DE68927933T2

DE68927933T2 - Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen

Info

Publication number: DE68927933T2
Application number: DE68927933T
Authority: DE
Inventors: Sonia Guterman; Robert Ladner
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1988-09-02
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1997-08-14
Anticipated expiration: 2009-09-02
Also published as: DE768377T1; DE68927933D1; IL91501A; WO1990002809A1; AU4308689A; EP0768377A1; EP1026240A2; EP1997891A1; EP1541682A3; EP1026240A3; JP3771253B2; EP1541682A2; EP0436597A1; IL91501A0; EP0436597A4; JPH04502700A; EP0436597B1; ATE151110T1; EP1892296A1; CA1340288C

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Entwicklung neuer Bindeproteine durch ein sich wiederholendes Verfahren der Mutagenese, Expression, chromatographischen Trennung und Amplifikation.

Stand der Technik

Die Aminosäuresequenz eines Proteins bestimmt seine dreidimensionale (3D) Struktur, die wiederum die Proteinfunktion bestimmt (EPST63, ANFI73). Das Klassifikationssystem der Proteinstruktur von Schulz und Schirmer (SCHU79, ch 5) wird hierin übernommen.
Die 3D-Struktur eines Proteins wird an manchen Stellen nicht wesentlich durch die Identität der Aminosäuren beeinflußt; an anderen Stellen sind nur eine oder wenige Aminosäuretypen erlaubt (SHOR8S, EISE85, REID88). Im allgemeinen besitzen Stellen, an denen eine große Variabilität erlaubt ist, Aminosäuregruppen, die zum Lösungsmittel hin gerichtet sind. Dagegen ist nur eine begrenzte Variabilität erlaubt, wo die Seitengruppen zu anderen Teilen des Proteins hin gerichtet sind. (Siehe auch SCHU79, S.169-171 und CREI84, S.239-245, 314-315).
Die Sekundärstruktur (Helices, Faltblätter, Biegungen, Schleifen) eines Proteins wird am meisten durch die örtliche Sequenz bestimmt. Gewisse Aminosäuren tendieren dazu, mit gewissen Sekundärstrukturen korreliert zu sein, und die allgemein verwendeten Chou-Fasman (CHOU74, CHOU78a, CHOU78b)-Regeln sind von diesen Korrelationen abgeleitet. Jedoch ist jeder Aminosäuretyp in Helices und in sowohl parallelen als auch antiparallelen Faltblättern beobachtet worden. Pentapeptide identischer Sequenz werden in verschiedenen Proteinen gefunden; in einigen Fällen sind die Konformationen der Pentapeptide sehr verschieden (KABS84,ARGO87).
Biegungen und Schleifen tolerieren Insertionen und Deletionen besser als andere Sekundärstrukturen (RICH81, THOR88, SUTC87a); verwandte Proteine unterscheiden sich meistens in den Schleifen und Biegungen.
Die Änderung dreier Reste in Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens in einer Weise, daß diese dieselben sind wie die entsprechenden Reste in Subtilisin von B. licheniformis ergab eine Protease, die ungefähr dieselbe Aktivität wie das Subtilisin des letzteren Organismus besaß; 82 Unterschiede verblieben in der Sequenz. Die drei geänderten Reste wurden ausgewählt, da diese die einzigen Unterschiede innerhalb von 7 Ångström (Å) des aktiven Zentrums darstellten (WELL87a).
Schulz und Schirmer fassen einige Beobachtungen über die Bindung von Proteinen an andere Moleküle zusammen (SCHU79, S.98-105). Beispielsweise binden Hämoglobin-alpha-Ketten sehr fest an Hämoglobin-beta-Ketten (delta G negativer als -11,0 Kcal/Mol); Antikörper binden fest an Antigene (Kds liegt im Bereich von 10&supmin;&sup6; bis 10 M, Kd ist die Dissoziationskonstante, die gleich ist mit [A][B]/[A:B]); der basische Rinderpankreas-Trypsininhibitor (BPTI) bindet fest an Trypsin (Kd = 6,0 x 10&supmin;¹&sup4; M (TSCH87), delta G = -18,0 Kcal/Mol); und Avidin bindet an Biotin (Kd = 1,3 x 10&supmin;¹&sup5; M (CREI84, S.362)). In jedem Fall ergibt sich die Bindung aus der Komplementarität der Oberflächen, die miteinander in Kontakt kommen: Ausstülpungen passen in Löcher, ungleiche Ladungen ziehen sich an, Dipole richten sich aus und hydrophobe Atome kommen mit anderen hydrophoben Atomen in Kontakt. Obwohl der Großteil des Wassers ausgeschlossen ist, wird oft gefunden, daß einzelne Wassermoleküle den Raum in intermolekularen Zwischenschichten ausfüllen; diese Wassermoleküle bilden üblicherweise Wasserstoffbrückenbindungen zu einem oder mehreren Atomen des Proteins oder zu weiteren gebundenen Wassermolekülen.
Die Faktoren, die die Proteinbindung beeinflussen, sind bekannt, (CHOT75, CHOT76, SCHU79, S.98-107 und CREI84, ch8), jedoch hat sich das Entwerfen neuer komplementärer Oberflächen als schwierig erwiesen. Obwohl für Austausch- Seitengruppen (SUTC87b) einige Regeln entwickelt worden sind, ist zu beachten, daß die Seitengruppen von Proteinen beweglich sind, und es schwierig ist vorauszusagen, welche Konformation eine neue Seitengruppe einnehmen wird. Weiterhin sind die Kräfte, die Proteine an andere Moleküle binden, relativ schwach, und es ist schwierig, die Effekte dieser Kräfte vorauszusagen. Folglich ist es schwierig, allein auf der Grundlage der Theorie verbesserte Bindeproteine zu entwerfen (QUIO87).
Jedoch ist die Enzym-Substrat-Affinität zufällig durch Protein-Engineering erhöht worden (WILK84). Eine Punktmutante der Tyrosyl-tRNA-Synthetase von Bacillus stearothermodhilus zeigt einen 100-fachen Anstieg der Affinität für ATP. Der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere an einer Oberflächenstelle kann die anderen Bindungseigenschaften des Proteins als die Substratbindung erheblich verändern, ohne daß die Tertiärstruktur des Proteins beeinflußt wird. Beispielsweise verursacht die Änderung des Oberflächenrestes E6 in V in den beta-Ketten des Sichelzellhämoglobins, daß das Desoxyhämoglobin-S durch Selbstbindung Fasern bildet (DICK83, p125-145); die Tertiär- und Quartärstruktur des Hämoglobins werden nicht verändert (PADL85, WISH75, WISH76).
Das Verändern einer einzigen Aminosäure in BPTI vermindert dessen Bindungsstärke an Trypsin erheblich, jedoch behalten einige der neuen Moleküle die ursprünglichen Merkmale der Bindung an und der Hemmung von Chymotrypsin, während andere ein neues Bindungsverhalten an Elastase zeigen (TANK77; TSCH87). Die Änderungen einzelner Aminosäuren auf der Oberfläche des Lambda Cro-Repressors vermindern dessen Affinität für den natürlichen Operator Or3 stark, steigern jedoch erheblich die Bindung des mutierten Proteins an einen mutierten Operator (EISE85). Folglich kann die Veränderung der Oberfläche eines Bindeproteins dessen Spezifität ohne Verlust der Bindungsaktivität ändern.
Die kürzlich entwickelten Techniken der "reversen Genetik" (reverse genetics) sind angewendet worden, um einzelne spezifische Mutationen an präzisen Basenpaar- Loci herzustellen (OLIP86, OLIP87 und AUSU87). Mutationen werden gewöhnlich durch Sequenzieren und in einigen Fällen durch den Verlust der Wildtyp-Funktion nachgewiesen. Diese Verfahren erlauben Forschern, die Funktion jedes einzelnen Restes in einem Protein (MILL88) oder jedes einzelnen Basenpaares in einer Sequenz regulatorischer DNA zu analysieren (CHEN88). Bei diesen Analysen ist es die Norm gewesen, nach dem klassischen Ziel zu streben, Mutanten zu erhalten, die eine einzige Veränderung tragen (AUSU87).
Reverse Genetik wird oft auf kodierende Bereiche angewandt, um zu bestimmen, welche Reste am wichtigsten für die Proteinstruktur und -funktion sind; die Isolierung einer einzigen Mutante für jeden Rest eines Proteins läßt anfänglich abschätzen, welche Reste eine Schlüsselrolle spielen.
Vor dem erfindungsgemäßen Verfahren sind zwei allgemeine Wege entwickelt worden, um neue Proteinmutanten durch reverse Genetik zu erzeugen. Beim ersten Weg - "Proteinchirurgie" genannt (DILL87) - wird eine spezifische Substitution an einem einzelnen Proteinrest eingeführt, um die Auswirkungen der spezifischen Substitutionen auf die Struktur und die Funktion zu bestimmen (CRAI85) (RAOS87) (BASH87). Jedoch werden für viele gewünschte Proteinveränderungen mehrfache Aminosäuresubstitutionen benötigt, und daher sind diese durch Einzelbasenaustausche oder selbst durch alle möglichen Aminosäuresubstitutionen an jedem möglichen Rest nicht zugänglich.
Der andere Weg basiert auf dem Zufall, um unter der Verwendung von mutagenen Chemikalien oder Bestrahlung verschiedene Mutanten an vielen Stellen innerhalb eines klonierten Gens zu erzeugen. Der spezifische Ort und die Art der Veränderung werden durch DNA-Sequenzierung bestimmt (PAKU86). Dieser Weg wird durch die Anzahl der Kolonien, die überprüft werden können, begrenzt. Weiterhin zieht er keinen Vorteil aus irgendwelchen Kenntnissen der Proteinstruktur und deren Verhältnis zur Bindungsaktivität.
Der Fortschritt hin zu Regeln, die Substitutionen von Aminosäuren leiten(ULME83), ist durch die extensiven Anstrengungen, die bei der Verwendung beider Methoden notwendig sind und die methodischen Beschränkungen bezüglich der Anzahl der Kolonien, die überprüft werden können, stark gehindert worden (ROBE86).
Der Ausdruck "Sättigungsmutagenese" mit Bezug auf synthetische DNA wird allgemein so verwendet, daß er die Erzeugung einer Population bedeutet, in welcher: a) jeder mögliche Basenpaaraustausch innerhalb eines Genfragments einer regulatorischen DNA-Region repräsentiert ist und b) die meisten mutierten Gene nur eine einzige Mutation enthalten. Folglich umfaßt eine Serie aller möglichen Einzelmutationen für eine 6 Basenpaare lange DNA eine Population von 18 Mutanten. Oliphant et al. (OLIP86) und Oliphant und Struhl (OLIP87) haben die Ligierung und Klonierung hoch degenerierter Oligonukleotide gezeigt und Sättigungsmutagenese auf die Untersuchung der Promotorsequenz und -funktion angewandt. Sie schlagen vor, daß ähnliche Methoden verwendet werden können, um die genetische Expression von Proteinen zu untersuchen; sie sagen jedoch nicht, wie die zu verändernden Proteinreste ausgewählt oder b) Mutanten mit gewünschten Eigenschaften selektiert oder durchmustert werden sollen.
Reidhaar-Olson und Sauer (REID88) haben synthetische, degenerierte Oligonukleotide verwendet, um gleichzeitig zwei oder drei Reste über alle 20 Aminosäuren hinweg in der Dimer-Grenzfläche des cI-Repressors vom Bakteriophagen Lambda zu verändern. Sie diskutieren nicht die Beschränkungen dahingehend, wieviele Reste auf einmal verändert werden können, noch erwähnen sie das Problem der ungleichen Häufigkeit von DNA, die für verschiedene Aminosäuren kodiert. Sie suchten Proteine, die entweder Wildtyp-Dimerisierung aufwiesen oder die keine Dimerisierung zeigten. Sie suchten keine Proteine, die neue Bindungseigenschaften aufweisen, und berichteten über keine von diesen.
Mehrere Forscher haben Proteine de novo entworfen und synthetisiert. Diese entworfenen Proteine sind klein, und die meisten sind in vitro als Polypeptide und nicht genetisch synthetisiert worden. Gutte und Kollegen haben ein Polypeptid hergestellt, das an DDT in 55 %-igem Ethanol bindet (MOSE83). Kürzlich berichteten Moser et al. (MOSE87) über die genetische Expression sowohl eines entworfenen, 24 Reste langen DDT-Bindeproteins als auch von Fusionen der DDT- Bindungssequenz an LacZ in E. coli. Sie stellen fest, daß das Entwerfen biologisch aktiver Proteine gegenwärtig unmöglich ist.
Erickson et al. (ERIC86) haben eine Serie von Proteinen entworfen und synthetisiert, die sie Betabelline nannten, was bedeutet, daß sie Beta-Faltblätter enthalten. Sie schlagen die Verwendung der Polypeptidsynthese mit gemischten Reagenzien vor, um mehrere hundert analoge Betabelline herzustellen, und die Verwendung einer Säule, um Analoga mit einer hohen Affinität für eine ausgewählte Zielverbindung, welche an die Säule gebunden wird, zu gewinnen. Sie sehen wiederholte Runden einer gemischten Synthese von Proteinvarianten und die Reinigung durch spezifische Bindung vor. Sie diskutieren nicht, auf welche Weise die zu verändernden Reste ausgewählt werden sollen. Da Proteine nicht amplifiziert werden können, müssen die Forscher die gewonnenen Proteine sequenzieren, damit in Erfahrung gebracht werden kann, welche Substitutionen die Bindung verbessern. Die Forscher müssen den Diversifizierungsgrad begrenzen, so daß jede Proteinvariante in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, damit die isolierte Fraktion sequenziert werden kann.
Verfahren sind entwickelt worden, um Zellen über deren Affinität an verschiedene Substanzen zu trennen. Auf tierische Zellen angewandte Verfahren führen zu allgemeinen Problemen: a) nicht-spezifische Wechselwirkungen zwischen Zellen und Affinitätsträger und b) irreversible Bindung von Zellen an Affinitätsmatrices (BONN85).
Ferenci und Mitarbeiter haben eine Reihe von Artikeln über die chromatographische Isolierung von Mutanten des Maltose-Transportproteins LamB von E. coli veröffentlicht (WAND79, FERE80a, FERE80b, FERE80c, FERE82a, FERE82b, FERE83, CLUN84, FERE86a, FERE86b, FERE86c, FERE87a, FERE87b, HEIN87 und HEIN88). Die Artikel berichten, daß spontane und induzierte Mutanten an dem LamB-Genort durch Chromatographie über eine Säule isoliert werden können, die immobilisierte Maltose, Maltodextrine oder Stärke trägt. Die Berichte spekulieren, daß weitere Anwendungen möglich sind, erwähnen jedoch spezifisch nur die Aufklärung der Reste, die für die Selektivität der Maltodextrin-Poren- oder ähnlicher Porenproteine verantwortlich sind. Die mutierten Proteine waren nicht-chimär, und es wurde kein Versuch unternommen, eine Bindung an neue Zielsubstanzen zu erhalten.
Sowohl FERE86a als auch CLUN84 heben die Schwierigkeiten hervor, die sich ergeben, wenn man mit lebenden Bakterien arbeitet, die Chemikalien metabolisieren können und ihr physiologisches Verhalten während des chromatographischen Experiments verändern.
Ein Fragment eines heterologen Gens kann in das Baktenophagen F1-Gen III eingebracht werden (SMIT85). Wenn das eingebaute Fragment den ursprünglichen Leserahmen aufrechterhält, verursacht die Expression des veränderten Gens III, daß ein eingebautes Segment in dem Gen III-Protein erscheint. Der entstandene Stamm der F1-Virionen wird durch einen Antikörper gegen das von der heterologen DNA kodierte Protein adsorbiert. Die Phagen wurden bei pH 2,2 eluiert und behielten einige Infektiösität bei. Jedoch wurde die einzige Kopie des F1-Gens III für die Insertion des heterologen Gens verwendet, so daß alle Kopien des Gen III-Proteins beeinflußt waren; die Infektiosität der entstandenen Phagen war 25-fach vermindert.
Smith stellte sein Verfahren als einen Weg vor, klonierte Gene unter Verwendung von Antikörpern gegen die Genprodukte zu isolieren. Er erwähnte das Mutagenisieren des eingebauten genetischen Materials oder das Induzieren neuer Bindungseigenschaften in der eingebauten Proteindomäne nicht.
Ein Fragment der Wiederholungsregion des Circumsporozoit-Proteins von Plasmodium falciparum ist auf der Oberfläche von M13 als ein Insert im Gen III- Protein exprimiert worden (CRUZ88). Die rekombinanten Phagen waren in Kaninchen sowohl antigenisch als auch immunogen. Die Autoren schlagen nicht die Mutagenese des eingebauten Materials vor.
Genfragmente, die für Hepatitis B-Virusepitope kodieren, sind an Fragmente von lamb fusioniert worden; wenn die Fusion in einer Region erfolgt, die für exponierte Domänen von LamB kodiert, erscheinen die HBV-Epitope auf der Zelloberfläche und sind immunogen (CHAR87). Charbit et al. (CHAR87) schlagen die Verwendung dieser manipulierten Stämme für die Entwicklung einer bakteriellen Lebendvakzine vor; sie schlugen weder die Mutagenese der fusionierten, heterologen Genfragmente noch die Entwicklung der Bindungsfähigkeiten vor.
Ladner, US-Patent Nr. 4 704 692 "Computer-unterstütztes System und Verfahren zum Bestimmen und Aufzeichnen möglicher chemischer Strukturen für die Umwandlung doppelkettiger oder mehrfachkettiger Polypeptide in einzelkettige Polypeptide", beschreiben ein gezieltes Verfahren zum Umwandeln von Proteinen, die aus zwei oder mehreren Ketten zusammengesetzt sind, in Proteine mit weniger Polypeptidketten, jedoch mit der im wesentlichen gleichen 3D-Struktur. Variierte DNA und genetische Selektion sind nicht erwähnt. Ladner und Bird, WO88/01649 (Veröffentlichung am 10. März 1988) offenbaren die spezifische Anwendung von computerisiertem Design von Linker-Peptiden auf die Herstellung von Einzelketten- Antikörpern.
Ladner, Glick und Bird, WO88/06630 (veröffentlicht am 7. September 1988) (LGB) spekulieren, daß verschiedene Einzelketten-Antikörperdomänen auf die Bindung an ein bestimmtes Antigen dadurch durchmustert werden können, daß die DNA, welche für die Bindungs-determinierenden Regionen eines Einzelketten-Antikörpers kodiert, variiert wird, das SCAD-Gen in das gpV-Gen eines Lambda-Phagen subkloniert wird, so daß eine SCAD/gpV-Chimäre auf der äußeren Oberfläche des Phagen präsentiert wird, und Phagen, welche bei der Affinitätschromatographie an das Antigen binden, selektiert werden. Das einzige erwähnte Antigen ist das Wachstumshormon vom Rind. Keine weiteren Bindemoleküle, Zielmoleküle, Trägerorganismen oder Proteine der äußeren Oberfläche werden diskutiert. Weder das Verfahren noch die Mutageneserate werden erwähnt.
Ladner und Bird, WO88/06601 (veröffentlicht am 7. September 1988) schlagen vor, daß aus einer einzelnen Kette bestehende "pseudodimere" Repressoren (DNA- Bindeproteine) dadurch hergestellt werden können, daß ein mutmaßliches Linker- Peptid mutiert wird, worauf eine in vivo-Selektion dieser Mutation folgt, und daß eine Selektion angewendet werden kann, um eine Bibliothek von Erkennungselementen zur Verwendung beim Entwurf asymmetrischer Repressoren zu erzeugen. Die Repressoren werden nicht auf der äußeren Oberfläche eines Organismus präsentiert.
Es wird nicht versichert, daß irgendeine zitierte Referenz Stand der Technik oder einschlägiger Stand der Technik ist, und die erwähnten Daten sind diejenigen, die auf den Referenzen erscheinen und müssen nicht identisch mit den tatsächlichen Veröffentlichungsdaten sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erflndung betrifft die Konstruktion, Expression und Selektion mutierter Gene, die neue Proteine mit gewünschten Bindungseigenschaften wie auch diese Proteine selbst spezifizieren. Die Substanzen, die von diesen Proteinen gebunden werden - nachstehend als "Zielsubstanzen" bezeichnet - können Proteine sein, müssen jedoch keine Proteine sein. Zielsubstanzen können sowohl andere biologische oder synthetische Makromoleküle als auch organische und anorganische Moleküle umfassen.
Die neuen Bindeproteine können erhalten werden: 1) durch Mutieren eines für ein bekanntes Bindeprotein kodierenden Gens innerhalb der für eine bekannte Bindedomäne kodierenden Subsequenz oder 2) dadurch, daß eine solche Subsequenz des Gens für ein erstes Protein genommen und mit einem vollständigen Gen oder einem Teil davon für ein zweites Protein (welches selbst ein bekanntes Bindeprotein sein kann oder nicht) kombiniert wird, 3) durch Mutieren eines Gens, das für ein Protein kodiert, welches, obwohl es keine bekannte Bindungsaktivität besitzt, eine Sekundär- oder höhere Struktur besitzt, die selbst zu Bindungsaktivität führt (Spalten, Furchen, etc.) oder 4) durch Mutieren eines für ein bekanntes Bindeprotein kodierenden Gens, jedoch nicht in der Subsequenz, von der bekannt ist, daß sie die Bindung verursacht. Das Protein, von welchem das neue Bindeprotein abgeleitet wird, muß keine spezifische Affinität für das Zielmaterial besitzen.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten einer Nukleinsäure, die für eine proteinartige Bindedomäne kodiert, die ein vorbestimmtes Zielmaterial bindet, das von der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers, der diese Domäne bindet, verschieden ist, umfassend
(a) das Herstellen einer vielfältigen Population amplifizierbarer genetischer Packungen, wobei die genetischen Packungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Zellen, Sporen und Viren besteht, wobei jede genetische Packung genetisch veränderbar ist und eine äußere Oberfläche einschließlich eines genetisch determinierten äußeren Oberflächenproteines hat, wobei jede Packung ein erstes Nukleinsäurekonstrukt enthält, das für ein mögliches chimäres Bindeprotein kodiert, wobei jedes chimäre Protein (i) und (ii), wie nachstehend definiert, umfaßt, und jedes dieser Konstrukte DNA umfaßt, die kodiert für (i) eine potentielle Bindedomäne, die eine Mutante einer stabilen vorherbestimmten Domäne eines vorherbestimmten Elterproteines (parentalen Proteins) ist, das von einem Einzelkettenantikörper verschieden ist und ein oder mehrere identifizierbare Oberflächenreste umfaßt, und für die sowohl ein Affinitätsmolekül als auch eine Aminosäuresequenz entweder verfügbar oder erhältlich sind, und (ii) ein äußeres Oberflächentransportsignal, um eine Darstellung der möglichen Bindedomäne auf der äußeren Oberfläche der genetischen Packung zu erhalten, wobei die Expression des Konstruktes zum Darstellen des chimären möglichen Bindeproteines und seiner möglichen Bindedomäne auf der äußeren Oberfläche der genetischen Packung führt; und worin die vielfältige Population genetischer Packungen zusammen eine Vielzahl von unterschiedlichen potentiellen Bindedomänen aufweist, wobei die Differenzierung unter der Vielzahl der verschiedenen potentiellen Bindedomänen durch die mindestens teilweise zufällige Variation einer oder mehrerer vorherbestimmter Aminosäurepositionen der Elterbindedomäne (parentalen Bindedomäne) auftritt, um statistisch an jeder Position eine Aminosäure zu erhalten, die zu einem vorherbestimmten Satz von zwei oder mehr Aminosäuren gehört, wobei die Aminosäuren des Satzes an der Position in statistisch vorherbestimmten erwarteten Proportionen auftreten, wobei die genetische Botschaft, die in den genetischen Packungen eingekapselt ist in vitro oder durch Zellkultur der genetischen Packungen amplifizierbar und auf der Basis der möglichen Bindedomäne, die sich darauf zeigt, abtrennbar ist;
(b) das Verursachen der Expression des chimären potentiellen Bindeproteins und des Darstellens der potentiellen Bindedomänen auf der äußeren Oberfläche der Packungen;
(c) das Inkontaktbringen der Packungen mit dem vorherbestimmten Zielmaterial, so daß die potentiellen Bindedomänen und das Zielmaterial miteinander wechselwirken können;
(d) das Abtrennen von Packungen, die eine potentielle Bindedomäne aufweisen, die das Zielmaterial bindet, von Packungen, die nicht so binden, auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, an das Zielmaterial in Schritt (c) zu binden, und
(e) das Gewinnen mindestens einer Packung, die auf ihrer äußeren Oberfläche ein chimäres Bindeprotein aufweist, das eine stabile erfolgreiche Bindedomäne (SBD) umfaßt, die an das Ziel bindet, wobei die Packung Nukleinsäure umfaßt, die für die erfolgreiche Bindedomäne kodiert, und Amplifizieren der für SBD kodierenden Nukleinsäure in vivo oder in vitro.
In Schritt (c) kann das Verfahren weiterhin das Inkontaktbringen der Packungen mit einem zweiten Material und das Isolieren der Packungen, die nicht an das zweite Material binden, umfassen. Weiterhin kann das neue Bindeprotein nach dem Erhalten eines neuen Bindeproteins, das eine erste vorbestimmte Zielsubstanz erkennt, als ein parentales potentielles Bindeprotein für die Isolierung eines Proteinderivates, das auch an eine, zweite vorbestimmte Zielsubstanz bindet, ausgewählt werden.
Chimäres Protein, umfassend (1) mindestens ein Segment eines äußeren Oberflächenproteines eines filamentösen Phagen, wobei das Segment ein äußeres Oberflächentransportsignal bereitstellt, das von einer Zelle erkannt wird, die von dem Phagen infiziert ist, so daß das chimäre Protein in der Hülle von Phagenpartikeln, die von der Zelle erzeugt werden, zusammengesetzt wird, und (2) eine stabile proteinartige Bindedomäne, die von einem Einzelkettenantikörper verschieden ist, wobei die Domane ein oder mehrere identifizierbare Oberflächenreste umfaßt, die an ein vorherbestimmtes Zielmaterial binden, das von der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers, der die Domäne spezifisch bindet, verschieden ist, wobei das Ziel ausreichend stark gebunden wird, so daß die Dissoziationskonstante des Bindedomänen;Zielkomplexes weniger als 10&supmin;&sup6; Mol/l beträgt, und wobei die Bindedomäne zum Phagen heterolog ist.
Die Erfindung umfaßt den Entwurf und die Synthese vielfältiger DNA, die für eine Familie potentieller Bindeproteine kodiert, welche durch konstante und variable Bereiche charakterisiert sind, wobei die Proteine mit einem Blick darauf entworfen werden, daß man ein Protein erhält, welches eine vorbestimmte Zielsubstanz bindet.
Für die Zwecke dieser Erfindung bezieht sich der Ausdruck "potentielles Bindeprotein" auf ein Protein, welches durch eine Spezies eines DNA-Moleküls in einer Population vielfältiger DNA kodiert wird, wobei der Variierungsbereich in einer oder mehreren Subsequenzen erscheint, die für ein oder mehrere Segmente des Polypeptids, das die Fähigkeit besitzt, als eine Bindedomäne für die Zielsubstanz zu dienen, kodieren.
Von Zeit zu Zeit kann es hilfreich sein, von der "parentalen Sequenz" der vielfältigen DNA zu sprechen. Wenn die gesuchte neue Bindedomäne analog zu einer bekannten Bindedomäne ist, ist die parentale Sequenz die Sequenz, die für die bekannte Bindedomäne kodiert. Die vielfältige DNA wird an den meisten Stellen identisch mit dieser parentalen Sequenz sein, wird sich jedoch an den ausgewählten Stellen von dieser unterscheiden. Wenn eine potentielle Bindedomäne ausgehend von ersten Auswahlprinzipien entworfen ist, ist die parentale Sequenz eine Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, von der vorausgesagt worden ist, daß sie die gewünschte Bindedomäne bildet, und die vielfältige DNA ist eine Population von "Tochter-DNAs", die mit dieser parentalen Sequenz durch einen hohen Grad an Sequenzähnlichkeit in Beziehung steht.
Das Grundprinzip der Erfindung ist eines der beschleunigten Evolution. Die Effizienz der beschleunigten Evolution wird durch die sorgfältige Auswahl der Reste, die zu variieren sind, erheblich verstärkt. Die 3D-Struktur der potentiellen Bindedomäne ist eine Schlüsseldeterminante bei dieser Auswahl. Zuerst wird eine Reihe von Resten, die gleichzeitig ein Molekül der Zielsubstanz kontaktieren können, identifiziert. Danach werden alle oder einige der Codons, die für diese Reste kodieren, gleichzeitig variiert, um eine vielfältige DNA-Population herzustellen. Die vielfältige DNA-Population wird verwendet, um Zellen zu transformieren, so daß eine vielfältige Population genetischer Packungen hergestellt wird.
Die gemischte Population genetischer Packungen, die für mögliche Bindeproteine kodierende Gene enthalten, wird angereichert bezüglich der Packungen, die Gene enthalten, welche Proteine exprimieren, die tatsächlich an die Zielsubstanz binden ("erfolgreiche Bindedomänen"). Nach einer öder mehreren Runden einer solchen Anreicherung werden ein oder mehrere der ausgewählten Gene untersucht und sequenziert. Wenn gewünscht, werden neue Variationsstellen ausgewählt. Die ausgewählten Tochtergene einer Generation werden dann zu den parentalen Sequenzen für die nächste Generation vielfältiger DNA, wodurch der nächste "Variierungsszyklus" beginnt. Solche Zyklen werden wiederholt, bis ein Protein mit der gewünschten Zielaffinität erhalten wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Figur 1 ist ein Schema, das die Beziehung zwischen verschiedenen Arten von Bindedomänen (BD) zeigt.
Die Figur 2 ist ein Flußdiagramm, das die Hauptschritte zeigt, die angewendet werden, um ein neues Protein mit Affinität für eine vorbestimmte Zielsubstanz zu erzeugen.
Die Figur 3 ist ein Schema einer PBD, die ein Molekül eines Zielmaterials kontaktiert.
Die Figur 4 ist ein Schema der Konstruktion von pLG3 ausgehend von M13mp 18 und pBR322.
Die Figur 5 ist ein Schema der Kontruktion von pLG7 ausgehend von pLG3 und synthetischer DNA.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Abschnitt 0.1: Überblick:

Die vorliegende Erfindung trennt mutierte Gene, die neue Proteine mit gewünschten Bindeeigenschaften spezifizieren, von nahe verwandten Genen, die Proteine ohne oder mit ungewünschten Bindeeigenschaften spezifizieren, dadurch, daß: 1) erreicht wird, daß das Produkt jedes mutierten Gens auf der äußeren Oberfläche einer replizierbaren genetischen Packung, die das Gen enthält, präsentiert wird, und 2) Affinitätstrennung angewendet wird, welche ein gewünschtes Zielmaterial umfaßt, um die Population der Packungen bezüglich solcher Packungen anzureichern, die Gene enthalten, welche Proteine mit verbesserten Bindungseigenschaften im Hinblick auf dieses Zielmaterial spezifizieren.
Lasse KD (x,y) eine Dissoziationskonstante sein,
Für die Zwecke der anhängenden Ansprüche ist ein Protein P ein Bindeprotein, wenn
(1) für eine molekulare, ionische oder atomische Spezies A die Dissoziationskonstante KD (P,A) < 10&supmin;&sup6; Mol/Liter und
(2) für eine davon verschiedene, molekulare, ionische oder atomische Species B KD (P,B)) 10&supmin;¹ Mol/Liter ist.
Als Ergebnis dieser zwei Bedingungen übt das Protein P eine Spezifität für A über B und einen minimalen Affinitätsgrad (oder Aviditätsgrad) für A aus.
Wenn eine Domäne eines Proteins primär verantwortlich ist für die Fähigkeit des Proteins, spezifisch eine ausgewählte Zielsubstanz zu binden, wird diese hierin als "Bindedomäne" (BD) bezeichnet. Wir bewerkstelligen das Erscheinen einer stabilen Proteindomäne als "potentielle Ausgangsbindedomäne (initial potential binding domain; IPBD) bezeichnet - auf der Oberfläche einer genetischen Packung. Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression zahlreicher, unterschiedlicher, variierter "potentieller Bindedomänen" (PBD), die alle verwandt sind zu einer "parentalen Bindedomäne" (parental potential binding domain; PPBD) wie die Bindedomäne eines bekannten Bindeproteins, und sie betrifft die Selektion und Amplifikation der Gene, die für die erfolgreichsten mutierten PBDs kodieren. Eine IPBD wird als PPBD für die erste Runde der Varuerung ausgewählt. Selektion-durch-Bindung isoliert eine oder mehrere "erfolgreiche Bindedomänen" (successful binding domains; SBD). Eine SBD aus einer Runde der Variierung und Selektion-durch-Bindung wird als die PPBD für die nächste Runde ausgewählt. Die Erfindung ist jedoch nicht beschränkt auf Proteine mit einer einzigen BD, da das Verfahren auf irgendwelche oder alle BDs des Proteins nacheinander oder gleichzeitig angewandt werden kann. Die Beziehungen der verschiedenen BDs sind in der Figur 1 dargestellt.
Der Ausdruck "vielfältige DNA" bedeutet eine Population aus Molekülen, die über den größten Anteil ihrer Länge dieselbe Basensequenz aufweisen, die sich jedoch an einer begrenzten Anzahl definierter Stellen, vorzugsweise 5-10 Codons, unterscheiden. Ein Molekül der vielfältigen DNA kann in ein Plasmid eingebracht werden, so daß es aus einem Teil eines Gens besteht (OLIP86, OLIP87, AUSU87, REID88). Wenn Plasmide, die die vielfältige DNA enthalten, verwendet werden, um Bakterien zu transformieren, stellt jede Zelle eine Version des Ursprungsproteins her. Jede Bakterienkolonie kann eine Version herstellen, die unterschiedlich von irgendeiner Version einer anderen Kolonie ist. Wenn die Varation der DNA an Stellen konzentriert sind, von denen bekannt ist, daß sie sich auf der Oberfläche des Proteins oder in einer Schleife befinden, wird eine Population aus Proteinen erzeugt werden, von denen viele Mitglieder sich in ungefähr dieselbe 3D-Struktur wie das parentale Protein falten werden. Die spezifischen Bindungseigenschaften jedes Mitglieds können jedoch unterschiedlich im Vergleich zu jedem anderen Mitglied sein. Man muß nur noch die Kolonien, die Gene für Proteine mit gewünschten Bindungseigenschaften enthalten, von solchen, die nicht die gewünschten Affinitäten ausüben, aussortieren.
Ein "Einzelkettenantikörper" ist ein Einzelkettenpolypeptid, welches mindestens 200 Aminosäuren umfaßt, wobei die Aminosäuren zwei Antigenbinderegionen bilden, die durch einen Peptid-Linker verknüpft sind, der erlaubt, daß sich die zwei Regionen so miteinander falten lassen, daß ein Antigen gebunden wird. Beide Antigenbindereg ionen müssen variable Domänen bekannter Antikörper sein, oder sie müssen 1) sich jeweils in einen beta-Zylinder (barrel) aus neun Strängen, die räumlich in derselben Weise in Beziehung stehen wie die neun Stränge der bekannten variablen Antikörperdomänen der leichten oder schweren Ketten, falten lassen und 2) in derselben Weise zueinander passen wie die variablen Domänen dieses bekannten Antikörpers. Allgemein gesprochen ist es eine Voraussetzung, daß - mit der Ausnahme der Aminosäuren, die der hypervariablen Region entsprechen mindestens 88 % Homologie mit den Aminosäuren der variablen Domäne eines bekannten Antikörpers vorhanden sein muß.
Der Ausdruck "Affinitätstrennungsmittel" umfaßt, ist jedoch nicht beschränkt auf: a) Affinitätssäulenchromatographie, b) Batch-Elution von einem Affinitätsmatrixmaterial, c) Batch-Elution von einem auf einer Platte angebrachten Affinitätsmaterial, d) Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, und e) Elektrophorese in der Gegenwart des Zielmaterials. "Affinitätsmaterial" wird in der Bedeutung eines Materials mit Affinität für das zu reinigende Material - "Analyt" genannt - verwendet. In den meisten Fällen ist die Assozuerung des Affinitätsmaterials und des Analyts reversibel, so daß der Analyt von dem Affinitätsmaterial freigesetzt werden kann, nachdem Verunreinigungen weggewaschen worden sind.
Affinitätssäulenchromatographie, Batch Elution von enem Affinitätsmatrixmaterial, das in irgendeinem Behältnis enthalten ist, und Batch-Elution von einer Platte sind sehr ähnlich und werden nachstehend unter dem Ausdruck "Affinitätschromatographie" behandelt.
Fluoreszenz-aktivierte Zeilsortierung umfaßt die Verwendung eines Affinitätsmaterials, das per se fluoreszierend oder mit einem Fluoreszenzmolekül markiert ist. Gegenwärtig im Handel erhältliche Zellsortierer benötigen 800 bis 1000 an jede Zelle gebundene Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs wie Texas-Rot. FACS können 10³ Zellen oder Viren/Sekunde sortieren.
Elektrophoretische Affinitätstrennung umfaßt die Elektrophorese von Viren oder Zellen in der Gegenwart eines Zielmaterials, wobei die Bindung des besagten Zielmaterials die Nettoladung der Viruspartikel oder Zellen verändert. Sie ist verwendet worden, um Bakteriophagen auf der Grundlage ihrer Ladung zu trennen (SERW87).
Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der Affinitätstrennung bakterieller Zellen oder von Bakterienviren (oder anderer genetischer Packungen), um eine Population bezüglich dieser Zellen oder Viren anzureichern, welche Gene tragen, die für Proteine mit gewünschten Bindungseigenschaften kodieren.
Für die vorliegende Erfindung werden die Worte "selektieren" und "Selektion" ausschließlich in ihrem genetischen Sinn verwendet; d.h. als ein biologisches Verfahren, worin ein Phänotypisches Merkmal verwendet wird, um eine Population bezüglich solcher Organismen anzureichern, die den gewünschten Phänotyp zeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt drei Hauptteile;
I. Entwurf und Herstellung einer replizierbaren genetischen Packung (GP), die eine IPBD auf der Oberfläche der GP präsentiert - bezeichnet als GP(IPBD),
II. Entwurf und Ausführung eines Affinitätstrennungsverfahrens, das GP(IPBD)s, die an ein bekanntes Affinitätsmolekül binden, von Wildtyp-GPs oder GP(LPBD&supmin;)s, von denen keine das bekannte Affinitätmolekül bindet, abtrennt und
III. Entwurf und Ausführung eines genetischen Varlierungsverfahrens - bezeichnet Struktur-geleitete Mutagenese -, worin eine Population von 10&sup6; oder mehr unterschiedlicher GP(PBD)s - bezeichnet GP(vgPBD) - hergestellt wird.
Eine Affinitätstrennung wird bezeichnet als ein "Trennungszyklus"; ein Schritt der Varuerung, gefolgt von so vielen Trennungszyklen wie benötigt werden, um eine SBD zu isolieren, wird ein "Variierungszyklus" bezeichnet. Die Aminosäuresequenz einer SBD aus einer Runde wird die PPBD für den nächsten Variierungszyklus. Wir führen Variierungszyklen wiederholt durch, bis die gewünschte Affinität und Spezifität der Bindung zwischen einer SBD und der ausgewählten Zielsubstanz erreicht wird.
Teil I ist eine Stammkonstruktion, wobei wir mit einer einzigen IPBD-Sequenz arbeiten. Variabilität kann in DNA-Subsequenzen, die benachbart zu den ipbd- Subsequenzen sind, und innerhalb des osp-ipbd-Gens eingebracht werden, so daß die IPBD auf der GP-Oberfläche erscheinen wird. Ein Molekül, wie ein Antikörper, mit einer hohen Affinität für eine korrekt gefaltete IPBD wird verwendet, um a) eine IPBD auf der GP-Oberfläche zu detektieren, b) Kolonien auf die Präsentation der IPBD auf der GP-Oberfläche zu durchmustern oder c) GPs zu selektieren, die eine IPBD aus einer Population präsentieren, wobei einige Mitglieder davon eine IPBD auf der GP-Oberfläche präsentieren könnten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt Teil I des Verfahrens:
1) Auswählen einer GP wie einer bakteriellen Zelle (Abschnitt 1.1.1), bakteriellen Spore (1.2.1) oder eines Phagen (1.3.1) mit einem geeigneten äußeren Oberflächenprotein (Abschnitte 1.1.3,1.2.3 und 1.3.3),
2) Auswählen einer stabilen IPBD (Abschnitt 2),
3) Entwerfen einer Aminosäuresequenz, die: a) die IPBD als eine Subsequenz umfaßt und b) verursachen wird, daß die IPBD auf der GP-Oberfläche erscheint (Abschnitte 1.1.2, 1.2.2, 1.3.2 und 4),
4) Konstruieren eines Gens - bezeichnet als osp-ipbd-, welches: a) für die entworfene Aminosäuresequenz kodiert, b) die benötige genetische Regulation bereitstellt und c) passende Stellen für eine genetische Manipulation einbringt (Abschnitte 4.1, 4.2, 4.3, 5.1 und 5.2),
5) Klonieren des osp-ipbd-Gens in die GP (Abschnitt 6.1) und
6) Gewinnen der transformierten GPs (Abschnitt 7) und Austesten derselben auf Gegenwart der IPBD auf der GP-Oberfläche (Abschnitt 8); dieser Test wird mit einem Affinitätsmolekül, das eine hohe Affinität für IPBD - bezeichnet als AfM(IPBD)-, durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt Teil I des Verfahrens:
1) und 2) wie vorstehend
3) Entwerfen einer DNA-Sequenz, welche a) für die IPBD als eine Subsequenz kodiert und b) geeignete Restriktionsstellen enthält, so daß zufüllige (random) DNA funktionsfähig an das ipbd-Genfragment gebunden werden kann, und c) die benötigten genetischen Regulationen bereitstellt; diese DNA-Sequenz wird als "Präsentationsprobe" bezeichnet (Abschnitte 1.1.4, 1.2.4, 1.3.4 und 4),
4) Konstruieren dieser Präsentationsprobe,
5) Klonieren der Präsentationsprobe in einem geeigneten Wirt in den OCV und Amplifizieren desselben,
6) Klonieren von zufälliger oder pseudozufälliger DNA in eine der Restriktionsstellen, die in der Präsentationsprobe bereitgestellt sind (Abschnitt 6.2), wodurch die zufällige oder pseudozufällige DNA als ein potentielles osp wirkt und
7) Gewinnen der GPs (Abschnitt 7) und Durchmustern der Kolonien der transformierten GPs auf Gegenwart der IPBD auf der GP-Oberfläche; dieses Durchmustern wird mit einem Affinitätsmolekül, das eine hohe Affinität für die IPBD aufweist - bezeichnet als AfM(IPBD) (Abschnitt 8)-, durchgeführt; oder alternativ
8) Selektieren von GPs, die die IPBD präsentieren, durch Verwendung einer Affinitätstrennung mittels AfM(IPBD) (Abschnitt 8).
Sobald eine GP(IPBD) hergestellt ist, kann diese oftmals als Ausgangspunkt für die Entwicklung verschiedener neuer Proteine, die an eine Vielzahl verschiedener Zielsubstanzen binden, verwendet werden. Die Erkenntnis, wie wir das Erscheinen einer IPBD auf der Oberfläche einer GP bewerkstelligen, kann verwendet werden, um weitere GP(IPBD)s zu entwerfen und herzustellen, die unterschiedliche IPBDs präsentieren.
Obwohl Teil I sich nur mit einer einzigen IPBD beschäftigt, werden viele Präparationen für den Teil III hergestellt, in welchem wir zahlreiche Mutationen in die potentielle Bindedomäne einbringen. Bezugnahmen auf PBD oder pbd in Teil I sollen eine vorbereitende Absicht anzeigen.
In Teil II optimieren wir die Trennung der GP(IPBD) von Wildtyp-GP - bezeichnet wtGP - auf der Grundlage der Affinität der IPBD für AfM(IPBD), und wir optimieren die Empfindlichheit des Affinitätstrennungsverfahrens. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt Teil II des erfindungsgemäßen Verfahrens:
1) Herstellen von Affinitätssäulen, welche AfM(IPBD) zu verschiedenen Dichten von AfM(IPBD)/(Matrixvolumen) tragen (Abschnitt 10.1),
2) Herstellen von GP(IPBD)s mit verschiedenen Mengen an IPBD pro GP,
3) Auswählen eines Gradientenverlaufs zum Eluieren der Säulen (Abschnitt 10.1),
4) Bestimmen, welche Kombination aus: a) IPBD/GP, b) Dichte der AfM(IPBD)/(Trägervolumen), c) anfänglicher Ionenstärke, d) Elutionsrate und e) aufgetragener (Menge an GP)/(Trägervolumen), die beste Trennung von GP(IPBD) von wtGP ergibt (Abschnitt 10.1),
5) Bestimmen der geringsten Menge an GP(IPBD), die aus einer viel größeren Menge an wtGP unter Anwendung optimaler Bedingungen isoliert werden kann (Abschnitt 10.2) und
6) Bestimmen der Effizienz des Affinitätstrennungsverfahrens (Abschnitt 10.3).
Der Teil II optimiert die Trennung eines einzelnen Typs der GP(IPBD) aus einem großen Überschuß einer einzigen unterschiedlichen GP. Die optimalen Bedingungen werden in Teil III verwendet werden, um GP(PBD)s, die die Zielsubstanz binden, von GP(PBD)s, die die Zielsubstanz nicht binden, abzutrennen. Die Optimierung wird bei einer oder mehreren spezifischen Temperaturen und bei einem oder mehreren spezifischen phs durchgeführt werden. Im Teil III muß der Anwender die Bedingungen spezifizieren, unter denen die ausgewählte SBD die Zielsubstanz binden sollte. Wenn sich die Bedingungen der beabsichtigten Verwendung deutlich von den Bedingungen unterscheiden, für die Affinitätstrennung optimiert wurden, muß der Anwender zu Teil II zurückkehren und die Affinitätstrennung für Bedingungen optimieren, die ähnlich zu den Bedingungen der beabsichtigten Verwendung der ausgewählten SBD sind.
In Teil III wählen wir ein Zielmaterial und eine GP(IPBD) aus, die durch das Verfahren des Teils I entwickelt wurde und die für das Zielmaterial geeignet ist. Unter Verwendung der IPBD als PPBD für die erste Runde der Varuerung stellen wir eine große Anzahl unterschiedlicher osp-pbd-Gene her, die für eine große Anzahl verschiedener PBDs kodieren. Wir verwenden eine Affinitätstrennung, die durch das Verfahren des Teils II entwickelt wurde, um die Population der GP(vgPBD)s bezüglich GPs anzureichern, die PBDs mit Bindungseigenschaften im Hinblick auf die Zielsubstanz präsentieren, die besser sind als die Bindungseigenschaften der PPBD. Eine aus einer Variierungsrunde ausgewählte SBD wird die PPBD für die nächste Variierungsrunde. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt Teil III des erfindungsgemäßen Verfahrens:
1) Auswählen eines Zielmoleküls (Abschnitt 11),
2) Auswählen einer GP(IPBD) (Abschnitt 12),
3) Auswählen einer Reihe verschiedener Reste in der PPBD, um auf der Grundlage a) der 3D-Struktur der IPBD, b) der Sequenzen homologer Proteine und c) von Computer- oder theoretischen Modellrechnungen, die anzeigen, welche Reste unterschiedliche Aminosäuren tolerieren können, ohne daß die zugrundeliegende Struktur zerstört wird, Variationen einzuführen (Abschnitt 13.1),
4) Auswählen einer Unterreihe der gleichzeitig zu variierenden Reste auf der Grundlage der Anzahl unterschiedlicher Varianten und unter Berücksichtigung der Frage, welche Varianten innerhalb der Nachweisfähigkeiten der Affinitätstrennung liegen (Abschnitt 13.2),
5) Ausführen der Varuerung durch:
a) Synthetisieren des Teils des osd-pbd-Gens, welcher für die zu variierenden Reste kodiert, unter Verwendung einer spezifischen Mischung von Nukleotidsubstraten für einige oder alle Basen, welche für Reste kodieren, die für die Variation vorgesehen sind, wodurch eine Population von DNA-Molekülen - bezeichnet als vgDNA - erzeugt wird (Abschnitt 13.3),
b) Ligieren dieser vgDNA durch Standardverfahren in den operativen Klonierungsvektor (OCV) (z.B. ein Plasmid oder Bakteriophage) (Abschnitt 14.1),
c) Verwenden der ligierten DNA, um Zellen zu transformieren, wodurch eine Population transformierter Zellen hergestellt wird (Abschnitt 14.2)
d) Kultivieren (d.h. Erhöhen der Anzahl) der Population transformierter Zellen und Gewinnen der Population von GP(PBD)s, wobei diese Population als GP(vgPBD) bezeichnet wird (Abschnitt 14.3),
e) Anreichern der Population bezüglich GPs, die die Zielsubstanz binden, durch das in Teil II entwickelte Affinitätstrennungverfahren mit dem ausgewählten Zielmolekül als Affinitätsmolekül (Abschnitt 15),
f) Wiederholen der Schritte III.5.d und III.5.e bis eine GP(SBD) mit einer verbesserten Bindung an die Zielsubstanz isoliert worden ist (Abschnitt 15) und
g) Testen der isolierten SBD oder SBDs auf Affinität und Spezifität für die ausgewählte Zielsubstanz (Abschnitt 15.8),
6) Wiederholen der Schritte III.3, III.4 und III.5 bis der gewünschte Bindungsgrad erhalten wird.
Der Teil III wird für jedes neue Zielmaterial wiederholt. Der Teil I muß nur wiederholt werden, wenn keine GP(IPBD), welche geeignet für eine ausgewählte Zielsubstanz ist, erhältlich ist. Der Teil II muß für jede neuentwickelte GP(IPBD) und für früher entwickelte GP(IPBD)s wiederholt werden, wenn sich die beabsichtigten Bedingungen für die Verwendung eines neuen Bindeproteins signifikant von den Bedingungen der vorherigen Optimierung unterscheiden.

Abschnitt 0.2: Abkürzungen:

Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet:

Abschnitt 0.3: Standard-Sequenzierungsverfahren:

Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf ein einziges Verfahren zum Bestimmen der Nukleotidsequenz (nts) in DNA-Subsequenzen.
Sequenzierungsreaktionen, Agarose-Gelelektrophorese und Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) werden unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt (AUSU87).
Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf ein einziges Verfahren zum Bestimmen von Proteinsequenzen, und die Bezugnahme in den anhängenden Ansprüchen auf das Bestimmen der Aminosäuresequenz einer Domäne soll irgendein praktisches Verfahren oder die Kombination von Verfahren umfassen, unabhängig davon, ob es sich um direkte oder indirekte Verfahren handelt. Das bevorzugte Verfahren besteht in den meisten Fällen darin, die Sequenz der DNA zu bestimmen, welche für das Protein kodiert, und danach daraus auf die Aminosäuresequenz zu schließen. In einigen Fällen können Standardverfahren der Proteinsequenzbestimmung benötigt werden, um posttranslationale Prozessierungen nachzuweisen.
Die Hauptschritte in dem Verfahren zum Herstellen und Isolieren eines neues Bindeproteins mit Affinität für ein ausgewähltes Zielmaterial sind in der Figur 2 dargestellt.

Abschnitt 1: Spezifizierung der genetischen Packung und Mittel zum Präsentieren einer heterologen Bindedomäne auf deren äußeren Oberfläche:

Abschnitt 1.0: Allgemeine Voraussetzungen der genetischen Packungen

Es wird hervorgehoben, daß die GP, an welcher die Selektion-durch-Bindung durchgeführt werden wird, nach der Selektion entweder zum Wachstum in irgendeiner geeigneten Umgebung oder zur in vitro-Amplifikation und Gewinnung der eingekapselten genetischen Botschaft fähig sein muß. Zumindest während eines Teils des Wachstums muß der Anstieg der Anzahl bezogen auf die Zeit ungefähr exponentiell sein. Der Anteil einer Populatiqn,: der die gewünschten Bindungseigenschaften aufweist, kann ziemlich klein sein, z.B. 1 in 10&sup6; oder weniger. Sobald dieser Anteil der Population von den nicht-bindenden Anteilen abgetrennt ist, muß es möglich sein, diesen zu amplifizieren. Das Kultivieren lebensfähiger Zellen stellt die leistungsfähigste Amplifikation genetischen Materials dar und ist bevorzugt. Genetische Botschaften können auch in vitro amplifiziert werden, jedoch ist dies nicht bevorzugt.
Eine GP kann typischerweise eine vegetative Bakterienzelle, eine Bakterienspore oder ein bakterielles DNA-Virus sein. Ein Stamm irgendeiner lebenden Zelle oder eines Virus ist potentiell geeignet, wenn der Stamm:
1) in Kultur gehalten werden kann,
2) affinitätsgetrennt werden kann und seine Lebensfähigkeit behält,
3) mit vernünftiger Einfachheit genetisch verändert werden kann und
4) manipuliert werden kann, damit die potentielle Bindeproteindomäne präsentiert wird, so daß diese mit dem Zielmaterial während der Affinitätstrennung wechselwirken kann.
DNA, die für die IPBD-Sequenz kodiert, kann in funktioneller Weise mit DNA verknüpft werden, die zumindest für das äußere Oberflächentransportsignal eines äußeren Oberflächenproteins (outer surface protein; OSP) kodiert, welches nativ für die GP ist, so daß die IPBD auf der äußeren Oberfläche der GP präsentiert wird. Es sollte möglich sein, eine genetische Packung zur Präsentation der IPBD oder PBD auf deren äußeren Oberfläche zu veranlassen, ohne daß die Lebensfähigkeit der GP oder die Bindungseigenschaften der IPBD oder PBD nachteilig beeinflußt werden, wenn die Fusion in der Nähe der Domänengrenzen liegt (BECK83, CRAW87, TOTH86, SMIT85, MANO86; und vgl. ROSS81, HOLL83).
Diejenigen Merkmale eines Proteins, die von einer Zelle erkannt werden und die dieses Protein veranlassen, auf dem Zytoplasma transportiert und auf der Zelloberfläche präsentiert zu werden, werden "Außenoberflächetransportsignale" bezeichnet.
Die replizierbare genetische Einheit (Phage oder Plasmid), die die osp-pbd-Gene (abgeleitet vom osp-ipbd-Gen) durch das Selektion-durch-Bindung-Verfahren trägt (siehe Abschnitt 14), wird nachstehend als operativer Klonierungsvektor (OCV) bezeichnet. Wenn der OCV ein Phage ist, kann dieser auch als genetische Packung dienen. Die Wahl einer GP hängt teilweise von der Verfügbarkeit eines geeigneten OCV und geeigneten OSP ab.
Vorzugsweise wird die GP auf einfache Weise z. B. durch Einfrieren gelagert. Wenn die GP eine Zelle ist, sollte sie eine kurze Verdopplungszeit wie beispielsweise 20-40 Minuten aufweisen. Wenn die GP ein Virus ist, sollte dieser prolifisch sein, z. B. eine Freisetzungsrate von mindestens 100/infizierte Zelle aufweisen. GPs, die anspruchsvoll oder teuer zu kultivieren sind, werden nicht bevorzugt. Die GP sollte leicht zu ernten sein, vorzugsweise durch Zentrifugation. Die GP ist vorzugsweise in einem Temperaturbereich von -70 bis 42ºC stabil (bei 4ºC mehrere Tage oder Wochen lang); unempfindlich gegen Scherkräfte, die bei der HPLC auftreten; unempfindlich gegenüber UV; tolerant gegen Austrocknung; und unempfindlich gegentiber einem pH von 2,0 bis 10,0, oberflächenaktiven Mitteln wie SDS oder Triton, Chaotrope wie 4M Harnstoff oder 2M Guanidinium-HCl, gewöhnlichen Ionen wie K&spplus;, Na&spplus; und SO&sub4;&supmin;&supmin;, gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln wie Ether und Aceton und abbauenden Enzymen. Letztendlich muß ein geeigneter OCV verfügbar sein (siehe Abschnitt 3).
Vorzugsweise sind die 3D-Struktur des OSP und die Sequenz des OSP-Gens bekannt. Falls die 3D-Struktur nicht bekannt ist, gibt es vorzugsweise Erkenntnisse darüber, welche Reste auf der Zelloberfläche exponiert sind, über die Lokalisierung der Domänengrenzen innerhalb des OSP und/oder über erfolgreiche Fusionen des OSP mit einem fremden Insert. Das OSP erscheint vorzugsweise in mehreren Kopien auf der äußeren Oberfläche der GP und besitzt vorzugsweise eine nichtessentielle Funktion. Es ist wünschenswert, daß das OSP nicht posttranslational prozessiert wird oder daß zumindest dieses Prozessieren verstanden wird.
Die bevorzugten GP, OCV und. OSP sind solche, für welche die geringsten ernsten Hindernisse beobachtet werden können im Vergleich zu denjenigen, die für jedes Kriterium die höchste Punktzahl aufweisen.
Als nächstes betrachten wir allgemeine Antworten auf die Fragen, die sich in diesem Schritt für die folgenden Fälle stellen: a) vegetativ wachsende Bakterienzellen (Abschnitt 1.1), b) Bakteriensporen (Abschnitt 1.2) und c) (Abschnitt 1.3). Bevorzugte OSPs für mehrere GPs sind in der Tabelle 2 angegeben.

Abschnitt 1.1: Bakterienzellen als genetische Packungen

Man kann irgendeinen gut charakterisierten Bakterienstamm auswählen, der in Kultur wachsengelassen werden kann. Die wichtigen Fragen in diesem Fall sind: a) wissen wir genug über die Mechanismen, die Proteine auf die Außenseite der Zelle dirigieren, b) wird sich die IPBD in der Umgebung der äußeren Membran falten und c) werden die Zellen die Expression des osp-pbd, abgeleitet vom osp-ipbd, während der Affinitätstrennung ändern? Einige IPBDs können große oder unlösliche prosthetische Gruppen, wie ein Fe&sub4;S&sub4;-Cluster, benötigen, die innerhalb der Zelle verfügbar sind, jedoch nicht im Medium. Die Bildung von in einigen Ferrodoxinen gefundenen Fe&sub4;S&sub4;-Cluster wird durch Enzyme katalysiert, die in der Zelle gefunden werden (BONO85). IPBDs, die solche prosthetischen Gruppen benötigen, falten sich vielleicht nicht oder funktionieren nicht, wenn sie auf Bakterienzellen präsentiert werden.

Abschnitt 1.1.1: Bevorzugte Bakterienzellen als GP:

Im Hinblick auf die extensiven Kenntnisse über E. coli, ist ein Stamm von E. coli, der keine Rekombination durchführen kann, der beste Kandidat für eine bakterielle GP. Weitere bevorzugte Kandidaten sind Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa.

Abschnitt 1.1.2: Bevorzugte äußere Oberflächenproteine für die Präsentation von IPBDs auf Bakterienzellen:

Gram-negative Bakterien besitzen Proteine der äußeren Membran (outer-membrane proteins; OMP), die eine Untergruppe der OSPs bilden. Viele OMPs überspannen die Membran ein oder mehrere Male. Die Signale, die veranlassen, daß OMPs in die äußere Membran dirigiert werden, sind in der Aminosäuresequenz des reifen Proteins kodiert. Fusionen von Fragmenten der omp-Gene mit Fragmenten eines x- Gens führten zu X, welches auf der äußeren Membran erscheint (BENS84, CLEM81). Falls keine Fusionsdaten verfügbar sind, fusionieren wir ein ipbd- Fragment an verschiedene Fragmente des osp-Gens und erhalten GPs durch Screening oder Selektion auf den Präsentation-der-IPBD-Phänotyps, die die osp- ipbd-Fusion auf der Zelloberfläche präsentieren.
Oliver hat einen Übersichtsartikel über die Mechanismen der Proteinsezernierung in Bakterien veröffentlicht (OLIV85 und OLIV87). Nikaido und Vaara (NIKA87) haben einen Übersichtsartikel "ber Mechanismen, durch welche Proteine auf die äußere Membran gram-negativer Bakterien dirigiert werden, veröffentlicht. Beispielsweise wird das LamB-Protein von E. coli mit einer typischen Signalsequenz synthetisiert, welche nachfolgend entfernt wird. Benson et al. (BENS84) zeigten, daß LamB-LacZ- Fusionsproteine in der äußeren Membran von E. coli abgelagert werden, wenn die Reste 1-49 des reifen LamB-Proteins für die Fusion verwendet werden, daß jedoch die Reste 1-43 nicht ausreichend sind.
LamB von E. coli ist ein Porin für Maltose- und Maltodextrintransport und dient als Rezeptor für die Adsorption der Bakteriophagen Lambda und K10. Dieses Protein ist bis zur Homogenität gereinigt worden (ENDE78), und es wurde gezeigt, daß es als Trimer funktioniert (PALV79). Zu Phagenresistenz führende Mutationen sind verwendet worden, um diejenigen Teile des LamB-Proteins zu definieren, die den jeweiligen Phagen adsorbieren (ROAM80, CLEM81, CLEM83, GEHR87).
Topologische Modelle sind entwickelt worden, die die Funktion des Phagenrezeptors und Maltodextrintransports beschreiben. Die Modelle beschreiben diese Domänen und ihre Lokalisierungen in bezug auf die Oberflächen der äußeren Membran (CLEM81, CLEM83, CHAR84, HEIN88).
LamB wird zur äußeren Membran transportiert, wenn eine funktionelle N-terminale Sequenz vorhanden ist; außerdem werden die ersten 49 Aminosäuren der reifen Sequenz für einen erfolgreichen Transport benötigt (BENS84). Eine Homologie zwischen Teilen des LamB-Proteins und den weiteren Proteinen der äußeren Membran OmpC, OmpF und PhoE ist entdeckt worden (NIKA84), welche die Homologie zwischen den Aminosäuren 39-49 von LamB und Sequenzen der weiteren Proteine umfaßt. Diese Subsequenzen können die Proteine für einen Transport zur äußeren Membran markieren. Weiterhin sind monoklonale Antikörper, die aus Mäusen stammen, welche mit gereinigtem LamB immunisiert worden sind, verwendet worden, um vier unterschiedliche topologische und funktionelle Regionen zu charakterisieren, von denen zwei den Maltosetransport betreffen (GABA82).

Abschnitt 1.1.3: Wahl der Insertionsstelle für IPBD in Bakterienzellen-OSP:

Für Fusionen von phoA in die für ein integrales Membranprotein kodierende Sequenz wird die PhoA-Domäne im Hinblick darauflokalisiert, wo das phoA-Gen in das integrale Membranprotein eingebaut wurde (BECK83 und MANO86). Das heißt, wenn phoA hinter einer Aminosäure eingebaut wird, die normalerweise im Zytoplasma gefunden wird, erscheint PhoA im Zytoplasma. Wenn phoA jedoch hinter einer Aminosäure eingebaut wird, die normalerweise im Periplasma gefunden wird, ist die PhoA-Domäne auf der periplasmatischen Seite der Membran lokalisiert und in ihr verankert. Beckwith und Kollegen (BECK88) haben diese Beobachtungen auf das lacZ-Gen ausgedehnt, welches so in Gene für integrale Membranproteine eingebaut werden kann, daß die LacZ-Domäne entweder im Zytoplasma oder im Periplasma erscheint, je nachdem, wo das lacZ-Gen eingebaut wurde.
OSP-IPBD-Fusionsproteine müssen keine strukturelle Rolle in den äußeren Membranen gram-negativer Bakterien erfüllen, da Teile der äußeren Membranen nicht hoch geordnet sind. Hinsichtlich großer OSPs gibt es wahrscheinlich eine oder mehrere Stellen, an denen osp verkürzt sein und an ipbd fusioniert sein kann, so daß die Zellen, die die Fusion exprimieren, IPBDs auf der Zelloberfläche präsentieren werden. Wenn gezeigt worden ist, daß Fusionen zwischen Fragmenten von osp und x X auf der Zelloberfläche präsentieren, können wir durch Ersetzen von x durch ipbd in der DNA-Sequenz ein osp-ipbd-Gen entwerfen. Andererseits wird eine erfolgreiche OMP-IPBD-Fusion vorzugsweise dadurch gesucht, daß Fragmente des besten omp an ein ipbd fusioniert werden, das fusionierte Gen exprimiert wird und die entstandenen GPs auf den Präsentation-der-IPBD-Phänotyp getestet werden. Wir verwenden die verfügbaren Daten über das OMP, um den Punkt oder die Punkte der Fusion zwischen omd und ipbd auszuwählen, damit die Wahrscheinlichkeit maximiert wird, daß die IPBD präsentiert werden wird. Alternativ verkürzen wir osp an mehreren Stellen und in einer Weise, die osp-Fragmente unterschiedlicher Länge produziert, und fusionieren die osp-Fragmente an ipbd; Zellen, die die Fusion exprimieren, werden durchmustert oder daraufhin selektiert, welche IPBDs auf der Zelloberfläche präsentieren. Eine zusätzliche Alternative ist es, kurze Segmente zufälliger DNA in die Fusion der omp-Fragmente an ipbd einzuschließen und danach die entstandene vielfältige Population nach Mitgliedern zu durchsuchen oder zu selektieren, die den Präsentauon-der-IPBD-Phänotyp besitzen.
Der Promotor für das osp-ipbd-Gen unterliegt vorzugsweise einer Regulation durch einen kleinen chemischen Induktor, wie Isopropylthiogalactosid (IPTG) (lac UV5- Promotor). Dieser muß nicht von einem natürlichen osp-Gen stammen; jeder regulierbare bakterielle Promotor kann verwendet werden (MANI82).
Sobald ein genetisches Packungssystem unter Verwendung vegetativer Bakterienzellen entworfen worden ist, ist es Zeit, eine IPBD auszuwählen (Abschnitt 2).

Abschnitt 1.1.4: In Vivo-Selektion auf ein Pseudo-osp-Gen aus Inserts zufälliger DNA in Bakterienzellen:

Als eine Alternative zum Auswählen eines natürlichen OSP und einer Insertionsstelle in dem OSP, können wir ein Gen konstruieren, welches umfaßt: a) einen regulierbaren Promotor (z.B. lacUV5), b) eine Shine-Dalgarno-Sequenz, c) eine periplasmatische Transportsignalsequenz, d) eine Fusion des ipbd-Gens mit einem Segment zufälliger DNA (wie in Kaiser et al. (KAIS87)), e) ein Stoppcodon und f) einen Transkriptionsterminator. Die zufällige DNA, welche vorzugsweise 90-300 Basen umfaßt, kodiert für zahlreiche potentielle OSTS (EF. KAIS87). Die Fusion von ipbd und der zufälligen DNA könnte in jeder Reihenfolge vorliegen, jedoch ist ipbd stromaufwärts etwas bevorzugt. Isolate der auf diese Weise erzeugten Population können auf die Präsentation von IPBD durchmustert werden. Vorzugsweise wird eine Version der Selektion-durch-Bindung verwendet, um GPs zu selektieren, die die IPBD auf der GP-Oberfläche presentieren und folglich ein DNA-Insert, welches für eine funktionelle OSTS kodiert enthalten. Alternativ können klonale Isolate der GPs auf den Präsentation-der-IPBD-Phänotyp durchmustert werden.
Die Bevorzugung der Anordnung ipbd stromaufwärts von der zufälligen DNA gründet auf der Betrachtung der Art und Weise, auf welche die erfolgreiche GP(IPBD) verwendet werden wird. In Teil III werden wir zahlreiche Mutationen in die pbd- Region des osp-Dbd-Gens einführen, von denen einige willkürliche Stoppcodons umfassen könnten. Falls pbd vor der zufälligen DNA liegt, führen die willkürlichen Stoppcodons im pbd dazu, daß kein OSP-PBD-Protein auf der Zelloberfläche erscheint. Falls das pbd hinter der zufälligen DNA liegt, könnten die willkürlichen Stopp-Codons im pbd dazu führen, daß unvollständige OSP-PBD-Proteine auf der Zelloberfläche erscheinen. Unvollständige Proteine sind oft nicht-spezifisch "klebrig", so daß GPs, welche unvollständige PBDs präsentieren, auf einfache Weise aus der Population entfernt werden.

Abschnitt 1.2: Präsentieren der IPBD auf Bakteriensporen:

Bakteriensporen besitzen wünschenswerte Eigenschaften als GP-Kandidaten. Bacillus-Sporen metabolisieren nicht aktiv noch verändern sie Proteine auf ihrer Oberfläche. Jedoch sind Sporen viel resistenter als vegetative Bakterienzellen oder Phagen gegenüber chemischen und physikalischen Mitteln. Sporen besitzen den Nachteil, daß die molekularen Mechanismen, die die Sporulation auslösen, weniger gut herausgearbeitet sind als die Bildung von M13 oder der Export von Proteinen zur äußeren Membran von E. coli.

Abschnitt 1.2.1.: Bevorzugte Bakteriensporen zur Verwendung als GPs:

Bakterien der Gattung Bacillus bilden Endosporen, die extrem resistent gegenüber Hitzeschäden, Bestrahlung, Austrocknung und toxischen Chemikalien sind (Übersicht durch Losick etal. (LOSI86)). Diese Sporen besitzen eine komplexe Struktur und Morphogenese, die Spezies-spezifisch und nur teilweise entschlüsselt ist. Die folgenden Beobachtungen sind relevant für die Verwendung von Bacillus- Sporen als genetische Packungen.
Plasmid-DNA wird gewbhnlich in Sporen eingeschlossen. Plasmid-kodierte Proteine sind auf der Oberfläche von Bacillus-Sporen- beobachtet worden (DEBR86). Die Sporulation umfaßt eine komplexe zeitliche Regulation, die nur mäßig gut verstanden wird (LOSI86). Die Sequenzen mehrerer Sporulationspromotoren sind bekannt; kodierende Sequenzen, die in funktioneller Weise mit solchen Promotoren verknüpft sind, werden nur während der Sporulation exprimiert (RAYC87).
Donovan etal. haben mehrere Polypeptid bestandteile der B. subtilis-Sporenhülle identifiziert (DONO87); die Sequenzen zweier vollständiger Hüllproteinen und die Amino-terminalen Fragmente zweier weiterer sind bestimmt worden. Einige Bestandteile der Spore werden in der Vorspore synthetisiert, z. B. kleine säurelösliche Sporenproteine (ERRI88), während andere Bestandteile in der Mutterzelle synthetisiert werden und in der Spore erscheinen (z. B. die Hüllproteine). Diese räumliche Organisation der Synthese wird auf transkriptionaler Ebene kontrolliert.
Sporen bauen sich selbst zusammen, jedoch sind die Signale, die veranlassen, daß sich verschiedene Proteine in verschiedenen Teilen der Spore lokalisieren, nicht sehr gut verstanden; vermutlich sind die Signale, die die Verlagerung der Hüllproteine aus dem Zytoplasma der Mutterzelle auf die Sporenhülle kontrollieren, in der Polypeptidsequenz eingebettet. Einige, jedoch nicht alle Hüllproteine werden als Vorläufermoleküle synthetisiert und danach durch spezifische Proteasen vor der Ablagerung in der Sporenhülle prozessiert (DONO87). Lebende Sporen, die sich nur wenig vom Wildtyp unterscheiden, werden in B. subtilis produziert, selbst wenn eines von vier Hüllproteinen fehlt (DONO87). Disulfidbindungen bilden sich innerhalb der Spore (Thiol-reduzierende Mittel werden benötigt, um einige der Hüllproteine in Lösung zu bringen). Das 12kd-Hüllprotein Cotd enthält 5 Cysteine. CotD enthält auch eine ungewöhnlich hohe Anzahl an Histidinen (16) und Prolinen (7). Das 11kd- Hüllprotein CotC enthält nur ein Cystein und ein Methionin. CotC besitzt eine sehr ungewöhnliche Aminosäuresequenz mit 19 Lysinen (K), die als 9 K-K-Dipeptide und ein isoliertes K erscheinen. Es kommen auch 20 Tyrosine (Y) vor, von denen 10 als 5 Y-Y-Dipeptide erscheinen. Von Peptiden, die reich an Y und K sind, ist bekannt, daß sie in oxidierenden Umgebungen vernetzt werden (DEVO78, WAIT83, WAIT86). CotC enthält 16 D- und E-Aminosäuren, die fast gleich sind mit den 19 Ks. Es gibt keine A-, F-, R-, I-, L-, N-, P-, Q-, S- oder W-Aminosäuren in CotC. Weder CotC noch CotD wird posttranslational gespalten. Die Proteine CotA und CotB werden posttranslational gespalten.
Endosporen aus der Gattung Bacillus sind stabiler als Exosporen von Streptomyces. Bacillus subtilis bildet Sporen in 4 bis 6 Stunden, während Streptomyces-Arten Tage oder Wochen benötigen können, um zu sporulieren. Weiterhin ist das genetische Wissen und die Manipulationstechnik für B. subtilis viel weiter entwickelt als für die anderen sporenbildenden Bakterien. Folglich sind Bacillus-Sporen im Vergleich zu Streptomyces-Sporen bevorzugt. Bakterien der Gattung Clostridium bilden auch sehr dauerhafte Endosporen, jedoch sind Clostridien strikt anaerob und nicht leicht zu kultivieren. Die Wahl einer Art aus Bacillus wird geleitet durch das Wissen und die Verfügbarkeit von Klonierungssystemen und der Einfachheit, mit der die Sporulation kontrolliert werden kann. Ein bestimmter Stamm wird durch die in Abschnitt 1. aufgeführten Kriterien ausgewählt. Viele vegetative biochemische Synthesewege werden abgeschaltet, wenn die Sporulation beginnt, so daß prosthetische Gruppen nicht verfügbar sein könnten.

Abschnitt 1.2.2 Bevorzugte Außenoberflächenproteine für die Präsentation der IPBD auf Bakteriensporen:

Wenn eine Spore als GP ausgewählt wird, ist der Promotor der wichtigste Teil des osd-Gens, da der Promotor eines Sporenhüllproteins am aktivsten ist: a) wenn das Sporenhüllprotein synthetisiert und auf der Spore abgelagert wird und b) an dem spezifischen Ort, an dem Sporenhüllproteine hergestellt werden. In B. subtilis werden einige der Sporenhüllproteine durch spezifische Proteasen posttranslational prozessiert. Es ist vorteilhaft, die Sequenzen der Vorläufermoleküle und reifen Hüllproteine zu kennen, so daß wir das Einbringen der Erkennungssequenz der spezifischen Protease in unsere Konstruktion einer OSP-IPBD-Fusion verhindern können. Die Sequenz eines reifen Sporenhüllproteins enthält Information, die veranlaßt, daß das Protein in der Sporenhülle abgelagert wird; folglich sind Genfusionen, die einen Teil oder die vollständige Sequenz eines reifen Hüllproteins umfassen, für das Durchmustern oder die Selektion auf den Präsentation-der-IPBD- Phänotyp bevorzugt.
Fusionen der ipbd-Fragmente an cotC- oder cotD-Fragmente veranlassen wahrscheinlich die IPBD, auf der Sporenoberfläche zu erscheinen. Die Gene cotC und cotD sind bevorzugte osp-Gene, da CotC und CotD nicht posttranslational gespalten werden. Subsequenzen von cotA oder cotB könnten ebenfalls verwendet werden, um eine IPBD zu veranlassen, auf der Oberfläche von B. subtilis-Sporen zu erscheinen, jedoch müssen wir die posttranslationale Spaltung dieser Proteine in Betracht ziehen. Für IPBD kodierende DNA könnte an beiden Enden der kodierenden Region oder an Stellen innerhalb der kodierenden Region an ein Fragment von cotA oder cotB fusioniert werden. Sporen könnten dann durchmustert oder auf den Präsentation-der-IPBD-Phänotyp selektiert werden.
Es ist bis heute nicht gezeigt worden, daß ein Bacillus-Sporulationspromotor durch einen exogenen chemischen Induktor induzierbar ist, wie der lac-Promotor von E. coli. Nichtsdestoweniger kann die Menge an Protein, das ausgehend von einem Sporulationspromotor hergestellt wird, durch andere Faktoren kontrolliert werden, wie die DNA-Sequenz nahe der Shine-Dalgarno-Sequenz oder die Codonverwendung.

Abschnitt 1.2.3: Wahl der Insertionsstelle für die IPBD im OSP einer Bakterienspore:

Die Überlegungen, die die Wahl der Insertionsstelle im Sporen-OSP leiten, sind dieselben, wie diejenigen, die im Abschnitt 1.1.3 angeführt sind.

Abschnitt 1.2.4: In Vivo-Selektion auf Pseudo-osd-Gene ausgehend von Inserts zufälliger DNA in Bakteriensporen:

Obwohl die Überlegungen für Sporen nahezu identisch mit den Überlegungen für vegetative Bakterienzellen sind (Abschnitt 1.1), ist die verfügbare Information über die Mechanismen, die Proteine veranlassen, auf Sporen zu erscheinen, dürftig, so daß die Verwendung des Weges über die zufällige DNA eine attraktivere Option wird.
Wir können den vorstehend unter 1.1.4 beschriebenen Weg zum Anheften einer IPBD an eine E. coli-Zelle verwenden, außer daß: a) ein Sporulationspromotor verwendet wird und b) keine periplasmatische Signalsequenz vorhanden sein sollte.

Abschnitt 1.3: Präsentation der IPBD auf der äußeren Oberfläche von Phagen:

Abschnitt 1.3.1: Bevorzugte Phagen zur Verwendung als GPs:

Im Gegensatz zu Bakterienzellen und -sporen hängt die Wahl eines Phagen stark von der Kenntnis der 3D-Struktur eines OSP ab und von der Kenntnis, wie dieses mit anderen Proteinen im Kapsid wechselwirkt. Die Größe des Phagengenoms und der Verpackungsmechanismus sind ebenfalls wichtig, da das Phagengenom selbst den Klonierungsvektor darstellt. Das osp-ipbd-Gen muß in das Phagengenom eingebaut werden; daher:
1) muß das Virion die Insertion oder Substitution des genetischen Materials akzeptieren können und
2) muß das Genom des Phagen klein genug sein, um eine geeignete Manipulation zu erlauben.
Zusätzliche sind die folgenden Überlegungen bei der Auswahl eines Phagen zu beachten: 1) der morphogenetische Syntheseweg des Phagen bestimmt die Umgebung, in welcher die IPBD die Gelegenheit haben wird, sich zu falten, 2) essentielle Disulfide enthaltende IPBDs können sich nicht innerhalb einer Zelle falten, 3) große oder unlösliche prosthetische Gruppen benötigende IPBDs können sich nicht falten, wenn sie sezerniert werden, da die prosthetische Gruppe fehlt und 4) wenn im Teil III eine Vanierung eingeführt wird, könnten mehrfache Infektionen Hybrid-GPs erzeugen, die das Gen für eine PBD tragen, jedoch zumindest einige Kopien eine unterschiedliche PBD auf ihren Oberflächen besitzen; es ist bevorzugt, diese Möglichkeit zu minimieren.
Bakteriophagen sind ausgezeichnete Kandidaten für GPs, da es nur eine geringe oder keine enzymatische Aktivität gibt, die mit intakten reifen Phagen assoziiert ist, und weil die Gene außerhalb eines bakteriellen Wirts inaktiv sind, was die reifen Phagenpartikel metabolisch inert macht. Der filamentöse Phage M13 und Bakteriophage PhiX174 sind von besonderem Interesse.

Filamentöser Phage:

Der gesamte Lebenszyklus des filamentösen Phagen M13, ein gewöhnlicher Klonierungs- und Sequenzierungsvektor, wird gut verstanden. M13 und f1 sind so nahe verwandt, daß wir die Eigenschaften jedes einzelnen als relevant für beide betrachten (RASC86); irgendwelche Unterscheidungen sind nur für die historische Genauigkeit wichtig. Die genetische Struktur (die vollständige Sequenz (SCHA78), die Identität und Funktion der zehn Gene und die Anordnung der Transkription und Lokalisierung des Promotors) von M13 sind ebenso gut bekannt wie die physikalische Struktur des Virions (BANN81, BOEK80, CHAN79, ITOK79, KAPL78, KUHN85b, KUHN87, MAKO80, MARV78, MESS78, OHKA81, RASC86, RUSS81, SCHA78, SMIT85, WEBS78 und ZIMM82); siehe RASO86 als Beispiel für eine kürzlich erschienene Übersicht der Struktur und Funktion der Hüllproteine.
Wichtige Fakten über M13 sind in Beispiel I offenbart.

Bakteriophage PhiX174:

Der Bakteriophage PhiX174 ist ein sehr kleines icosaedrisches Virus, das sorgfältig mit Hilfe der Genetik, Biochemie und Elektronenmikroskopie untersucht worden ist (siehe The Single-Stranded DNA Phages (DENH78)). Bis heute sind keine Proteine von PhiX174 durch Röntgenstrahldiffraktion untersucht worden. PhiX174 ist nicht als Klonierungsvektor verwendet worden, da PhiX174 fast keine zusätzliche DNA akzeptieren kann; das Virus ist so eng gedrängt, daß mehrere seiner Gene überlappen. Chambers et al. (CHAM82) zeigten, daß Mutanten im Gen G durch das auf einem Plasmid getragene Wildtyp-G-Gen gerettet werden, so daß der Wirt dieses Protein liefert.
Drei Genprodukte von PhiX174 sind auf der Außenseite des reifen Virions vorhanden: F (Kapsid), G (Hauptstachelprotein, 60 Kopien pro Virion) und H (Nebenstachelprotein, 12 Kopien pro Virion). Das G-Protein umfaßt 175 Aminosäuren, während H 328 Aminosäuren umfaßt. Das F-Protein interagiert mit der einzelsträngigen DNA des Virus. Die Proteine F, G und H werden von einer einzigen mRNA in den Virus-infizierten Zellen translatiert.

Große DNA-Phagen

Phagen wie Lambda oder T4 besitzen viel größere Genome im Vergleich zu M13 oder PhiX174. Große Genome können weniger gut manipuliert werden als kleine Genome. Ein Phage mit einem großen Genom könnte jedoch verwendet werden, falls eine genetische Manipulation ausreichend gut durchgeführt werden kann. Phagen wie Lambda und T4 besitzen kompliziertere 3D-Kapsidstrukturen als M13 oder PhiX174, wodurch mehr OSPs ausgewählt werden müssen. Phage Lambda- Virions und Phage T4-Virions bilden sich intrazellulär, so daß IPBDs, die große oder unlösliche prosthetische Gruppen benötigen, sich auf der Oberfläche dieser Phagen falten könnten. Der Phage Lambda und der Phage T4 sind nicht bevorzugt, wobei jedoch Abkömmlinge dieser Phagen konstruiert werden können, um diese Nachteile zu überwinden.

RNA-Phagen

RNA-Phagen wie Qbeta sind nicht bevorzugt, da eine Manipulation von RNA viel weniger geeignet ist als die Manipulation von DNA. Obwohl kompetente RNA- Bakteriophagen nicht bevorzugt sind, könnten geeignete, genetisch veränderte, RNA-enthaltende Partikel von RNA-Phagen abgeleitet werden, wie MS2.
Um MS2 als GP verwenden zu können, müßten wir den größten Anteil des natürlichen Virusgenoms entfernen, so daß ein osd-ipbd-Gen in das Proteinkapsid passen könnte. Es ist bekannt, daß das A-Protein sequenzspezifisch an eine Stelle am 5'-Ende des + RNA-Strangs bindet, wodurch die Bildung von RNA-enthaltenden Partikeln veranlaßt wird, wenn das Hüllprotein vorhanden ist. Wenn eine Botschaft (message), die die A-Proteinbindungsstelle und das Gen für eine Chimäre des Hüllproteins und einer PBD enthält, in einer Zelle, die ebenfalls das A-Protein und das Wildtyp-Hüllprotein (beide ausgehend von regulierten Genen auf einem Plasmid hergestellt) enthält, produziert würde, würde die für das chimäre Protein kodierende RNA verpackt werden. Eine Packung, die RNA umfaßt, welche durch Proteine, die von dieser RNA kodiert werden, eingekapselt ist, genügt dem Hauptkriterium, daß die genetische Botschaft innerhalb der Packung irgendetwas auf der Außenseite spezifiziert. Die Partikel selbst sind nicht lebensfähig.
Nach dem Isolieren der Packungen, die eine SBD tragen, müßten wir:
1) die RNA vom Proteinkapsid trennen,
2) die RNA in DNA mittels AMV- oder MMTV-Reverser Transkriptase revers transkribieren und
3) die DNA durch mehrere Zyklen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) solange amplifizieren, bis genug Material vorhanden ist, um die gewonnene genetische Botschaft in ein Plasmid zum Sequenzieren und für weitere Arbeiten subklonieren zu können.
Alternativ könnten Helferphagen verwendet werden, um die Phagen zu retten (rescue).

Abschnitt 1.3.2: Bevorzugte Außenoberflächenproteine zur Präsentation von IPBDs auf Phagen:

Bezüglich eines ausgewählten Bakteriophagen ist das bevorzugte OSP gewähnlich eines, das in der größten Kopienanzahl auf der Phagenoberfläche vorhanden ist, da dies die größte Flexibilität hinsichtlich der Varuerung des Verhältnisses von OSP- IPBD zu Wildtyp-OSP erlaubt und ebenso zu der höchsten Wahrscheinlichkeit führt, eine zufriedenstellende Affinitätstrennung zu erhalten. Weiterhin führt ein Protein, das nur in einer oder wenigen Kopien vorhanden ist, gewöhnlich eine essentielle Funktion bei der Morphogenese oder Infektion aus; das Mutieren eines solchen Proteins durch Addition oder Insertion führt wahrscheinlich zu einer verminderten Lebensfähigkeit der GP.
Es ist bevorzugt, daß das Wildtyp-osp-Gen erhalten bleibt. Das ipbd-Genfragment kann entweder in eine zweite Kopie des Rezipienten-osp-Gens oder in ein neu konstruiertes osp-Gen eingebaut werden. Das bevorzugte OSP für den Fall, daß die GP M13 ist, ist das Gen III-Protein (siehe Beispiel 1).

Abschnitt 1.3.3: Wahl der Insertionsstelle für die IPBD im OSP:

Der Anwender muß eine Stelle in dem gewählten OSP-Gen für die Insertion eines ipbd-Genfragments auswählen. Die Hüllen der meisten Bakteriophagen sind hochgeordnet. Folglich ist es bei Bakteriophagen im Gegensatz zu Bakterien und Sporen wichtig, die meisten oder alle Reste des parentalen OSP in den konstruierten OSP-IPBD-Fusionsproteinen zu erhalten. Eine bevorzugte Stelle für die Insertion des ipbd-Gens in das Phagen-osd-Gen ist eine, in der: a) die IPBD sich in ihre ursprüngliche Form faltet, b) die OSP-Domänen sich in ihre ursprünglichen Formen falten und c) es keine Wechselwirkung zwischen den beiden Domänen gibt.
Falls ein 3D-Modell des Phagen verfügbar ist, das andeutet, daß entweder der Amino- oder Carboxy-Terminus eines OSP zum Lösungsmittel exponiert ist, wird der exponierte Terminus dieses reifen OSP zum primären Kandidaten für die Insertion des ipbd-Gens. Ein 3D-Modell mit geringer Auflösung genügt.
In der Abwesenheit einer 3D-Struktur sind die Amino- und Carboxy-Termini des reifen OSP die besten Kandidaten für die Insertion des ipbd-Gens. Eine funktionelle Fusion kann zusätzliche Reste zwischen den IPBD- und OSP-Domänen erfordern, um ungewollte Wechselwirkungen zwischen den Domänen zu verhindern. DNA mit zufälliger Sequenz oder DNA, die für eine spezifische Sequenz eines Proteins kodiert, welches homolog zu der IPBD oder dem OSP ist, kann, falls notwendig, zwischen das osp-Fragment und ipbd-Fragment eingebaut werden.
Die Fusion an einer Domänengrenze innerhalb des OSP ist ebenfalls ein guter Weg zum Erhalten einer funktionellen Fusion.
Es existieren mehrere Verfahren zum Identifizieren der Domänen. Verfahren, die sich auf Atomkoordinaten beziehen, sind in einem Übersichtsartikel zusammengefaßt durch Janin und Chothia (JANI85), siehe auch ROSE85, RASH84, VITA84, PABO79, POTE83 und SCOT87.
Wenn die einzige erhältliche Strukturinformation die Aminosäuresequenz des OSP- Kandidaten ist, verwenden wird die Sequenz, um Biegungen und Schleifen vorauszusagen. Die Wahrscheinlichkeit ist hoch, daß einige der Schleifen und Biegungen korrekt vorausgesagt werden (vgl. Chou und Fasman (CHOU72)); diese Orte sind ebenso Kandidaten für die Insertion des ipbd-Genfragments.

Abschnitt 1.3.4: In Vivo-Selektion auf das Pseudo-OSP-Gen ausgehend von Inserts zufälliger DNA in Bakteriensporen:

Alternativ kann eine funktionelle Insertionsstelle dadurch bestimmt werden, daß eine Anzahl rekombinanter Konstrukte erzeugt und der funktionelle Stamm auf der Grundlage phänotypischer Merkmale selektiert wird. Da die OSP-IPBD in der Phagenhülle eine strukturelle Rolle erfüllen muß, ist es unwahrscheinlich, daß irgendeine an das ipbd-Gen geknüpfte, bestimmte Sequenz zufälliger DNA ein Fusionsprotein produzieren wird, das in einer funktionellen Weise in die Hülle paßt. Nichtsdestoweniger wird zufällige DNA, die zwischen große Fragmente eines Hüllproteingens und das ipbd-Gen eingebaut wird, ein Population erzeugen, die wahrscheinlich ein oder mehrere Mitglieder enthält, welche die IPBD auf der Außenseite eines lebensfähigen Phagen präsentieren. Eine Präsentationsprobe, die ähnlich zu derjenigen ist, die in 1.1.4 definiert ist, wird konstruiert, und Sequenzen zufälliger DNA werden in die geegneten Stellen kloniert.

Abschnitt 2: Wahl der IPBD:

Eine IPBD kann aus natürlich vorkommenden Proteinen oder Domänen natürlich vorkommender Proteine ausgewählt oder ausgehend von ersten Prinzipien entworfen werden. Ein entworfenes Protein kann Vorteile über natürliche Proteine aufweisen, wenn: a) das entworfene Protein stabiler ist, b) das entworfene Protein kleiner ist und c) die Ladungsverteilung des entworfenen Proteins freier spezifiziert werden kann.
Eine Kandidaten-IPBD muß die folgenden Kriterien erfüllen: 1) Stabilität unter den Bedingungen für deren beabsichtigte Verwendung (die Domäne kann das gesamte Protein umfassen, das eingebaut werden wird, z. B. BPTI), 2) die Kenntnis der Aminosäuresequenz ist erhältlich, 3) Identifizierung der Reste auf der äußeren Oberfläche und deren räumliche Beziehung und 4) Verfügbarkeit eines Moleküls, AfM(IPBD), mit einer hohen spezifischen Affinität für die IPBD.
Vorzugsweise ist die IPBD nicht größer als notwendig, da es leichter ist, Restriktionsstellen in kürzere Aminosäuresequenzen einzubauen. Die Nützlichkeit von Kandidaten-IPBDs, die alle diese Voraussetzungen erfüllen, hängt von der Verfügbarkeit der nachstehend diskutierten Information ab.
Die Information, die verwendet wird, um über die Geeignetheit einer IPBD zu entscheiden, umfaßt: 1) eine 3D-Struktur (Kenntnis stark bevorzugt), 2) eine oder mehrere Sequenzen, die homolog zu der IPBD sind (je mehr homologe Sequenzen bekannt sind, desto besser), 3) den pI der IPBD (Kenntnis ist in einigen Fällen notwendig), 4) die Stabilität und Löslichkeit als Funktion der Temperatur, des pH und der Ionenstärke (vorzugsweise bekannt als stabil über einen weiten Bereich und löslich unter Bedingungen der beabsichtigten Verwendung), 5) die Fähigkeit zur Bindung von Metallionen wie Ca&spplus;&spplus; oder Mg&spplus;&spplus; (Kenntnis bevorzugt; Bindung per se, keine Präferenz), 6) enzymatische Aktivitäten, wenn vorhanden (Kenntnis borzugt, Aktivität per se hat Verwendungen, kann jedoch Probleme verursachen), 7) Bindungseigenschaften, wenn vorhanden (Kenntnis bevorzugt, spezifische Bindung ebenfalls bevorzugt), 8) die Verfügbarkeit eines Moleküls mit spezifischer und starker Affinität (Kd < 10&supmin;¹¹ M) für die IPBD (bevorzugt), 9) die Verfügbarkeit eines Moleküls mit spezifischer und mittlerer Affinität (10 M < Kd < 10&supmin;&sup6; M) für die IPBD (bevorzugt), 10) die Sequenz einer IPBD-Mutante, die nicht an das (die) Affinitätsmolekül(e) bindet (bevorzugt) und 11) die Absorptionsspektrum im Sichtbaren, UV, NMR, etc. (charakteristische Absorption bevorzugt).
Wenn nur eine Molekülart mit Affinität für die IPBD (AfM(IPBD)) verfügbar ist, wird diese verwendet werden, um a) die IPBD auf der GP-Oberfläche zu detektieren, b) die Expressionsrate und die Dichte des Affinitätsmoleküls auf der Matrix zu optimieren (Abschnitt 10.1) und c) die Effizienz und Empfindlichkeit der Affinitätstrennung zu bestimmen (Abschnitte 10.2 und 10.3). Wie vorstehend angemerkt, würde man jedoch bevorzugen, zwei Arten von AfM(IPBD) verfügbar zu haben, eine mit hoher und eine mit mittlerer Affinität für die IPBD. Die Art mit hoher Affinität würde für die anfängliche Detektion und für die Bestimmung der Effizienz und Empfindlichkeit verwendet werden (10.2 und 10.3) und die Art mit mittlerer Affinität würde für die Optimierung verwendet werden (10.1).
Für mindestens 20 Kandidaten-IPBDs ist die vorstehende Information verfügbar oder ist praktisch zu erhalten, wie z.B. Rinderpankreas-Trypsininhibitor (BPTI, 58 Reste), Crambin (46 Reste), dritte Domäne von Ovomucoid (56 Reste), T4-Lysozym (164 Reste) und Azurin (128 Reste).
Die meisten der PBDs, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren von einer PPBD abstammen, beeinflussen Reste mit Seitengruppen, die zum Lösungsmittel hin gerichtet sind. Exponierte Reste können einen weiten Bereich von Aminosäuren akzeptieren, während verborgene Reste diesbezüglich beschränkter sind (REID88). Oberflächenmutationen üben typischerweise nur geringe Effekte auf die Schmelztemperatur der PBD aus, sie können jedoch die Stabilität der PBD vermindern. Daher sollte die gewählte IPBD eine hohe Schmeiztemperatur (60ºC akzeptierbar, je höher desto besser) aufweisen und über einen weiten pH-Bereich (8,0 bis 3,0 akzeptierbar; 11,0 bis 2,0 bevorzugt) stabil sein, so daß die SBDs, die durch Mutation und Selektion-durch-Bindung von der ausgewählten IPBD abstammen, eine ausreichende Stabilität beibehalten. Vorzugsweise vermindern die Substitutionen in der IPBD, die verschiedene PBDs ergibt, den Schmelzpunkt der Domäne nicht unter 50ºC.
Zwei allgemeine Merkmale des Zielmoleküls - Größe und Ladung - haben eine Einfluß darauf, daß gewisse Klassen von IPBDs wahrscheinlicher als andere Klassen Derivate ergeben, die spezifisch an das Zielmolekül binden werden. Da diese sehr allgemeine Merkmale sind, kann man alle Zielmoleküle in sechs Klassen unterteilen: a) große positive, b) große neutrale, c) große negative, d) kleine positive, e) kleine neutrale und f) kleine negative. Eine kleine Auswahl von IPBDs - eine oder wenige, die jeder Zielmolekülklasse entsprechen - werden eine bevorzugte Kandidaten-IPBD für irgendein ausgewähltes Zielmolekül enthalten.
Alternativ kann der Anwender wählen, eine GP(IPBD) für ein bestimmtes Zielmolekül zu konstruieren; Abschnitt 2.1 stellt Kriterien dar, die eine Beziehung schaffen zwischen der Zielmolekülgröße und -ladung zu der Auswahl der IPBD.

Abschnitt 2.1: Einfluß der Zielmolekülgröße auf die Wahl der IPBD:

Wenn das Zielmolekül ein Protein oder ein anderes Makromolekül ist, ist eine bevorzugte Ausführungsform der IPBD ein kleines Protein wie BPTI von Bos taurus (58 Reste), Crambin von Rapssamen (46 Reste) oder die dritte Domäne von Ovomucoid von Coturnix coturnix Japonica (japanische Wachtel) (56 Reste) (PAPAB2), da Zielmoleküle aus dieser Klasse Spalten und Gruben aufweisen, die kleine Proteine in einer hochspezifischen Weise angleichen können. Wenn das Zielmolekül ein Makromolekül ohne eine kompakte Struktur ist, wie Stärke, sollte dieses behandelt werden, als wäre es ein kleines Molekül. Ausgedehnte Makromoleküle mit definierter 3D-Struktur, wie Collagen, sollten als große Moleküle behandelt werden.
Wenn das Zielmolekül ein kleines Molekül ist, wie ein Steroid, ist eine bevorzugte Ausführungsform der IPBD ein Protein mit der Größe von Ribonuklease von Bos taurus (124 Reste), Ribonuklease von Aspergillus oryzae (104 Reste), Hühnereiweißlysozym von Gallus gallus (129 Reste), Azurin von Pseudomonas aeruginosa (128 Reste) oder T4-Lysozym (164 Reste), weil solche Proteine Spalten und Gruben aufweisen, in welche das kleine Zielmolekül passen kann. Die Brookhaven-Proteindatenbank enthält 3D-Strukturen für diese Proteine. Gene, die für Proteine kodieren, die so groß sind wie T4-Lysozym können durch Standardtechniken für die erfindungsgemäßen Zwecke manipuliert werden.
Wenn das Zielmolekül ein im Wasser unlösliches Mineral ist, muß man die Natur der molekularen Oberfläche des Minerals in Betracht ziehen. Glatte Oberflächen (wie kristallines Silicium) benötigen mittlere bis große Proteine (wie Ribonuklease) als IPBD, damit sie einen ausreichenden Kontaktbereich und eine ausreichende Spezifität besitzen. Rauhe, geriffelte Oberflächen (Zeolite) könnten entweder von kleinen Proteinen (BPTI) oder größeren Proteinen (T4-Lysozym) gebunden werden.
Das Zielmaterial kann beispielsweise ausgewählt werden aus einer nichtmakromolekularen organischen Verbindung, wobei in diesem Fall die potentielle Bindedomäne mehr als ungefähr 80 Aminosäurereste umfassen kann, und einer makromolekularen organischen Verbindung, wobei in diesem Fall die potentielle Bindedomäne weniger als ungefähr 80 Aminosäurereste besitzen kann.

Abschnitt 2.2: Einfluß der Zielmolekülladung auf die Wahl der IPBD:

Elektrostatische Abstoßung zwischen Molekülen gleicher Ladung kann Moleküle mit hochkomplementären Oberflächen an der Bindung hindern. Daher ist es bevorzugt, daß die IPBD und das Zielmolekül unter den Bedingungen der beabsichtigten Verwendung entweder entgegengesetzte Ladung aufweisen oder daß eines von diesen neutral ist. Der Einschluß von Gegenionen kann eine elektrostatische Abstoßung vermindern oder beseitigen.

Abschnitt 2.3: Weitere Asdekte der Wahl der IPBD:

Wenn die ausgewählte IPBD ein Enzym ist, kann es notwendig sein, einen oder mehrere Reste im aktiven Zentrum zu verändern, um die Enzymfunktion zu inaktivieren. Wenn beispielsweise die IPBD T4-Lysozym und die GP E. coli-Zellen oder M13 wären, würden wir das Lysozym inaktivieren, damit es die Zellen nicht lysiert. Wenn andererseits die GP PhiX174 wäre, wäre die Inaktivierung von Lysozym nicht notwendig, weil T4-Lysozym innerhalb von E. coli-Zellen ohne Zerstörungswirkungen überproduziert werden kann und PhiX174 sich intrazellulär bildet. Es ist bevorzugt, Enzym-IPBDs, die für die GP oder ihren Wirt schädlich sein könnten, durch das Ersetzen von Aminosäuren an einem oder mehreren Resten des aktiven Zentrums zu inaktivieren. Es ist erlaubt, einen oder mehrere Reste zu variieren, die verändert wurden, um die ursprüngliche enzymatische Aktivität der IPBD auszulöschen. Solche GPs, die für ein aktives Enyzm kodierende osd-pbd- Gene erhalten, können sterben, jedoch wird der größte Anteil der Sequenzen nicht schädlich sein.

Abschnitt 3: Wahl des OCV:

Der OCV ist vorzugsweise klein, z. B. kleiner als 10 kb. Es ist wünschenswert, daß Kassettenmutagenese für den OCV anwendbar ist; vorzugsweise sind mindestens 25 Restriktionsenzyme verfiigbar, die den OCV nicht schneiden. Es ist ebenso wünschenswert, daß Einzelstrang-Mutagenese anwendbar ist. Letztendlich trägt der OCV vorzugsweise einen Selektionsmarker. Ein geeigneter OCV ist käuflich erhältlich oder wird durch Manipulation verfügbarer Vektoren konstruiert. Plasmide sind bevorzugt vor dem bakteriellen Chromosom, da Gene auf Plasmiden viel einfacher konstruiert und mutiert werden können als chromosomale Gene. Wenn Bakteriophagen verwendet werden müssen, muß das osp-ipbd-Gen in das Phagengenom eingebaut werden.
Für Phagen, wie M13, wird ein Antibiotikumresistenzgen in das Genom eingebracht (HINE80). Virulentere Phagen, wie PhiX174, erzeugen erkennbare Plaques, die abgenommen werden können, so daß in diesen Fällen ein Resistenzgen nicht essentiell ist; außerdem gibt es keinen Platz im PhiX174-Virion, um irgendein zusätzliches genetisches Material zuzufügen. Die Unfähigkeit, ein Antibiotikumresistenzgen einzubringen, ist ein Nachteil, da dies die Anzahl der GPs, die durchmustert werden können, beschränkt.
Es ist bevorzugt, daß die GP(IPBD) einen Selektionsmarker, der von der wtGP nicht getragen wird, trägt. Es ist ebenso bevorzugt, daß die wtGP einen Selektionsmarker, der nicht von der GP(IPBD) getragen wird, trägt.

Abschnitt 4: Entwerfen des osp-ipbd-Geninserts:

Wir entwerfen eine Aminosäuresequenz, die die IPBD veranlassen wird, auf der GP- Oberfläche zu erscheinen, wenn sie exprimiert wird. Diese Aminosäuresequenz kann die gesamte kodierende Region des osp-ipbd-Gens determinieren, oder sie kann nur die ipbd-Sequenz enthalten, welche an Restriktionsstellen grenzt, in die zufällige DNA kloniert werden wird (Abschnitt 6.2).
Das tatsächliche Gen kann auf irgendeine Weise hergestellt produziert werden. Das Dbd-Segment, das vom ipbd-Segment abstammt, muß auf die Weise, die in Teil III beschrieben ist, einfach genetisch manipulierbar sein. Synthetische ipbd-Segmente sind bevorzugt, da sie die größte Kontrolle über das Plazieren von Restriktionsstellen erlauben.

Abschnitt 4.1: Genetische Regulation des osp-ipbd-Gens:

Bezüglich der Regulation des osp-ipbd-Gens sind die zwei wichtigen Fragen: a) wieviel OSP-IPBD benötigen wir auf jeder GP und b) wie sorgfältig müssen wir diese Menge regulieren?
Die essentielle Funktion der Affinitätstrennung ist es, GPs, die PBDs (abgeleitet von der IPBD) mit einer hohen Affinität für das Zielmolekül tragen, von GPs, die PBDs mit einer niedrigen Affinität für das Zielmolekül tragen, zu trennen. Wenn ein Grad ient irgendeines Elutionsmittels, wie ansteigende Salzkonzentration, die Bedingungen verändert, werden alle schwachbindenden PBDs nicht mehr binden, bevor irgendwelche starkbindenden PBDs nicht mehr binden. Die Regulation des osp-pbd-Gens muß so sein, daß alle Packungen genügend PBD präsentieren, um eine gute Trennung in Abschnitt 15 zu erreichen. Wenn die Menge von PBD/GP einen Effekt auf das Elutionsvolumen der GP von der Affinitätsmatrix haben würde, müßten wir die Menge von PBD/GP sorgfältig regulieren. Die folgende Analyse zeigt, daß es einen streng linearen Effekt von IPBD/GP auf das Elutionsvolumen gibt, und nimmt nur an: a) daß alle GPs dieselbe Größe aufweisen, b) daß Wechselwirkungen zwischen den PBDs und der Affinitätsmatrix die unterschiedliche Elution der GPs dominieren, c) daß das System im Gleichgewicht ist und d) daß alle PBDs auf ein und derselben GP identisch sind.
Wenn Np identische PBDs auf einer GP jeweils Zugang zu den Zielmolekülen haben und jede PBD eine freie Energie der Bindung an das Zielmolekül von delta Gb hat, ist die gesamte freie Bindungsenergie
delta Gbtot = Np * delta Gb.
Delta Gb ist eine Funktion der Parameter des Lösungsmittels, wie: 1) lonenkonzentration, 2) pH, 3) Temperatur, 4) Konzentration neutraler löslicher Feststoffe, wie Saccharose, Glucose, Ethanol, etc., 5) spezifische Ionen, wie Calcium, Acetat, Benzoat, Nikotinat, etc.. Wenn die Bedingungen während der Affinitätstrennung verändert werden, so daß sich delta Gb null nähert, nähert sich delta Gbtot Np mal schneller null. Wenn delta Gbtot auf null zu oder über null geht, werden die Packungen von den immobilisierten Zielmolekülen dissoziieren und eluiert werden.
GPs, die mehr PBDs tragen, weisen eine schärferen Übergang zwischen gebunden und ungebunden auf als Packungen mit weniger derselben PBDs. Für Gleichgewichtsbedingungen wird der Mittelpunkt des Übergangs nur durch die Lösungsbedingungen bestimmt, die die individuellen Wechselwirkungen bis auf eine freie Energie von null bringen. Die Anzahl der PBDs/GP bestimmt die Schärfe des Übergangs.
Es sollte auch angemerkt werden, daß die Anzahl der PBDs/GP gewöhnlich durch die physiologischen Bedingungen beeinflußt wird, so daß eine Probe genetisch identischer GP(PBD)s GPs mit unterschiedlichen Anzahlen von PBDs auf der GP- Oberfläche enthalten kann. In einer Population von GP(vgPBD)s wird jede PBD- Sequenz auf mehr als einer GP erscheinen, und die tatsächliche Anzahl der PBDs/GP wird von GP zu GP innerhalb eines gewissen Bereichs variieren. Innerhalb einer variierten Population von PBDs bedeutet PBDx die PBD mit einer maximalen Affinität für das Zielmolekül. Wenn es einen linearen Effekt der Anzahl der PBDs/GP auf das Elutionsvolumen gibt, werden die GPs mit der größten Anzahl von PBDx diejenigen sein, die am längsten auf der Säule zurückgehalten werden. Wenn wir die angereicherte Population kultivieren, wird die GP(PBDx) amplifiziert werden und neue GP(PBDx)s mit unterschiedlichen Anzahlen von PBDx/GP erzeugen. Folglich könnte das erfindungsgemäße Affinitätstrennungsverfahren einen linearen Effekt der Anzahl von PBDs/GP auf das Elutionsvolumen der GP(PBD) solange tolerieren, bis die starke Bindung an das Zielmolekül die PBD zufällig veranlaßt, auf der GP nur in einer geringen Anzahl präsentiert zu werden.
Da es keinen jinea ren Effekt auf das Elutionsvolumen abhängig von der Anzahl der IPBDs/GP gibt, wird ein Bedarf für eine sehr sorgfältige Regulation von IPBD/GP nicht vorausgesehen. Eine reproduzierbare Genexpression wird einfacher kontrolliert durch Verwendung regulierter anstatt konstitutiver genetischer Elemente. Die vorstehende Analyse nimmt an, daß die GP(IPBD)s im Gleichgewicht zwischen gelöst in Puffer und gebunden an die Affinitätsmatrix sind. Die Elutionsrate kann ein wichtiger Parameter bei der Säulenaffinitätschromatographie sein. Bei der Batch- Elution von einer Affinitätsmatrix oder der Elution von einer Affinitätsplatte kann die Zeit, in der jeder Puffer mit dem Affinitätsmaterial in Kontakt ist, eine wichtige Variable sein. Die Dichte der Affinitätsmoleküle auf der Matrix ist eine wichtige Variable bei der Optimierung der Affinitätstrennung. Da die vorstehende Analyse qualitativ ist, optimieren wir in Abschnitt 10 der bevorzugten Ausführungsform experimentell: 1) die Dichte der IPBD auf der GP-Oberfläche, 2) die Dichte der Affinitätsmoleküle auf der Affinitätsmatrix, 3) die anfängliche Ionenstärke, 4) die Elutionsrate und 5) die Menge von GP/(Matrixvolumen), die auf die Säule geladen wird.
Die Transkriptionsregulation der Genexpression wird am besten verstanden und ist am effektivsten, so daß wir unsere Aufmerksamkeit auf den Promotor richten. Viele Promotoren sind bekannt, die durch spezifische Chemikalien, welche zum Kulturmedium gegeben werden) kontrolliert werden können. Beispielsweise wird der lacUV5-Promotor induziert, wenn Isopropylthiogalactosid zum Kulturmedium zugegeben wird, beispielsweise zu 1,0 µM bis 10,0 mM. Nachstehend verwenden wir "XINDUCE" als einen allgemeinen Ausdruck für eine Chemikalie, die die Expression eines Gens induziert. Wenn die Transkription des osp-ipbd-Gens durch XINDUCE kontrolliert wird, steigt die Anzahl der OSP-IPBDs pro GP bei einer ansteigenden Konzentration von XINDUCE bis ein Abfallen der Anzahl lebensfähiger Packungen beobachtet wird oder bis genügend IPBD auf der Oberfläche geernteter GP(IPBD)s beobachtet wird.
Die Kriterien, die die Maximalanzahl von OSP-IPBDs pro GP beeinflussen, sind primär struktureller Natur. Es kann sterische Hinderung oder andere ungewollte Wechselwirkungen zwischen IPBDs geben, wenn jedes Wildtyp-OSP durch OSP- IPBD ersetzt wird. Exzessive Mengen von OSP-IPBD kann ebenso die Löslichkeit oder die Morphogenese der GP nachteilig beeinflussen. Im Fall von zellulären und viralen GPs ergaben nur fünf Kopien eines Proteins mit Affinität für ein anderes immobilisiertes Molekül eine erfolgreiche Affinitätstrennung (FERE82a, FERE82b und SMIT85).
Eine andere Betrachtung der Promotorregulation ist, daß es später nützlich sein kann, den Regulationsgrad des osp-ipbd zu kennen (Abschnitt 8). Insbesondere sollte man bestimmen, wie die Abwesenheit von XINDUCE zu der Abwesenheit von IPBD auf der GP-Oberfläche führt; ein dichter Promotor ist bevorzugt. Dichtheit ist geeignet: a) zu zeigen, daß die Affinität von GP(osp-ipbd)s für AfM(IPBD) auf dem osp-ipbd-Gen basiert und b) das Wachstum von GP(OSD-pbd) in der Abwesenheit von XINDUCE zu erlauben, wenn die Expression von osp-pbd nachteilig ist. Der lacUV5-Promotor in Verbindung mit dem LaqIq-Repressor ist ein bevorzugtes Beispiel.

Abschnitt 4.2: DNA-Sequenzentwurf:

Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf ein einziges Verfahren des Genentwurfs. Das folgende Verfahren ist ein Beispiel für ein Verfahren des Genentwurfs, das die erfindungsgemäßen Bedürfnisse erfüllt.
Wenn die Aminosäuresequenz der OSP-IPIBD eine definierte Sequenz ist, wird das gesamte Gen konstruiert werden (Abschnitt 6.1). Wenn zufällige DNA an ipbd fusioniert wird, wird zuerst eine "Präsentationsprobe" konstruiert; die zufällige DNA wird danach eingebaut, um die Population mutmaßlicher osp-ipbd-Gene zu vervollständigen (Abschnitt 6.2), aus denen ein funktionelles osd-ipbd-Gen durch in vivo-Selektion oder ähnlichen Techniken identifiziert wird.
Man kann irgendein genetisches Manipulationsverfahren verwenden, um die korrekte Genfusion herzustellen, solange man auf einfache Weise und exakt Mutationen an spezifische Stellen in der pbd-DNA-Subsequenz dirigieren kann (Abschnitt 14.1). Im Fall der hierin betrachteten Mutageneseverfahren muß jedoch die DNA-Sequenz des osp-ipbd-Gens unterschiedlich zu jeder anderen DNA im OCV sein. Der Grad und die Natur des benötigten Unterschieds wird durch das Mutageneseverfahren bestimmt. Man ersetzt Subsequenzen, die für die PBD kodieren, durch vgDNA; danach müssen die zu mutierenden Subsequenzen durch Restriktionsstellen flankiert werden, die innerhalb des OCV nur einmal vorkommen. Wenn Einzelstrang- Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese verwendet werden muß, darf die DNA- Sequenz der für die IPBD kodierenden Subsequenz nur einmal innerhalb des OCV vorkommen.
Regulatorische Elemente umfassen: a) Promotoren, b) Shine-Dalgarno-Sequenzen und c) Transkriptionsterminatoren, und können aus natürlichen Sequenzen isoliert oder aus der Kenntnis der Konsensus-Sequenzen natürlicher regulatorischer Regionen entworfen werden.
Die kodierenden Anteile der zu synthetisierenden Gene werden auf Proteinebene entworfen und danach in DNA kodiert. Die Aminosäuresequenzen werden so ausgewählt, daß sie verschiedene Ziele erreichen, umfassend: a) Präsentation einer IPBD auf der Oberfläche einer GP, b) Veränderung der Ladung auf einer IPBD und c) Erzeugung einer Population von PBDs, aus welcher eine SBD selektiert werden kann. Die Mehrdeutigkeit im genetischen Code wird verwendet, um einen optimalen Austausch von Restriktionsstellen zu erreichen und verschiedene Verteilungen von Aminosäuren an variierten Codons zu erzeugen.

Abschnitt 4.3: Spezifische DNA-Sequenzfestlegung:

Ein Computerprogramm kann verwendet werden, um alle möglichen mehrdeutigen DNA-Sequenzen, die für eine durch den Anwender vorgegebene Aminosäuresequenz kodieren, zu identifizieren und Orte zu identifizieren, wo Restriktionsstellen für ortsspezifische Restriktionsenzyme bereitgestellt werden könnten, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern.
Restriktionsstellen werden innerhalb des osp-ipbd-Gens positioniert, so daß das längste Segment zwischen den Stellen so kurz wie möglich ist. Enzyme, die kohäsive Enden produzieren, sind bevorzugt. Die Codonpräferenz des beabsichtigten Wirts und die Sekundärstruktur der Boten-RNA wird ebenfalls in Betracht gezogen.

Abschnitt 5.1: Organisation der Gensynthese:

Eine etablierte Strategie für die Gensynthese ist, beide Stränge des gesamten Gens in überlappenden Segmenten von 20 bis 50 Nukleotiden (nts) zu synthetisieren (THER88). Wir bevorzugen eine alternative Methode, die geeigneter für die Synthese von vgDNA ist. Unsere Methode unterscheidet sich von früheren Methoden (OLIP86, OLIP87, AUSU87), indem wir: a) zwei synthetische Stränge verwenden und b) die extendierte DNA nicht in der Mitte schneiden. Unsere Ziele sind: a) längere Stücke von dsDNA herzustellen als DNA, die als ssDNA mit kommerziellen DNA-Synthesegeräten synthetisiert werden kann und b) Stränge herzustellen, die komplementär zu einzelsträngiger vgDNA sind. Unter Verwendung zweier synthetischer Stränge beseitigen wir das Erfordernis für eine palindromische Sequenz am 3'-Ende.
DNA-Synthesegeräte können Oligo-nts bis zu 100 nts in einer vernünftigen Ausbeute herstellen, MDNA 100. Die Parameter Nw (die Überlappungslänge, die benötigt wird, um ein effizientes Hybridisieren (annealing) zu erhalten und Ns (die Anzahl der überstehenden Basen, die benötigt werden, damit ein Restriktionsenzym in der Nähe der dsDNA mit glatten Enden schneiden kann) werden durch DNA- und Enzymchemie bestimmt. Nw = 10 und Ns = 5 sind vernünftige Werte.
Wir teilen die zu synthetisierende DNA-Sequenz in zwei ungefähr gleiche Teile auf, wobei jede 5-8 Basen länger als die Hälfte der Gesamtlänge ist, so daß eine Überlappung von 10 bis 16 bp (Nw) zwischen den zwei Teilen entsteht, die keine variierten Basen enthält. Die Überlappung ist vorzugsweise nicht palindromisch und besitzt einen hohen GC-Gehalt. Wir synthetisieren den Überlappungsanteil und die 5'-Extension eines jeden Stranges. Wenn diese Stränge hybridisiert und mit Klenow- Enzym und allen vier NTPs vervollständigt sind, erhalten wir die gewünschte Sequenz als dsDNA mit glatten Enden. Wenn die DNA an andere DNA mit kohäsiven Enden ligiert werden muß, werden 5 bis 10 (Ns) Basen zu diesem Ende zugefügt. Die synthetische dsDNA kann danach mit einem geeigneten Restriktionsenzym effizient geschnitten werden (OLIP87).
Da MDNA nicht streng auf 100 fixiert ist, sind die gegenwärtigen Grenzen von 190 (=2 MDNA-Nw) nts insgesamt und 100 in jedem Fragment nicht streng, sondern können um 5 bis 10 nts ausgedehnt werden. Das Überschreiten der Grenzen von 190 und 100 wird zu niedrigeren Ausbeuten führen, was jedoch in gewissen Fällen akzeptierbar sein kann.

Abschnitt 5.2: DNA-Synthese und -Reinigungsverfahren:

Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf ein bestimmtes Verfahren zur DNA-Synthese oder -Konstruktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA durch Standardmittel mit einem Milligen 7500 DNA-Synthesegerät synthetisiert. Das Milligen 7500 besitzt sieben Chemikalienfläschchen, aus denen Phosphoramidite entnommen werden können. Normalerweise enthalten die ersten vier A, C, T und G. Die weiteren drei Chemikalienfläschchen können ungewöhnliche Basen wie Inosin oder Basenmischungen enthalten und werden "Schmutzfläschchen" genannt. Die Standard-Software erlaubt das programmierte Mischen von zwei, drei oder vier Basen in äquimolaren Mengen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf irgendein bestimmtes Verfahren zum Reinigen von DNA für die genetische Manipulation. Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution mittels eines IBI-Geräts (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) wird bevorzugt verwendet, um große dsDNA-Fragmente zu reinigen. Im Fall von Oligo-nts sind PAGE upd Elektroelution mit einem Epigene-Gerät (Epigene Corp., Baltimore, MD) eine Alternative zur HPLC.

Abschnitt 6.1: Klonieren eines bekannten OSP-ipbd-Gens in OCV:

In einem bevorzugten Verfahren wird das synthetische Gen unter Verwendung von Plasmiden konstruiert, die durch Standardverfahren (MANI82, S.250) oder durch leicht modifizierte Standardverfahren in Bakterienzellen eingebracht werden und diese transformieren. Alternativ werden von natürlicher DNA abstammende DNA- Fragmente an andere von natürlicher DNA abstammende DNA-Fragmente oder an synthetische DNA-Fragmente funktionell geknüpft. In der meisten Fällen der bevorzugten Methode umfaßt die Gensynthese die Konstruktion einer Reihe von Plasmiden, die immer größere Segmente des vollständigen Gens enthalten.

Abschnitt 6.2: Klonierung zufälliger DNA (potentielle osp) in die Präsentationsprobe:

Wenn zufällige DNA und Phänotypische Selektion oder Screening verwendet werden, um eine GP(IPBD) zu erhalten, klonieren wir zufällige DNA in eine der Restriktionsstellen, die in die Präsentationsprobe eingebracht wurde.
Die zufällige DNA kann auf verschiedenste Weise erhalten werden. Das Degenerieren synthetischer DNA ist eine Möglichkeit. Alternativ kann natürliche pseudo-zufällige DNA genommen werden. Wenn beispielsweise eine Sph I-Stelle (GCATG/C) an einem Ende des ipbd-Fragments in die Präsentationsprobe eingebracht worden ist, würden wir Nla III (CATG/) verwenden, um DNA, die viele verschiedene Sequenzen enthält, partiell zu spalten, was viele verschiedene Fragmente mit CATG-3'-Überhängen erzeugt. Vorzugsweise besitzt die Präsentationsprobe verschiedene Restriktionsstellen an beiden Enden des ipbd- Gens, so daß zufällige DNA an beiden Enden kloniert werden kann.
Ein die Präsentationsprobe enthaltendes Plasmid wird mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und die fragmentierte, zufällige DNA wird durch Standardverfahren hybridisiert und ligiert. Die ligierten Plasmide werden verwendet, um Zellen zu transformieren, die kultiviert und auf die Expression des Antibiotikumresistenzgens selektiert werden. Plasmid-tragende GPs werden danach durch das in Abschnitt 15 dargestellte erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung des AfM(IPBD) - als ob dies das Zielmolekül wäre - auf den Präsentation-der-IPBD-Phänotyp selektiert. Abschnitt 15 ist entworfen, um GP(PBD)s, die an ein Zielmolekül binden, von einer großen Population, die nicht bindet, zu isolieren.

Abschnitt 7: Gewinnen der GPs:

Zellen werden mit ligierten OCVs transformiert und auf die Aufnahme des OCV nach einer geeigneten Inkubation mit einem Agens, das für die Selektionsmarker auf dem OCV geeignet ist, selektiert. GPs werden durch für die GP geeignete Verfahrennaheliegenderweise gewöhnlich durch Zentrifugation - behandelt, um GPs zu pelletieren, welche daraufhin in sterilem Medium (Zellen) oder Puffer (Sporen oder Phagen) resuspendiert werden.

Abschnitt 8: Verifizieren der Präsentationsstrategie:

Die geernteten Packungen werden jetzt auf die Präsentation der IPBD auf der Oberfläche getestet; alle Ionen oder Cofaktoren, von denen bekannt ist, daß sie für die Stabilität der IPBD oder des AfM(IPBD) essentiell sind, müssen zu geeigneten Mengen zugegeben werden. Der Test kann durchgeführt werden: a) durch Affinitätsmarkierung, b) enzymatisch, c) spektrophotometrisch, d) durch Affinitätstrennung oder e) durch Affinitätspräzipitation. In diesem Schritt ist das AfM(IPBD) eines, das dahingehend ausgewählt wurde, daß es eine hohe Affinität (vorzugsweise Kd < 10&supmin;¹¹ M) für das IPBD-Molekül und eine niedrige oder keine Affinität für die wtGP aufweist. Wenn beispielsweise BPTI die IPBD ist, könnte Trypsin, Anhydrotrypsin oder Antikörper gegen BPTI als AfM(BPTI) verwendet werden, um auf die Gegenwart von BPTI zu testen. Anhydrotrypsin, ein Trypsin- Derivat, worin das Serin 195 in Dehydroalanin umgewandelt worden ist, besitzt keine proteolytische Aktivität, behält jedoch seine Affinität für BPTI (AKOH72 und HUBE77).
Vorzugsweise wird die Gegenwart der IPBD auf der Oberfläche der GP unter Verwendung eines löslichen, markierten Derivats des AfM(IPBD) mit hoher Affinität für IPBD nachgewiesen. Das markierte Derivat des AfM(IPBD) wird als AfM(IPBD)* bezeichnet.
Wenn zufällige DNA verwendet worden ist, werden die Verfahren des Abschnitts 15 verwendet, um ein klonales Isolat zu erhalten, das den Präsentation-der-IPBD- Phänotyp aufweist. Alternativ können klonale Isolate auf den Präsentation-der-IPBD- Phänotyp durchmustert werden. Die Tests dieses Schrittes werden ein oder mehrere Male auf diese klonalen Isolate angewendet.
Wenn keine Isolate, die an das Affinitätsmolekül binden, erhalten werden, wenden wird die Korrekturmaßnahmen - wie in Abschnitt 9 offenbart - an.
Wenn ein oder mehrere Tests anzeigen, daß die IPBD auf der GP-Oberfläche präsentiert wird, stellen wir sicher, daß die Bindung von Molekülen mit bekannter Affinität für die IPBD durch das chimäre osp-ipbd-Gen begründet ist, und zwar unter Verwendung genetischer und biochemischer Standardverfahren wie:
1) Überführen des osp-ipbd-Gens in die parentale-GP, um sicherzustellen, daß osp-ipbd die Bindung veranlaßt,
2) Deletieren des osp-ipbd-Gens von der isolierten GP, um sicherzustellen, daß der Verlust von osp-ipbd den Verlust der Bindung verursacht,
3) Zeigen, daß die Bindung der GPs an das AfM(IPBD) mit [XINDUCE] korreliert (in den Fällen, in denen die Expression von osp-ipbd durch [XINDUCE] kontrolliert wird) und
4) Zeigen, daß die Bindung der GPs an das AfM(IPBD) spezifisch für die immobilisierte AfM(IPBD) und nicht für die Trägermatrix ist.
Die Gegenwart der IPBD auf der GP-Oberfläche wird durch die strenge Korrelation zwischen [XINDUCE] und den Reaktionen, die für die Menge der IPBD (wie: a) Bindung der GPs durch lösliches AfM(IPBD)*, b) durch IPBD verursachte Absorption und c) biochemische Reaktionen der IPBD) linear sind, angezeigt. Der Nachweis (4), daß die Bindung an das AfM(IPBD) stattfindet und die genetischen Tests (1) und (2) sind wichtig; der Test mit XINDUCE (3) ist weniger wichtig.
Wir sequenzieren das relevante ipbd-Genfragment aus jedem von mehreren klonalen Isolaten, um das Konstrukt zu bestimmen.
Wir stellen die maximale Salzkonzentration und den pH-Bereich fest, bei denen die GP(IPBD) das gewählte AfM(IPBD) bindet.
Wenn die IPBD auf der Oberfläche der GP präsentiert wird und wenn diese Präsentation klar durch das eingebrachte osp-ipbd-Gen veranlaßt wird, gehen wir zu Teil II über; ansonsten müssen wir das Ergebnis analysieren und geeignete Korrekturmaßnahmen übernehmen.

Abschnitt 9: Perfektionieren des Präsentationssystems:

Immer wenn wir versucht haben, ein ipbd-Fragment an ein natürliches osp-Fragment zu fusionieren, waren unsere Optionen:
1) Wähle eine unterschiedliche Fusion an dasselbe osp durch
a) Verwenden entgegengesetzter Enden des osp,
b) Beibehalten mehr oder weniger Reste aus dem osp in der Fusion; beispielsweise in Inkrementen von 3 oder 4 Resten,
c) Austesten einer bekannten oder vorausgesagten Domänengrenze,
d) Austesten einer vorausgesagten Schleifen- oder Biegungsposition,
2) wähle ein unterschiedliches osp oder
3) gehe auf die Methode mit zufälliger DNA über.
Immer wenn wir das Verfahren mit zufälliger DNA ohne Erfolg versucht haben, waren unsere Optionen:
1) Wähle eine andere Beziehung zwischen dem ipbd-Fragment und der zufälligen DNA (ipbd zuerst, zufällige DNA als zweites oder umgekehrt),
2) teste einen unterschiedlichen Grad der partiellen Spaltung, ein unterschiedliches Enzym für die partielle Spaltung, einen unterschiedlichen Schergrad oder eine unterschiedliche Quelle natürlicher DNA oder
3) gehe auf das natürliche OSP-Verfahren über.
Wenn alle vernünftigen OSPs der gegenwärtigen GP ausprobiert worden sind und das Verfahren mit zufälliger DNA ausprobiert worden ist, und beide erfolgreich waren, wählen wir eine neue GP.

Teil II

Abschnitt 10.0: Affinitätstrennungsmittel:

Im Teil II optimieren wir ein Affinitätstrennungssystem, welches im Teil III verwendet werden wird, um eine Population von GP(vgPBD)s bezüglich solcher GP(PBD)s anzureichern, die PBDs mit einer erhöhten Affinität für das Zielmolekül präsentieren.
Affinitätschromatographie ist das bevorzugte Mittel, jedoch können FACS, Elektrophorese oder andere Mittel ebenso verwendet werden.

Abschnitt 10.1: Optimierung der Affinitätschromatographietrennung:

Änderungen der Elutionsmittelkonzentration veranlassen GPs, von der Säule zu eluieren. Das Elutionsvolumen wird jedoch auf einfachere Weise gemessen und spezifiziert. Es ist so zu verstehen, daß die Elutionsmittelkonzentration das Mittel ist, das die GP-Freisetzung verursacht, und daß eine Elutionsmittelkonzentration ausgehend vom Elutionsvolumen und dem spezifizierten Gradienten berechnet werden kann.
Unter Verwendung eines spezifizierten Elutionsprotokolls vergleichen wir die Elutionsvolumina der GP(IPBD)s mit den Elutionsvolumina der wtGP an Affinitätssäulen, die das AfM(IPBD) tragen. Die Vergleiche werden durchgeführt mit verschiedenen: a) Mengen an IPBD/GP, b) Dichten von AfM(IPBD)/(Matrixvolumen) (DoAMoM), c) anfängliche Ionenstärken, d) Elutionsraten, e) Mengen an GP/(Trägervolumen), f) pHs und g) Temperaturen, da diese diejenigen Parameter sind, die am wahrscheinlichsten die Empfindlichkeit und Effizienz der Trennung beeinflussen. Danach wählen wir diejenigen Bedingungen aus, die die beste Trennung ergeben.
Wir optimieren nicht den pH oder die Temperatur, sondern wir zeichnen die optimalen Werte für die anderen Parameter für einen oder mehrere pH- und Temperaturwerte auf. Die Bedingungen für die beabsichtigte Verwendung, die durch den Anwender spezifiziert werden (Abschnitt 11), können eine Spezifizierung des pH oder der Temperatur erfordern. Wenn der pH spezifiziert worden ist, wird der pH beim Eluieren der Säule nicht mehr variiert (Abschnitt 15.3). Ein Herabsetzen des pH kann dazu führen, daß gebundene GPs von der Matrix freigesetzt werden. Wenn die beabsichtigte Verwendung eine Temperatur spezifiziert, werden wir die Affinitätssäule während der Elution auf der spezifizierten Temperatur halten; wir können jedoch die Temperatur während der Wiederaufbereitung variieren.
Das AfM(IPBD) ist vorzugsweise eines, von dem bekannt ist, daß es eine mäßige Affinität für die IPBD (Kd im Bereich 10&supmin;&sup6; M bis 10&supmin;&sup8; M) besitzt. Wenn Populationen von GP(vgPBD)s fraktioniert werden, wird es ungefähr drei Subpopulationen geben: a) solche ohne Bindungsaktivität, b) solche, die eine gewisse Bindungsaktivität aufweisen, die jedoch mit hoher Salzkonzentration oder niedrigem pH ausgewaschen werden können und c) solche, die sehr fest binden und in situ wieder gewonnen werden müssen. Wir optimieren die Parameter, um eher (a) von (b) als (b) von (c) zu trennen. Nehmen wir an, daß PBDw eine PBD mit einer schwachen Bindungsaktivität für das Zielmolekül und PBDs eine PBD mit einer starken Bindungsaktivität ist. Eine höhere DoAMoM könnte beispielsweise die Retention von GP(PBDw) favorisieren, es jedoch sehr schwer machen, lebensfähige GP(PBDs) zu eluieren. Wir werden die Affinitätstrennung opumieren, um eher GP(PBDw) zurückzuhalten als die Freisetzung von GP(PBDs) zu erlauben, da eine fest gebundene GP(PBDs) durch in situ-Wachstum gewonnen werden kann. Wenn wir finden, daß DoAMoM das Elutionsvolumen stark beeinflußt, können wir in Teil III die Menge des Zielmoleküls auf der Affinitätssäule vermindern, wenn eine SBD mit mäßig starker Affinität (Kd in der Größenordnung von 10&supmin;&sup7; M) für das Zielmolekül gefunden worden ist.
Bei diesem Schritt messen wir die Elutionsvolumina der genetisch reinen GPs, die von der Affinitätsmatrix als scharfe Banden eluieren, welche durch UV-Absorption detektiert werden können. Proben der eluierten Fraktionen werden auf einem geeigneten Medium (Zellen oder Sporen) oder auf empfindlichen Zellen (Phagen) ausplattiert, und die Kolonien oder Plaques werden gezählt.
Mehrere Werte für IPBD/GP, DoAMoM, Elutionsraten, anfängliche Ionenstärken und Auftragvolumina sollten untersucht werden. Wir nehmen vorweg, daß optimale Werte von IPBD/GP und DoAMoM korrelieren werden, und daß diese daher zusammen optimiert werden sollten. Die Effekte der Anfangsionenstärke, Elutionsrate und Menge an GP/(Matrixvolumen) sind wahrscheinlich nicht streng korreliert; sie können also unabhängig voneinander optimiert werden.
Für jede zu testende Parameterreihe wird die Säule auf eine spezifische Weise eluiert. Beispielsweise können wir ein Protokoll - Elutionsprotokoll 1 - genannt verwenden: ein KCl-Gradient läuft von 10 mM bis zum Maximum, das hinsichtlich der GP(IPBD)-Lebensfähigkeit erlaubt ist, in 100 Fraktionen von 0,05 Vv (Leervolumen), gefolgt von 20 Fraktionen von 0,05 Vv bei maximal erlaubtem KCl; der pH des Puffers wird auf den spezifizierten Wert mit einem geeigneten Puffer wie Tris aufrechterhalten. Es ist wichtig, daß die Bedingungen dieser Optimierung ähnlich den Bedingungen sind, die in Teil III für die Selektion auf die Bindung an das Zielmolekül (Abschnitt 15.3) und die Gewinnung der GPs von dem chromatographischen System (Abschnitt 15.4) sind.
Wenn das osp-ipbd-Gen durch [XINDUCE] reguliert wird, kann IPBD/GP durch Variieren von [XINDUCE] kontrolliert werden. Geeignete Werte für [XINDUCE] hängen von der Identität des [XINDUCE] und vom Promotor ab; wenn beispielsweise XINDUCE Isopropylthiogalactosid (IPTG) und der Promotor lacUV5 ist, sind [IPTG] = 0, 0,1 µM, 1,0 µM, 10,0 µM, 100,0 µM und 1,0 mM geeignete Mengen zum Austesten. Der Variationsbereich für [XINDUCE] wird ausgedehnt, bis ein Optimum gefunden oder eine akzeptierbare Expressionsrate erhalten wird.
DoAMoM wird ausgehend vom Maximum, welches das Matrixmaterial binden kann, zu 1 % oder 0,1 % dieser Menge in geeigneten Stufen variiert. Wir nehmen vorweg, daß die Trennungseffizienz eine gleichmäßige Funktion von DoAMoM sein wird, so daß es geeignet ist, einen weiten Bereich der Werte für DoAMoM mit einem groben Gitter abzudecken und danach die Nachbarschaft des angenäherten Optimums mit einem feineren Gitter zu untersuchen.
Mehrere Werte der Anfangsionenstärke werden ausgetestet, wie 1,0 mM, 5,0 mM, 10,0 mM und 20,0 mM.
Die Elutionsrate wird durch aufeinanderfolgende Faktoren von 1/2 ausgehend von der maximal erreichbaren Rate bis auf 1/16 dieses Wertes variiert. Die schnellste Elutionsrate, die eine gute Trennung ergibt, ist optimal.
Das Ziel der Optimierung ist es, einen scharfen Übergang zwischen gebundenen und ungebundenen GPs zu erhalten, geleitet durch Steigern der Salzkonzentration oder Vermindern des pH oder einer Kombination von beidem. Diese Optimierung muß nur ausgeführt werden: a) für jede zu verwendende Temperatur, b) für jeden zu verwendenden pH und c) wenn eine neue GP(IPBD) erzeugt wird.
Regulierbare Promotoren sind für alle genetischen Packungen außer möglicherweise für Bakteriensporen verfügbar. Ein Promotor, der in Bakteriensporen funktioniert, könnte durch Konstruieren eines Hybrids aus einem Sporulationspromotor und einem regulierbaren bakteriellen Promotor (z. B. lac) oder durch Sättigungsmutagenese eines Sporulationspromotors, gefolgt von einem Screening auf regulierbare Promotoraktivität hergestellt werden (vgl. OLIP86, OLIP87). Wenn der Promotor des osp-ipbd-Gens nicht regulierbar ist, optimieren wir DoAMoM, die Elutionsrate und die Menge an GP/Matrixvolumen. Wenn die optimierte Affinitätstrennung nicht akzeptierbar ist, müssen wir Mittel entwickeln, um die Menge an IPBD pro GP zu verändern.

Abschnitt 10.2: Messen der Empfindlichkeit der Affinitätstrennung:

Wir bestimmen die Empfindlichkeit der Affinitätstrennung (Csensi) durch Messen der Minimalmenge an GP(IPBD), die in der Gegenwart eines großen Überschusses an wtGP nachgewiesen werden kann. Der Anwender wählt eine Anzahl von Trennungszyklen - Nchrom bezeichnet - aus, die durchgeführt werden, bevor eine Anreicherung abgeschlossen ist; vorzugsweise liegt Nchrom im Bereich von 6 bis 10, und Nchrom muß größer als 4 sein. Die Anreicherung kann nach Isolierung einer gewünschten GP(SBD) beendet werden, bevor Nchrom erreicht ist.
Die Empfindlichkeitsmessung wird deutlich beschleunigt, wenn GP(IPBD) und wtGP unterschiedliche Selektionsmarker tragen.
Mischungen von GP(IPBD) und wtGP werden in Verhältnissen von 1:Vlim, wobei Vlim durch einen geeigneten Faktor (z. B. 1/10) über einen geeigneten Bereich variiert, typischerweise 10¹¹ bis 10&sup4; hergestellt. Große Werte für Vlim werden zuerst ausgetestet; sobald ein positives Ergebnis für einen Wert von Vlim erhalten wird, müssen keine kleineren Werte von Vlim ausgetestet werden. Jede Mischung wird auf eine Säule aufgetragen, die bei der optimalen DoAMoM ein AfM(IPBD) mit einer hohen Affinität für die IPBD trägt, und die Säule wird durch Anwendung des spezifizierten Elutionsprotokoll eluiert. Die letzte Fraktion, die lebensfähige GPs enthält, und ein Inokulum des Säulenmatrixmaterials werden kultiviert. Wenn GP(IPBD) und wtGP unterschiedliche Selektionsmarker besitzen, identifiziert der Transfer auf Selektionsplatten jede Kolonie. Ansonsten wird eine Anzahl (z. B. 32) der klonalen GP-Isolate auf die Gegenwart der IPBD durch die in Abschnitt 8 diskutierten Verfahren getestet.
Wenn die IPBD nicht auf der Oberfläche irgendeiner der isolierten GPs detektiert wird, werden GPs vereinigt aus: a) den letzten wenigen (z.B. 3 bis 5) Fraktionen, die lebensfähige GPs enthalten und b) aus einem Inokulum, das von der Säulenmatrix genommen wird. Die vereinigten GPs werden kultiviert, über dieselbe Säule geschickt und auf die beschriebene Weise bezüglich der GP(IPBD) angereichert. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis Nchrom Durchläufe durchgeführt worden sind oder bis die IPBD auf den GPs detektiert worden ist. Wenn GP(IPBD) nach Nchrom Durchläufen nicht detektiert wird, wird Vlim vermindert und das Verfahren wiederholt.
Csensi ist gleichzusetzen mit dem höchsten Wert von Vlim, für den der Anwender innerhalb von Nchrom Durchläufen die GP(IPBD) wiedergewinnen kann. Die Anzahl der chromatographischen Zyklen (Kcyc), die benötigt werden, um die GP(IPBD) zu isolieren, ergibt eine grobe Schätzung für Ceff; Ceff ist ungefähr die Kcyc-ste Wurzel von Vlim:
Ceff = (ca.) exp(loge(Vlim)/Kcyc)
Wenn beispielsweise Vlim 4,0 x 10&sup8; ist und 3 Trennungszyklen benötigt werden, um die GP(IPBD) zu isolieren, dann Ceff = (ca.) 736.

Abschnitt 10.3: Messen der Trennungseffizienz:

Um Ceff genauer zu bestimmen, bestimmen wir das Verhältnis von GP(IPBD)/wtGP, das auf eine AfM(IPBD)-Säule geladen wird und ungefähr gleiche Mengen an GP(IPBD) und wtGP nach der Elution ergibt.

Abschnitt 10.4: Weitere Tennungsmittel

Weitere Trennungsmittel werden auf eine Weise optimiert, die derjenigen entspricht, die für die Affinitätschromatographie verwendet wurde.
FACS (z.B. FACStar von Beckton-Dickinson, Mountain View, CA) ist am geeignetsten für Bakterienzellen und Sporen, da die Empfindlichkeit der Maschine ungefähr 1000 Moleküle des Fluoreszenzmarkers an jede GP gebunden voraussetzt, um eine Trennung zu gewährleisten. Um FACS-Trennung von GPs zu optimieren, verwenden wir ein Derivat des AfM(IPBD), das mit einem Fluoreszenzmolekül - AfM(IPBD)* bezeichnet - markiert wird. Die Variablen, die optimiert werden müssen, umfassen: a) Menge an IPBD/GP, b) Konzentration von AfM(IPBD)*, c) Ionenstärke, d) Konzentration der GPs und e) Parameter, die den Betrieb der FACS-Maschine betreffen. Da AfM(IPBD)* und GPs in Lösung wechselwirken, wird die Bindungsaktivität linear sein für sowohl [AfM(IPBD)*] als auch (präsentierte IPBD]. Vorzugsweise werden diese beiden Parameter zusammen variiert. Die anderen Parameter können unabhängig voneinander optimiert werden.
Elektrophorese ist am besten geeignet für Bakteriophagen wegen deren geringen Größe (SERW87). Elektrophorese ist ein bevorzugtes Trennungsmittel, wenn das Zielmolekül so klein ist, daß das chemische Fixieren desselben an eine Säule oder an einen Fluoreszenzmarker das gesamte Zielmolekül wesentlich verändern würde. Beispiesweise enthalten Chloracetationen nur 7 Atome und würden durch jede Bindung wesentlich verändert werden. GPs, die Chloracetat binden, würden negativer geladen sein als GPs, die das Ion nicht binden, und auf diese Weise könnten diese Klassen von GPs getrennt werden.
Die Parameter für die Optimierung der Elektrophorese umfassen: a) IPBD/GP, b) Konzentration des Gelmaterials, z. B. Agarose, C) Konzentration des AfM(IPBD), d) Ionenstärke, e) Größe, Form und Kühlungskapazität des Elektrophoreseapparates, f) Spannungen und Ströme und f) Konzentration der GPs. Vorzugsweise werden IPBD/GP und (AfM(IPBD)] zur gleichen Zeit variiert, und andere Parameter werden unabhängig voneinander optimiert.

Teil III

Abschnitt 11.0: Wahl des Zielmaterials:

Jedes Material kann als Zielmaterial ausgewählt werden, vorbehaltlich folgender Beschränkungen:
Wenn Affinitätschromatographie verwendet werden muß, dann:
1) müssen die Moleküle des Zielmaterials von einer ausreichenden Größe und chemischen Reaktivität sein, damit sie auf ein Trägermaterial aufgetragen werden können, das für die Affinitätstrennung geeignet ist,
2) darf das Zielmaterial nach dem Auftragen auf eine Matrix nicht mit Wasser reagieren,
3) darf das Zielmaterial nach dem Auftragen auf eine Matrix keine Proteine in einer nicht-spezifischen Weise. binden oder diese abbauen und
4) müssen die Moleküle des Zielmaterials ausreichend groß sein, damit das Anheften des Materials an eine Matrix genügend unveränderte Oberflächenbereiche (gewöhnlich mindestens 500 Å², ausschießlich des Atoms, das an den Linker geknüpft ist) für die Proteinbindung bereitstellt.
Wenn FACS als Affinitätstrennungsmittel zu verwenden ist, dann:
1) müssen die Moleküle des Zielmaterials von einer ausreichenden Größe und chemischen Reaktivität sein, damit sie an einen geeignten Fluoreszenzfarbstoff konjugiert werden können oder die Zielmoleküle müssen selbst fluoreszierend sein,
2) darf das Zielmolekül nach der notwendigen Fluoreszenzmarkierung nicht mit Wasser reagieren,
3) darf das Zielmaterial nach der notwendigen Fluoreszenzmarkierung keine Proteine auf eine nicht-spezifische Weise binden oder abbauen und
4) müssen die Moleküle des Zielmaterials ausreichend groß sein, damit das Anheften des Materials an einen geeigneten Farbstoff genügend unveränderte Oberflächenbereiche (gewöhnlich mindestens 500 Å², ausschließlich des Atoms, das an den Linker geknüpft ist) für die Proteinbindung bereitstellt.
Wenn Affinitätselektrophorese verwendet werden muß, dann:
1) muß das Zielmolekül entweder geladen sein oder von solcher Natur, daß seine Bindung an ein Protein die Ladung des Proteins verändert,
2) darf das Zielmaterial nicht mit Wasser reagieren,
3) darf das Zielmaterial keine Proteine auf eine nicht-spezifische Weise binden oder abbauen und
4) muß das Zielmolekül kompatibel mit einem geeigneten Gelmaterial sein.
Mögliche Zielmaterialien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: a) lösliche Proteine, wie Pferdeherz-Myoglobin, Elastase humaner Neutrophiler, aktivierter (Blutgerinnungs-) Faktor X, alpha-Fetoprotein, alpha-Interferon, Melittin, Adenylatcyclase-Toxin von Bordetella pertussis, jede retrovirale pol-Protease oder jede retrovirale gag-Protease), b) Lipoproteine (wie humanes Lipoprotein niedriger Dichte), c) Glycoproteine (wie monoklonale Antikörper), d) Lipopolysaccharide (wie O-Antigen von Salmonella enteritidis), e) Nukleinsäuren (wie tRNAs, ribosomale RNAs, Boten-RNAs, dsDNA oder ssDNA, möglicherweise. mit Sequenzspezifität); f): lösliche organische Moleküle (wie Cholesterin, Aspartam, Bilirubin, Morphin, Codein, Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), Benz(a)pyren, Prostaglandin PGE2, Protoporphyrin IX oder Actomycin D), g) metallorganische Komplexe (wie Eisen-Häm oder Kobalt-Häm), h) organische Polymere (wie Cellulose oder Chitin), i) unlösliche Mineralien (wie Asbest, Zeolite oder Hydroxylapatit), j) virale oder Phagen- Hüllproteine (wie Influenza-Hämagglutinin oder das Kapsid vom Phagen Lambda) und k) bakterielle Membran- oder äußere Membranproteine (wie LamB von E. coli oder Flagella-Proteine).
Die Bereitstellung mehrerer Milligramm des reinen Zielmaterials ist erwünscht. Verunreinigtes Zielmaterial kann verwendet werden, jedoch erhält man u.U. ein Protein, das an eine Verunreinigung anstatt an das Zielmolekül bindet.
Die folgende Information über das Zielmaterial ist sehr wünschenswert:
1) Stabilität als eine Funktion der Temperatur, des pH und der Ionenstärke,
2) Stabilität im Hinblick auf Chaotrope, wie Harnstoff oder Guanidinium-Cl,
3) pl,
4) Molekulargewicht,
5) Bedarf an prosthetischen Gruppen oder Ionen, wie Häm oder Ca&spplus;² und
6) proteolytische Aktivität, falls vorhanden.
Zusätzlich zu dieser am meisten gewünschten Information ist es nützlich: 1) die Sequenz des Zielmoleküls, wenn das Zielmolekül ein Makromolekül ist, 2) die 3D- Struktur des Zielmoleküls, 3) die enzymatische Aktivität, wenn vorhanden, und 4) die Toxizität, wenn vorhanden, zu kennen.
Der Anwender der vorliegenden Erfindung spezifiziert gewisse Parameter der beabsichtigten Verwendung des Bindeproteins:
1) den akzeptierbaren Temperaturbereich,
2) den akzeptierbaren pH-Bereich,
3) die akzeptierbare Konzentration an Ionen und neutralen löslichen Feststoffen,
4) die maximal akzeptierbare Dissoziationskonstante für das Zielmolekül und die SBD:
KT = [Target][SBD]/[Target: SBD]
In einigen Fällen benötigt der Anwender u.U. eine Unterscheidung zwischen T, dem Zielmolekül, und N, einigen Nicht-Zielmolekülen. Wenn man annimmt, daß
KT = [T][SBD]/[T:SBD] und
KN = [N][SBD]/[N:SBD],
dann ist KT/KN = ([T][N:SBD])/([N][T:SBD]).
Der Anwender spezifiziert danach einen maximal akzeptierbaren Wert für das Verhältnis KT/KN.
Wenn das Zielmaterial eine gewöhnliche Protease ist, muß man die folgenden Punkte in Betracht ziehen:
1) Eine hochspezifische Protease kann wie jedes andere Zielmolekül behandelt werden,
2) eine gewöhnliche Protease, wie Subtilisin, kann die OSPs auf der GP einschließlich OSP-PBDs abbauen; es gibt mehrere alternative Wege für das Vorgehen mit gewöhlichen Proteasen, wie beispielsweise: a) Ein chemischer Inhibitor kann verwendet werden, um die Proteolyse zu verhindern (z.B. Phenylmethylfluorsulfonat (PMFS), welches Serinproteasen inhibiert), b) eine oder mehrere Reste des aktiven Zentrums können mutiert werden, um ein inaktives Protein zu erzeugen (z. B. eine Serinprotease, in welcher das aktive Serin zu Alanin mutiert ist) oder c) eine oder mehrere Aminosäuren im aktiven Zentrum des Proteins können chemisch modifiziert werden, um die katalytische Aktivität zu zerstören (z. B. eine Serinprotease, in welcher das aktive Serin umgewandelt ist zu Anhydroserin),
3) SBDs, die auf eine Bindung an eine Protease selektiert wurden, müssen keine Inhibitoren sein; SBDs, die erfolgreich das Protease-Zielmolekül hemmen, sind eine ziemlich kleine Untergruppe der SBDs, die an das Protease-Zielmolekül binden,
4) je mehr wir die Zielprotease modifizieren, desto weniger wahrscheinlich erhalten wir eine SBD, die die Zielprotease inhibiert, und
5) wenn der Anwender voraussetzt, daß die SBD die Zielprotease inhibiert, darf das aktive Zentrum der Zielprotease nicht mehr als notwendig modifiziert werden; die Inaktivierung durch Mutation oder eine chemische Modifikation sind bevorzugte Verfahren für die Inaktivierung, und ein Proteinproteaseinhibitor wird zu einem primären Kandidaten für die IPBD. Beispielsweise könnte BPTI durch die erfindungsgemäßen Verfahren so mutiert werden, daß er an andere Proteasen als Trypsin bindet (TANK77 und TSCH87).

Abschnitt 12.0: Wahl der GP(IPBD):

Der Anwender muß eine GP(IPBD) auswählen, die gemäß den Kriterien des Abschnitts 2 geeignet für das gewählte Zielmolekül ist. Es wird vorweggenommen, daß eine kleine Sammlung von GP(IPBD)s so assembliert werden kann, daß mindestens ein Mitglied der Sammlung im Hinblick auf irgendein ausgewähltes Zielmolekül ein geeigneter Startpunkt für die Konstruktion eines Proteins, welches an das ausgewählte Zielmolekül bindet, unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren sein wird. Der Anwender sollte die Affinitätstrennung durch die in Teil II beschriebenen Verfahren für Bedingungen optimieren, die geeignet für die beabsichtigte Verwendung sind.

Abschnitt 13.0: Identifizierung einer Familie von zu erzeu PBDs, die mit der PPBD verwandt sind

Abschnitt 13.1: Auswählen von zu variierenden Resten auf einer IPBD (oder anderen PPBD):

Wir wählen die zu variierenden Reste in der IPBD durch Betrachtung mehrerer Faktoren aus, wie beispielsweise: a) die 3D-Struktur der IPBD, b) Sequenzen, die zu der IPBD homolog sind und c) Modellieren der IPBD und Mutanten der IPBD. Da die Anzahl der Reste, die die Bindungsaktivität stark beeinflussen könnten, immer größer ist als die Anzahl, die gleichzeitig variiert werden kann, muß der Anwender eine Untergruppe solcher Reste auswählen, die zur gleichen Zeit variiert werden sollen. Der Anwender muß auch versuchsweise auszuprobierende Variierungsgrade auswählen und die Häufigkeit verschiedener Sequenzen berechnen. Die Liste der variierten Reste und der Grad der Variierung an jedem variierten Rest werden angepaßt bis die zusammengesetzte Variierung gleich groß ist wie Csensi und Mntv.
Ein Schlüsselkonzept ist, daß nur strukturierte Proteine eine spezifische Bindung eingehen, d.h. an eine bestimmte chemische Einheit unter Ausschluß der meisten anderen binden können. Daher werden die zu variierenden Reste im Hinblick auf das Beibehalten der zugrundeliegenden IPBD-Struktur ausgewählt. Substitutionen, die die Faltung einer IPBD verhindern, werden GPs, die diese Gene tragen, veranlassen, wahllos zu binden, so daß sie auf einfache Weise von der Population entfernt werden können.
Das Verbergen hydrophober. Oberflächen, so daß die Hauptmenge des Wassers ausgeschlossen ist, beeinflußt eine der stärksten Kräfte, die die Bindung von Proteinen an andere Moleküle lenken. Die Hauptmenge des Wassers kann aus dem Bereich zwischen zwei Molekülen nur dann ausgeschlossen werden, wenn die Oberflächen komplementär sind. Wir müssen so viele Oberflächen wie möglich austesten, um eine zu finden, die komplementär zum Zielmolekül ist. Die Selektiondurch-Bindung isoliert solche Proteine, die schon komplementärer zu einigen Oberflächen auf dem Zielmolekül sind. Diese effektive Diversität einer variierten Population wird besser durch die Anzahl der unterschiedlichen Oberflächen als durch die Anzahl der Proteinsequenzen gemessen. Folglich sollten wir eher die Anzahl der erzeugten Oberflächen in unserer Population maximieren als die Anzahl der Proteinsequenzen.
Im hypothetischen Beispiel 1 betrachten wir eine hypothetische PBD, die - wie in Figur 3 gezeigt -, an ein hypothetisches Zielmolekül bindet. Die Figur 3 ist ein 2D- Schema von 3D-Objekten; hypothetisch angenommen befinden sich die Reste 1, 2, 4, 6, 7, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 27, 29, 31, 33, 34, 36, 37, 38 und 39 der IPBD auf der 3D-Oberfläche der IPBD, obwohl diese als innerhalb des Kreises gelegen dargestellt sind. Proteine besitzen keine unterscheidbaren, zählbaren Oberflächen. Daher definieren wir eine "Interaktionsgruppe" als eine Gruppe von Resten, wobei alle Mitglieder der Gruppe gleichzeitig ein Molekül des Zielmaterials berühren können, ohne daß irgendein Atom des Zielmoleküls näher als der van der Waals-Abstand an irgendein Hauptkettenatom der IPBD herankommt. Das dahingehende Konzept, daß ein Rest ein Molekül des Zielmaterials "berührt", wird nachstehend diskutiert. Eine hypothetische Interaktionsgruppe, Gruppe A, in Figur 3 umfaßt die Reste 6, 7, 20, 21, 22, 33 und 34, die als Quadrate dargestellt sind. Eine weitere hypothetische lnteraktionsgruppe, Gruppe B, umfaßt die Reste 1, 2, 4, 6, 31, 37 und 39, die durch Kreise dargestellt sind.
Wenn wir einen Rest, beispielsweise Nr. 21, durch alle 20 Aminosäuren variieren, erhalten wir 20 Proteinsequenzen und 20 verschiedene Oberflächen für die lnteraktionsgruppe A. Man beachte, daß der Rest 6 in beiden Interaktionsgruppen vorkommt, und daß die Variation des Restes 6 durch mit alle 20 Aminosäuren 20 Versionen der Interaktionsgruppe A und 20 Versionen der Interaktionsgruppe B ergibt.
Betrachtet man nun die Variation von 2 Resten, jeweils durch alle 20 Aminosäuren, erzeugt man 400 Proteinsequenzen. Wenn die beiden variierten Reste beispielsweise die Nr. 1 und die Nr. 21 sind, würde es nur 40 unterschiedliche Oberflächen ergeben, da die Interaktionsgruppe A nicht vom Rest 1 abhängt und die lnteraktionsgruppe B nicht vom Rest 21 abhängt. Wenn die beiden variierten Reste jedoch die Nr.7 und die Nr. 21 sind, würden 400 Oberflächen erzeugt werden.
Wenn N räumlich getrennte Reste zur gleichen Zeit variiert werden, werden 20 x N Oberflächen erzeugt. Die Variation von N Resten in derselben Interaktionsgruppe erzeugt 20N Oberflächen. Wenn beispielsweise N = 7, ersugt die Variation der getrennten Reste 140 Oberflächen, während die Variation von wechselwirkenden Resten 20&sup7; = 1,28 x 10&sup9; Oberflächen erzeugt. Folglich sollten, wenn N Reste variiert werden, alle Reste in derselben Interaktionsgruppe vorliegen, damit die Anzahl der erzeugten Oberflächen maximiert wird.
Die Größe der Oberflächenbereiche, die in starke Protein-Protein-Wechselwirkungen verwickelt sind, liegt im Bereich von 1000 Å² bis 2000 Å² (SCHU79, S. 103 ff). Individuelle Aminosäuren besitzen Gesamtoberflächenbereiche, die hauptsächlich vom Typ der Aminosäure und weniger von der Konformation abhängen. Diese Flächen liegen im Bereich von ungefähr 180 Å² für Glycin bis ungefähr 360 Å² für Tryptophan. Ausgehend von Aminosäure-Lösungsmittel-Expositionen publizierter Proteinstruktu ren errechnen wir, daß 1000 Å² auf einer Proteinoberfläche zwischen 4 und 30 Aminosäurereste umfaßt. Variierte Aminosäuresequenzen, wie sie in tatsächlichen Proteinen gefunden werden, schließen zwischen 10 und 25 Reste bei der Bildung von 1000 Å² Proteinoberfläche ein. Schulz und Schirmer schätzen, daß 100 Å² Proteinoberfläche bis zu 1000 unterschiedliche spezifische Muster einnehmen können (SCHU79, S. 105). Die Anzahl an Oberflächenmustern steigt exponentiell mit der Fläche, die unabhängig variiert werden kann. Eine der BPTI- Strukturen, die in der Brookhaven-Proteindatenbank aufgezeichnet sind (6PTI), besitzt beispielsweise einen exponierten Gesamtoberflächenbereich von 3997 Å² (unter Anwendung des Verfahrens von Lee und Richards (LEEB71) und einem Lösungsmittelradius von 1,4 Å und Atomradien wie in Tabelle 7 gezeigt). Wenn wir diese Oberfläche frei variieren könnten und wenn 100 Å² 1000 Muster erzeugen können, könnten wir durch Variieren der Oberfläche von BPTI 10¹²&sup0; unterschiedliche Muster konstruieren! Diese Berechnung ist nur dazu da, die ungeheure Anzahl an möglichen Oberflächenmustern basierend auf einem allgemeinen Proteingrundgerüst anzudeuten.
Ein Proteinnetzwerk kann jedoch nicht alle möglichen Muster auf jeder einzelnen bestimmten Fläche von 100 Å² Oberfläche nur durch Ersatz der Seitengruppen der Oberflächenreste präsentieren. Das Proteingrundgerüst hält die variierten Seitengruppen in ungefähr konstanten Stellungen, so daß die Variationen nicht unabhängig sind. Wir können trotzdem eine riesige Sammlung unterschiedlicher Proteinoberflächen durch Variieren solcher Proteinreste, die auf die Außenseite des Proteins gerichtet sind, erzeugen.
Die Überprüfung eines Modells, in dem der BPTI in Kontakt mit Myoglobin steht, zeigt, daß alle Reste 3, 7, 8, 10, 13, 39, 41 und 42 gleichzeitig ein Molekül der Größe und Form von Myoglobin kontaktieren können. Der Rest 49 kann nicht ein einziges Myoglobinmolekül gleichzeitig mit irgendeinem der ersten Gruppe berühren, obwohl sich alle auf der Oberfläche des BPTI befinden. Es ist jedoch nicht die Absicht der vorliegenden Erfindung, Modelle zu verwenden, um zu bestimmen, welcher Teil des Zielmoleküls tatsächlich die Bindungsstelle einer PBD ist.
Für die Kassettenmutagenese liegen die zu variierenden Proteinreste vorzugsweise in einer Folge eng genug beieinander, so daß die variierte DNA (vgDNA), welche für alle von diesen kodiert, in einem Stück hergestellt werden kann. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf eine bestimmte Länge der vgDNA, die synthetisiert werden kann, beschränkt. Mit der gegenwärtigen Technologie kann ein Stück von 60 Aminosäuren (180 DNA-Basen) überspannt werden.
Man kann andere Mutationsverfahren verwenden, wie Einzelstrang-Oligonukleotidgerichtete Mutagenese (BOTS85) unter Verwendung von zwei oder mehreren Mutationsprimern, um weit voneinander getrennte Reste zu mutieren.
Alternativ können zwei Kassetten mutiert werden, um Reste zu variieren, die durch mehr als 60 Reste getrennt sind. Eine erste Kassette wird mutiert, um eine Population mit beispielsweise bis zu 30000 Mitgliedern zu produzieren. Unter Verwendung eines vanierten OCV mutieren wir eine zweite Kassette, um eine zweite variierte Population mit der gewünschten Diversität zu produzieren.
Der zusammengesetzte Variationsg rad darf nicht die vorherrschenden Bedingungen beeinträchtigen, nämlich daß a) sehr große Anzahlen an unabhängig transformierten Zellen hergestellt oder b) kleine Bestandteile in einer hochvariierten Population detektiert werden können. Die Grenzen für den Variierungsgrad werden im Abschnitt 13.2 diskutiert.
Wir setzen die Daten über die IPBD und das Zielmolekül zusammen, die nützlich sind für die Entscheidung, welche Reste variiert werden sollen: 1) Die 3D-Struktur oder zumindest eine Liste von Resten auf der Oberfläche der IPBD, 2) eine Liste von Sequenzen, die homolog zu der IPBD sind und 3) ein Modell des Zielmoleküls oder eines entsprechenden Zielmaterials.
Diese Daten und das Verständnis des Verhaltens unterschiedlicher Aminosäuren in Proteinen werden verwendet werden, um zwei Fragen zu beantworten:
1) Welche Reste der IPBD sind auf der Außenseite und liegen räumlich nahe genug zusammen, damit das Zielmolekül gleichzeitig berührt werden kann?
2) Welche Reste der IPBD können variiert werden, so daß mit einer hohen Wahrscheinlichkeit die zugrundeliegende IPBD-Struktur aufrechterhalten wird?
Obwohl ein Atommodell des Zielmaterials auf der Grundlage von Röntgenstrahlkristallographie, NMR, etc., für solche Untersuchungen bevorzugt ist, ist es nicht notwendig. Wenn beispielsweise das Zielmolekül ein Protein unbekannter 3D-Struktur ist, reicht es aus, das Molekulargewicht des Proteins zu kennen und zu wissen, ob es ein lösliches globuläres Protein, ein fibröses Protein oder ein Membranprotein ist. Man kann dann ein Protein bekannter Struktur derselben Klasse und ähnlicher Größe und Form auswählen, um dieses als ein molekulares Analogon und als Maßstab zu verwenden. Bei niednger Auflösung sehen sich alle Proteine einer gegebenen Größe und Klasse sehr ähnlich. Die spezifischen Volumina sind dieselben, alle sind mehr oder weniger kugelförmig, und daher besitzen alle Proteine derselben Größe und Klasse ungefähr denselben Krümmungsradius. Die Krümmungsradien zweier Moleküle bestimmen, wie sehr die beiden Moleküle in Kontakt kommen können.
Das geeignetste Verfahren zum Auswählen der Reste der Proteinkette, an denen die Aminosäuren variiert werden sollen, ist das Sichtbarmachen eines Modells der IPBD mit einer interaktiven Computergrafik. Eine Stiftfigurenpräsentation von Molekülen ist bevorzugt. Ein geeignetes Hardware-Set ist ein Evans & Sutherland PS390 Grafikterminal (Evans & Sutherland Corporation, Salt Lake City, UT) und ein MicroVAX II Supermicro-Computer (Digital Equipment Corp., Maynard, MA).
Geeignete Programme zum Sichtbarmachen und Manipuliert von Proteinmodellen umfassen a) PS-FRODO, geschrieben von T. A. Jones (JONE85) und vertrieben vom Biochemistry Department der Rice Universität, Houston, TX; und b) PROTEUS, entwickelt von Dayringer, Tramantano und Fletterick (DAYR86).
Theoretische Berechnungen, wie die dynamische Proteinsimulation, werden verwendet, um den Effekt einer Substitution an einem bestimmten Rest eines bestimmten Aminosäuretyps auf die 3D-Struktur des parentalen Proteins abzuschätzen. Solche Berechnungen könnten auch andeuten, ob eine bestimmte Substitution die Flexibilität des Proteins stark beeinflussen wird.

Abschnitt 13.1.1: Die Hauptgruppe:

Unter Anwendung der Kenntnis, welche Reste sich auf der Oberfläche der IPBD befinden, wählen wir diejenigen Reste aus, die auf der Oberfläche der IPBD nahe genug zusammen liegen, damit diese ein Molekül des Zielmaterials gleichzeitig berühren können, ohne daß irgendein IPBD-Hauptkettenatom näher als der van der Waals-Abstand (nämlich 4,0 bis 5,0 Å) an irgendein Zielmolekülatom kommt. Ein Rest der IPBD "berührt" das Zielmolekül, wenn a) ein Hauptkettenatom innerhalb des van der Waals-Abstands, nämlich 4,0 bis 5,0 Å irgendeines Atoms des Zielmoleküls liegt oder b) das Cbeta innerhalb des Dausschluß irgendeines Atoms des Zielmoleküls liegt, so daß ein Seitengruppenatom einen Kontakt mit diesem Atom herstellen könnte. Da sich Seitengruppen in der Größe unterscheiden (vgl. Tabelle 35), wird einige Urteilskraft beim Auswählen von Dausschluß vorausgesetzt. In der bevorzugten Ausführungsform werden wir DAusschluß = 8,0 Å verwenden, wobei jedoch andere Wert im Bereich von 6,0 Å bis 1,0 Å verwendet werden könnten. Wenn die IPBD ein G an einem Rest besitzt, konstruieren wir ein pseudo Cbeta mit dem korrekten Bindungsabstand und korrekten Bindungswinkeln und beurteilen die Fähigkeit des Restes, das Zielmolekül ausgehend von diesem pseudo Cbeta berühren zu können.
Alternativ wählen wir eine Gruppe von Resten auf der Oberfläche der IPBD so aus, daß die Oberflächenkrümmung, die durch die Reste definiert wird, in der Gruppe nicht so groß ist, daß sie den Kontakt zwischen allen Resten in der Gruppe und einem Molekül des Zielmaterials verhindern würde. Dieses Verfahren ist geeignet, wenn das Zielmaterial ein Makromolekül, wie ein Protein, ist, weil die von der IPBD abstammenden PBDs nur einen Teil der makromolekularen Oberfläche kontaktieren werden.
Wir bevorzugen, daß es irgendwelche Hinweise dafür gibt, daß die zugrundeliegende IPBD-Struktur Substitutionen an jedem Rest in der Hauptgruppe der Reste tolerieren wird. Hinweise könnten aus verschiedenen Quellen kommen, wie beispielsweise: a) homologen Sequenzen, b) statischem Computermodellieren und c) dynamischen Computersimulationen.
Die Reste in der Hauptgruppe müssen in der Proteinsequenz nicht benachbart sein. Wir setzen nur voraus, daß alle Aminosäuren an den zu variierenden Resten ein Molekül des Zielmaterials gleichzeitig berühren können, ohne Atomüberlappungen aufzuweisen. Wenn das Zielmaterial beispielsweise Pferdeherz-Myoglobin wäre und wenn die IPBD BPTI wäre, könnte irgendeine Gruppe von Resten in einer Interaktionsgruppe vom BPTI, wie in der Tabelle 34 definiert, ausgewählt werden.
Vorzugsweise enthält die Hauptgruppe 8 bis 16 Reste. Diese Anzahl an Resten erlaubt eine ausreichende Variabilität, um eine Oberfläche, die komplementär zum Zielmolekül ist, zu finden; sie ist jedoch klein genug, damit ein signifikanter Teil der Oberfläche gleichzeitig variiert werden kann.

Abschnitt 13.1.2: Die Sekundärgruppe:

Die Sekundärgruppe umfaßt Reste, die Reste in der Primärgruppe berühren und aus der Primärgruppe ausgeschlossen sind, weil der betreffende Rest: a) im Inneren liegt, b) hochkonserviert ist oder c) auf der Oberfläche liegt, die Krümmung der IPBD-Oberfläche jedoch den Rest daran hindert, mit dem Zielmolekül zur gleichen Zeit wie ein oder mehrere Reste in der Primärgruppe in Kontakt zu sein.
Innere Reste können, obwohl sie häufig konserviert sind, einige konservative Austausche wie 1 gegen L oder F gegen Y tolerieren. Diese Austausche beeinflussen die genaue Plazierung und Dynamik benachbarter Proteinreste, und eine solche Variation kann nützlich sein, sobald eine SBD gefunden wird.
Oberflächenreste in der Sekundärgruppe sind meistens an der Peripherie der Hauptgruppe lokalisiert, die nicht gleichzeitig mit allen anderen Resten der Hauptgruppe einen direkten Kontakt mit dem Zielmolekül eingeht. Die Ladung der Aminosäure an einem dieser Reste könnte jedoch einen starken Effekt auf die Bindung ausüben. Es ist geeignet, die Ladung einiger oder aller dieser Reste zu variieren, um eine SBD zu verbessern. Beispielsweise erzeugt das variierte Codon, das äquimolar A und G als Base 1, äquimolar C und A als Base 2 und A als Base 3 enthält, die Aminosäuren T, A, K und E mit gleicher Wahrscheinlichkeit.

Abschnitt 13.1.3: Wahl der Reste, die zuerst variiert werden sollen:

Der erlaubte Variierungsgrad, der eine Progression sichert, bestimmt, wieviele Reste auf einmal variiert werden können; die Geometrie bestimmt welche.
Der Anwender wählt Reste aus, die auf viele Weisen variiert werden können; die folgende ist eine bevorzugte Weise. Paare von Resten werden ausgewählt, die diametrisch entgegengesetzt auf der Oberfläche der Hauptgruppe liegen. Zwei solche Paare werden verwendet, um die Oberfläche nach oben/unten und nach rechts/links zu begrenzen. Alternativ werden drei Reste ausgewählt, die auf der Oberfläche ein einbeschriebenes Dreieck mit einer so großen Fläche wie möglich bilden. Ein bis drei weitere Reste werden in einer Schachbrettweise über der Interaktionsoberfläche ausgewählt. Die Wahl weit auseinanderliegender, zu varuerender Reste erhöht die Wahrscheinlichkeit einer hohen Spezifität, da alle dazwischenliegenden Reste eine akzeptierbare Komplementarität aufweisen müssen, bevor sich günstige Wechselwirkungen an weit getrennten Resten entwickeln können.
Die Anzahl der ausgewählten Reste ist abhängig von dem Bereich, in welchem jeder im Hinblick auf die in Abschnitt 13.2 diskutierten Beschränkungen variiert werden kann. In der ersten Runde erwarten wir keine Bindung zwischen der IPBD und dem Zielmolekül, und daher ist die Progression kein Thema. Bei der ersten Runde kann der Anwender wählen, einen solchen Variierungsgrad herzustellen, daß jedes Molekül der vgDNA durch beispielsweise unbeschränkte Vanierung von 10 Codons (20¹&sup0; = ungefähr 10¹³) potentiell unterschiedlich ist. Ein Lauf des DNA- Synthesegerätes stellt ungefähr 10¹³ Moleküle einer Länge von 100 nts her.
Unzulänglichkeiten bei der Ligierung und Transformation wird die Anzahl der tatsächlich getesteten Proteine auf zwischen 10&sup7; und 5 x 10&sup8; vermindern. Mehrmalige Wiederholungen des Verfahrens mit einem solchen sehr hohen Variierungsg rad wird keine wiederholbaren Ergebnisse liefern; der Anwender muß entscheiden, ob dies wichtig ist.

Abschnitt 13.2: Variationsbereich an ieder Mutationsstelle:

Der Gesamtvariierungsgrad ist das Produkt aus der Anzahl an Varianten an jedem variierten Rest. Jeder variierte Rest kann ein unterschiedliches Variierungsschema aufweisen, welches 2 bis 20 unterschiedliche Möglichkeiten produziert. Wir setzen voraus, daß der Prozeß progressiv ist, d.h. jeder Variierungszyklus schafft einen besseren Startpunkt für den nächsten Variisierungszyklus im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus.
N. B.: Das Ansetzen des Variierungsgrades in einer Weise, daß das ppbd und viele Sequenzen, die verwandt zu der ppbd-Sequenz sind, in nachweisbaren Mengen vorhanden sind, stellt sicher, daß der Prozeß progressiv ist. Wenn der Variierungsgrad so hoch ist, daß die ppbd-Sequenz zu solch niedrigen Mengen vorhanden ist, daß eine nennenswerte Chance besteht, daß keine Transformante die PPBD präsentieren wird, könnte die beste SBD der nächsten Runde schlechter sein als die PPBD. Bei exzessiv hohem Variierungsg rad ist jede Mutageneserunde unabhängig von vorhergehenden Runden, so daß es keine Sicherheit einer Progression gibt. Dieser Weg kann zu wertvollen Bindeproteinen führen, jedoch wird die Wiederholung der Experimente mit diesem Variierungsgrad keine progressiven Ergebnisse erzeugen. Eine exzessive Variation ist nicht bevorzugt.
Wenn der Variierungsg rad so ist, daß die parentale Sequenz und jeder einzelne Aminosäureaustausch für die Selektion vorhanden ist, wissen wir, daß eine selektierte Sequenz näher am Optimum oder gleich wie die parentale Sequenz ist. Wenn andererseits sehr hohe Variierungsgrade verwendet werden, kann eine Sequenz selektiert werden, nicht weil sie besser als die parentale Sequenz ist, sondern weil die parentalen und verbesserten Sequenzen durch Zufall abwesend sind.
Progression ist nicht eine Alles-oder-Nichts-Eigenschaft. Solange der meiste Teil der Information, die aus vorhergehenden Variierungszyklen erhalten wird, beibehalten wird und viele verschiedene Oberflächen, die verwandt zu der PPBD-Oberfläche sind, hergestellt werden, ist der Prozeß progressiv. Wenn der Variierungsgrad so hoch ist, daß das ppbd-Gen nicht detektiert werden kann, vermindert sich die Sicherstellung der Progression. Wenn die Wahrscheinlichkeit, die PPBD wiederzugewinnen vernachlässigbar ist, ist die Wahrscheinlichkeit eines progressiven Verhaltens ebenso vernachlässigbar.
Ein entgegengesetzter Zwang in unseren Entwurfsbetrachtungen ist, daß PBDs in der Population nur bis zu einer Menge, die detektiert werden kann, geeignet sind; jeder Überschuß über die nachweisbare Menge wird ungenutzt gelassen. Folglich produzieren wir so viele zur PPBD verwandte Oberflächen wie möglich mit der Einschränkung, daß die PPBD nachweisbar sein muß.
Wir verschieben die Beschreibung, wieviel Vanierung genau erlaubt ist, bis wir: a) realent-Verteilungen für ein vaniertes Codon spezifiziert und b) die Auswirkungen der Diskrepanzen zwischen spezifizierten nt-Verteilungen und tatsächlichen nt- Verteilungen überprüft haben.

Abschnitt 13.3: Entwurf der vgDNA. die für die PBD-Familie kodiert:

Wir müssen nun entscheiden, wie die Vanierung innerhalb der Codons für die zu variierenden Reste verteilt wird. Diese Entscheidungen werden beeinflußt durch die Natur des genetischen Codes. Wenn vgDNA synthetisiert wird, erzeugt die Variation der ersten Base eines Codons eine Population, die Aminosäuren aus der ersten Spalte der Tabelle des genetischen Codes (wie gezeigt in den Tabellen 3 bis 6 auf S. 87 von WATS87) enthält; die Variation der zweiten Base des Codons erzeugt eine Population, die Aminosäuren aus der ersten Reihe der Tabelle des genetischen Codes enthält; die Variation der dritten Base des Codons erzeugt eine Population, die Aminosäuren aus demselben Block enthält. Wenn zwei oder drei Basen im selben Codon variiert werden, wird das Muster komplizierter. Die Arbeit mit 3D- Proteinstrukturmodellen kann definierte Serien von Aminosäuren vorschlagen, die an einem gegebenen Rest zu substituieren sind, jedoch kann das Variationsverfahren voraussetzen, daß entweder mehr oder weniger Arten von Aminosäuren eingeschlossen werden. Beispielsweise könnte die Untersuchung eines Modells die Substitution von N oder Q an einem gegebenen Rest vorschlagen. Die kombinatorische Variation der Codons setzt voraus, daß das Mischen von N und Q an einer Stellung auch K und H als Möglichkeiten für denselben Rest umfaßt. Man muß auswählen: 1) nur N, 2) nur Q oder 3) eine Mischung aus N, K, H und Q zu setzen. Die vorliegende Erfindung stützt sich nicht auf genaue Voraussagen dahingegehend, welche Aminosäuren an jeden Rest plaziert werden sollten, sondern die Aufmerksamkeit wird darauf gerichtet, welche Reste variiert werden sollten.
Es gibt viele Weisen, in einem Protein Diversität zu erzeugen (siehe RICH86, CARU85 und OLIP86). Ein Extremfall ist, daß ein oder wenige Reste des Proteins soviel wie möglich variiert werden (siehe u. a. CARU85, CARU87, RICH86 und WHAR86). Wir werden diese Beschränkung "fokusierte Mutagenese" bezeichnen. Fokusierte Mutagenese ist geeignet, wenn die IPBD oder andere PPBD wenig oder keine Bindung an das Zielmolekül zeigt, wie zum Beginn der Suche nach einem Protein, das an ein neues Zielmaterial binden soll. Wenn es keine Bindung zwischen der PPBD und dem Zielmolekül gibt, wählen wir vorzugsweise eine Gruppe von 5 bis 7 Resten aus und variieren jeden durch alle 20 Möglichkeiten.
Ein alternativer Mutageneseplan ("diffuse Mutagenese") ist, viel mehr Reste durch eine begrenzte Reihe von Wahlmöglichkeiten zu variieren (siehe Vershon et al., K15 von INOU86 und PAKU86). Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, daß jedes der reinen, für die DNA-Synthese aktivierten nts (z.B. nt-Phosphoramidite) mit einer geringen Menge eines oder mehrerer weiterer aktivierter nts versetzt wird. Im Gegensatz zur allgemeinen Praxis setzt die vqrliegende Erfindung den Grad der Mischung so an, daß nur ein geringer Prozentsatz (1 % bis 0,00001 % beispielsweise) des Endprodukts die anfängliche DNA-Sequenz enthält. Viele Einzel-, Doppel-, Dreifach- und höhere Mutationen ereignen sich, jedoch ist auch die Gewinnung der Basissequenz ein mögliches Ergebnis. Wenn man annimmt, daß Nb die Anzahl der zu variierenden Basen und Q der Teil aller Sequenzen ist, die die parentale Sequenz besitzen sollten, dann ist M der Teil der Mischung, der die Hauptkomponente ist
M = exp {loge(Q)/Nb} = 10 (log10(Q)/Nb)
Wenn beispielsweise 30 Basenpaare des DNA-Stranges zu variieren sind und 1 % des Produktes die parentale Sequenz aufweisen soll, sollte jedes gemischte nt- Substrat 86 % des parentalen-nt und 14 % andere nts enthalten. Die Tabelle 8 zeigt die Fraktion (fn) der DNA-Moleküle mit n nicht-parentalen Basen, wenn 30 Basen mit Reagenzien synthetisiert werden, die den Teil M der Hauptkomponente enthalten. Wenn M = 0,63096 sind f24 und höhere kleiner als 10&supmin;&sup8;. Der Eintrag "am meisten" in Tabelle 8 bedeutet die Anzahl von Änderungen, die die höchste Wahrscheinlichkeit besitzen. Man beachte, daß eine wesentliche Wahrscheinlichkeit für mehrfache Substitutionen nur auftritt, wenn man die Fraktion der parentalen Sequenz (f0) auf ungefähr 10 heruntersetzt. Eine Mutagenese dieser Art kann auf jeden Teil des Proteins zu jeder Zeit angewandt werden, sie ist jedoch am geeignetsten, wenn bereits eine gewisse Bindung an das Zielmolekül etabliert worden ist. Die Nb Basenpaare des DNA-Stranges, die mit gemischten Reagenzien synthetisiert werden, müssen nicht nebeneinanderliegen. Sie werden so ausgewählt, daß zwischen Nb/3 und Nb Codons zu verschiedenen Graden beeinflußt werden. Die für die Mutation ausgewählten Reste werden mit Bezug auf die 3D-Struktur der IPBD ausgewählt, wenn diese bekannt ist. Beispielsweise könnte man alle oder die meisten Reste in der Haupt- und Sekundärgruppe auswählen. Man kann Beschränkungen hinsichtlich des Ausmaßes der Variation an jedem dieser Reste auf der Grundlage homologer Sequenzen oder anderer Daten auferlegen. Die Mischung der nicht-parentalen nts muß nicht zufällig sein, sondern Mischungen können so vorbestimmt werden, daß bestimmten Aminosäuretypen spezifische Wahrscheinlichkeiten für das Erscheinen an jedem Codon zugeordnet werden können. Beispielsweise kann ein Rest eine hydrophobe Aminosäure in allen bekannten homologen Sequenzen enthalten; in einem solchen Fall würde die erste und dritte Base dieses Codons variiert werden, jedoch würde die zweite als T festgesetzt werden. Diese diffuse Struktur-gerichtete Mutagenese wird geringste Veränderungen aufdecken, die in einem Proteingrundgerüst möglich und mit konservativen inneren Veränderungen assoziiert sind, wie V nach I, wie auch nicht so feine Veränderungen, die gleichzeitige Veränderungen an zwei oder mehr Resten des Proteins benötigen.
Für die fokusierte Mutagenese betrachten wir jetzt die Verteilung der nts, die an jedem variierten Codon eingebaut werden. Jedes Codon könnte unterschiedlich programmiert werden. Wenn wir keine Information besitzen, die andeutet, daß eine bestimmte Aminosäure oder Aminosäureklasse geeignet ist, sind wir bestrebt, alle Aminosäuren mit gleicher Wahrscheinlichkeit einzusetzen, da die Repräsentation einer pbd über der nachweisbaren Grenze unrentabel ist. Gleiche Mengen aller vier nts an jeder Position in einem Codon erzeugt eine Aminosäureverteilung, in welcher jede Aminosäure im Verhältnis zu der Anzahl der Codons, die für sie kodieren, vorhanden ist. Diese Verteilung hat den Nachteil, daß sich zwei basische Reste für jeden sauren Rest ergeben. Zusätzlich erscheinen sechsmal mehr R, S und L als W oder M. Wenn fünf Codons mit dieser Verteilung synthetisiert werden, sind Sequenzen, die für fünf Rs kodieren, 7776-mal häufiger als Sequenzen, die für fünf Ws kodieren. Um W-W-W-W-W in nachweisbaren Menge präsent zu haben, müssen wir R-R-R-R-R in einem 7776-fachen Überschuß präsent haben.
Nehmen wir an, daß Abun(x) die Häufigkeit von DNA-Sequenzen, die für die Aminosäure x kodieren, ist und durch die Verteilung der nts an jeder Base des Codons definiert wird. Für jede Verteilung wird es eine am meisten favorisierte Aminosäure (most-favoured amino acid; mfaa) mit der Häufigkeit Abun(mfaa) und eine am wenigsten favorisierte Aminosäure (least4avoured amino acid; lfaa) mit der Häufigkeit Abun(lfaa) geben. Wir suchen die nt-Verteilung, die alle 20 Aminosäuren erlaubt und die das größte Verhältnis Abun(lfaa)/Abun(mfaa) unter dem Vorbehalt zweier Bedingungen erzeugt: gleichgroße Häufigkeit saurer und basischer Aminosäuren und die geringstmögliche Anzahl an Stopp-Codons. Die einzigen nt- Verteilungen, die Abun(E)+Abun(D) = Abun(R)+Abun(K) ergeben, werden in Betracht gezogen und die Funktion wird maximiert:
{(1-Abun(stop)) (Abun(lfaa)/Abun(mfaa))}.
Wir haben die Suche nach der optimalen nt-Verteilung dadurch vereinfacht, daß die dritte Base auf T oder G (C oder G ist äquivalent) beschränkt wurde. Alle Aminosäuren sind möglich und die Anzahl verfügbarer Stoppcodons wird vermindert, da TGA- und TM-Codons beseitigt sind. Die Aminosäuren F, Y, C, H, N, I und D benötigen T als dritte Base, während W, M, Q, K und E G benötigen. Daher verwenden wir eine äquimolare Mischung aus T und G für die dritte Base.
Ein Computerprogramm, welches als Teil der vorliegenen Erfindung geschrieben und "Finde das optimale vgCodon" bezeichnet wurde (siehe Tabelle 9), variiert die Zusammensetzung an Base 1 und 2 in Schritten von 0,05 und berechnet die Zusammensetzung, die den größten Wert der Menge {(Abun(lfaa)/Abun(mfaa)(1- Abun(stop)))} ergibt. Ein vg-Codon wird symbolisch definiert durch die nt-Verteilung an jeder Base:
Die Variation der Mengen t1, c1, a1, g1, t2, c2, a2 und g2 steht unter dem Vorbehalt der Bedingung, daß Abun(E)+Abun(D) gleich ist mit Abun(K)+Abun(R);
Abun(E)+Abun(D)) = g1*a2
Abun(K)+Abun(R) = a1*a2/2 + c1*ge + a1*g2/2
g1*a2 = a1*a2/2 + c1*g2 + a1*g2/2
Beim Auflösen nach g2 erhalten wir
g2 = (g1*a2 - 0,5*a1*a2)/(c1 + 0,5*a1)
Zusätzlich,
t1 = 1 - a1 - c1 - g1
t2 = 1 - a2 - c2 - g2.
Wir variieren a1, c1, g1, a2 und c2 und berechnen danach t1, g2 und t2. Anfänglich findet die Variation in Schritten von 5 % statt. Sobald eine ungefähr optimale Verteilung der nts bestimmt worden ist, wird die Region mit Schritten von 1 % weiter untersucht. Die Logik dieses Programms ist in Tabelle 9 gezeigt. Die optimale Verteilung ist: Odtimales vg-Codon
und führt zu DNA-Molekülen, die für jeden Typ Aminosäure mit den in Tabelle 10 gezeigten Häufigkeiten kodieren.
Der Computer, der ein DNA-Synthesegerät, wie das Milligen 7500, kontrolliert, kann so programmiert werden, daß jede Base eines Oligo-nt mit einer beliebigen nts- Verteilung dadurch synthetisiert wird, daß die nt-Substrate (z. B. nt-Phosphoramidite) aus jedem von zwei oder mehreren Reservoirs entnommen werden. Alternativ können die nt-Substrate in beliebigen Verhältnissen gemischt und in eines der zusätzlichen Reservoirs für die sogannte "Schmutzfläschchen"-Synthese gegeben werden.
Die erhaltene tatsächliche nt-Verteilung wird sich von der spezifizierten nt-Verteilung wegen mehrerer Gründe unterscheiden, wie beispielsweise: a) unterschiedlicher inhärenter Reaktivität der nt-Substrate und b) unterschiedlicher Zersetzung der Reagenzien. Es ist möglich, diese Effekte teilweise auszugleichen, jedoch wird ein gewisser Restfehler bleiben. Wir bezeichnen die durchschnittliche Diskrepanz zwischen spezifizierter und beobachteter nt-Fraktion als Serr,
Serr = Quadratwurzel (mittlere [(fobs - fspec)/fspec])
worin fobs die Menge eines Typs eines an einer Base gefundenen nt und fspec die Menge dieses Typs des nt ist, das an derselben Base spezifiziert war. Der Durchschnitt wird für alle spezifizierten nts-Typen und für eine Anzahl (z. B. 10 oder 20) unterschiedlicher, variierter Basen berechnet. Hypothetisch wird die tatsächliche nt-Verteilung an einer variierten Base innerhalb 5 % der spezifizierten Verteilung liegen. Die gegenwärtig erhältlichen DNA-Synthesegeräte und die verfügbare DNA- Synthesechemie können unterschiedliche Fehlerrate aufweisen. Es liegt in der Verantwortlichkeit des Anwenders, Serr für das verwendete DNA-Synthesegerät und die angewandte Chemie zu bestimmen.
Um die möglichen Auswirkungen der Fehler hinsichtlich nt-Zusammensetzung auf die Aminosäureverteilung zu bestimmen, modifizieren wir das Programm "Finde das optimale vgCodon" in vier Weisen:
1) Die Fraktion jedes nt in den ersten zwei Basen läßt man ausgehend von ihrem optimalen Wert mal (1 - Serr) bis zum optimalen Wert mal (1 + Serr) in sieben gleichen Schritten (Serr ist die hypothetische durch den Anwender eingegebene Teilfehlerrate) variieren; die Summe der nt-Fraktionen an einer Base ist immer gleich 1,0,
2) 92 wird auf dieselbe Weise wie a2 variiert (d.h. wir vernachlässigen die Beschränkung, daß Abun(D)+Abun(E) = Abun(K)+Abun(R),
3) t3 und 93 werden ausgehend von 0,5 mal (1 - Serr) bis 0,5 mal (1 + Serr) in drei gleichen Schritten variiert,
4) das geringste Verhältnis Abun(Ifaa)/Abun(mfaa) wird gesucht.
In gegenwärtigen Experimenten werden wir das Synthesegerät so betreiben, daß die optimale DNA-Verteilung "optimales vgCodon" - wie vorstehend angegeben - hergestellt wird. Eine unvollständige Kontrolle über die DNA-Chemie kann jedoch verursachen, daß tatsächlich die folgende Verteilung erhalten wird, die die schlechteste ist, die erhalten werden kann, wenn alle nt-Fraktionen innerhalb von 5 % der Werte liegen, die in "optimales vgCodon" spezifiziert sind. Eine entsprechende Tabelle kann für jedes gegebene Serr unter Verwendung des Programms "Finde das schlechteste vgCodon innerhalb Serr für eine gegebene Verteilung" berechnet werden, das in Tabelle 11 dargestellt ist. Optimales vgCodon, schlechtestenfalls 5 %-Fehler
Diese Verteilung erzeugt DNA, die für verschiedene Aminosäuren kodiert, mit den in Tabelle 12 dargestellten Häufigkeiten.
Wenn fünf Codons mit Reagenzien synthetisiert werden, die so gemischt sind, daß die nt-Verteilung "optimales vgCodon" produziert wird, und, wenn wir die nt- Verteilung "optimales vgCodon, schlechtestenfalls 5 % Fehler" tatsächlich erhalten haben, sind DNA-Sequenzen, die für die mfaa an allen der fünf Codons kodieren, ungefähr 277 mal so wahrscheinlich wie DNA-Sequenzen, die für die lfaa an allen der fünf Codons kodieren; ungefähr 24 % der DNA-Sequenzen werden ein Stopp- Codon in einem oder mehreren der fünf Codons besitzen.
Wenn fünf Codons unter Verwendung von äquimolaren Mischungen an den Basen 1 und 2 synthetisiert werden, (Abun(mfaa)/Abun(lfaa))&sup5; = 7776. Wenn wir die optimale nt-Verteilung programmieren und innerhalb von 5 % kommen, dann (Abun(mfaa)/Abun(lfaa))&sup5; = 277. Die Gesamtzahl verschiedener PBDs ist unverändert, jedoch ist die am wenigsten favonsierte Sequenz ungefähr 28 mal häufiger vorhanden. Das Nachweisen der am wenigsten favorisierten Aminosäuresequenz benötigt, wenn vier Reste mit äquimolaren nts an jeder variierten Base variiert werden, ein Trennugssystem, das so empfindlich ist, wie das Nachweisen der am wenigsten favorisierten Aminosäuresequenz, wenn fünf Reste mit der optimierten nt-Verteilung variiert werden.
Die Verteilung "optimales vgCodon" wird hypothetisch in der zweiten Version der zweiten Varuerung des hypothetischen Beispiels 2 verwendet. Die Häufigkeit der DNA, die für jeden Aminosäuretyp kodiert, wird jedoch der Tabelle 12 entnommen. Die Häufigkeit der DNA, die für die parentale Aminosäuresequenz kodiert ist: Menge(parentale Seq.)
Daher werden sowohl die DNA, die für die PPBD-Sequenz kodiert, als auch sehr viele verwandte Sequenzen in einer für den Nachweis ausreichenden Menge vorhanden sein, und wir sind sicher, daß das Verfahren progressiv sein wird.
Ein Variierungsgrad, der die Gewinnung der PPBD erlaubt, besitzt zwei Eigenschaften:
1) Wir können nicht zurückgehen, da die PPBD erhältlich ist,
2) eine enorme Anzahl mehrfacher Austausche, die in Beziehung zur PPBD stehen, sind für die Selektion verfügbar, und wir können diese nachweisen und Nutzen aus diesen Veränderungen ziehen.
Der Anwender muß die Liste der zu variierenden Reste und die Variierungsgrade für jeden Rest anpassen, bis die berechnete Vanierung innerhalb der durch Mntv und Csensi bestimmten Grenzen liegt.
Vorzugsweise betrachten wir auch die Wechselwirkungen zwischen den Variierungsstellen und der umgebenden DNA. Wenn das anzuwendende Mutageneseverfahren der Austausch einer Kassette ist, betrachten wir, ob die Varuerung willkürliche Restriktionsstellen erzeugt und ob sie ernsthaft mit der beabsichtigten Einführung der Diversität interferieren. Wir vermindern oder beseitigen willkürliche Restriktionsstellen durch die geeignete Wahl des Variierungsmusters und stille Veränderung der Codons, die benachbart zu den Variierungsstellen liegen. Siehe das detaillierte Beispiel.

Abschnitt 14.1: Insertion synthetischer vgDNA in Plasmide:

Für die Kassettenmutagenese wurden Restriktionsstellen entworfen und synthetisiert, und diese werden verwendet, um die synthetische vgDNA in den OCV einzuführen. Restriktionsspaltungen und Ligierungen werden durch Anwendung von Standardverfahren durchgeführt (AUSU87). Im Fall der Einzelstrang-Oligonukleotidgerichteten Mutagenese wird synthetische vgDNA verwendet, um Diversität in dem Vektor zu erzeugen (BOTS85).

Abschnitt 14.2: Transformation von Zellen:

Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf irgendein Verfahren zum Transformieren von Zellen mit DNA. Standardverfahren wie diejenigen, die in MANI82 beschrieben sind, können für die bestimmten Wirtszellen und den OCV optimiert werden. Das Ziel ist, eine große Anzahl unabhängiger Transformanten, vorzugsweise 10&sup7; oder mehr, herzustellen. Es ist nicht notwendig, transformierte Zellen zwischen der Transformation und Affinitätstrennung zu isolieren. Wir bevorzugen, transformierte Zellen in einer hohen Konzentration zu bekommen, so daß diese dicht auf relativ wenige Platten ausplattiert werden können.

Abschnitt 14.3: Kultivierung der GP(vgPBD)-Population:

Die transformierten Zellen werden zuerst unter nicht-selektiven Bedingungen, die die Expression der Plasmidgene erlauben, kultiviert und danach selektiert, um nichttransformierte Zellen abzutöten. Transformierte Zellen werden danach zur Expression des ops-pbd-Genszu der geeigneten Induktionsrate induziert, wie in Abschnitt 10.1 bestimmt ist. Die die IPBD tragenden GPs werden durch ein für die Packung geeignetes Verfahren geerntet.
Ein hoher Diversitätsgrad kann durch in vitro variierte DNA-Synthese erzeugt werden, und diese Diversität kann passiv über mehrere Generationen hinweg in einem Organismus ohne positiven Selektionsdruck aufrechterhalten werden. Der Verlust oder die Verminderung der Häufigkeit schädlicher Mutationen ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung vorteilhaft. Es ist bevorzugt, daß die Selektion durchgeführt wird, bevor mehr als ein paar wenige Generationen verstrichen sind.
Weiterhin würde das Unterteilen der variierten Population vor der Amplifikation in einem Organismus durch Entfernen einer kleinen Probe (weniger als 10 %) für die weitere Arbeit zu einem Diversitätsverlust führen; daher sollte man die gesamte oder den größten Anteil der synthetischen DNA und die meisten oder alle transformierten Zellen verwenden.

Abschnitt 15: Isolierung von GP(PBD)s mit Bindung-an-Zielmolekül-Phänotyden:

Die geernteten Packungen werden unter Anwendung der Affinitätstrennung mittels des auf einer Matrix immobilisierten Zielmaterials bezüglich des Bindung-an- Zielmolekül-Phänotyps angereichert. Packungen, die nicht an das Zielmaterial binden, werden weggewaschen. Wenn die Packungen Bakteriophagen oder Endosporen sind, kann es wünschenswert sein, ein bakteriozides Mittel, wie Azid, in den Puffer einzubringen, um Bakterienwachstum zu verhindern.

Abschnitt 15.1: Anheften des Zielmaterials an eine Säule:

Affinitätssäulenchromatographie ist das bevorzugte Verfahren der Affinitätstrennung, jedoch können andere Affinitätstrennungsverfahren verwendet werden. Viele verschiedene, kommerziell erhältliche Trägermaterialien für die Affinitätschromatographie werden verwendet. Diese umfassen derivatisierte Kiigelchen, an die das Zielmaterial kovalent gebunden wird, oder nicht-derivatisiertes Material, an welches das Zielmaterial irreversibel adhäriert.
Lieferanten von Trägermaterial für die Affinitätschromatographie umfassen: Applied Protein Technologies Cambridge, MA; Bio-Rad Laboratories, Rockville Center, NY; Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Die Zielmaterialien werden gemäß den Anweisungen der Hersteller jeder Matrixpräparation mit Hinblick auf eine gute Präsentation des Zielmoleküls an die Matrix angeheftet.

Abschnitt 15.2: Verminderung der Selektion aufgrund nicht-spezifischer Bindung:

Wir reduzieren eine nicht-spezifische Bindung der GP(PBD)s an die Matrix, die das Zielmolekül trägt, auf zwei Weisen:
1) Wir behandeln die Säule mit Blockierungsmittel wie genetisch defekte GPs, oder mit einer Proteinlösung, bevor die Population von GP(vgPBD)s chromatographiert wird und
2) wir schicken vor der Affinitätschromatographie die Population von GP(vgPBD)s über eine Matrix, die kein Zielmolekül oder ein unterschiedliches Zielmolekül aus derselben Klasse wie das tatsächliche Zielmolekül enthält.
Der vorstehende Schritt (1) sättigt gegebenenfalls vorhandene nicht-spezifische Bindung ab, die die Affinitätsmatrix gegenüber Wildtyp-GPs oder Proteinen im allgemeinen zeigen könnte; der Schritt (2) entfernt Komponenten unserer Population, die eine nicht-spezifische Bindung an die Matrix oder an Moleküle derselben Klasse wie das Zielmolekül ausüben. Wenn das Zielmolekül beispielsweise Pferdeherz- Myoglobin ist, kann eine Rinderserumalbumin-tragende Säule verwendet werden, um GPs, die PBDs mit einer starken nicht-spezifischen Bindung an Proteine enthalten, abzufangen. Wenn das Zielmolekül Cholesterin ist, kann eine hydrophobe Verbindung, wie p-Tertiärbutylbenzylalkohol verwendet werden, um GPs, die PBDs mit starker nicht-spezifischer Bindung an hydrophobe Verbindungen präsentieren, zu entfernen. Es wird vorweggenommen, daß PBDs, die sich nicht falten oder die vorzeitig terminiert sind, nicht-spezifisch "klebrig" sein werden. Die Kapazität der Anfangssäule, die wahllos adhäsive PBDs entfernt, sollte größer sein (z. B. fünffach größer) als die Spule, die das Zielmolekül trägt.
Eine Variation des Trägermaterials (Polystyrol, Glas, Agarose, etc.) bei der Analyse von Klonen, die SBDs tragen, wird angewendet, um eine Anreicherung bezüglich der Packungen, die eher das Trägermaterial als das. Zielmolekül binden, auszuschließen.

Abschnitt 15.3: Elution der Säule:

Die Population von GPs wird unter Bedingungen, die kompatibel mit der beabsichtigten Verwendung des Bindeproteins sind, auf eine Affinitätsmatrix aufgetragen, und die Population wird durch die Passage eines Gradienten irgendeines gelösten Feststoffes durch die Säule fraktioniert. Das Verfahren reichert PBDs, die eine Affinität für das Zielmolekül besitzen und für die Affinität für das Zielmolekül durch die verwendeten Elutionsmittel weniger beeinflußt wird, an.
Ionen und Cofaktoren, die für die Stabilität der PBDs (abgeleitet von der IPBD) oder des Zielmoleküls benötigt werden, müssen zu geeignten Mengen in die Puffer eingebracht werden. Wir entfernen zuerst GP(PBD)s, die nicht an das Zielmolekül binden, durch Waschen der Matrix mit demjenigen Volumen des Anfangspuffers, das benttigt wird, um die optische Dichte (bei 260 nm oder 280 nm) zurück zur Grundlinie zu bringen, plus 1 bis 5 Leervolumina (Vv). Die Säule wird danach eluiert mit einem Gradienten mit ansteigender: a) Salzkonzentration, b) [H+] (sinkender pH), c) Konzentration neutraler gelöster Feststoffe, d) Temperatur (ansteigend oder abfallend) oder e) irgendeiner Kombination dieser Faktoren. Salz ist der am meisten bevorzugte gelöste Feststoff für die Gradientenbildung. Andere gelöste Feststoffe, die allgemein nicht-kovalente Wechselwirkungen schwächen, können auch verwendet werden. "Salz" umfaßt Lösungen, die irgendeine der folgenden Ionenarten enthalten:
Andere ionische oder neutrale gelöste Feststoffe können verwendet werden. Alle gelösten Feststoffe stehen unter dem Vorbehalt der Voraussetzung, daß sie die genetischen Packungen nicht töten. Neutrale gelöste Feststoffe, wie Ethanol, Aceton, Ether oder Harnstoff, werden häufig für die Proteinreinigung verwendet, jedoch sind viele unter diesen oberhalb niedriger Konzentrationen sehr schädlich für Bakterien und Bakteriophagen. Bakteriensporen sind andererseits undurchlässig für die meisten neutralen gelösten Feststoffe. Mehrere Passagen können bei den Schritten in Abschnitt 15 durchgeführt werden. Unterschiedliche gelöste Feststoffe können bei verschiedenen Analysen verwendet werden, Salz in der einen, pH in der nächsten etc.

Abschnitt 15.4: Gewinnung der Packungen:

Die Gewinnung der Packungen, die eine Bindung an die Affinitätssäule zeigen, kann auf mehrere Weisen erreicht werden, beispielsweise ausgehend von:
1) Fraktionen, die mit einem Gradienten - wie vorstehend beschrieben - eluiert wurden;
2) Fraktionen, die mit löslichem Zielmaterial eluiert wurden,
3) Zellen, die in situ auf der Matrix kultiviert wurden,
4) Zellen, die mit Teilen der Matrix inkubiert wurden,
5) Fraktionen, die nach chemischem oder enzymatischem Abbauen der Verbindung, die das Zielmolekül an die Matrix heftet, eluiert wurden und
6) Regeneration der GPs nach Abbauen der Packungen und Gewinnen der OCV-DNA.
Es ist möglich, Kombinationen dieser Verfahren anzuwenden. Es sollte daran erinnert werden, daß das, was wir von der Affinitätsmatrix zurückgewinnen wollen, nicht die GPs per se sind, sondern die in ihnen vorhandene Information. Die Gewinnung lebensfähiger GPs ist sehr stark bevorzugt, jedoch ist die Gewinnung des genetischen Materials essentiell.
Eine unachtsame Inaktivierung der GPs ist sehr schädlich. Es ist bevorzugt, daß die maximalen Grenzen für die löslichen Feststoppe, bei denen die GPs nicht inaktiviert oder das Zielmolekül oder die Säule denaturiert werden, bestimmt werden. Man muß Bedingungen anwenden, die die Säule denaturieren, um GPs zu eluieren; bevor das Zielmolekül denaturiert wird, sollte ein Teil der Affinitätsmatrix für die mögliche Verwendung als Inokulum entfernt werden. Da die GPs durch Protein-Protein- Wechselwirkungen und andere nicht-kovalente molekulare Wechselwirkungen zusammengehalten werden, wird es Fälle geben, bei denen die molekulare Packung so fest an die Zielmoleküle auf der Affinitätsmatrix binden werden, daß die GPs nicht in lebensfähiger Form abgewaschen werden können. Dies wird sich nur ereignen, wenn eine sehr feste Bindung erhalten worden ist. In diesen Fällen können die vorstehend beschriebenen Verfahren (3) bis (5) verwendet werden, um die gebundenen Packungen oder genetische Botschaften von der Affinitätsmatrix zu erhalten.
Es ist durch Manipulation der Elutionsbedingungen möglich, SBDs zu isolieren, die bei einem bestimmten pH (pHb), jedoch nicht bei einem anderen pH (pH&sub0;) an das Zielmolekül binden. Die Population wird bei pHb aufgetragen, und die Säule wird sorgfältig bei pHb gewaschen. Die Säule wird danach mit Puffer bei pH&sub0; eluiert, und GPs, die bei dem neuen pH herunterkommen, werden vereinigt und kultiviert. Ähnliche Verfahren können für andere Lösungsparameter, wie die Temperatur, verwendet werden. Beispielsweise könnten GP(vgPBD)s auf eine Insulin-tragende Säule aufgetragen werden. Nach dem Eluieren mit Salz, um GPs mit geringer oder keiner Bindung an Insulin zu entfernen, eluieren wir mit Salz und Glucose, um GPs freizusetzen, die PBDs präsentieren, welche Insulin oder Glucose in einer kompetitiven Weise binden.

Abschnitt 15.5: Amplifizieren der angereicherten Packungen:

Lebensfähige GPs mit der selektierten Bindungseigenschaft werden durch Kultivieren in einem geeigneten Medium oder im Fall von Phagen durch Infektion in einen Wirt amplifiziert, also kultiviert. Wenn die GPs durch die Chromatographie inaktiviert worden sind, muß der das osp-pbd-Gen tragende OCV ausgehend von der GP gewonnen und in einen neuen lebensfähigen Wirt eingebracht werden.

Abschnitt 15.6: Bestimmung. ob eine weitere Anreicherung notwendig ist:

Die Wahrscheinlichkeit, eine GP mit verbesserten Bindungseigenschaften zu isolieren, steigt mit jedem Trennungszyklus um Ceff. Nehmen wir an, daß N die Anzahl der durch die Variierungproduzierten unterschiedlichen Aminosäuresequenzen ist. Wir wollen K Trennungszyklen durchführen, bevor versucht wird, eine SBD zu isolieren, wobei K so gewählt ist, daß die Wahrscheinlichkeit, eine einzige SBD zu isolieren 0,10 oder höher ist.
K = die kleinste gerade Zahl> = log&sub1;&sub0;(0,10 N)/log&sub1;&sub0;(Ceff)
Wenn beispielsweise N 1,0 x 10&sup7; ist und Ceff = 6,31 x 10² ist, dann log&sub1;&sub0;(1,0 x 10&sup6;)/log&sub1;&sub0;(6,31 x 10²) + 6,0000/2,8000 = 2,14. Daher würden wir versuchen, SBDs nach dem dritten Trennungszyklus zu isolieren. Nach nur zwei Trennungszyklen ist die Wahrscheinlichkeit, eine SBD zu finden, (6,31 x 10²)²/(1,0 x 10&sup7;) + 0,04, und der Versuch, SBDs zu isolieren, könnte rentabel sein.
Klonale Isolate aus der letzten Fraktion, die in Abschnitt 15.3 eluiert wurde und irgendwelche lebenfähigen GPs enthält, sowie klonale Isolate, die durch Kultivieren eines lnokulums, das von der Affinitätsmatrix genommen wurde, erhalten worden sind, werden kultiviert. Wenn K Trennungszyklen beendet worden sind, werden Proben mehrerer (z. B. 32) dieser klonalen Isolate auf Elutionseigenschaften an der {Zielmolekül}-Säule getestet. Wenn keine der isolierten, genetisch reinen GPs eine verbesserte Bindung an das Zielmolekül zeigt oder wenn K Zyklen noch nicht beendet worden sind, vereinigen und kultivieren wir auf eine Weise, die ähnlich zu der in Abschnitt 14.3 dargestellten Weise ist, die GPs aus den letzten wenigen eluierten Fraktionen (siehe Abschnitt 15.4), die lebensfähige GPs enthielten, und von den GPs, die durch Kultivieren eines von der Säulenmatrix genommenen Inokulums erhalten wurden. Danach wiederholen wir das in Abschnitt 15 beschriebene Anreicherungsverfahren. Diese zyklische Anreicherung kann für Nchrom Passagen fortgesetzt werden oder solange, bis eine SBD isoliert wird.
Wenn eine oder mehrere der isolierten GPs eine verbesserte Retention auf der {Zielmolekül}-Säule aufweisen, bestimmen wir, ob die Retention der Kandidaten- SBDs durch die Affinität für das Zielmaterial begründet ist. Das Zielmaterial wird an eine unterschiedliche Trägermatrix in einer optimalen Dichte angeheftet, und die Elutionsvolumina der Kandidaten-GP(SBD)s werden gemessen. Wir wählen den Kandidaten aus, der entweder das höchste Elutionsvolumen aufweist oder der nach der Elution auf der Säule zurückbleibt. Wenn keine der Kandidaten-GP(SBD)s ein höheres Elutionsvolumen als die GP(PPBD dieser Runde) aufweist, vereinigen und kultivieren wir die GPs aus den letzten wenigen Fraktionen, die lebensfähige GPs enthielten, und die GPs, die durch Kultivieren eines von der Säulenmatrix genommenen lnokulums erhalten worden sind. Wir wiederholen dann das Anreicherungsverfahren des Abschnitts 15.
Wenn alle SBDs eine Bindung zeigen, die besser ist als diejenige der PPBD dieser Runde, vereinigen und kultivieren wir die GPs aus der letzten Fraktion, die lebensfähige GPs enthält, und aus dem von der Säule genommenen Inokulum. Diese Population wird nochmals durch mindestens einen Durchlauf chromatographiert, um die GPs auf der Grundlage des Kd weiter zu fraktionieren.
Wenn ein RNA-Phage als GP verwendet wird, wird die RNA entweder mittels eines Helferphagen kultiviert oder revers transkribiert werden, und die DNA wird amplifiziert. Die amplifizierte DNA könnte dann sequenziert oder in geeignete Plasmide subkloniert werden.

Abschnitt 15.7: Charakterisierung der Population:

Wir charakterisieren Mitglieder der Population, die die gewünschten Bindungseigenschaften zeigt, durch genetische und biochemische Verfahren. Wir erhalten klonale Isolate und testen diese Stämme durch genetische und Affinitätsverfahren, um den Genotyp und Phänotyp hinsichtlich der Bindung an das Zielmolekül zu bestimmen. Für mehrere genetisch reine Isolate, die eine Bindung zeigen, demonstrieren wir durch Ausschneiden des osP-sbd-Gens und Überführen desselben in die parentale GP, daß die Bindung durch das artifizielle chimäre Gen verursacht wird. Wir ligieren auch das deletierte Grundgentst jeder GP, von welcher das osp-sbd entfernt wird und zeigen, daß jedes Grundgerüst alleine der GP keine Bindungsaffinität für das Zielmolekül verleihen kann. Wir sequenzieren das osp-sbd- Gen aus mehreren klonalen Isolaten.

Abschnitt 15.8: Test auf Bindungsaffinität:

Für ein oder mehrere klonale Isolate subklonieren wir das sbd-Genfragment - ohne das osp-Fragment - in einen Expressionsvektor, so daß jede SBD als freies Protein hergestellt werden kann. Jedes SBD-Protein wird durch normale Mittel, wie beispielsweise Affinitätschromatographie, gereinigt. Physikalische Messungen der Bindungsstärke werden danach für jedes freie SBD-Protein durch eines der folgenden Verfahren durchgeführt: 1) Veränderung des Stokes-Radius als Funktion der Bindung des Zielmaterials, gemessen durch Merkmale der Elution von einer Molekularsiebsäule, wie Agarose, 2) Retention radioaktiv markierter SBD an einer Zentrifugen-Affinitätssäule, an die das Zielmaterial fixiert worden ist oder 3) Retention des radioaktiv markierten Zielmaterials an einer Zentrifugen- Affinitätssäule, an die die SBD fixiert worden ist. Die Bindungsmessungen für jede freie SBD werden verglichen mit den entsprechenden Bindungsmessungen für die PPBD.
In jedem Assay messen wir das Bindungsausmaß als eine Funktion der Konzentration jedes Proteins und weitere relevante physikalische und chemische Parameter.
Zusätzlich wird die SBD mit der höchsten Affinität für das Zielmolekül aus jeder Runde verglichen mit der besten SBD der vorhergehenden Runde (IPBD der ersten Runde) und mit der IPBD hinsichtlich der Affinität für das Zielmaterial. Nachfolgende Runden der Mutagenese und Selektion-durch-Bindung erzeugen eine steigende Affinität bis die gewünschten Grade erreicht sind.
Wenn die Bindung noch nicht ausreichend ist, müssen wir entscheiden, welche Reste als nächstes zu variieren sind (siehe Abschnitt 16.0).

Abschnitt 15.9: Weitere Affinitätstrennungsmittel:

FACS kann verwendet werden, um GPs, die ein Fluoreszenz-markiertes Zielmolekül binden, mit den in Teil II bestimmten optimierten Parametern zu trennen. Wir vermeiden eine artifizielle Bindung an den Fluoreszenzmarker durch Verwendung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Farbstoffen, die so gewählt sind, daß sie strukturell unterschiedlich sind.
Die elektrophoretische Affinitätstrennung verwendet unveränderte Zielmoleküle, so daß nur andere Ionen im Puffer eine artifizielle Bindung hervorrufen können. Eine artifizielle Bindung an das Gelmaterial erzeugt eine Zurückhaltung, die unabhängig von der Feld richtung ist, und daher auf einfache Weise beseitigt werden kann. Eine variierte Population von GPs wird viele verschiedene Ladungen aufweisen.
Zuerst wird die variierte Population von GPs in einem Geel elektrophorisiert, das kein Zielmaterial enthält. Die Elektrophorese wird fortgesetzt, bis die GPs entlang der Spur verteilt sind. Die Zielmolekül-freie Spur, in welcher die anfängliche Elektrophorese durchgeführt wird, wird durch eine entfernbare Trennwand von einem Gelfeld, das Zielmaterial enthält, abgetrennt. Die Trennwand wird entfernt, und eine zweite Elektrophorese wird rechtwinklig zur ersten durchgeführt. GPs, die nicht an das Zielmolekül binden, wandern mit unveränderter Mobilität, während GPs, die das Zielmolekül binden, sich von der Mehrheit der GPs, die das Zielmolekül nicht binden, trennen. Es wird sich eine diagonale Linie nicht-bindender GPs bilden. Diese Linie wird ausgeschnitten und verworfen. Andere Teile des Geis werden aufgelöst, und die GPs werden kultiviert.

Abschnitt 16.0: Der nächste Variierungszyklus:

Welche Reste der PBD sollen in der nächsten Variierungsrunde variiert werden? Die allgemeine Regel ist, soviel der akkumulierten Information wie möglich zu konservieren. Die bereits variierten Aminosäuren sind diejenigen, die am besten bestimmt sind. Die Umgebung der anderen Reste hat sich verändert, so daß es geeignet ist, diese wieder zu variieren. Da es immer mehr Reste in der Haupt- und Sekundärgruppe gibt als gleichzeitig variiert werden können, beginnen wird durch Auswählen der Reste, die entweder niemals variiert worden sind (höchste Priorität) oder die in einem oder mehreren Zyklen nicht variiert worden sind. Wenn wir finden, daß das Variieren aller Reste außer denjenigen, die im vorhergehenden Zyklus variiert wurden, keinen ausreichend hohen Diversitätsgrad erlauben, könnten Reste, die im vorhergehenden Zyklus variiert worden sind, nochmals variiert werden. Wenn beispielsweise die Anzahl der unabhängigen Transformanten, die hergestellt werden können, und die Empfindlichkeit der Affinitätstrennung so sind, daß 7 Reste variiert werden könnten, und wenn die Haupt- und Sekundärgruppe 13 Reste enthielte, würden wir immer 7 Reste variieren, obwohl dies bedeutet, daß einige Reste zweimal in einer Gruppe variiert würden. In diesen Fällen würden wir die bereits variierten Reste auswählen, die die Aminosäuren der höchsten Häufigkeit in den verwendeten variierten Codons enthalten.
Es ist die Informationsanhäufung, durch die das Verfahren erlaubt, solche Proteinsequenzen zu selektieren, die eine Bindung zwischen der SBD und dem Zielmolekül hervorrufen. Einige Zwischenflächen zwischen Proteinen und anderen Molekülen umfassen 20 oder mehr Reste. Eine vollständige Variation der 20 Reste würde 10²&sup6; unterschiedliche Proteine erzeugen. Durch Aufteilen der Reste, die räumlich eng zusammenliegen, in überlappende Gruppen von 5 bis 7 Resten können wir eine große Oberfläche variieren, wobei wir niemals mehr als 10&sup7; bis 10&sup9; Kandidaten auf einmal testen müßten, was eine 10¹&sup9;-bis 10¹&sup7;-fache Ersparnis bedeutet.
Nachdem wir die zu variierenden Reste ausgewählt haben, setzen wir wieder den Variierungsbereich für jeden Rest gemäß den in 13.2 dargestellten Prinzipien fest, entwerfen die für die gewünschten Mutanten kodierende vgDNA (Abschnitt 13.3), klonieren die vgDNA in GPs (Abschnitt 14) und selektieren-durch-Bindung-an- Zielmolekül solche GPs, die SBDs tragen (Abschnitt 15).

Abschnitt 17.0: WEITERE BETRACHTUNGEN:

Abschnitt 17.1: Gemeinsame Selektionen:

Man kann die Affinitätstrennung des beschriebenen Verfahrens modifizieren, um ein Molekül zu selektieren, das an das Material A, jedoch nicht an das Material B bindet. Man muß zwei Selektionssäulen herstellen, eine mit Material A und die andere mit Material B. Die Population der genetischen Packungen wird durch die beschriebene Art und Weise hergestellt; bevor man jedoch die Population auf A anwendet, schickt man die Population über die B-Säule, um solche Mitglieder der Population zu entfernen, die eine hohe Affinität für B besitzen. Es kann notwendig sein, die Population, die nicht an B bindeir vor der Passage über A zu amplifizieren. Die Amplifikation wird am wahrscheinlichsten benötigt, wenn A und B auf irgendeine Weise ähnlich sind und die PPBD auf das Aufweisen einer Affinität für A selektiert worden ist.
Um beispielsweise eine SBD zu erhalten, die A, jedoch nicht B bindet, könnten drei Säulen in Reihe verbunden werden: a) Eine Säule, die irgendeine Verbindung - weder A noch B - oder nur das Matrixmaterial trägt, b) eine Säule, die B trägt und c) eine Säule, die A trägt. Eine Population von GP(vgPBD)s wird auf die Säulenreihe aufgetragen, und die Säulen werden mit dem Puffer einer konstanten Ionenstärke, der für die Applikation verwendet wird, gewaschen. Die Säulen werden entkoppelt, und die dritte Säule wird mit einem Gradienten eluiert, um GP(PBD)s zu isolieren, die A, jedoch nicht B binden.
Man kann auch Moleküle erzeugen, die sowohl an A als auch an B binden. In diesen Fällen verwenden wir ein 3D-Modell und mutieren eine Oberfläche des fraglichen Moleküls, um eine Bindung an A zu bekommen. Danach mutieren wir eine unterschiedliche Oberfläche, um eine Bindung an B zu produzieren.
Die Materialien A und B könnten Proteine sein, die sich nur an einem oder einigen wenigen Resten unterscheiden. Beispielsweise könnte A ein natürliches Protein sein, für welches das Gen kloniert worden ist, und B könnte eine Mutante von A sein, die noch die Gesamt-3D-Struktur von A aufweist. SBDs, die darauf selektiert worden sind, daß sie A, jedoch nicht B binden, müssen in der Nähe der Reste, die in B mutiert worden sind, an A binden. Wenn die Mutationen so ausgewählt hit worden sind, daß sie im aktiven Zentrum von A vorliegen (unter der Annahme, daß A ein aktives Zentrum besitzt), dann wird eine SBD, die A, jedoch nicht B bindet, an das aktive Zentrum von A binden und wahrscheinlich ein Inhibitor von A sein.
Um ein Protein zu erhalten, das sowohl an A als auch an B binden wird, können wir alternativ zuerst eine SBD erhalten, die A bindet, und eine unterschiedliche SBD, die B bindet. Wir können danach die Gene, die für diese Dom nen kodieren, kombinieren, so daß ein 2-Domänen-Einzelpolypeptid-Protein hergestellt wird. Das Fusionsprotein wird eine Affinität sowohl füra als auch für B aufweisen.
Wir können auch Bindeproteine mit einer Affinität sowohl für A als auch für B so erzeugen, daß diese Materialien um dieselbe Stelle auf dem Bindeprotein kompetieren. Wir garantieren eine Kompetition durch überlappende Stellen für A und B. Wir erzeugen erst ein Molekül, das an das Zielmaterial A bindet. Wir variieren danach eine Gruppe von Resten, die definiert sind als: a) solche Reste, die variiert wurden, um eine Bindung an A zu erhalten plus b) solche Reste, die 3D-räumlich in der Nähe der Reste der Gruppe (a) liegen, die jedoch innen liegen und so unwahrscheinlich direkt an entweder A oder B binden. Reste in der Gruppe (b) verursachen wahrscheinlich kleine Veränderungen hinsichtlich der Stellung der Reste in der Gruppe (a), so daß die Affinitäten für A und B geringfügig verändert werden. Mitglieder dieser Populationen werden auf eine Affinität für sowohl A als auch B selektiert.

Abschnitt 17.2: Selektion auf Nicht-Bindung:

Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um auf Proteine zu selektieren, die nicht an ausgewählte Zielmoleküle binden. Betrachten wir ein Protein von pharmakologischer Bedeutung, wie Streptokinase, welches antigenisch in einem unerwünschten Ausmaß ist. Wir können das pharmakologisch bedeutende Protein als IPBD und Antikörper gegen dieses als Zielmolekül nehmen. Reste auf der Oberfläche des pharmakologisch bedeutenden Proteins würden variiert werden, und die GP(PBD)s, die nicht an eine Antikörpersäule binden, würden vereinigt und kultiviert werden. Oberflächenreste können auf mehrere Weisen identifiziert werden, wie beispielsweise: a) ausgehend von der 3D-Struktur, b) ausgehend von Hydrophobizitätsbetrachtungen oder c) durch chemisches Markieren. Die 3D- Struktur des pharmakologisch bedeutenden Proteins bleibt der bevorzugte Weg, um zu variierende Reste auszuwählen, außer daß wir jetzt Reste auswählen, die in weitem Abstand voneinander liegen, so daß wir die ursprüngliche Oberfläche so wenig wie möglich unverändert lassen.
Für das Zerstören der Bindung benötigt man häufig nur die Veränderung einer einzelnen Aminosäure in der Bindungszwischenfläche. Wenn polyklonale Antikörper verwendet werden, haben wir es mit dem Problem zu tun, daß alle oder die meisten starken Epitope in einem einzelnen Molekül verändert werden müssen. Vorzugsweise würde man eine Reihe monoklonaler Antikörper oder einen engen Bereich von Antikörper-Spezies haben. Wenn wir eine Reihe von Säulen mit monoklonalen Antikörpern hätten, könnten wir eine oder mehrere Mutationen erhalten, die die Bindung an jeden monoklonalen Antikörper zerstören. Wir könnten danach einige oder alle diese Mutationen in einem Molekül kombinieren, um ein pharmakologisch bedeutendes Protein zu erzeugen, das von keinem der monoklonalen Antikörper erkannt wird. Solche Mutanten müssen getestet werden, um zu verifizieren, daß die pharmakologisch interessanten Eigenschaften nicht zu einem unakzeptablen Grad durch die Mutationen verändert worden sind.
Typischerweise besitzen polyklonale Antikörper einen weiten Bereich von Bindungskonstanten für ein Antigen. Selbst wenn wir nur polyklonale Antikörper hätten, die an das pharmakologisch bedeutende Protein binden, können wir wie folgt vorgehen. Wir konstruieren das pharmakologisch bedeutende Protein so, daß es auf der Oberfläche einer replizierbaren GP erscheint. Wir führen Mutationen in die Reste ein, die auf der Oberfläche des pharmakologisch bedeutenden Proteins liegen oder in Reste, von denen man annimmt, daß sie auf der Oberfläche des pharmakologisch bedeutenden Proteins liegen, so daß eine Populataion von GPs erhalten wird. Polyklonale Antikörper werden an eine Säule fixiert, und die Population der GPs wird bei Niedrigsalzbedingungen auf die Säule aufgetragen. Die Säule wird mit einem Salzgradienten eluiert. Die GPs, die bei der niedrigsten Salzkonzentration eluieren, sind solche, welche pharmakologisch bedeutende Proteine tragen, die in einer Weise mutiert worden sind, daß die Bindung an Antikörper die eine maximale Affinität für das pharmakologisch bedeutende Protein aufweisen, beseitigt worden ist. Die GPs, die bei der niedrigsten Salzkonzenzration eluieren, werden isoliert und kultiviert. Die isolierte SBD wird zu der PPBD für weitere Variierungsrunden, so daß die antigen ischen Determinanten nacheinander beseitigt werden.

Abschnitt 17.3: Selektion von PBDs auf Strukturbeibehaltung:

Wir können auf Insertionen oder Deletionen selektieren, die die 3D-Struktur bekannter Bindeproteine konservieren. Betrachten wir eine GP, die den BPTI auf ihrer Oberfläche exprimiert. Im bpti-osd-Genkkönnen wir die Codons für K26 und A27 durch 5 variierte Codons ersetzen (3,2 x 10&sup6;. Sequenzen). K26 und A27 liegen in einer Biegung und sind weit entfernt von der Trypsinbindungsoberfläche. Wir verwenden die Selektion-durch-Bindung, um GPs zu isolieren, die Mutanten des BPTI exprimieren, welche eine hohe spezifische Affinität für Trypsin beibehalten haben.

Abschnitt 17.4: Erzeugte Bindeproteine sind nicht einzigartig:

Für jedes Zielmolekül gibt es eine große Anzahl von SBDs, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gefunden werden können. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß irgendeine PBD in der Population an das Zielmolekül binden wird, erzeugen wir durch die Selektion-durch-Bindung eine so große Population wie es uns auf geeignete Weise möglich ist. Schlüsselfragen für die Handhabung des Verfahrens sind: "Wieviele Transformanten können wir herstellen?" und "Wie klein ist der Bestandteil, den wir durch Selektion-durch-Bindung finden können?". Genetiker finden routinemäßig Mutationen mit Häufigkeiten von einer in 10¹&sup0; unter Verwendung einfacher leistungsfähiger Selektionen. Der optimale Variierungsgrad wird bestimmt durch die maximale Anzahl an Transformanten und die Selektionsempfindlichkeit, so daß wir für jede vernünftige Empfindlichkeit ein progressives Verfahren anwenden, um eine Reihe von Proteinen mit immer höherer Affinität für das gewählte Zielmaterial zu erhalten. 1000-fache Anreicherungen durch einen einzelnen Elutionsschritt von einer Affinitätsplatte sind gezeigt worden (SMIT85).
Die Verwendung verschiedener Variationsschemas kann unterschiedliche Bindeproteine erzeugen. Eine große Anzahl von Proteinen wird an irgendein gegebenes Zielmolekül binden. Wenn sich folglich ein Bindeprotein aus irgendeinem Grund als ungeeignet erweist (z.B. zu antigenisch), kann das Verfahren mit unterschiedlichen Variationsparametern wiederholt werden. Man könnte beispielsweise unterschiedliche zu variierende Reste auswählen oder eine unterschiedliche nt-Verteilung an variierten Codons wählen, so daß eine neue Verteilung der Aminosäuren an denselben Resten getestet wird. Selbst wenn dieselbe Hauptgruppe der Reste verwendet wird, könnte man eine unterschiedliche SBD erhalten, wenn die Reihenfolge, in der man zu variierende Untergruppen auswählt, verändert.

Abschnitt 17.5: Andere Mutagenesearten sind möglich:

Die hierin diskutierten Verfahfen zur Erzeugung von Diversität in der Population sind nicht die einzig möglichen Verfahren. Jedes Mutageneseverfahren, das zumindest einen großen Teil der aus einer Selektion erhaltenen Information konserviert und danach weitere Mutationen in derselben Domäne einführt, wird funktionieren. Die limitierenden Faktoren sind die Anzahl der unabhängigen Transformanten, die hergestellt werden können, und die Anreicherungsmenge, die man durch Affinitätstrennung erreichen kann. Daher verwendet die bevorzugte Ausführungsform ein Mutageneseverfahren, das Mutationen in solchen Resten konzentriert, die am wahrscheinlichsten die Bindungseigenschaften der PBD beeinflussen und am wenigsten wahrscheinlich die zugrundeliegende Struktur der IPBD zerstören.
Andere Mutageneseverfahren könnten erlauben, andere GPs in Betracht zu ziehen. Beispielsweise ist der Bakteriophage Lambda aufgrund der sehr vielen Restriktionsstellen kein geeignetes Klonierungsvehikel für die Kassettenmutagenese. Man kann jedoch Einzelstrang-Oligo-nt-gerichtete Mutagenese ohne den Bedarf an nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen auf Lambda anwenden. Niemand hat bisher Einzelstrang-Oligo-nt-gerichtete Mutagenese verwendet, um den für die vorliegende Erfindung geforderten hohen Diversitätsgrad einzuführen; wenn dies jedoch möglich ist, würde eine solche Methode es erlauben, Phagen mit großen Genomen zu verwenden.

Beispiel 1

BPTI-abgeleitetes Bindeprotein für HHMb: präsentiert durch M13-Phagen

Nachstehend wird ein hypothetisches Beispiel eines Protokolls zum Entwickeln eines neuen vom BPTI abgeleiteten Bindemoleküls mit Affinität für Pferdeherz-Myoglobin (HHMb; Horse Heart Myoglobin) unter Verwendung des gewöhnlichen Bakteriophagen M13 von E. coli als genetische Packung vorgestellt. Es ist verständlich, daß eine gewisse weitere Optimierung gemäß den hierin dargestellten Lehren notwendig sein kann, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Mögliche Modifikationen des bevorzugten Verfahrens werden unmittelbar nach verschiedenen Schritten des hypothetischen Beispiels diskutiert.
Wir setzen hypothetisch die folgenden technischen Werte voraus:
YDQ 500 ng/Synthese von ssDNA, 100 Basen lang, 10 µg/Synthese von ssDNA, 60 Basen lang, 1 mg/Synthese von ssDNA, 20 Basen lang.
MDNA 100 Basen
Ypl 1 mg/l
Lef 0,1 % für glattes Ende-glattes Ende,
4 % für überhängendes Ende-glattes Ende,
11 % für überhängendes Ende-überhängendes Ende.
5 x 10&sup8;
Ceff 900-fache Anreicherung
Csensi 1 in 4 x 10&sup8;
Nchrom 10 Passagen
Serr 0,05

Beispiel 1, Teil I

In diesem Beispiel werden wir M13 als eine replizierbare GP und den BPTI als IPBD verwenden. In Teil I beschäftigen wir uns nur mit dem Versuch, den BPTI auf der äußeren Oberfläche eines M13-Derivats präsentiert zu bekommen. Variable DNA kann in das osp-ipbd-Gen eingeführt werden, jedoch nicht in die Region, die für die Trypsin-Bindungsregion des BPTI kodiert. Sobald der BPTI auf der M13-Oberfläche eines M13-Derivats präsentiert wird, gehen wir zu Teil II über, um die Affinitätstrennungsverfahren zu optimieren.
Für dieses Beispiel wählen wir einen filamentösen Bakteriophagen von E. coli, M13. Wir bevorzugen Phagen anstatt vegetativer Bakterienzellen, da Phagen viel weniger metabolisch aktiv sind. Wir bevqrzugen Phagen anstatt Sporen, da die molekularen Mechanismen der Virionbildung und die 3D-Struktur des Virions viel besser verstanden werden als die entsprechenden Prozesse der Sporenbildung und Sporenstrukturen.
M13 ist ein sehr gut untersuchter Bakteriophage, der vielfach für die DNA- Sequenzierung und als genetischer Vektor verwendet wird; er ist ein typisches Mitglied der Klasse filamentöser Phagen. Die relevanten Tatsachen über M13 und andere Phagen, die es uns erlauben, unter Phagen auszuwählen, werden in Abschnitt 1.3.1. zitiert.
Im Vergleich zu anderen Bakteriophagen sind filamentöse Phagen allgemein attraktiv, und M13 ist besonders attraktiv, weil:
1) die 3D-Struktur des Virions bekannt ist,
2) das Prozessieren des Hüllproteins gut verstanden wird,
3) das Genom ausdehnbar ist,
4) das Genom klein ist,
5) die Sequenz des Genoms bekannt ist,
6) das Virion physikalisch resistent gegenüber Scherung, Hitze, Kälte, Guanidinium-Cl, niedrigem pH und Hochsalz ist,
7) der Phage ein Sequenzierungsvektor ist, so daß das Sequenzieren besonders einfach ist und
8) Antibiotikumresistenzgene in das Genom mit voraussagbaren Ergebnissen kloniert worden sind (HINE80).
Andere in den Abschnitten 1.0 und 1.3 aufgstete Kriterien sind ebenso erfüllt: M13 ist auf einfache Weise kultivierbar und lagerbar (FRIT85), wobei jede infizierte Zelle 100 bis 1000 M13-Nachkommen nach einer Infektion erzeugt. M13 benötigt keine ungewöhnlichen oder teuren Medien und ist auf einfache Weise zu gewinnen und zu konzentrieren (SALI64, YAMA70, FRIT85). M13 ist stabil gegenüber physikalischen Kräften: Temperatur (10 % der Phagen übedeben 30 Minuten bei 85ºC), Scherung (Waring-Mischer tötet nicht), Austrocknung (nicht anwendbar), Bestrahlung (nicht anwendbar), Alter (mehrere Jahre stabil).
M13 ist stabil gegenüber Chemikalien: pH (< 2,2 (SMIT85)), oberflächenaktiven Mittel (nicht anwendbar), Chaotrope (Guanidinium-HCl = 6,0 M), Ionen (keine spezifischen Empfindlichkeiten), organischen Lösungsmittel (Ether und andere organische Lösungsmittel sind lethal (MARV78)), Proteasen (nicht anwendbar, HHMb ist keine Protease). Es ist nicht bekannt, daß M13 empfindlich gegenüber anderen Enzymen ist.
Das M13-Genom ist 6423 bp groß, und die Sequenz ist bekannt (SCHA78). Da das Genom klein ist, ist sowohl Kassettenmutagenese anwendbar auf RF M13 (AUSU87) als auch Einzelstrang-Oligo-nt-gerichtete Mutagenese (FRIT85). M13 ist ein Plasmid und Transformationssystem in sich selbst und ein idealer Sequenzierungsvektor. M13 kann auf Rec-Stämmen von E. coli kultiviert werden. Das M13-Genom ist ausdehnbar (MESS78, FRIT85). M13 verleiht Zellen keinen Vorteil, lysiert jedoch Zellen auch nicht. Die Sequenz des Gens VIII ist bekannt und die Aminosäuresequenz kann auf einem synthetischen Gen unter Verwendung des lacUV5-Promotors kodiert und in Verbindung mit dem Lacilq-Repressor verwendet werden. Der lacUV5-Promotor wird durch IPTG induziert. Das Gen VIII-Protein wird durch einen gut untersuchten Prozeß sezerniert und zwischen A23 und A24 gespalten. Die Reste 18, 21, 22 und 23 des Gen VIII-Proteins kontrollieren die Spaltung. Das reife Gen VIII-Protein bildet die Hülle um die zirkuläre ssDNA. Die 3D- Struktur des f1 -Virions ist in mittlerer Auflösung bekannt; der Amino-Terminus des Gen VIII-Proteins liegt auf der Oberfläche des Virions. Es ist über keine Fusionen an das Gen VIII-Protein von M13 berichtet worden. Die 2D-Struktur des Hüllproteins von M13 ist in der 3D-Struktur impliziert. Das reife Gen VIII-Protein von M13 besitzt nur eine Domäne. Es gibt vier seltenere (minor) Proteine: Gen III, VI, VII und IX. Jedes dieser selteneren Proteine ist uungefähr fünf Kopien pro Virion vorhanden und betriffi die Morphogenese oder Infektion. Das Haupt-Hüllprotein ist in mehr als 2500 Kopien pro Virion vorhanden.
Obwohl keine Berichte über Fusionen des Gens VIII von M13 an andere Gene existieren, macht die Kenntnis der 3D-Struktur des Virions (BANN810) das Anhängen der IPBD an den Amino-Terminus des reifen Hüllproteins von M13 (M13 CP Coat Protein) ziemlich attraktiv. Sollte eine direkte Fusion des BPTI an das M13 CP nicht dazu führen, daß BPTI der auf der Oberfläche von M13 präsentiert wird, so werden wir einen Teil der BPTI-Sequenz variieren und/oder kurze Sequenzen zufälliger DNA zwischen BPTI und M13 CP einbauen.
Smith (SMIT85) und de la Cruz etal. (CRUZ88) haben gezeigt, daß Insertionen in das Gen III neue Proteindomänen auf der äußeren Oberfläche des Virions erscheinen lassen. Wenn der BPTI nicht durch Fusionieren des bpti-Gens an das m13cd-Gen so hergestellt werden kann, daß er auf der äußeren Oberfläche des Virions erscheint, werden wir bpti entweder an der von Smith und von de la Cruz et al. verwendeten Stelle oder an einen der Terminifusion ieren. Wir werden eine zweite synthetische Kopie des Gens III verwenden, so daß einige unveränderte Gene III- Proteine vorhanden sein werden.
Das Gen VIII-Protein wird als OSP ausgewählt, weil es in vielen Kopien vorhanden ist und weil seine Lokalisierung und Orientierung im Virion bekannt sind. Man beachte, daß die Ungewißheit im Hinblick auf den Scheitelkreis des Hüllproteins über dessen eigener alpha-helikalen Achse unwichtig ist.
Das 3D-Modell von f1 deutet stark an, daß das Fusionieren des BPTI an den Amino- Terminus von M13 CP wahrscheinlicher ein funktionelles Protein erzeugt als irgendeine andere Fusionsstelle (siehe Abschnitt 1.3.3).
Die Aminosäuresequenz des Prä-Hüllproteins von M13 (SCHA78) - bezeichnet als AA_seq1 - ist
Der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren und der Code für mehrdeutige DNA sind international anerkannt (GEOR87). Die beste Stelle zum Inserieren einer neuen Proteindomäne in M13 CP ist hinter A23, da SP-I das Prä-Hüllprotein hinter A23 spaltet, wie durch den Pfeil angedeutet ist. Die Proteine, die sezerniert werden können, werden an den Amino-Terminus des reifen M13 CP gebunden erscheinen. Da der Amino-Terminus des reifen M13 CP auf der äußeren Oberfläche des Virions lokalisiert ist, wird die eingebrachte Domäne auf der Außenseite des Virions präsentiert werden.
Der BPTI wird als IPBD dieses Beispiels ausgewählt (siehe Abschnitt 2.1), da er alle Kriterien erfüllt oder darüber hinausgeht: Er ist ein kleines, sehr stabiles Protein mit einer gut bekannten 3D-Struktur. Marks et al. (MARK86) haben gezeigt, daß eine Fusion des phoA-Signalpeptid-Genfragments mit DNA, die für die reife Form des BPTI kodiert, nativen BPTI im Periplasma von E. coli erscheinen läßt, was anzeigt, daß es nichts in der Struktur des BPTI gibt, das verhindert, daß er sezerniert wird.
Marks et al. (MARK87) zeigten auch, daß die Struktur des BPTI selbst nach Entfernung einer der Cystin-Brücken stabil ist. Sie zeigten dies dadurch, daß sowohl C14 als auch C38 durch entweder zwei Alanine oder zwei Threonine ersetzt wurden. Die C14/C38-Cystin-Brücke, die Marks et al. entfernten, ist diejenige, die sehr nahe an der spaltbaren Bindung im BPTI liegt; überraschenderweise funktionierten beide Molekülmutanten als Trypsininhibitoren. Dies deutet an, daß der BPTI außerordentlich stabil ist und sich daher wahrscheinlich trotz zahlreicher Oberflächenmutationen in ungefähr dieselbe Struktur faltet. Unter Verwendung der Kenntnis von Homologen können wir vide infra darauf schließen, welche Reste nicht variiert werden dürfen, wenn die BPTI-Grundstruktur erhalten werden soll.
Die 3D-Struktur des BPTI ist in einer hohen Auflösung durch Röntgenstrahldiffraktion (HUBE77, MARQ83, WLOD84, WLOD87a, WLOD87b), Neutronendiffraktion (WLOD84) und durch NMR (WAGN87) bestimmt worden. In einer der Röntgenstrahlstrukturen, die in der Brookhaven-Proteindatenbank hinterlegt sind, "6PTI", war keine Elektronendichte für A58 angegeben, was andeutet, daß A58 keine eindeutig definierte Konformation besitzt. Folglich wissen wir, daß die Carboxygruppe keine essentielle Wechselwirkung in der gefalteten Struktur eingeht. Der Amino-Terminus des BPTI liegt sehr nahe am Carboxy-Terminus. Goldenberg und Creighton berichteten über zirkularisierten BPTI und zirkulär permutierten BPTI (GOLD83). Einige Proteine, die homolog zum BPTI sind, besitzen mehr oder weniger Reste an beiden Termini.
Der BPTI ist als "Wasserstoffatom der Proteinfaltung" bezeichnet worden und ist Gegenstand zahlreicher experimenteller und theoretischer Untersuchungen geworden (STAT87, SCHW87, GOLD83, CHAZ83).
Der BPTI besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß mindestens 32 homologe Proteine bekannt sind, wie in der Tabelle 13 gezeigt ist. Eine Liste ionisierbarer Gruppen ist in der Tabelle 14 gezeigt, und die Zusammensetzung der an jedem Rest vorkommenden Aminosäuretypen ist in der Tabelle 15 gezeigt.
Der BPTI ist frei löslich, und es ist nicht bekannt, daß er Metallionen bindet. Der BPTI besitzt keine bekannte enzymatische Aktivität. Der BPTI bindet an Trypsin (Kd = 6,0 x 10&supmin;¹&sup4; M (TSCH87). Der BPTI ist nicht toxisch. Wenn K15 des BPTI zu L verändert wird, erhält man keine meßbare Bindung zwischen der BPTI-Mutante und Trypsin (TSCH87).
Alle konservierten Reste sind verborgen; von den sieben vollständig konservierten Resten zeigt nur G37 eine bemerkenswerte Exponierung. Die Lösungsmittelzugänglichkeit jedes Restes im BPTI wird in der Tabelle 16 dargestellt, die errechnet wurde ausgehend vom Eintrag "6PTI" in der Brookhaven- Proteindatenbank mit einem Lösungsmittelradius von 1,4 Å, den in der Tabelle 7 gezeigten Atomradien und dem Verfahren von Lee und Richards (LEEB71). Jeder der 51 nicht-konversierten Reste kann zwei der mehrere Arten von Aminosäuren aufnehmen. Dadurch, daß nur solche Aminosäuren an jedem Rest unabhängig substituiert werden, die an diesem Rest bereits beobachtet worden sind, könnten wir ungefähr 7 x 10&sup4;² verschiedene Aminosäuresequenzen erhalten, von denen die meisten sich in Strukturen falten werden, die sehr ähnlich zu derjenigen des BPTI sind.
Der BPTI wird als eine IPBD für Makromoleküle geeignet sein (siehe Abschnitt 2.1.1). Der BPTI und BPTI-Homologe binden fest und mit hoher Spezifität an eine Anzahl von Enzymen.
Der BPTI ist außer bei sehr hohem pH stark positiv geladen, so daß er als IPBD für Zielmoleküle geeignet ist, die unter den Bedingungen der beabsichtigten Verwendung nicht so stark positiv sind (siehe Abschnitt 2.1.2). Es existieren Homologe vom BPTI, die jedoch sehr unterschiedliche Ladungen aufweisen (nämlich SCI-III von Bombyx mon mit -7 und der Trypsininhibitor aus Rindercolostrum mit -1). Sobald ein Derivat von M13 gefunden worden ist, das den BPTI auf der Oberfläche präsentiert, kann die Sequenz der BPTI-Domäne durch eine der homologen Sequenzen ersetzt werden, um saure oder neutrale IPBDs herzustellen.
Der BPTI ist kein Enzym (siehe Abschnitt 2.1.3). Der BPTI ist ziemlich klein; wenn dies ein pharmakologisches Problem verursachen sollte, können zwei oder mehrere BPTI-abgeleitete Domänen verknüpft werden wie im humanen BPTI-Homologen, welches zwei Domänen aufweist.
Ein Derivat von M13 ist der bevorzugte OCV (siehe Abschnitt 3). Ein "Phasmid" ist ein Hybrid zwischen einem Phagen und einem Plasmid und wird erfindungsgemäß verwendet. Aus Phasmid-tragenden Zellen isolierte Doppelstrang-Plasmid-DNA wird unter Verwendung der Standard konvention bezeichnet, z. B. pXY24. Aus diesen Zellen präparierte Phagen würde man als XY24 bezeichnen. Phasmide, wie Bluescript K/S (vertrieben durch Stratagene) sind nicht für unsere Zwecke geeignet, weil Bluescript nicht das vollständige Genom von M13 enthält und durch Coinfektion mit Helferphagen gerettet (rescued) werden muß. Solche Coinfektionen könnten zu einer genetischen Rekombination führen, die heterogene Phagen erzeugt, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ungeeignet sind.
Der Bakteriophage M13 bla 61 (ATCC 37039) ist durch Insertion des Beta- Lactamase-Gens von Wildtyp-M13 abgeleitet (HINE80). Dieser Phage enthält 8,13 kb DNA. M13 bla cat 1 (ATCC 37040) ist durch eine zusätzliche Insertion des Chloramphenicol-Resistenzgens von M13 bla 61 abgeleitet (HINE80); M13 bla cat 1 enthält 9,88 kb DNA. Obwohl keine von diesen Varianten des M13 den ColE1- Replikationsursprung enthält, könnten beide als Startpunkt verwendet werden, um einen für das vorliegende Beispiel verwendbaren Klonierungsvektor zu konstruieren.
Der OCV für das vorliegende Beispiel wird durch ein in der Figur 4 dargestelltes Verfahren konstruiert. Eine kurze Beschreibung aller für dieses Beispiel konstruierter Plasmide und Phasmide wird in der Tabelle 17 gefunden.
Für Einzelstrang-Oligo-nt-ortsgerichtete Mutagenese führen Mehrfach-Primer zu einer hohen Effizienz. Drei nicht-mutagene Primer werden verwendet: Basen 2326- 2352 für wtM13, Basen 4854-4875 des wtM13 und die komplementären Basen zu den Basen 3431-3451 von pBR322. Man beachte, daß pLG2 und dessen Derivate den Anti-Sinnstrang des ampR-Gens im +DNA-Strang tragen. Die Segmente werden so ausgewählt, daß sie einen hohen GC-Gehalt besitzen und das pLG7-Genom in mehrere Segmente ungefähr gleicher Länge unterteilen.
Die genetischen Manipulationsverfahren, die benötigt werden, um den OCV zu konstruieren, sind Standardverfahren unter Verwendung kommerziell erhältlicher Restriktionsenzyme und unter Anwendung der empfohlenen Bedingungen. Alle Restriktionsfragmente der DNA werden durch Elektrophorese oder HPLC gereinigt. M13 und dessen erzeugte Derivate werden in den E. coli-Stamm PE384 (F&spplus;, Rec&supmin;, Sup&spplus;, AmpS) infiziert. Plasmid-DNA der M13-Derivate wird in den E. coli Stamm PE383 (F&supmin;,Rec&supmin;,Sub&spplus;,AmpS) transformiert, so daß wir mehrfache lnfektionsrunden in der Kultur vermeiden. Die Isolierung des M13-Phagen wird durch das Verfahren von Salivar et al. durchgeführt (SALI64); die Isolierung der Replikationsform (RF) von M13 wird durch das Verfahren von Jazwinski et al. durchgeführt (JAZW73a und JAZW73b). Die Isolierung von den ColEI- Replikationursprung enthaltenden Plasmiden wird durch das Verfahren von Maniatis durchgeführt (MANI82).
Wir wählen das ampR-Gen von pBR322 als geeignetes Antibiotikumresistenzgen aus. Andere Resistenzgene, wie Kanamycin, könnten verwendet werden. Das Acc I- bis-Aat II-Fragment von pBR322 ist eine auf geeignete Weise erhältliche Quelle des anyR und des Col E1-Ursprungs.
M13mp 18 (New England Biolabs) enthält weder AatII- noch AccI-Stellen. Daher bauen wir einen Adaptor ein, der es uns erlaubt, das AatII-bis-AccI-Fragment von pBR322, das das ampR-Gen und den COlE1-Replikationsursprung trägt, in eine gewünschte Stelle des M13mp 18 einzubauen. M13mp 18 enthält einen lacUV5- Promotor und ein lacz-Gen die nicht geeignet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind. Durch Schneiden von M13mp 18 mit AvaII und Bsu36I und Verwerfen der ungefähr 600 dazwischenliegenden Basenpaare beseitigen wir alle Erkennungsstellen mehrerer Enzyme, die für die Konstruktion des bpti-Gen VIII- Gens sind.
Der folgende Adaptor wird synthetisiert,
Der hybridisierte Adaptor wird mit RF M13mp 18 ligiert, der mit sowohl AvaII als auch Bsu36I geschnitten und durch PAGE oder HPLC gereinigt worden ist. Transformierte Zellen werden mit Ampicillin auf Plasmidaufnahme selektiert. Das erhaltene Konstrukt wird pLG1 bezeichnet.
DNA von pLG1 wird mit sowohl AatII als auch AccI geschnitten. Das AatII-bis-AccI- Fragment von pBR322 wird an das Gerüst von LG1 ligiert. Das korrekte Konstrukt wird pLG2 bezeichnet.
Die AccI-Restriktionsstelle wird nicht länger für die Vektorkonstruktion benötigt. Um diese Stelle zu beseitigen, wird RF pLG2 dsDNA mit AccI geschnitten, mit Klenow- Fragment und dATP und dTTP behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und danach religiert. Der Klonierungsvektor - als pLG3 bezeichnet - ist jetzt bereit für die stufenweise Insertion des osp-ipbd-Gens.
Wir sind nun bereit, ein Gen zu entwerfen (siehe Abschnitt 4), das BPTI-Domänen veranlassen wird, auf der äußeren Oberfläche eines M13-Derivats zu erscheinen: LG7.
Um eine neue Proteindomäne zu erhalten, die an die Außenseite von M13 angeheftet ist, bauen wir hinter A23 des Prä-Hüllproteins von M13 DNA ein, die für den reifen BPTI kodiert. Der reife BPTI beginnt mit einem Argininrest, welcher geladen ist; eine Spaltung durch Signalpeptidase list in solchen Fällen normal. Signalpeptidase I (SP-I) schneidet ein chimäres Protein aus M13-Hüllprotein und BPTI hinter A23, wodurch der reife BPTI an dessen Carboxy-Erde an den Amino- Terminus von M13 CP angeheftet bleibt.
Die folgende Aminosäuresequenz - als AA_seq2 bezeichnet - wird durch Einbauen der Sequenz für reifen BPTI (unterstrichen gezeigt) unmittelbar hinter der Signalsequenz des M13-Prä-Hüllproteins (durch den Pfeil angedeutet) und vor der Sequenz für das M13 CP konstruiert.
Die Sequenznummern der Fusionsproteine beziehen sich auf die Fusion wie kodiert, wenn nichts anderes angemerkt ist. Folglich wird das Alanin, mit dem M13 CP beginnt, als "Nummer 82", "Nummer 1 von M13 CP" oder "Nummer 59 der reifen BPTI-M13 CP-Fusion" bezeichnet.
Das osp-ipbd-Gen wird durch den lacUV5-Promotor reguliert und durch den trpA- Transkriptionsterminator terminiert. Der E. coli-Wirtsstamm beherbergt das lacIq- Gen. Das osd-ipbd-Gen wird exprimiert und parallel mit dem Wildtyp-Gen VIII prozessiert. Das neue Protein, das aus an eine M13 CP-Domäne gebundenem BPTI besteht, bildet nur einen Teil der Hülle. Die Affinitätstrennung kann Phagen abtrennen, die nur 5 oder 6 Kopien eines Moleküls tragen, welches eine hohe Affinität für eine Affinitätsmatrix besitzt (SMIT85); 1 % Einbau des chimären Proteins ergibt ungefähr 30 Kopien des auf der Oberfläche exponierten Proteins. Wenn dies nicht ausreichend ist, können zusätzliche Kopien beipielsweise durch Erhohen der IPTG-Menge bereitgestellt werden.
Nach dem Modell für f1 von Marvin und Kollegen (BANN81) wurde ein die M13-Hülle umfassendes Modell und eine BPTI-Domäne, die aus dem Brookhaven- Proteindatenbankeintrag "6PTI" entnommen wurde, durch Standardmodellbauverfahren konstruiert, die sicherstellen, daß kovalente Bindungslängen und -winkel nahe an akzeptierbaren Werten sind. Das Modell zeigt, daß das Fusionsprotein in die supramolekulare Struktur auf eine stereochemisch akzeptierbare Weise passen könnte, ohne daß die innere Struktur entweder des M13 CP oder der BPTI-Domäne zerstört wird.
Die für AA_seq2 kodierende mehrdeutige DNA-Sequenz wird durch ein Computerprogramm auf Stellen untersucht, wo Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme erzeugt werden könnten, ohne daß die Aminosäuresequenz verändert wird (siehe Abschnitt 4.3). Eine Hauptenzymtabelle wird ausgehend von Katalogen der Enzymlieferanten zusammengestellt. Die Enzyme, die nicht den OCV schneiden (vorzugsweise konstruiert wie vorstehend beschrieben).
Unter Anwendung des in Abschnitt 4.3 angegebenen Verfahrens entwerfen wir ein ipbd-Gen, wie dasjenige, das in der Tabelle 25 gezeigt ist. Einige Restriktionsenzyme (z. B. Ban I oder Hph I) schneiden den OCV zu oft, so daß sie wertlos sind.
Die gesamte DNA-Sequenz der m13cd-bpti-Fusion mit Anmerkungen ist in der Tabelle 25 dargestellt, die die verwendbaren Restriktionsstellen und biologisch wichtige Merkmale, nämlich den lacUV5-Promotor, den lacO-Operator, die Shine- Dalgarno-Sequenz, die Aminosäuresequenz, die Stopp-Codons und den Transkriptionsterminator, zeigt.
Das ipbd-Gen wird unter Anwendung des in Abschnitt 5.1 beschriebenen Verfahrens in mehreren Stufen synthetisiert, wodurch dsDNA-Fragmente von 150 bis 190 Basenpaaren erzeugt werden.
Die vier Schritte (siehe Abschnitt 6.1), in denen wir synthetische Fragmente des m13cp-bpti-Gens (das osp-ipbd-Gen des vorliegenden Beispiels) in pLG3 und dessen Derivate klonieren, sind in der Figur 5 dargestellt.
Die in pLG3 einzubringende Sequenz umfaßt a) das Segment von RsrII bis AvrII (Tabelle 25), b) eine Abstandhalter (spacer)-Sequenz (gccgctcc) und c) das Segment von AsuII bis SauI. Das Segment ist 158 Basen lang und wird ausgehend von zwei kürzeren synthetischen Oligo-nts, wie in Abschnitt 5.1 der allgemeinen Beschreibung beschrieben, synthetisiert.
Die Tabelle 27 zeigt den Anti-Sinnstrang der einzubauenden Sequenz. Das in Großbuchstaben und unterstrichen gezeigte 99 Basen lange Fragment (5'- CCGTCC.... CCTTCG-3' = olig#3) wird in der standardisierten Weise synthetisiert. Auf ähnliche Weise wird das 100 Basen lange Fragment des Sinnstrangs, das in Kleinbuchstaben (5'-cgctca....aattg-3' = olig#4) gezeigt ist, synthetisiert. Nach dem Hybridisieren wird die Doppelstrangregion durch das vorstehend angegebene Verfahren mit Klenow-Fragment verlängert, um die gesamten 176 Basen doppelsträngig zu machen. Die überlappende Region ist 23 Basenpaare lang und enthält 14 CG-Paare und 9 AT-Paare. Die DNA zwischen AvrII und AsuII kodiert für nichts im endgültigen Dbd-Gen; sie ist vorhanden, damit die DNA sowohl von AvrII als auch AsuII zur gleichen Zeit im nächsten Schritt geschnitten werden kann. Acht Basen sind an der linken Seite von RsrII und neun Basen an der linken Seite von SauI (selbe Spezifität und Schnittmuster wie Bsu36I) angefügt worden. Diese Basen an den Enden sind nicht Teil des endgültigen Produkts; sie müssen vorhanden sein, damit die Restriktionsenzyme binden und die synthetische DNA schneiden können, um spezifische überhängende Enden herzusullen.
Die synthetische DNA wird sowohl mit SauI als auch RsrII geschnitten und an auf gleiche Weise geschnittene dsDNA von pLG3 ligiert. Das Konstrukt mit dem korrekten Insert wird pLG4 bezeichnet.
Der zweite Schritt der Konstruktion des OCV wird in der Tabelle 28 dargestellt. Wie bei der Konstruktion von pLG4 werden zwei Stücke einzelsträngiger DNA synthetisiert: ein 99 Basen langes Fragment des Anti-Sinnstrangs, das mit p25 endet, und ein 99 Basen langes Fragment (beginnend mit p 18). Sowohl die synthetische dsDNA als auch dsRF pLG4 DNA werden sowohl mit AvrII als auch AsuII ligiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Das dieses zweite Insert tragende Konstrukt wird pLG5 bezeichnet.
Die Konstruktion von pLG6 verläuft auf ähnliche Weise wie die Konstruktion von pLG5. Die Sequenz ist in der Tabelle 30 gezeigt. Die zwei einzeisträngigen Segmente (das eine vom mit N66 endenden Anti-Sinnstrang und das andere vom Sinnstrang, der mit der dritten Base des Codons für Y58 beginnt) werden synthetisiert, hybridisiert und mit Klenow-Fragment verlängert. Sowohl die synthetische DNA als auch RF pLG5 werden sowohl mit BssHI als auch AsuII geschnitten, gereinigt, und geeignete Stücke werden ligiert und verwendet um E. coli zu transfomieren.
Die Konstruktion von pLG7 wird in der Tabelle 32 dargestellt und verläuft auf ähnliche Weise wie die Konstruktionen von pLG4, pLG5 und pLG6. Die zwei einzelsträngigen Segmente (das eine vom Anti-Sinnstrang, der mit der ersten Base des Codons für V110 endet, und das andere beginnend mit E101) werden synthetisiert, hybridisiert und mit Klenow-Fragment verlängert. Sowohl die synthetische DNA als auch RF pLG6 werden sowohl mit Bbel als auch AusII geschnitten, gereinigt, und die geeigneten Stücke werden ligiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Das Konstrukt mit dem korrekten vierten Insert wird pLG7 bezeichnet; die Präsentation des BPTI auf der äußeren Oberfläche von LG7 wird durch die Verfahren des Abschnitts 8 verifiziert.
M13am429 ist eine Amber-Mutation von M13, die verwendet wird, um eine nichtspezifische Bindung von Phagen, die von M13 abgeleitet sind, an die Affinitätsmatrix zu vermindern. M13am429 ist durch genetische Standardverfahren (MILL72) von wtM13 abgeleitet.
Der Phage LG7 wird auf dem E. coli-Stamm PE384 in LB-Medium mit verschiedenen Konzentrationen von IPTG kultiviert, welches zu dem Medium gegeben wird, um das osp-ipbd-Gen zu induzieren. Der Phage LG7 wird von Zellen, die mit 0,0, 0,1,1,0, 10,0 oder 100,0 µm oder 1,0 mM IPTG kultiviert wurden, erhalten, durch das Verfahren von Salivar (SALI64) geerntet (siehe Abschnitt 7) und konzentriert, um durch das Verfahren von Messing (MESS83) einen Titer von 10¹² pfu/ml zu erhalten.
Das bevorzugte Verfahren zum Bestimmen, ob LG7 BPTI auf dessen Oberfläche präsentiert (siehe Abschnitt 8), ist, zu bestimmen, ob dieser Phage ein markiertes Derivat von Trypsin (trp) oder Anhydrotrypsin (AHTrp) auf einem Filter zurückhalten kann, das die Passage von ungebundenem Trp oder AHTrp erlaubt. Trypsin enthält 10 Tyrosinreste und kann durch Standardverfahren mit ¹²&sup5;I iodiert werden; wir bezeichnen das markierte Trypsin als "trp*". Markiertes Anhydrotrypsin wird als "AHTrp*" bezeichnet. Andere Markierungsarten können für trp oder AHTrp verwendet werden, z. B. Biotin oder ein Fluoreszenzmarker. AHTrp* oder trp* wird zu einer Aktivität von 0,3 µCi/µg markiert. Eine Probe von 10¹²LG7 (10 mM IPTG) wird mit 1,0 µg trp* oder AHTrp* in 1,0 ml eines Puffers aus 10 mM KCl gemischt und mit 1 mM K&sub2;HPO&sub4;KH&sub2;PO&sub4; auf pH 8,0 eingestellt. Die Mischung wird durch ein Amicon MSP1-System mit einem aufgesetzten Membranfilter geschickt, das die Passage von Proteinen, welche kleiner als Mr = 300.000 sind, erlaubt. Die Filter werden vor der Analyse in Puffer, der trp oder AHTrp enthält, getaucht. Die Filter werden zweimal mit 0,5 ml des Puffers, der trp oder AHTrp enthält, gewaschen. Die auf dem Filter zurückgehaltene Radioaktivität wird mit einem Szintillationszähler oder einer anderen geeigneten Vorrichtung quantifiziert. Wenn jedes Virion eine Kopie des BPTI präsentiert, können 0,05 µg Proteine gebunden werden, was zu 3 x 10&sup4; Zerfällen/Min ute auf dem Filter führen würde.
Eine alternative Weise, um die Presentation des BPTI auf der Oberfläche von LG7 zu quantifizieren, ist, die stöchiometrische Bindung zwischen Trypsin und dem BPTI auszunutzen, um den BPTI zu titrieren. Eine Lösung mit einem Titer von 10 pfu/ml eines Phagen ist ungefähr 1,6 x 10&supmin;&sup9; M für den Phagen, wenn jedes Virion infektiös ist. Das Verhältnis von pfu zu Gesamtphage;n: kann spektrophotometrisch mittels der molaren Extinktionskoeffizienten bei 260 nm und 280 nm, korrigiert hinsichtlich der größeren Länge von LG7 im Vergleich zu wtM13, bestimmt werden. Wenn beispielsweise 1,0 ml Lösung, die 1012 pfu des mit 1,0 mM IPTG kultivierten LG7- Phagen enthält, Trypsinlösungen bis zu 4,8 x 10&supmin;&sup7; M inhibiert, errechnen wir, daß ungefähr 300 BPTIs/GP vorhanden sind (d.h. (4,8 x 10&supmin;&sup7; Moleküle von BPTI/I)/(1,6 x 10&supmin;&sup9; Phagenil)). Die Hemmung einer spezifizierten Trypsinkonzentration wird auf einfachste Weise spektrophotometrisch mittels eines Peptid-verknüpften Farbstoffs, wie Nalpha-Benzoyl-Arg-Nan gemessen (TSCH87).
Alternativ kann die Bindung an eine Affinitätssäule vewendet werden, um die Gegenwart des BPTI auf der Oberfläche des Phagen LG7 nachzuweisen. Eine Affinitätssäule mit einem Gesamtvolumen von 2,0 ml und mit einer BioRad Affi-Gel 10( )-Matrix und 30 mg AHTrp als Affinitätsmaterial wird durch das BioRad- Verfahren hergestellt. Das Leervolumen (Vv) dieser Säule ist hypothetisch 1,0 ml. Diese Affinitätssäule wird als {AHTrp} bezeichnet.
Eine Probe von 10¹² M13am429 wird auf {AHTrp} in 1,0 ml 10 mM KCl, gepuffert auf pH 8,0 mit KH&sub2;PO&sub4;/K&sub2;HPO&sub4;, aufgetragen. Die Säule wird danach mit demselben Puffer gewaschen, bis die optische Dichte des Durchlaufs bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgeht oder 4 x Vv durch die Säule geschickt worden sind, je nachdem was zuerst erreicht wird. Proben von LG7 oder LG10 werden danach auf die abgesättigte {AHTrp}-Säule zu 10¹² pfu/ml in 1,0 ml desselben Puffers aufgetragen. Die Säule wird danach wieder mit demselben Puffer gewaschen, bis die optische Dichte des Durchlaufs bei 280 nM auf die Grundlinie zurückgeht oder 4 x Vv hindurchgeschickt worden sind, je nachdem was zuerst erreicht wird. Nach diesem Waschschritt wird ein KCl-Gradient von 10 mM bis 2 M in 3 x Vv, gepuffert mit Phosphat auf pH 8,0, über die Säule geschickt. Der erste KCl-Gradient wird gefolgt von einem KCl-Gradienten, der von 2 M bis 5 M in 3 x Vv läuft. Der zweite KCl- Gradient wird gefolgt von einem Guanidinium-Cl-Gradienten von 0,0 M bis 2,0 M in 2 x Vv in 5 M KCl und mit Phosphat auf pH 8,0 gepuffert. Fraktionen von 50 µl werden gesammelt und durch Ausplattieren von 4 µl jeder Fraktion in geeigneten Verdünnungen auf empfindliche Zellen auf Phagen untersucht. Die Retention des Phagen in der Säule wird durch Erscheinen des LG7-Phagen in Fraktionen, die deutlich später von der Säule eluieren als der Kontrollphage LG10 oder wtM13, angezeigt. Ein erfolgreiches Isolat von LG7, der den BPTI präsentiert, wird identifiziert, das bpti-Insert und die Übergänge werden sequenziert, und dieses Isolat wird für die weitere, nachstehend beschriebene Arbeit verwendet.
Wenn vgDNA verwendet wird, um eine funktionelle Fusion zwischen einer BPTI- Mutante und M13 CP (vide infra) zu erhalten, wird DNA aus einem klonalen Isolat in den Regionen sequenziert, die variiert wurden. Die willkürlichen Restriktionsstellen für verwendbare Restriktionsenzyme werden enifemt, wenn möglich durch "stilleu Codonveränderungen. Die Sequenznummern der Reste in OSP-IPBD werden durch irgendwelche Insertionen geändert werden; nachstehend werden wir jedoch Reste, die hinter Rest 23 eingebaut werden, als 23a, 23b etc. bezeichnen. Insertionen nach Rest 81 werden als 81a, 81b, etc. bezeichnet. Dies führt dazu, daß die Numerierung der Reste zwischen C5 und C55 des BPTI beibehalten werden kann. Der Rest C5 des BPTI wird in der Fusion immer als 28 bezeichnet; der Rest C55 des BPTI wird in der Fusion immer als 78 bezeichnet, und die dazwischenliegenden Reste haben konstante Nummern.
Sollte der LG7-Phage von Zellen, die mit 10 mM IPTG kultiviert worden sind, keinen BPTI auf seiner Oberfläche präsentieren, haben wir mehrere Wahlmöglichkeiten. Wir könnten versuchen, zu bestimmen, warum die Konstruktion nicht wie erwartet arbeitet. Es gibt verschiedene mögliche Fehlerarten, wie beispielsweise: a) Der BPTI wird nicht von der M13-Signalsequenz abgespalten, b) der BPTI wird von M13 CP abgespalten und c) das chimäre Protein wird hergestellt und hinter der Signalsequenz abgespalten, jedoch wird das prozessierte Protein nicht in die M13- Hülle eingelagert. Der BPTI ist aus E. coli sezerniert worden (MARK86); jedoch wurde die M13-Hüllproteinsignalsequenz nicht verwendet. Daher sind Probleme, die durch die Signalsequenz begründet sind, unwahrscheinlich, jedoch möglich. Wir könnten durch Assays, worin try* oder Antry* verwendet wird, bestimmen, ob der BPTI im Periplasma vorhanden oder an die innere Membran von LG7-infizierten Zellen gebunden war.
Proteine im Periplasma können durch Spheroplastenbildung unter Verwendung von Lysozym und EDTA in einer konzentrierten Saccharoselösung freigesetzt werden (BIRD67, MALA64). Wenn der BPTI frei im Periplasma vorlag, würde er im Überstand gefunden werden. Try* würde mit dem Überstand gemischt und über eine nicht-denaturierende Molekularsiebsäule geschickt werden, und die radioaktiven Fraktionen würden gesammelt werden. Die radioaktiven Fraktionen würden danach durch SDS-PAGE analysiert und durch Silberfärbung auf Banden der BPTI-Größe untersucht werden.
Spheroplastenbildung exponiert Proteine, die in der inneren Membran verankert sind. Spheroplasten werden mit AHTrp* gemischt und danach entweder filtriert oder zentrifugiert, um sie von ungebundenem AHTrp* zu trennen. Nach Waschen mit hypertonischem Puffer, werden die Spheroplasten auf das Ausmaß der AHTrp*- Bindung analysiert; alternativ werden die Membranproteine durch Western Blot- Analyse untersucht.
Wenn der BPTI frei im Periplasma vorliegt, würden wir erwarten, daß das chimäre Protein sowohl zwischen dem BPTI und der reifen M13-Hüllsequenz als auch zwischen dem BPTI und der Signalsequenz geschnitten wurde. In diesem Fall sollten wir den BPTI/M13 CP-Übergang durch Einbauen von vgDNA an den Codons für die Reste 78-82 der AA_seq2 verändern.
Wenn der BPTI an die innere Membran angeheftet gefunden wird, gibt es zwei wahrscheinliche Erklärungen. Die erste ist, daß das chimäre Protein hinter der Signalsequenz geschnitten, jedoch nicht in das LG7-Virion eingelagert wird; in diesem Fall würde man ebenfalls vgDNA zwischen die Reste 78 und 82 der AA_seq2 einbauen. Die alternative Hypothese ist, daß der BPTI sich falten und mit Trypsin reagieren könnte, selbst wenn die Signalsequenz nicht gespalten wird. Die N-terminale Aminosäuresequenzierung des aus dem Zellhomogenat isolierten Trypsin-bindenden Materials bestimmt, welche Prozessierung stattfindet. Wenn die Signalsequenz gespalten wird, würden wir das vorstehende Verfahren verwenden, um die Reste zwischen C78 und A82 zu variieren; nachfolgende Schritte würden Reste hinter dem Rest 81 zufügen Wenn die Signalsequenz nicht gespalten wird, würden wir die Reste zwischen 23 und 27 der AA_seq2 variieren. Nachfolgende Schritte durch dieses Verfahren würden Reste hinter 23 zufügen.
Wenn der BPTI weder im Periplasma noch an der inneren Membran gefunden wird, würden wir erwarten, daß der Fehler in der Signalsequenz oder dem Signalsequenzzum-BPTI-Übergang lag. In diesem Fall würde man die Reste zwischen 23 und 27 variieren.
Mehrere Experimente, die eine Varuerung in die bpti-Gen VIII-Fusion einführen, sind möglich, wie beispielsweise:
1) 3 variierte Codons zwischen den Resten 78 und 82 unter Verwendung von olig#12 und olig#13,
2) 3 variierte Codons zwischen den Resten 23 und 27 unter Verwendung von olig#14 und olig#15,
3) 5 variierte Codons zwischen den Resten 78 und 82 unter Verwendung von olig#13 und olig#12a,
4) 5 variierte Codons zwischen den Resten 23 und 27 unter Verwendung von olig#15 und olig#14a,
5) 7 variierte Codons zwischen den Resten 78 und 82 unter Verwendung von olig#13 und olig#12b und
6) 7 variierte Codons zwischen den Resten 23 und 27 unter Verwendung von olig#15 und olig#14b.
Um den BPTI-M13 CP-Übergang zu verändern, führen wir DNA, die in den Codons für die Reste zwischen 78 und 82 variiert ist, in die SphI- und SfiI-Stellen des pLG7 ein. Die Reste hinter dem letzten Cystein sind sowohl hinsichtlich der Zusammensetzung als auch hinsichtlich der Länge in den zum BPTI homologen Aminosäuresequenzen sehr variabel; in der Tabelle 25 sind diese Reste als G79, G80 und A81 bezeichnet. Der erste Teil des M13 CP wird als A82, E83 und G84 bezeichnet. Eines der oligo-nts olig#12, olig#12a oder olig#12b und der Primer olig#13 werden durch Standardverfahren synthetisiert. Die oligo-nts sind:
worin q eine Mischung ist aus (0,26 T, 0,18 C, 0,26 A und 0,30 G), feine Mischung ist aus (0,22 T, 0,16 C, 0,40 A und 0,22 G) und Keine Mischung aus gleichen Teilen von T und G ist. Die in Kleinbuchstaben gezeigten Basen an beiden Enden sind Platzhalter (spacer) und werden nicht in das klonierte Gen eingebaut. Der Primer ist komplementär zum 3'-Ende jedes der längeren Oligo-nts. Eines der variierten Oligonts und der Primer olig#1 3 werden in äquimolaren Mengen kombiniert und hybridisiert. Die dsDNA wird mit allen vier (nt)TPs und klenow-Fragment vervollständigt. Die entstehende dsDNA und RF pLG7 werden sowohl mit SfiI als auch SphI geschnitten, gereinigt, gemischt und ligiert. Diese Ligierungsmischung geht durch das in Abschnitt 15 beschriebene Verfahren, in welchem wir einen transformierten Klon selektieren, der AHTrp bindet, wenn er mit IPTG induziert wird.
Um den Übergang zwischen der M13-Signalsequenz und dem BPTI zu variieren, führen wir DNA, die in den Codons für die Reste zwischen 23 und 27 variiert sind, in die KpnI- und XhoI-Stellen des pLG7 ein. Die ersten drei Reste sind sehr variabel in den zum BPTI homologen Aminosäurensequenzen. Die homologen Sequenzen variieren auch in der Länge am Amino-Terminus. Eines der Oligo-nts olig#14, olig#14a oder olig#14b und der Primer olig#15 werden durch Standardverfahren synthetisiert.
worin q eine Mischung ist aus (9,26 T, 0,18 C, 0,26 A und 0,30 G), feine Mischung ist aus (0,22 T, 0,16 C, 0,40 A und 0,22 G) und k eine Mischung aus gleichen Teilen von T und G ist. Die in Kleinbuchstaben gezeigten Basen an beiden Enden sind Abstand halter (spacer). Eines der variierten Oligo-nts und der Primer werden in äquimolaren Mengen kombiniert und hybridisiert. Die dsDNA wird mit allen vier (nt)TPs und Klenow-Fragment vervollständigt. Die entstehende dsDNA und RF pLG7 werden sowohl mit KpnI als auch XhoI geschnitten, gereinigt, gemischt und ligiert. Diese Ligierungsmischung geht durch das in Abschnitt 15 beschriebene Verfahren, in welchem wir einen transformierten Klon selektieren, der AHTrp oder trp bindet, wenn er mit IPTG induziert wird.
Wenn keiner dieser Wege ein funktionierendes chimäres Protein produziert, können wir eine unterschiedliche Signalsequenz oder ein unterschiedliches OSP in M13 (z. B. das Gen III-Protein, für welches es Fusionsdaten gibt (SMIT85, CRUZ88)) oder eine andere genetische Packung ausprobieren.

Beispiel 1, Teil II

Der BPTI bindet sehr fest an Trypsin (Kd = 6,0 x 10&supmin;¹&sup4; M) und an Anhydrotrypsin, so daß diese Moleküle nicht bevorzugt für die Optimierung der Menge des auf LG7 zu präsentierenden BPTI oder der Menge des an die Säule zu fixierenden Affinitätsmoleküls sind. Tschesche et al. berichteten über die Bindung mehrerer BPTI-Derivate an verschiedene Proteasen: Dissoziationskonstanten für BPTI-Derivate, molar.
Aus dem Bericht von Tschesche et al. schließen wir, daß mit "+" markierte Molekülpaare Kds besitzen, die größer sind als 3,5 x 10&supmin;&sup6; M, und daß die mit "&supmin;" markierten Molekülpaare Kds besitzen, die viel größer als 3,5 x 10&supmin;&sup6; M sind. Aufgrund der Fülle an Daten über die Bindung des BPTI und verschiedener Mutanten an Trypsin und andere Proteasen (TSCH87) können wir auf verschiedene Weisen fortschreiten (für andere PBDs können wir zwei verschiedene monoklonale Antikörper erhalten, einen mit einer hohen Affinität mit Kd der Größenordnung 10&supmin;¹¹ Mund einen mit einer mittleren Affinität mit Kd in der Größenordnung von 10&supmin;&sup6; M). In diesem Beispiel können wir verwenden: a) die mittelmäßige Bindung zwischen dem BPTI und Elastase humaner Leukozyten (HuLE1), b) die mittelmäßig starke Bindung der Schweine-Elastase an den BPTI (V15) oder c) die Bindung des BPTI(A15) (Rest 38 im pbd-Gen) an Trypsin (schwach, jedoch nachweisbar) oder an Schweinepankreas-Elastase.
Wir vergleichen die Retention der LG7-Virions mit der Retention Wildtyp-M13 an {AHTrp}. M13-Derivate mit mehr DNA als Wildtyp-M13 besitzen entsprechend längere Virions. Folglich werden wir pLG8 erzeugen, der sich von pLG7 nur dadurch unterscheidet, daß er Stopp-Codons an den Codons 2 und 3 und ein verändertes L- Codon an Codon 7 des osp-ipbd-Gens besitzt. Die Phagen LG8 werden genauso viel DNA wie LG7 besitzen; daher ist das LGB-Virion genauso lang wie das LG7- Virion. LG8 kann jedoch den BPTI nicht auf seiner Oberfläche präsentieren.
Um die Identifizierung verschiedener M13-abgeleiteter Phagen zu beschleunigen, ersetzen wir durch Standardverfahren das amp -Gen von LGB durch das tet -Gen von pBR322. Das BSMI-bis-AatII tet -Fragment von pBR322 wird in DNA von pLGB ligiert, die mit XbaI und AatII geschnitten worden ist. Das korrekte Konstrukt mit 9,2 kb ist auf einfache Weise von pBR322 unterscheidbar und wird LG10 bezeichnet.
Der Phage LG7 wird mit verschiedenen Mengen an IPTG im Medium kultiviert und auf die vorstehend beschriebene Art und Weise geerntet. Eine Affinitätssäule mit einem Bettvolumen von 2,0 ml, die eine Menge an HuLE1 trägt, welche ausgewählt ist aus dem Bereich 0,1 mg bis 30,0 mg aufl ml BioRad Affi-Gel 10( ) oder Affi-Gel 15( ) wird {HuLE1} bezeichnet. Eine geeignete Reihe für Dichten von HuLE1 auf der Säule ist (0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 2,0 mg/ml, 8,0 mg/ml, 15,0 mg/ml und 30,0 mg/ml). Das Vv von {HuLE1} ist hypothetisch 1,0 ml. Die Elution des LG7-Phagen wird verglichen mit der Elution von LG10 an {HuLE1} mit verschiedenen Mengen an fixiertem HuLE1. Die Säulen werden auf eine standardisierte Weise eluiert:
1) 10 mM KCl, mit Phosphat auf pH 8,9 gepuffert, bis die optische Dichte bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgeht oder 4 x Vv, je nachdem, was zuerst erreicht wird,
2) ein Gradient von 10 mM bis 2 M KCl in 3 x Vv, pH mit Phosphat auf 8, gehalten,
3) ein Gradieent von 2 M bis 5 M KCl in 3 x Vv, Phosphatpuffer zu pH 8,0,
4) konstant 5 M KCl plus 0 bis 0,8 M Guanidinium-Cl in 2 2 x Vv mit Phosphatpuffer zu pH 8,0.
Die bevorzugte Induktionsmenge (IPTGoptimal) und die Menge des Affinitätsmoleküls an der Matrix (DoAMoMoptimal) sind so, daß sie den schärfsten LG7-Elutionspeak erzeugen, der im Vergleich zu LG8, der keinen BPTI trägt, eine signifikante Retardation zeigt. Hypothetisch findet die beste Trennung für die Menge an BPTI/GP statt, die hergestellt wird, wenn die Zellen mit 10,0 µM IPTG induziert werden und wenn 4,0 mg HuLE1/ml auf BioRad Affi-Gel 10( ) aufgetragen werden.
Wenn die Menge an BPTI/GP und die Menge an HuLE1/Trägervolumen optimiert worden ist, gehen wir auf die Optimierung der Elutionsrate, der Anfangsionenstärke und der Menge an GP/(Trägervolumen) über. Diese Parameter können getrennt optimiert werden.
Unter Verwendung des optimalen BPTI/GP und HuLE1/Trägervolumen messen wir das Elutionsvolumen von LG7 und LG8 für verschiedene Elutionsraten, nämlich 1, 1/2, 1/4, 1/8 und 1/16 mal die maximale Fließrate. Hypothetisch ist 1/4 der maximalen Elutionsrate besser als 1/2, jedoch 1/8 ungefähr gleich wie 1/4. Daher wird 1/4 der maximalen Elutionsrate verwendet werden.
Die Elutionsvolumina von LG7, der aus Zellen erhalten wird, die auf Medien mit 2, mM IPTG kultiviert worden sind, werden bei optimaler DoAMoM und Elutionsrate für Auftragsmengen von 10&sup9;, 10¹&sup0;, 10¹¹und 10¹² pfu gemessen. Hypothetisch überladen 10¹² pfu des reinen LG7 die Säule, und eine signifikante Phagenanzahl eluiert vor deren charakteristischer Position im KCl-Gradienten. Wir finden auch, daß 10¹¹ pfu die Säule nur leicht überladen, und daß 10¹&sup0; pfu die Säule nicht überladen. Da bei der Verwendung der Affinitätstrennung in Abschnitt 15 eine Population eine Rolle spielt, in welcher kein einziges Mitglied häufiger vorhanden ist als ein Teil in 10&supmin;&sup6;, schließen wir, daß 10¹² pfu einer variierten Population auf eine Säule mit 1,0 ml Matrixvolumen aufgetragen werden könnte, ohne daß diese hinsichtlich jeder einzelnen Spezies überladen wird. Das Überladen einer 1,0 ml-Säule durch 10¹² pfu deutet auch an, daß die Anfangssäule, die wahllos adhärierende Phagen abfängt, 5 bis 10 mal so groß wie die Säule, die das Zielmaterial trägt, sein sollte.
Die Elutionsvolumina von LG7 und LG10, die von Zellen erhalten werden, welche auf Medien mit 2,0 mM IPTG kultiviert worden sind, werden bei optimalen Bedingungen und für eine Beladung mit 10¹&sup0; pfu bei verschiedenen Anfangsionenstärken bemessen: 1,0 mM, 5,0 mM, 10,0 mM, 20,0 mM und 50,0 mM. Wir können beispielsweise finden, daß LG10 durch die Säule leicht zurückgehalten wird, wenn diese bei 1,0 mM KCl beladen wird, daß jedoch LG7 immer an seiner charakteristischen Stelle im Gradienten von der Säule kommt. Wir verwenden 10, mM als Anfangsionenstärke in allen verbleibenden Affinitätstrennungen.
Um die Empfindlichkeit der Chromatographie des Phagen, der Varianten des BPTI auf seiner Oberfläche präsentiert (Abschnitt 10.1), zu bestimmen, stellen wir künstliche Mischungen zweier nahe verwandter Phagen her, die sich nur an einem Rest in der BPTI-Domäne unterscheiden. Eine Variante des Phagen besitzt eine starke Affinität für die in diesem Schritt verwendete Säule, während der andere Phage keine Affinität für die Säule besitzt. Wir chromatographieren diese Mischungen, um zu entdecken, wie wenig Phagen, die an die Säule binden, innerhalb eines großen Überschusses an Phagen, die nicht an die Säule binden, nachgewiesen werden können.
Für diese Tests wählen wir AHTrp als AfM(BPTI). Eine Säule mit 2 ml Bettvolumen wird präpariert mit (DoAMoMoptimal mg von AHTrp)/(ml von Affi-Gel 10( )) Die Säule wird {AHTrp} bezeichnet und besitzt Vv = 1,0 ml.
Ein neuer Phage - LG9 - der BPTI(V15) als IPBD präsentiert, wird anstelle von LG7, der BPTI(K15, Wildtyp) als IPBD präsentiert, hergestellt. Der Rest 15 des BPTI ist Rest 38 des osp-ipbd-Gens. Wir führen den-Austausch K38 gegen V durch Ersetzen eines kurzen Segments des osp-ipbd-Gens zwischen ApaI & StuI ein. Das korrekte Konstrukt wird pLGg bezeichnet. Um die Unterscheidung zwischen LG7 und einem LG9-derivatisierten Phagen zu beschleunigen, ersetzen wir das amp -Gen des LG9 durch das tetR-Gen von pBR322. DNA von pBR322 zwischen BsmI (1353, glatte Enden hergestellt) und AatII (1428) wird in dsDNA von pLG9, die mit XbaI (glatte Enden hergestellt) und AatII geschnitten worden ist, ligiert. Das korrekte Konstrukt mit 9,2 kb ist auf einfache Weise von pBR322 unterscheidbar und wird als LG11 bezeichnet. DNA vom Phagen LG11 wird in der Nachbarschaft der Übergangsstelle des neu eingebauten tetR-Gens sequenziert, um das Konstrukt zu bestätigen.
LG7 und LG11 werden mit optimalem IPTG (2,0 mM) kultiviert und geerntet. Mischungen werden hergestellt in den Verhältnissen
LG7:LG11 :: 1:Vlim
worin Vlim in Faktor 10-Schritten im Bereich von 10¹&sup0; bis 10&sup5; liegt. Große Werte von Vlim werden zuerst getestet; sobald ein Vlim gefunden wird, das die Gewinnung von LG7 erlaubt, werden kleinere Werte von Vlim nicht mehr getestet.
Die Säule {AHTrp} wird zuerst durch Behandlung mit 10¹¹ Virions von M13am429 in 100 µl 10 mM KCl, mit Phosphat auf pH 8,0 gepuffert, blockiert; die Säule wird mit demselben Puffer gewaschen, bis OD&sub2;&sub6;&sub0; auf die Grundlinie zurückgeht oder 4 x Vv durch die Säule geschickt worden sind, je nachdem was zuerst erreicht wird. Eine der Mischungen aus LG7 und LG11, die 10¹² pfu in 1 ml desselben Puffers enthält, wird auf {AHTrp} aufgetragen. Die Säule wird auf eine standardisierte Weise eluiert:
1) 10 mM KCl, mit Phosphat auf pH 8,0 gepuffert, bis die optische Dichte bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgeht oder 4 x Vv, je nachdem was zuerst erreicht wird, (verwerfe Durchfluß),
2) ein Gradient von 10 mM bis 2 M KCl in 3 X Vv, pH mit Phosphat auf 8, gehalten, (30 x 100 µl-Fraktionen),
3) ein Grad ient von 2 M bis 5 M KCl in 3 x Vv, Phosphatpuffer zu pH 8,0, (30 x 100 µl-Fraktionen),
4) konstant 5 M KCl plus 0 bis 0,8 M Guanidinium-Cl in 2 x Vv, mit Phosphatpuffer zu pH 8,0, (20 x 100 µl-Fraktionen),
5) konstant 5 M KCl plus 0,8 M Guanidinium-Cl in 1,2 x Vv, mit Phosphatpuffer zu pH 8,0, (12 x 100 µl-Fraktionen).
4 µl-Proben von jeder Fraktion werden in einer geeigneten Verdünnung auf Phagenempfindlichen Sup&spplus;-Zellen ausplattiert (so daß M13am429 nicht wachsen werden wird). Eine Probe der Spulenmatrix wird ebenfalls als Inokulum für Phagenempfindliche Sup&spplus;-Zellen verwendet. Die Plaques werden aufampicillinenthaltenden LB-Agar überführt, und AmpR-Kolonien werden unter Verwendung von trp* oder AHTrp* auf die Präsentation des BPTI(K15) getestet.
Hypothetisch ist Vlim = 4,0 x 10&sup8; der größte Wert, für welchen LG7 wiedergewonnen werden kann. Folglich Csensi = 4,0 x 10&sup8;. Drei Chromatographiezyklen werden benitigt, um LG7 zu isolieren, so daß die erste Annäherung an Ceff 740 ( =exp(loge(4,0 x 10&sup8;)/3)) ist.
Wir bestimmen jetzt die Effizienz der Affinitätstrennung (Abschnitt 10.2). Dies wird durchgeführt durch: a) Herstellen von Mischungen aus LG7 und LG11 im Verhältnis 1:Q, b) Anreichern der Population hinsichtlich LG7 für einen Trennungszyklus und c) Bestimmen der Fraktion von LG7 in der letzten Phagen-enthaltenden Fraktion. Wenn Q 1,5 x 10&sup4; ist, sind 3 % der Kolonien BPTI-positiv. Wenn Q 1,5 x 10³ ist, sind 60 % der Kolonien BPTI-positiv. Also errechnen wir Ceff = 0,6 x 1,5 x 10³ = 900.
Unser hypothetischer LG7 sollte eine oder mehrere BPTI-Domänen auf jedem Virion präsentieren. Das osp-ipbd-Gen steht unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors, so daß die Expressionsraten des BPTI-M13 CP über [IPTG] manipuliert werden kann. Dieses Konstrukt kann verwendet werden, um viele verschiedene Bindeproteine zu entwickeln, die alle auf dem BPTI basieren. Die optimale Induktionsrate und die optimale Menge an AfM(PBD) (= DoAMoMoptimum = 2,0 mg/(ml des Trägermaterials)) sollten bestimmt worden sein; Zielmoleküle werden in dieser Menge durch das in Abschnitt 15.1 offenbarte Verfahren auf Säulen aufgetragen. Diese optimalen Raten/Mengen können für alle Zielmoleküle und alle Varianten des BPTI, die auf Derivaten von M13, die auf LG7 basieren, präsentiert sind, geeignet sein, jedoch können einige weitere Optimierungen nötig sein, wenn andere pH oder Temperaturwerte verwendet werden.
Weitere pbd-Genfragmente können anstelle von bpti-Geenfragmenten mit einer hohen Wahrscheinlichkeit, daß die PBD auf der Oberfläche des neuen LG7-Derivats erscheinen wird, eingesetzt werden.

Beispiel 1, Teil III

HHMb wird als typisches Proteinzielmolekül gewählt; ein anderes Protein könnte ebenso verwendet werden. HHMb erfüllt alle Kriterien für ein Zielmolekül: 1) Es ist groß genug, um an eine Affinitätsmatrix fixiert werden zu können, 2) nach dem Anheften ist es nicht reaktiv und 3) nach dem Anheften existieren genügend unveränderte Oberflächen, so daß eine spezifische Bindung durch PBDs möglich ist.
Die wichtige Information ist für HHMb bekannt: 1) HHMb ist zwischen pH 4,4 und 9,3 mindestens bis 70ºC stabil, 2) HHMb ist bis 1,6 M Guanidinium-Cl stabil, 3) der pl von HHMb ist 7,0, 4) Mr (HHMb) = 16.000, 5) HHMb benötigt Häm, 6) HHMb besitzt keine proteolytische Aktivität.
Zusätzlich ist die folgende Information über HHMb und andere Myoglobine erhältlich: 1) die Sequenz von HHMb, 2) die 3D-Struktur von Myoglobin aus Walspermien (HHMb besitzt 19 Aminosäureunterschiede; es wird allgemein angenommen, daß die 3D-Strukturen fast identisch sind), 3) es besitzt keine enzymatische Aktivität, 4) es besitzt keine Toxizität.
Wir setzen die Spezifikationen einer SBD wie folgt fest:
1) T=25ºC
2) pH = 8,0
3) Akzeptierbare lösliche Feststoffe:
A) für die Bindung:
i) Phosphat als Puffer: 0 bis 20 mM und
ii) KCl: 10 mM,
B) für die Säulenelution:
i) Phosphat als Puffer: 0 bis 30 mM,
ii) KCl: bis zu 5 M und
iii) Guanidinium-Cl: bis zu 0,8 M.
4) Akzeptierbare Kd < 1,0 x 10&sup8; M.
Wir wählen LG7 als GP(IPBD).
Die zu variierenden Reste werden zum Teil unter Verwendung interaktiver Computergraphiken, durch die Strukturen sichtbar gemacht werden können, ausgewählt. In diesem Abschnitt beziehen sich alle Restenummern auf den BPTI. Wir wählen eine Gruppe von Resten, die eine Oberfläche bilden, so aus, daß alle Reste ein Zielmolekül kontaktieren ktnnen. Die Information, die wichtig für die Auswahl der zu variierenden BPTI-Reste ist, umfaßt: 1) die 3D-Struktur, 2) die Lösungsmittelzugänglichkeit jedes Restes (LEEB71), 3) eine Zusammenstellung der Sequenzen anderer Proteine, die homolog zum BPTI sind und 4) Kenntnis der strukturellen Natur verschiedener Aminosäuretypen.
Die Tabellen 16 und 34 zeigen, welche Reste des BPTI: a) eine wesentliche Oberflächenexponierung aufweisen und b) bekanntlich andere Aminosäuren in anderen nahe verwandten Proteinen tolerieren. Wir verwenden interaktive Computergraphiken, um Gruppen von 8 bis 20 Resten auszuwählen, die exponiert und variabel sind, und zwar so, daß alle Mitglieder einer Gruppe gleichzeitig ein Molekül des Zielmaterials berühren können. Wenn der BPTI eine kleine Aminosäure an einem gegebenen Rest besitzt, kann diese Aminosäure das Zielmolekül nicht gleichzeitig mit allen anderen Resten in der Interaktionsgruppe kontaktieren, wohingegen jedoch eine größere Aminosäure einen guten Kontakt herstellen könnte. Eine geladene Aminosäure könnte die Bindung beeinflussen, ohne daß ein direkter Kontakt stattfindet. In diesen Fällen sollte der Rest mit einer Bemerkung, daß größere Reste geeignet sein könnten, mit in die Interaktionsgruppe aufgenommen werden. Auf eine ähnliche Weise können grpße Aminosäuren in der Nähe des geometrischen Zentrums der Interaktionsgruppe verhindern, daß Reste auf beiden Seiten des großen zentralen Restes gleichzeitig einen Kontakt eingehen. Wenn jedoch eine kleine Aminosäure anstelle einer großen Aminosäure eingesetzt wird, würde die Oberfläche flacher werden und die Reste auf beiden Seiten könnten gleichzeitig einen Kontakt eingehen. Ein solcher Rest sollte mit der Bemerkung, daß eine kleine Aminosäure geeignet sein kann, in die Interaktionsgruppe aufgenommen werden.
Die Tabelle 35 wurde ausgehend von Standardmodellteilen aufstellt und zelgt die maximale Spannweite zwischen Cbeta und der Spitze eines jeden Typs der Seitengruppe. Cbeta wird verwendet, weil sie starr an die Proteinhauptkette fixiert ist; die Rotation um die Calpha-Cbeta-Bindung ist der wichtigste Freiheitsgrad zum Bestimmen der Seitengruppenstellung.
Die Tabelle 34 zeigt 5 Oberflächen, die die gegebenen Kriterien erfüllen. Die erste Oberfläche umfaßt die Gruppe von Resten, die Trypsin im Komplex aus Trypsin und BPTI kontaktieren, wie im Brookhaven-Proteindatenbankeintrag "1TPA" berichtet ist. Diese Gruppe wird durch die Zahl "1" bezeichnet. Die exponierte Oberfläche der Reste in dieser Gruppe (aus Tabelle 16 entnommen) ergänzt sich auf 1148 Å² und nähert sich dem Kontaktbereich zwischen dem BPTI und Trypsin.
Andere mit 2 bis 5 bezifferte Oberflächen wurden dadurch ausgewählt, daß zuerst ein exponierter, variabler Rest und danach benachbarte Reste ausgewählt wurden, bis eine Oberfläche definiert war. Die Auswahl der in der Tabelle 34 gezeigten Gruppen von Resten ist in keiner Weise erschöpfend oder einzigartig; andere Gruppen von variablen Oberflächenresten können ebenso ausgewählt werden. Nachstehend beziehen wir uns auf K15 als Rest, der oben auf dem Molekül ist, während die Carboxy- und Amino-Termini unten sind.
Lösungsmittelzugänglichkeiten sind geeignete, leicht aufzulistende Indikatoren der Exponierung eines Restes. Lösungsmittelzugänglichkeiten müssen mit einiger Vorsicht verwendet werden; kleine Aminosäuren sind unterrepräsentiert und große Aminosäuren überrepräsentiert. Der Anwender muß beachten, wie die Lösungsmittelzugänglichkeit einer unterschiedlichen Aminosäure sein würde, wenn diese in die Struktur des BPTI eingesetzt wird.
Um eine spezifische Bindung zwischen einem Derivat des BPTI und HHMb zu erzeugen, werden wir die Reste in der Gruppe #2 variieren. Diese Gruppe umfaßt 12 Hauptreste 17(R), 19(I), 21(Y), 27(A), 28(G), 29(L), 31(Q), 32(T), 34(V), 48(A), 49(E) und 52(M) (Abschnitt 13.1.1). Keiner der Reste in der Gruppe #2 ist in dem Beispiel für Sequenzen, die in der Tabelle 34 aufgelistet sind, vollständig konserviert; folglich können wir sie mit einer hohen Wahrscheinlichkeit, daß die zugrundeliegende Struktur aufrechterhalten wird, variieren. Eine unabhängige Substitution an jedem dieser 12 Reste durch Aminosäuretypen, die an diese st beobaachtet verden, würde ungefähr 4,4 x 10&supmin;&sup6; Aminosäuresequenzen und dieselbe Anzahl an Oberflächen produzieren.
Der BPTI ist ein sehr basisches Protein. Diese Eigenschaft ist für das Isolieren und Reinigen des BPTI und dessen Homologe verwendet worden, so daß die hohe Häufigkeit von Arginin- und Lysinresten eine Besonderheit für die Isolierung bedeutet und nicht notwendigerweise für die Struktur benötigt wird. Tatsächlich enthält der SCI-III von Bombyx mon sieben saure Gruppen mehr als basische Gruppen (SASA84).
Der Rest 17 ist hochvariabel und vollständig exponiert und kann R, K, A, Y, H, F, L, M, T, G, Y, P oder S sein. Alle Aminosäuretypen werden beobachtet: große, kleine, geladene, neutrale und hydrophobe. Daß keine sauren Gruppen beobachtet werden, könnte durch eine Unausgewogenheit in der Probe begründet sein.
Der Rest 19 ist ebenfalls variabel und vollständig exponiert; er kann P, R, I, S, K, Q und L sein.
Der Rest 21 ist nicht sehr variabel; er ist F oder Y in 31 von 33 Fällen und I und W in den verbleibenden Fällen. Die Seitengruppe von Y21 füllt den Raum zwischen T32 und der Hauptkette der Reste 47 und 48. Das OH am Ende der Y-Seitengruppe ragt in das Lösungsmittel hinein. Man kann selbstverständlich die Oberfläche durch Ersetzen von Y oder F so variieren, daß die Oberfläche entweder hydrophob oder hydrophil in dieser Region ist. Es ist ebenfalls möglich, daß die anderen aromatischen Aminosäuren (nämlich H) oder die anderen hydrophoben (L, M oder V) toleriert werden könnten.
Der Rest 27 ist meistens A, jedoch werden auch S, K, L und T beobachtet. Aus strukturellen Gründen wird dieser Rest wahrscheinlich jede hydrophile Aminosäure und vielleicht sogar jede Aminosäure tolerieren.
Der Rest 28 ist G im BPTI. Dieser Rest befindet sich in einer Biegung, liegt jedoch nicht in einer Konformation vor, die für Glycin eigentümlich ist. Sechs weitere Aminosäuretypen sind an diesem Rest beobachtet worden: K, N, Q, R, H und N.
Kleine Seitengruppen an diesem Rest könnten HHMb nicht gleichzeitig mit den Resten 17 und 34 kontaktieren. Große Seitengruppen könnten mit HHMb zur selben Zeit wie die Reste 17 und 34 wechselwirken. Geladene Seitengruppen an diesem Rest könnten die Bindung von HHMb an die Oberfläche, die durch die anderen Reste der Hauptgruppe definiert ist, beeinflussen. Jede Aminosäure außer vielleicht P sollte toleriert werden.
Der Rest 29 ist hochvariabel und meistens L. Diese vollständig exponierte Position wird wahrscheinlich fast jede Aminosäure außer vielleicht P tolerieren.
Die Reste 31, 32 und 34 sind hochvariabel, exponiert und in ausgestreckter Konformationen; jede Aminosäure sollte toleriert werden.
Die Reste 48 und 49 sind ebenso hochvariabel und vollständig exponiert; jede Aminosäure sollte toleriert werden.
Der Rest 52 liegt in einer Alpha-Helix. Jede Aminosäure außer vielleicht P sollte toleriert werden.
Wir betrachten jetzt eine mögliche Variation der Sekundärgruppe (Abschnitt 13.1.2) der Reste, die sich in der Nachbarschaft der Hauptgruppe befinden. Benachbarte Reste, die in späteren Stadien variiert werden könnten, umfassen 9(P), 11(T), 15(K), 16(A), 18(I), 20(R), 22(F), 24(N), 26(K), 35(Y), 47(5), 50(D) und 53(R).
Der Rest 9 ist hochvariabel, ausgestreckt und exponiert. Der Rest 9 und die Reste 48 und 49 sind durch eine Ausbüchtung getrennt, die durch die ansteigende Kette von Rest 31 bis 34 verursacht wird. Damit der Rest 9 und die Reste 48 und 49 gleichzeitig an der Bindung teilnehmen können, muß entweder das Zielmolekül eine Einbuchtung aufweisen, in welche die Kette von 31 bis 34 paßt, oder alle drei Reste (9, 48 und 49) müssen große Aminosäuren aufweisen, die den Biegungsradius des BPTI-Derivats effektiv reduzieren.
Der Rest 11 ist hochvariabel, ausgestreckt und exponiert. Der Rest 11 ist wie der Rest 9 etwas von der durch die Hauptreste definierten Oberfläche entfernt und wird unter denselben Umständen zu der Bindung beitragen.
Der Rest 15 ist hochvariabel. Die Seitengruppe des Restes 15 weist von der durch die Gruppe #2 definierten Oberfläche weg. Veränderungen der Ladung am Rest 15 könnte die Bindungseigenschaft der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche beeinflussen.
Der Rest 16 ist variabel, weist jedoch von der durch die Hauptgruppe definierten Oberfläche weg. Veränderungen der Ladung an diesem Rest könnte die Bindungseigenschaft der durch die Gruppe #2 definierten Oberfläche beeinflussen.
Der Rest 18 ist I im BPTI. Dieser Rest befindet sich in einer ausgestreckten Konformation und ist exponiert. Fünf andere Aminosäuren sind an diesem Rest beobachtet worden: M, F, L, V und T. Nur T ist hydrophil. Die Seitengruppe weist direkt weg von der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche. Eine Substitution der geladenen Aminosäuren an diesem Rest könnte die Bindungseigenschaft der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche beeinflussen.
Der Rest 20 ist R im BPTI. Dieser Rest befindet sich in einer ausgestreckten Konformation und ist exponiert. Vier andere Aminosäuren sind an diesem Rest beobachtet worden: A, S, L und Q. Die Seitengruppe weist direkt weg von der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche. Eine Veränderung der Ladung an diesem Rest könnte die Bindungseigenschaft der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche beeinflussen.
Der Rest 22 ist nur wenig vaniiert und ist Y, F oder H in 30 von 33 Fällen. Nichtsdestoweniger sind A, N und S an diesem Rest beobachtet worden. Aminosäuren wie L, M, 1 oder Q könnten hier ausprobiert werden. Veränderungen am Rest 22 können die Mobilität des Restes 21 beeinflussen; Veränderungen der Ladung am Rest 22 könnte die Bindungseigenschaft der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche beeinflussen.
Der Rest 24 zeigt einige Variation; er kann jedoch wahrscheinlich nicht gleichzeitig mit allen Resten in der Hauptgruppe mit einem Zielmolekül wechselwirken. Eine Veränderung der Ladung an diesem Rest könnte eine Wirkung auf die Bindungseigenschaft der durch die Hauptgruppe definierten Oberfläche ausüben.
Der Rest 26 ist hochvariiert und exponiert. Veränderungen der Ladung können die Bindungseigenschaft der durch die Restegruppe #2 definierten Oberfläche beeinflussen; Substitutionen können die Mobilität des Restes 27, der sich in der Hauptgruppe befindet, beeinflussen.
Der Rest 25 ist meistens Y, W ist beobachtet worden.
Die Seitengruppe von 35 ist verborgen, jedoch könnte die Substitution von F oder W die Mobilität des Restes 34 beeinflussen.
Der Rest 47 ist immer T oder S in der verwendeten Sequenzprobe. Das Ogamma akzeptiert wahrscheinlich eine Wasserstoffömdung vom NH des Restes 50 in der Alpha-Helix. Nichtsdestoweniger gibt es keinen einschlägigen sterischen Grund, andere Aminosäuretypen an diesem Rest auszuschließen. Insbesondere können andere Aminosäuren, deren Seitengruppen Wasserstoffbindungen akzeptieren können, nämlich N, D, Q und E hier akzeptierbar sein.
Der Rest 50 ist oft eine saure Aminosäure, jedoch sind andere Aminosäuren möglich.
Der Rest 53 ist oft R, jedoch sind andere Aminosäuren an diesem Rest beobachtet worden. Änderungen der Ladung können die Bindung an die Aminosäuren in der lnteraktionsgruppe #2 beeinflussen.
Den veröffentlichten Modellen (HUBE77, WLOD84) kann man entnehmen, daß R39 auf der entgegengesetzten Seite des BPTI betrachtet von der durch die Reste in der Gruppe #2 definierten Oberfläche gelegen ist. Daher wird eine Variation am Rest 39, die zur gleichen Zeit wie die Variation einiger Reste in der Gruppe #2 vorgenommen wird, die Bindung, die entlang der Oberfläche #2 stattfindet, viel weniger wahrscheinlich verbessern als eine Variation anderer Reste in der Gruppe #2.
Zusätzlich zu den 12 Hauptresten und 13 Sekundärresten gibt es zwei weitere Reste, 30(C) und 33(F), die die Oberfläche #2 beeinflussen und die wahrscheinlich nicht variiert werden, zumindest nicht bis zu einem späten Verfahrensstadium. Die Seitengruppen dieser Reste liegen innerhalb vom BPTI verborgen und sind konserviert. Das Verändern dieser Reste verändert die Oberfläche keineswegs soviel wie die Veränderung der Reste in der Hauptgruppe. Diese verborgenen, konservierten Reste tragen jedoch zum Oberflächenbereich der Oberfläche #2 bei. Die Oberfläche der Restegruppe #2 ist vergleichbar mit der Fläche der Trypsinbindenden Oberfläche. Die Hauptreste 17, 19, 21, 27, 28, 29, 31, 32, 34, 48, 49 und 52 besitzen eine vereinigte Lösungsmittel-zugängliche Fläche von 946,9 Å². Die Sekundärreste 9, 11, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 35, 47, 50 und 53 besitzen eine vereinigte Oberfläche von 1041,7 Å². Die Reste 30 und 33 besitzen eine exponierte Oberfläche von insgesamt 38,2 Å². Folglich beträgt die vereinigte Oberfläche der drei Gruppen 2026,8 Å².
Der Rest 30 ist C im BPTI und in allen homologen Sequenzen konserviert. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß C14/C38 in allen natürlichen Sequenzen konserviert ist, obwohl Marks et al. (MARK87) zeigten, daß das Austauschen von sowohl C14 als auch C38 gegen NA oder T/T einen funktionellen Trypsininhibitor ergibt. Daher ist es möglich, daß BPTI-ähnliche Moleküle sich falten werden, wenn C30 ersetzt wird.
Der Rest 33 ist F im BPTI und in allen homologen Sequenzen. Eine visuelle Betrachtung der BPTI-Struktur deutet an, daß die Substitution durch Y, M, H oder L toleriert werden könnte.
Unter der Annahme unserer hypothetischen Affinitätstrennungsempfindlichkeit, Csensi, entscheiden wir, sechs Reste zu variieren, was einigen Spielraum für Fehler in der tatsächlichen Basenzusammensetzung variierter Basen offenläßt. Um eine maximale Erkennung zu erhalten, wählen wir Reste aus der Hauptgruppe, die so weit wie möglich voneinander enifemt sind. Die Tabelle 36 zeigt die Abstände zwischen den Beta-Kohlenstoffen der Reste in der Haupt- und Periphärgruppe. R17 und V34 liegen an einem Ende der Hauptoberfläche. Die Reste A27, G28, L29, A48, E49 und M52 liegen am anderen Ende, ungefähr 20 Å entfernt; von diesen werden wir die Reste 17, 27, 29, 34 und 48 variieren. Die Reste 28, 49 und 52 werden in späteren Runden variiert.
Von den verbleibenden Hauptresten wird 21 für spätere Variationen gelassen. Unter den Resten 19, 31 und 32 wählen wir willkürlich 19 für die Variation aus.
Eine unbegrenzte Variation der sechs Reste führt zu 6,4 x 10&sup7; Aminosäuresequenzen. Hypothetisch ist Csensi 1 in 4 x 10&sup8;. Die Tabelle 37 zeigt die programmierte Varuerung an den gewählten Resten. Die parentale Sequenz ist als 1 Teil in 5,5 x 10&sup7; vorhanden, jedoch sind die am wenigsten favorisierten Sequenzen nur zu 1 Teil in 4,2 x 10&sup9; vorhanden. Unter den Einzel-Aminosäure-Substitutionen ausgehend von der PPBD ist F17-I19-A27-L29-V34-A48 am wenigsten favorisiert und besitzt eine berechnete Häufigkeit von 1 Teil in 1,6 x 10&sup8;. Unter Verwendung des optimalen qfk-Codons können wir die parentale Sequenz und alle Ein-Aminosäure- Substitutionen an der PPBD wiedergewinnen, wenn die tatsächlichen nt- Zusammensetzungen in einen Bereich innerhalb 5 % der programmierten Zusammensetzungen kommen. Die Anzahl der Transformanten ist Mntv = 1,0 x 10&sup9; (ebenfalls hypothetisch); folglich werden wir die meisten der programmierten Sequenzen herstellen.
Die vorstehenden Restenummern beziehen sich auf den reifen BPTI. Da sich die Tabelle 25 auf das Prä-MI 3CP-BPTI-Protein bezieht, sind alle Nummern der reifen BPTI-Sequenz durch die Länge der Signalsequenz, 23, erhöht worden. Folglich wünschen wir, die Reste 40, 42, 50, 52, 57 und 71 zu variieren. Eine DNA- Subsequenz, die alle diese Codons enthält, wird zwischen den (ApaI)-Stellen an der Base 191 und der Sphl-Stelle ander Base 309 des osp-pbd-Gens gefunden. Unter ApaI DraII und PssI ist ApaI bevorzugt, da dieses sechs Basen ohne jegliche Zweideutigkeit erkennt und weniger Sequenzen in der vg DNA schneiden wird. Ungewünschte Restriktionsstellen können in einigen Fällen durch Verwendung der Codonmehrdeutigkeit verhindert werden: die Veränderungen des Codons für G51 von GGC zu GGT verhindert, daß eine ApaI-Stelle an den Codons 50, 51 und 6=52 erzeugt wird.
Jedes zu synthetisierende Stück der dsDNA muß sechs bis acht Basen an beiden Enden angefügt enthalten, damit mit den Restriktionsenzymen geschnitten werden kann, und wird in der Tabelle 37 gezeigt. Die erste synthetische Base (vor dem Schneiden mit ApaI und SphI) ist 184 und die letzte 322. 142 Basen sind zu synthetisieren. Das Zentrum des zu synthetisierenden Stückes liegt zwischen Q54 und V57. Die Überlappung darf keine variierten Basen einschließen, so daß wir die Basen 245 bis 256 als Überlappung wählen, die somit 12 Basen lang ist. Man beachte, daß das Codon für F56 in TTC geändert worden ist, um den GC-Gehalt der Überlappung zu erhöhen. Die Aminosäuren, die verändert werden, sind als X markiert mit einem Plus-Zeichen daniber. Die Codons 57 und 71 werden auf dem Sinn- (unteren) Strang synthetisiert. Der Entwurffordert "qfk" im Anti-Sinnstrang, so daß der Sinnstrang (von 5' zu 3') a) gleiche Teile C und A (d.h. das Komplementäre zu k), b) (0,40 T, 0,22 A, 0,22 C und 0,16 G) (d.h. das Komplementäre zu f) und c) (0,26 T, 0,26 A, 0,30 C und 0,18 G) enthält.
Jeder Rest, der durch "qfk" kodiert ist, besitzt 21 mögliche Ergebnisse, jede der Aminosäuren plus Stopp. Die Tabelle 12 zeigt die Verteilung der durch "qfk" kodierten Aminosäuren bei der Annahme von 5% Fehlern. Die Häufigkeit der parentalen Sequenz ist das Produkt der Häufigkeiten von R x I x A x L x V x A. Die Häufigkeit der am wenigsten favorisierten Sequenz ist 1 in 4,2 x 10&sup9;.
Olig#27 und olig#28 werden hybridisiert und mit Klenow-Fragment und allen vier (nt)TPs verlängert. Sowohl die synthetische dsDNA als auch RF pLG7 DNA werden mit sowohl ApaI als auch SdhI geschnitten. Die geschnittene DNA wird gereinigt, und geeignete Stücke werden ligiert (siehe Abschnitt 14.1) und verwendet, um kompetente PE383 zu transformieren (Abschnitt 14.2). Um eine ausreichende Anzahl von Transformanten zu erzeugen, beginnen wir mit 5,0 l Zellen.
1) Kultiviere E. coli in 5,0 l LB-Medium bei 37ºC bis die Zelldichte 5 x 10&sup7; bis 7 x 10&sup7; Zellen/ml erreicht,
2) kühle für 65 Minuten auf Eis ab, zentrifugiere die Zellsuspension bei 4000 g für 5 Minuten bei 4ºC,
3) verwerfe den Überstand; resuspendiere die Zellen in 1667 ml einer eiskalten, sterilen Lösung von 60 mM CaCl&sub2;,
4) kühle für 15 Minuten auf Eis ab und zentrifugierte danach bei 4000 g für 5 Minuten bei 4ºC,
5) resuspendiere die Zellen in 2 x 400 ml eiskaltem, sterilem 60 mM CaCl&sub2;; lagere die Zellen bei 4ºC für 24 Stunden,
6) füge DNA (100 µg) in 20 ml Ligierungs- oder TE-Puffer zu, mische, inkubiere für Minuten auf Eis,
7) verteile in 200 µl-Aliquots und setze die Zellen einem Hitzeschock bei 42ºC für 20 Sekunden aus,
8) füge 200 ml LB-Medium zu und inkubiere bei 37ºC für 1 Stunde,
9) gebe die Kultur zu 2,0 l LB-Medium, enthaltend Ampicillin zu 35-100 µg/ml und kultiviere über Nacht bei 37ºC,
10) entferne nach 6 Stunden 200 ml und plattiere 0,5 ml-Portionen mit JM 107 in der Log-Phase auf LB-Agar aus, verwende die Soft-Agar- Überschichtungstechnik. Phagen werden aus dem Soft-Agar präpariert,
11) zentrifugiere die Übernacht-Kultur, um die Zellen zu entfernen, und pelletiere die Phagen (MESS83),
12) gewinne Virions durch das Verfahren von Salivar et al. (SALI64).
Es ist wichtig: a) sämtliche oder fast die gesamte synthetisierte vgDNA in der Ligierung zu verwenden, b) sämtliche oder fast die gesamte Ligierungsmischung zu verwenden, um Zellen zu transformieren und c) sämtliche oder fast alle Transformanten zu kultivieren. Diese Maßnahmen sind darauf gerichtet, die Diversität aufrechtzuerhalten.
Es ist wichtig, die Virions auf eine Weise zu sammeln, die sämtliche oder fast alle Transformanten vereinigt. Da F&supmin;-Zellen für die Transformation verwendet werden, stellen mehrfache Infektionen kein Problem für die Übernacht-Phagenproduktion dar. F'-Zellen werden für die Phagenproduktion im Agar verwendet.
HHMb besitzt einen pl von 7,0, und wir führen die Chromatographie bei pH 8, durch, so daß HHMb leicht negativ ist, während der BPTI und die meisten seiner Mutanten positiv sind. HHMb wird an eine 2,0 ml-Säule von Affi-Gel 10( ) oder Affi- Gell 15( ) zu 4,0 mg/ml Trägermatrix - derselben Dichte, die optimal für eine trp- tragende Säule ist - fixiert.
Um BPTI-Varianten mit starker unspezifischer Bindung an irgendwelche Proteine oder an die Trägermatrix zu entfernen (Abschnitt 15.2), schicken wir die variierte Population von Virions über eine Säule, die Rinderserumalbumin (BSA) trägt, bevor die Population auf die {HHMb}-Säule aufgetragen wird. Affi-Gel 10( ) oder Affi-Gel 15( ) wird verwendet, um BSA in der größten Menge, die die Matrix tragen kann, zu immobilisieren. Eine 10,0 ml-Säule wird mit 5,0 ml Affi-Gel-verknüpftes-BSA beladen; diese Säule - als {BSA} bezeichnet - hat Vv = 5,0 ml. Die variierte Population von Virions, die 1012 pfu in 1 ml (0,2 x Vv) Puffer mit 10 mM KCl, 1 mM Phosphat, pH 8,0, enthält, wird auf {BSA} aufgetragen. Wir waschen {BSA} mit 4,5 ml (0,9 x Vv) Puffer mit 50 mM KCl, 1 mM Phosphat, pH 8,0. Der Waschschritt mit 50 mM Salz wird Virions eluieren, die schwach an BSA adhärieren, jedoch nicht Virions mit starker Bindung. Der vereinigte Durchfluß der {BSA}-Säule hat ein Volumen von 5,5 ml mit ungefähr 13 mM KCl.
Die Säule {HHMb} wird zuerst durch Behandlung mit 10¹¹ Virions von M13(am429) in 100 µl 10 mM KCl, mit Phosphat auf pH 8,0 gepuffert, abgesättigt; die Säule wird mit demselben Puffer gewaschen, bis OD&sub2;&sub6;&sub0; auf die Grundlinie zurückgeht oder 2 x Vv durch die Säule geschickt worden sind, je nachdem was zuerst erreicht wird. Der vereinigte Durchfluß von {BSA} wird zu {HHMb} in 5,5 ml Puffer mit 13 mM KCl, 1 mM Phosphat, pH 8,0, gegeben. Die Säule wird auf die folgende Weise eluiert (Abschnitt 15.3):
1) 10 mM KCl, mit Phosphat auf pH 8,0 gepuffert, bis die optische Dichte bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgeht oder 2 x Vv, je nachdem was zuerst erreicht ist, (Durchfluß wird verworfen),
2) ein Gradient von 10 mM bis 2 M KCl in 3 x Vv, mit Phosphat auf 8,0 gehalten, (30 x 100 µl-Fraktionen),
3) ein Gradient von 2 M bis 5 M KCl in 3 x Vv, Phosphatpuffer zu pH 8,0, (30 x 100 ml-Fraktionen),
4) konstant 5 M KCl plus 0 bis 0,8 M Guanidinium-Cl in 2 x Vv, mit Phosphatpuffer zu pH 8,0, (20 x 100 µl-Fraktionen) und
5) konstant 5 M KCl plus 0,8 M Guanidinium-Cl in 1 x Vv, mit Phosphatpuffer zu pH 8,0, (10 x 100 µl-Fraktionen).
Zusätzlich zu den Elutionsfraktionen wird eine Probe von der Säule entfernt und als Inokulum für Phagen-empfindliche Sub&spplus;-Zellen verwendet. Eine 4 µl-Probe von jeder Fraktion wird auf Phagen-empfindliche Sup&spplus;-Zellen ausplattiert. Fraktionen, die zu viele zu zählende Kolonien ergeben, werden in niedrigerer Verdünnung nochmals ausplattiert. Ein ungefährer Titer jeder Fraktion wird berechnet. Beginnend mit der letzten Fraktion und sich vorarbeitend zu der ersten Fraktion, deren Titer bestimmt wurde, vereinigen wir die Fraktionen, bis ungefähr 10&sup9; Phagen in dem Pool sind, d. h. ungefähr 1 Teil in 1000 auf die Säule aufgetragenen Phagen. Diese Population wird in 3 x 10¹¹ Phagen-empflindliche PE384 in 300 ml LB-Medium infiziert. Die niedrige lnfektionsmenge wird gewählt, um die Möglichkeit von mehrfachen Infektionen zu vermindern. Nach 30 Minuten sind lebensfähige Phagen in die Empfängerzellen eingedrungen, haben jedoch noch nicht begonnen, neue Phagen zu produzieren. Phagen-getragene Gene werden in dieser Phase exprimiert, und wir können Ampicillin zugeben, welches uninfizierte Zellen töten wird. Diese Zellen tragen noch F-pili und werden Phagen absorbieren, was hilft, Mehrfachinfektionen zu verhindern.
Wenn eine Mehrfachinfektion ein Problem darstellen sollte, das nicht durch Kultivieren zu niedriger "multiple-of-infection" auf F&spplus;-Zellen gelöst werden kann, kann das folgende Verfahren verwendet werden, um das Problem zu beseitigen. Ausgehend von der Affinitätstrennung erhaltene Virions werden in F&spplus;-E. coli infiziert und kultiviert, damit die genetischen Botschaften amplifiziert werden (Abschnitt 15.5). CCC-DNA wird entweder durch Gewinnen von RF DNA oder durch in vitro- Verlängerung von Primer, die an Phagen-ssDNA hybridisiert wurden, erhalten. Die CCC-DNA wird verwendet, um F&supmin;-Zellen in einem hohen Verhältnis von Zellen zu DNA zu transformieren. Auf diese Weise erhaltene, einzelne Virions sollten Proteine tragen, die nur durch die darin befindliche DNA kodiert sind.
Die Variierung führt zu ungefähr 6,4 x 10&sup7; verschiedenen Aminosäuresequenzen. Ceff ist 900. Folglich beträgt nach zwei Trennungszyklen die Wahrscheinlichkeit, eine einzelne SBD zu isolieren, weniger als 0,10; nach drei Zyklen steigt die Wahrscheinlichkeit über 0,10.
Die Phasmid-Population wird kultiviert und dreimal chromatographiert und danach auf SBDs hin untersucht (Abschnitt 15.7). Bei jedem Trennungszyklus werden Phagen aus den drei letzten Fraktionen, die lebensfähige Phagen enthalten, vereinigt mit Phagen, die durch Enifernen von etwas Trägermatrix als Inokulum erhalten wurden. Bei jedem Zyklus werden ungefähr 10¹² Phagen auf die Säule geladen, und ungefähr 10&sup9; Phagen werden für den nächsten Trennungszyklus kultiviert. Nach dem dritten Trennungszyklus werden 32 Kolonien aus der letzten Fraktion, die lebensfähige Phagen enthielt, ausgewählt; Phagen aus diesen Kolonien werden bezeichnet als SBD1, SBD2,..., und SBD32.
Jede der SBDs wird kultiviert und auf eine Retention an einer HHMb-tragenden Pep- Tie-Säule getestet (Abschnitt 15.8). Der Phage LG7 (SBD11) zeigt die größte Retention an der Pep-Tie {HHMb}-Säule und eluiert bei 367 mM KCl, während wtM13 bei 20 mM KCl eluiert. SBD11 wird zur parentalen Aminosäuresequenz des zweiten Variierungszyklus.
Das Ergebnis dieses hypothetischen Experiments ist in der Tabelle 38 gezeigt. R40 wurde verändert in D, I42 wurde verändert in Q, A50 wurde verändert in E, L52 blieb L und A71 wurde verändert in W.
Die nächste Variierungsrunde (Abschnitt 16) ist in der Tabelle 39 dargestellt. Die zu variierenden Reste werden ausgewählt durch: a) Auswählen einiger Reste in der Hauptgruppe, die in der ersten Runde nicht variiert wurden (nämlich die Reste 42, 44, 51, 54, 55, 72 oder 75 der Fusion) und b) Auswählen einiger Reste in der Sekundärgruppe. Die Reste 51, 54, 55 und 72 werden durch alle 20 Aminosäuren und unvermeidbar Stopp variiert. Der Rest 44 wird nur variiert zwichen Y und F. Einige Reste in der Sekundärgruppe werden durch einen beschränkten Bereich hindurch variiert; primär, um verschiedene Ladungen (+, 0, -) erscheinen zu lassen. Der Rest 38 wird variiert durch K, R, E oder G. Der Rest 41 wird variiert durch I, V, K oder E. Der Rest 43 wird variiert durch R, S, G, N, K, D, E, T oder A.
Olig#29 und olig#30 werden synthetisiert, hybridisiert, verlängert und in pLG7 an den ApaI/SphI-Stellen kloniert. Die Ligierungsmischung wird verwendet, um 5 l kompetente PE383-Zellen so zu transformieren, daß 10&sup9; Transformanten erhalten werden. Eine neue {HHMb} wird unter Verwendung derselben Trägermatrix, wie diejenige, die in Runde 1 verwendet wurde, präpariert. Eine Probe von 10¹² des geernteten LG7 wird auf die {HHMb} aufgetragen und affinitätsgetrennt. Die letzten 10&sup9; Phagen, die von der Säule kommen, und ein Inokulum werden vereinigt und kultiviert. Die kultivierten Phasmide werden nochmals in 3 Trennungszyklen chromatographiert. 32 klonale Isolate (bezeichnet als SBD11-1, SBD11-2, ..., SBD11-32) werden aus dem Durchfluß der drei Trennungszyklen erhalten und auf die Bindung an eine Pep-Tie {HHMb}-Säule getestet. Von dieser Reihe zeigt SBD11- 23 die stärkste Retention an der Pep-Tie {HHMb}-Säule und eluiert bei 692 mM KCl.
Die Ergebnisse dieser hypothetischen Selektion sind in der Tabelle 40 gezeigt. Der Rest 38 (K15 des BPTI) wurde zu E verändert, 41 wird V, 43 wird N, 44 wird F, 51 wird F, 54 wird S, 55 wird A und 72 wird Q.
Der sbd11-23-Anteil des osp-pbd-Gens wird in einen Expressionsvektor kloniert, und der BPTI (E15, D17, V18, Q19, N20, F21, E27, F28, L29, S31, A32, S34, W71, Q72) wird im Periplasma exprimiert. Dieses Protein wird durch Standardverfahren isoliert und dessen Bindung an HHMb wird getestet. Es wird gefunden, daß Kd 4,5 x 10&supmin;&sup7; M ist.
Eine dritte Variierungsrunde unter Verwendung von SBD11-23 als PPBD ist in Tabelle 41 dargestellt; acht Aminosäuren werden variiert. Diejenigen in der Hauptgruppe - Reste 40, 55 und 57 - werden durch alle zwanzig Aminosäuren variiert. Der Rest 32 wird variiert durch P, Q, T, K, A oder E.
Der Rest 34 wird variiert durch T, P, Q, K, A oder E.
Der Rest 44 wird variiert durch F, L, Y, C, W oder Stopp.
Der Rest 50 wird variiert durch E, K oder Q.
Der Rest 52 wird variiert durch L, F, I, M oder V.
Das Ergebnis dieser Vanierung ist in der Tabelle 42 gezeigt. Die selektierte SBD wird SBD11-23-5 bezeichnet und eluiert von einer Pep-Tie {HHMb}-Säule bei 980 mM KCl. Das sbd11-23-5-Segment wird in einen Expressionsvektor kloniert, und der BPTI (E9, Q11, E15, A17, V18, Q19, N20, W21, Q27, F28, M29, S31, L32, H34, W71, Q72) wird produziert. Dieses Mal ist Kd 7,3 x 10&supmin;&sup9; M.
Dieses Beispiel ist hypothetisch. Es wird vorweggenommen, daß mehrere Variierungszyklen benötigt werden, um Dissoziationskonstanten von 10&supmin;&sup8; M zu erreichen. Es ist auch möglich, daß mehr als drei Trennungszyklen bei einigen Variierungszyklen benötigt werden. Tatsächliche DNA-Chemie und DNA- Synthesegeräte können größere Fehler aufweisen als unsere hypothetischen 5 %. Wenn Serr > 0,05, können wir nicht auf einmal 6 Reste variieren. Eine Variation von 5 Resten auf einmal ist sicherlich möglich.

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Höchstwert ist der Wert von n mit der höchsten Wahrscheinlichkeit Tabelle 9: Bestes vgCodon Tabelle 10: Häufigkeiten, erhalten ausgehend vom optimalen vgCodon
Verhältnis = Abun(W)/Abun(S) = 0.4074
lfaa = am wenigsten favorisierte Aminosäure
mfaa = am meisten favorisierte Aminosäure Tabelle 11: Berechne das schlechteste Codon Tabelle 11, Fortsetzung Tabelle 11, Fortsetzung Tabelle 12: Häufigkeiten, erhalten unter Verwendung des optimalen vgCodons unter der Annahme von 5% Fehlern
Verhältnis = Abun(F)/Abun(R) = 0.3248 Tabelle 13: BPTI-Homologe Tabelle 13, Fortsetzung
R # Restenummer
1 BPTI
2 manipulierter BPTI aus Mark 87
3 manipulierter BPTI aus Mark87
4 Riner-Colostrum (DUFT85)
5 Rinderserum (DUFT85)
6 Halbsynthetischer BPTI, TSCH87
7 Halbsynthetischer BPTI, TSCH87
8 Halbsynthetischer BPTI, TSCH87
9 Halbsynthetischer BPTI, TSCH87
10 Halbsynthetischer BPTI, TSCH87
11 manipulierter BPTI, TSCH87
12 Dendroaspis polylepis polylepsis (schwarze Mamba) Gift I (DUFT85)
13 Dendroaspis polylepis polylepis (schwarze mamba) Gift K (DUFT85)
14 Hemachatus hemachates (Ringhals-Kobra) HHV II (DUFT85)
15 Naja nivea (Cape-Kobra) NNV II (DUFT85)
16 Vipera russelli (Russel's Viper) RVV II (TAKA74)
17 Eiweiß Rotes Meer-Schildkröte (DUFT85)
18 Schneckenschleim (Helix Pomanis) (WAGN78)
19 Dendroaspis angusticeps (asiatische grüne Mamba)
C13 S1 C3 Toxin (DUFT85) Tabelle 13, Fortsetzung Tabelle 13, Fortsetzung
Anmerkungen:
a) beide beta-Bungarotoxine weisen den Rest 15 deletiert auf.
b) B. mori weist einen zusätzlichen Rest zwischen C5 und C14 auf; wir haben F und G dem Rest 9 zugeordnet.
c) alle natürlichen Proteine weisen C bei 5, 14, 30, 38, 50 & 55 auf.
d) alle Homologen weisen F33 und G37 auf.
e) zusätzliche C's in Bungarotoxinen bilden Zwischenketten-Cystin-Brücken. Tabelle 14: Zählung der ijonisierbaren Gruppen. BPTI-Homologe.
Sequenzen dargestellt in Tabelle 10
+ ist die Summe aus K+R+NH -D - CO2, ungefähre Ladung auf dem Molekül bei pH 7.0
# ist die Summe aus K+R+NH +D + E + CO2, d.h. Anzahl der ionisierten Gruppen bei pH 7.0 Tabelle 15: Aminosäuren, die an jedem Rest beobachtet werden BPTI-Homologe Tabelle 15: Fortsetzung. Tabelle 16: Exposition in BPTI Tabelle 16: Fortsetzung.
"Gesamtfläche" ist die Fläche, gemessen ausgehend von einem wirksamen dynamischen Kugelradius von 1,4Å, wobei nur die Atome innerhalb eines Restes berücksichtigt werden. Dies berücksichtigt die Konformation.
"Nicht bedecktdurch M/C" ist die Fläche, gemessen ausgehend von einem wirksamen dynamischen Kugelradius von 1,4A, wobei alle Hauptkettenatome berücksichtigt werden; Fraktion ist die exponierte Fläche geteilt durch die Gesamtfläche Durch Hauptkettenatome verborgene Oberfläche ist deutlicher bedeckt als die Oberfläche, die durch Seitengruppenatome bedeckt ist.
"Überhaupt nicht bedeckt" ist die Fläche, gemessen ausgehend von einem wirksamen dynamischen Kugelradius von 1,4Å, wobei alle Atome des Proteins berücksichtigt werden. Tabelle 17: Plasmide, die im genau beschriebenen Beispiel verwendet wurden Tabelle 25: Mit Anmerkung versehene Sequenz des ipbd-Gens Tabelle 25, Fortsetzung. Tabelle 25, Fortsetzung. Tabelle 25, Fortsetzung. Tabelle 25, Fortsetzung.
Beachte die folgenden Enzym-Äquivalenzen
Xma III = Eag I
Acc III = BspM II
Dra II = EcoO109 I
Asu II = BstB I
WSau I = Bsu36 I Tabelle 27: DNA_synth1 Tabelle 27, Fortsetzung. Tabelle 28: DNA_seq2 Tabelle 28, Fortsetzung. Tabelle 30: DNA_seq3 Tabelle 30, Fortsetzung. Tabelle 32: DNA_seq4 Tabelle 32, Fortsetzung Tabelle 34: Einige Interaktiorisgruppen im BPTI Tabelle 34, Fortsetzung Tabelle 34, Fortsetzung
s bezeichnet Sekundärgruppe
x bedeutet: in oder nahe der Oberfläche, jedoch verborgen und/oder hoch konserviert Tabelle 35: Abstände von Cbeta bis zur Spitze der Seitengruppe in Ångström
Anmerkung: Diese Abstände wurden für Standardmodellteile berechnet, bei denen alle Seitengruppen vollständig gestreckt sind. Tabelle 36: Abstände, BPTI-Restreihe #2 Abstände in Ångstrom zwischen CbetaS. Hypothetisches Cbeta wurde zu jedem Glycin addiert. Tabelle 36, Fortsetzung. Abstände in Ångstrom zwischen CbetaS. Hypothetisches Cbeta wurde zu jedem Glycin addiert. Tabelle 37: vgDNA, um BFTI-Gruppe#2.1 zu variiered
parentale Base=1/ (5.5x10&sup7;) am wenigsten favorisiert=1/(4.2x10&sup9;) Att wenigsten favorisierte Ein-Aminosäure-Substitution ausgehend von PPBD, vorhanden zu 1 in 1,6x10&sup7; Tabelle 38: Ergebnis der Variation der Gruppe#2 von BPTI 2.1 Tabelle 39: vgDNA, um Gruppe #2 BPTI 2.2 zu variieren
Parentale Base = 1/(4.4x10&sup7;) am wenigsten favorisiert = 1/(1.25x10&sup9;) am wenigsten favorisierte Ein-Aminosäure-Substitution ausgehend von PPBD, vorhanden zu 1 in 1.2x10&sup7; Tabelle 40: Ergebnis der Variation der Gruppe #2 von BPTI 2.2 Tabelle 41: vg DNA Gruppe #2 von BPTI 2.3
parentale Basen = 1/(1x10&sup7;) am wenigsten favorisiert = 1/ (4x10&sup8;)
Am wenigsten favorisierte Ein-Aminosäure-Substitution ausgehend v)n PPBD, vorhanden zu 1 in 3x10&sup7; Tabelle 42: Ergebnis der Variation der Gruppe 2# von EPTI 2.3

Claims

1. Verfahren zum Erhalten einer Nukleinsäure, die für eine proteinartige Bindedomäne kodiert, die ein vorbestimmtes Zielmaterial bindet, das von der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers, der diese Domäne bindet, verschieden ist, umfassend

a) das Herstellen einer vielfältigen Population amplifizierbarer genetischer Packungen, wobei die genetischen Packungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Zellen, Sporen und Viren besteht, wobei jede genetische Packung genetisch veränderbar ist und eine äußere Oberfläche einschließlich eines genetisch determinierten äußeren Oberflächenproteines hat, wobei jede Packung ein erstes Nukleinsäurekonstrukt enthält, das für ein mögliches chimäres Bindeprotein kodiert, wobei jedes chimäre Protein (i) und (ii), wie nachstehend definiert, umfaßt, und jedes dieser Konstrukte DNA umfaßt, die kodiert für (i) eine potentielle Bindedomäne, die eie Mutante einer stabilen vorherbestimmten Domäne eines vorherbestimmten Elterproteines ist, das von einem Einzelkettenantikörper verschieden ist und ein oder mehrere identifizierbare Oberflächenreste umfaßt, und für die sowohl ein Affinitätsmolekül als auch eine Aminosäuresequenz entweder verfügbar oder erhältlich sind, und (ii) ein äußeres Oberflächentransportsignal, um eine Darstellung der möglichen Bindedomäne auf der äußeren Oberfläche der genetischen Packung zu erhalten, wobei die Expression des Konstruktes zum Darstellen des chimären möglichen Bindeproteines und seiner möglichen Bindedomäne auf der äußeren Oberfläche der genetischen Packung führt; und worin die vielfältige Population genetischer Packungen zusammen eine Vielzahl von unterschiedlichen potentiellen Bindedomänen aufweist, wobei die Differenzierung unter der Vielzahl der verschiedenen potentiellen Bindedomänen durch die mindestens teilweise zufällige Variation einer oder mehrerer vorherbestimmter Aminosäurepositionen der Elterbindedomäne auftritt, um statistisch an jeder Position eine Aminosäure zu erhalten, die zu einem vorherbestimmten Satz von zwei oder mehr Aminosäuren gehört, wobei die Aminosäuren des Satzes an der Position in statistisch vorherbestimmten erwarteten Proportionen auftreten, wobei die genetische Botschaft, die in den genetischen Packungen eingekapselt ist, in vitro oder durch Zellkultur der genetischen Packungen amplifizierbar und auf der Basis der möglichen Bindedomäne, die sich darauf zeigt, abtrennbar ist;

(b) das Verursachen der Expression des chimären potentiellen Bindeproteins und des Darstellens der potentiellen Bindedomänen auf der äußeren Oberfläche der Packungen;

(c) das Inkontaktbringen der Packungen mit dem vorherbestimmten Zielmaterial, so daß die potentiellen Bindedomänen und das Zielmaterial miteinander wechselwirken können;

(d) das Abtrennen von Packungen, die eine potentielle Bindedomäne aufweisen, die das Zielmaterial bindet, von Packungen, die nicht so binden, auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, an das Zielmaterial in Schritt (c) zu binden, und

(e) das Gewinnen mindestens einer Packung, die auf ihrer äußeren Oberfläche ein chimäres Bindeprotein aufweist, das eine stabile erfolgreiche Bindedomäne (SBD) umfaßt, die an das Ziel bindet, wobei die Packung Nukleinsäure umfaßt, die für die erfolgreiche Bindedomäne kodiert, und Amplifizieren der für SBD kodierenden Nukleinsäure in vivo oder in vitro.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population amplifizierbarer genetischer Packungen durch das Darstellen von mindestens 10&sup5;, aber nicht mehr als 10&sup9; verschiedenen potentiellen Bindedomänen und/oder (2) dadurch, daß von 1 in 10&sup4; bis 1 in 10&sup9; der Packungen der Population die gleiche potentielle Bindedomäne aufweisen, gekennzeichnet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Niveau der Vielfältigkeit der Population so ausgewählt ist, daß die die potentiellen Bindedomänen aufweisenden Packungen, die durch Substitution einzelner Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der möglichen Elterbindestelle erhalten sind, in nachweisbaren Mengen vorhanden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Signal durch ein Segment des chimären Proteins zur Verfügung gestellt wird, das hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz mindestens einem funktionellen Teil eines natürlichen äußeren Oberflächenproteines identisch ist, das von der genetischen Packung kodiert wird, oder von einer Zelle, die von der genetischen Packung natürlicherweise infiziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die potentielle Elterbindedomäne ursprünglich so ausgewählt ist, daß sie eine ist, die einer Domäne eines bekannten Proteines über 50% homolog ist, wobei die letztgenannte Domäne einen Schmelzpunkt von mindestens ungefähr 60ºC hat.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das ursprünglich gewählte Elterbindeprotein nicht bevorzugt an das vorherbestimmte Ziel bindet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmaterial ein oder mehrere diskrete Moleküle umfaßt und die potentielle Elterbindedomäne als eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, umfassend weiter das Identifizieren eines Wechselwirkungssatzes von Aminosäuren, die an der Oberfläche der potentiellen Elterbindedomäne sind und die alle gleichzeitig ein einzelnes Molekül der Zielsequenz berühren können, und Erhalten der potentiellen Bindedomänen durch Ersetzen einer oder mehrerer der Aminosäuren in dem Wechselwirkungssatz durch unterschiedliche Aminosäuren.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmaterial eine nicht makromolekulare organische Verbindung ist und die potentiellen Bindedomänen mehr als ungefähr 80 Aminosäurereste umfassen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmaterial eine makromolekulare organische Verbindung ist und die potentiellen Bindedomänen weniger als ungefähr 80 Aminosäurereste haben.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wöbei das Zielmaterial ein in wäßriger Lösung unlösliches Mineral ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ziel ein anorganisches Molekül ode komplexes Ion ist, das in wäßriger Lösung stabil ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ziel eine organometallische Verbindung ist, die in wäßriger Lösung stabil ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmaterial eine allgemeine Protease ist, wobei das immobilisierte Zielmaterial zuerst mit einem irreversiblen oder kovalenten Inhibitor inkubiert wird, um die Protease zu inaktivieren.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die amplifizierbare genetische Packung eine Zelle oder ein Virus ist, die/das affinitätsgetrennt werden kann und lebensfähig bleibt.

15. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das bekannte Bindeprotein ein Enzym ist, dessen Aktivität eine letale Wirkung auf die amplifizierbare genetische Packung, den Wirt der amplifizierbaren genetischen Packung oder das Ziel hat, wobei die Mehrzahl der Nukleinsäurekonstrukte für die Expression eines Analogs des bekannten Bindeproteines kodiert, das nicht eine solche letale enzymatische Aktivität hat.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ziel ionisierbare Gruppen enthält und der pH der Lösungen für den beabsichtigten Gebrauch und der pH der Affinitätstrennung so gewhlt sind, daß sowohl das potentielle Bindeprotein als auch das Ziel stabil bleiben.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ziel ionisierbare Gruppen enthält, umfassend weiter das Bereitstellen von Gegenionen zur Verringerung der elektrostatischen Abstoßung zwischen dem potentiellen Bindeprotein und dem Ziel.

18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ursprüngliche potentielle Bindedomäne 6 ausgewählt ist, daß unter den Bedingungen der beabsichtigten Verwendung des gewünschten Bindeproteines und unter den Bedingungen der Affinitätstrennung die potentielle Bindedomäne und das Ziel entweder eine entgegengesetzte Ladung haben oder eines davon neutral sein wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die amplifizierbare genetische Packung eine bakterielle Zelle ist.

20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die amplifizierbare genetische Packung eine bakterielle Spore ist.

21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die amplifizierbare genetische Packung ein Bakteriophage ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Signal vom Hüllprotein von M13 oder einem Segment davon bereitgestellt wird, das ein äußeres Oberflächentransportsignal darstellt.

23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Signal durch das Gen III-Protein von M13 oder ein Segment davon bereitgestellt wird, das ein äußeres Oberflächentransportsignal darstellt.

24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verteilung der Nukleotide, die in jedes geänderte Kodon eingebaut sind, so ausgewählt ist, daß sie zu im wesentlichen gleichen Häufigkeiten von sauren und basischen Aminosäuren führt.

25. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) weiter das Inkontaktbringen der Packungen mit einem zweiten Material und das Isolieren der Packungen, die nicht an das zweite Material binden, umfaßt.

26. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach dem Erhalten eines neuen Bindeproteines; das ein erstes vorherbestimmtes Ziel erkennt, das neue Bindeprotein als ein potentielles Elterbindeprotein ausgewählt wird für die Isolierung eines Proteinderivates, das auch an ein zweites vorherbestimmtes Ziel bindet.

27. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ursprünglich ausgewählte potentielle Elterbindedomäne aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (a) Bindedomänen von Pankreastrypsininhibitor aus Rind, Crambin, Ovomucoid, T4 Lysozym, Lysozym aus Hühnereiweiß, Ribonuklease und Azurin und (b) Domänen, die mindestenes 50% mit einer der zuvor genannten Domänen homolog sind und einen Schmelzpunkt von mindestens 60ºC haben, besteht.

28. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das äußere Oberflächentransportsignal vom lamb Protein oder einem Segment davon bereitgestellt wird, das ein äußeres Oberflächentransportsignal darstellt.

29. Chimäres Protein, umfassend (1) mindestens ein Segment eines äußeren Oberflächenproteines eines filamentösen Phagen, wobei das Segment ein äußeres Oberflächentransportsignal bereitstellt, das von einer Zelle erkannt wird, die von dem Phagen infiziert ist, so daß das chimäre Protein in der Hülle von Phagenpartikeln, die von der Zelle erzeugt werden, zusammengesetzt wird, und (2) eine stabile proteinartige Bindedomäne, die von einem Einzelkettenantikörper verschieden ist, wobei die Domane ein oder mehrere identifizierbare Oberflächenreste umfaßt, die an ein vorherbestimmtes Zielmaterial binden, das von der Antigenbindungsstelle eines Antkörpers, der die Domäne spezifisch bindet, verschieden ist, wobei das Ziel ausreichend stark gebunden wird, so daß die Dissoziationskonstante des Bindedomänen:Zielkomplexes weniger als 10&supmin;&sup6; Mol/l beträgt, und wobei die Bindedomäne zum Phagen heterolog ist.

30. Virus, das auf seiner äußeren Oberfläche ein chimäres Bindeprotein trägt, wobei das Protein (i) eine proteinartige Bindedomäne umfaßt, die von einem Einzelkettenantikörper verschieden ist und die hinsichtlich. ihrer Struktur ausreichend stabil ist, um einen Schmelzpunkt von mindestens 40ºC zu haben, und die ausreichend stark an ein Ziel, das von der variablen Domäne eines Antkörpers verschieden ist, bindet, so daß die Dissoziationskonstante des Bindungsdomänen:Zielkomplexes weniger als 10&supmin;&sup6; Mol/l beträgt, und (ii) mindestens einen funktionellen Teil eines Hüllproteines des Virus umfaßt, wobei der Teil, wenn das chimäre Protein in einer geeigneten Wirtszelle erzeugt wird, so wirkt, daß das Darstellen des chimären Bindeproteines oder seiner prozessierten Form an der äußeren Oberfläche des Virus verursacht wird, wobei die Bindedomäne an das Zielmaterial binden kann, an das das Hüllprotein nicht bevorzugt bindet, wobei die Bindedomäne den nativen Hüllproteinen des Virus fremd ist.

31. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in mindestens einem Fall die Aminosäurereste, die in einer ersten Anordnung von potentiellen Bindedomänen variiert sind, in der folgenden Anordnung potentieller Bindedomänen konstant gelassen werden.

32. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zum Herstellen einer Population vielfältiger genetischer Packungen die Herstellung einer Population vielfältiger DNA umfaßt, die eine potentielle Bindedomäne kodiert, die eine Mutante einer stabilen vorherbestimmten Domäne eines vorherbestimmten Elterproteines, das von einem Einzelkettenantikörper verschieden ist, ist, umfassend ein oder mehrere identifizierbare Oberflächenreste, und für die sowohl ein Affinitätsmolekül als auch eine Aminosäuresequenz entweder verfügbar oder erhältlich sind, worin die Verteilung von Nukleotiden, die in jedem variierten Kodon eingebaut sind, so ausgewählt ist, daß sie zu im wesentlichen gleichen Häufigkeiten von sauren und basischen Aminosäuren führt.

33. Protein nach Anspruch 29, wobei das Protein eine erste fremde Domäne umfaßt, die ein erstes Zielmaterial erkennt, und eine zweite fremde Domäne, die ein zweites Zielmaterial erkennt.

34. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die anfänglich gewählte parentale potentielle Bindedomäne mindestens 50% homolog mit der Bindedomäne von pankreatischem Trypsininhibitor aus Rindern ist.

35. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das anfänglich gewählte parentale potentielle Bindeprotein mindestens eine stabile Bindedomäne hat und diese Domäne einen Schmelzpunkt von mindestens 60ºC hat und über einen pH-Bereich von mindestens 3,0 bis 8,0 stabil ist.

36. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die amplifizierbare genetische Packung ein Escherichia coli-Stamm ist.

37. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die amplifizierbare genetische Packung ein filamentöser Phage ist.

38. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die amplifizierbare genetische Packung ein Derivat eines Escherichia coli M13- Bakteriophagen oder eines Derivates des filamentösen Phagen Pf1 aus Pseudomonas aeruginosa ist.

39. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Verteilung von Nukleotiden, die in jedes variierte Kodon eingebaut sind, weiter so gewählt wird, daß der größte Wert für die Menge ((1.- Häufigkeit (Stopp-Kodons)) x (Häufigkeit der am wenigstens häufigen Aminosäure)/(Häufigkeit der häufigsten Aminosäure)) ist.

40. Chimäres Protein nach Anspruch 29, wobei die Fremddomäne an ein Zielmaterial bindet, das nicht bevorzugt von dem äußeren Oberflächenprotein gebunden wird.

41. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Verteilung von Nukleotiden, die in jedes variierte Kodon eingebaut sind, weiter so gewählt wird, daß sie den höchsten Wert für die Menge ((1. - Häufigkeit (Stopp-Kodons)) x (Häufigkeit der am wenigstens häufigen Aminosäure)/(Häufigkeit der häufigsten Aminosäure)) ergibt.

42. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das vorherbestimmte parentale Protein mit der genetischen Packung nicht nativ assoziiert ist.

43. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das vorherbestimmte parentale Protein kein Oberflächenprotein der genetischen Packung ist.

44. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das vorherbestimmte parentale Protein kein Oberflächenprotein einer Zelle oder eines Virus ist.

45. Verfahren nach Anspruch 11 wobei das vorherbestimmte parentale Protein kein bakterielles oder virales Protein ist.

46. Verfahren nach Anspruch 1, wobei für mindestens ein Kodon eine gewünschte Mischung von Aminosäuren durch die Verwendung einer nicht äquimolaren Mischung von Nukleotiden bei der Synthese mindestens einer Basenposition des Kodons erhalten wird.

47. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Affinität der erfolgreichen Bindedomäne für das Ziel wesentlich größer ist als die Affinität der parentalen Bindedomäne für das Ziel.

48. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die äußere Oberfläche der genetischen Packungen nicht nur das chimäre Protein präsentiert, sondern auch das entsprechende äußere Oberflächenprotein vom Wildtyp.

49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei mindestens eines der für das chimäre Protein und für das äußere Oberflächenprotein aus Wildtyp kodierenden Gene unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors steht, der die Steuerung des Verhältnisses von chimärem zu Wilddtyp-Protein zuläßt.

50. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das äußere Oberflächenprotein ein Hüllprotein ist, das vom Gen III eines filamentösen Phagen abgeleitet ist.

51. Verfahren nach Anspruch 48, wobei die potentielle Bindedomäne mit einem exponierten Amino- oder Carboxylterminus des reifen Wildtyp-Hüllproteines verbunden ist.

52. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Insertionsstelle für die anfängliche potentielle Bindedomäne an einer Domänengrenze eines Hüllproteines ist.

53. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Insertionsstelle für die anfängliche potentielle Bindedomäne an einer Kehre oder einer Schlaufe eines Hüllproteines ist.

54. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das äußere Oberflächenprotein das Gen VIII Protein von M13 ist.

55. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Packung durch Elution als ein Ergebnis einer Erniedrigung des pH's zurückgewonnen wird, einer Steigerung der Konzentration des Salzes oder eines anderen gelösten Bestandteils, der nichtkovalente Wechselwirkungen schwächt, der Temperatur oder der Konzentration eines löslichen Zielmaterials oder einer Kombination davon.

56. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmaterial auf einer Matrix immobilisiert ist und die. genetische Packung in situ auf der Matrix amplifiziert wird.

57. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmaterial auf einer Matrix immobilisiert wird und die Packung durch Elution nach chemischem oder enzymatischem Abbau der Bindung, die das Ziel an der Matrix hält, zurückgewonnen wird.

58. Virus nach Anspruch 30, wobei das Virus auf seiner äußeren Oberfläche das entsprechende Wildtyp-Hüllprotein des Virus trägt.

59. Virus nach Anspruch 30, wobei die proteinähnliche Bindedomäne im wesentlichen an den Aminoterminus des reifen Hüllproteines gekoppelt ist.

60. Protein nach Anspruch 29, wobei die proteinähnliche Bindedomäne im wesentlichen an den Aminoterminus des reifen Hüllproteines gebunden ist.

61. Protein nach Anspruch 29, wobei das äußere Oberflächenprotein gVIII- (hauptsächliches Hüll) Protein ist.

62. Virus nach Anspruch 30, wobei das äußere Oberflächenprotein gVIII-(hauptsächliches Hüll) Protein ist.

63. Protein nach Anspruch 29, wobei das äußere Oberflächenprotein das gIII-Protein ist.

64. Virus nach Anspruch 30, wobei das ußere Oberflächenprotein das gIII-Protein ist.