DE69329367T2

DE69329367T2 - Wachstumshormon-enthaltendeproteinformulierung

Info

Publication number: DE69329367T2
Application number: DE69329367T
Authority: DE
Inventors: Staffan Castensson; Ebba Florin-Robertsson; Elvy Hoekby; Sirkka Thome
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1993-04-01
Publication date: 2001-06-21
Anticipated expiration: 2013-04-02
Also published as: PT587858E; EP0587858A1; NO310804B1; JP3268557B2; NZ251498A; ATE196092T1; EP0587858B1; ES2150940T5; ES2150940T3; NO934355L; NO934355D0; DE69329367T3; DK0587858T3; WO1993019776A1; GR3034925T3; AU666007B2; CA2102693A1; CA2102693C; AU3913593A; US5567677A

Description

Die Erfindung betrifft eine Formulierung von Wachstumshormon oder einem jeglichen funktionellen Analog davon, speziell von menschlichem Wachstumshormon (hGH) in Lösungen, die Citrat in einer Konzentration von ungefähr 2 bis 50 mM als Puffersubstanz und insbesondere Natriumcitrat in einer Konzentration von ungefähr 2 bis 20 mM enthalten. Dieser Puffer wird zur Verbesserung der Stabilität verwendet.
Wachstumshormon kann sowohl vom Mensch als auch vom Tier stammen, wie menschliches Wachstumshormon (hGH), Wachstumshormon vom Rind (bGH) und Wachstumshormon vom Schwein (pGH).
hGH ist ein Protein, das aus einer einzelnen Kette von 191 Aminosäuren besteht. Das Molekül ist durch zwei Disulfidbrücken quervernetzt und die monomere Form hat eine relative Molekülmasse von 22 kDa. Jedoch ist menschliches Hypophysen- Wachstumshormon nicht homogen. Beispielsweise ist auch eine kleinere 20 kDa-hGH-Variante, die von dem gleichen Gen produziert wird, bekannt. Die "basische hGH"-Variante (hGH-V), die von der Placenta während der Schwangerschaft produziert wird, ist ein anderes Analog, das ein Produkt eines separaten Gens ist. Wie das 22 kDa-hGH besteht es aus 191 Aminosäuren, aber an verschiedenen Positionen innerhalb des Moleküls sind 13 von diesen unterschiedlich. Siehe z. B. Bewley, T. A., et al., Adv. Enzymol., 42, 73-166, 1975, und Frankenne, F., et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol., 66, 1171-80, 1988.
Rekombinantes hGH (22 kDa) ist seit mehreren Jahren kommerziell erhältlich. Es wird gegenüber den von der Hypophyse abgeleiteten Produkten bevorzugt, da das aus menschlichem Gewebe hergestellte Produkt infektiöse Mittel, wie jenes für die Creutzfeldt-Jacob-Erkrankung, enthalten könnte. Es befinden sich zwei Typen von therapeutisch nützlichen rekombinanten hGH-Präparaten auf dem Markt: das authentische, z. B. Genotropin®, Kabi Pharmacia AB, und ein Analog mit einem zusätzlichen Methioninrest an dem N-terminalen Ende, z. B. Somatonorm®.
hGH wird verwendet, um das Längenwachstum bei Patienten mit Zwergenwuchs aufgrund von Hypophysenvorderlappeninsuffizienz oder Ullrich-Turner-Syndrom zu stimulieren, aber es sind auch andere Indikationen vorgeschlagen worden.
Die Stabilität von Proteinen in wäßrigen Formulierungen stellt in der pharmazeutischen Industrie allgemein ein Problem dar. Es ist oftmals gelöst worden, indem das Protein in unterschiedlichen Trocknungsverfahren, wie Gefriertrocknung, getrocknet worden ist. Das Protein ist danach verteilt und in getrockneter Form gelagert worden. Der Patient muß das getrocknete Protein notwendigerweise in einem Lösemittel vor einer Verwendung rekonstituieren, was selbstverständlich einen Nachteil darstellt und für den Patienten unbequem ist.
Durch neue Vorrichtungen für Verabreichungen, z. B. Kabipen®, der in dem U.S.-Patent 4,968,299, Kabi Pharmacia AB, beschrieben ist, hat der Patient eine Vorrichtung erhalten, die relativ einfach zu handhaben ist. Die Vorrichtung umfaßt eine Zweikammerampulle Genomix®, die hGH als lyophilisiertes Pulver in einer der Kammern und ein für die Rekonstitution vorgesehenes Verdünnungsmittel in der anderen enthält. Der Patient rekonstituiert das Produkt vor einer Verwendung. Das lyophilisierte Produkt kann bis zu 24 Monate gelagert werden. Das rekonstituierte Produkt ist dann für 3 Wochen stabil, wenn es bei 2-8ºC gelagert wird.
Das Gefriertrocknungsverfahren ist ein kostspieliger und zeitaufwendiger Verfahrensschritt und es wäre sehr vorteilhaft, wenn dieser Schritt bei der Herstellung eines kommerziellen Produkts eines Proteins vermieden werden könnte.
Für einen Patienten, der tägliche Injektionen eines Wachstumshormons, z. B. von hGH, benötigt und speziell wenn der Patient ein Kind ist, ist es wichtig, daß das Produkt leicht zu handhaben, zu dosieren und zu injizieren ist. Die Rekonstitution von gefriergetrocknetem hGH erfordert Umsicht und Sorgfalt und sollte vorzugsweise vermieden werden, ist aber die einzige Methode, die derzeit verfügbar ist.
Es würde die Verwendung von Wachstumshormon und insbesondere von hGH vereinfachen, wenn das Protein als Lösung produziert und an den Patienten, der das Arzneimittel direkt ohne Rekonstitution injizieren könnte, vertrieben werden könnte.
Es sind unterschiedliche Lösungen dieses Problems offenbart worden, aber bis jetzt ist kein Produkt auf dem Markt erschienen.
In WO 89/09614, Genentech, wird eine stabilisierte Formulierung von hGH, die Glycin, Mannitol und einen Puffer umfaßt, offenbart und in einer bevorzugten Ausführungsform wird ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, wie Polysorbat 80, zugesetzt. Als Puffersubstanz wird Natriumphosphat vorgeschlagen. Die Formulierung hat eine erhöhte Stabilität in einer lyophilisierten Formulierung und bei Rekonstitution.
Eine andere Möglichkeit einer Verabreichung von Wachstumshormon in einer Lösung besteht darin, ein Polyoxyethylen- Polyoxypropylen enthaltendes Blockcopolymer gemäß EP 211 601, International Minerals and Chemical Corporation, zuzusetzen. Diese Lösung gewährleistet eine länger andauernde Freisetzung bei einer Verabreichung an das Tier.
WO 91/18621 offenbart eine Mischung von IGF-I und hGH, die in einem Puffer bei einem pH von ungefähr 6, wie Citrat, mit einem grenzflächenaktiven Mittel, das die Löslichkeit des hGH bei diesem pH erhöht, formuliert ist und die als wäßrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung gelagert werden soll. Gemäß dieser Referenz ist IGF-I im allgemeinen bei einem pH von nicht mehr als ungefähr 6 stabil und ist hGH bei einem höheren pH von 7,4-7,8 stabil.
Es besteht auf dem Markt ein Bedarf für stabilisierte, injizierbare Wachstumshormonlösungen, z. B. hGH in einer Lösung. Es wäre ebenfalls vorteilhaft, wenn die endgültige pharmazeutische Lösung nur ein Minimum an Zusatzstoffen, wie Tenside, enthalten würde.
Wir haben jetzt eine neue Formulierung gefunden, die die vorstehend erwähnten Probleme löst.

GH-STABILITÄT

Die Stabilität von hGH hängt von den chemischen und physikalischen Eigenschaften des Proteins ab. Es sind verschiedene Abbauwege, wie Desamidierung, Oxidation und Aggregation, bekannt.
Desamidierung und Oxidation sind übliche chemische Reaktionen, die Veränderungen der Primärstruktur des Proteins umfassen. Eine Desamidierung tritt speziell in wäßrigen Lösungen auf, aber niedrige Temperatur und niedriger pH der Lösungen unterdrücken die Desamidierungsreaktion.
Verschiedene Formen einer Aggregation resultieren aus der stofflichen Instabilität des Proteins. Aggregate können löslich oder unlöslich sein und die Bindung beider Formen kann kovalent oder nicht-kovalent sein. Die Aggregate können opaleszierende Lösungen bilden, aber es kann auch eine nicht- sichtbare Aggregation geben, die nur chemisch gezeigt werden kann. Die Verhinderung einer kovalenten Aggregation in Proteinformulierungen ist wichtig, da solche Prozesse irreversibel sind und zu der Produktion inaktiver Spezies, die zusätzlich auch immunogen sein könnten, führen könnten. Veränderungen in der Primärstruktur könnten ebenfalls Konformationsveränderungen verursachen, die die Ursache einer Selbstassoziierung des Proteins, einer Aggregation, sein könnten. Die nicht- kovalente Aggregation, die unter bestimmten Bedingungen auftritt, kann zu Präzipitation und Aktivitätsverlust führen.
Eine große Anzahl von Reaktionen kann unter verschiedenen pH-Bedingungen auftreten, und es ist fast unmöglich, ein Protein bei einem bestimmten pH-Wert, der alle Modifizierungsreaktionen eliminiert, während er hohe Löslichkeit und korrekte Konformation des Proteins bewahrt, zu formulieren.
Bis jetzt ist von Herstellern im allgemeinen ein leicht alkalischer pH verwendet worden, um sichtbare Teilchen zu vermeiden und ein klares Produkt zu erhalten. In den meisten kommerziell erhältlichen Produkten liegt der pH über 7 trotz des höheren Risikos einer Desamidierung.
Wenn das Produkt Genotropin® von Kabi Pharmacia rekonstituiert wird, wird ein pH von 6,7 bei einer hGH-Konzentration von 16 IU/ml erhalten. Dieser pH ist ein Kompromiß zwischen einem pH, der eine vollständig klare Lösung ergibt (pH 8), und pH 6, der eine niedrigere Desamidierungsgeschwindigkeit, aber eine etwas höhere Opaleszenz ergibt.
Aufgrund dieser Komplexität ist es nicht möglich, eine Proteinzubereitung zu formulieren und alle Abbauwege zu eliminieren. Das gefriergetrocknete Proteinprodukt ist viel stabiler als die entsprechende wäßrige Lösung. Obwohl ein gefriergetrocknetes Produkt nach der Verarbeitung ausreichend stabil ist, wird das Protein während der Lagerung jedoch nach wie vor langsam abgebaut werden.

DIE ERFINDUNG

Vollständig unerwartet haben wir festgestellt, daß Wachstumshormon enthaltende Lösungen, in denen Citrat als eine Puffersubstanz gewählt worden ist, stabiler sind als jene, in denen Phosphat der Puffer ist.
Die Erfindung betrifft eine stabilisierte, injizierbare Formulierung von Wachstumshormon oder einem jeglichen funktionellen Analog davon, die mindestens 12 Monate stabil ist, bestehend aus dem Wachstumshormon oder einem jeglichen funktionellen Analog davon und Citrat in einer Konzentration von 2- 50 mM als Puffersubstanz, und enthält vorzugsweise Natriumcitrat als Puffersubstanz in einer Konzentration von 2-40 mM, bei einem pH von ungefähr 5,0 bis 7,0, um dadurch das Wachstumshormon in der Formulierung zu stabilisieren, und gegebenenfalls Aminosäuren, wie z. B. Glycin und Alanin, und/oder Mannitol oder anderen Zuckeralkoholen und/oder Glycerol und/oder anderen Kohlenhydraten und gegebenenfalls einem Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol.
Vorzugsweise ist die Formulierung eine wäßrige Lösung von hGH oder einem jeglichen funktionellen Analog davon und Citrat als Puffersubstanz in einer Konzentration von 2 bis 20 mM, z. B. 5 mM oder 10 mM und enthält vorzugsweise Natriumcitrat als Puffersubstanz bei einem pH von ungefähr 6,0 bis 7,0.
Die Lösung sollte isotonisch sein. Das Wachstumshormon ist vorzugsweise rekombinantes hGH.
Die erfindungsgemäße Formulierung ist für mindestens 12 Monate stabil. Mit stabil ist hier eine Menge von mehr als 85% Monomer (IEF) und von Fragmenten gemäß SDS-PAGE von weniger als 2% gemeint.
Die beanspruchte Formulierung kann auch Wachstumshormon und Wachstumsfaktoren in einer Mischung umfassen. Mit Wachstumsfaktor sind Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGF-1 oder IGF-2) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) entweder aus natürlichen Quellen oder durch Rekombinationstechniken produziert gemeint.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Formulierung, in dem Wachstumshormon oder ein jegliches funktionelles Analog davon mit Citrat als Puffersubstanz gemischt wird oder die Bestandteile der Endformulierung im Zuge des letzten Gelreinigungsschritts zugegeben werden.
Sie betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der Wachstumshormon, ein jegliches funktionelles Analog davon benötigt, in dem die beanspruchte Formulierung verabreicht wird.
Mit Wachstumshormon (GH) ist sowohl natürlich vorkommendes menschliches und tierisches GH als auch rekombinantes GH (rGH), wie rhGH, rbGH und rpGH, gemeint. Mit funktionellen Analogen sind Verbindungen mit der gleichen therapeutischen Wirkung wie das Wachstumshormon in Tieren und Menschen gemeint.
Das Wachstumshormon, das in den Puffer eingebracht werden soll, könnte das anfänglich isolierte Produkt oder ein Produkt, das gefriergetrocknet und danach rekonstituiert worden ist, sein.
Die Konzentration des Wachstumshormons hängt nur von seiner Löslichkeit in dem verwendeten Puffer und der therapeutisch gewünschten Menge für die verabreichte Dosis ab. Vorzugsweise ist die Konzentration von hGH 1-80 IU/ml und mehr bevorzugt 2-40 IU/ml.
Eine Aggregation in Form einer Präzipitation, die durch Schütteln der Lösung beobachtet wird, ist ein Ergebnis einer Denaturierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Dies könnte durch Abfüllen ohne Kopfraum, wodurch folglich die Voraussetzungen für eine Aggregation verringert werden, vermieden werden.

BEISPIEL 1

Material für Formulierungsstudien wurde aus dem gewöhnlichen Genotropin®-Prozeß erhalten. Das menschliche Wachstumshormon wird in dem Bakterium Escherichia coli (E. coli) K12 unter Verwendung des Expressionsplasmids pAPSTIIhGH-3 als Matrize synthetisiert. Das Hormon wird während der Synthese aus der Zelle in den periplasmatischen Raum sezerniert. Menschliches Wachstumshormon wird nachfolgend aus dem periplasmatischen Raum der E. coli nach Aufbrechen der äußeren Bakterienmembran isoliert. Der rekombinantes hGH enthaltende Extrakt wurde an DEAE-Sepharose FF fraktioniert. Es folgten zwei Ammoniumsulfat-Präzipitationsschritte und danach zwei Fraktionierungsschritte an DEAE-Sepharose FF. Eine Formulierung wurde ausgeführt durch Gelfiltration, die dazu dient, in den vorangegangenen Reinigungsschritten verwendete Salze zu entfernen und die Bestandteile der Endformulierung hinzuzufügen. Die letzte Säule Sephadex G-25 (Pharmacia, Durchmesser 1,3 cm, Betthöhe 45 cm) wurde mit dem Formulierungspuffer äquilibriert. Äquilibrierung und Chromatographie wurden bei +7ºC ausgeführt. Die gewünschte Proteinkonzentration wurde durch verdünnen mit dem Formulierungspuffer erzielt.
Es wurde die Stabilität von sieben Lösungen untersucht. Siehe Tabelle 1. Tabelle 1 Tabelle 1 Fortsetzung Tabelle 2 Tabelle 2 Fortsetzung

METHODEN

Isoelektrische Fokussierung (IEF) mit densitometrischer Auswertung

IEF ist eine Methode, gemäß welcher das Ausmaß einer Desamidierung ausgewertet werden kann.
Die Trennung von hGH-Komponenten wird in einem pH- Gradienten, der zwischen zwei Elektroden etabliert und durch Trägerampholyte stabilisiert wird, ausgeführt. Die Proteine wandern, bis sie sich selbst an ihrem isoelektrischen Punkt in dem Gradienten, an dem ein Protein keine Gesamt-Nettoladung aufweist, ausrichten und werden sich dementsprechend aufkonzentrieren, wenn die Wanderung endet. Folglich wird die Trennung entsprechend der Ladung erzielt. Die relative Verteilung von geladenen hGH-Formen wird durch Densitometer-Abtastung von mittels Coomassie Blue angefärbten Polypeptiden quantifiziert. Je höher der Prozentsatz des Monomers, desto weniger Desamidierung.

Größenverteilung der Polypeptide (SDS-PAGE)

Proteine in Zubereitungen von Somatropin, hGH, wurden durch Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert, wodurch negativ geladene SDS-Protein-Molekülkomplexe erhalten wurden. Eine Trennung wurde dann entsprechend der Molekülgröße durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen (PAGE) in Gegenwart von SDS erhalten. Die relative Polypeptidgrößenverteilung von hGH wurde durch Densitometer-Abtastung der mittels Silber angefärbten Polypeptidbanden quantifiziert.

Sichtprüfung

Das Aussehen der Lösungen wurde mittels des Auges gemäß Ph. Eur., 2. Auflage, geprüft.
pH
wurde mit Glas- und Kalomel-Elektroden gemessen.
Beispiele A, E und H sind gemäß der Erfindung.
Aus den Tabellen 1 und 2 wird klar ersehen, daß der Prozentsatz von Fragmenten viel höher in der mit Na-phosphat gepufferten Lösung als in jener mit Na-citrat ist. B (Na-phosphat) enthält nach 15 Monaten Lagerung bei 5ºC 7,3% Fragmente und 92,7% des Monomers und A (Na-citrat) enthält 1,0% bzw. 98,9%.
Für F (Na-phosphat) beträgt die relative Menge an Fragmenten 2,9% und der Prozentsatz an Monomer beträgt 97,1% nach 6 Monaten Lagerung bei 5ºC. E (Na-citrat) enthält 0,2% bzw. 99,8%. B, C, D, F und G enthalten Na-phosphat und weisen alle hohe Prozentsätze an Fragmenten nach der Lagerung auf. D hat einen höheren pH, aber die Menge an Fragmenten ist höher als für die Lösung E unter Verwendung von 10 mM Na-citrat-Puffer. In D ist das Ausmaß der Desamidierung inakzeptabel hoch.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel wurde ausgeführt, um erfindungsgemäße Zusammensetzungen mit und ohne Benzylalkohol zu vergleichen. Siehe Tabelle 3.
Die Formulierungen wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 erklärt, hergestellt, aber die für die Formulierung verwendete Pufferlösung enthielt Benzylalkohol. Tabelle 3 Tabelle 3 Fortsetzung

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel wurde ausgeführt, um erfindungsgemäße Zusammensetzungen mit und ohne Benzylalkohol zu vergleichen. Siehe Tabelle 3.
Die Formulierungen wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 erklärt, hergestellt, aber die für die Formulierung verwendete Pufferlösung enthielt Benzylalkohol. Tabelle 3 Tabelle 3 Fortsetzung
Beispiel 2 wird ausgeführt, um zu zeigen, wie die Zugabe von Benzylalkohol die Stabilität beeinflußt, wenn Natriumcitrat als Puffer verwendet wird. Benzylalkohol ist ein Konservierungsmittel, das mit Vorbehalt in injizierbaren Multidosis-Zubereitungen verwendet werden kann. Gemäß den Arzneibüchern wird gefordert, daß injizierbaren Multidosis- Zubereitungen ein geeignetes Konservierungsmittel zugesetzt wird, um die mikrobielle Sicherheit des Produkts zu garantieren.
Da Benzylalkohol einen Einfluß auf die Isotonizität hat, wird die Menge von Mannitol entsprechend angepaßt, wenn Benzylalkohol zugesetzt wird.
Aus Tabelle 3 wird klar ersehen, daß die Zugabe von Benzylalkohol keinen Einfluß auf die Stabilität hat, wenn Nacitrat als Puffer verwendet wird.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel wurde ausgeführt, um erfindungsgemäße Zusammensetzungen mit und ohne Glycin und Mannitol zu vergleichen. Siehe Tabelle 4.
Die Formulierungen wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 erklärt, hergestellt. Tabelle 4
Aus Tabelle 4 kann ersehen werden, daß die Zugabe von Zusatzstoffen, wie Glycin und Mannitol, keinen Einfluß auf die Stabilität hat, wenn Na-citrat als Puffer verwendet wird.

Claims

1. Stabilisierte, injizierbare Formulierung von Wachstumshormon oder einem jeglichen funktionellen Analog davon, die mindestens 12 Monate stabil ist, bestehend aus dem Wachstumshormon und Citrat in einer Menge von 2-50 mM als Puffersubstanz bei einem pH von ungefähr 5 bis 7, um dadurch das Wachstumshormon in der Formulierung zu stabilisieren, und gegebenenfalls Aminosäuren und/oder Zuckeralkoholen und/oder Glycerol und/oder Kohlenhydraten und/oder Konservierungsmittel.

2. Formulierung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung eine wäßrige Lösung von hGH ist.

3. Formulierung nach Anspruch 2, wobei das Citrat als Puffersubstanz eine Konzentration von 2 bis 20 mM aufweist.

4. Wäßrige Lösung von hGH nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche Natriumcitrat als Puffersubstanz und einen pH von ungefähr 6-7 umfaßt.

5. Wäßrige Lösung von hGH nach Anspruch 4, welche Natriumcitrat in einer Menge von 5 mM umfaßt.

6. Wäßrige Lösung von hGH nach Anspruch 4, welche Natriumcitrat in einer Menge von 10 mM umfaßt.

7. Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welche Glycin und/oder Mannitol und/oder Glycerol umfaßt.

8. Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welche ein Konservierungsmittel umfaßt.

9. Formulierung nach Anspruch 8, die eine wäßrige Lösung von hGH ist und das Konservierungsmittel ist Benzylalkohol.

10. Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in welcher hGH rekombinantes hGH ist.

11. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch Mischen von Wachstumshormon oder einem jeglichen funktionellen Analog davon mit Citrat als Puffersubstanz oder durch Zugeben der Bestandteile der Endformulierung im Zuge des letzten Gelreinigungsschritts.