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DE60037200T2 - Orts-spezifisches rekombinationssystem zur manipulation des plastidengenoms in höheren pflanzen - Google Patents

Orts-spezifisches rekombinationssystem zur manipulation des plastidengenoms in höheren pflanzen Download PDF

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DE60037200T2
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plastid
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cre
nucleic acid
gene
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DE60037200T
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Sylvie Highland Park CORNEILLE
Kerry Jackson LUTZ
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Rutgers State University of New Jersey
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Description

  • FACHGEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft die Bereiche transgener Pflanzen und Molekularbiologie. Genauer gesagt sind DNA-Konstrukte und Verfahren zur Verwendung davon bereitgestellt, welche die Exzision von Target-DNA-Sequenzen aus transplastomischen Pflanzen erleichtern.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es wird in dieser Anmeldung durch Autorennamen und Publikationsjahr in Klammern auf mehrere Publikationen verwiesen, um den Wissensstand des Fachgebiets, dem diese Erfindung angehört, vollständig zu beschreiben. Vollständige Zitate für diese Verweise sind am Ende der Beschreibung zu finden.
  • Das genetische Plastidensystem höherer Pflanzen ist höchst polyploid. Zum Beispiel gibt es in einem Tabakblatt 100 Chloroplasten, wobei jedes ~100 identische Genomkopien trägt, eine Gesamtzahl von 100.000 Kopien in einer Blattzelle. Protein-Expression in hohem Ausmaß, fehlende Pollentransmission und die Durchführbarkeit, polycistronische Expressionseinheiten zu gentechnisch erzeugen, machen das Plastidengenom zu einer attraktiven Alternative zur gentechnischen Veränderung des Kerns. Plastidentransformationsvektoren enthalten oft einen selektiven Marker, am häufigsten ein Spectinomycin-Resistenz-(aadA-)Gen, flankiert durch die Plastiden-DNA-Sequenzen, welche auf die Insertion eines Markergens durch homologe Rekombination in das Plastidengenom abzielen. Gene von kommerziellem Wert, denen jedoch ein selektierbarer Phänotyp fehlt, sind physikalisch mit dem selektiven Marker verbunden, und die zwei Gene sind zusammen als Block von heterologen Sequenzen integriert. Plastidentransformation wird durch biolistische DNA-Lieferung oder Polyethylenglykol-induzierte Aufnahme der transformierenden DNA, gefolgt von Selektion des Antibiotikaresistenzmarkers erreicht, um bevorzugte Fortpflanzung von Plastiden mit transformierten Genkopien zu sichern. Als Ergebnis werden alle 10.000 Wildtyp-Plastidengenomkopien in einer Zelle durch transgene Kopien während eines allmählichen Verfahrens ersetzt [Maliga (1993)].
  • Einführung eines selektierbaren Markergens ist wesentlich, um bevorzugte Aufrechterhaltung der transformierten Plastidengenomkopien zu sichern. Jedoch ist, sobald die Transformation erreicht wird, die Aufrechterhaltung des Markergens nicht wünschenswert. Ein Problem kann die Belastung des Stoffwechsels sein, die durch die Expression des selektierbaren Markers auferlegt wird. Zum Beispiel akkumuliert FLARE-S, das Produkt des Markergens mit guten Aussichten, Getreidechloroplasten zu transformieren, bis zu 18% des gesamten löslichen Zeltproteins [Khan und Maliga (1999)]. Das zweite Problem ist das relativ hohe Potenzial für horizontalen Transfer von Plastidenmarkergenen auf Mikroben [Tepfer (1989), Dröge et al. (1998), Sylvanen (1999)], da häufig verwendete Plastidenmarkergenkonstrukte wirkungsvoll in E. coli exprimiert werden [Carrer et al. (1993), Svab und Maliga (1993)]. Deshalb sind Plastidenmarkergene in kommerziellen Produkten nicht wünschenswert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Verfahren und Systeme bereitgestellt, welche die Manipulation der Plastidengenome höherer Pflanzen erleichtern. Die Verfahren und Systeme der Erfindung können verwendet werden, um heterologe Sequenzen aus dem Plastidengenom zu entfernen, wie z. B. selektierbares Markergen nach erfolgreicher Isolation von transformierten Nachkommen. Alternativ dazu können sie entworfen werden, um endogene Gene zu entfernen, die in Pflanzenzellmetabolismus, Wachstum, Entwicklung und Fertilität involviert sind.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein ortsspezifisches Rekombinationsverfahren zur Entfernung von vorgegebenen Nucleinsäuresequenzen vom Plastidengenom bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines ersten Nucleinsäurekonstrukts, wobei das Konstrukt einen Promotor umfasst, der operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für eine Plastiden-Targeting-Transitsequenz kodiert, die operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für ein Protein kodiert, das Exzisionsaktivität zeigt, wobei das Konstrukt weiters eine für einen ersten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure umfasst, die pflanzenspezifische 5'- und 3'-Regulations-Nucleinsäuresequenzen aufweist. Das Verfahren umfasst auch die Verwendung eines zweiten DNA-Konstrukts, wobei das zweite Konstrukt eine für einen zweiten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure und Exzisionsstellen umfasst. Das zweite Konstrukt enthält gegebenenfalls ein Gen von Interesse und umfasst weiters flankierende Plastiden-Targeting-Nucleinsäuresequenzen, welche eine homologe Rekombination in das Plastidengenom vereinfachen. Das zweite DNA-Konstrukt wird in die Pflanzenzelle eingeführt, und die Zellen werden in Gegenwart eines Selektionsmittels kultiviert, wodurch Pflanzenzellen ausgewählt werden, welche die Proteine exprimieren, für welche das zweite DNA-Konstrukt kodiert. Das erste DNA-Konstrukt wird dann in Zellen, die über das zweite Konstrukt verfügen, in Gegenwart eines Selektionsmittels eingeführt, und diese Pflanzenzellen, die Proteine exprimieren, für welche das erste Konstrukt kodiert, werden ausgewählt. Wenn vorhanden wirkt die Exzisionsaktivität auf die Exzisionsstellen, wodurch die vorgegebene Targetsequenz herausgeschnitten wird. Pflanzen können dann aus Pflanzenzellen regeneriert werden, die durch das vorangegangene Verfahren erhalten werden.
  • Proteine, die über Exzisionsaktivität verfügen, die für die Durchführung der Erfindung geeignet ist, umfassen unter anderem CRE, Flippase, Resolvase, FLP, SSV1-kodierte Integrase und Transposase. Sequenzen, die Exzisionsstellen entsprechen, die für die Ausführung der Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem LOX-Sequenzen und frt-Sequenzen.
  • Eine Vielzahl der Selektion von Mitteln kann ausgewählt werden. Diese umfassen unter anderem Kanamycin, Gentamycin, Spectinomycin, Streptomycin und Hygromycin, Phosphinotricin, Basta, Glyphosat und Bromoxynil.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist ein ortsspezifisches Rekombinationsverfahren zur Entfernung von vorgegebenen Nucleinsäuresequenzen aus dem Plastiden genom bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines ersten Nucleinsäurekonstrukts, wobei das Konstrukt einen regulierten Promotor umfasst, der operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für eine optionale Plastiden-Targeting-Transitsequenz kodiert, die operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für ein Protein kodiert, das über Exzisionsaktivität verfügt, wobei das Konstrukt gegebenenfalls weiters eine für einen ersten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure umfasst, die pflanzenspezifische 5'- und 3'-Regulations-Nucleinsäuresequenzen aufweist. Ein zweites DNA-Konstrukt wird ebenfalls bereitgestellt, wobei das zweite Konstrukt eine für einen zweiten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure und Exzisionsstellen umfasst, wobei das zweite Konstrukt weiters flankierende Plastiden-Targeting-Nucleinsäuresequenzen umfasst, welche eine homologe Rekombination in das Plastidengenom an der vorgegebenen Targetsequenz erleichtern, sodass Exzisionsstellen nach homologer Rekombination und Einführung des zweiten DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle die vorgegebene Targetsequenz flankieren. Die so erzeugte Pflanzenzelle wird dann in Gegenwart eines Selektionsmittels kultiviert, wodurch jene Pflanzenzellen ausgewählt werden, welche die Proteine exprimieren, für welche das zweite DNA-Konstrukt kodiert. Eine Pflanze wird dann aus Zellen regeneriert, die das zweite Konstrukt enthalten, und das erste DNA-Konstrukt wird in diese Zellen in Gegenwart eines Selektionsmittels eingeführt, und jene Pflanzenzellen, die Proteine exprimieren, für welche das erste Konstrukt kodiert, werden ausgewählt. Die Exzisionsaktivität wirkt dann auf die Exzisionsstellen, wodurch die vorgegebene Targetsequenz herausgeschnitten wird.
  • Regulierbare Promotoren, die für diese Ausführungsform der Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem induzierbare Promotoren, gewebsspezifische Promotoren, entwicklungsregulierte Promotoren und chemisch induzierbare Promotoren.
  • Kandidaten für vorgegebene Targetsequenzen können z. B. Gene umfassen, die mit männlicher Sterilität, clpP, Ribosomenproteinen, Ribosomenoperonsequenzen assoziiert sind.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine schematische Darstellung von CRE-vermittelter Exzision und Integration von DNA-Segmenten.
  • 2 ist eine Karte von Plastidentransformationsvektor pSAC48, wobei codA von direkten loxP-Stellen umklammert ist. Positionen der Plastidengene rrn16, trnV, rps12/7 [Shinozaki et al. (1986)], der aadA- und codA-Transgene und relativen Restriktionsstellen sind markiert.
  • 3 ist eine Karte eines binären Agrobacterium-Vektors pPZP212 mit einem auf Plastide abgezielten Ssu-tp-cre-Gen. Markiert sind: Fragmente des linken und rechten Rands von Agrobacterium, das Kanamycin-Resistenz(neo-)Gen, der P2'-Promotor, das SSU-Transitpeptid (ssu-tp), cre-kodierende Region, Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme BamHI, EcoRI, HindIII, NcoI, NheI und XbaI.
  • 4 zeigt Karten der Plastidengenom-<codA>-Deletionsderivate. Es sind die Plastidentargetingregion von Vektor pSAC48, die Karte derselben Region des Wildtypplastidengenoms (Nt-wt), die Karte des Plastidengenoms mit CRE-vermittelter Deletion von codA über die lox-Stellen und die Karte des Plastidengenoms mit Deletion über Prrn-Sequenzen, denen trnV, aadA und codA fehlt, dargestellt. Positionen von Plastidengenen rrn16, trnV und rps12/7 [Shinozaki et al. (1986)], aadA- und codA-Transgenen, Primern (01–04) und relevanten Restriktionsstellen (Al, ApaI, EV, EcoRV) sind markiert.
  • 5 ist ein Gel, das PCR-Amplifikation zeigt, die CRE-vermittelte Deletion von codA aus dem Plastidengenom bestätigt. Primer 01 und 02 (3) amplifizierten das 0,7-kb-Fragment der deletierten Region. Dieselben Primer amplifizieren das 2,0-kb-aadA-codA-Fragment in Testerlinien Nt-pSAC48-21A und Nt-pSAC-16C (kein transgenes Cre-Gen). Es wurde kein spezifisches Fragment in Wildtyp-DNA-Probe und in Cre1-10-Linie erhalten. Die so erhaltenen Linien sind in Tabelle 1 angeführt.
  • 6 zeigt die Ergebnisse der DNA-Gel-Blot-Analyse, worin Plastidengenomstruktur in den angegebenen Pflanzenproben bestimmt wurde. Die gesamte zelluläre DNA wurde aus den Blättern der Pflanzen isoliert, die in Tabelle 1 angeführt sind, und mit den Apal- und EcoRV-Restriktionsendonucleasen verdaut. Die Sonden waren die Wildtyp-Apal-EcoRV-Plastiden-Targetingregion und die aadA-(NcoI-XbaI-Fragment) und codA-(NcoI-XbaI-Fragment) kodierenden Regionen. Die hybridisierenden Fragmente sind in 3 markiert.
  • 7 sind Gele, die Einheitlichkeit der Plastidengenompopulationen in den Ssu-tp-cre-transformierten Pflanzen zeigen. Die gesamte Zell-DNA, die aus mehreren Blättern extrahiert wurde, wurde mit der Apal-EcoRV-Targetingregionsonde sondiert. Die Zahlen identifizieren Blätter, aus welchen DNA extrahiert wurde. Zum Beispiel wurden soeben verschiedene Blätter aus der Cre1-3-Pflanzen sondiert. Für Details siehe Kurzbeschreibung von 6.
  • 8A und 8B sind Gele von PCR-Analyse, die CRE-vermittelte Deletion von codA in Keimlingen nachweisen, die durch Bestäubung mit Ssu-top-cre-Aktivatorlinien erhalten werden. 5 Tage alte Keimlinge wurden aus der Kreuzung von Nt-pSAC48-21A als Mutterelternteil und Cre2-200- und Cre2-300-Aktivatorlinien als Polleneltern getestet. Amplifikationsprodukte sind auch für Kontrollen geselbstete Nt-pSAC48-21A-Keimlinge (48 selbst), Wildtyp (wt), die Elternpflanze (48P) und die Cre1-3-Pflanze dargestellt. 8A: Die codA-Region wurde mit den 01/02-Primern amplifiziert; die Größe des aadA-codA-Fragments ist 2,0 kb; das codA-Deletionsfragment ist 0,7 kb (4). 8B: Testen der cre-Sequenzen durch PCR-Amplifikation mit den Cre1/Cre3-Oligonucleotiden.
  • 9 ist ein Diagramm der Plastiden-Transformation von pSAC38 mit dem >neo<, eingeklammert von invertierten lox-Stellen. Positionen der Plastidengene rrn16, trnV und rps12/7 [Shinozaki et al. (1986)], aadA- und codA-Transgene und relevanten Restriktionsstellen sind markiert.
  • 10 zeigt eine Karte des Plastidengenoms, welches das >neo<-Inversionskonstrukt enthält. Es sind die Plastidentargetingregion des Vektors pSAC38, die Karte derselben Region des Wildtypplastidengenoms (Nt-wt), die Karte des Plastidengenoms mit CRE-vermittelter Inversion von neo über die lox-Stellen dargestellt. Positionen der Plastidengene rrn16, trnV und rps12/7 [Shinozaki et al. (1986)], aadA und neo-Transgene, Primer (01–04) und relevanten Restriktionsstellen (BamHI) sind markiert.
  • 11 zeigt die Ergebnisse von DNA-Gel-Blotanalyse für die Bestimmung von Plastidengenomstruktur von CRE-aktivierten >neo<-Pflanzen durch DNA-Gel-Blotanalyse. Gesamtzell-DNA wurde mit der BamHI-Restriktionsendonuclease verdaut. Die Sonden waren die Wildtyp-ApaI-EcoRV-Plastiden-Targeting-Region. Die hybridisierenden Fragmente sind in 10 markiert.
  • 12 zeigt einen beispielhaften monocistronischen Inversionsvektor. Die für das Gen von Interesse (goi) kodierende Region wird durch invertierte lox-Stellen (Dreiecke) flankiert. CRE aktiviert goi-Expression durch Inversion, sodass der kodierende Strang transkribiert wird. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene [Shinozaki et al. (1986)].
  • 13 zeigt einen alternativen dicistronischen lox-Inversionsvektor. Es ist anzumerken, dass die invertierten lox-Stellen den selektiven Marker (aadA) und goi flankieren und nur ein Gen exprimiert wird. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene [Shinozaki et al. (1986)].
  • 14 zeigt einen grundlegenden Tabakplastiden-lox-Deletionsvektor. Der bereitgestellte Vektor ist ein geeignetes Gerüst für Vektorherstellung und richtet Insertionen in die trnV-rps12/7-Intergenregion.
  • 15 zeigt einen Tabak-Plastiden-lox->aadA>-Deletionsvektor. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene [Shinozaki et al. (1986)].
  • 16 zeigt einen konstitutiven dicistronischen Tabak->aadA>-goi-Deletionsvektor. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene und in [Shinozaki et al. (1986)] beschrieben.
  • 17 zeigt einen konstitutiven dicistronischen Tabak-goi->aadA>-Deletionsvektor. Es ist anzumerken, dass Vektoren in 16 und 17 sich in der relativen Reihenfolge des Markergens und des Gens von Interesse unterscheiden. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene [Shinozaki et al. (1986)].
  • 18 zeigt einen konstitutiven dicistronischen Tabak-goi->aadA>-Deletionsvektor, in welchem Expression von aadA von der Translationskopplung abhängt. Es ist anzumerken, dass in diesem Konstrukt nur eine Leader-Sequenz verwendet wird. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene [Shinozaki et al. (1986)].
  • 19 zeigt einen induzierbaren Tabak-lox-Deletionsvektor. Expression von goi hängt von der aadA-Exzision ab. rrn16, trnV und rps12/7 sind Plastidengene [Shinozaki et al. (1986)]. Abkürzungen: P, Promotor; T, 3'-nichttranslatierte Region; L1 ist die 5'-Leadersequenz.
  • 20 zeigt einen Vektor, der für Cre-vermittelte Deletion von clpP-Gen aus dem Plastidengenom geeignet ist. Die Region des gentechnisch veränderten Plastidengenoms, das dargestellt ist, ist die Sequenz, die in dem Plastidentransformationsvektor enthalten ist. Die clpP-Exons sind dunkle Kästchen, die Introns sind offene Kästchen. Kartenposition von Plastidengenen psbB, rps12-Exon-I und rp120 sind ebenfalls dargestellt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die folgenden Definitionen sind bereitgestellt, um zum Verständnis des Gegenstands beizutragen, der als die Erfindung erachtet wird.
  • Heteroplastomisch beschreibt die Gegenwart einer Mischpopulation von verschiedenen Plastidengenomen innerhalb einer einzelnen Plastide oder in einer Population von Plastiden, die in Pflanzenzellen oder -geweben enthalten sind.
  • Homoplastomisch bezeichnet eine reine Population von Plastidengenomen, entweder innerhalb einer Plastide oder innerhalb einer Population, die in Pflanzenzellen und -geweben enthalten ist. Homoplastomische Plastiden, Zellen oder Gewebe sind genetisch stabil, weil sie nur eine Form von Plastidengenom enthalten. Daher bleiben sie sogar nachdem der Selektionsdruck entfernt worden ist homoplastomisch, und geselbstete Nachkommen sind ebenfalls homoplastomisch. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung können heteroplastomische Populationen von Genomen, die funktional homoplastomisch sind (d. h. nur geringere Populationen von Wildtyp-DNA oder transformierte Genome mit Sequenzvariationen enthalten), hierin als „funktional homoplastomisch" oder „im Wesentlichen homoplastomisch" bezeichnet werden. Diese Formen von Zellen oder Geweben können einfach durch kontinuierliche Selektion auf einen homoplastomischen Zustand gereinigt werden.
  • Plastom bezeichnet das Genom einer Plastide.
  • Transplastom bezeichnet ein transformiertes Plastidengenom.
  • Transformation von Plastiden bezeichnet die stabile Integration von transformierender DNA in das Plastidengenom, das auf die Samennachkommen von Pflanzen übertragen wird, welche die transformierten Plastiden enthalten.
  • Selektierbares Markergen bezeichnet ein Gen, das nach Expression einen Phänotyp verleiht, durch welchen erfolgreich transformierte Plastiden oder Zellen oder Gewebe, die die transformierte Plastide tragen, identifiziert werden können.
  • Transformierende DNA bezeichnet homologe DNA oder heterologe DNA, flankiert durch homologe DNA, die, wenn sie in Plastiden eingeführt wird, durch homologe Rekombination Teil des Plastidengenoms wird.
  • Operabel gebunden bezieht sich auf zwei verschiedene Regionen oder zwei separate Gene, die in einem Konstrukt aneinander gespleißt sind, sodass beide Regionen wirken, um Genexpression und/oder Proteintranslation zu fördern.
  • „Nucleinsäure" oder ein „Nucleinsäuremolekül" bezeichnet wie hierin verwendet ein beliebiges DNA- oder RNA-Molekül, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig und, wenn einzelsträngig, das Molekül seiner komplementären Sequenz in entweder linearer oder zirkulärer Form. In der Diskussion von Nucleinsäuremolekülen kann eine Sequenz oder Struktur eines bestimmten Nucleinsäuremoleküls hierin gemäß der normalen Konvention der Bereitstellung der Sequenz in der 5'-zu-3'-Richtung beschrieben werden. Unter Verweis auf Nucleinsäuren der Erfindung wird manchmal der Begriff „isolierte Nucleinsäure" verwendet. Dieser Begriff, wenn er auf DNA angewendet wird, bezeichnet ein DNA-Molekül, das von Sequenzen getrennt ist, mit welchen es unmittelbar zusammenhängend im natürlich auftretendem Genom des Organismus verbunden ist, in welchem es seinen Ursprung hat. Zum Beispiel kann eine „isolierte Nucleinsäure" ein DNA-Molekül umfassen, das in einen Vektor insertiert ist, wie z. B. ein Plasmid oder einen Virusvektor, oder in die genomische DNA einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle oder Wirtsorganismus integriert ist.
  • Wenn auf RNA angewendet, bezeichnet der Begriff „isolierte Nucleinsäure" primär ein RNA-Molekül, das von einem isolierten DNA-Molekül kodiert wird, wie oben definiert. Alternativ dazu kann der Begriff ein RNA-Molekül betreffen, das ausreichend von anderen Nucleinsäuren getrennt worden ist, mit welchen es in seinem natürlichen Zustand assoziiert sein würde (d. h. in Zellen oder Geweben). Eine isolierte Nucleinsäure (entweder DNA oder RNA) kann weiters ein Molekül repräsentieren, das direkt durch biologische oder synthetische Mittel produziert wird und von anderen Komponenten getrennt ist, die bei ihrer Produktion vorhanden waren.
  • Die Begriffe „prozentuelle Ähnlichkeit", „prozentuelle Identität" und „prozentuelle Homologe", wenn auf eine besondere Sequenz Bezug genommen wird, werden verwendet, wie im University of Wisconsin GCG Software Programm dargelegt.
  • Der Begriff „funktional" wie hierin verwendet impliziert, dass die Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz für den erwähnten Test oder Zweck funktional ist.
  • Die Phrase „im Wesentlichen bestehend aus" steht, wenn sie zur Bezugnahme auf ein(e) besondere(s) Nucleotid oder Aminosäure verwendet wird, für eine Sequenz mit Eigenschaften einer bestimmten Seq.-ID Nr. Zum Beispiel umfasst die Phrase, wenn sie als Verweis auf eine Aminosäuresequenz verwendet wird, die Sequenz per se und Molekülmodifikationen, welche die grundlegenden und neuen Eigenschaften der Sequenzen nicht beeinflussen.
  • Ein „Replikon" ist ein genetisches Element, z. B. ein Plasmid, Cosmid, Bacmid, Phage oder Virus, das großteils unter seiner eigenen Kontrolle zur Replikation in der Lage ist. Ein Replikon kann entweder RNA oder DNA sein und kann einzel- oder doppelsträngig sein.
  • Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie z. B. ein Plasmid, Cosmid, Bacmid, Phage oder Virus, an welches ein(e) andere(s) genetische(s) Sequenz oder Element (entweder DNA oder RNA) angeheftet werden kann, um die Replikation der/des angehefteten Sequenz oder Element zu verursachen.
  • Ein „Expressionsoperon" bezeichnet ein Nucleinsäuresegment, das Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen besitzen kann, wie z. B. Promotoren, Enhancer, Translationsstartsignale (z. B. ATG- oder AUG-Codons), Polyadenylierungssignale, Terminatoren und dergleichen, und welches die Expression einer polypeptidkodierenden Sequenz in einer Wirtszelle oder einem Organismus erleichtert.
  • Der Begriff „Oligonucleotid" bezeichnet wie hierin verwendet Primer und Sonden der vorliegenden Erfindung und wird als Nucleinsäuremolekül definiert, das aus zwei oder mehr Ribo- oder Desoxyribonucleotiden besteht, vorzugsweise mehr als drei. Die exakte Größe des Oligonucleotids hängt von verschiedenen Faktoren und von der besonderen Anwendung und Verwendung des Oligonucleotids ab.
  • Der Begriff „Sonde" bezeichnet wie hierin verwendet ein Oligonucleotid, Polynucleotid oder eine Nucleinsäure, entweder RNA oder DNA, ob natürlich wie in einem gereinigten Restriktionsenzymverdau vorkommend oder synthetisch produziert, das in der Lage ist, mit einer Nucleinsäure mit Sequenzen, die zur Sonde komplementär sind, zu anellieren oder spezifisch an eine solche zu hybridisieren. Eine Sonde kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die exakte Länge der Sonde hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich Temperatur, Quelle der Sonde und Verwendung des Verfahrens. Zum Beispiel enthält die Oligonucleotidsonde für diagnostische Anwendungen abhängig von der Komplexität der Targetsequenz die Oligonucleotidsonde typischerweise 15–25 oder mehr Nucleotide, obwohl sie weniger Nucleotide enthalten kann. Die hierin angeführten Sonden sind ausgewählt, um zu verschiedenen Strängen einer besonderen Targetnucleinsäuresequenz im Wesentlichen komplementär zu sein. Dies bedeutet, dass die Sonden ausreichend komplementär sein müssen, um in der Lage zu sein, sich an ihre jeweiligen Targetsträngen unter einer Reihe von vorgegebenen Bedingungen „spezifisch zu hybridisieren" oder mit ihnen zu anellieren. Deshalb muss die Sondensequenz nicht die exakt komplementäre Sequenz des Targets reflektieren. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment an das 5'- oder 3'-Ende der Sonde angeheftet werden, wobei der Rest der Sondensequenz zum Targetstrang komplementär ist. Alternativ dazu können die nicht-komplementären Basen oder längeren Sequenzen in die Sonde eingefügt werden, vorausgesetzt, dass die Sondensequenz ausreichend Komplementarität mit der Sequenz der Target-Nucleinsäure aufweist, um spezifisch damit zu anellieren.
  • Der Begriff „Primer" bezeichnet wie hierin verwendet ein Oligonucleotid, entweder RNA oder DNA, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig, entweder von einem biologischen System stammend, durch Restriktionsenzymverdau erzeugt oder synthetisch produziert, das, wenn es in die geeignete Umgebung platziert wird, in der Lage ist, funktional als Initiator von matrizenabhängiger Nucleinsäuresynthese zu wirken. Wenn er mit einer geeigneten Nucleinsäurematrize, geeigneten Nucleosidtriphosphatvorläufern von Nucleinsäuren, einem Polymerase-Enzym, geeigneten Cofaktoren und Bedingungen, wie z. B. einer/einem geeigneten Temperatur und pH, präsentiert wird, kann der Primer an seinem 3'-Terminus durch die Hinzufügung von Nucleotiden durch die Wirkung einer Polymerase oder ähnlicher Aktivität verlängert werden, um ein Primer-Extensionsprodukt zu ergeben. Der Primer kann in der Länge abhängig von besonderen Bedingungen und erforderlicher Anwendung variieren. Zum Beispiel ist der Oligonucleotidprimer in diagnostischen Anwendungen typischerweise 15–25 oder mehr Nucleotide lang. Der Primer muss ausreichend komplementär zur gewünschten Matrize sein, um die Synthese des gewünschten Extensionsprodukts zu Primen, d. h. in der Lage sein, sich mit dem gewünschten Matrizenstrang auf eine Art und Weise zu anellieren, die ausreichend ist, um die 3'-Hydroxylgruppierung des Primers in geeigneter Nebeneinanderstellung zur Verwendung im Beginn von Synthese durch eine Polymerase oder ein ähnliches Enzym bereitzustellen. Es ist nicht erforderlich, dass die Primersequenz ein exaktes Komplement der gewünschten Matrize repräsentiert. Zum Beispiel kann eine nicht-komplementäre Nucleinsäuresequenz an das 5'-Ende eines andernfalls komplementären Primers angeheftet werden. Alternativ dazu können nicht-komplementäre Basen innerhalb der Oligonucleotid-Primersequenz eingefügt werden, vorausgesetzt, die Primersequenz ist ausreichend komplementär zur Sequenz des gewünschten Matrizenstrangs, um funktional einen Matrizen-Primer-Komplex für die Synthese des Extensionsprodukts bereitzustellen. Hierin beschriebene Aminosäurereste liegen vorzugsweise in der isomeren „L"-Form vor. Jedoch können Reste in der isomeren „D"-Form für einen beliebigen L-Aminosäurerest substituiert werden, vorausgesetzt, die gewünschten Eigenschaften des Polypeptids werden beibehalten.
  • Alle Aminosäurerestsequenzen, die hierin repräsentiert sind, entsprechen der herkömmlichen Links-nach-Rechts-Aminoterminus-Carboxyterminus-Ausrichtung.
  • Die Begriffe „Markierung", „Markierungssequenz" oder „Proteinmarkierung" bezeichnen eine chemische Gruppierung, entweder ein Nucleotid, Oligonucleotid, Polynucleotid oder eine Aminosäure, ein Peptid oder Protein oder eine andere Chemikalie, die, wenn sie zu einer anderen Sequenz hinzugegeben wird, dieser Sequenz zusätzlichen Nutzen bereitstellt oder nützliche Eigenschaften verleiht, insbesondere in der Detektion oder Isolation. Daher kann eine homopolymere Nucleinsäuresequenz oder eine Nucleinsäuresequenz, die zu einem Fang-Oligonucleotid komplementär ist, zu einem Primer oder einer Sondensequenz hinzugefügt werden, um die nachfolgende Isolierung eines Extensionsprodukts oder hybridisierten Produkts zu erleichtern. Im Fall von Proteinmarkierungen können Hystidinreste (z. B. 4 bis 8 aufeinander folgende Histidinreste) entweder zum Amino- oder Carboxyterminus eines Proteins hinzugefügt werden, um Proteinisolation durch Chelatmetallchromatographie zu erleichtern. Alternativ dazu können Aminosäuresequenzen, Peptide, Proteine oder Fusionspartner, die Epitope oder Bindungsdeterminanten repräsentieren, die mit spezifischen Antikörpermolekülen oder anderen Molekülen reagieren (z. B. Flag-Epitop, c-myc-Epitop, Transmembranepitop des Influenza-A-Virus-Hämagglutinin-Proteins, Protein A, Cellulose-Bindungsdomäne, Calmodulin-Bindungsprotein, Maltose-Bindungsprotein, Chitinbindungsdomäne, Glutathion-S-Transferase und dergleichen), zu Proteinen hinzugefügt werden, um Proteinisolierung durch Verfahren wie Affinitäts- oder Immunaffinitätschromatographie zu erleichtern. Chemische Markierungsgruppierungen umfassen solche Moleküle wie Biotin, das entweder zu Nucleinsäuren oder Proteinen hinzugefügt werden kann und Isolation oder Detektion durch Wechselwirkung mit Avidinreagenzien erleichtern, und dergleichen. Zahlreiche andere Markierungsgruppierungen sind bekannt und können vom ausgebildeten Fachmann berücksichtigt werden und sollen im Schutzumfang der Erfindung liegen.
  • Wie hierin verwendet stehen die Begriffe „Reporter", „Reportersystem", „Reportergen" oder „Reportergenprodukt" für ein operatives genetisches System, in welchem eine Nucleinsäure ein Gen umfasst, das für ein Produkt kodiert, dass, wenn es exprimiert wird, ein Reportersignal produziert, das einfach messbar ist, z. B. durch biologischen Test, Immuntest, Radioimmuntest oder durch kolorimetrische, fluorogene, Chemilumineszenz- oder andere Verfahren. Die Nucleinsäure kann entweder RNA oder DNA, linear oder zirkulär, einzel- oder doppelsträngig sein, Anti-Sense- oder Sense-Polarität aufweisen und ist operabel an die notwendigen Kontrollelemente zur Expression des Reportergenprodukts gebunden. Die erforderlichen Kontrollelemente variieren in Abhängigkeit von dem Wesen des Reportersystems und ob das Reportergen in Form von DNA oder RNA vorliegt, können aber unter anderem solche Elemente wie Promotoren, Enhancer, Translationskontrollsequenzen, Poly-A-Additionssignale, Transkriptionsterminationssignale und dergleichen umfassen.
  • Die Begriffe „transformieren", „transfizieren", „transduzieren" sollen ein beliebiges Verfahren oder Mittel umfassen, durch welches eine Nucleinsäure in eine Zelle oder einen Wirtsorganismus eingeführt wird, und können austauschbar verwendet werden, um dieselbe Bedeutung zu vermitteln. Solche Verfahren umfassen unter anderem Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, PEG-Fusion, biolistische Bombardierung und dergleichen.
  • Ein „Klon" oder eine „Klonzellpopulation" ist eine Population von Zellen, die von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorgänger durch Mitose abstammen.
  • Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer primären Zelle oder Zeltpopulation, die zu stabilem In-vitro-Wachstum für viele Generationen in der Lage ist.
  • CRE-VERMITTELTE ORTSSPEZIFISCHE REKOMBINATION
  • Das Plastidengenom höherer Pflanzen ist in 100–10.000 Kopien pro Zelle vorhanden. Einführung eines selektierbaren Markergens ist wesentlich, um bevorzugte Aufrechterhaltung der transformierten Plastidengenomkopien zu sichern, die nützliche Gene mit keinen selektierbarem Phänotyp tragen. Jedoch ist die Aufrechterhaltung des Markergens nicht wünschenswert, sobald Transformation erreicht ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein ortsspezifisches Bakteriophagen-P1CRE-loxP-Rekombinationssystem bereitgestellt, das zur wirkungsvollen Eliminierung von Markergenen aus dem Plastidengenom geeignet ist. Das hierin veranschaulichte System hat zwei Komponenten: einen Plastidentesterstamm, der ein Cytosindeaminase-(codA-)Transgen, flankiert von lox-Stellen, trägt, die Empfindlichkeit gegenüber 5-Fluorcytosin verleiht, und eine Kern-CRE-Linie, die ein nuklearkodiertes, auf Plastiden abzielendes CRE trägt. Sowohl der Plastidentester (keine CRE-Aktivität) als auch die nukleare CRE-Linie (keine lox-Sequenz) waren genetisch stabil. Jedoch wurde codA in einer sehr großen Geschwindigkeit eliminiert, als das auf Plastiden abzielende CRE in den Plastidentesterstamm durch Transformation oder Kreuzung eingeführt wurde. Das Gen für das nuklearkodierte CRE wurde in der Folge von transformierten Plastiden durch Segregation in den Samennachkommen getrennt. Exzision von codA durch CRE war oft von Deletion eines Plastidengenomsegments begleitet, flankiert von kurzen direkt wiederholten Sequenzen. Entfernung von Antibiotikaresistenzmarkern von transplastomischen Pflanzen eliminiert die Stoffwechselbelastung, die von der Expression des selektierbaren Markergens auferlegt wird, und sollte auch die öffentliche Akzeptanz der transgenen Feldfrüchte verbessern. Zusätzliche Anwendungen des ortsspezifischen CRE-lox-Rekombinationssystems sind Aktivierung von Plastidengenexpression durch Deletion oder Inversion von Plastidengenomsequenzen und Induktion von kontrolliertem Zelltod durch Deletieren von wesentlichen Genen im männlichen Fortpflanzungsgewebe.
  • Obwohl die Verwendung von CRE-Rekombinase hierin veranschaulicht ist, sind andere prokaryotische und eukaryotische ortsspezifische Rekombinasen gleichermaßen geeignet für die Eliminierung der Markergene.
  • Kürzlich haben sich mehrere prokaryotische und niedere eukaryotische ortsspezifische Rekombinationssysteme bei höheren Eukaryoten als erfolgreich erwiesen. In Pflanzen- und Tierzellen funktionale ortsspezifische Rekombinationssysteme aus Bakteriophagen-P1 (Cre-lox) Mu (Gin-gix) und aus Inversionsplasmiden von Saccharomyces cerevisiae (FLP-frt) [Morris et al. (1991), O'Gorman et al. (1991), Lichtenstein und Barrens (1993), Lyznik et al. (1993), Lyznik et al. (1995), Lyznik et al. (1996)] und Zygosaccharomyces rouxii (R-RS). In jedem dieser Systeme ist kein zusätzlicher Faktor neben den Rekombinase- und Targetsequenzen für Rekombination erforderlich. Bericht siehe van Haaren und Ow (1993). Das ortsspezifische CRE-loxP-Rekombinationssystem von Bakteriophagen-P1 ist umfassend in vitro und in E. coli studiert worden [Craig (1988), Adams et al. (1992)]. Expression von CRE-Protein (38,5 kDa) ist ausreichend, um Rekombination zwischen 34 bp großen loxP-Stellen zu bewirken, die aus 13 bp großen invertierten Wiederholungen bestehen, die durch 8 bp große asymmetrische Spacer-Sequenz getrennt sind. Wenn es zwei loxP-Stellen innerhalb eines DNA-Segments gibt, hängt das Ergebnis der Rekombinati onsreaktion von der relativen Position der Rekombinationsstellen ab. Wenn die Rekombinationsstellen eine direkte Wiederholung bilden, d. h. wenn sie in derselben Ausrichtung vorliegen, führt Rekombination zur Deletion der dazwischen liegenden DNA. Wenn die Rekombinationsstellen in einer invertierten Ausrichtung vorliegen, führt CRE-vermittelte Rekombination zu einer Inversion der dazwischen liegenden DNA. Die Produkte dieser Reaktionen sind in 1 dargestellt. Das ortsspezifische CRE-Rekombinationssystem ist für die Eliminierung von Nukleargenen in einer Reihe von eukaryotischen Systemen verwendet worden, einschließlich höherer Pflanzen [Dale und Ow (1991), Russell et al. (1992), Srivastava et al. (1999)].
  • Vor der vorliegenden Erfindung war die Wirksamkeit von CRE-vermittelter Eliminierung von Plastidengenen, auf die abgezielt wird, unbekannt. Um dieses System für diesen Zweck zu untersuchen, wurde CRE-vermittelte Eliminierung des codA-Gens, das für Cytosindeaminase (CD, EC 3.5.4.1) kodiert, beurteilt. Cytosindeaminase konvertiert 5-Fluorcytosin (5FC) in 5-Fluoruracil (5FU), den Vorläufer von 5-Fluor-dUMP. 5FC ist für CD-exprimierende Zellen aufgrund von irreversibler Inhibition von Thymidilatsynthase durch 5-Fluor-dUMP letal [Beck et al. (1972)]. Cytosindeaminase fehlt in Pflanzen. Expression des bakteriellen codA in Plastiden macht Zellen auf 5FC empfindlich, während Zellen, denen Transgenexpression fehlt, resistent sind [Serino und Maliga (1997)]. Daher konnte 5FC-Resistenz für positive Identifikation von Zellen mit CRE-induzierter codA-Deletion verwendet werden, sogar wenn solche Deletionsereignisse relativ selten waren. Das Testsystem der vorliegenden Erfindung inkorporiert ein codA-Gen in das Tabakplastidengenom zwischen zwei direkt ausgerichteten lox-Stellen (>codA>). Das Transplastom war in Abwesenheit von CRE-Aktivität stabil. Jedoch wurde höchst effiziente Eliminierung von >codA> durch Einführung eines nuklearkodierten, auf Plastiden abzielenden CRE ausgelöst.
  • BEISPIEL 1
  • CRE-VERMITTELTE DELETION DES SELEKTIERBAREN PLASTIDENMARKERS
  • Cre-vermittelte Deletion des selektiven Plastidenmarkers in den Plastiden von somatischer Tabakzelle ist in Beispiel 1 beschrieben. Der selektierbare Marker, der von den lox-Stellen flankiert ist, ist hierin durch codA veranschaulicht. Jedoch kann es jedes beliebige andere selektierbare und nicht-selektierbare Markergen sein oder eine beliebige DNA-Sequenz, unabhängig vom Informationsgehalt, flankiert durch lox-Stellen im Plastidengenom. Komponenten des Testsystems sind Tabakpflanzen, die eine codA-kodierende Region tragen, flankiert durch lox-Stellen (>codA>). Eine zweite Komponente des Testsystems ist ein nukleares Gen, das für eine auf Plastiden abzielende Cre-Stellen-spezifische Rekombinase kodiert. Deletion eines >codA>, für welches eine Plastide kodiert, wird durch Einführung von nuklearem Cre in den Nukleus von somatischen (Blatt-)Tabakzellen durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erreicht. Alternativ dazu kann das nuklear kodierte Cre-Gen durch Fertilisation mit Pollen eines geeigneten Aktivator-der-Deletion-Stamms eingeführt werden. Das nukleare Cre-Gen wird in der Folge durch Segregation in den Samen-Nachkommen entfernt.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG VON BEISPIEL 1
  • Die folgenden Materialien und Verfahren sind bereitgestellt, um die Umsetzung von Beispiel 1 zu erleichtern.
  • Plastiden-CodA mit direkten lox-Stellen.
  • Das codA-Gen ist in einem SacI-HindIII-Fragment enthalten. Die Genkarte ist in 2 dargestellt. PrrnloxD (Seq.-ID Nr. 4) ist ein Plastiden-rRNA-Operon-(rrn16-)Promotorderivat. Es ist in einem SacI-EcoRI-Fragment enthalten, das durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden 5'-GGGGAGCTCGCTCCCCCGCCGTCGTTCAATG-3' und 5'-GGGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT GCTCCCAGAAATATAGCCA-3' als Primer und Plasmid pZS176 [Vorläufer von Plasmid pZS197, Svab und Maliga (1993)] als Matrize erhalten wird. Das Promotorfragment PrrnloxD enthält eine lox-Stelle am 3'-Ende angrenzend an die EcoRI-Stelle. Das EcoRI-NcoI-Fragment enthält die Ribosomenbindungsstelle aus Plasmid pZS176. Das Fragment wurde durch Anellierung der komplementären Oligonucleotide 5'-AATTCGAAGCGCTTGGATACAGTTGTAGGGAGGGATC-3' und 5'-CATGGATCCCTCCCTACAACTGTATCCAAGCGCTTCG-3' erhalten. Die codA-kodierende Region ist in einem NcoI-XbaI-Fragment enthalten [Serino und Maliga (1997)]. Das TrbcLloxD (Seq.-ID Nr. 5) ist die 3'-untranslatierte rbcL-Region, die in einem XbaI-HindIII-Fragment enthalten ist, die durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden 5'-GGTCTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATA CGAAGTTATAGACATTAGCAGATAAATT-3' und 5'-GGGGGTACCAAGCTTGCTAGATTTTGTATTTCAAATCTTG-3' und Plasmid pMSK48 als Matrize erhalten wurden [Khan und Maliga (1999)]. TrbcLloxD enthält eine lox-Stelle angrenzend an die XbaI-Stelle in direkter Orientierung relativ zur lox-Stelle in der codA-5'-UTR. Das chimäre PrrnloxD:codA:TrbcLloxD-Gen wurde in den Tabak-Plastidentransformationsvektor pRV111B [Zoubenko et al. (1994)] als SacI-HindIII-Fragment eingeführt, um Plasmid pSAC48 zu erhalten.
  • Auf Plastiden abzielendes nukleares cre gebunden an nukleares Kanamycin-Resistenzgen.
  • Zwei auf Plastiden abzielende nukleare cre-Gene wurden getestet. Das cre-Gen in binärem Agrobacterium-Vektor pK027 und pK028 kodiert für die CRE-Rekombinase, an dem N-Terminus translational fusioniert mit dem kleinen Erbsen-Rubisco-Untereinheit-(SSU-)Chloroplasten-Transitpeptid [Timko et al. (1985)] und zweiundzwanzig bzw. fünf Aminosäuren der reifen kleinen Rubisco-Untereinheit. Beide cre-Gene sind in einem EcoRI-HindIII-Fragment enthalten. Die schematische Karte der Gene ist in 3 dargestellt. Der P2'-Agrobacterium-Promotor [Velten et al. (1984)] (Sequenz-ID Nr. 9) ist in einem EcoRI-NcoI-Fragment enthalten. Das P2'-Promotorfragment wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden 5'-ccgaattcCATTTTCACGTGTGGAAGATATG-3' und 5'-ccccatggtaggatcctatCGATTTGGTGTATCGAGATTGG-3' als Primer und Plasmid pHC1 [Carrer et al. (1990)] als Matrize erhalten. PCR-Amplifikation führte eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und ClaI-, BamHI- und eine NcoI-Stelle am 3'-Ende ein. Ein T, das zwischen den ClaI- und den BamHI-Stellen eingeführt wurde, eliminierte ein ATG und führt ein In-frame-Stopcodon ein [Sriraman (2000)]. Die Rubisco-SSU-Transitpeptide sind in BamHI-NcoI-Fragmenten enthalten. Das pKO27-Fragment (Erbsen-SSU-TP22, Sequenz-ID Nr. 7) wurde durch Verwendung von Oligonucleotiden 5'-CCGGATCCAATTCAACCACAAGAACTAAC-3' und 5'-GGGGCTAGCCATGGCAGGCCACACCTGCATGCAC-3' als Primer und Plasmid pSSUpGEM4 als Matrize eingeführt [Timko et al. (1985)]. Das pKO28-Fragment [Erbsen-SSU-TP5, Sequenz-ID Nr. 6] wurde durch Verwendung von Oligonucleotiden 5'-CCGGATCCAATTCAACCACAAGAACTAAC-3' und 5'-GGGGCTAGCCATGGTCAATGGGTTCAAATAGG-3' als Primer und Plasmid pSSUpGEM4 als Matrize eingeführt [Timko et al. (1985)]. Ein Erbsen-SSU-TP mit 23 Aminosäuren des reifen Polypeptids ist in Sequenz-ID Nr. 8 dargestellt. Die crekodierende Region, die in einem NcoI-Xbal-Fragment enthalten ist (Sequenz-ID Nr. 3), wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Cre1-5'-GGGGAGCTCCATGGCTAGCTCCAATTTACTGACCGTACAC-3' und Cre2-5'-GGGTCTAGACTAATCGCCATCCTCGAGCAGGCGCACCATTGC-3' Oligonucleotiden als Primer und DNA, isoliert aus Escherichia-coli-Stamm BNN132 (ATCC-Nummer 47059), als Matrize erhalten. Die Gegenwart des cre-Gens in Pflanzen-Kern-DNA wurde durch PCR-Amplifikation mit den Cre1- und Cre3-Oligonucleotiden nachgewiesen. Die Sequenz von Cre3-Oligonucleotid ist 5'-TCAATCGATGAGTTGCTTC-3'. Der Agrobacterium-nos-Terminator (Tnos) ist in einem XbaI-HindIII-Fragment enthalten [Svab et al. (1990)]. Die auf Plastiden abzielenden nuklearen cre-Gene wurden als EcoRI-HindIII-Fragmente in die binären pPZP212-Agrobacterium-Vektoren eingeführt [Hajdukiewicz et al. (1994)], um Plasmide pKO27 und pKO28 mit zweiundzwanzig und fünf Aminosäuren von reifem Rubisco-SSU zu erhalten. Eine schematische Karte von Agrobacterium-Vektoren ist in 3 dargestellt.
  • Transgene Pflanzen.
  • Plastidentransformation unter Verwendung des biolistischen Protokolls, Selektion von transplastomischen Tabakklonen (RMOP-Medium, 500 mg/l Spectinomycindihydrochlorid) und Charakterisierung der transplastomischen Klone durch DNA-Gel-Blot-Analyse wurde beschrieben [Svab und Maliga (1993)]. Es ist ebenfalls von Transformation mit Agrobacterium-Vektoren pKO28 oder pKO27 und Regeneration von transformierten Tabakpflanzen berichtet worden [Hajdukiewicz et al. (1994)]. Kurz gesagt wurden nukleare Gentransformanten durch Kanamycinresistenz auf RMOP-Sproß-Regenerationsmedium ausgewählt, das 100 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Carbenicillin enthielt. Kanamycinresistenz der Sprossen wurde durch Durchwurzelung auf Pflanzenaufrechterhaltungs-(RM-)Medium nachgewiesen, das 100 mg/l Kanamycin enthielt. Testen von 5FC-Zytotoxizität wurde auf RMPO-Medium nach veröffentlichten Verfahren durchgeführt [Serino und Maliga (1997)].
  • Transplastomische Tabakpflanzen mit einem CodA-Gen, flankiert durch direkte lox-Stellen.
  • Plastidentransformationsvektor pSAC48 trägt ein codA-Gen, in welchem zwei lox-Stellen die kodierende Region in einer direkten Ausrichtung flankieren. Wenn die codA-kodierende Region über die lox-Stellen deletiert wird, wird eine lox-Stelle, flankiert vom Promotor (Prrn) und Terminator (TrbcL), zurückgelassen. Der selektive Marker in pSAC48, ein pRV111B-Vektor-Derivat, ist ein Spectinomycin-Resistenz-(aadA-)Gen (2). Transformation mit Plasmid pSCAC48 ergab eine Reihe von unabhängig transformierten transplastomischen Linien, wovon vier zum homoplastomischen Zustand gereinigt wurden: Nt-pSAC48-21A, Nt-pSAC48-16C, Nt-pSAC48-16CS und Nt-PSAC48-9A. Diese Linien werden als identisch erachtet, mit der Ausnahme, dass sie unabhängig erzeugt wurden. Eine einheitliche Population von transformierten Plastidengenomen in den transplastomischen Pflanzen wurde durch DNA-Gel-Blot-Analyse (siehe unten) verifiziert.
  • Nuklearkodierte, auf Plastiden abzielende Cre-Gene.
  • Zur Aktivierung der Deletion von Plastiden->codA>-Gen führten die Erfinder ein gentechnisch hergestelltes cre-Gen in den Nukleus der transplastomischen Linien ein, das für ein auf Plastiden abzielendes CRE kodiert. Das Abzielen auf nuklearkodierte Plastidenproteine erfolgt durch ein N-terminales Transitpeptid (TP), das während des Imports aus dem Cytoplasma in die Plastiden abgespalten wurde [Soll und Tien (1998)]. Zur Sicherstellung des Plastiden-Targetings der CRE-Rekombinase wurde sie translational mit dem kleinen Rubisco-Untereinheit-(SSU-)Transitpeptid fusioniert [Timko et al. (1985)]. Deshalb ist das Produkt der Proteinfusion SSU-TP-CRE. Wirksamkeit des Imports von chimären Proteinen hängt von der Größe des reifen Protein-N-Terminus ab, der in das Konstrukt inkorporiert ist [Wasmann et al. (1986); Lubben et al. (1989)]. Zwei chimäre cre-Gene (Ssu-tp-cre) wurden hergestellt, eines mit 5 (Vektor pKO28) und eines mit 22 (Plasmid pKO27) Aminosäuren des reifen SSU-N-Terminus, die für SSU-TP5-CRE bzw. SSU-TP22-CRE kodieren. Diese Gene werden auch als Cre1 bzw. Cre2 bezeichnet (Tabelle 1). Die cre-Gene wurden im P2'-Promotor und Tnos-Terminatorkassetten im binären Agrobacterium-pPZP212-Vektor exprimiert, der Kanamycinresistenz (neo) als selektierbaren Marker trägt (3).
  • Tabakpflanzen, die mit Ssu-tp5-cre (pKO37) und Ssu-tp22-cre (pKO36) transformiert wurden, wurden ebenfalls erhalten. In diesen Pflanzen wird das nukleare cre aus dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor exprimiert (Seq.-ID Nr. 10, Timermans et al. (1990)].
    Linie Plastiden-Genotypa Nuklearer Marker
    Wildtyp trnV+ aadA– codA–
    Nt-pSAC48-21A Nt-pSAC48-16C trnV+ aadA+ codA+
    Cre1-1 trnV+ aadA+ codA– trnV– aadA– codA– neo
    Cre1-2 trnV+ aadA+ codA– trnV– aadA– codA– neo
    Cre1-3 trnV+ aadA– codA– neo
    Cre1-4 trnV– aadA– codA– neo
    Cre1-10 trnV– aadA– codA– neo
    Cre2-1 trnV+ aadA+ codA– neo
    Cre2-2 trnV+ aadA+ codA– trnV+ aadA*+ codA– trnV– aadA– codA– neo
    Cre2-3 trnV+ aadA+ codA+ trnV+ aadA+ codA– trnV+ aadA*+ codA– trnV– aadA– codA– neo
    Cre2-4 trnV+ aadA+ codA– neo
    Cre2-5 trnV+ aadA+ codA– neo
    Cre2-10 trnV+ aadA+ codA– trnV– aadA– codA– neo
    Cre1-100 trnV+ aadA– codA– neo
    Cre2-100 trnV+ aadA– codA– neo
    Cre2-200 trnV+ aadA– codA– neo
    Cre2-300 trnV+ aadA– codA– neo
    • * Gegenwart oder Abwesenheit von Piastidengen ist durch + oder – angezeigt. Da das Plastiden-trnV-Gen in einigen der Linien deletiert ist, ist der Wildtyp-Plastiden-Genotyp trnV+ aadA– codA–.
  • Deletion von codA aus dem Plastidengenom in somatischen Zellen.
  • Zum Testen der Wirksamkeit der CRE-vermittelten Deletion in somatischen Zellen wurden die Ssu-tp-cre-Gene in den Nukleus der transplastomischen >codA>-Linien durch Co-Kultivierung von Agrobacterium und Tabakblattscheiben eingeführt. Pflanzen, die 11 individuelle Ssu-tp-cre-Insertionsereignisse repräsentieren, sind charakterisiert worden. Fünf Linien (Cre1-Derivate) wurden durch Transformation mit Ssu-Tp5-cre-Gen (Vektor pKO28) und sechs Linien (Cre2-Derivat) durch Transformation mit dem Ssu-tp22-cre (Vektor pKO27) erhalten (Tabelle 1). Deletion von codA wurde zuerst in einer DNA-Probe getestet, die aus einem Blatt von elf kanamycinresistenten Sprossen entnommen wurde, die ein individuelles Integrationsereignis des nuklearen Cre-Gens repräsentieren. In der Folge wurden 4 bis 7 weitere Blätter aus sechs Sprossen entnommen, um nachzuweisen, dass das Ergebnis der Analyse für die Pflanze typisch ist. Die anfänglichen DNA-Proben wurden zuerst auf den Verlust von >codA> durch PCR unter Verwendung von O1/O2-Primerpaar gescreent, das komplementär zu Sequenzen im N-Terminus in der aadA-kodierenden Region war, und dem codA-Promotor (4A). Amplifikation mit diesen Primern ergibt ein ~0,7-kb-Fragment, wenn >codA> deletiert ist, und ein ~2,0-kb-Fragment, wenn das >codA>-Gen immer noch vorhanden ist. Ethidiumbromidgefärbte Gele von PCR-Produkten in
  • 5 zeigen vollständigen Verlust von >codA> in jeder der Proben. Eine perfekt rekonstituierte lox-Stelle zwischen Prrn und TrbcL wurde in acht Klonen durch PCR-Amplifikation der Region mit Primern O1/O4 aus denselben DNA-Proben und direkte Sequenzierung des Amplifikationsprodukts mit Primer O2 nachgewiesen (nicht dargestellt). In zwei Klonen (Cre1-4, Cre1-10) fehlt ein Fragment aufgrund der Deletion von aadA gemeinsam mit codA (siehe unten). Plastidengenomstruktur in der anfänglichen DNA-Probe wurde durch Gel-Blot-Analyse von ApaI-EcoRV-verdauter Gesamt-Zell-DNA bestimmt. Die Sonden waren die Plastiden-Targeting-Region und die aadA- und codA-kodierenden Regionen. Die DNA-Gel-Blots sind in 6 dargestellt. Die Karten der Elterngenome und Deletionsderivate, die zur Interpretation dieser Genome beitragen, sind in 4 dargestellt. In Plastidentesterstämmen, die kein CRE exprimieren (Nt-pSAC48-21A, Nt-pSAC48-16C), hybridisierten alle drei Sonden an dasselbe 4,9-kb-DNA-Fragment, übereinstimmend mit codA und aadA, die in allen Plastidengenomkopien gegenwärtig sind. In den SSU-TP-CRE-exprimierenden Pflanzen war kein 4,9-kb-Fragment detektierbar, was die dramatische Geschwindigkeit anzeigt, mit welcher das >codA>-Gen aus dem Plastidengenom deletiert wurde. CRE-vermittelte Deletion von >codA> über die lox-Stellen erbrachte das 3,6-kb-Fragment, das in neun der elf Klone detektiert wurde. Das 3,6-kb-Fragment war das einzige Produkt, das in vier Klonen detektiert wurde, und war in einer heteroplastomischen Population in fünf Klonen gegenwärtig. Unerwartet war die Bildung eines 1,4-kb-ApaI-EcoRV-Fragments in fünf Klonen. DNA-Gel-Blot-Analyse bestätigte, dass diesem Fragment sowohl codA als auch aadA fehlen und es kleiner als das Wildtyp-ApaI-EcoRV-Fragment ist (1,9 kb). Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten in dieser Region bestätigte die Deletion von codA, aadA und trnV durch homologe Rekombination über die duplizierten Prrn-Promotorregionen. Einer der Prrn-Promotoren steuert codA, der andere befindet sich stromauf des rRNA-Operons an seiner nativen Stelle. Deletion von trnV ist der Grund, warum das ApaI-EcoRV-Fragment, das aus dieser Region stammte (1,4 kB), kleiner ist als das Wildtypfragment (1,9 kb).
  • Die anfänglichen DNA-Proben wurden aus einem Blatt einer Pflanze entnommen, das durch Verwurzelung des Sprosses erhalten wurde, der nach Transformation mit den Ssu-tp-cre-Genen erhalten wurde. Zum Nachweisen, dass die DNA-Proben, die aus dem Blatt extrahiert wurden, für die Pflanze typisch waren, haben die Erfinder mehrere verschiedene Blätter aus denselben Pflanzen entnommen (7). In vier Klonen wurde codA durch CRE über die lox-Stellen exzidiert, und die Sprossen waren für das deletierte Genom homoplastomisch. Zwei davon, Cre1-3 und Cre2-4, wurden durch Testen von sieben bzw. vier weiteren Blättern derselben Pflanzen weiter charakterisiert. DNA-Gel-Blot-Analyse dieser Proben bestätigte eine einheitliche Deletion von >codA> aus allen Genomkopien. Diese Pflanzen sind die gewünschten Endprodukte, welche die gewünschten Plastidentransgene tragen und denen dieser unerwünschte selektive Marker fehlt. Diese Pflanzen und deren Nachkommen können direkt über die Produktion von rekombinanten Promotoren verwendet werden, da sie frei vom selektierbaren Markergen sind. Weiters sind diese Pflanzen eine Quelle der gentechnisch erzeugten Chloroplasten zur Einführung in die Zuchtlinien durch sexuelle Kreuzung. Die Samennachkommenschaft der Pflanzen segregiert das Ssu-tp-cre-Aktivatorgen. Pflanzen mit den gewünschten Chloroplasten, denen das Aktivatorgen fehlt, können durch PCR-Tests auf cre-Sequenzen identifiziert werden. Alternativ dazu können Individuen, denen cre fehlt, in der Samennachkommenschaft durch Empfindlichkeit gegen Kanamycin identifiziert werden, da die Ssu-tp-cre-Gene in den pKO27- und pKO28-Agrobacteriumvektoren physikalisch mit Kanamycin-Resistenz verbunden sind (neo-Gen, 3). In zwei Klonen, Cre1-4 und Cre1-10, trat Deletion von trnV (für tRNA-ValG AC kodierend), aadA und codA durch homologe Rekombination über die duplizierte Prrn-Promotorregion auf. Die Cre1-10-Pflanze ist homoplastomisch für die Deletion basierend auf der Enthahme sieben weiterer Blätter (7). Offensichtlich ist das eine verbleibende trnV-Gen, das für tRNA-ValUAC kodiert, für die Translation aller Valincodons ausreichend, oder es gibt Import von tRNA-ValG AC aus dem Cytoplasma. Im Cre1-4-Klon enthielten einige der Blätter (zwei von vier) Restgenomkopien mit trnV und aadA.
  • In fünf Klonen enthielten die anfänglichen DNA-Proben mehr als eine Form von Plastidengenomkopien. Mischpopulationen von Plastidengenompopulationen wurden in allen Teilen der Pflanzen durch Testen von weiteren Blätter nachgewiesen (7). Genetisch stabile codA-Deletionslinien können aus diesen heteroplastomischen Pflanzen durch Testen von Pflanzen erhalten werden, die aus einzelnen somatischen Zellen oder individuellen Keimlingen in einer segregierenden Samennachkommenschaft regeneriert wurden.
  • Deletion von codA aus dem Plastidengenom in der Samennachkommenschaft.
  • CRE-vermittelte Deletion des negativen Plastidenmarkers codA in somatischen Zellen wurde im vorherigen Abschnitt beschrieben. Deletion von Plastidenmarkergen in den somatischen Zellen der transplastomischen Pflanzen, ohne einen sexuellen Zyklus zu durchlaufen, ist höchst wünschenswert, um die Produktion von markerfreien transplastomischen Pflanzen zu beschleunigen. Jedoch ist dieser Ansatz nur durchsetzbar, wenn es ein System für Gewebskultur und Pflanzenregeneration aus somatischen Zellen gibt. Ein solches System ist nicht für die wirtschaftlich wichtigen Getreidepflanzen Reis und Mais verfügbar. Als Alternative zur Transformation von somatischen Zellen entwickelten die Erfinder CRE-Aktivatorlinien, die ein nuklearkodiertes, auf Plastiden abzielendes Cre tragen, um als Quelle von Cre-Gen verwendet zu werden, wenn es als Pollenelternteil verwendet wird. Die Tabak-CRE-Aktivatorlinien wurden durch Transformation des Nukleus der Wildtyppflanzen mit SSU-TP-CRE-Konstrukten erhalten. Linien, in welchen das Cre an ein nukleares Kanamycinresistenzgen in einem Wildtypcytoplasma gebunden ist, sind Cre1-100, Cre2-100, Cre2-200 und Cre2-300 (Tabelle 1).
  • Zur Aktivierung der Deletion von >codA> in der Samennachkommenschaft wurden Testerpflanzen Nt-pSAC48-21A und Nt-pSAC48-16C kastriert, um Selbstbefruchtung zu vermeiden, und mit Pollen aus den Cre2-200- und Cre2-300-Aktivatorlinien befruchtet. Die Aktivatorlinien sind primäre transgene Pflanzen (T0), die für das Ssu-tp-cre-Gen segregieren. Deshalb verfügt ein Teil der Samennachkommenschaft, die von der Kreuzung abstammt, über die Aktivatorgene, während andere dies nicht tun. Wenn das codA-Gen gegenwärtig ist, amplifiziert das O1/O2-Primerpaar, das in 4 markiert ist, ein 2,0-kb-Fragment. Wenn das codA-Gen abwesend ist, amplifizieren dieselben Primer ein 0,7-kb-Fragment. PCR-Analyse, die in 8 dargestellt ist, bestätigte die CRE-vermittelte Deletion von >codA> in Keimlingen. Die Cre1-100-, Cre2-100- und Cre2-300-Aktivator-Linien exprimieren CRE offensichtlich wirkungsvoll, was durch die Gegenwart von nur dem 0,7-kb-Fragment in Keimlingen angezeigt ist, die das nukleare cre-Gen tragen. In Keimlingen mit keiner cre-Sequenz amplifizierten dieselben Primer das codA-enthaltende 2,0-kb-Fragment. Interessanterweise enthielten cre+-Keimlinge aus der Kreuzung mit Cre2-200 eine Mischpopulation von codA-enthaltenden (2,0 kb) und codA-deletierten (0,7 kb) Fragmenten, was weniger wirkungsvolle CRE-induzierte Deletion von >codA> anzeigt. Daher sind Expressionsausmaß und Gewebsspezifität der zwei nuklearen Ssu-Tp22-cre-Gene für die individuellen Transformationsereignisse charakteristisch. CRE-Aktivität von Cre1-100-, Cre2-100- und Cre2-300-Aktivatorlinien ist für rasche Elimination von >codA> in einer Kreuzung geeigneter als die Cre2-200-Linie. Es ist nicht wünschenswert, die Ssu-tp-cre-Aktivatorgene in den Produktionslinien beizubehalten. Jedoch sind diese im Nukleus kodiert und können aus den transgenen Chloroplasten in der nächsten Samennachkommenschaft getrennt werden. Bindung von Ssu-tp-cre an das nukleare Kanamycin-Resistenzgen erleichtert die Identifikation von Keimlingen, denen cre in einer segregierenden Samenpopulation fehlt.
  • Ortsspezifische CRE-Rekombination zur Deletion von Plastiden-DNA-Sequenzen.
  • Biolistische Transformation von Tabakblättern erbringt immer Sprossen, die eine Mischpopulation von Plastidengenomkopien enthalten. Eine Mischpopulation von Plastidengenomkopien wird durch DNA-Gel-Blot-Analyse bestimmt [Carrer et al. (1993), Svab und Maliga (1993), Carrer und Maliga (1995)] und kann in UV-Licht sichtbar gemacht werden, wenn das grünfluoreszierende Protein in Plastiden exprimiert wird [Khan und Maliga (1999)]. Homoplastomische, genetisch stabile Pflanzen werden im zweiten Zyklus der Pflanzenregeneration aus den Blättern der regenerierten Pflanzen oder in der Samennachkommenschaft erhalten. Die Zellen der >codA>-Testerstämme tragen eine einheitliche Population von Plastidengenomkopien. Daher wird das Ssu-tp-cre in das nukleare Genom einer Zelle eingeführt, die für >codA> homoplastomisch ist. Es wurde erwartet, dass die regenerierten Sprossen eine Mischpopulation von Plastidengenomkopien enthalten. Stattdessen fehlt allen Plastidengenomkopien >codA>, ein Beweis für den enormen Selektionsdruck durch CRE-Aktivität gegen Plastidengenomkopien, die zwei lox-Stellen tragen. Es ist wichtig, dass Deletion von >codA> in Abwesenheit von Selektion gegen >codA> durch Expo sition gegenüber 5-Fluorcytosin auftritt. Praktisch komplette Elmination von >codA> kann auch erhalten werden, wenn CRE-Aktivität durch Kreuzung eingeführt wird, unter Verwendung von Pollen eines geeigneten Deletionsaktivatorstamms. Deletion des selektierbaren Markers in somatischen Zellen ist die bevorzugte Wahl gegenüber Elimination des Markers in der Samennachkommenschaft. Der wichtigste Vorteil ist Zeitersparnis. Einführung von Ssu-tp-cre in den Nukleus von somatischen Zeilen erfordert nur drei bis sechs Wochen, Ssu-tp-cre segregiert auch in den ersten Samennachkommen. Hingegen benötigt die Einführung und Elimination von Ssu-tp-cre einen zusätzlichen Samennachkommen, etwa drei Monate lang.
  • Interessanterweise sind Genomkopien mit einer lox-Stelle oder keiner lox-Stelle (Wildtyp) in CRE-exprimierenden Zellen stabil. Instabilität von Genomen mit zwei lox-Stellen kann auf die Bildung von linearen Enden während Exzisionsverfahren zurückzuführen sein. Die linearen Enden können dann durch homologe Rekombination über die Prrn-Promotor-Sequenzen rezirkulieren, was die trnV-aadA-codA-Deletionsderivate erbringt.
  • CRE-Herstellung.
  • Obwohl CRE ein prokaryotisches Protein ist, trägt es natürlich ein nukleares Lokalisierungssignal (NLS), das auf ein CRE-GFP-Fusionsprotein auf den Nukleus in Säugetierzellen abzielte. Die NLS-Sequenzen überlappen die DNA-Bindungsregionen, und die Integrität dieser Region ist für die DNA-Rekombinase-Aktivität wichtig [Le et al. (1999)]. Die Erfinder zielten das neu synthetisierte TP-CRE-Protein auf Plastiden ab, unter Verwendung eines auf Plastiden abzielenden Transitpeptids (TP). Das TP befindet sich am N-Terminus von Plastidenproteinen und wird während des Imports aus dem Cytoplasma in Plastiden abgespalten [Soll und Tien (1998)]. Deshalb fusionierten die Erfinder ein Plastidentransitpeptid translational mit CRE, um einen Import aus dem Cytoplasma in Plastiden zu steuern. Translationale Fusion erbrachte ein Protein mit einem N-terminalen Plastidentargetingsignal und einem internen nuklearen Lokalisierungssignal. Wirkungsvolle CRE-vermittelte Deletion von plastidenkodierten codA-Genen zeigt das Targeting von SSU-TP-CRE auf Plastiden. Wenn zwei potenzielle Targetingsequenzen gegenwärtig sind, verdrängt im Allgemeinen eine davon die andere [Small et al. (1998)]. N-terminale Organellen- Targeting-Sequenzen dominieren normalerweise das zweite interne Lokalisierungssignal. Zum Beispiel ist das 70-kDa-Hitzeschockprotein von Wassermelonen-Cotyledonen, die N-terminale Plastiden- und interne glyoxysomale Targetingsequenzen tragen, ausschließlich auf Plastiden ausgerichtet. Proteine befinden sich auf Glyoxysomen nur in Abwesenheit der Plastiden-Präsequenz [Wimmer et al. (1997)]. Die tRNA-Modifikationsenzyme enthalten Informationen sowohl für Mitochondrien-(N-terminale Extension) als auch Kern-Targeting. Das Enzym mit der N-terminalen Extension ist auf Mitochondrien ausgerichtet, und nur die kurze Form, der die N-terminale Extension fehlt, ist auf den Nukleus ausgerichtet [Small et al. (1998)]. Es war ein Glücksfall, dass das N-terminale Rubisco-SSU-Transpeptid die nuklearen CRE-Lokalisierungssignale dominierte und das TP-CRE-Fusionsprotein auf Plastiden (Chloroplasten) ausgerichtet war. Eine zweite Eigenschaft, die für die vorliegende Erfindung wichtig ist, ist die Aufrechterhaltung von Rekombinaseaktivität, wenn CRE mit Proteinen oder Peptiden an seinen N- und C-Termini fusioniert ist. N-terminale Fusion von CRE mit dem E.-coli-Maltose-Bindungsprotein beeinflusste die Rekombinasefunktion nicht [Kolb und Sidell (1996)]. Es zeigte sich auch, dass CRE eine C-terminale Fusion mit GFP [Le et al. (1999)] sowie einem 11-Aminosäuren-Epitop an das Herpes-simplex-Virus(HSV-)Glykoprotein-D-Hüllprotein annimmt. Die Epitopmarkierung erleichtert Detektion von CRE-Expression in vitro und in vivo unter Verwendung von Immunfluoreszenzmarkierung mit einem kommerziell verfügbaren Antikörper [Stricklett et al. (1998)]. Offensichtlich beeinflussten die fünf und 22 Aminosäuren, die nach Verarbeitung der SSU-TP5-CRE- und SU-TP22-CRE-Proteine zurückgelassen wurden, nicht die CRE-Funktion.
  • Dominant negative Selektionsmarker für positive Identifikation von Deletionsderivaten.
  • Eine praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Entfernung von selektierbaren Markergenen aus dem transformierten Plastidengenom. Bei Tabak ist das Exzisionsverfahren, das durch CRE-Konstrukte vermittelt wird, die hierin beschrieben sind, so wirkungsvoll, dass die >codA>-Deletionsderivate in Abwesenheit von 5FC-Selektion identifiziert werden können. Jedoch kann CRE-vermittelte Exzision von Markergenen in anderen Pflanzen weniger wirkungsvoll sein. In diesen Spezies kann der positive selektive Marker (aadA) unter Verwendung von Linkerpep tiden wie in der Literatur beschrieben mit einem dominant negativen selektiven Marker fusioniert werden [Khan und Maliga (1999)], oder die positiven und negativen Markergene können in einem dicistronischen Operon kombiniert werden [Staub und Maliga (1995)]. Dominant negative Selektionsmarker ermöglichen normalerweise, dass nicht-toxische Verbindungen als toxische Mittel verwendet werden, sodass Zellen, die diese Marker exprimieren, in Gegenwart der Verbindung nicht lebensfähig sind, während Zellen, die diese nicht tragen, unbeeinflusst bleiben. Zum Beispiel fehlt Cytosindeaminase in Pflanzen. Expression von codA, das für Cytosindeaminase (CD, EC 3.5.4.1) kodiert, in Plastiden macht Gewebskulturzellen und Keimlinge für 5FC empfindlich, was direkte Identifikation von Klonen erleichtert, denen dieser negative selektive Marker fehlt [Serino und Maliga (1997)]. Cytosin-Deaminase überführt 5-Fluorcytosin (5FC) in 5-Fluoruracil (5FU), den Vorläufer von 5-Fluor-dUMP. 5FC ist für CD-exprimierende Zellen aufgrund von irreversibler Hemmung von Thymidylat-Synthase durch 5-Fluor-dUMP letal [Beck et al. (1972)]. Die Erfinder haben festgestellt, dass Keimlinge und Pflanzengewebe, die >codA> exprimieren, für 5FC empfindlich waren. Keimlinge, denen codA fehlte, konnten einfach durch 5FC-Resistenz identifiziert werden. Daher sind die hierin beschriebenen Konstrukte geeignet, um Cytosindeaminase in ausreichend hohen Spiegeln zu exprimieren, um nützlich zu sein, um ein negatives Selektionsschema zu implementieren.
  • Alternative negative selektive Marker können durch Anpassung von substratabhängigen negativen Selektionsschemen, die für nukleare Gene beschrieben sind, erhalten werden. Solche negativen Selektionsschemen basieren auf der Resistenz gegenüber Indol, Naphthyl oder Naphthalinacetamid [Depicker et al. (1988), Karlin-Neumamn et al. (1991), Sundaresan et al. (1995)], Chlorat [Nussaume et al. (1991)], Kanamycin [Xiang und Guerra (1993)] und 5-Fluorcytosin (5FC) [Perera et al. (1992), Stougaard (1993)].
  • BEISPIEL 2
  • CRE-VERMITTELTE INVERSION VON PLASTIDEN-DNA-SEQUENZEN
  • Wenn die lox-Stellen in Bakterien in einer invertierten Ausrichtung vorliegen, führt CRE-vermittelte Rekombination zu einer Inversion der dazwischen liegenden DNA. Die Erfinder haben getestet, ob die CRE-vermittelte Inversionsreaktion auch in Plastiden höherer Pflanzen auftritt, die DNA-Sequenzen enthalten, die von invertierten lox-Stellen flankiert sind. Dies wurde unter Verwendung einer Kanamycin-Resistenz(>neo<-) kodierenden Region in einer invertierten Ausrichtung in Bezug auf den Promotor beurteilt (9). In diesem Konstrukt wird der nicht-kodierende Strang von neo transkribiert, und die Pflanzen sind kanamycin-empfindlich. Die für >neo< kodierende Region wird von invertierten lox-Stellen flankiert. CRE-vermittelte Inversion der Sequenzen kehrt neo-Ausrichtung um, was zur Transkription des Sense-Strangs und Expression von Kanamycin-Resistenz führt. Inversion der Plastiden-kodierten >neo<- kodierenden Region kann durch mehrere Ansätze erreicht werden. Ein Ansatz ist es, ein nukleares Cre in den Nukleus von somatischen Tabakzellen, z. B. Blatt, durch Agrobacterium-vermittelte Transformation einzuführen. Ein zweiter Ansatz ist die Einführung des nuklearkodierten Cre-Gens durch Fertilisation mit Pollen eines geeigneten Aktivator-der-Inversion-Stamms. Weitere Ansätze dienen zur Bereitstellung von CRE-Aktivität über die Einführung von chemisch induzierbarem Promotor in das Konstrukt oder zur vorübergehenden Expression von CRE aus einem nuklearen Chloroplast-Konstrukt.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN ZUR UMSETZUNG VON BEISPIEL 2
  • Plastiden-neo-Gen mit invertierten lox-Stellen.
  • Das neo-Gen ist in einem SacI-HindIII-Fragment enthalten. Die Genkarte ist in 8 dargestellt. PrrnloxI (Seq.-ID Nr. 1) ist ein Plastiden-rRNA-Operon-(rrn16-)Promotorderivat. Es ist in einem SacI-XbaI-Fragment enthalten, das durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 5'-ggggagctcGCTCCCCCGCCGTCGTTCAATG-3' und 5'-ggtctagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatGCTCCCAGAAATATAGCCA-3' als Primer und Plasmid pZS176 [Vorläufer von Plasmid pZS197; Svab und Maliga (1993)] (1993)] als Matrize erhalten wird. Das Promotorfragment PrrnloxI enthält eine lox-Stelle am 3'-Ende, angrenzend an die XbaI-Stelle. Die neo-kodierende Region ist in einem NcoI-XbaI-Fragment enthalten, das von Plasmid pHC62 abstammt. Die neo-Sequenz in Plasmid pHC62 ist mit der neo-Sequenz identisch, die in 28B, US-Patent 5.877.402 , dargestellt ist. Das EcoRI-NcoI-Fragment enthält die Ribosomenbindungsstelle aus Plasmid pZS176. Das Fragment wurde durch Anellierung der komplementären Oligonucleotide 5'-AATTCGAAGCGCTTGGATACAGTTGTAGGGAGGGATC-3' und 5'-CATGGATCCCTCCCTACAACTGTATCCAAGCGCTTCG-3' erhalten. Das TrbcLloxI (Seq.-ID Nr. 2) ist die 3'-untranslatierte rbcL-Region, die in einem EcoRI-HindIII-Fragment enthalten ist, die durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden 5'-gggaattcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatAGACATTAGCAGATAAATT-3' und 5'-gggggtaccaagcttgCTAGATTTTGTATTTCAAATCTTG-3' Plasmid pMSK48 [Khan und Maliga (1999)] als Matrize erhalten wird. TrbcLloxI enthält eine lox-Stelle angrenzend an die EcoRI-Stelle in einer invertierten Ausrichtung in Bezug auf die lox-Stelle in PrrnloxI. Das chimäre PrrnloxI:neo:TrbcLloxI-Gen wurde in den Tabakplastidentransformationsvektor pPRV111B [Zoubenko et al. (1994)] als SacI-HindIII-Fragment eingeführt, um Plasmid pSAC38 zu erhalten.
  • Auf Plastiden abzielendes nukleares cre, gebunden an nukleares Gentamycin-Resistenzgen (aacC1).
  • Die auf Plastiden abzielenden nuklearen cre-Gene wurden als EcoRI-HindIII-Fragmente in die binären pPZP222-Agrobacteriumvektoren eingeführt, die ein pflanzenselektierbares Gentamycin-Resistenzgen tragen [Hajdukiewicz et al. (1994)], um Plasmide pKO30 und pKO31 mit zweiundzwanzig und fünf Aminosäuren der reifen Rubisco-SSU zu erhalten. Die Karte der Agrobacterium-Vektoren ist mit der in 3 dargestellten identisch, mit der Ausnahme, dass sie ein Gentamycin-Resistenzgen tragen.
  • Transplastomische Tabakpflanzen mit einem neo-Gen, flankiert durch invertierte lox-Stellen.
  • Plastidentransformationsvektor pSAC38 mit dem invertierten >neo<-Gen ist in 9 dargestellt. Das invertierte >neo<-Gen wird durch Selektion von Spectinomycin- Resistenz (aadA), für welche im Vektor kodiert wird, in Plastiden eingeführt. Zwei unabhängig transformierte Linien wurden auf den homoplastomischen Zustand gereinigt: Nt-pSAC38-9A und Nt-pSAC38-10C. Der homoplastomische Zustand wurde durch DNA-Gel-Blot-Analyse bestätigt.
  • Nuklearkodierte, auf Plastiden abzielende Cre-Gene.
  • Pflanzen-Aktivatorlinien, in welchen Ssu-tp-cre an ein nukleares Kanamycinresistenzgen gebunden ist, sind in Beispiel 1 beschrieben worden. Der Plastidenmarker zum Testen von CRE-aktivierter Inversion, der in Beispiel 2 beschrieben ist, verwendet ein Kanamycin-Resistenzgen. Kanamycin-Resistenz, die durch das Plastidengen aufgrund von CRE-vermittelter Inversion verliehen wurde, konnte nicht von Kanamycinresistenz unterschieden werden, die vom Markergen des binären Agrobacterium-Vektors verliehen wird, der verwendet wurde, um das nukleare cre einzuführen. Deshalb haben die Erfinder Aktivatorstämme geschaffen, in welchen Ssu-tp-cre an Gentamycin-Resistenz gebunden ist. Das Ssu-tp22-cre-Gen, gebunden an die nukleare Gentamycin-Resistenz, ist der Cre3-Stramm, und das Ssu-tp5-cre-Gen gebunden an Gentamycin-Resistenz, ist der Cre4-Stamm.
  • Inversion von >neo< im Plastidengenom von somatischen Zellen.
  • Die nuklearen cre-Gene wurden in die Chloropasten->neo<-Teststämme durch Co-Kultivierung von Tabakblättern mit den Agrobacteriumstämmen und Selektion auf Gentamycinresistenz (100 mg/l) eingeführt. Verdau von Gesamt-Zell-DNA mit BamHI und Sondierung mit der Plastiden-Targeting-Region (ApaI-EcoRV-Fragment, 4) hybridisiert an 1,8-kb- und 3,8-kb-Fragmente in den Eltern-Nt-pSAC38-10C-Linien (10). Aktivierung durch CRE in Linie Cre3-3 und Cre4-5 schuf eine Mischpopulation von >neo<-Genen, welche die ursprünglichen und invertierten Ausrichtungen repräsentierten, die als hybridisierende ursprüngliche 3,8-kb- und 1,8-kb- und neu geschaffene 4,6-kb- und 0,9-kb-Fragmente detektiert wurden. Linien, die cre und ein Fragment in etwa in Wildtypgröße tragen, sind aadA-neo-Deletionsderivate, ähnlich jenen, die in 4 dargestellt sind. Daher erscheint es, dass CRE-vermittelte Inversion über lox-Stellen erhöhte lokale Rekombinationshäufigkeiten schuf, was zur De letion der Transgene über die kurzen direkten Wiederholungen von Prrn-Promotoren führt.
  • Kontrolle der Inversion über lox-Stellen durch CRE-Aktivität.
  • Hierin beschreiben die Erfinder Konstrukte für CRE-vermittelte Inversion von Plastidengenomsegmenten, die durch invertierte lox-Stellen flankiert sind. Inversion der Sequenzen ist unabhängig von der kodierten genetischen Information und basiert nur auf CRE-Aktivität. CRE-Aktivität kann vorübergehend bereitgestellt werden, durch Expression in Plastiden aus Plastidensignalen, beschrieben in US-Patent Nr. 5.877.402 , oder aus nuklearen Genen, die für ein auf Plastide abzielendes CRE kodieren. Solche auf Plastiden abzielende CRE-Konstrukte sind in Beispiel 1 beschrieben, zum Beispiel die Ssu-tp5-cre- oder Sssu-tp22-cre-Gene. Alternative Ansätze zur Bereitstellung von CRE-Aktivität sind stabile Inkorporation eines auf Plastiden abzielenden nuklearen Cre in den Nukleus von somatischen (Blatt-)Zellen durch agrobacteriumvermittelte, PEG-induzierte oder biolistische Transformation oder durch Fertilisation mit Pollen aus einer transformierten Pflanze. Der Agrobacterium-P2-Promotor und der Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor, die hierin veranschaulicht sind, sind konstitutive Promotoren. Regulierte Expression von CRE kann für verschiedene Anwendungen wichtig sein. Entwicklungsgesteuerte Expression kann aus Promotoren mit gewebsspezifischer Aktivität erhalten werden. Regulierte Expression von CRE kann aus chemisch induzierten nuklearen Genpromotoren erhalten werden, die auf Elicitoren, Steroide, Kupfer oder Tetracyclin reagieren [siehe Überblick in Gatz et al. (1992), Mett et al. (1993), Aoyama und Chau (1997), Gatz (1997) Martinez et al. (1999), Love et al. (2000) und in US-Patent 5.614.395 beschrieben].
  • Kontrollierte Expression von schädlichen Genprodukten
  • Es gibt eine Vielzahl an wertvollen heterologen Proteinen, die den Plastidenstoffwechsel beeinflussen. Zum Beispiel können verschiedene Proteine in photosynthetische Membranen insertiert werden und Photosynthese beeinflussen. Dieses Problem kann umgangen werden, indem die Pflanzen zuerst bis zur Reife gezüchtet werden, dann die Produktion des schädlichen Proteins durch chemische Induktion von CRE- Expression aktiviert wird. CRE wiederum macht das Gen durch lox-vermittelte Inversion der kodierenden Region exprimierbar.
  • Die molekularen Instrumente, die für die Herstellung solcher Plastidengene notwendig sind, sind in der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Im Fall des monocistronischen Inversionsvektors wird das Gen von Interesse (goi) von invertierten lox-Stellen flankiert und wird durch Bindung mit aadA eingeführt (12). Die für den selektierbaren Marker (aadA) kodierende Region ist das erste Leseraster und wird vom Promotor exprimiert. Das goi-Leseraster ist die zweite kodierende Region und wird nicht exprimiert, da es in einer invertierten Ausrichtung in Bezug auf den Promotor vorliegt. Expression von goi wird durch CRE-vermittelte Inversion der goi-kodierenden Region wie für >neo< in Beispiel 2 beschrieben und in 12 dargestellt induziert.
  • Der dicistronische lox-Inversionsvektor ist in 13 dargestellt. In diesem Fall flankieren die invertierten lox-Stellen sowohl aadA als auch goi. Die für den selektierbaren Marker (aadA) kodierende Region wird aus dem Promotor exprimiert. Der goi-Leseraster wird nicht exprimiert, da er in einer invertierten Ausrichtung zum Promotor vorliegt. Expression von goi wird durch CRE-vermittelte Inversion der aadA-goi-enthaltenden Region induziert, die zur simultanen Expression von goi und Inaktivierung von aadA führt.
  • Die Gegenwart von zwei lox-Stellen kann das Plastidengenom destabilisieren, das zur CRE-unabhängigen Deletion von Plastidengenomsequenzen führt. Es scheint jedoch, dass CRE-Aktivität selbst nicht mutagen ist, und die Plastidengenome sind stabil, wenn nur eine lox-Stelle gegenwärtig ist. Mutante lox-Stellen, die wirkungsvoll exzidiert sind, aber sich in exzisionsresistenten Stellen rekombinieren, sind beschrieben worden (Hoess et al. (1982), Albert et al. (1995)]. Solche lox-Stellen würden wirkungsvolle Inversion vermitteln, aber die neuen lox-Stellen sind gegen zusätzliche Zyklen von CRE-Aktivierung resistent. Die Bereitstellung von nur einem kurzen Ausbruch von CRE-Aktivierung, der einen chemisch induzierbaren Promotor verwendet, könnte das Expressionssystem weiter verbessern.
  • BEISPIEL 3
  • CRE-VERMITTELTE DELETION ZUM GEWINNEN VON MARKERFREIEN TRANSPLASTOMISCHEN PFLANZEN UND ZUR EXPRESSION DER REKOMBINANTEN PROTEINE IN HOHEM AUSMASS
  • Plastiden-loxP-Vektoren in diesem Abschnitt sind für CRE-vermittelte Exzision selektiver Marker in transplastomischen Pflanzen beschrieben. Da die Exzision von Sequenzen zwischen direkt ausgerichteten lox-Stellen sehr wirkungsvoll ist, können Varianten derselben Vektoren für CRE-aktivierte Expression von rekombinanten Vektoren verwendet werden. Eine Familie von Plastidenvektoren mit geeignet positionierten lox-Stellen ist in 14 bis 17 schematisch dargestellt.
  • Die Karte des grundlegenden Tabakplastiden-lox-Deletionsvektors ist in 14 dargestellt. Sie enthält (a) zwei direkt ausgerichtete lox-Stellen, die durch eine einzigartige BglII-Klonierungsstelle getrennt sind, und (b) eine angrenzende Polyklonierungsstelle. Diese Sequenzen (Seq-ID Nr. 11) werden in die ScaI-Stelle des Plastidenwiederholungsvektors pPRV100 insertiert [ US-Patent Nr. 5.877.402 ; Zoubenko et al. (1994)]. Geeignete Markergene (aadA, neo oder kan, bar, Glyphosatresistenz, Bromoxynilresistenz) zur Insertion in die BglII-Stelle sind in US-Patent 5.877.402 , WO 00/07421 und WO 00/03022 beschrieben worden.
  • Die Karte des Tabakplastiden-lox->aadA>-Deletionsvektors ist in 15 dargestellt. Er ist der grundlegende lox-Deletionsvektor mit einem aadA-Gen, das in die BglII-Stellen kloniert ist, die gegen das rrn-Operon ausgerichtet sind.
  • Karten von konstitutiven dicistronischen lox-Deletionsvektoren sind in 16 bis 18 dargestellt. Dieses dicistronische Design ermöglicht simultane Expression sowohl des ersten als auch zweiten offenen Leserasters. Der selektierbare Marker, der für Exzision entworfen ist, kann im ersten (16) oder zweiten (17, 18) offenen Leseraster kodiert sein. Da sich eine minimale 34-bp-lox-Stelle zwischen den zwei Leserastern befindet, haben sowohl das Markergen (aadA) als auch das Gen von Interesse ihre eigene Leader-Sequenz, um Translation zu erleichtern (16,
  • 17). Translationskopplung kann auch durchführbar sein, wenn die lox-Stelle in den N-Terminus der für das Markergen kodierenden Region eingeführt werden kann (18). DNA-Sequenz von Promotor-lox-Konstrukten, die in 16 dargestellt ist, ist in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt. Promotoren und Promotor-Leader-Kombinationen, die zur Förderung von Proteinexpression in Plastiden in hohem Ausmaß geeignet sind, sind in der europäischen Patentanmeldung WO 00/07421 , WO 97/06250 und WO 98/55595 beschrieben. Sequenzen, die für direkt ausgerichtete lox-Stellen geeignet sind, sind in Seq.-ID Nr. 11 angegeben. Translationskopplung zwischen einem Gen von Interesse und dem Stromab-aadA ist in 18 dargestellt. Es gibt mehrere Wege, um Translationskopplung zwischen angrenzenden Genen zu erreichen [Baneyx (1999)]. Ein Ansatz ist die Einführung einer geeignet beabstandeten Ribosomenbindungsstelle in der Stromauf-Genkodierungsregion [Schoner et al. (1986), Omer et al. (1995)]. Ein Beispiel für eine geeignete Sequenz direkt stromauf des Translationsinitiationscodons (ATG) kann G-GAG-GAA-TAA-CTT-ATG sein. Ein spezifisches Beispiel für die Verwendung der Sequenz ist Translationskopplung zwischen einem bar (geeignete Quelle, die in der europäischen Patentanmeldung WO 00/07421 beschrieben ist) und einem Stromab-aadA ist in Seq.-ID Nr. 12 angegeben. Es ist anzumerken, dass SalI-Stelle stromab von AUG inkorporiert ist, um gentechnische Herstellung der BglII-SalI-Region und die direkt ausgerichteten lox-Stellen in der aadA-kodierenden Region und stromab von aadA zu erleichtern. Die Sequenz ist für ein BglII-SpeI-Fragment angegeben. Die BglII-Stelle liegt innerhalb der bar-kodierenden Region; die SpeI-Stelle befindet sich stromab der zweiten lox-Stelle, wie in 18 markiert. Wenn eine C-terminale Verlängerung zur Herstellung einer Ribosomenbindungsstelle inakzeptabel ist, kann eine geeignete Sequenz durch stumme Mutagenese der kodierenden Region an der dritten Codonposition erhalten werden. Varianten von Plastidenribosomenbindungsstellen sind katalogisiert worden [Bonham-Smith und Bourque (1989)].
  • Ein induzierbarer Tabak-lox-Deletionsvektor ist in 19 dargestellt. Das Markergen (aadA) ist im ersten Leseraster, gefolgt von einem stummen goi, dem das Translationsinitiationscodon (ATG) und der 5'-untranslatierte Leader fehlt, kodiert. Expression des goi-Rasters wird durch aadA-Exzision ausgelöst, die zur Translationsfusion der N-terminalen aadA-Region mit dem goi führt. Nach aadA-Exzision wird die goi-mRNA aus den aadA-Translationskontrollsignalen, der 5'-UTR und AUG translatiert. DNA-Sequenz des SacI-NheI-Fragments ist in Seq-ID Nr. 13 angegeben. Die Prrn-Promotor-atpB-Translationskontrollregion ist in der europäischen Patentanmeldung WO 00/07421 beschrieben. Das aadA-Konstrukt hat zwei direkt ausgerichtete lox-Stellen: eine in dem N-Terminus der kodierenden Region und eine stromab von aadA, um CRE-vermittelte Exzision des Markergens zu erleichtern.
  • BEISPIEL 4
  • DELETION VON WESENTLICHEN PLASTIDENGENEN ZUR GEWINNUNG VON CYTOPLASMATISCHER MÄNNLICHER STERILITÄT
  • US-Patent Nr. 5.530.191 stellt ein zytoplasmatisches männliches Sterilitäts-(CMS-)System für Pflanzen bereit, das auf der Modifikation des Plastidengenoms basiert. Das CMS-System umfasst drei Transgene; ein „männliches Plastidensterilitäts"-Gen, das Plastiden- und zelluläre Untauglichkeit eines anderen Gewebes verursacht, und zwei nukleare Gene, welche die Expression des Plastidengens regulieren. Eine wichtige Eigenschaft des Systems ist entwicklungsgesteuerter Zelltod basierend auf der Expression oder dem Fehlen von Expression eines Plastidengens. Als spezifischer Ansatz zur Induktion von entwicklungsgesteuerter Ablation eines anderen Gewebes beschreiben die Erfinder CRE-vermittelte Exzision von essentiellen Plastidengenen über direkt ausgerichtete lox-Stellen.
  • Die Zahl der Gene, für welche das Plastidengenom kodiert, ist etwa 120. Einige der Gene sind nicht-essentiell und können durch Genunterbrechung, auf die abgezielt wird, ohne große phänotypische Konsequenz inaktiviert werden. Gute Beispiele sind die Plastiden-ndh-Gene [Burrows et al. (1998), Shikanai et al. (1998)] oder das trnV-Gen, dessen Deletion in Beispiel 1 beschrieben worden ist. Exzision dieser Gene verursacht unwahrscheinlich Zellablation. Die photosynthetischen Gene sind für das Überleben unter Feldbedingungen essentiell. Jedoch können pigmentdefiziente, nicht-photosynthetische Pflanzen aufrechterhalten werden, solange sie auf einem saccharose-enthaltenden Medium wachsen, oder werden auf photosynthetisch aktive Wildtyp-(grüne)Pflanzen transplantiert [Kanevski und Maliga (1994)]. Einige der Haushaltsgene, wie z. B. die Gene, die für die Plastiden-Multiuntereinheit-RNA-Polymerase kodieren, sind für photosynthetisches Wachstum essentiell, aber nicht für das Überleben [Allison et al. (1996)]. Daher ist die Deletion dieser Gene nicht geeignet, um Zelltod auszulösen. Nur eine relativ kleine Zahl an Plastidengenen hat sich als essentiell für Lebensfähigkeit erwiesen. Die wesentliche Natur der Gene wurde durch das Fehlen von homoplastomischen Zellen in Versuchen zur Zellzerstörung erkannt, die angeben, dass der Verlust dieser Gene zu Zelltod führt. Zelltod aufgrund des Fehlens von Plastidenfunktion ist verständlich, da Plastiden die Stelle der Biosynthese von Aminosäuren sind, mehrere Lipide, und sind für Nitratassimilation erforderlich. Beispiele für Plastidengene, die für das Zellüberleben essentiell sind, sind das clpP-Protease-Untereinheitgen [Huang et al. (1994)], ycf1 und ycf2, die zwei größten plastidenkodierten offenen Leseraster [Drescher et al. (2000)].
  • Zur Induktion von Zelltod durch CRE-vermittelte Exzision können direkt ausgerichtete lox-Stellen in die das Plastidengenom flankierenden essentiellen Gene eingeführt werden, wie in 20 für clpP dargestellt ist. Das clpP-Gen hat zwei große Introns (807 bp und 637 bp), und die Region kann in geeigneter Weise als SalI-SphI-Fragment kloniert werden. Der selektierbare Marker aadA wird in eine KpnI-Restriktionsstelle insertiert, die durch PCR-Mutagenese stromab von clpP-Exon 3 geschaffen wird, in Richtung rps12-Exon-I ausgerichtet. Eine der lox-Stellen wird gleich neben dem aadA-Gen erzeugt, die zweite lox-Stelle wird in Intron I insertiert. Zelltod wird durch Aktivierung des nuklearen Cre-Gens wie in US-Patent Nr. 5.530.191 beschrieben induziert. Es ist notwendig, einen selektiven Marker zu verwenden, wie z. B. aadA, um die lox-Stellen in das Plastidengenom einzuführen. Das aadA-Gen kann in der Folge unter Verwendung einer zweiten unabhängigen ortsspezifischen Rekombinase wie z. B. FRT über die frt-Stellen, die im Transformationsvektor gentechnisch hergestellt werden, der in 20 dargestellt ist, eliminiert werden.
  • Alternative Targets für CRE-vermittelte Deletion in einem CMS-System sind die wesentlichen Ribosomenproteingene, wie z. B. rpI23, das Ribosomen-RNA-Operon [für Insertionsstellen siehe Staub und Maliga (1992), Zoubenko et al. (1994)] und die ycf1- und ycf2-Gene [Drescher et al. (2000)].
  • Es wird in der gesamten Beschreibung auf die folgenden Sequenzen Bezug genommen, und diese erleichtern die Umsetzung der vorliegenden Erfindung. Seq.-ID Nr. 1: PrrnloxI-Sequenz
    Figure 00400001
    Seq.-ID Nr. 2: TrbcLloxI-Sequenz
    Figure 00400002
    Seq.-ID Nr. 3: Sequenz der cre-kodierenden Region
    Figure 00400003
    Figure 00410001
    Seq.-ID Nr. 4: PrrnloxD-Sequenz
    Figure 00410002
    Seq.-ID Nr. 5: TrbcLloxD-Sequenz
    Figure 00410003
    Seq.-ID Nr. 6: Erbsen-ssuTP5-Sequenz
    Figure 00410004
    Seq.-ID Nr. 7: Erbsen-ssuTP22-Sequenz
    Figure 00410005
    Seq.-ID Nr. 8: Erbsen-ssuTP23-Sequenz
    Figure 00420001
    Seq.-ID Nr. 9: P2-Promotor-Sequenz
    Figure 00420002
    Seq.-ID Nr. 10: 35S-Promotor-Sequenz
    Figure 00420003
    Seq.-ID Nr. 11: KpnI-lox-BglII-lox-HindIII-Fragment
    Figure 00430001
    Seq.-ID Nr. 12: Translationskopplung von bar und aadA nach dem Schema in Fig 18. BglII-SpeI-Fragment.
    Figure 00430002
    Seq.-ID Nr. 13: CRE-induzierte Expression von rekombinantem Protein nach dem Design in Fig 19. SacI-NheI-Fragment.
    Figure 00430003
    Figure 00440001
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Claims (17)

  1. Ortsspezifisches Rekombinationsverfahren zur Entfernung von vorgegebenen Nucleinsäuresequenzen vom Plastidengenom, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Bereitstellung eines ersten Nucleinsäurekonstrukts, wobei das Konstrukt einen Promotor umfasst, der operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für eine Plastiden-Targeting-Transitsequenz kodiert, die operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für ein Protein kodiert, das Exzisionsaktivität zeigt, wobei das Konstrukt weiters eine für einen ersten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure umfasst, die pflanzenspezifische 5'- und 3'-Regulations-Nucleinsäuresequenzen aufweist; b) Bereitstellung eines zweiten DNA-Konstrukts, wobei das zweite Konstrukt eine für einen zweiten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure und Exzisionsstellen umfasst, wobei das zweite Konstrukt gegebenenfalls ein Gen von Interesse enthält, wobei das zweite Konstrukt weiters flankierende Plastiden-Targeting-Nucleinsäuresequenzen umfasst, welche eine homologe Rekombination in das Plastidengenom vereinfachen. c) Einführung des zweiten DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle; d) Kultivieren der Pflanzenzelle aus Schritt c) in Gegenwart eines Selektionsmittels, wodurch Pflanzenzellen ausgewählt werden, welche die Proteine exprimieren, für welche das zweite DNA-Konstrukt kodiert; e) Einführung des ersten DNA-Konstrukts in Pflanzenzellen aus Schritt d) in Gegenwart eines Selektionsmittels und Selektion von Pflanzenzellen, die Proteine exprimieren, für welche das erste Konstrukt kodiert, wobei die Exzisionsaktivität wenn vorhanden auf die Exzisionsstellen wirkt, wodurch die vorgegebene Targetsequenz herausgeschnitten wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin eine Pflanze aus Pflanzenzellen aus Schritt c) regeneriert wird, wobei die Zellen dann mit dem ersten Konstrukt kontaktiert werden und Schritte d) und e) durchgeführt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste Konstrukt das in 3 dargestellte ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das zweite Konstrukt das in 2 dargestellte ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Protein mit Exzisionsaktivität aus der aus CRE, Flippase, Resolvase, FLP, SSV1-kodierter Integrase und Transposase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Exzisionsstellen LOX-Sequenzen und frt-Sequenzen sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Selektionsmittel aus der aus Kanamycin, Gentamycin, Spectinomycin, Streptomycin und Hygromycin, Phosphinotricin, Basta, Glyphosat und Bromoxynil bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Exzision der vorgegebenen Sequenz ein exprimierbares Translationsfusionprotein schafft.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die vorgegebene Targetsequenz die Nucleinsäure ist, die für einen selektierbaren Marker kodiert, welche im zweiten Konstrukt vorhanden ist.
  10. Ortsspezifisches Rekombinationssystem, welches die Konstrukte nach Anspruch 1 umfasst.
  11. Ortsspezifisches Rekombinationsverfahren zur Entfernung von vorgegebenen Nucleinsäuresequenzen aus dem Plastidengenom, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Bereitstellung eines ersten Nucleinsäurekonstrukts, wobei das Konstrukt einen regulierten Promotor umfasst, der operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für eine Plastiden-Targeting-Transitsequenz kodiert, die operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für ein Protein kodiert, das über Exzisionsaktivität verfügt, wobei das Konstrukt gegebenenfalls weiters eine für einen ersten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure umfasst, die pflanzenspezifische 5'- und 3'-Regulations-Nucleinsäuresequenzen aufweist; b) Bereitstellung eines zweiten DNA-Konstrukts, wobei das zweite Konstrukt eine für einen zweiten selektierbaren Marker kodierende Nucleinsäure und Exzisionsstellen umfasst, wobei das zweite Konstrukt weiters flankierende Plastiden-Targeting-Nucleinsäuresequenzen umfasst, welche eine homologe Rekombination in das Plastidengenom an der vorgegebenen Targetsequenz erleichtern, sodass Exzisionsstellen nach homologer Rekombination die vorgegebene Targetsequenz flankieren; c) Einführung des zweiten DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle; d) Kultivieren einer Pflanzenzelle nach Schritt c) in Gegenwart eines Selektionsmittels, wodurch Pflanzenzellen ausgewählt werden, welche die Proteine exprimieren, für welche das zweite DNA-Konstrukt kodiert; e) Regeneration einer Pflanze aus Zellen, die in Schritt d) erhalten werden; f) Einführung des ersten DNA-Konstrukts in Pflanzenzellen aus Schritt e) in Gegenwart eines Selektionsmittels und Selektion dieser Pflanzenzellen, die Proteine exprimieren, für welche das erste Konstrukt kodiert, wobei die Exzisionsaktivität wenn vorhanden auf die Exzisionsstellen wirkt, wodurch die vorgegebene Targetsequenz herausgeschnitten wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der regulierbare Promotor aus der aus induzierbaren Promotoren, gewebsspezifischen Promotoren, entwicklungsregulierten Promotoren und chemisch induzierbaren Promotoren bestehenden Gruppe von Promotoren ausgewählt ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, worin die vorgegebene Sequenz aus der aus Genen, die mit männlicher Sterilität assoziiert sind, clpP-Ribosomenproteinen, Ribosomen-RNA-Operonsequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Protein mit Exzisionsaktivität aus der aus CRE, Flippase, Resolvase, FLP, SSV1-kodierter integrase und Transposase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Exzisionsstellen LOX-Sequenzen und frt-Sequenzen sind.
  16. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Selektionsmittel aus der aus Kanamycin, Gentamycin, Spectinomycin, Streptomycin und Hygromycin, Phosphinotricin, Basta, Glyphosat und Bromoxynil bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  17. Ortsspezifisches Rekombinationssystem zur Entfernung von vorgegebenen Nucleinsäuresequenzen, welches das Konstrukt nach Anspruch 11 umfasst.
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