Verwandte Anmeldung
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Die vorliegende Erfindung steht allgemein mit der in der US-Anmeldung mit der
Anmeldenummer 973452, eingereicht am 9. November 1992 (EP-A-0542487) unter dem
Titel "Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin", offenbarten Erfindung in Beziehung.
Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von L-Isoleucin
durch Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und Resistenz
gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder D-Serin sowie die Fähigkeit zur Produktion von
L-Isoleucin aufweist. L-Isoleucin ist eine Aminosäure, die als Medikament,
Lebensmittelzusatz und als Zusatz für Futtermittel nützlich ist.
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Im Hinblick auf das direkte Fermentierungsverfahren zur Produktion von
L-Isoleucin waren verschiedene Verfahren bekannt; zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung
eines Mikroorganismus, der zur Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium gehört und
Resistenz gegenüber α-Amino-β-hydroxyvalerinsäure zusammen mit einer zusätzlichen,
verliehenen Resistenz gegenüber einem oder mehreren Mitteln, ausgewählt aus Ethionin,
β-(2-Thiazolyl)-DL-alanin und S-(2-Aminoethyl)-L-cystein, aufweist (veröffentlichte,
ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 101582/75); ein Verfahren unter Verwendung eines
Mikroorganismus, der zur Gattung Corynebacterium gehört und Resistenz gegenüber
S-(2-Aminoethyl)-L-cystein aufweist (veröffentlichte, ungeprüfte Japanische
Patentanmeldung Nr. 61290/77); und ein Verfahren unter Verwendung eines Stamms von Escherichia
coli, der gegenüber 2-Amino-3-methylthiobuttersäure resistent ist (Chemical Abstracts 89
(1987), 17, AN 145017h).
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Ein wirksames Verfahren zur Produktion von L-Isoleucin ist vom industriellen
Gesichtspunkt aus immer gefragt.
Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann L-Isoleucin in großen Ausbeuten bei
geringen Kosten durch Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört
und Resistenz gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder D-Serin sowie die Fähigkeit zur
Produktion von L-Isoleucin aufweist, in einem Medium, Anreicherung von L-Isoleucin in der
Kultur und Gewinnung von L-Isoleucin daraus produziert werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jeder Mikroorganismus verwendet
werden, solange er zur Gattung Escherichia gehört, Resistenz gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-
cystein oder D-Serin und die Fähigkeit zur Produktion von L-Isoleucin aufweist.
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Die erfindungsgemäß verwendeten geeigneten Mikroorganismen können erhalten
werden, indem L-Isoleucin-produzierende Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia
gehören, einer herkömmlichen Mutagenese, wie Behandlung mit
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und Röntgenstrahlung, unterworfen, die so erhaltenen Mikroorganismen auf einer
Agarplatte mit Minimalmedium, enthaltend S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder D-Serin,
ausgestrichen und Kolonien, die auf der Agarplatte mit Minimalmedium wachsen, aufgenommen
werden.
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Alternativ können die geeigneten Mikroorganismen erhalten werden, indem eine
Mutante mit Resistenz gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein oder D-Serin, die von einem
Stamm vom Wildtyp stammt, einer Mutagenese unterzogen wird, um deren
L-Isoleucin-Produktivität zu steigern.
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Beispiele der bevorzugten Mikroorganismen sind Escherichia coli H-8670 und
Escherichia coli H-8683.
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Erfindungsgemäß kann die Produktion von L-Isoleucin durch Züchtung der
vorstehenden Mikroorganismen in herkömmlicher Weise ausgeführt werden. Als Medium kann
jedes synthetische oder natürliche Medium verwendet werden, solange es geeignete
Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und geringe Mengen anderer
Nährstoffe enthält, die der verwendete Stamm benötigt.
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Als Kohlenstoffquelle können Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Lactose,
Melasse, Cellulosehydrolysat, Hydrolysat von Rohzucker und Stärkehydrolysat; und organische
Säuren, wie Brenztraubensäure, Essigsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure und Milchsäure,
verwendet werden. Ferner können auch Glycerin, Alkohole wie Ethanol, etc. verwendet werden,
mit der Maßgabe, daß sie von dem verwendeten Stamm assimiliert werden können.
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Als Stickstoffquelle können Ammoniak; verschiedene anorganische Salze, wie
Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat; Ammoniumsalze
organischer Säuren wie Ammoniumacetat, Amine und andere stickstoffhaltige Verbindungen,
Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Sojabohnenpreßkuchenhydrolysat,
verschiedene angezüchtete Zellen und deren Spaltprodukt, etc. verwendet werden.
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Als anorganische Verbindung können Kaliumdihydrogenphosphat,
Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat,
Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat, etc. verwendet werden.
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Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, z. B. mittels Schüttelkultur und
submerser Schüttelkultur unter Belüftung, bei einer Temperatur von 20ºC bis 40ºC,
vorzugsweise 25 bis 38ºC, ausgeführt. Der pH-Wert des Mediums liegt im Bereich von 5 bis 9 und
wird vorzugsweise nahezu neutral gehalten. Der pH-Wert wird mit Calciumcarbonat,
anorganischen oder organischen Säuren, alkalischen Lösungen, Ammoniak, pH-Pufferungsmitteln
oder ähnlichen Mitteln eingestellt.
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Nach Züchtung während 2 bis 7 Tagen reichert sich L-Isoleucin üblicherweise in
der Kultur an.
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Nach der Beendigung der Züchtung werden Präzipitate, wie Zellen, aus der Kultur
durch Zentrifugation, etc. entfernt, und L-Isoleucin kann aus dem Überstand mittels
Ionenaustauschbehandlung, Konzentrieren, Aussalzen, etc. in Verbindung miteinander gewonnen
werden.
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Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen
veranschaulicht.
Beispiel 1:
Herstellung eines Mutantenstamms mit Resistenz gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein
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Escherichia coli H-8664, das von Escherichia coli H-8285 (FERM BP-3629)
stammt und ein Erfordernis für Methionin, eine α-Amino-β-hydroxyvalerinsäure-Resistenz,
Rifampicin-Resistenz, Thiaisoleucin-Resistenz, Argininhydroxamat-Resistenz und eine DL-
Ethionin-Resistenz aufweist, wurde einer herkömmlichen Mutationsbehandlung mit
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (0,2 mg/ml, 33ºC, 30 Minuten) unterworfen und dann auf
einer Agarplatte mit Minimalmedium (0,5% Glucose, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/l
Calciumchlorid, 2% Agar, pH 7,2), enthaltend 0,2 g/l S-(2-Aminoethyl)-L-cystein, 3 g/l DL-
Methionin und 10 g/l L-Threonin, ausgestrichen. Nach Züchtung bei 33ºC während 2 bis 5
Tagen wurden große Kolonien, die auf dem Medium wuchsen, als mutierte Stämme mit
Resistenz gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein angezüchtet und dem
L-Isoleucin-Produktionstest unterzogen, um Stämme mit einer Fähigkeit zur L-Isoleucin-Produktion zu
selektieren, die größer als die des Elternstamms ist. Unter den auf diese Weise selektierten Stämmen
befand sich Escherichia coli H-8670.
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Der so erhaltene Stamm H-8670 wurde am 22. Oktober 1992 beim Fermentation
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, gemäß dem Budapester
Vertrag unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4051 hinterlegt.
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Der Stamm H-8670 wurde mit dem Elternstamm in bezug auf den Resistenzgrad
gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein in der folgenden Weise verglichen.
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Der Mutantenstamm und der Elternstamm wurden auf einer Agarplatte mit
natürlichem Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% Natriumchlorid, 2% Agar, pH 7,2) 24
Stunden gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden in sterilisiertem Wasser suspendiert, und
die Zellsuspension wurde ausgestrichen, wobei eine Dichte von etwa 1 · 10³ Zellen/cm² auf
der vorstehend erwähnten Agarplatte mit Minimalmedium erhalten wurde, das
S-(2-Aminoethyl)-L-cystein in den in Tabelle 1 gezeigten Mengen, 3 g/l DL-Methionin und 10 g/l
L-Threonin enthielt. Die Züchtung wurde 72 Stunden bei 33ºC ausgeführt und der
Vermehrungsgrad wurde beobachtet. Der Resistenzgrad gegenüber S-(2-Aminoethyl)-L-cystein
wurde im Hinblick auf den Vermehrungsgrad ausgedrückt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
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+: ausreichendes Wachstum
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-: kein Wachstum
Beispiel 2:
L-Isoleucin-Produktionstest
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Der in Beispiel 1 erhaltene Stamm Escherichia coli H-8670 und der Elternstamm
Escherichia coli H-8664 wurden auf 20 ml Impfmedium (2% Glucose, 1% Pepton, 1%
Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid, pH 7,0) in einen 300 ml-Erlenmeyerkolben überimpft und
unter Schütteln 16 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die so erhaltene Impfkultur (2 ml) wurde auf
100 ml Fermentationsmedium (6% Glucose, 0,2% Maisquellwasser, 1,6% Ammoniumsulfat,
0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mg/l DL-Methionin, 4% Magnesiumphosphat, 1%
Calciumcarbonat, pH 7,0) in einem 2 l-Erlenmeyerkolben überimpft und unter Schütteln 72
Stunden bei 30ºC gezüchtet.
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Nach der Beendigung der Züchtung wurde die Menge an angereichertem
L-Isoleucin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
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Stamm L-Isoleucin (g/l)
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H-8664 9,0
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H-8670 12,2
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Ein Liter der L-Isoleucin enthaltenden Kultur, die durch Züchtung des Stamms
H-8670 erhalten wurde, wurde zentrifugiert (3000 UpM, 10 Minuten), um die Zellen und
andere Verunreinigungen daraus zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde über eine mit
einem stark sauren Kationenaustauscherharz, DIAION (Typ H&spplus;, Produkt von Mitsubishi
Kasei Corporation, Japan) gepackte Säule geleitet, um das L-Isoleucin daran zu adsorbieren.
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Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und einer Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak
unterzogen, um L-Isoleucin-Fraktionen zu gewinnen. Die gewonnenen Fraktionen wurden
konzentriert und zu dem Konzentrat wurde Ethanol zugegeben. Durch Lagerung des
Gemisches unter Kühlen wurden 10,3 g L-Isoleucin-Kristalle mit einer Reinheit von 98% oder
höher erhalten.
Beispiel 3:
Herstellung eines Mutantenstamms mit Resistenz gegenüber D-Serin
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Der in Beispiel 1 erhaltene Stamm Escherichia coli H-8670 (FERM BP-4051)
wurde einer herkömmlichen Mutationsbehandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (0,2
mg/ml, 33ºC, 30 Minuten) unterworfen und dann auf einer Agarplatte mit Minimalmedium
(0,5% Glucose, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6%
Dinatriumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 20 mg/l Calciumchlorid, 2% Agar, pH 7,2),
enthaltend 20 g/l D-Serin und 3 g/l DL-Methionin, ausgestrichen. Nach Züchtung bei 33ºC
während 2 bis 5 Tagen wurden große Kolonien, die auf dem Medium wuchsen, als
Mutantenstämme mit Resistenz gegenüber D-Serin angezüchtet und dem L-Isoleucin-Produktionstest
unterzogen, um Stämme mit einer Fähigkeit zur L-Isoleucin-Produktion zu selektieren, die
größer als die des Elternstamms ist. Unter den auf diese Weise selektierten Stämmen befand
sich Escherichia coli H-8683.
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Der so erhaltene Stamm H-8683 wurde am 22. Oktober 1992 beim Fermentation
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, gemäß dem Budapester
Vertrag unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4052 hinterlegt.
-
Der Stamm H-8683 wurden mit dem Elternstamm in bezug auf den Resistenzgrad
gegenüber D-Serin in der folgenden Weise verglichen.
-
Der Mutantenstamm und der Elternstamm wurden auf einer Agarplatte mit
natürlichem Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% Natriumchlorid, 2% Agar, pH 7,2) 24
Stunden gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden in sterilisiertem Wasser suspendiert, und
die Zellsuspension wurde ausgestrichen, wobei eine Dichte von etwa 1 · 10³ Zellen/cm² auf
der vorstehend erwähnten Agarplatte mit Minimalmedium erhalten wurde, das D-Serin in den
in Tabelle 3 gezeigten Mengen und 3 g/l DL-Methionin enthielt. Die Züchtung wurde 72
Stunden bei 33ºC ausgeführt und der Vermehrungsgrad wurde beobachtet. Der Resistenzgrad
gegenüber D-Serin wurde im Hinblick auf den Vermehrungsgrad ausgedrückt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
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+: ausreichendes Wachstum
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-: kein Wachstum
Beispiel 4:
L-Isoleucin-Produktionstest
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Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm Escherichia coli H-8683 und der Elternstamm
Escherichia coli H-8670 wurden auf 20 ml Impfmedium (2% Glucose, 1% Pepton, 1%
Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid, pH 7,0) in einem 300 ml-Erlenmeyerkolben überimpft und
unter Schütteln 16 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die so erhaltene Impfkultur (2 ml) wurde auf
100 ml Fermentationsmedium (6% Glucose, 0,2% Maisquellwasser, 1,6% Ammoniumsulfat,
0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mg/l DL-Methionin, 4% Magnesiumphosphat, 1%
Calciumcarbonat, pH 7,0) in einem 2 l-Erlenmeyerkolben überimpft und unter Schütteln 72
Stunden bei 30ºC gezüchtet.
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Nach der Beendigung der Züchtung wurde die Menge an angereichertem
L-Isoleucin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
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Stamm L-Isoleucin (g/l)
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H-8670 12,2
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H-8683 14,1
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Ein Liter der L-Isoleucin enthaltenden Kultur, die durch Züchtung des Stamms
H-8683 erhalten wurde, wurde zentrifugiert (3000 UpM, 10 Minuten), um die Zellen und
andere Verunreinigungen daraus zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde über eine mit
einem stark sauren Kationenaustauscherharz, DIAION (Typ H&spplus;, Produkt von Mitsubishi
Kasei Corporation, Japan) gepackte Säule geleitet, um das L-Isoleucin daran zu adsorbieren.
Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und einer Elution mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak
unterzogen, um L-Isoleucin-Fraktionen zu gewinnen. Die gewonnenen Fraktionen wurden
konzentriert und zu dem Konzentrat wurde Ethanol zugegeben. Durch Lagerung des
Gemisches unter Kühlen wurden 11,9 g L-Isoleucin-Kristalle mit einer Reinheit von 98% oder
höher erhalten.