DE69423402T2 - Stabile, pharmazeutische Zusammensetzungen die hybrid alpha-Interferon enthalten - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft stabile wäßrige Zusammensetzungen, die ein α-Interferonhybrid enthalten.
• Die Interferone sind Familien mit induzierbaren sekretorischen Proteinen, die in Reaktion auf virale und andere Stimuli gebildet werden. Die α-Interferone werden derzeit klinisch zur Behandlung einer Vielzahl an unterschiedlichen Krankheitszuständen verwendet, die umfassen: Haarzelleukämie, Karposi Sarkom bei AsS, chronische Non-A, Non-B Hepatitis und Basalzellcarzinom.
• Es wurden rekombinante humane α-Interferon B/D Hybrideinheiten konstruiert, die verschiedene Teile der Sequenz der Ausgangs-α-Interferonarten B und D tragen, um Moleküle mit vorteilhaften Eigenschaften zu erzeugen (A. Meister, G. Uz, K. E. Mogensen, J. Gen. Virol. 67, 1633 (1986)). Die Ausgangsmoleküle werden geschnitten, um die DNA Segmente auszutauschen, die für die Peptidsequenzen 1-60, 61-92, 93-150 und 151-166 kodieren. Das BDBB Hybrid zeigt eine besonders interessante präklinische antivirale und antiproliferative Aktivität (H. K. Hochkeppel, G. Gruetter, M. A. Horisberger, J. K. Lazdins, Drugs of the Future, 17(10), 899, (1992)). Proteine, wie α-Interferon BDBB, haben komplexe chemische und physikalische Eigenschaften, die Schwierigkeiten bei der Reinigung, der Abtrennung, der Lagerung und der Verabreichung dieser Spezies verursachen. Daher unterscheidet sich die Formulierung von medizinischen Proteinarzneimitteln stark von der von unempfindlichen kleinen organischen Molekülen. Mehrere Klassen von Hilfsstoffen wurden bei parenteralen Formulierungen von Proteinen und Peptiden verwendet. Da Proteine eine schwache orale Bioverfügbarkeit aufweisen, ist der herkömmlichste Ansatz sie als injizierbare Produkte zu präsentieren, um eine effiziente Arzneimittelabgabe zu erreichen. Aufgrund der Instabilität in Lösung werden die Proteine im allgemeinen als lyophilisierte (gefriergetrocknete) Pulver zur unmittelbaren Rekonstitution vor der Injektion über subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Wege formuliert.
• Der Proteinabbau kann in zwei Kategorien getrennt werden, nämlich chemische und physikalische Stabilität. Die chemische Stabilität bezieht sich auf alle Vorgänge, bei denen das Protein chemisch durch die Bindungsspaltung oder -bildung modifiziert wird. Die physikalische Stabilität umfaßt nicht die kovalente Modifizierung, aber Veränderungen in der höheren Ordnungsstruktur des Proteins, beispielsweise durch Denaturierung, Aggregation oder Fällung. Es ist erwünscht, das Hybrid-α-Interferon BDBB in einem nicht-aggregierten Zustand zu halten, um alle möglichen immunogenen Nebenwirkungen und/oder inkonsistente Dosierung während der Therapie zu eliminieren.
• Bei einer gewünschten Konzentration zur Verwendung als injizierbares therapeutisches Mittel ist Hybridα-Interferon BDBB in Wasser physikalisch instabil. Die Löslichkeit wird beeinträchtigt und es liegt in einem aggregierten Zustand vor. Daher müssen stabilisierende Hilfsstoffe verwendet werden.
• Es wurde gefunden, daß Hybrid-α-Interferon in einem aggregierten Zustand vorkommt, wenn es in Lösung bei neutralem pH (phosphatgepuffert) formuliert wird. Zusätzlich scheint die Löslichkeit des Proteins unter solchen Bedingungen beeinträchtigt zu werden und es wird tatsächlich wenig gelöst.
• In der JP 59 196 823 A wird eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, die Interferon zusammen mit einem Zuckeralkohol und einem organisch puffernden Mittel enthält. Jedoch erwähnt dieses Dokument kein spezifisches Interferon oder beschreibt eine wäßrige Lösung, die nur Interferon und ein pufferndes Mittel enthält.
• Es wurde gefunden, daß die Formulierung von Hybrid-α-Interferon in wäßriger Lösung bei niedrigem pH das Protein stabilisiert, im gewünschten monomeren Zustand hält und es ermöglicht, mehr in Lösung zu bringen.
• Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung eine stabile wäßrige Lösung eines Hybrid-α-Interferons, die als Stabilisator einen Puffer bei einem pH von 3,0 bis 5,0 enthält.
• Der pH der Lösung beträgt vorzugsweise 4,0 bis 4,5.
• Das Hybrid-α-Interferon ist vorzugsweise α-Interferon BDBB (SEQ ID Nr. 1).
• Das ausgewählte Puffersalz sollte pharmazeutisch annehmbar sein, beispielsweise Glycin/HCl oder Natriumcitrat und vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 20 und 400 mM enthalten sein. Das bevorzugte Puffersalz ist Glycin/HCl in einer Konzentration von 50-150 mM.
• Ein pharmazeutisch annehmbares Polyol, beispielsweise Mannit, Glucose oder Saccarose kann auch verwendet werden, vorzugsweise bei einer Konzentration von 20-500 mM. Das bevorzugte Polyol ist Mannit bei einer Konzentration von 100-250 mM. Das Polyol wird hauptsächlich verwendet, um die Tonizität der Lösungen auf physiologische Werte einzustellen.
• Das Hybrid-α-Interferon ist vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1-1,5 mg/ml enthalten. Der bevorzugteste Bereich reicht von 0,2 bis 0,4 mg/ml.
• Das Hybrid-α-Interferon wird normal isoliert und in einem Mehrstufenverfahren gereinigt und als gefrorene Stammlösung in einem Puffersystem mit pH 7 gelagert, was nicht pharmazeutisch annehmbar ist. Um die erfindungsgemäßen stabilen Lösungen herzustellen, ist es notwendig, dieses Puffersystem gegen eines auszutauschen, das beim gewünschten pH pharmazeutisch annehmbar ist. Dies kann durch die Zugabe des gewünschten Puffers, Unterziehen der Lösung einer Ultrafiltration und mehrmalige Wiederholung des Zyklus ausgeführt werden. Es können andere Verfahren verwendet werden, wie Gelfiltrationschromatographie.
• Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind als Pharmazeutika für die oben erwähnten Indikationen durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion geeignet.
• Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
• Herstellung einer stabilen Citratlösungsformulierung mit 0,3 mg/ml Hybrid-α-Interferon BDBB bei pH 4,0
• Die Stammlösung des Hybrid-α-Interferons BDBB (2,6 mg/ml in 200 mM Ammoniumchlorid/20 mM Tris(hydroxymethyl)methylamin bei pH 7,0) wird mit 40 mM Natriumcitrat/Citronensäurepuffer bei pH 4,0 in einer Ultrafiltrationszelle (Amicon) auf 50 ml gebracht, die mit einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 10 kDa ausgestattet ist (Amicon YM10). Die Zelle wird bis 50-60 psi mittels sauerstofffreiem Stickstoff unter Druck gesetzt. Das Volumen wird ohne daß das Protein ausfällt unter kontinuierlichem Rühren zur Minimierung der Proteinkonzentration an der Oberfläche der Membran und mit 40 mM Natriumcitrat/Citronensäurepuffer bei pH 4,0 zurückverdünnt. Dieser Zyklus wird fünfmal wiederholt. Der pH der schließlichen Lösung wird mit 4,0 bestätigt. Der Proteingehalt der schließlichen Lösung wird bei 0,3 mg/ml mittels Standardverfahren bestätigt (Bradfordtest, Bio-Rad).
• Die oben beschriebene Formulierung wird sterilisiert, aseptisch in 2 ml fassende Typ I Glasröhrchen in Pharmaqualität abgefüllt und mit Teflon-beschichteten Gummisepten/Aluminiumkappen verschlossen. Die Gläschen werden bei 4ºC im Dunklen gelagert. Zu gegebenen Zeitintervallen werden die Proben durch Umkehrphasen HPLC (ein Maß für die chemische Stabilität) und Größenausschlußchromatographie (ein Maß für den Aggregationszustand des Proteins in Lösung) analysiert. Die Umkehrphasen-HPLC-Ergebnisse, ausgedrückt als % Hybrid-α- Interferon der Gesamtpeakfläche sind im folgenden gezeigt:
• 4ºC Lagerzeit/Tage [Hybrid-α-Interferon] % Gesamtpeakfläche
• Beginn 96,53
• 12 96,05
• 21 96,64
• 25 96,43
• 26 96,30
• 33 95,00
• 44 96,33
• 45 95,37
• 49 95,34
• 70 94,62
• 92 94,83
• 111 94,08
• 136 94,00
• Die Ergebnisse werden als Mittel von Mehrfachinjektionen (im allgemeinen 3-5) ausgedrückt. Der Variationskoeffizient (cv) für diese Bestimmungen beträgt < 0,3%.
• Der Abbau scheint Kinetiken pseudo-erster Ordnung zu folgen. Durch die Verlängerung der am besten angepaßten Geraden durch die Daten kann eine Abschätzung der Produkthaltbarkeit gemacht werden, die als benötigte Zeit definiert wird, die zum Abbau bis auf 95% (t 95) des Anfangsgehalts des Hybrid-&alpha;-Interferons BDBB benötigt wird. Diese Formulierung hat eine vorhergesagte Produkthaltbarkeit von mindestens 8 Monaten bei 4ºC.
• Die Größenausschlußchromatographie (SEC) zeigt keine detektierbare Bildung von Aggregaten nach der Lagerung für 136 Tage bei 4ºC.
Beispiel 2
• Das Beispiel 1 wird wiederholt, außer daß die Lösung auch 200 mM Mannit enthält. Die Stabilitätstests werden wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, aber bei einer Lagerung bei verschiedenen Temperaturen für beschleunigte Tests, wie dies im folgenden gezeigt ist.
• Lagertemperatur/Zeit [Hybrid-&alpha;-Interferon] % Gesamtpeakfläche
• 25ºC Beginn 96,33
• 1 Woche 96,07
• 2 Wochen 94,59
• 3 Wochen 94,07
• 4 Wochen 93,51
• 6 Wochen 91,83
• 13 Wochen 86,57
• Lagertemperatur/Zeit [Hybrid-&alpha;-Interferon] % Gesamtpeakfläche
• 30ºC Beginn 96,32
• 3 Wochen 93,22
• 6 Wochen 87,72
• 13 Wochen 78,91
• 40ºC Beginn 96,34
• 1 Woche 94,39
• 2 Wochen 86,04
• 6 Wochen 68,99
• Der Abbau scheint Kinetiken pseudo-erster Ordnung zu folgen. Mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens weist die Formulierung eine vorhergesagte Produkthaltbarkeit von über 6 Wochen bei 25ºC auf.
Beispiel 3
• Herstellung einer stabilen Glycinlösungsformulierung mit 0,3 mg/ml Hybrid-&alpha;-Interferon BDBB bei pH 4,0
• Mittels eines analogen Verfahrens zu dem, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wird eine Stammlösung des Hybrid-&alpha;-Interferons BDBB (2,6 mg/ml in 200 mM Ammoniumchlorid/20 mM Tris(hydroxymethyl)methylamin mit pH 7,0) in eine 0,3 mg/ml Lösung des Proteins in 80 mM Glycin/HCl Puffer bei pH 4,0 umgewandelt.
• Die Stabilitätstests der stabilen Hybrid-&alpha;-Interferon BDBB Glycinlösungsformulierung bei pH 4,0 werden gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ausgeführt. Die Ergebnisse sind folgende:
• 4ºC Lagerungszeit/Tage [Hybrid-&alpha;-Interferon] % Gesamtpeakfläche
• Beginn 96,93
• 9 96,04
• 19 95,50
• 21 96,49
• 44 95,83
• 49 95,45
• 92 95,50
• 136 95,26
• Der Abbau scheint Kinetiken pseudo-erster Ordnung zu folgen. Mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens weist die Formulierung eine vorhergesagte Produkthaltbarkeit von mindestens 18 Monaten bei 4ºC auf
• Die SEC zeigt keine signifikante Bildung von Aggregaten nach einer Lagerung bei 4ºC für 136 Tage.
Beispiel 4
• Das Beispiel 3 wird wiederholt, außer daß die Lösung 200 mM Mannit enthält. Die Stabilitätstests werden wie in Beispiel 3 ausgeführt, aber mit einer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen, wie dies unten gezeigt ist.
• Lagertemperatur/Zeit [Hybrid-&alpha;-Interferon] % Gesamtpeakfläche
• 4ºC Beginn 98,03
• 1 Woche 97,73
• 4 Wochen 96,92
• 8 Wochen 97,73
• 15 Wochen 97,64
• 20 Wochen 97,54
• 30 Wochen 97,60
• 40ºC Beginn 98,03
• 1 Woche 95,22
• 2 Wochen 92,97
• 4 Wochen 84,61
• Der Abbau scheint Kinetiken pseudo-erster Ordnung zu folgen. Mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens weist die Formulierung eine vorhergesagte Produkthaltbarkeit von mindestens 5 Jahren bei 4ºC auf.
• Die SEC zeigt keine signifikante Bildung von Aggregaten nach einer Lagerung bei 4ºC für 20 Wochen oder nach einer Lagerung bei 40ºC für 4 Wochen.
Beispiel 5
• Das Beispiel 3 wird wiederholt, außer daß die Konzentration des Glycin/HCl Puffers 318 mM beträgt. Die Stabilitätstests werden wie in Beispiel 3 ausgeführt, aber mit einer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen, wie dies im folgenden gezeigt ist.
• Lagertemperatur/Zeit [Hybrid-&alpha;-Interferon] % Gesamtpeakfläche
• 4ºC Beginn 97,22
• 2 Wochen 96,34
• 4 Wochen 96,46
• 8 Wochen 95,66
• 40ºC Beginn 97,22
• 1 Woche 91,16
• 2 Wochen 85,60
• 4 Wochen 77,41
• Der Abbau scheint Kinetiken pseudo-erster Ordnung zu folgen. Mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens weist die Formulierung eine vorhergesagte Produkthaltbarkeit von mindestens 6 Monaten bei 4ºC auf.
Sequenzliste
• (1) Allgemeine Information:
• (i) Anmelder:
• (A) Name: Ciby-Geigy AG
• (B) Straße: Klybeckstrasse 141
• (C) Stadt: Basel
• (E) Land: Schweiz
• (F) Postleitzahl: 4002
• (G) Telefon: 061 969 1111
• (H) Telefax: 061 969 7976
• (I) Telex: 962991
• (ii) Titel der Erfindung: Pharmazeutische Zusammensetzungen
• (iii) Anzahl der Sequenzen: 1
• (iv) Computerlesbare Form:
• (A) Mediumtyp: Diskette
• (B) Computer: IBM PC kompatibel
• (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
• (D) Software: Chemtext Version 1.50
• SEQ ID Nr. 1:
• (i) Sequenzeigenschaften:
• (A) Länge: 166 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (C) Strangart: einzeln
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: Protein
• (iii) Hypothetisch: nein
• (iv) Antisinn: nein (v) Name: rekombinantes Hybridinterferon &alpha;-BDBB
• (ix) Merkmal:
• (A) Name/Schlüssel: Dilsulfidbindung
• (B) Lage: Aminosäure 1 bis 99
• (ix) Merkmal:
• (A) Name/Schlüssel: Dilsulfidbindung
• (B) Lage: Aminosäure 29 bis 139

Claims (12)

1. Stabile wäßrige Lösung eines Hybrid-&alpha;-Interferons, die als Stabilisator einen Puffer mit einem pH von 3,0 bis 5,0 enthält.

2. Stabile Lösung nach Anspruch 1, die einen pH von 4,0 bis 4,5 aufweist.

3. Stabile Lösung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Puffer Glycin/HCl oder Natriumcitrat ist.

4. Stabile Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Puffer mit einer Konzentration von 20-400 mM vorliegt.

5. Stabile Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Puffer Glycin/HCl mit einer Konzentration von 50-150 mM ist.

6. Stabile Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Hybrid-&alpha;-Interferon &alpha;-Interferon BDBB (SEQ ID Nr. 1) ist.

7. Stabile Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Hybrid-&alpha;-Interferon eine Konzentration von 0,1 bis 1,5 mg/ml aufweist.

8. Stabile Lösung nach Anspruch 7, worin das Hybrid-&alpha;-Interferon eine Konzentration von 0,2 bis 0,4 mg/ml aufweist.

9. Stabile Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die auch ein pharmazeutisch annehmbares Polyol enthält.

10. Stabile Lösung nach Anspruch 9, worin das Polypol Mannit, Glucose oder Saccharose ist.

11. Stabile Lösung nach Anspruch 9 oder 10, worin das Polyol in einer Konzentration von 20 bis 500 mM enthalten ist.

12. Stabile Lösung nach Anspruch 9, worin das Polyol Mannit in einer Konzentration von 100 bis 250 mM ist.