DE68918494T2

DE68918494T2 - Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.

Info

Publication number: DE68918494T2
Application number: DE68918494T
Authority: DE
Inventors: Alan H Christiansen; Howard P Hershey; Peter H Quail; Robert A Sharrock; Thomas D Sullivan
Original assignee: Lubrizol Genetics Inc
Current assignee: Mycogen Plant Science Inc
Priority date: 1988-05-17
Filing date: 1989-05-16
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2009-05-17
Also published as: EP0342926A2; CA1339684C; EP0342926B1; JPH11332565A; US6054574A; ATE112314T1; US6020190A; JP3509855B2; DE68918494D1; ES2060765T3; US5614399A; US5510474A; JPH0279983A; EP0342926A3; JP2003174880A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist auf dem Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie angesiedelt und betrifft Pflanzengentechnik mittels DNA-Rekombinations-Technologie. Die Identifizierung und Charakterisierung eines DNA-Segments aus der upstream nicht transkribierten Region eines Pflanzen-Ubiquitingens sind beschrieben. Dieses Segment ist befähigt, die Transkription von nahegelegenen Pflanzenexprimierbaren Genen in Gewebe, das rekombinante DNA enthält, von sowohl monocotyledonen als auch dicotyledonen Pflanzen zu initiieren und anzutreiben. Das beschriebene DNA-Segment ermöglicht die selektive Expression und Regulation von gewünschten Strukturgenen in Pflanzengewebe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ubiquitin ist ein 8,5 kDa Protein, das in eukaryotischen Zellen in entweder freiem, monomeren Zustand oder kovalent gebunden an verschiedene cyctoplasmatische Proteine, Kern- oder Membranproteine gefunden wird. Dieses Protein enthält 76 Aminosäurereste, und seine Aminosäuresequenz ist in einem ungewöhnlich hohen Maße konserviert. Die Sequenz von Ubiquitin ist zwischen so unterschiedlichen Spezies, wie Mensch, Kuh, mediteraner Fruchtfliege, Xenopus und Huhn identisch (U. Bond und M. Schlesinger (1985) Mol. Cell. Biol. 5 : 949-956). Ubiquitine aus Hefe und Mensch unterscheiden sich in nur drei unterschiedlichen Aminosäuren (K. Ozkaynak et al. (1984) Nature 312 : 663-666), während sich Pflanzen-Ubiquitin von dem aus Hefe nur durch zwei Aminosäuren unterscheidet. Basierend auf diesen zwei oder drei Aminosäure-Unterschieden in der Sequenz, scheint es mindestens drei Typen von Ubiquitin zu geben - in Tier, Pflanze und Hefe.
Ubiquitin wird in drei hauptsächlichen Zellkompartimenten gefunden - der cyctoplasmatischen Membran, dem Cytoplasma und dem Kern. Dieses Protein ist erforderlich für den ATP-abhängigen Abbau von intrazellulären Proteinen, was ein nicht-lysosomaler Stoffwechselweg ist, um aus der Zelle solche Proteine zu entfernen, die beschädigt oder abnormal sind und auch normale Proteine mit einer kurzen Halbwertzeit (A. Hershko et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1619-1623; D. Finley et al. (1985) Trends Biol. Sci. 10 : 343-347). Ubiquitin bindet an ein Zielprotein, wobei es dieses zum Abbau markiert. Die kovalente Anlagerung geschieht durch Isopeptid-Bindungen zwischen dem Carboxy-Terminus (Glycin) in Ubiquitin und der E-Aminogruppe der Lysyl-Seitenketten in den Zielproteinen.
Ubiquitin spielt auch eine Rolle bei der zellulären Antwort auf Streß, wie Hitzeschock und Anwachsen der Metall(Arsenit)-Konzentration (D. Finley et al. (1985) supra). Die meisten lebenden Zellen antworten auf Streß (z. B. Einwirkenlassen von Temperaturen, die einige Grade über der normalen physiologischen Temperatur liegen, oder von erhöhten Konzentrationen von Schwermetallen, Ethanol, Oxidationsmitteln und Aminosäure-Analogen) durch Aktivierung einer kleinen Gruppe von Genen, die selektiv Streßproteine synthetisieren, welche auch Hitzeschockproteine genannt werden. Es wurde gefunden, daß diese Streßproteine in den meisten Organismen Untereinheiten mit Molekulargewichten von 89, 70 und 23 kDa haben (U. Bond und M Schlesinger (1985) supra). Ubiquitin mit einem Molekulargewicht von etwa 8,5 kDa antwortet auch auf Streß, weil sich in verschiedenen Spezies (Hefe, Maus, Wüstenrennmaus und Hühnerembryo-Fibroplasten) die Level von UbiquitinmRNA und Ubiquitin-Protein als ein Ergebnis der verschiedenen Streßbedingungen erhöhen.
In eukaryotischen Systemen wird die Expression von Genen durch eine Region der DNA-Sequenz gelenkt, die Promotor genannt wird. Im allgemeinen wird angenommen, daß der Promotor derjenige Teil der DNA ist, der sich upstream von der kodierenden Region befindet und die Bindungsstelle für RNA- Polymerase II enthält und die Transkription der DNA initiiert. Die Promotorregion enthält auch andere Elemente, die als Regulatoren der Genexpression wirken. Diese schließen eine TATA-Box-Consensus-Sequenz in der Nachbarschaft von etwa -30 und oft eine CAAT-Box-Consensus-Sequenz bei etwa -75 bp 5' relativ zur Transkriptionsstartstelle oder cap-Stelle, welche als + 1 definiert ist, ein (R. Breathnach und P. Chambon (1981) Ann. Rev. Biochem. 50 : 349-383; J. Messing et al. (1983) in Genetic Engineering of Plants, Hrsg. T. Kosuge, C.P. Meredith und A. Hollaender, Seiten 211-227). In Pflanzen kann die CAAT-Box durch die AGGA-Box ersetzt sein (J. Messing et al. (1983) supra). Andere regulatorische Elemente, die anwesend sein können, sind solche, die die Genexpression in Antwort auf Umweltstimuli, wie Beleuchtung oder Nährstoffverfügbarkeit oder in Antwort auf ungünstige Bedingungen, wie Hitzeschock, Anaerobiose oder Schwermetallanwesenheit, beeinflussen. Zusätzlich können DNA-Sequenzen anwesend sein, die die Genexpression während der Entwicklung oder in Gewebs-spezifischer Weise steuern. Andere gefundene regulatorische Elemente sind die Enhancer (in Tiersystemen) oder die "upstream activating sequences" (in Hefe), welche die Erhöhung der Gesamtexpression von nahegelegenen Genen in einer Weise bewirken, welche unabhängig von der Position und Orientierung im Hinblick auf das nahegelegene Gen ist. Sequenzen, die zu der Tier-Enhancer-Core-Consensus-Sequenz 5'-GGTGTGGAAA (oder TTT) G-3' homolog sind, wurden in Pflanzen beschrieben, z. B. in dem Erbsen-Legumin-Gen bei etwa Position -180 bezogen auf die Transkriptionsstartstelle (G. Lycett et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 : 4493-4506) und in dem Adh1- und Adh2-Gen aus Mais bei etwa -200 bzw. -170 bp von der Transkriptionsstartstelle. Im allgemeinen werden Promotoren 5' oder upstream relativ zum Start der kodierenden Region des entsprechenden Gens gefunden, und diese Promotorregion, die alle untergeordneten regulatorischen Elemente enthält, kann zwischen 100 und 1000 oder mehr Nukleotide enthalten.
Von den regulatorischen Elementen, die die Genexpression steuern, ist das Hitzeschockelement vielleicht eines der am häufigsten Untersuchten. Obwohl die Vielseitigkeit der zellulären Antwort auf Hitzeschock seit fast einem Jahrzehnt bekannt ist, ist sehr wenig über die Funktion des Hitzeschockproteins, das selektiv durch gestreßte Zellen synthetisiert wird, bekannt. Die Induktion der Streßproteinsynthese findet auf transkriptionaler Ebene statt, und es wurde gefunden, daß die Antwort in Bakterien, Pilzen, Insekten und Säugetieren ähnlich ist (E. Craig (1985) CTC Crit. Rev. Biochem. 18 : 239- 280). Zusätzlich zur Synthese und Anreicherung der klassischen Hitzeschockproteine als Antwort auf Streß, synthetisieren Zellen, die gestreßt werden, auch Proteasen und Ubiquitin. In E. coli wird ein 94 kDa-Enzym, das eine ATP-abhängige proteolytische Aktivität hat, durch das Ion (cap R) Gen kodiert, dessen Expression unter der Kontrolle des Hitzschock-Regulons steht (E. Ozkaynak et al. (1984) Nature 312 : 663-666). In Hühnerembryo-Fibroplasten (U. Bond et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5 : 949-956) vergrößerte sich der Ubiquitin-mRNA-Level fünffach nach Hitzeschock oder Einwirkung von 50 uM Arsenit. Jede mRNA umfaßt tandemmäßig wiederholte identische Polypeptide, welche nach Translation als ein Polyubiquitinmolekül, multiple Ubiquitinmoleküle hervorrufen, was einen besonderen Mechanismus zum Amplifizieren genetischer Information bietet. Dieser erhöhte Level von Ubiquitin-mRNA hielt nicht während der Erholungsphase nach dem Hitzeschock an, was eine vorübergehende Rolle für freies Ubiquitin während der Streßantwort anzeigt.
Es wurde postuliert (J. Anathan et al. (1986) Science 232 : 522-524), daß metabolischer Streß, der die Aktivierung von Hitzschock-Proteingenen auslöst, durch einen gemeinsamen Mechanismus wirkt. Metabolischer Streß, der Hitzeschockgene aktiviert, verursacht die Denaturierung intrazellulärer Proteine; die Anreicherung von abnormalen Proteinen wirkt als ein Signal, Hitzeschockgene zu aktivieren. Eine Rolle für Ubiquitin beim Ansteuern abnormaler Proteine für den Abbau und auch für verschiedene proteolytische Enzyme würde in Einklang stehen mit solch einem Model der Hitzeschockprotein-Genregulation.
Die meisten der früheren Arbeiten über Hitzeschockgene wurde mit Drosophila-Arten durchgeführt. Insbesondere wurde das Drosophila hsp70 Gen in rekombinanten Studien weitverbreitet verwendet. In homologen Systemen wurde das Drosophila hsp70 Gen an das E. coli β-Galactosidase-Strukturgen fusioniert, damit die Aktivität des Hybridgens von den fünf internen hsp70- Hitzeschockgenen in dem Empfänger Drosphila unterschieden werden konnte. Drosophila-Hitzeschockgene wurden auch in heterologe Systeme eingeführt, z. B. in Affen-COS-Zellen und Maus-Zellen (H. Pelham (1982) Cell 30 : 517- 528). Die Regulation durch Hitzeschock wurde in dem Hybrid hsp70-lac Z- Gen beobachtet, welches in die Drosophila-Keimbahn integriert worden war und in welches ein 7 kb E. coli β-Galctosidase DNA-Fragment in die Mitte des hsp70-Strukturgens insertiert worden war. Es wurde gezeigt, daß die sich ergebende β-Galactosidase-Aktivität in den Transformanten durch Hitzeschock reguliert wird (J. Lis et al. (1983) Cell 35 : 403-410).
Die DNA-Sequenz, die die Hitzeschockantwort verleiht, wurde durch Deletionsanalyse des Drosophila hsp70-Hitzeschockpromotors identifiziert als 5'-CTGGAAT_TTCTAGA-3' (H. Pelham et al. (1982) in Heat Shock From Bacteria Lo Man, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 43-48) und ist im allgemeinen in der -66 bis -47-Region des Gens oder etwa 26 Basen upstream der TATA-Box lokalisiert. Es wurde weiter bewiesen, daß eine chemisch synthetisierte Kopie dieses Elements, wenn sie upstream der TATA-Box des Herpesvirus-Thymidinkinasegens anstelle des normalen upstream-Promotorelements plaziert worden war, ausreichend war, Hitzeinduzierbarkeit durch das Thymidinkinasegen in Affen-COS-Zellen und in Xenopus-Oocyten zu verleihen. (Das Thymidinkinasegen ist normal nicht hitzeinduzierbar). Diese Hitzeschockssequenzen wechselwirken mit (einem) spezifischen Hitzeschock- Transkriptionsfaktor(en), welcher bzw. welche die Induktion von Hitzeschockproteinen erlaubt bzw. erlauben (C. Parker et al. (1984) Cell 37 : 273-283). Hitzeschockgen-Induktoren können Faktoren sein, die die Konzentration von Hitzeschockproteinen innerhalb der Zelle verändern (verringern) und somit die Transkription und Translation der Hitzeschockgene steuern.
In höheren Pflanzen wurde die Streßantwort durch vermehrte Proteinsynthese als Antwort auf Hitzeschock in Sojabohne, Erbse, Hirse, Korn, Sonnenblume, Baumwolle und Weizen gezeigt (T. Barnett et al. (1980) Dev. Genet. 1 : 331- 340; J. Key et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 3526-3530). Die Hauptunterschiede bei der gesehenen Hitzeschockantwort unter den Pflanzenarten sind: (a) die Menge des Gesamtproteins, das als Antwort auf Streß synthetisiert worden war, (b) die Größenverteilung der verschiedenen synthetisierten Proteine, (c) die Induktionsoptimumstemperatur der Hitzeschockproteine und (d) die lethale (Zusammenbruchs-)temperatur. Es wurde gefunden, daß Proteine mit hohem Molekulargewicht elektrophoretisch ähnlich innerhalb der verschiedenen Arten sind. Die Hitzeschockproteine mit geringem Molekulargewicht (15-27 kDa) zeigen mehr elektrophoretische Heterogenität zwischen den Arten. In Pflanzen ähneln die Proteine mit hohem Molekulargewicht solchen, die in Drosophila produziert wurden. Es gibt jedoch einen ausgeprägten Unterschied in der Komplexität der Hitzeschockproteine mit geringem Molekulargewicht zwischen Pflanzen und Drosophila. In Drosophila werden vier Hitzeschockproteine, 22, 34, 36 und 27 kDa, synthetisiert, während die Sojabohne über 20 Hitzeschockproteine mit Molekulargewichten im Bereich von 15-18 kDa produziert. Gene für Proteine mit geringem Molekulargewicht in Sojabohnen sind die am aktivsten exprimierten und koordinativ regulierten Gene unter Hitzeschockbedingungen (F. Schoffl et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 : 301-314).
Key et al. (europäische Patentanmeldung Nr. 85 302 593.0, eingereicht am 12. April 1985) haben die Promotorregion von Pflanzen-Hitzeschockgenen studiert. Vier Sojabohnen-Hitzeschockgene (drei Gene kodierend für 15- 18 kDa Hitzeschockproteine und ein Gen kodierend für ein 17,3 kDa Hitzeschockprotein) wurden kloniert und sequenziert. Die kodierenden Sequenzen und flankierenden Sequenzen der vier Hitzeschockgene wurden bestimmt. Die Promotorregionen dieser vier Gene wurden subkloniert, mit einem T-DNA- Shuttle-Vektor verbunden und in Agrobacterium tumefaciens transferiert. Einer der rekombinanten Klone eines Sojabohnen-Hitzeschockgens, das für ein 15-18 kDa-Protein kodierte, enthielt einen offenen Leserahmen von 462 Nukleotiden und eine 291 Nukleotid lange Promotorregion upstream des ATG- Translationsinitiationskodons. Der Promotor beinhaltete die TATA-Box, die CAAT-Box, die Transkriptionsinitiationsstelle und eine Hitzeschock-Consensus-Sequenz 1 31-144 Nukleotide upstream des ATG-Translationsstartkodons mit der Sequenz 5'-CT_GAA_TTC_AG-3'. Nur drei der vier Klone zeigten wesentliche Homologie in der Promotorregion, aber es gab starke Ähnlichkeiten zwischen den Hitzeschock-Consensus-Sequenzen aller vier Klone. Signifikanterweise zeigten die kodierende Sequenz, die upstream-Promotorregion und die downstream-flankierende Region der vier Sojabohnen-Hitzeschockgene fast keine Ähnlichkeit zu den entsprechenden Regionen der Drosophila- Hitzeschockgene. Obwohl es Gemeinsamkeiten zwischen der Consensus-Sequenz der Promotorregion aus Drosophila und den Sojabohnen-Hitzeschockgenen gab, besaßen die Promotorregionen der Sojabohnen-Hitzeschockgene nicht die invertierte Wiederholungs-(repeat)Sequenzcharakteristik der Drosophilagene.
Die Promotorregion der Sojabohnen-Hitzeschockgene wurde verwendet, ein Sojabohnengen und ein Fremdgen (eines, das normalerweise nicht in Sojabohne gefunden wird) zu aktivieren und die Regulation der Streßantwort zu zeigen (Key et al., europäische Patentanmeldung 85 302 593.0, eingereicht am 12. April 1985). Der Promotor wurde auf dem Sojabohnen SB 13-Hitzeschockgen als ein DNA-Fragment isoliert, das sich 65 bp downstream des Transkriptionsstarts erstreckte, um einen Hauptteil der nichttranslatierten "leader"-Sequenz zu enthalten, aber nicht das Startkodon für die Translation. Ein
Bezugszeichenliste
-Galactosidasegen wurde unter der Kontrolle des Hitzeschockpromotors innerhalb der T-DNA des Ti-Plasmids in stabiler Form innerhalb von A. tumefaciens plaziert und dann in eine Pflanze oder eine Pflanzenzellkultur transferiert. Die Verwirklichung des DNA-Transfers wurde durch die Expression des β-Galactosidasegens erkannt, und zwar durch die Produktion einer blauen Farbe nach Hitzebehandlung in einem Medium, das das 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-galactosidase-Substratmolekül enthielt (M. Rose et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2460-2464).
Versuche mit Kreuzexpression, wo ein Gen aus einer Pflanzenart auf die Expression in einer unterschiedlichen Art untersucht wird, fügt eine weitere Dimension zum Verstehen der spezifischen Funktion hinzu. Diese Experimente können die Insertion eines Gens unter der Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines Gens, das künstlich an einen verschiedenen oder nicht natürlichen Promotor fusioniert worden ist, umfassen. In 1983 haben Murai et al. (Science 222 : 476-482) die Expression des Phaseolingens aus Phaseolus vulgaris L. in Sonnenblumen-(Helianthus) Gewebe unter zwei Bedingungsgruppen erhalten: (i) wenn das Phaseolingen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors war, und (ii) wenn das Gen verbunden mit und unter der Kontrolle eines T-DNA-Promotors war. In den nachfolgenden Experimenten wurde gezeigt, daß das Phaseolinstrukturgen unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors in Tabak exprimiert werden konnte, und daß die Gewebs-spezifische Expression in dem heterologen Wirt (Tabak) ähnlich zu dem im nativen Wirt (Bohne) war (C. Sengupta-Gopalen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3320-3324).
In späteren Experimenten (J. Jones et al. (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418) wurde die Expression des Octopine-Synthetasegens (ocs) in sowohl regenerierten transformierten homologen (Petunien)- als auch heterologen (Tabak)- Pflanzen beschrieben. In dieser Studie wurden das ocs-Gen an den Promotor eines Petunien-Chlorophyll a/b bindenden Proteins fusioniert. Kreuzexpression wurde durch W. Gurley et al. ((1986) Mol. Cell. Biol. 6 : 559-565) und Key et al., europäische Patentanmeldung Nr. 85 302 593.0, eingereicht am 12. April 1985, erhalten, die über die starke Transkription in Sonnenblumen-Tumorgewebe eines Sojabohnen-Hitzeschockgens unter der Kontrolle seines eigenen Promotors berichteten. In diesem Fall wurde die funktionale Aktivität als die richtige thermale Induktionsantwort gemessen.
Der erste Beweis für eine Transkription, die von einem monocotyledonen Promotor in einer dicotyledonen Wirtpflanze initiiert worden war, wurde von Matzke et al. (1984) EMBO J. 3 : 1525-1531 beschrieben. Diese Fachleute klonierten das Z4-Gen aus Zeinmais, und führten es in einem Ti-abgeleiteten Vektor in Sonnenblumenstämmchen ein. Die sich ergebende Zein-mRNA konnte dann in einem Weizenkeimsystem translatiert werden, aber nicht in den transformierten Sonnenblumenkalli.
In einer späteren Studie wurde das Weizen gen whAB1.6, das für das Chlorophyll a/b Haupt-Bindungsprotein kodierte, in einen T-DNA-enthaltenden Vektor kloniert und sowohl in Petunien als auch in Tabak transferiert (G. Lamppa et al. (1985) Nature 316 : 750-752). Die Expression wurde in sowohl den monocotyledonen als auch den dicotyledonen Wirten erhalten, und es wurde bestimmt, daß sie Licht-induziert und Gewebs-spezifisch ist. In einer früheren Studie erhielten Rochester et al. ((1986) EMBO J. 5 : 451-458) die Expression des Mais-Hitzeschock-hsp70-Gens in transgenen Petunien. Die Mais-hsp70- mRNA wurde nur als Antwort auf thermalen Streß synthetisiert. Insoweit stellen diese drei Studien die Gesamtanzahl publizierter Reporte, die die erfolgreiche Expression von monocotyledonen Genen in transgenen dicotyledonen Pflanzen beschreiben. Jedoch gibt es auch negative Reporte, die minimale oder keine Expression des Mais-Alkoholdehydrogenase-Gens in Tabakwirten beschreiben (Llewllyn et al. (1985) in Molecular Form and Function of the Plant Genome, L. van Vloten-Doting, G.S. Groot and T. Hall (Hrsg.), Plenum Publishing Corp., Seiten 593-608; J.G. Ellis et al. (1987) EMBO J. 6 : 11-16), was einen möglichen inhärenten Spezies-spezifischen Unterschied zwischen monocotyledonen und dicotyledonen Promotoren nahelegt.
Man nimmt an, daß die Hitzeschockantwort einen thermalen Schutz oder Thermotoleranz zu anders nicht-tolerierbaren Temperaturen schafft (M. Schlesinger et al. (1982) in Heat Shock from Bacteria to Man, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Seite 329). Eine tolerierbare Hitzeschocktemperatur ist eine Temperatur, die hoch genug ist, die Hitzeschockantwort zu induzieren, aber nicht hoch genug ist, um lethal zu wirken. Thermotoleranz in Pflanzenkeimlingen kann durch verschiedene Behandlungsbedingungen erreicht werden: (a) 1 bis 2 Stunden Einwirkenlassen eines kontinuierlichen Hitzeschocks bei 40ºC, gefolgt von einer 45ºC Inkubation, (b) ein 30-minütiger Hitzeschock bei 40ºC, gefolgt von 2 bis 3 Stunden bei 28ºC vor dem Shift zu 45ºC, (c) ein 10-minütiger Hitzeschock bei 45ºC, gefolgt von etwa 2 Stunden bei 28ºC vor dem Shift zu 45ºC und (d) Behandlung der Keimlinge mit 50 um Arsenit bei 28ºC für 3 Stunden oder mehr vor dem Shift zu 45ºC. Während der Vorbehandlung vor der Inkubation bei der potentiell lethalen Temperatur werden Hitzschockproteine synthetisiert und angereichert. Auch die Hitzeschock-mRNA- und Proteinsynthese geschieht bei 45ºC, falls die Pflanzenkeimlinge, wie oben beschrieben, vorkonditioniert worden sind. Wenn die Temperatur zurück zu physiologischen Gradzahlen (z. B. 28ºC) geshiftet wird, wird die normale Transkription und Translation wieder aufgenommen, und nach 3 bis 4 Stunden bei normaler Temperatur gibt es keine detektierbare Synthese von Hitzeschockproteinen mehr (J. Key et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 3526-3530; M. Schlesinger et al. (1982) Trends Biochem. Sci. 1 : 222-225). Die Hitzeschockproteine, die während der 40ºC Hitzeschockbehandlung synthetisiert worden waren, sind sehr stabil und werden nicht sofort abgebaut.
Obwohl Ubiquitin als Antwort auf Umgebungsstreß einschließlich Hitzeschock reguliert wird, unterscheidet sich die Regulation der Ubiquitin-Transkription von der klassischer Hitzeschockproteintranskripte. Sowohl Ubiquitin- als auch Hitzeschockprotein-mRNA-Level, werden in Antwort auf zellulären Streß erhöht. Jedoch während klassische Hitzeschockproteine sich während des Hitzeschocks anreichern und während der Erholungsphase bestehen bleiben, werden Ubiquitin-mRNAs, die sich während dem Hitzschock angereichert haben, schnell innerhalb von Stunden nach der Streßbehandlung abgebaut. Dieses instabile mRNA-Transkript legt eine spezialisierte, aber vorübergehende, Rolle für Ubiquitin während des Hitzeschocks nahe und deutet eine einzige mRNA-Sequenz in der Ubiquitingen-Promotorregion an, was eine spezialisierte regulatorische Kontrolle während der zellulären Antwort auf Streß spezifiziert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die erste Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung neuer DNA-Segmente und -konstruktionen, die ein regulatorisches Promotorsystem umfassen, das den Fachmann in die Lage versetzt, Strukturgene in Pflanzengewebe selektiv zu exprimieren. Der Promotor umfaßt die DNA-Sequenzen der 5'- nichttranskribierten Regionen von Pflanzen-Ubiquitingenen, die die Transkription von Genen, die sich unter ihrer Kontrolle befinden, initiieren und regulieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel stammt die Promotor-Sequenz aus der upstream-Region des Ubiquitingens von Mais.
Die Isolation und Charakterisierung eines Promotors, der in Pflanzen aktiv ist, die Expression eines downstream-Gens zu steuern und zu regulieren, ist in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Diese DNA-Sequenz wurde als eine natürlich vorkommende Region upstream des Ubiquitinstrukturgens gefunden, welches aus einer genomischen Bibliothek von Mais isoliert worden war. Die Transkriptionsstartstelle oder Cap-Stelle, wie sie durch S1-Nukleasekartierung bestimmt worden war, als Base 1 bezeichnet und die Sequenzen, die innerhalb etwa 899 Basen 5' zur Transkriptionstartstelle plus etwa 1093 Basen 3' zur Cap-Stelle, aber 5' zur Translationsstartstelle enthalten sind, stellen den Ubiquitin-Promotor dar. Innerhalb dieser etwa 2 kb Promotor-Region sind eine TATA-Box (-30), zwei überlappende Hitzeschock-Consensus-Elemente (-204 und -214), eine 83 Nukleotid lange Leadersequenz unmittelbar benachbart zur Transkriptionsstartstelle und ein Intron, das sich von Base 84 bis Base 1093 erstreckt, lokalisiert.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das einen in Pflanzen exprimierbaren Promotor und ein in Pflanzen exprimierbares Strukturgen enthält, wobei das Strukturgen unter die regulatorische Kontrolle aller Transkription-initiierender und -aktivierender Elemente des Promotors gestellt ist. Insbesondere kann der Pflanzen- Ubiquitinpromotor mit einer Vielzahl von DNA-Sequenzen, typischerweise Strukturgenen, kombiniert werden, um DNA-Konstrukte für die regulierte Transkription und Translation dieser DNA-Sequenzen bereitzustellen und welche die regulierte Steuerung der Expression erlauben, wenn mit erhöhten Temperaturen Streß ausgeübt wird.
Solche rekombinanten DNA-Moleküle werden in Pflanzengewebe eingeführt, so daß die Promotor/Strukturgen-Kombination exprimiert wird. Es wird beabsichtigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren allgemein auf die Expression von Strukturgenen in sowohl monocotyledonen als auch dicotyledonen Pflanzen anwendbar ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine Analyse eines genomischen Ubiquitin-Klons aus Mais. (A) Restriktionskarte des Ubiquitingens, 7,2b1. (B) Restriktionskarte von zwei subklonierten PstI-Fragmenten des Ubiquitingens 1. (C) Schematische Darstellung der Organisation des Mais-Ubiquitingens 1. Das 5'-nichttranslatierte Exon wird durch offene Kästchen angezeigt und die Tandem-Ubiquitin-kodierenden Regionen sind durch numerierte Kästchen angezeigt.
Die Fig. 2-1 bis 2-7 zeigen die DNA-Sequenz und die davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Ubiquitingens 1. Der Transkriptionsstart, wie er durch S1-Nukleasekartierung bestimmt worden ist, wird mit Base 1 bezeichnet. Sequenzen, die die mutmaßliche "TATA"-Box (-30) und die überlappenden Hitzeschock-Consensus-Sequenzen (-214 und -204) darstellen, sind unterstrichen. Das Intron erstreckt sich von Base 84 bis Base 1093, und die Polyubiquitinprotein-kodierende Sequenz erstreckt sich von Base 1094 bis 2693.
Fig. 3 zeigt, daß alle sieben der Ubiquitin-kodierenden Repeats für eine identische Aminosäuresequenz kodieren. Die Nukleotidsequenz der sieben Repeats ist unter der abstammenden Aminosäuresequenz in einer Linie gezeigt. Eine zusätzliche 77. Aminosäure, Glutamin, ist in dem 7.-Repeat, dem Stopkodon vorausgehend, vorhanden. Ein Polyadenylierungssignal, AATAAT, ist in der 3'-nichttranslatierten Region, 113bp vom Stopkodon, vorhanden.
Fig. 4 ist eine diagrammhafte Darstellung des Verfahrens, das für die Konstruktion der Maisubiquitinpromotorregion-Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) Genfusion verwendet wurde.
Fig. 5 zeigt einen Test für den Ubiquitinpromotor. CaMV-CAT: Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotor - CAT Genfusion; UBQ-CAT: Maisubiquitinpromotor - CAT Genfusion. -

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Definitionen werden gegeben, um Unklarheiten in Hinsicht auf Zweck oder Umfang ihrer Verwendung in der Beschreibung und den Ansprüchen zu entfernen.
Expression bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines Strukturgens.
Promotor bezieht sich auf Nukleotidsequenzen am 5' Ende eines Strukturgens, welche die Initiation der Transkription lenken. Promotorsequenzen sind notwendig, aber nicht immer ausreichend, die Expression eines downstream- Gens anzutreiben. Im allgemeinen beinhalten eukaryotische Promotoren eine charakteristische DNA-Sequenz homolog zur Consensus-5'-TATAAT-3' (TATA)-Box etwa 10 bis 30 bp 5' zur Transkriptionsstart-(cap)-Stelle, welche per Vereinbarung, mit + 1 numeriert ist. Basen 3' zur Cap-Stelle werden positive Zahlen gegeben, während Basen 5' zur Cap-Stelle negative Zahlen erhalten, was ihren Abstand von der Cap-Stelle widerspiegelt. Andere Promotorkomponenten, die CAAT-Box, werden oft etwa 30 bis 70 bp 5' zur TATA-Box gefunden und weisen Homologie zu der kanonischen Form 5'- CCAAT-3' auf (R. Breathnach und P. Chambon (1981) Ann. Rev. Biochem. 50 : 349-383). In Pflanzen ist die CAAT-Box manchmal durch eine Sequenz ersetzt, die als AGGA-Box bekannt ist, welches eine Region mit Adeninresten, die symmetrisch das Triplet G (oder T) NG flankieren, (J. Messing et al. (1983), in Genetic Engineering of Plants, T. Kosuge et al. (Hrsg.), Plenum Press, Seiten 211-227). Andere Sequenzen, die regulatorische Einflüsse auf die Transkription ausüben, können innerhalb der Promotorregion gefunden werden und erstrecken sich bis 1000 bp oder mehr von der Cap-Stelle.
Regulatorische Kontrolle bezieht sich auf die Modulation der Genexpression, die durch DNA-Sequenzelemente, die primär, aber nicht ausschließlich, upstream zur (5' zur) Transkriptionsstartstelle lokalisiert sind, induziert wird. Die Regulation kann eine alles-oder-nichts Antwort auf Umgebungsstimuli zur Folge haben oder kann Veränderungen im Level der Genexpression zur Folge haben. Bei dieser Erfindung wirken die Hitzeschock-regulatorischen Elemente so, daß sie den Level der downstream-Genexpression als Antwort auf eine plötzliche Temperaturerhöhung vorübergehend erhöhen.
Plazieren eines Strukturgens unter die regulatorische Kontrolle eines Promotors oder eines regulatorischen Elements meint das Positionieren des Strukturgens, so daß die Expression des Gens durch diese Sequenzen gesteuert wird.
Im allgemeinen wird gefunden, daß Promotoren 5'(upstream) zu den Genen positioniert sind, die sie steuern. Somit wird bei der Konstruktion von Kombinationen aus heterologem Promotor/Strukturgen der Promotor vorzugsweise upstream zum Gen und in einem Abstand von der Transkriptionsstartstelle positioniert, der dem Abstand zwischen dem Promotor und dem Gen, das er in seiner natürlichen Umgebung steuert, nahekommt. Wie es auf diesem Gebiet bekannt ist, können einige Veränderungen in diesem Abstand ohne Verlust der Promotorwirkung toleriert werden. Ähnlich spiegelt das bevorzugte Positionieren eines regulatorischen Elements in Hinsicht auf ein heterologes Gen, das unter seine Kontrolle gestellt wird, seine natürliche Position relativ zu dem Strukturgen, das er in der Natur reguliert, wieder. Wieder können, wie es auf diesem Gebiet bekannt ist, einige Veränderungen dieses Abstands hingenommen, bzw. akkommodiert werden.
Die Promotorwirkung kann während der Expression eines Strukturgens, das unter seiner regulatorischen Kontrolle steht, auf der transkriptionalen Ebene unter Verwendung von DNA-RNA-Hybridisierungstests ("Northern"-Blots) und auf der translationalen Ebene unter Verwendung spezifischer funktionaler Tests für das synthetisierte Protein (z. B. durch Messung der enzymatischen Aktivität oder durch Immunoassay des Proteins) getestet werden.
Das Strukturgen ist jener Teil eines Gens, der ein DNA-Segment, das für ein Protein, Polypeptid oder einen Teil davon kodiert, enthält und die 5'-Sequenz, die die Initiierung der Transkription antreibt, nicht einschließt. Das Strukturgen kann eines sein, das normalerweise in einer Zelle gefunden wird oder eines sein, das normal nicht an der zellulären Stelle gefunden wird, wo es eingeführt worden ist, wobei in diesem Fall von einem heterologen Gen gesprochen wird. Ein heterologes Gen kann ganz oder teilweise aus irgendeiner auf diesem Fachgebiet bekannten Quelle einschließlich einem bakteriellen Genom oder Episom, eukaryotischer DNA, Kern- oder Plasmid-DNA, cDNA, viraler DNA oder chemisch synthetisierter DNA stammen. Ein Strukturgen kann eine oder mehrere Modifikationen in entweder der kodierenden oder der nichttranslatierten Region enthalten, welche die biologische Aktivität oder chemische Struktur des Expressionsprodukts, die Expressionsrate oder die Art und Weise der Expressionskontrolle beeinflussen können. Solche Modifikationen schließen ein, aber sind nicht beschränkt darauf, Mutationen, Insertionen, Deletionen und Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide. Das Strukturgen kann eine nicht-unterbrochene kodierende Sequenz bilden oder kann ein oder mehrere Introns enthalten und zwar gebunden durch geeignete Spleißverbindungsstellen. Das Strukturgen kann eine Zusammensetzung von Fragmenten, die aus einer Vielzahl von Quellen stammen, natürlich vorkommenden oder synthetischen, sein. Das Strukturgen kann auch für ein Fusionsprotein kodieren. Es ist beabsichtigt, daß die Einführung rekombinanter DNA- Moleküle, die den Promotor/Strukturgen/Polyadenylierungssignal-Komplex enthalten, in Pflanzengewebe Konstrukte beinhaltet, wo das Strukturgen und sein Promotor aus jeweils verschiedenen Pflanzenarten stammen.
Das Pflanzen-Ubiquitin-regulatorische System bezieht sich auf eine etwa 1 kb Nukleotidsequenz 5' zur Translationsstartstelle des Mais-Ubiquitingens und umfaßt Sequenzen, die die Initiation der Transkription, Regulation der Transkription, Steuerung des Expressionslevels, Induktion von Streßgenen und Vergrößerung der Expression als Antwort auf Streß lenken. Das regulatorische System, das sowohl den Promotor als auch regulatorische Funktionen enthält, ist die DNA-Sequenz, die die regulatorische Kontrolle oder Modulation der Genexpression bereitstellt. Ein Strukturgen, das unter die regulatorischen Kontrolle des Pflanzen-Ubiquitin-regulatorischen Systems gestellt ist, meint, daß ein Strukturgen so positioniert ist, daß die regulierte Expression des Gens durch die Sequenzen gesteuert wird, die das Ubiquitin-regulatorische System umfassen.
Das Polyadenylierungssignal bezieht sich auf irgendeine Nukleinsäuresequenz, die mRNA-Prozessierung bewirken kann, welche gewöhnlich durch das Hinzufügen eines Polyadenylsäurestücks an das 3'-Ende des mRNA-Precursors gekennzeichnet ist. Das Polyadenylierungssignal-DNA-Segment kann selbst eine Zusammensetzung von Segmenten sein, die aus verschiedenen Quellen, natürlich vorkommenden oder synthetischen, stammen und kann aus einer genomischen DNA oder einer von einer mRNA-stammenden cDNA sein. Polyadenylierungssignale werden gewöhnlich durch das Vorhandensein von Homologie zu der kanonischen Form 5'-AATAA-3' erkannt, obwohl Veränderungen des Abstands, teilweises "readthrough", und multiple Tandem-kanonische Sequenzen nicht unüblich sind (J. Messing et al. supra). Es sollte erkannt werden, daß ein kanonisches "Polyadenylierungssignal" in der Tat transkriptionale Termination und nicht Polyadenylierung an sich verursachen kann (C. Montell et al. (1983) Nature 305 : 600-605).
Das Pflanzengewebe beinhaltet differenzierte und undifferenzierte Gewebe von Pflanzen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Wurzeln, Triebe, Blätter, Pollen, Samen, Tumorgewebe und verschiedene Formen von Zellen in Kultur, wie Einzelzellen, Protoplasten, Embryos und Kallusgewebe. Das Pflanzengewebe kann "in planta" oder in Organ-, Gewebe- oder Zellkultur sein.
Homologie wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf die Identität oder nahe Identität von Nukleotid- und/oder Aminosäuresequenzen. Wie es auf diesem Fachgebiet verstanden wird, können Nukleotid-Mismatches an der dritten oder Wobblebase im Kodon ohne Aminosäure-Substitutionen in der endgültigen Polypeptidsequenz zu verursachen, auftreten. Auch können geringe Nukleotidmodifikationen (z. B. Substitutionen, Insertionen oder Deletionen) in bestimmten Regionen der Gensequenz toleriert werden und als nicht wesentlich betrachtet werden, wann immer solche Modifikationen zu einer Änderung der Aminosäuresequenz führen, die nicht die Funktionalität des Endprodukts verändert. Es wurde gezeigt, daß chemisch synthetisierte Kopien von ganzen oder Teilen von Gensequenzen die entsprechenden Regionen in dem natürlichen Gen ohne Verlust der Genfunktion ersetzen können. Homologe spezifische DNA-Sequenzen können durch Fachleute unter Verwendung des Nukleinsäure-Kreuzhybridisierungs-Tests unter stringenten Bedingungen, wie auf diesem Fachgebiet gut bekannt ist, identifiziert werden (wie beschrieben in Hames and Higgins (Hrsg.) (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, UK). Das Ausmaß der Homologie wird oft in prozentualer Identität zwischen den verglichenen Sequenzen gemessen. Somit soll es in dieser Anmeldung so verstanden werden, daß geringe Sequenzvariationen innerhalb homologer Sequenzen existieren können.
Stammend von wird hier so verwendet, daß es entnommen, erhalten, empfangen, aufgespürt, repliziert oder von einer Quelle (chemisch und/oder biologisch) herkommend meint. Ein Derivat kann durch chemische oder biologische Manipulation (einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Substitution, Addition, Insertion, Deletion, Extraktion, Isolation, Mutation und Replikation) der Originalquelle hergestellt werden.
Chemisch synthetisiert meint mit Bezug auf eine DNA-Sequenz, daß die Nukleotide der Komponente in vitro zusammengesetzt werden. Manuelle chemische DNA-Synthese kann unter Verwendung gut bekannter Verfahren erreicht werden (M. Caruthers (1983) in Methodology of DNA and RNA Sequencing, Weissman (Hrsg.), Praeger Publishers (New York) Kapitel 1) oder automatische chemische Synthese kann unter Verwendung einer von einer Anzahl kommerziell erhältlicher Maschinen durchgeführt werden.
Hitzeschockelemente beziehen sich auf DNA-Sequenzen, die die Genexpression als Antwort auf den Streß plötzlicher Temperaturerhöhungen regulieren. Diese Antwort wird als eine sofortige, wenn auch vorübergehende Vergrößerung des Expressionslevels eines Downstreamgens gesehen. Die Originalarbeit über Hitzeschockgene wurde mit Drosophila unternommen, aber viele andere Arten einschließlich Pflanzen (T. Barnett et al. (1980) Dev. Genet. 1 : 331- 340) zeigten analoge Antworten auf Streß. Die wesentliche Hauptkomponente der Hitzeschockelemente wurde in Drosophila beschrieben und hat die Consensus-Sequenz 5'-CTGGAAT-TTCTAGA-3'und ist in der Region zwischen den Resten -66 bis -47 bp upstream der transkriptionalen Startstelle lokalisiert (H. Pelham und M. Bienz (1982) supra). Eine chemisch synthetisierte Oligonukleotidkopie dieser Consensus-Sequenz kann die natürliche Sequenz beim Verleihen der Hitzeschock-Induzierbarkeitersetzen. In anderen Systemen wurden multiple Hitzeschockelemente innerhalb der Promotorregion identifiziert. Zum Beispiel erkannten Rochester et al. (1986) supra zwei Hitzeschockelemente im Mais-hsp 70 Gen.
Die Leadersequenz bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die etwa 100 Nukleotide zwischen der Transkriptionsstartstelle und der Translationsstartstelle lokalisiert ist. Innerhalb der Leadersequenz ist eine Region umfaßt, die die ribosome Bindungsstelle spezifiziert.
Introns oder intervenierende Sequenzen beziehen sich in dieser Arbeit auf solche Regionen der DNA-Sequenz, die zusammen mit den kodierenden Sequenzen (Exons) transkribiert werden, aber dann bei der Bildung der maturierten mRNA entfernt werden. Introns können überall innerhalb einer transkribierten Sequenz auftauchen - zwischen kodierenden Sequenzen desselben oder verschiedener Gene, innerhalb der kodierenden Sequenz eines Gens, was seine Aminosäuresequenz unterbricht und zerteilt und innerhalb der Promotorregion (5' zur Translationsstartstelle). Introns im Primärtranskript werden herausgeschnitten, und die kodierenden Sequenzen werden gleichzeitig und exakt ligiert, um die maturierte mRNA zu bilden. Die Verbindungen der Introns und Exons bilden die Spleißstellen. Die Basensequenz eines Introns beginnt mit GU und endet mit AG. Dasselbe Spleißsignal wird in vielen höheren Eukaryoten gefunden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung eines rekombinanten Vektors, der für die Expression von DNA-kodierenden Segmenten in Pflanzenzellen brauchbar ist. Der hier beschriebene Vektor benutzt einen Mais-Ubiquitin-Promotor, um die Expression eines insertierten DNA-kodierenden Segments zu steuern. Die transkriptionalen regulatorischen Sequenzen können mit einem extrachromosomalen Replikationssystem für einen vorbestimmten Wirt kombiniert sein. Andere DNA-Sequenzen mit Restriktionsstellen für die Geninsertion können hinzugefügt sein, um einen Vektor für die regulierte Transkription und Translation insertierter Gene in diesem Wirt bereitzustellen. Der Vektor kann auch ein prokaryotisches Replikationssystem, das die Amplifikation in einem prokaryotischen Wirt erlaubt, Marker für die Selektion und andere DNA-Regionen enthalten. Dies würde erlauben, große Mengen des Vektors in gut charakterisierten Bakteriensystemen vor der Transformation eines Pflanzen- oder Säugetierwirts wachsen zu lassen. Die Prinzipien für die Konstruktion eines Vektors mit geeigneter Orientierung des Promotors und der kodierenden Sequenzen bezüglich einander sind dem Fachmann gut bekannte Angelegenheiten. In einigen Situationen mag es wünschenswert sein, das Promotorsystem mit einem gewünschten Strukturgen zu verbinden und die sich ergebende Konstrukt-DNA direkt in einen Wirt einzuführen. Verfahren für solchen direkten Transfer schließen ein, aber sind nicht darauf beschränkt, Protoplastentransformation, Elektroporation, direkte Injektion von DNA in den Kern und Co-Transformation durch Calciumpräzipitation.
Diese Erfindung umfaßt den ersten Bericht eines isolierten und charakterisierten Pflanzen-Ubiquitinpromotors. Der Mais-Ubiquitinpromotor, wie er in der vorliegenden Arbeit beschrieben wird, schließt die RNA-Polymeraseerkennung und -bindungsstellen, die transkriptionale Initiationssequenz (cap-Stelle), regulatorische Sequenzen verantwortlich für die induzierbare Transkription und eine nicht translatierbare dazwischenliegende (intervenierende) Sequenz (Intron) zwischen der transkriptionalen Startstelle und der translationalen Initiationsstelle ein. Zwei überlappende Hitzeschock-Consensus-Promotorsequenzen befinden sich 5'(-214 und -204) von der transkriptionalen Startstelle. Ein Exon von 83 Nukleotiden ist direkt benachbart zur Cap-Stelle lokalisiert und ihm folgt ein großes (etwa 1 kb) Intron.
Der Ubiquitinpromotor zusammen mit dem Ubiquitinstrukturgen kann aus zwei etwa 2 kb Pst-Fragmenten des Mais-Genoms (Fig. 1) isoliert werden. Das gesamte Fragment kann verwendet werden, um die Promotorfunktion durch Überwachen der Expression der mRNA oder des Proteins zu zeigen. Die Einführung eines heterologen Gens downstream des Ubiquitin-Translationsinitiationskodons wird zur Expression eines Fusionsproteins führen. Die Insertion eines heterologen Gens (mit seinen eigenen Start- und Stopkodons) zwischen dem Ubiquitinpromotor und dem Translationsinitiationskodon wird zur Expression des nativen Polypeptids, das dem insertierten Gen entspricht, führen. Die Insertion des gewünschten Strukturgens wird am günstigsten mit der Verwendung von Linkern mit Blunt-Enden an den Enden des Gens erreicht.
Alternativ kann das Ubiquitin-Genfragment mit Restriktionsenzymen verdaut sein, insbesondere an der Stelle, die dem Start des Strukturgens direkt vorausgeht oder an einer Stelle, die der Transkriptionsstartstelle vorausgeht. Zum Beispiel war das Promotorfragment in der vorliegenden Erfindung aus dem Ubiquitingen als ein etwa 2 kb PstI-Fragment zu gewinnen. Um sicherzustellen, daß das Promotorfragment frei von dem Translationsinitiationskodon ist, kann das Fragment, das die 5'-flankierende Region enthält, selektiv mit Doppelstrang-Exonuklease unter kontrollierten Bedingungen verdaut werden, um eine gewünschte Anzahl von Nukleotidpaaren zu entfernen. Es ist wünschenswert, das Ubiquitin-Translationsinitiationskodon zu entfernen, so daß die Translation des insertierten Gens an seiner eigenen Startstelle beginnen wird. Das isolierte (und verkürzte) Promotor-Fragment wird dann in den Vektor insertiert, und zwar unter Verwendung von Linkern oder Homopolymer-Tailing, um gewünschte Restriktionsstellen, die mit den verbleibenden Regionen des Vektors kompatibel sind, einzuführen. Im allgemeinen kann das Promotor-Fragment mit spezifischen Restriktionsenzymen geschnitten sein, und die sich ergebenden verkürzten DNA-Fragmente werden auf die Promotor-Funktion getestet und mit denen des intakten Promotors verglichen. Zusätzlich können DNA-Kodons hinzugefügt werden und/oder existierende Sequenzen können verändert werden, um Derivat-DNA-Fragmente, die die Promotorfunktionen erhalten haben, zu ergeben.
Die sich ergebenden DNA-Konstrukte können als Klonierungsvehikel für ein interessierendes Strukturgen in einem Pflanzenwirt brauchbar sein. Bei dieser Erfindung wurde das Strukturgen, das CAT entweder unter der Kontrolle des Mais-Ubiquitinpromotors oder des Blumenkohl-Mosaikviruspromotors kodiert, in sowohl Hafer- als auch Tabakzellen exprimiert. Wenn der Ubiquitinpromotor verwendet wurde, wurde ein größeres Expressionsausmaß mit dem monocotyledonen Wirt als mit dem decotyledonen Wirt erreicht; jedoch wurde ein höherer Expressionslevel mit decotyledonem als mit monocotyledonem Wirt erreicht, wenn der Blumenkohl-Mosaikviruspromotor verwendet wurde. Der Unterschied in den Expressionslevel spiegelt, die inhärente Ungleichheit der verschiedenen Promotoren und auch die grundsätzlichen zellulären Unterschiede bei der Regulation der Expression und Prozessierung zwischen monocotyledonen und decotyledonen Wirten wieder. Zur Zeit ist es nicht vorhersagbar, Routine oder naheliegend, daß ein monocotyledoner Promotor in einer decotyledonen Wirtszelle funktioniert.
Eine breite Vielfalt von Strukturgenen kann in die betreffenden DNA-Klonierungsvektoren für die Produktion gewünschter Proteine, wie z. B. Enzyme, Hormone u.ä., eingeführt werden. Zusätzlich können DNA-Konstrukte dieses Typs für die verbesserte Produktion von DNA, die aus einem besonderen Gen stammt, verwendet werden, ebenso für die verbesserte Produktion von mRNA, die verwendet werden kann, um cDNA herzustellen. Solche Vektoren, die spezifische DNA-Sequenzen enthalten, finden breite Anwendung und sind ziemlich vielseitig; z. B. können sie für die Amplifikation in Bakterien und auch für die Expression in höheren Zellen, die zusätzliche zelluläre Funktionen berücksichtigen, verwendet werden. Ein Vorteil der Verwendung höherer eukaryotischer rekombinanter Systeme, um kommerziell medizinische und landwirtschaftlich wünschenswerte Proteine herzustellen, ist, daß sie korrekte post-translationale Modifikationen sicherstellen, welche andernfalls in prokaryotischen und niederen eukaryotischen Wirten schwierig zu duplizieren sein könnten.
In dieser Erfindung wurde gezeigt, daß der Mais-Ubiquitinpromotor in Hafer und Tabak als Beispiele von Monocotyledonen und Dicotyledonen funktioniert, und es ist denkbar, daß dieser Promotor in noch anderen Zellen funktioniert. Solche Systeme schließen beispielsweise und ohne Beschränkung andere Zellen, von denen Ubiquitingene isoliert worden sind, ein und wurden höchst konserviert gefunden, z. B. in anderen Monocotyledonen zusätzlich zu Mais, anderen Dicotyledonen als Tabak, niederen eukaryotischen Organismen, wie z. B. Hefe und in Säugetierzellen. Das Screening zellulärer Systeme, die für die Verwendung mit dem Mais-Ubiquitinpromotor geeignet sind, kann gemäß der hier gegebenen Lehre ohne übermäßigen Experimentieraufwand erreicht werden. Die Konstruktion von Vektoren, die für die Expression eines DNA-kodierenden Segments in individuellen Systemen geeignet sind, wurde gut dokumentiert. Shuttle-Vektoren, die zur Replikation in mehr als einem Wirt fähig sind, wurden auch beschrieben, z. B. Shuttle-Expressionsvektoren für sowohl Hefe- als auch Säugetierzellen, für Pflanzen und Tierzellen und für Pflanzen und Bakterienzellen. Zusätzlich soll es so verstanden werden, daß Ubiquitingene aus irgendeinem anderen System, die ähnlich wie zu Mais- Ubiquitingen als Pflanzenpromotor funktionieren, als Quelle für die Ubiquitinpromotorsequenz verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des Mais- Ubiquitinpromotors als Hitzeschockpromotor. Zwei Hitzeschock-Consensus- Sequenzen sind upstream des Mais-Ubiquitingens an den Positionen -214 und -204 lokalisiert. In vielen Eukaryoten wurde gezeigt, daß natürlich vorkommende und chemisch-synthetisierte Sequenzen, die homolog zu der Hitzeschock-Consensus-Sequenz sind, die Induktion der Genexpression regulieren. Obwohl der Ubiquitinpromotor Sequenzen enthält, die als solche des Hitzeschock-Elements identifiziert wurden, unterscheidet sich der Promotor von klassischen Hitzeschockpromotoren (1) indem er ein nicht-translatiertes Intron 3' zur Transkriptionsstartstelle hat und (2) indem die Regulation der Ubiquitinexpression konstitutiv als auch induktiv stattfindet. Die funktionale Beziehung zwischen Hitzeschockelementen und dem Vorhandensein eines langen Introns innerhalb der Promotorregion ist im Stand der Technik unbekannt. Der Nukleotidabstand zwischen diesen charakteristischen Merkmalen und auch die Ausrichtung und Orientierung eines Elements im Hinblick auf das andere werden in der vorliegenden Arbeit als variabel vermutet, solange die Hauptpromotorfunktion der Derivat-regulatorischen Fragmente aktiv bleibt.
Das Vorhandensein eines Introns in der Promotorregion wurde mit der relativen Stabilität des unprozessierten mRNA-Transkripts und indirekt mit dem Level des synthetisierten Proteins in Zusammenhang gebracht (Callis et al. (1987) Genes and Development 1 : 1183-1200). Es wurde berichtet, daß konstitutiv exprimierte Ubiquitin-mRNA in Hühnerembryo-Fibroplasten in stabilen Level beibehalten wird, während Ubiquitin-mRNA, die als Antwort auf Streß gebildet wurde, eine Halbwertzeit von etwa 1,5 bis 2 Stunden hat.
In Hefe wurden vier einzelne Ubiquitin-kodierende Loci beschrieben. Konstitutiv exprimiertes Ubiquitin wird durch ein oder mehrere der drei Ubiquitingene kodiert, wovon zwei ein etwa 400 bp Intron direkt innerhalb der kodierenden Region enthalten. Das vierte Ubiquitingen frei von einem nicht translatierten Intron, aber mehrere Hitzeschockelemente enthaltend, bewirkt in erster Linie die Induktion der Ubiquitinexpression als Antwort auf Streß. Es wurde gezeigt, daß das letztere Ubiquitingen nicht konstitutiv wirkt, sondern eher angeschaltet wird als Antwort auf Hitzeschock oder eines Streßsignals (E. Ozkaynak et al. (1987) EMBO J. 6 : 1429-1439).
In Mais wird Ubiquitin durch eine kleine Multigenfamilie kodiert. In dieser Erfindung wird die Nukleotidsequenz eines der Ubiquitingene gezeigt. Ein großes (etwa 1 kb) Intron zwischen der transkriptionalen und translationalen Startstelle und auch Nukleotidsequenzen, die den Consensus-Hitzeschocksequenzen entsprechen, werden innerhalb der Mais-Ubiquitinpromotorregion gefunden. Diese zwei Regionen der Spezialisierung sind höchstwahrscheinlich bei der Ubiquitinsynthese beteiligt und bei der Regulation des Ubiquitin-Levels als Antwort auf äußere Einflüsse. Die funktionale Beziehung zwischen dem Intron und den Hitzeschockelementen, die innerhalb des Ubiquitinpromotors umfaßt sind, ist unbekannt. Es wird in dieser Erfindung berichtet, daß der Mais-Ubiquitinpromotor die mRNA-Synthese sowohl unter normalen als auch unter Hitzeschockbedingungen reguliert und daß Veränderungen bei der Regulation der Transkription für die Erhöhung der Ubiquitinsynthese nach Hitzeschock verantwortlich sind.
Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung gegeben, nicht um beschränkend zu wirken.

BEISPIELE

Beispiel 1:

Isolation und Charakterisierung des Mais-Ubiquitingens

A. Wachstum der Pflanzen

Zea mays-Inzuchtlinie B73 wurde in feuchtem Vermiculit für 4 bis 5 Tage bei 25ºC in der Dunkelheit wachsengelassen. Der Teil der Keimlinge vom Mesocotyl-Wurzelknoten zur Keimspitze wurde geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt.

B. RNA-Isolation und -analyse

Zelluläre Gesamt-RNA wurde aus gefrorenem Gewebe unter Verwendung des Guanidinthiocyanat-Verfahrens extrahiert. Poly(A)&spplus; RNA wurde aus der zellulären Gesamt-RNA durch Durchlauf über eine Poly U-Sephadex-Säule (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) isoliert. Gesamt- oder Poly(A)&spplus; RNA wurde auf 1,5% Agarosegelen, die 3% (wt/vol) Formaldehyd enthielten, elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde auf Gene ScreenTM (DuPont) durch Kapillarblotting unter Verwendung von 25 mM Natriumphosphat (pH 6,5) übertragen.
Die Blots wurden in 50% Formamid, 5XSSC, 100 ug denaturierter Lachs- DNA, 40 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,5% BSA und 1% SDS prehybridisiert. Die Blots wurden in 50% Formamid, 5XSSC, 100 ug/ml denaturierter Lachs-DNA, 40 mM Natriumphosphat (pH 6,8) und 10% Dextransulfat hybridisiert.

C. Konstruktion der cDNA-Bibliothek

Doppelstrang cDNA wurde aus Poly(A)&spplus; RNA durch eine Modifikation des Verfahrens von Murray et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2 : 75-84 synthetisiert. Oligo(dC)-Tailing der Doppelstrang-cDNA und das Annealing der mit Oligo(dC)-Schwänzen versehenen cDNA mit Oligo(dG)-Schwänzen versehenem pBR322 wurde unter Verwendung der Standardtechnik durchgeführt. Die angelagerte (annealed) DNA wurde in E. coli HB101 transformiert und direkt auf Nitrozellulosefilter (Millipore, HATF; 0,45 um) auf L-Agar-Platten, die Tetracyclin (15 ug/ml) enthielten, plattiert.

D. Identifikation der Ubiquitin-cDNA

Eine Anzahl von cDNAs, die potentiell Licht-regulierte mRNAs darstellen, wurde durch Screening einer cDNA-Bibliothek durch Differentialhybridisierung erhalten. Verschiedene dieser cDNAs wurden selektiert und weiter durch RNA-Blotanalyse gescreent, um die Lichtregulation zu bestätigen. Ein cDNA- Klon, p6R7.2b1, während er keine durch rotes Licht regulierte mRNA darstellte, war von Interesse, weil er mit drei Poly(A)&spplus; RNAs verschiedener Größe und Häufigkeit hybridisierte. Der Nick-translatierte p6T7.2b1 hybridisierte stark mit den mRNAs mit 2100 Nukleotiden und 1600 Nukleotiden, aber nur schwach mit dem Transkript mit 800 Nukleotiden. Jedoch detektierte die Hybridisierung von Northern-Blots mit einer Einzelstrang-³²p-markierten RNA, die durch SP6-Polymerase-Transkription linearisierter pCA210 erzeugt worden war, welches ein durch Subklonieren des cDNA-Inserts von p6T7.2b1 in pSP64 konstruiertes Plasmid ist, leicht alle drei Transkripte.
Weil bekannt ist, daß RNA-RNA-Hybride thermisch stabiler sind als DNA-RNA- Hybride wurden Einzelstrang-RNA-Sonden eher als Nick-translatierte DNA- Sonden in Northern-Blot-Hybridisierungen verwendet. Wieder wurde gefunden, daß das 1600 Basen-Transkript etwa dreimal weniger häufig als das 2100 Basen-Transkript vorkommt, wie es durch Northern-Blots bestimmt worden ist, ungeachtet dessen, ob der Blot mit Nick-translatierter DNA oder Einzelstrang-RNA-Sonden hybridisiert worden war. Das kleinste Transkript war etwa halb so häufig wie die 2100 Basen-mRNA in Blots, die mit RNA- Sonden hybridisiert worden waren.
Restriktionsfragmente wurden in M13mp18 und/oder mp19 subkloniert und durch das Dideoxynukleotidketten-Terminationsverfahren sequenziert. Die Sequenzanalyse des Klons zeigte einen einzelnen offen Leserahmen von 818 bp, der durch ein TAA-Stopkodon terminiert wurde. Die "National Biochemical Research Foundation"-Bibliothek wurde unter Verwendung des "D fast P"- Programms für Proteinsequenzen, die homolog zu der abgeleiteten Aminosäuresequenz sind, abgesucht. Eine größere als 95%ige Homologie wurde zwischen der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Mais-cDNA-Klons und den Sequenzen von Rinder- und menschlichem Ubiquitin gefunden.

E. Konstruktion einer genomischen Bibliothek und Screening

Mais-DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus gefrorenen Mais-Keimlingen isoliert. Die DNA wurde partiell mit Sau3A verdaut, größenfraktioniert und in die BamHI-Stellen von Charon 35 (Loenen et al. (1983) Gene 26 : 171- 179) kloniert. Eine Bibliothek von etwa 2·10&sup6;pfu wurde auf rekombinante Phagen, die Sequenzen homolog zu dem Ubiquitin-cDNA-Klon enthielten, durch in situ-Plaquehybridisierung unter Verwendung eines Ubiquitin-cDNA- Klons als Hybridisierungsprobe gescreent. Rekombinante Phagen wurden aus Broth-Lysaten gereinigt und Phagen-DNA wurde mittels Standardtechniken isoliert. Restriktionendonukleasenverdaus wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt.

Genomische Southern-Blot-Analyse

Isolierte Mais-DNA mit hohem Molekulargewicht wurde mit EcoRI, HindIII und SacI verdaut, auf 0,7% Agarosegelen fraktioniert und die DNA-Fragmente wurden auf Gene Screen PlusTM (DuPont) übertragen. Filter wurden für 6 bis 8 Stunden bei 65ºC in 6XSSC (1XSSC = 0,15M NaCl, 0,025 M Na-Citrat), 5X Denhardt's Medium, 100 ug/ml denaturierter, Ultraschall-behandelter Lachs-DNA, 20 ug/ml Polyadenylsäure, 10 mM Dinatrium-EDTA und 0,5% SDS pre-hybridisiert. Die Filter wurden bei 65ºC in frischem Puffer mit³²pmarkierter Plasmid-DNA (pCA210) hybridisiert. Die Autoradiographie wurde bei -80ºC unter Verwendung von Kodak X-OMAT AR-Film und einem "Du- Pont Cronex Lightning Plus intensifying-Screen" ausgeführt. Bei jedem Verdau hybridisierten 8 bis 10 Restriktions-Fragmente mit der Nick-translatierten pCA210-Sonde, was nahelegt, das Ubiquitin durch eine kleine Multigen- Familie kodiert wird. Der Beweis, daß Ubiquitin durch eine kleine Multigen- Familie kodiert wird, wurde für Xenopus, Gerste und Hefe berichtet.
Zwei oder drei Fragmente in jedem Verdau hybridisierten stark mit der Sonde, während die übrigen Fragmente schwach hybridisierten. Die Unterschiede bei den Hybridisierungsintensitäten können verschiedene Sequenz-Homologie wiedergeben, so daß die cDNA-Sonde vorzugsweise mit den Genen hybridisiert, von der sie stammt.
Ubiquitin-Gene aus Hefe und Xenopus wurden charakterisiert und haben sechs bzw. mindestens zwölf Ubiquitin-Repeats. Mais-Gene entsprechend den drei auf den Northern-Blots detektierten Transkripte haben sieben, fünf und eins oder zwei Ubiquitin-Repeats in den 2,1, 1,6 bzw. 0,8 kb mRNAs. Das in dieser Erfindung beschriebene Mais-Ubiquitin-Gen kodiert für sieben Repeats. Somit kann der auf den Southern-Blots beobachtete Unterschied in der Hybridisierungsintensität ein Ergebnis der Restriktionsfragmente sein, die eine unterschiedliche Anzahl von Ubiquitin-Repeats enthalten.
Der Ubiquitin-cDNA-Klon enthielt keine EcoRI- und HindIII-Stelle. Jedoch können die Mais-Ubiquitin-Gene Introns enthalten, die durch die in den genomischen Verdaus verwendeten Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten werden. Dies kann zu Ubiquitin-Exons auf verschiedenen Fragmenten führen und kann für die unterschiedlichen Hybridisierungsintensitäten, die in den Southern-Blots beobachtet wurden, verantwortlich sein.

G. Ubiquitin-Sequenzanalyse und Analyse der Transkriptionsstartstelle

Die Dideoxynukleotidketten-Terminationssequenzierung wurde unter Verwendung der Klenow-Fragmente von DNA-Polymerase 1 (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Ein 1 ,85 kb PstI-Fragment des genomischen Klons 7,2b1 (siehe Fig. 1b), der homolog zu dem cDNA-Klon p6T7.2b.1 und das 2 kb PstI-Fragment direkt upstream, das AC3#9M13RF genannt wird, wurden in beiden Richtungen in M13mp19 subkloniert. Rekombinante Phagen-RF-DNA wurde als Plasmid-DNA präpariert. Klone mit unidirektionalen progressiven Deletionen wurden zum Sequenzieren beider Stränge dieser PstI-Fragmente hergestellt. Exonuklease III und Exonuklease VII wurden von New England Biolabs bzw. Bethesda Research Laboratories erhalten. Die Computeranalyse der DNA-Sequenzen wurde unter Verwendung von Programmen, die durch die "University of Wisconsin Genetics Computer Group" erhältlich gemacht wurden, durchgeführt.
Die Transkriptionsstartstelle des Ubiquitin-Gens und die 3'-Verbindung des Introns und Exons in der 5'-nichttranslatierten Region des Gens wurden durch S1-Nuklease-Kartierung bestimmt. Für S1-Sonden geeignete Fragmente wurden wie folgt hergestellt. Die Ubiquitin-DNA wurde entweder mit BgIII oder Xhol verdaut. Diese wurden dann mit ³²p unter Verwendung von -³²p- ATP (6000 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) und T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) markiert. Nachfolgender Verdau der BgIII und Xhol-kinasierten Fragmente mit PstI bzw. EcoRI erzeugten ein 946 bp PstI- BIII-Fragment und ein 643 bp EcoRI-XhoI-Fragment. Diese Fragmente wurden von den anderen end-markierten Fragmenten durch Elektrophorese über ein 5%-Polyacrylamidgel getrennt. Stücke, die die 946 bp PstI-BgIII und die 643 bp EcoRI-XhoI-Fragmente enthielten, wurden aus dem Gel geschnitten und die markierten DNAs wurden aus dem Gel eluiert. Das end-markierte DNA-Fragment (10-20 fmol) wurde mit 2 ug Poly(A)&spplus; RNA in 30 ul Puffer, der 80% deionisiertes Formamid, 0,4 M Natriumchlorid, 40 mM PIPES (pH 6,4) und 1 mM EDTA (pH 8,0) enthielt, hybridisiert. Die Nukleinsäurelösung wurde für etwa 16 Stunden auf 80ºC erhitzt. Eiskalter S1 -Verdaupuffer (300 ul), der 280 mM Natriumchlorid, 50 mM Natriumacetat (pH 4,6), 4,5 mM Zinksulfat und 20 ug/ml Einzelstrang-DNA enthielt, wurde hinzugefügt, und die DNA mit 250 Units/ml S1-Nuklease (New England Nuclear) verdaut. Die Reaktion wurde mit 75 ul S1-Terminationsmix, der 2,5 M Ammoniumacetat und 50 mM EDTA enthielt, gestoppt. Die Produkte des S1-Nuklease-Verdaus wurden dann auf einem 6% Polyacrylamid/8M Harnstoffgel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Endpunkte der S1-geschützten Fragmente in der Ubiquitin-Sequenz wurden bestimmt durch Vergleich mit einer Sequenzleiter, die durch Maxam/Gilbert-Basen Modifikations-Spaltreaktionen erzeugt worden war, wobei die Reaktionen an den als S1-Sonden verwendeten end-markierten Fragmenten durchgeführt worden waren.
Die DNA-Sequenz des Mais-Ubiquitin-1-Gens, 7,2b1, ist in den Fig. 2-1 bis 2-7 gezeigt. Die Sequenz ist aus 899 Basen upstream der Transkriptionsstartstelle, 1992 Basen 5'-nichttranslatierte und Intronsequenzen und 1 999 Basen, die sieben Ubiquitin-Proteinrepeats kodieren und den 249 Basen der 3'-Sequenz vorausgehen, zusammengesetzt. Eine "TATA"-Box ist bei -30 lokalisiert und zwei überlappende Hitzeschock-Elemente sind bei -214 und -240 (-204) lokalisiert. Die DNA-Sequenz der kodierenden und der 3'-Region des Ubiquitin-1-Gens von Mais, 7,2b1, ist auch in Fig. 3 gezeigt. Die von Mais Ubiquitin stammende Aminosäuresequenz ist oben gezeigt, und die Nukleotidsequenz der sieben Ubiquitin-Repeats ist unterhalb in einer Reihe angeordnet. Ein Schema der Organisation der sieben vollständigen Ubiquitineinheiten in der genomischen DNA ist in Fig. 1C gezeigt.
Die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen aller Ubiquitin-Repeats sind identisch (Fig. 3). Das terminale (siebte) Ubiquitin-Repeat enthält eine zusätzliche 77. Aminosäure, Glutamin, vor dem TAA-Stop-Kodon. Diese zusätzliche Aminosäure wird nicht in reifem Ubiquitin gefunden und wird scheinbar während der Prozessierung entfernt. Die 77. Aminosäure des letzten Repeats ist im menschlichen Gen Valin, während sie in zwei Hühnergenen Tyrosin und Asparagin ist. Hefe und Gerste haben auch eine extra Aminosäure, Asparagin bzw. Lysin; jedoch wird keine extra Aminosäure im Xenopus-Gen gefunden. Es wurde vorgeschlagen, daß die extra Aminosäure als ein Hindernis für die Konjugation von unprozessiertem Polyubiquitin an Targetproteine wirkt. Ein Polyadenylierungssignal (AATAAT) ist in der 3'-nichttranslatierten Sequenz, 113 bp vom Stopkodon, vorhanden.
Alle sieben Repeats kodieren für die identische Aminosäuresequenz, während die Nukleotidsequenz der Repeats in nicht weniger als 39 Nukleotiden abweicht. Dies ist ähnlich zu dem, was für die Nukleotidsequenzhomologien zwischen Ubiquitingenen berichtet worden ist. Etwa 80% der Nukleotid-Mismatches zwischen Ubiquitin-Repeats sind in der dritten (wobble) Base im Kodon. Wechselnde Kodonverwendung für Leucin (5 Kodons), Serin (3 Kodons) und Arginin (3 Kodons) sind für die verbleibenden Nukleotid-Mismatches verantwortlich.
Die Aminosäuresequenz für Mais-Ubiquitin ist identisch zu der, die für zwei höhere Pflanzen, Hafer und Gerste, bestimmt worden ist. Die Sequenz unterscheidet sich von der für Hefe berichteten Sequenz durch zwei Aminosäuren; Alanin für den Serin-Ersatz an den Positionen 28 und 57. Die Mais-Sequenz ist auch leicht unterschiedlich von der für Ubiquitin aus allen Tieren berichteten; Austausche durch Serin für Prolin an Position 19, Aspartat für Glutamat an Position 24 und Alanin für Serin an Position 57. Somit scheint es, basierend auf der Sequenz, drei Typen von Ubiquitin zu geben: Pflanzen, Tiere und Hefe.

Beispiel 2:

Konstruktion des Plasmids pUB-CAT, das den Mais-Ubiquitinpromotor und ein Strukturgen enthält

A. Isolation des Promotors und Konstruktion von pUB-CAT

Das für die Konstruktion der Fusion von Ubiquitingen upstream Region-Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) Gen verwendete Verfahren ist in Fig. 4 gezeigt. Das BamHI-HindIII Restriktionsfragment, das das CAT-Gen und die Nopalinsynthase (NOS) 3'-nichttranslatierte Region und das Polyadenylierungssignal von pNOS-CAT enthält (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 5824-5828) wurde in mit BamHI und HindIII verdautem pUC18 subkloniert. Dieses Konstrukt wurde pUB-CAT genannt.
Ein etwa 2,0 kb PstI-Fragment direkt upstream der Ubiquitin-Polyprotein kodierenden Region des Mais-Ubiquitingens 7,2b1 wurde in M13mp19 subkloniert. Dieses DNA-Segment umspannt die Nukleotide -899 bis 1092 der in den Fig. 2-1 bis 2-7 dokumentierten Mais-Ubiquitinsequenz. Diese rekombinante DNA wurde AC3#9M13RF genannt und enthält den Ubiquitinpromotor, die 5'-nichttranslatierte Leadersequenz und etwa 1 kb Intron, das in Fig. 4 UBI-5' beschriftet ist.
Die Fusion aus Ubiquitinpromotor-CAT Reportergen wurde konstruiert durch Einführen von Blunt-Enden im 2,0 kb PstI-Fragment von AC3#9M13RF mit T&sub4;-DNA-Polymerase und Klonieren dieses Fragments in SmaI-verdautes pUC18-CAT. Dieses Konstrukt wurde pUB-CAT genannt.

B. Einführung von rekombinanter DNA in Hafer- und Tabakprotoplasten

Blätter (2 g) von 5 bis 6 Tage-alten ausgebleichten Haferkeimlingen wurden mit einer Rasierklinge fein zerhackt. Das Gewebe wurde einige Male mit Verdaumedium (3 mM MES, pH 5,7, 10 mM Calciumchlorid, 0,5 M Mannitol und 2 mg/ml Arginin) gespült und dann für 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 20 ml Verdaumedium, das 2% Zellulase enthielt, inkubiert. Das Gewebe wurde gelegentlich geschüttelt, um Protoplasten freizusetzen. Das Material wurde durch ein 63 um-Sieb filtriert und 5 Minuten bei 50xg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und die Protoplasten wurden zweimal mit Verdaumedium gewaschen und dann in Elektroporationspuffer resuspendiert, um 0,5 ml der Protoplastensuspension pro Elektroporation zu ergeben. Der Elektroporationspuffer bestand aus: 10 mM HEPES, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid, 4 mM Calciumchlorid und 0,5 M Mannitol.
Protoplasten (0,5 ml) in Elektroporationspuffer wurden auf Eis mit 0,5 ml Elektroporationspuffer, der 40 ug Plasmid-DNA plus 100 ug Ultraschallbehandelter Lachs-DNA enthielt, gemischt. Die Protoplasten wurden auf Eis mit einem 350 Volt, 70 msec Puls durch Elektroporation behandelt. Die Protoplasten wurden nochmals 10 Minuten auf Eis inkubiert, dann in 10 ml Murasuge-Skoog (MS)-Medium verdünnt und bei Raumtemperatur für 24 Stunden inkubiert.
Die Protoplasten wurden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 50xg pelletiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und die Protoplasten einmal mit MS-Medium gewaschen. Das Protoplasten-Pellet wurde in 200 ul Puffer A (0,25 M Tris, pH 7,8, 1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Protoplasten wurden durch Ultrabeschallung für 5 bis 10 Sekunden mit der niedrigsten Einstellung zerbrochen. Die Protoplastentrümmer wurden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 4ºC pelletiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, auf 65ºC für 10 Minuten erhitzt und bei -20ºC aufbewahrt.

C. Assay für CAT-Aktivität in transformierten Protoplasten

Aliqots (100 ul) des elektroporatierten Protoplastenextrakts (Extrakt von Zellen, die mit rekombinanter DNA transformiert worden waren) wurden zu 80 ul Puffer A und 20 ul eines Gemischs aus 20 ul ¹&sup4;C-Chloramphenicol (40- 60 mCi/ mM), 2 mg Acetyl-CoA und 230 ul Puffer A hinzugefügt. Die Reaktion wurde für 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden mit 600 ul Ethylacetat extrahiert und wurden dann durch Verdampfung des Ethylacetats konzentriert und in 10 ul Ethylacetat resuspendiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Chloroform:Methanol (95 : 5, v/v)-Lösungsmittels aufgetrennt und dann durch Autoradiographie nachgewiesen.
Die Transformation von Wirtzellen wurde durch Messen der Menge der Enzymaktivität, wobei das Enzym durch das Strukturgen exprimiert wird, welches in dem Promotor-Gen-Fusions-Konstruktenthalten ist, bestimmt. Bei diesem Beispiel wurde in dem DNA-Konstrukt das Strukturgen verwendet, das für Chloramphenicolacetyltransferase kodiert. Um die Wirksamkeit des in dem rekombinanten DNA-Fusions-Konstrukt verwendeten Promotors zu testen, wurden parallele Elektroporationen ausgeführt, entweder unter Verwendung der Maisubiquitinpromotor-CAT Genfusion pUC-CAT (hier und in Fig. 4 beschrieben) oder von pCaMV-CAT, einer Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotor-CAT Genfusion, (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 5824-5828), die von V. Walbot Stanford University erhalten worden war. Wie es in Fig. 5 gezeigt ist, ist in Hafer-Protoplasten der Ubiquitin-Promotor stärker als der CaMV-Promotor, wie es durch die Menge der exprimierten enzymatischen Aktivität beurteilt worden ist.

Beispiel 3:

Hitzeschock-Antwort

A. Hitzeschock-Behandlung

Zur Hitzeschock-Behandlung wurden 4 bis 5 Tage-alte ausgebleichte Keimlinge in einen Inkubator bei 42ºC überführt und 1, 3 und 8 Stunden nach diesem Transfer geerntet. Gesamt-RNA (7 ug) wurde isoliert, denaturiert und durch ein 1,5% Agarose-3% Formaldehydgel elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde auf Gene Screen übertragen und mit einzelsträngiger RNA, die von dem linearisierten pCA210 unter Verwendung von SP6-RNA Polymerase transkribiert worden war, sondiert. (Das rekombinante Plasmid, pCA210 wurde durch Subklonieren des 975 bp Inserts von p6R7.2b1 in pSP64 (Promega) konstrukiert, so daß SP6-RNA-Polymerase eine für die Hybridisierung mit Ubiquitin-mRNA spezifische RNA-Sonde synthetisierte). Nach Autoradiographie wurden die Banden ausgeschnitten, und die an den Filter gebundene Menge an Radioaktivität wurde durch Flüssigscintillation bestimmt. Aus der Analyse der Northern-Blots wurden die Level der drei Ubiquitin-Transkripte bestimmt.
Eine Stunde nach dem Transfer auf 42ºC vergrößerte sich der Level des 2,1 kb Transkripts auf das 2,5- bis 3-fache. Eine etwa 2-fache Zunahme wurde für das 1,6 kb-Transkript beobachtet, jedoch wurde keine Zunahme für das 0,8 kb Transkript gesehen. Drei Stunden nach dem Transfer der Keimlinge auf erhöhte Temperatur kehrten die Level der zwei größten Ubiquitin- Transkripte auf den in unbehandeltem (nicht geschocktem) Gewebe beobachteten Level und blieb auf diesen Leveln für mindestens nochmals 5 Stunden. Die vorübergehende Natur von Ubiquitin während der Hitzeschock-Antwort in Mais kann anzeigen, daß das Ubiquitin eine spezialisierte Rolle bei Hitzeschock hat und nur eine kurze Zeitdauer an vergrößerten Leveln von Ubiquitin erforderlich sind.

B. Hitzeschock-Sequenzen

Die Nukleotid-Sequenz des Mais-Ubiquitingens ist in den Fig. 2-1 bis 2-7 gezeigt. Innerhalb der Promotorregion sind Nukleotidsequenzen homolog zu der Consensus-Hitzeschocksequenz, von der gezeigt wurde, daß sie Streß- Induzierbarkeit verleiht, wenn sie upstream eines heterologen Promotors plaziert ist (Pelham (1982) supra) vorhanden. Die Consensus-Sequenz für das Drosophila-Hitzeschock-Element ist
5'-CTGGAAT_TTCTAGA-3'
und wird allgemein etwa 26 Basen upstream der Transkriptionsstartstelle gefunden.
Innerhalb 900 Basen 5' zur Transkriptionsstartstelle des Mais-Ubiquitinpromotors sind zwei überlappende Hitzeschock-Sequenzen lokalisiert:
5'-CTGGA CCCCTCTCGA-3' mit Nukleotid -214 startend und
5'-CTCGA GAGTTCCGCT-3' mit Nukleotid -240 (-204) startend.
Es wurde auch gefunden, daß der Ubiquitin-Promotor aus Hühnerembryo- Fibroplasten zwei überlappende Hitzeschock-Consensus-Promotorsequenzen enthält:
5'-CTCGA ATCTTCCAG-3' mit Nukleotid -369 startend und
5'-CCAGA GCTTTCTTTT-3' mit Nukleotid -359 startend. Die 5'- flankierende Region des Hefe-Ubiquitingens UB14 (E. Ozkaynak et al. (1987) supra) umfaßt eine 18 kb, rotationssymmetrische (palindromische) Sequenz, 5'-TTCTAGAACGTTCTAGAA-3', 365 Basen upstream der Translationsstartstelle. Die mittleren 14 Basen (unterstrichen) dieser 18 bp Sequenz enthalten eine exakte Homologie zu der rotationssymmetrischen Consensus-"Hitzeschock-Box"-Nukleotidsequenz, die bei etwa 284 Nukleotiden upstream der vermuteten Transkriptionsstartstelle beginnt.
Die relative Position dieser Hitzeschock-Sequenz in bezug auf das transkriptionale Initiationskodon und seine letztliche Auswirkung auf die Größe der Induktionsantwort auf Hitzeschock oder anderen Streß bleibt größtenteils unbekannt, obwohl vorgeschlagen wurde (U. Bond et al. (1986) supra), daß je weiter ein Hitzeschock-Element 5' von der transkriptionalen Startstelle lokalisiert ist, desto kleiner ist der Level der Induktion als Antwort auf Streß.
In dieser Erfindung wird angenommen, daß eine Hitzeschock-Sequenz willkürlich an verschiedenen Loci innerhalb des Ubiquitin-Promotors positioniert werden kann und daß sie in der Sequenz chemisch verändert werden kann oder durch eine synthetische homologe Sequenz ersetzt werden kann, so lange die modifizierte Promotor-Sequenz die Ubiquitin-Promotorfunktion beibehält, welche die Initiation, Lenkung und Regulation der Transkription unter Streß- und nicht-Streß-Bedingungen umfaßt. Biochemische Techniken, die erforderlich sind, Nukleotide zu insertieren und/oder deletieren und um die sich ergebenden DNA-Fragmente zu handhaben, sind dem Fachmann auf dem Gebiet des Gendesigns geläufig.

Beispiel 4:

Vorhandensein von Hitzeschock-Sequenz(en) und eines großen Introns innerhalb des Ubiciuitin-Promotors

Der Ubiquitin-Promotor aus Mais ist strukturell durch das Vorhandensein von zwei überlappenden Hitzeschock-Sequenzen etwa 200 bp upstream der transkriptionalen Startstelle und durch ein großes (etwa 1 kb) Intron zwischen der transkriptionalen Startstelle und dem translationalen Initiationskodon gekennzeichnet. Diese Promotor-Struktur ist sehr ähnlich zu jener, die für den Ubiquitin-Promotor aus Hühnerembyro-Fibroplasten berichtet worden ist (U. Bond et al. (1986) supra), in dem zwei überlappende Hitzeschock-Sequenzen etwa 350 bp upstream der transkriptionalen Startstelle lokalisiert sind und ein 674 bp Intron zwischen dem transkriptionalen und translationalen Initiationskodon enthalten ist. Kürzlich (E. Ozkaynak et al. (1987) supra), wurde die Nukleotidsequenz der Promotorregion aus dem Hefe-Ubiquitin-UB14 Gen bestimmt, und es wurde gefunden, daß es eine Hitzeschocksequenz etwa 280 bp upstream der transkriptionalen Startstelle enthält, aber diesem Hefe- Ubiquitin-Promotor fehlte ein langes Intron zwischen der Transkriptions- und Translations-Initiationsstartstelle. Jedoch wurde gefunden, daß zwei anderen Hefe-Ubiquitingenen, die Introns enthielten, Sequenzen homolog zu der Pelham "Hitzeschock-Box"-Sequenz fehlten.
Es wurde gezeigt, daß Ubiquitin-Promotoren die Expression von Ubiquitin als Antwort auf Hitzeschock in Hefe, Hühnerembryo-Fibroplasten und Mais hochregulieren. In allen drei Systemen ist der Level der Ubiquitin-mRNA nach Hitzeschock-Behandlung erhöht, und es wurde bestimmt, daß das Anwachsen des Ubiquitin-Levels in Mais und Hühnerembryo-Fibroplasten etwa dreifach ist. Diese Steigerung der Ubiquitin-Expression als Antwort auf Hitzeschock ist
signifikant geringer als jene, die mit anderen Hitzeschock-Genen erhalten wird. Es wurde in Hühnerembryo-Fibroplasten gefunden, daß die Level von Ubiquitin-mRNA in Zellen, die 45ºC ausgesetzt worden waren, sich 2,5-fach über einen Zeitraum von 2,5 Stunden erhöhten, während sich die Level von HSP70-mRNA unter den gleichen Hitzeschock-Bedingungen zehnfach erhöhten. Darüber hinaus wurde auch gefunden, daß sich die relative Instabilität von Ubiquitin-mRNA während der Erholung der Zellen von einem 3-stündigen Hitzeschock (Halbwertzeit von etwa 1,5 bis 2 Stunden) signifikant von jener der HSP70-mRNAs unterscheidet, welche als stabil gefunden wurden.
Es ist interessant festzustellen, daß im Gegensatz zu Ubiquitin-Promotoren HSP70-Gene keine langen Introns zwischen dem transkriptionalen und translationalen Initiationskodon enthalten. Ein anderer Unterschied zwischen dem Ubiquitin-Promotor und anderen Hitzeschock-Promotoren ist, daß Ubiquitin sowohl konstitutiv als auch induktiv exprimiert wird, während die Expression klassischer Hitzeschock-Proteine hauptsächlich als Antwort auf Hitzeschock oder anderen Streß stattfindet. Diese Erfindung erlaubt Fachleuten mit Kenntnis auf diesem Gebiet, den Ubiquitin-Promotor bezüglich der Zusammensetzungssequenz und der Position von sowohl dem Intron als auch den Hitzeschock-Sequenzen zu modifizieren, um die konstitutive und/oder induktive Expression von Ubiquitin zu verändern. Auch kann standardmäßige rekombinante Technologie angewendet werden zur Beibehaltung als auch zur chemischen Veränderung der Nukleotidsequenzen innerhalb der Mais-Ubiquitin-Promotorregion, und zwar in solch einer Weise, daß die Promotorfunktion der sich ergebenden modifizierten DNA beibehalten oder verbessert wird. Das Testen auf die Ubiquitin-Promotorfunktion kann ausgeführt werden, wie es in Beispiel 2 gelehrt ist.

Claims

1. DNA-Sequenz, nicht länger als 2 kb, umfassend ein Pflanzen-Ubiquitin- Regulatorsystem, worin das Regulatorsystem ein Hitzeschock-Element und ein Intron enthält.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das Hitzeschock-Element eine mindestens 75%ige Homologie zu der Hitzeschock-Consensus-Sequenz aufweist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das Hitzeschock-Element nicht mehr als etwa 214 Nukleotide in 5'-Richtung von der Transkriptionsstartstelle entfernt ist.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, worin das Regulatorsystem zwei Hitzeschock-Elemente enthält.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 4, worin die Hitzeschock-Elemente derart angebracht sind, daß sie sich überlappen.

6. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das Intron eine Länge von etwa 1 kb hat.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 6, worin das Intron jenes des Mais- Ubiquitin-Promotors ist.

8. DNA-Sequenz nach Anspruch 6, worin das Intron nicht mehr als 83 Nukleotide in 3'-Richtung von der Transkriptionsstartstelle entfernt ist.

9. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das Hitzeschock-Element upstream der Transkriptionsstartstelle lokalisiert ist und das Intron downstream der Transkriptionsstartstelle lokalisiert ist.

10. DNA-Konstrukt, umfassend:

(a) DNA-Sequenz, nicht länger als 2 kb, umfassend ein Pflanzen- Ubiquitin-Regulatorsystem, worin das Regulatorsystem ein Hitzeschock-Element und ein Intron enthält, und

(b) Pflanzen-exprimierbares Strukturgen, worin das Strukturgen unter die regulatorische Kontrolle des Pflanzen-Ubiquitin-Regu- Iatorsystems gestellt ist.

11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, worin das Strukturgen für ein Gen codiert, das in der Natur nicht unter einer Hitzeschock-Kontrolle steht.

12. Verfahren zur konstitutiven Expression eines Strukturgens und zur selektierten Streß-induzierten Expressionserhöhung des Strukturgens in einer Pflanzenzelle, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Transformation der Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt, umfassend ein Pflanzen-Ubiquitin-Regulatorsystem, worin ein Hitzeschock-Element und ein Intron vorliegt, und ein Pflanzenexprimierbares Strukturgen, das unter der regulatorischen Kontrolle des Pflanzen-Ubiquitin-Regulatorsystems steht, und

(b) selektive Anwendung von Streßbedingungen auf die transformierte Pflanzenzelle, wodurch eine Expressionserhöhung des Strukturgens induziert wird.