孔，4℃包被过夜。甩掉包被液，拍干，每孔加入250μl封闭液(含1％BSA的PBS，pH7.4)，4℃静置过夜。洗涤一次，拍干，抽干，真空密封保存。
4.3.2稀土离子铕标记的抗环孢霉素A单克隆抗体的制备
采用商品化的抗环孢霉素A单克隆抗体(Abcam公司，Kd＝10-8)，以Scatehard作图法评估抗体亲和常数(万文徽，单克隆抗体亲和常数的测定，单克隆抗休通讯，1993,9,72-75)，结果显示其结合CsA、CsC的亲和常数(Ka)分别为8.98×107M-1、1.02×107M-1。
取上述抗环孢霉素A单克隆抗体1mg，以0.05M NaHCO3-Na2CO3缓冲液透析(pH 9.7，含0.9％NaCl)。取出抗体溶液，与0.3mg的DTPAA-Eu混合，4℃避光反应6小时。以TSA缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.85，含NaCl 0.9％，NaN30.05％)作为洗脱液，以Sephadex G50柱(1.5cm×60cm)分离DTPAA-Eu标记的抗环孢霉素A抗体，得8.6ml纯化的标记抗体。
4.3.3环孢霉素A校准品的制备
精确称取环孢霉素A标准品，溶于甲醇，配制10μg/ml的环孢霉素A溶液。以不含环孢霉素免疫抑制剂的正常人全血冻融裂解物为基质，加入0.1％的叠氮钠，稀释环孢霉素A溶液至各浓度，各校准品浓度分别为0ng/ml、40ng/ml、150ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml。
4.4试剂盒评估
4.4.1人全血样品的前处理
将环孢霉素A校准品或样品、全血溶解剂和全血沉降剂，分别按100μL/50μL/200μL混合，旋涡混匀30秒钟，于13000rpm离心5分钟，取澄清透明的上清液为待测样品。
4.4.2检测
在包被有CsC-BSA的微孔板内依次加入分析缓冲液50μL、处理后的环孢霉素A校准品或待测样品50μL和铕离子标记的抗环孢霉素A抗体50μL，室温下振荡反应1小时。以洗涤液(含0.05％吐温-20的TSA溶液)洗板6次，拍干，加入增强液150μL/孔，振荡5分钟后，在时间分辨荧光分析仪(PerkinElmer Victor 1420)上检测荧光。
4.4.3 CsA浓度计算
以环孢霉素A校准品浓度对荧光强度(Counts per Second,CPS)作图，建立校准曲线；将待测样品荧光强度值代入校准曲线，计算样品浓度。
实施例5以CsC-BSA、CsA-BSA为竞争分子的CsA-TRFIA检测CsA
以0.01M的PBS(pH7.4)为包被稀释液，分别稀释CsC-BSA、CsA-BSA蛋白复合物至浓度10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml，200μl/孔包被过夜(4℃)；去除包被液，加入240μl封闭液(0.01M PBS，pH 7.5，含1％BSA，0.02％(v/v)Tween-20，0.05％NaN3，5％蔗糖)，4℃静置过夜。去除包被液，拍干，真空抽干，得到3种不同包被浓度的CsC-BSA及CsA-BSA板条。
采用上述包被的板条，按照实施例4.4.2所述步骤测试环孢霉素A校准品，得到以下校准曲线(图5)。
以平行12孔测定校准品A点(CsA浓度为“0”)，测得荧光强度值，计算其均值(x)及标准差(s)，以(x-2s)在图5所示的校准曲线上对应的浓度值为检测灵敏度。CsC-BSA包被浓度为10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml时检测灵敏度分别为9.1ng/ml、6.6ng/ml、5.9ng/ml，CsA-BSA包被浓度为10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml时检测灵敏度分别为78.7ng/ml、52.6ng/ml、30.0ng/ml。
以基于CsC-BSA或CsA-BSA包被的CsA-TRFIA平行12孔测定各不同浓度的校准品，以各校准品荧光强度的变异系数(标准差/均值)对校准品浓度作图(图5)，基于CsC-BSA或CsA-BSA包被的CsA-TRFIA的CV值均处于5.1％-13.6％之间，二种方法具有相似的检测精密性。
由图5可知，以CsC为固相竞争分子的CsA-TRFIA，其检测灵敏度显著优于以CsA为固相竞争分子的的检测方法，这主要得益于待测物CsA对抗体结合CsC的高效阻断作用，即：由于CsA与抗体的结合力远大于CsC与抗体的结合力，微量的CsA便可以有效抑制抗体与固相CsC分子的结合，从而使CsA检测灵敏度得以有效改善。
以上数据还表明，包被CsC-BSA复合物的CsA-TRFIA可以获得与包被CsA-BSA的CsA-TRFIA基本一致的荧光强度；尽管抗CsA抗体结合CsC的亲合力较低，但由于CsC分子的活泼羟基使其容易获得结构明确、组成单一的羧基化产物，从而得以制备高偶联率的CsC-BSA复合物，其包被的微孔表面含有丰富的CsC分子，因而可获得足够高的荧光强度。
实施例6特异性检测
选择21种与环孢霉素A有相似结构或功能的化合物，调整其浓度为50-1000倍常规剂量，加入全血样品中，测试其与以CsC为固相竞争分子的CsA-TRFIA的交叉反应，计算交叉反应率。交叉反应率(％)＝[IC50(CsA浓度)/IC50(交叉反应物浓度)]×100％。结果示于表1。
表1
表1数据表明，在以CsC为竞争分子的CsA-TRFIA中，除了CsC、CsD和CsA代谢物M1、M2有轻度交叉反应外，以CsC为竞争分子的CsA-TRFIA对其它化合物的交叉反应率均低于1％，体内CsA代谢物、临床常见药物以及CsA所含杂质均不会影响CsA测量值的准确性，表明采用本方法检测CsA具有高度的临床特异性。
实施例7、相关性分析
分别以CsC、CsA为竞争分子的CsA-TRFIA试剂检测ABBOTT ARCHITECT i2000CsA-CMIA(Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)试剂测定过的47份肝移植术后患者(服用过环孢霉素A)全血样品，以Origin软件对CsA-TRFIA与ABBOTT CsA-CMIA测量值作相关性分析，结果示于图6和图7。数据表明，以CsC、CsA为竞争分子的CsA-TRFIA与国际上最被认可的ABBOTT CsA-CMIA检测47份临床样品的相关系数(R值)分别为0.980和0.935，以CsC为竞争分子的CsA-TRFIA与ABBOTT CsA-CMIA检测值的相关性明显优于以CsA为竞争分子的CsA-TRFIA，这主要得益于本发明所述方法对低CsA浓度样品的检测值更加准确，而以CsA为竞争分子的CsA-TRFIA则因为检测灵敏度的不足，不能准确检测低浓度的CsA样品，尤其是CsA浓度<300ng/mL的样品。
综上所述，本发明提供了一种以CsC为竞争分子检测样品中CsA浓度的方法及免疫分析试剂盒。本发明所述方法可以使用亲合性较低的抗环孢霉素A抗体获得明显改善的检测灵敏度，检测结果准确、可靠。本发明所述方法对于其它难以获得高亲合力抗体的免疫抑制剂的检测也具有参考价值。

Claims (14)

1.一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析方法，其特征在于，采用环孢霉素C为竞争分子定量检测样品中的环孢霉素A浓度。
2.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A)制备环孢霉素A-蛋白免疫原；
B)合成环孢霉素C-蛋白复合物，将其包被微孔，使微孔表面带有环孢霉素C分子；
C)标记抗环孢霉素A单克隆抗体；
D)以微孔表面的环孢霉素C-蛋白复合物为竞争分子，以标记的抗环孢霉素A单克隆抗体为检测试剂，通过竞争免疫分析定量检测样品中环孢霉素A浓度。
3.根据权利要求2所述的免疫分析方法，其特征在于，所述步骤A)中所述的环孢霉素A-蛋白免疫原的制备包括以下步骤：
A)通过光化学反应使环孢霉素A与4-苯甲酰苯甲酸连接，从而在环孢霉素A分子上引入羧基；
B)以EDCI或EDCI-NHS活化环孢霉素A分子上引入的羧基；
C)将活化后的环孢霉素A与蛋白载体偶联，获得环孢霉素A-蛋白免疫原。
4.根据权利要求3所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的蛋白载体选自：各种动物来源的血清白蛋白、血清γ-球蛋白、甲状腺球蛋白，卵清蛋白、或钥孔血蓝蛋白。
5.根据权利要求2所述的免疫分析方法，其特征在于，所述步骤C)中所述的环孢霉素C-蛋白复合物的合成包括以下步骤：
A)将丁二酸酐与环孢霉素C反应，使环孢霉素C羧基化；
B)通过EDCI或EDCI-NHS将羧基化的环孢霉素C与载体蛋白交联。
6.根据权利要求2所述的免疫分析方法，其特征在于，所述步骤D)中所述标记抗环孢霉素A单克隆抗体的标记物选自：酶、放射性同位素、荧光物质、化学发光物质或稀土离子。
7.根据权利要求6所述的免疫分析方法，其特征在于，所述标记物为Eu3+离子。
8.根据权利要求2所述的免疫分析方法，其特征在于，所述通过竞争免疫分析定量检测样品中环孢霉素A浓度包括以下步骤：
A)使用样品前处理试剂处理样品；
B)在包被有环孢霉素C-蛋白复合物的微孔内加入上述处理后的环孢霉素A校准品或样品，以及标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，形成免疫复合物；
C)洗涤除去未结合的标记的抗环孢霉素A单克隆抗体，检测微孔表面免疫复合物中标记的抗环孢霉素A单克隆抗体产生的信号；
D)根据上述步骤获得的校准曲线和各样品信号强度，对样品中环孢霉素A进行定量。
9.根据权利要求8所述的免疫分析方法，其特征在于，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂。
10.一种检测环孢霉素A浓度的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有环孢霉素C-蛋白复合物的固相微孔板，铕离子标记的抗环孢霉素A单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：环孢霉素A校准品，洗涤液，分析缓冲液，荧光增强液和样品前处理试剂。
12.根据权利要求11所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的样品前处理试剂包括全血溶解剂和全血沉降剂。
13.根据权利要求12所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述全血溶解剂选自：皂素、吐温、Triton、SDS中一种或几种的组合，或尿素、盐酸胍、蛋白水解酶中一种或几种的组合，所述全血沉降剂选自：二价金属离子的甲醇-乙二醇混合溶液，或二价金属离子的DMSO-乙二醇混合溶液，或二价金属离子-乙二醇混合溶液。
14.根据权利要求13所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述全血溶解剂含0.5％-2％(w/v)的皂素，所述全血沉降剂含10mM-100mM硫酸锌，70％-90％(v/v)甲醇，10％-30％(v/v)乙二醇。
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