Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der ein Protein
erkennt, welches an FK506 bindet (FK506-bindendes Protein), welches wiederum eine
immunsuppressive Aktivität aufweist, ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels eines
FK506-bindenden Proteins und ein Kit dafür, welche auf dem medizinischen Gebiet
verwendbar sind.
Stand der Technik
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Eine als FK506 oder FR-900506 bezeichnete Verbindung ist gut dafür bekannt, eine
potente immunsuppressive Aktivität aufzuweisen, und ist als Mittel zur Prophylaxe und
Behandlung der Abstoßung bei Organtransplantation und Autoimmunerkrankungen
verwendbar (beispielsweise japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr.
148181/1986).
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Die Aktivität ist jedoch so potent, daß die Bestimmung der optimalen Dosis von höchster
Wichtigkeit ist, und die Gabe einer Menge, die eine wirksame immunsuppressive
Aktivität ohne Nebenwirkungen induzieren kann, extrem wichtig ist.
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Neuere Studien ergaben, daß die immunsuppresive Wirkung von FK506 durch die
Bindung an ein intrazelluläres FK506-bindendes Protein (im folgenden als FKBP
bezeichnet) mit ähnlicher Aktivität wie Peptidylprolyl-cis-trans-isomerase verursacht
wird [beispielsweise Nature, 357, 692 bis 694 und 695 bis 697 (1992)].
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Es ist bekannt, daß FKBP einige Typen in Abhängigkeit vom Molekulargewicht
einschließt, wie FKBP-12 (Molekulargewicht 12KDa), FKBP-13 (Molekulargewicht
13KDa), FKBP-25 (Molekulargewicht 25KDa), FKBP-56 (Molekulargewicht 56KDa),
FKBP-80 (Molekulargewicht 80KDa) und ähnliche, und ihre Strukturen wurden bereits
identifiziert.
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Siehe beispielsweise Nature, 341, 755 bis 757 und 758 bis 760 (1989), J. Am. Chem. Soc.
113, 1409 bis 1411 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 6229 bis 6233 (1991) und
ähnliches.
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Auch über die Herstellung eines FKBP mit einem Molekulargewicht von 11819 Daltons
und 107 Aminosäuren durch Gentechnik wurde bereits berichtet [Nature, 346, 671 bis
674 (1990)].
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Es wurde auch berichtet, daß FK506 von diesen FKBPs am stärksten an FKBP-12 bindet
und daß seine Affinitätskonstante (Kd) 0,4 nM beträgt, und daß FKBP-12 in großen
Mengen nicht nur in Lymphozyten vorhanden ist, sondern auch in verschiedenen
Geweben einschließlich Erythrocyten [Trans. Proc. 23 (6), 2760 bis 2762 (1991)].
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Im Hinblick auf die Tatsache, daß, wenn FKBP-12 einem Maus MLR-System gemeinsam
mit einer bestimmten Menge FK506 gegeben wird, die immunsuppresive Wirkung von
FK506 proportional zur Menge von zugegebenem FKBP-12 inhibiert wird, bindet FK-
506 an FKBP-12 in Plasma, falls es im Blut vorhanden ist, und die immunsuppresive
Wirkung kann nicht in dem Grad erzielt werden, der von der FK506-Konzentration im
Plasma erwartet wird. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß Erythrocyten von
Patienten, bei denen eine Operation durchgeführt wurde, lysieren und FKBP-12 aus
Erythrocyten durch das Plasma zirkuliert, und daß Patienten verschiedene
Empfindlichkeiten zeigen, bestand ein Bedarf an der Entwicklung einer Technik, welche
den präzisen Assay des FKBP-Spiegels im Plasma ermöglicht, wodurch die
Empfindlichkeit des Patienten gegen FK506 bestimmt und ein geeigneter FK506-Spiegel
im Plasma ermittelt werden kann.
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Es wurden Anfangsexperimente zur Herstellung von Antikörpern gegen FK506-bindende
Proteine beschrieben. Jayaraman et al. (J. Biol. Chem. 1992; 267 : 9474-9477)
beschrieben Experimente zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein synthetisches
Peptid, das den Aminsäuren 3 bis 16 des Proteins entspricht. Die Bildung dieses
Antikörpers wird durch wiederholte subkutane Gabe des Peptids an ein Kaninchen und
Isolierung des Serums aus diesem Kaninchen stimuliert. Weitere Experimente zur
Herstellung von Antikörpern gegen FKBP-verwandte Proteine unter Verwendung einer
Anzahl von aus FK506-bindendem Protein isoliertem Oligopeptiden durch Injektion in
Kaninchen wurden von Rosborough et al. (Transplantation Proceedings 1991; 23 : 2890-
2893) beschrieben, wobei diese Experimente zu Antikörpern führten, die nur das
denaturierte Protein binden konnten. So behandelte der Stand der Technik nur Antikörper
gegen Teilpeptide des vollständigen Proteins.
Offenbarung der Erfindung
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines monoklonalen
Antikörpers, der FKBP erkennt, eines Verfahrens zur präzisen Bestimmung des Spiegels
von FKBP im Plasma zur Bestimmung des geeigneten FK506-Spiegels im Plasma, und
eines Kits zur Verwendung in dem Assay.
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Die Erfinder haben intensive Studien durchgeführt und bei der Herstellung eines
monoklonalen Antikörpers Erfolg gehabt, der eine antigene Determinante in FKBP
erkennt und die Bindung zwischen FKBP und FK506 nicht inhibiert, und ein Verfahren
zur präzisen Bestimmung des Spiegels von FKBP im Plasma und ein Kit für den Assay
entwickelt.
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Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper,
welcher eine antigene Determinante in einem Human-FKBP-12 erkennt und die Bindung
zwischen einem Human-FKBP-12 und FK506 nicht inhibiert, ein Verfahren zur
Bestimmung des FKBP-Spiegels, umfassend Umsetzung dieses immobilisierten
monoklonalen Antikörpers mit einem Enzym-markierten FK506 und FKBP in einer
Probe, und ein Kit für einen FKBP-Spiegel-Assay, umfassend diesen monoklonalen
Antikörper, FKBP und ein Enzym-markiertes FK506.
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Der monoklonale Antikörper, welcher eine antigene Determinante in Human-FKBP-12
erkennt und die Bindung zwischen Human-FKBP-12 und FK506 nicht inhibiert (dieser
monoklonale Antikörper wird im folgenden als Anti-FKBP-Antikörper bezeichnet), kann
beispielsweise durch die übliche Zellfusionsmethode wie die grundlegende Methode von
Kohler und Milstein [Nature, 256, 495 (1975)] hergestellt werden.
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Bevorzugt werden Milzzellen, die aus mit FKBP immunisierten Mäusen erhalten wurden,
und Maus-Myelom-Zellen unter Bildung eines Hybridoms fusioniert, aus dem ein
monoklonaler Antikörper, welcher eine antigene Determinante in FKBP erkennt und die
Bindung zwischen FKBP und FK506 nicht inhibiert, durch die Methode hergestellt
werden, die durch Beispiel 1 oder Beispiel 2 im folgenden erläutert wird. Bevorzugt
gehört der Antikörper zur IgG- oder IgM-Klasse und am bevorzugtesten zu einer
Unterklasse wie IgG&sub1; λ oder IgG&sub1; κ. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert
insbesondere einen Anti-FKBP-Antikörper, welcher nur mit 12 kd FKBP oder sowohl mit
12 kd und 30 bis 35 kd FKBPs reagiert.
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Das Verfahren zur Bestimmung eines FKBP-Spiegels der vorliegenden Erfindung ist eine
Zwei-Stufen-Methode, bei der ein Anti-FKBP-Antikörper zum selektiven Assay nur des
gewünschten FKBPs verwendet wird.
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Die Zwei-Stufen-Methode schließt ein 1) Immobilisieren eines Anti-FKBP-Antikörpers,
welcher eine antigene Determinante in einem FKBP der angestrebten Art erkennt und die
Bindung zwischen FKBP und FK506 nicht beeinträchtigt, auf einer festen Phase wie einer
Immunoplatte unter Verwendung von IgG wie Anti-Maus IgG(H + L); 2) Umsetzen des
immobilisierten Anti-FKBP-Antikörpers mit einer Probe, welche FKBP enthält (oder
seriell verdünntes FKBP, wenn eine Eichkurve gezeichnet wird) und einem mit einem
Enzym wie Peroxidase (im folgenden als POD bezeichnet) markierten FK506, welches
beispielsweise FK506-C32(LA)-POD sein kann, das auf die im folgenden Beispiel 1
genannte Weise produziert wird; und 3) schließlich Bestimmung des FKBP-Spiegels
durch Messung der Absorption zur Bestimmung der Farbentwicklung des Substrats unter
Verwendung einer Enzymsubstratlösung wie einer o-Phenylendiamin- und
Wasserstoffperoxidlösung, welche proportional ist zur Menge des Enzym-markierten
FK506, welches durch das FKBP abgefangen wird, das an den Anti-FKBP-Antikörper
gebunden ist.
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Der Anti-FKBP-Antikörper der vorliegenden Erfindung kann für die Bestimmung der
vorstehend genannten Zwei-Stufen-Methode als FKBP-Spiegel-Assay-Kit in
Kombination mit einem FKBP-Standardprodukt und einem Enzym-markierten FK506
verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung ermöglicht die einfache und präzisere Bestimmung des
Spiegels von FKBP in Plasma, welches Einflüsse auf den immunsupressiven Effekt von
FK506 ausübt, genauso wie die Bereitstellung von wichtigen Daten für die Bestimmung
der optimalen Dosis von FK506.
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Zusätzlich kann die Dosis von FK506 in enger Übereinstimmung mit dem Zustand von
individuellen Patienten in tatsächlichen klinischen Situationen bestimmt werden, da
sowohl die selektive Bestimmung des Spiegels eines bestimmten FKBP (z. B. FKBP-12)
allein und die Bestimmung des Gesamt-FKBP-Spiegels je nach Bedarf ermöglicht
wurden.
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Die vorliegende Erfindung wird in größerem Detail durch illustrierende Beispiele erklärt,
auf die die Erfindung nicht beschränkt ist.
Beispiel 1: Herstellung eines Anti-FKBP-Antikörpers
(1) Herstellung und Eigenschaften von FKBP-12
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Eine DNA (48-mer), entsprechend dem C-Terminus von FKBP-12, wurde unter
Verwendung eines DNA-Synthesizers (hergestellt von Applied Biosystem) aus der DNA-
Sequenz hergestellt, über die von S. L. Schreiben et al., Havard Universität berichtet
wurde [Nature, 346, 671 bis 674 (1990)].
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5'-CCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATGA-3'
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Der Terminus dieses 48-mers wurde mit ²&sup5;P markiert, und unter Verwendung desselben
als Sonde wurde die Human-T-Zellen cDNA-Bibliothek HL1016b (CLONTECH),
500000 Plaques, gescreent, wobei ein positiver Plaque erhalten wurde. Ein Fragment
[pUC-23(Ec)], welches FKBP-12-cDNA enthielt, wurde aus diesem Plaque subkloniert.
Das pUC-23(Ec) wurde sequenziert, wobei eine Deletion der 1 bis 32 DNA-Sequenz
gefunden wurde, die dem N-Terminus entspricht. DNA zur Ergänzung des fehlenden
Teils und etwa 80b.p. AT-reiche stille Mutanten-N-terminale DNA, hergestellt zur
Erhöhung der Expression in Echerichia coli, wurden als eine EcoRI-BamHI-Stelle in ein
Plasmid eingeführt, welches zur Expression unter der Kontrolle eines Tryptophan-
Promoters fähig ist, wodurch ein Expressions-Vektor pFKBP333 erhalten wurde. Unter
Verwendung dieses Vektors wurde E. coli HB101 transformiert, wobei eine
Expressionszelle HB101/pFKBP(AT)311 erhalten wurde. Die Zelle wurde in L-amp.-
Kulturflüssigkeit während 19 Stunden inkubiert, und die Proteinsynthese wurde durch
Zugabe von IAA (Indol-Acrylsäure) bis zu einer Endkonzentration von 90 ug/ml
induziert. E. coli wurde isoliert, und die Zellen wurden mit einer French-Presse in 50 mM
Tris-HCl, 2 mM β-ME, 2 mM CaCl&sub2;, 10 mM MgCl&sub2; und 5% Glycerin zerstört und bei
4ºC während 30 Minuten bei 6000 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde
bei 60ºC während 15 Minuten wärmebehandelt, zentrifugiert (4ºC, 6000 · g, 45 min. +
4ºC, 18000 · g, 20 min. · 2), dialysiert [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4ºC, über Nacht] und
einer reversed phase HPLC mit DEAT-Toyo-Pearl 650M (C4) zur Reinigung von FKBP-
12 unterzogen.
(2) Immunisierung von Mäusen mit FKBP-12
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FKBP-12 in Phosphatpuffer (im folgenden als PBS bezeichnet), 250 ug/ml, 0,1 ml, und
die äquivalente Menge Freunds vollständiges Adjuvans (FCA) wurden gemischt und zur
intraperitonealen Immunisierung von BALB/c-Mäusen verwendet. Dieselbe Menge
FKBP-12 wurde mit Freund's unvollständigem Adjuvans (FIA) gemischt und für einige
intraperitoneale Immunisierungen ca. alle 10 Tage verwendet.
(3) Bestimmung des Antikörper-Titers im Blut
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Blut (10 ul) wurde aus der Schwanzvene der Mäuse entnommen, mit PBS (990 ul)
gemischt und als Probe verwendet. Zum Assay wurde eine FKBP-12-PBS-Lösung (10
ug/ml, 50 ul) in Immunoplatten-Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur während
3 Stunden zur Bindung an die Oberfläche umgesetzt. Dann wurden die Vertiefungen
gewaschen, und die Bindungsstelle wurde mit 0,2% Milchblocker-PBS geblockt. Nach
erneutem Waschen wurde die verdünnte Serumprobe wie oben erhalten zugegeben und
bei Raumtemperatur während einer Stunde umgesetzt. Dann wurde Anti-Maus-IgG
(H + L)-POD (100 ul/Vertiefung, hergestellt von Vector Lab.) zugegeben und bei
Raumtemperatur während einer Stunde umgesetzt. Nach Waschen wurde die Farbe durch
eine übliche Methode unter Verwendung von o-Phenylendiamin entwickelt.
(4) Produktion eines Anti-FKBP-12-Antikörpers
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Die Mäuse, welche einen erhöhten Antikörper-Titer zeigten, erhielten eine Injektion von
FKBP-12 [250 ug/ml (PBS), 0,2 ml] in die Schwanzvene zur Endimmunisierung. Vier
Tage später wurde die Milz zur Präparation von 1,44 · 10&sup8; Milzzellen entfernt. Daneben
wurden Mäuse-Myelom-Zellen P3 · 63Ag8U.1 auf eine Konzentration von 2,9 · 10&sup7;
Zellen eingestellt und einer Zeltfusion in 50% PEG 4000 (Endkonzentration) unterzogen.
Dann wurden die fusionierten Zellen in HAT-Medium in einer 24-Vertiefungs-Platte mit
106 Zellen/ml · 1 ml/Vertiefung gescreent. Zwei Wochen später wurden 144
Vertiefungen, in denen Zellen in HAT-Medium wuchsen, auf ihre Anti-FKBP-12-
Antikörperproduktion gescreent. Spezifisch wurde im Fall von Antikörper-Titer im Blut
FKBP-12 (5 ug/ml, end) auch zugegeben, wenn eine Anti-FKBP-12-Antikörper
enthaltende Probe zur Reaktion zugegeben wurde, und die Vertiefungen, die in
Gegenwart von FKBP-12 keine Farbe entwickelten, wurden ausgewählt. Darüber hinaus
wurden 32 Klone mit hohen Antikörper-Titern gegen FKBP-12 selektiert.
(5) Selektion von Anti-FKBP-12-Antikörper, welcher FKBP-12 erkennt und die Bindung
zwischen FK506 oder FK506-C32(LA)-POD und FKBP-12 nicht inhibiert.
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Ein Anti-Maus-IgG(H + L) wurde an eine feste Phase gebunden und der gescreente
Antikörper gebunden. Dann wurde FKBP-12 (50 ul/l ug/ml) und im folgenden (6)
erhaltenes FK506-C32(LA)-POD (1000fach verdünnt, 50 ul) zugegeben, so daß
Koexistenz bestand, und die Klone, welche eine erhöhte Absorption bei 490 nm aufgrund
der Reaktion mit o-Phenylendiamin zeigten, wurden ausgewählt. Verschwinden der
Farbentwicklung in Gegenwart von FK506 (10 ug/ml) zeigt die Erkennung von FK506
aus FK506-C32(LA)-POD durch FKBP-12 an, welches an den Anti-Maus-IgG(H + L)
gebunden ist. Als Ergebnis wurden fünf Arten Antikörper (5-1-A5, 5-1-B3, 5-1-C5, 5-2-
D1 (IgG&sub1;), 5-4-D2) durch die Immunisierungsmethode unter Verwendung von FKBP-12
als Antigen erhalten; und die gesamten sieben Arten von monoklonalen Antikörpern
wurden durch die Immunisierungsmethode unter Verwendung von
Harnstoffdenaturiertem FKBP-12 als Antigen im folgenden (7) - IA4 (IgM), 3A8 (IgG&sub3;), IF7, 3B8
- und durch die Immunisierungsmethode unter Verwendung von FKBP-12 als Antigen
erhalten, das an Ovalbumin gebunden war, wie im folgenden (8) - 4F8 erhalten.
(6) Herstellung von FKBP506-C32(LA)-POD
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Bernsteinsäure-FR-90056-Substanz-Halbester (230 mg), erhalten auf dieselbe Weise wie
in Beispiel 1 der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 92659/1989, N-
Hydroxysuccinimid (35 mg) und eine Lösung (10 ml) von 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (43 mg) in Methylenchlorid wurden bei
Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser
gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der erhaltene
Rücksatnd (250 mg) wurde mit 11-Aminoundecansäure (120 mg) und Triethylamin (60
mg) in einem Lösungsmittel aus Dimethylformamid-Wasser (1 : 1, 20 ml) bei
Raumtemperatur während 6 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser
gewaschen und getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der erhaltene Rückstand
wurde auf eine Kieselgel-Säule unter Verwendung von Chloroform als
Entwicklungslösungsmittel aufgetragen und ergab 120 mg 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-
[2-(4-N-(10-carboxydecyl)-(4-amino-1,4-dioxo-1-butyloxy))-3 -methoxycyclohexyl)-1-
methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-
azatricyclo [22.3.1.04.9]octacoctacos-18-ene-2, 3,10,16-tetraon.
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NMR (CDCl&sub3;, δ): 1.2-1.4 (m), 5.9-6.1 (1H, m)
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FAB Masse: 1109 (M + Na)&spplus;
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Unter Verwendung der oben erwähnten Verbindung wurde eine FK506-C32(LA)-POD-
Lösung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, 3) der japanischen ungeprüften
Patentveröffentlichung Nr. 92659/1989 durch Umsetzung mit Meerrettich-Peroxidase
erhalten.
(7) Herstellung von Harnstoff-denaturiertem FKBP-12
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Harnstoff (312 mg) wurde zu einer FKBP-12 (847 ug/ml) enthaltenden 0,08%igen
wässrigen Trifluoressigsäurelösung (460 ul) gegeben, und die Mischung wurde bei
Raumtemperatur zur Herstellung von 650 ul einer Lösung von FKBP-12 (600 ug/ml)
gerührt, die für die Immunisierung verwendet wurde.
(8) Herstellung von Ovalbumin-gebundenem FKBP-12
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FKBP-12 (1032 ug, verwendet wurden 1032 ul mit 1 mg/ml) und eine Lösung (1032 ul)
Ovalbumin (Sigma, Chargen-Nr. 76F-8040) in PBS (2 mg/ml) wurden gemischt. Dazu
wurde tropfenweise 0,62 ml einer 0,13M Glutaraldehyd-PBS-Lösung gegeben. Die
Mischung wurde bei Raumtemperatur während 14 Stunden gerührt und dreimal gegen
PBS (1 l) dialysiert und als Immunogen verwendet.
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Das Mischungsverhältnis von FKBP-12 und Ovalbumin war FKBP-12 1032 ug
Ovalbumin 2064 ug und die Lösungsmenge war 2,7 ml.
Beispiel 2: Herstellung eines Anti-FKBP-12-Antikörpers
(1) Mäuse wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (1) und (2) immunisiert.
(2) Bestimmung des Antikörper-Titers in Blut
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Eine Lösung (50 ul) FKBP-12 (20 ug/ml) in PBS wurde in jede Vertiefung einer 96-
Vertiefungs-Platte zum ELISA verteilt und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die
FKBP-12-Lösung in den Vertiefungen wurde durch Absaugen entfernt, und die
Vertiefung wurde dreimal mit einer 0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen. Eine
0,2% Milch/PBS-Lösung (250 ul) wurde in jede Vertiefung der Platte gegeben, und die
Platte wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten stehengelassen. Die 0,2%ige
Milch/PBS-Lösung in den Vertiefungen wurde durch Absaugen entfernt, eine Lösung
(100 ul) jedes Antiserums, verdünnt mit einer 0,2%igen Milch/0,05%igen Tween
20/PBS-Lösung, wurde in die Vertiefungen gegeben, und die Vertiefungen wurden bei
Raumtemperatur während 2 Stunden stehengelassen. Dann wurde das verdünnte
Antiserum in den Vertiefungen durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden
dreimal mit einer 0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen. Eine mit alkalischer
Phosphatase markierte Anti-Maus IgG (H + L)-Lösung, 1000fach verdünnt mit einer 0,2
%igen Milch/0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung, wurde in 100 ul in jede Vertiefung
gegeben, und die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur während 2 Stunden
stehengelassen. Die mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Maus IgG(H + L)-Lösung
in den Vertiefungen wurde durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden
fünfmal mit einer 0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen. Dann wurde eine
Lösung von 0,1 mM 4-Methylumbelliferylphosphat (4MU-P, Sigma) in einem Puffer (10
mM Diethanolamin/0,5% MgCl&sub2;/H&sub2;O) in 100 ul in jede Vertiefung gegeben, und die
Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur während 15 Minuten stehengelassen. Die
Fluoreszenz-Intensität (Anregung: 360 nm, Emission: 460 nm) jeder Vertiefung wurde
auf einem Floureszenzplattenlesegerät abgelesen.
(3) Die Maus mit dem höchsten Antikörper-Titer wurde selektiert und erhielt eine
Injektion mit 0,2 ml einer PBS-Lösung, enthaltend 1,5 mg/ml FKBP-12 in die
Schwanzvene zur Endimmunisierung 10 Tage nach der vierten Injektion.
(4) Zellfusion
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Zellen wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1-(4) zur Herstellung von Hybridomen
fusioniert (3-3-D4-C6, 2C1-87, 3F4-70).
(5) Herstellung und Reinigung von Antikörpern
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Die durch Sceenen und Klonen erhaltenen Hybridome 2C1-87 und 3F4-70 wurden
jeweils in einen F75-Kolben mit 5 · 10&sup4; Zellen/ml (50 ml/F75) angeimpft und während 4
Tagen kultiviert. Die Kultur wurde zentrifguiert, zweimal mit einem Medium ohne Serum
gewaschen und in 0,5 ml suspendiert. Eine Hybridom-Suspension (0,5 ml) wurde
intraperitoneal BALB/C-Mäusen (BALB/C, weiblich, 6 Wochen alt) transplantiert, die
zwei Wochen zuvor eine intraperitoneale Injektion von Pristan (0,5 ml) erhalten hatten.
Zehn Tage später wurde bei den Mäusen eine Laparotomie durchgeführt, und Ascites (5
ml) wurde aus jeder Maus erhalten. Die jeweiligen Ascites wurden unter Verwendung
von Affigel Protein A MAPS-II-Kit (Bio-Rad) gereinigt und ergaben gereinigte
monoklonale Anti-FKBP-12-Antikörper 2C1-87 (Subtyp: IgG&sub1; λ) und 3F4-70 (Subtyp:
IgG&sub1; κ). Das Hybridom 3-3-D4-C6 wurde auf dieselbe Weise kultiviert, und der
monoklonale Anti-FKBP-12-Antikörper 3-3-D4-C6 (Subtyp: IgM) wurde erhalten.
Beispiel 3: Assay des FKBP-12-Spiegels (Zwei-Stufen-Methode)
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Eine Lösung von Anti-Maus-IgG (H + L) (10 ug/ml) wird in eine Immunoplatte in 50 ul
pro Vertiefung gegeben, bei 4ºC über Nacht stehengelassen und dreimal mit 0,05%
Tween 20-PBS gewaschen. 0,2% Milchblocker-PBS (200 ul/Vertiefung) wird bei
Raumtemperatur während einer Stunde zur Blockierung der Bindungsstelle umgesetzt,
und 0,2% Milchblocker-0,05% Tween 20-PBS (50 ul/Vertiefung) und die Anti-FKBP-
12-Antikörper (5-2-D1)-Kultur (50 ul/Vertiefung), im Beispiel 1 erhalten, wird in die
Vertiefungen gegeben und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die Vertiefungen werden
dreimal mit 0,05%iger Tween 20-PBS gewaschen und bei Raumtemperatur während 2,5
Stunden mit FKBP-12 (50 ul/Vertiefung) umgesetzt, das seriell mit 0,05% Tween 20-
PBS verdünnt war. Die Vertiefungen werden dreimal mit 0,05% Tween 20-PBS
gewaschen. Eine FK506-C32(LA)-POD-Lösung (50 ul/Vertiefung), 500fach mit PBS
verdünnt, wird zugegeben, und die Vertiefungen werden bei Raumtemperatur während 2
Stunden stehengelassen. Die Vertiefungen werden fünfmal mit 0,05% Tween 20-PBS
gewaschen und einer Farbentwicklung durch eine übliche Methode unter Verwendung
einer o-Diphenylamin/Wasserstoffperoxid-Lösung unterzogen. Der Grad der
Farbentwicklung, der entsprechend der Menge an FKBP-12 einer Veränderung unterliegt,
wird bestimmt.
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Normales Human-Plasma wurde anstelle des seriell verdünnten FKBP-12 durch die oben
erwähnte Methode untersucht. Der FKBP-12-Spiegel war ungefähr 100 ng/ml.
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Die Genauigkeit des Resultats wurde durch ein Reagens bestätigt, das das Recovery-
Verhältnis von FKBP-12 zeigte (1 ug) und zu normalem Human-Plasma (1 ml) gegeben
wurde.